Respostas Alberts

Respostas às atividades da obra Biologia Molecular da Célula, 5a Edição

Uma criatura do mar avistada entre as Antilhas e Nice, em 1562. Nunca saberemos exatamente o que a pessoa que desenhou esta figura realmente viu, mas é pouco provável que esta criatura tenha sido totalmente inventada. Qualquer um que tenha feito um curso de histologia sabe como é difícil aprender a observar e cap-tar detalhes relevantes e precisos a partir de uma cena não familiar. Isto é importante para os biólogos celula-res; é muito fácil interpretar o que não é familiar quando já se tem um conhecimento prévio, impossibitando a percepção de algo novo.

Alberts-Resp_Book.indb 1Alberts-Resp_Book.indb 1 23.11.09 10:54:2923.11.09 10:54:29


Células e Genomas 1 1-1 Falso. Os conjuntos de genes da hemoglobina se originaram nos humanos da du-

plicação a partir de um gene ancestral que codificava a proteína globina; portanto, eles são exemplos de genes parálogos. Os genes da hemoglobina α humana e dos chimpanzés são ortólogos, assim como os genes da hemoglobina β de humanos e de chimpanzés, etc. Todos os genes que codificam a proteína globina, incluindo o gene para a mioglobina, que apresenta uma relação evolutiva mais distante, são homólogos uns aos outros.

1-2 Verdadeiro. Nos organismos unicelulares, o genoma também é o material here-ditário, e qualquer modificação que ele sofra é repassada para a próxima gera-ção. As células germinativas geralmente estão isoladas no interior dos organismos multicelulares, minimizando o seu contato com células estranhas, vírus e DNA, protegendo assim as espécies dos efeitos de uma possível transferência genética horizontal.

1-3 Verdadeiro. Os genomas das bactérias são reduzidos ao essencial: apenas uma pe-quena porção se destina ao controle da expressão gênica. Já no genoma humano, apenas cerca de 1,5% das sequências de DNA codifica proteínas.

1-4 A resistência a mutações, observada no código genético, sugere que ele esteja su-jeito às pressões da seleção natural. Dessa maneira, a resistência a mutações é uma característica favorável do código genético, pois permite que os organismos mantenham informações suficientes para especificar fenótipos complexos. Esta lógica sugere que um evento aleatório – aproximadamente de um em um milhão – tenha sido responsável pelo surgimento de um código genético à prova de erros como o nosso.

Contudo, na prática isto não é tão simples. Se a resistência a mutações for uma característica essencial de qualquer código genético, então os únicos códigos que observaríamos seriam aqueles à prova de erros. Um evento evolutivo menos rígi-do, que originasse um código mais sujeito a erros, poderia limitar a complexidade da vida.

Existem diversas provas de que o código genético não é estático e responde às forças da seleção natural. Variantes do código genético já foram identificadas em mitocôndrias e no genoma nuclear de diversos organismos.

Referência: Freeland SJ e Hurst LD (1998) The genetic code is one in a million. J. Mol. Evol. 47, 238-248.

1-5 Algumas hipóteses poderiam ser testadas: 1. Uma análise do conteúdo de aminoácidos poderia indicar se o conjunto de ami-

noácidos utilizado pelos organismos sendo caracterizados difere ou não daquele utilizado pelos organismos da Terra. No entanto, mesmos organismos da Terra podem apresentar aminoácidos diferentes dos 20 mais comuns, como hidroxipro-linas, fosfosserinas e fosfotirosinas.

2. O sequenciamento do DNA da amostra a ser caracterizada permitirá a compara-ção da sua sequência de nucleotídeos com a sequência dos organismos da Terra. Uma análise cuidadosa da sequência poderia resolver este problema.

3. A análise do código genético do novo organismo pode ser uma boa abordagem.

1-6 “Alimentar-se” significa “obter energia livre ou substratos a partir de”, seja esta fonte a luz solar ou compostos químicos inorgânicos. No caso da fotossíntese, os fótons da luz solar são utilizados para excitar os elétrons de algumas moléculas,


4 Capítulo 1 Células e Genomas

criando espécies instáveis. Quando estes elétrons voltam ao seu estado natural, a energia liberada é aproveitada por mecanismos que direcionam a síntese de ATP. De modo similar, os organismos litotróficos obtêm energia livre pela oxidação de uma ou mais moléculas reduzidas obtidas das fendas termais (p. ex., H2S → S + 2H+), utilizando alguma molécula comum presente no ambiente como aceptora de elétrons (2H+ + ½ O2 → H2O). A energia liberada nestas reações de oxidação-redução (transferência de elétrons) é utilizada em reações que envolvam a síntese de ATP.

1-7 São possíveis quatro árvores filogenéticas (Figura R1-1). Os três grupos podem ter divergido de um ancestral comum ao mesmo tempo. As eubactérias e as arque-bactérias podem ter divergido dos eucariotos e então se separado. As eubactérias e os eucariotos podem ter divergido das arquebactérias e então formado ramos distintos. Ou ainda, as arquebactérias e os eucariotos podem ter divergido das eubactérias antes de divergirem entre si. Apesar de os eventos de transferência horizontal tornarem a análise filogenética mais complicada, acredita-se que as arquebactérias e os eucariotos se separaram das eubactérias e então as arquebac-térias divergiram do grupo dos eucariotos.

1-8 É pouco provável que qualquer gene tenha se originado com as características perfeitas para a sua função. Assume-se que genes altamente conservados, como os que codificam o RNA ribossomal, tenham sido otimizados por processos evo-lutivos mais rápidos durante a evolução do ancestral comum a arquebactérias, eubactérias e eucariotos. Uma vez que RNAs ribossomais (e os produtos de outros genes altamente conservados) participam nos processos fundamentais aperfei-çoados anteriormente, não houve pressão evolutiva para mudança. Já os genes menos conservados – ou seja, os que evoluem mais rapidamente – estão cons-tantemente sujeitos a ocupar novos nichos funcionais. Considere, por exemplo, a evolução dos diferentes genes da globina (veja a resposta da Questão 1.1).

1-9 A. Uma vez que os genes envolvidos nos processos de fluxo de informação estão

menos sujeitos à transferência horizontal, as árvores evolutivas derivadas destes genes são mais confiáveis para estimar as relações evolutivas entre os organismos. Portanto, é provável que as arquebactérias tenham se separado dos eucariotos de-pois de ambos terem divergido do grupo das eubactérias.

B. A complexidade é uma explicação lógica para as diferenças nas taxas de transfe-rência horizontal de genes. A transferência bem sucedida de um gene relacionado ao processo de fluxo de informação necessita que o seu produto gênico se encaixe em um complexo funcional preexistente, talvez suplantando a proteína original presente no organismo. Para que esta proteína se encaixe em um complexo pro-teico, é necessário que ela apresente superfícies de ligação complementares ao complexo, permitindo a sua interação correta. Já um produto gênico que desem-penhe uma reação metabólica independente pode ser perfeitamente funcional em qualquer organismo. Se esta reação metabólica conferir alguma vantagem adaptativa ao organismo que receber este gene (ou ao menos, não conferir des-vantagens), o gene em questão pode ser acomodado no genoma do organismo receptor.

Referência: Jain R, Rivera MC e Lake JA (1999) Horizontal gene transfer among genomes: The complexity hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3801-3806.

Figura R1-1 As quatro possíveis relações evolutivas entre archaea (A), eubactérias (B) e eucariotos (E) (Resposta 1-7).

A B E A B E A E BA B E


Capítulo 1 Células e Genomas 5

1-10 A. A hipótese mais simples é que a transferência gênica tenha ocorrido no ponto in-

dicado na Figura R1-2. As linhagens além deste ponto apresentam o gene Cox2 nuclear, enquanto as linhagens que se ramificam nos pontos anteriores não apre-sentam.

B. Cinco gêneros (Lespedeza, Dumasia, Pseudeminia, Neonotonia e Amphicarpa) aparentemente possuem cópias funcionais dos genes mitocondrial e nuclear, conforme indicado em cinza na Figura R1-2.

C. Dez gêneros (Eriosema, Atylosia, Erythrina, Ramirezella, Vigna, Phaseolus, Ortholobium, Psoralea, Cullen e Glycine) não apresentam o gene mitocondrial funcional. O número mínimo de eventos de inativação é quatro, conforme indica-do pelos quadrados na Figura R1-2.

D. Seis gêneros (Calopogonium, Pachyrrhizus, Cologania, Pueraria, Pseudovigna e Teramnus) não apresentam a cópia funcional do gene nuclear. O número mínimo de eventos de inativação é cinco, conforme indicado pelos círculos na Figura R1-2.

E. Estes dados sugerem que a transferência de genes da mitocôndria para o núcleo não é um processo de apenas uma etapa; isto é, simultânea perda do gene mito-condrial e aparecimento deste gene no núcleo. Este é um cenário bastante impro-vável uma vez que as versões nucleares dos genes mitocondriais devem adquirir ainda sequências sinalizadoras que permitam o transporte das proteínas sinteti-zadas para a mitocôndria (veja o Capítulo 12 da obra). Os dados apresentados na Figura R1-2 indicam que o processo de transferência iniciou com o aparecimento do gene no núcleo. Esta primeira etapa não é acompanhada pela perda do gene mitocondrial. Uma vez que o gene nuclear esteja ativado, é observado um está-gio intermediário onde as duas cópias do gene estão ativadas. Posteriormente, uma das cópias é inativada. Se o gene nuclear for inativado, o processo de transfe-rência do gene é interrompido. Se o gene mitocondrial for inativado (geralmente por mutações pontuais), a transferência gênica pode continuar. O estágio final da transferência é a eliminação do gene mitocondrial não funcional, um processo que ocorrerá durante a replicação do genoma.

Referência: Adams KL, Song K, Roessler OG, Nugent JM, Doyle JL, Doyle JJ e Palmer JD (1999) Intracellular gene transfer in action: Dual transcription and multiple silencing of nuclear and mitocondrial cox2 genes in legumes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 13863-13868.

1-11 A. Os dados da árvore filogenética (ver Figura 1-3, constante na obra, p. 43) indicam

que o gene da hemoglobina de plantas tenha se originado por transferência hori-zontal. As sequências das hemoglobinas de plantas parecem ter divergido há mui-to tempo na escala evolutiva, no mesmo momento, ou ainda antes, do surgimento dos moluscos, insetos e nematoides. As relações evolutivas indicadas na árvore sugerem que o gene da hemoglobina surgiu a partir de algum ancestral comum.

B. Se o gene da hemoglobina de plantas tivesse se originado de transferência hori-zontal a partir de um parasita nematoides, a sua sequência estaria agrupada com as sequências de genes de hemoglobina de nematoides na árvore filogenética da Figura Q1-3.

1-12 Três hipóteses gerais podem ser propostas.A hipótese do tempo de geração propõe que as diferenças nas taxas são conse-

quência dos diferentes tempos de geração. Espécies como o rato, com tempo de geração mais curto, passarão por um número maior de gerações e divisões das células germinativas, e consequentemente por mais ciclos de replicação do DNA. Esta hipótese assume que os erros inseridos durante a replicação do DNA são a maior fonte de mutações.

A hipótese da taxa metabólica afirma que espécies com maiores taxas de evo-lução apresentam maiores taxas metabólicas, gerando mais espécies reativas de oxigênio, a principal fonte de danos ao DNA. Isto é particularmente relevante quando consideramos genomas mitocondriais, uma vez que a mitocôndria é o


6 Capítulo 1 Células e Genomas

principal local de utilização de oxigênio e de geração de radicais livres nas cé-lulas.

A hipótese da eficiência de reparo propõe que a eficiência de reparo do DNA danificado difere entre as linhagens. Espécies com mecanismos de reparo mais eficientes reduziriam a proporção de erros que levariam a mutações. Existem evi-dências experimentais de que estas diferenças nos sistemas de reparo existem, a partir de células humanas e de ratos em cultivo, mas não está claro se estas dife-renças existem também nas células germinativas destes organismos.

Referência: Li WH (1997) Molecular Evolution, p. 228-230. Sinauer Associates, Inc.: Sunderland MA.

Figura R1-2 Resumo da distribuição do gene Cox2 e seu transcrito, em um contexto filogenético, mostrando os locais mais prováveis de transferência gênica e o número mínimo de eventos de inativação do gene mitocondrial (quadrados) e do gene nuclear (círculos) (Resposta 1-10). O destaque em cinza indica os gêneros que aparentemente apresentam cópias funcionais dos ge-nes mitocondrial e nuclear.

GENE RNAmt mtnuc nuc

Pisum

Clitoria

TephrosiaGalactiaCanavalia

Lespedeza

EriosemaAtylosiaErythrina

RamirezzellaVignaPhaseolus

Dumasia

CalopogoniumPachyrhizus

CologaniaPuerariaPseudeminiaPseudovigna

OrtholobiumPsoraleaCullen

NeonotoniaTeramnusAmphicarpa

Glycine

+ –

+ –

+ –+ –+

+ +

+ + + +

+ + + +

+ +

+ + + +

+ +

+ +

+ +

+ ++ +

+ +

–

+ –+ –

+ –+ –

+ –+ –

+ –

+ –+ –

+–+–+–

+–+–+–

+–+–+–

+–+–+–

+–+–

+–+–+–

+–

+–

+ –

+ –

+ –+ –+ –

Transferênciagênica eativação


Química Celular e Biossíntese 2 2-1 Verdadeiro. A cada meia-vida, metade da radiatividade restante diminui. Após 10

meias-vidas (1/2)10, apenas 1/1.024 da radiatividade original se mantém.

2-2 Falso. O pH da solução será próximo ao neutro (pH 7,0), pois poucos íons H� do HCl irão exceder o número de íons H� originados da dissociação das moléculas de água. Não importa o quão dissolvido esteja um ácido, ele não originará uma solução básica. Em concentração igual a 10�8 M, o pH da solução será 6,98.

2-3 Falso. A maioria das interações entre macromoléculas depende da habilidade de associação e dissociação rápidas, o que não é possível se estas moléculas intera-girem por ligações covalentes. No entanto, em situações onde uma grande esta-bilidade estrutural é necessária, como na formação da parede celular de plantas, bactérias e fungos, ou na matriz extracelular das células animais, algumas macro-moléculas podem se encontrar unidas por ligações covalentes.

2-4 Verdadeiro. A diferença entre animais e plantas é o modo como obtêm as molécu-las que serão oxidadas para consumo de energia. As plantas utilizam as reações de fotossíntese, e os animais precisam ingerir suas fontes de alimento.

2-5 Verdadeiro. As reações de oxidação-redução se referem às reações nas quais ocor-re transferência de elétrons entre moléculas. Uma reação de oxidação deve ser acompanhada por uma reação de redução, pois o número de elétrons deve ser mantido constante.

2-6 Falso. A constante de equilíbrio para a reação A ↔ B não é alterada. O acoplamen-to de reações pode transformar uma reação desfavorável em uma reação favorá-vel, por alterar a concentração dos produtos da primeira reação em relação aos seus substratos, mas não irá mudar o valor da sua constante de equilíbrio, pois, como o nome indica, este valor é constante.

2-7 Verdadeiro. Uma reação com valor negativo de ΔG° não irá ocorrer esponta-neamente caso a concentração de produto exceda a concentração esperada nas condições de equilíbrio. Já uma reação com valor positivo de ΔG° ocorrerá es-pontaneamente em condições onde exista excesso de substratos em relação à concentração esperada nas condições de equilíbrio.

2-8 Falso. A glicólise é a única via metabólica capaz de gerar ATP na ausência de oxi-gênio. Existem diversas situações de anoxia em que as células dependem da gli-cólise para a obtenção de energia. Por exemplo, em treinos intensos de corrida, a circulação não é capaz de manter condições adequadas de oxigenação nos mús-culos das pernas, que dependem então da glicólise, realizada a partir das molécu-las de glicogênio celular. Outro exemplo são as hemácias, que, por apresentarem mitocôndrias, não realizam metabolismo oxidativo.

2-9 Falso. Os átomos de oxigênio da molécula de CO2 não são oriundos dos átomos de oxigênio consumidos durante a oxidação da glicose. As moléculas de oxigênio utilizadas na fosforilação oxidativa originam moléculas de água.

2-10 A química orgânica realizada nos laboratórios raramente é realizada em água, de-vido à baixa solubilidade de alguns compostos e à reatividade da água com algu-mas reações. No entanto, a maior diferença entre a química orgânica das células


8 Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese

vivas e a realizada em laboratório é a complexidade. Um fator essencial em labo-ratório é o uso de reagentes com alto grau de pureza; já nas células vivas, milha-res de reações distintas são realizadas simultaneamente e sem interferências. É a habilidade das enzimas de isolar ambientes ótimos através de catalisadores que permite a realização de tantas reações simultâneas.

2-11 A. O etanol em uma cerveja com graduação alcoólica igual a 5% está na concentra-

ção 0,86 M. O etanol puro é 17,2 M ([789 g/L] � [mol/46 g]). B. No limite legal de 80 mg/100 mL, haverá uma concentração de etanol igual a 17,4

mM no sangue ([80 mg/0,1 L0 � [mmol/46 mg]). C. No limite legal (17,4 mM), o etanol de cervejas com graduação alcoólica igual a

5% (0,86 M) estará diluído 49,4 vezes (860 mM/17,4 mM). Esta diluição repre-senta 809 mL de cerveja em 40 L de água corporal, o que equivale a 2,3 cervejas de 355 mL.

D. Aproximadamente quatro horas. Com duas vezes o limite legal, uma pessoa terá 64 g de etanol ([0,16 g/0,1L] � [40 L]). Uma pessoa é capaz de metabolizar 8,4 g de etanol por hora, levando 3,8 horas para metabolizar 32 g de etanol (equivalente à quantidade que excede o limite legal).

2-12 Quanto menor a meia-vida, maior o número de átomos que diminuirão por uni-dade de tempo, aumentando o número de dpm ou curies. Se átomos radiativos estiverem presentes em quantidades equimolares, aqueles com meia-vida mais curta apresentarão maior valor de dpm ou Ci/mmol – uma atividade específica maior.

2-13 A. Uma solução é considerada neutra quando as concentrações de H� e OH� são

iguais. Isto ocorre quando a concentração de cada um destes íons é igual a 10�7 M, e seu produto equivale a 10�14 M2.

B. Em uma solução de NaOH de 1 mM, a concentração de OH� é 10�3M. Portanto, a concentração de H� é igual a 10�11 M, o que corresponde a um valor de pH igual a 11.

[H�] �KW

[OH�]

�10�14 M2

� 10�11 M10�3 M

C. Um valor de pH igual a 5,0 corresponde a uma concentração de H� igual a 10�5 M. A concentração de íons OH– nesta mesma solução será igual a 10�9 M.

2-14 Os valores de pK, do menor para o maior, serão 4, 1, 2, 3. Considere o grupo carbo-xila da cadeia lateral do aspartato, ou ácido aspártico, na superfície de uma pro-teína, na ausência de outros grupos ionizáveis (condição 1). Nestas condições, o seu valor de pK será de aproximadamente 4,5, um valor maior do que o observado no aminoácido livre, pois não sofre a influência do grupo amino carregado positi-vamente. Se esta cadeia lateral se encontrar em um ambiente hidrofóbico, no in-terior de uma proteína (condição 2), o seu valor de pK será maior, pois a presença de um grupo carregado em um ambiente hidrofóbico é desfavorável. Havendo um segundo grupo negativamente carregado neste ambiente hidrofóbico (condição 3), o valor de pK da cadeia lateral do aspartato será ainda maior devido à repulsão eletrostática. Caso exista um grupo de carga positiva neste ambiente (condição 4), a atração eletrostática favorecerá a transferência de um próton, diminuindo o valor de pK da cadeia lateral do aspartato, mesmo quando comparado ao mesmo aminoácido exposto na superfície de uma proteína (1).

2-15 Se a atividade enzimática for dependente de uma alteração no estado de proto-nação de um resíduo de histidina, esta histidina deverá estar no seu estado pro-tonado (carregado), e a enzima será ativa em valores de pH menores que o pK da histidina (geralmente entre 6,5 e 7,0).


Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese 9

2-16 Antes de uma corrida, o corredor deve respirar rapidamente. Como uma corrida de curta distância resultará em uma diminuição do pH do sangue, o objetivo antes da corrida é aumentar o pH sanguíneo, aumentando o tempo que o atleta levará para atingir o estado de fadiga. Segurar o fôlego irá aumentar a quantidade de CO2 dissolvido no sangue, deslocando o equilíbrio da reação para a direita, aumentan-do a [H�] e diminuindo o pH do sangue. Ao respirar rapidamente, a concentração de CO2 do sangue diminui e desloca o equilíbrio da reação para a esquerda, dimi-nuindo a [H�] e aumentando o pH do sangue.

2-17 Os grupos funcionais das três moléculas estão indicados e devidamente denomi-nados na Figura R2-1.

2-18 O cálculo é feito do seguinte modo (utilizando a molécula de água como exem-plo): massa da água � 3 � 10�23 g ([18g/mol] � [mol/6 � 1023 moléculas]).

v � (kT/m)1/2

v �

v � 3,78 � 104 cm/seg

As velocidades instantâneas para as moléculas de água, glicose e mioglobina são: 3,8 � 104 cm/seg, 1,2 � 104 cm/seg e 1,3 � 103 cm/seg. Convertendo estes valo-res em km/h, uma molécula de água se desloca em uma velocidade igual a 1.360 km/h, a glicose a 428 km/h, e a mioglobina a 47 km/h.

Referência: Berg HC (1993) Random Walks in Biology: Expanded Edition, p. 5-6, Princeton University Press.

2-19 A termodinâmica considera o sistema como um todo, ou seja, inclui as moléculas de água. O aumento na entropia se deve principalmente ao efeito da polimeriza-ção das unidades de tubulina (hidrofóbicas) sob as moléculas de água adjacentes (que são ordenadas na proximidade dos microtúbulos). Estas moléculas de água não estão livres para interagir com as demais moléculas de água que as rodeiam, o que resulta em um aumento da entropia do sistema, excedendo a diminuição da entropia causada pela polimerização dos microtúbulos.

2-20 Toda população de moléculas de ATP disponíveis no corpo é reciclada 1.800 vezes por dia, um pouco mais de uma vez por minuto. A conversão de 3 moles de gli-cose em CO2 gera 90 moles de ATP ([3 moles de glicose] x [30 moles de ATP/mol de glicose]). O corpo contém 5 x 10–2 mol de ATP ([2 x 10–3 mol/L] x 25 L). Como a concentração de ATP não muda, cada molécula precisa ser reciclada 1.800 vezes por dia ([90 moles de ATP/dia] / [5 x 10–2 mol de ATP]).

2-21 O corpo humano consome cerca de 70 watts.

watts�

109 ATP�

5 � 1013 células�

mol�

12 kcal�

4,18 � 103 Jcorpo 60 seg célula corpo 6 � 1023 ATP mol kcal

�69,7 J/seg

�69,7 watts

corpo corpo

2-22 Escalar o monte Matterhorn a partir do topo do monte Zermatt, uma distância vertical de 2.818 m, requer 496 kcal:

trabalho � 75 kg �9,8 m

� 2.818 m �J

�kcal

seg2 kg m2/seg2 4,18 � 103

� 495,5 kcal

Este valor equivale a 1,5 barra energética. Na realidade, o corpo humano não con-verte energia em trabalho com 100% de eficiência, e sim com aproximadamente 25% de eficiência, o que aumenta a necessidade calórica para cerca de 6 barras.

O

hidroxila

carbonil

piruvato

sulfidril

cisteína

amino

carboxilato

fosforil

1,3-bifosfoglicerato

carboxilato

grupo carboxílico fosfórico do

ácido anídricoO

P

OC

C

CH2

CH3

SH

OC

O–

CH2

CH2

CH

NH3

+

HO H

O––O

O

O

C

C

O–

O–

P O––O

Figura R2-1 Grupos funcionais nas mo-léculas de 1,3 bifosfoglicerato, piruvato e cisteína (Resposta 2-17).


10 Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese

Referência: Frayn KN (1996) Metabolic Regulation: A Human Perspective, p. 179. Londres: Portland Press.

2-23 Sob condições anaeróbias, as células não são capazes de utilizar piruvato e NADH. Os elétrons transportados pelo NADH são transferidos para a cadeia transporta-dora de elétrons da fosforilação oxidativa; na ausência de oxigênio, contudo, estes elétrons não são utilizados, assim como o piruvato, havendo então acúmulo de piruvato e NADH. O processo de fermentação combina estas duas moléculas em lactato ou etanol, que são exportados pela célula para o ambiente extracelular.

Células que não realizam fermentação convertem rapidamente as suas moléculas de NAD� em NADH, que se acumula e inibe a glicólise na etapa de conversão de gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-bifosfoglicerato. A fermentação regenera as molé-culas de NAD� pela transferência de elétrons das moléculas de NADH para piru-vato, permitindo a continuidade da glicólise.

2-24 Na ausência de oxigênio, a energia celular é obtida pela fermentação, o que requer um maior fluxo do ciclo glicolítico para gerar quantidades suficientes de ATP. Na presença de oxigênio, a célula é capaz de gerar ATP pela fosforilação oxidativa, que gera ATP de modo mais eficaz que a glicólise, e menos moléculas de glicose são necessárias para gerar a mesma quantidade de ATP.

2-25 Não é possível reverter esta reação em condições fisiológicas. O fluxo de reações ao longo de uma via metabólica requer que os valores de ΔG de todas as etapas sejam negativos. Reverter a reação G6P � ADP → glicose � ATP, com ΔG° � 4,0 kcal/mol, requer uma proporção de [glicose] [ATP] / [G6P] [ADP] menor do que 10�2,84 (0,0015) para atingir o equilíbrio da reação (ΔG � 0).

ΔG � ΔG° � 1,41 kcal/mol log[glicose] [ATP]

[G6P] [ADP]

0 � 4,0 kcal/mol � 1,41 kcal/mol log[glicose] [ATP]

[G6P] [ADP]

log[glicose] [ATP]

��4,0 kcal/mol

� �2,44[G6P] [ADP] 1,41 kcal/mol

log[glicose] [ATP]

� 0,0015[G6P] [ADP]

A concentração de ATP no interior de uma célula sempre excede a concentração de ADP, impossibilitando a reversão da reação.

2-26 A remoção de fragmentos de dois átomos de carbono a partir da extremidade car-boxílica é a única possibilidade que explica a diferença entre o metabolismo de ácidos graxos de cadeia par ou ímpar. Os dois átomos de carbono terminais não são removidos do ácido fenilacético, pois o anel benzênico interfere com o pro-cesso de fragmentação através de alterações induzidas no terceiro átomo, a partir da extremidade carboxílica. Como este carbono faz parte do anel benzênico no ácido fenilacético, ele não é metabolizado.

Além de explicar a diferença no metabolismo de ácidos graxos de cadeia par e ímpar, os resultados de Knoop também indicaram a direção da degradação da cadeia do ácido graxo. Se a extremidade não ácida nos ácidos graxos fosse degra-dada inicialmente, a adição do anel benzênico impediria o seu metabolismo, ou o anel benzênico seria excretado sempre na mesma forma, independentemente do número de átomos de carbono presentes na molécula de ácido graxo.

Referência: Knoop F (1905) Der Abbau aromatischer Fettsäuren im Tierkörper. Beitr. Chem. Physiol. 6, 150-162.

2-27 Os experimentos de alimentação cruzada indicam que as três etapas controladas pelos produtos dos genes TrpB, TrpD e TrpE estão arranjadas na seguinte ordem:

X TrpE

Y TrpD

Z TrpB

triptofano


Capítulo 2 Química Celular e Biossíntese 11

Sendo X, Y e Z intermediários não identificados da via metabólica.

A habilidade da cepa TrpE – de ser alimentada pelas outras duas cepas indica que TrpD– e TrpB– acumulam intermediários mais distantes da via metabólica do que a etapa controlada pelo gene TrpE. A habilidade da cepa TrpD– de ser alimentada por TrpB– e não por TrpE – situa este gene no meio da via. Como TrpB– não é capaz de ser alimentada por nenhuma outra cepa, isso indica que este gene controla a etapa mais próxima ao triptofano.

Referência: Yanofsky C (2001) Advancing our knowledge in biochemistry, genetics, and microbiology through studies on tryptophan metabolism. Anuu. Rev. Biochem. 70, 1-37.



Proteínas 3 3-1 Verdadeiro. Em uma folha �, as cadeias laterais dos aminoácidos de cada uma

das fitas que a compõem estão posicionadas, alternadamente, acima e abaixo do plano da folha �. Cada fita de uma folha � pode ser considerada uma hélice na qual cada aminoácido apresenta uma rotação de 180° em relação ao aminoácido adjacente.

3-2 Verdadeiro. As alças que se projetam e circundam as proteínas geralmente apre-sentam diversos grupos químicos que permitem a interação de outras moléculas através de diversas ligações químicas fracas.

3-3 Verdadeiro. As enzimas apresentam números fixos de sítios de ligação. Quando a concentração de substrato for suficiente para que todos os sítios de ligação de uma proteína estejam ocupados, a velocidade máxima de reação que esta enzima catalisa não pode ser aumentada através do aumento da quantidade de substra-to.

3-4 Falso. O número de turnover é constante, pois ele corresponde ao valor de Vmáx dividido pela concentração enzimática. Por exemplo, um aumento de duas vezes na concentração da enzima induzirá um valor de Vmáx duas vezes maior, mas não afetará o número de turnover: 2 Vmáx/2 [E] � k3.

3-5 Verdadeiro. O termo cooperatividade indica que alterações conformacionais so-fridas por uma das subunidades que compõem uma proteína com estrutura qua-ternária são comunicadas às outras subunidades idênticas da molécula, induzin-do a mesma alteração conformacional em toda a proteína.

3-6 Verdadeiro. Cada ciclo de fosforilação e desfosforilação hidrolisa uma molécula de ATP; no entanto, isto não pode ser visto como desperdício de energia. Os ciclos de adição e remoção de fosfato permitem que as proteínas tenham suas ativida-des finamente reguladas em resposta a estímulos externos que exigem alterações rápidas no estado de metabolismo da célula.

3-7 Uma vez que cada posição em uma proteína de 300 aminoácidos pode ser ocupa-da por um dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, existem 20300 (o que equiva-le a 10390) proteínas possíveis. A massa de uma destas possíveis proteínas seria:

massa �110 d

�300 a

� 10390 proteínas �g

a proteína 6 � 1023 d

massa � 5,5 � 10370 g

Portanto, a massa de proteínas ultrapassaria a massa total observada no universo (1080 g) em um fator de 10290!

3-8 Em termos gerais, uma identidade de pelo menos 30% é suficiente para a identi-ficação de proteínas homólogas nas buscas em bancos de dados. As identidades entre 20 e 30% são problemáticas, pois as proteínas identificadas como possíveis homólogas podem ser falso-positivas, uma limitação da técnica. A busca por sequências de proteínas homólogas de relacionamento evolutivo mais distante é facilitada pelo uso de sequências de aminoácidos mais curtas, pois quando se


14 Capítulo 3 Proteínas

utiliza sequências inteiras normalmente a identidade é menor que 30%. Nestes casos, com a sequência completa, as porções não conservadas da proteína serão predominantes na comparação entre as sequências de proteínas dos bancos de dados.

3-9 A justaposição das porções N-terminal e C-terminal do domínio kelch o identifica como sendo do tipo encaixe. Os domínios do tipo em linha são caracterizados pela posição das porções N-terminal e C-terminal em lados opostos do domínio.

3-10 A. Estes dados são consistentes com a hipótese de que o comportamento de mola da

molécula de titina se deve ao desenovelamento sequencial dos seus domínios Ig. Inicialmente, o fragmento continha sete domínios Ig, havendo sete picos no gráfi-co resultante de força versus extensão. Os picos resultantes observados correspon-dem ainda ao esperado em uma perda sequencial da estrutura secundária dos domínios da proteína. A adição de um agente desnaturante elimina os picos do gráfico, pois a proteína já terá perdido a estrutura dos seus domínios Ig, aumen-tando a extensão que ela atinge por unidade de força aplicada. Quando estes do-mínios são estabilizados por ligações entre eles e, portanto, se tornam incapazes de se desenovelarem, os picos desaparecem do gráfico e a extensão por unidade de força aplicada diminui.

B. O espaçamento entre os picos, de aproximadamente 25 nm, corresponde quase perfeitamente ao valor calculado para o desenovelamento sequencial dos domí-nios Ig. Um domínio enovelado ocupa 4 nm, mas, quando desenovelado, os seus 89 aminoácidos alinhados ocupam cerca de 30 nm (89 � 0,34 nm), um aumento de 26 nm.

C. A presença de picos separados indica que cada domínio se desdobra quando sub-metido a uma força característica, implicando que cada domínio apresenta uma estabilidade definida. A coleção de domínios se desdobra na ordem do menos ao mais estável. Assim, é necessário um pouco mais de força a cada vez para desdo-brar o próximo domínio.

D. A quebra abrupta da força reflete uma característica importante das proteínas: a cooperatividade. As proteínas tendem a perder a sua estrutura terciária e secun-dária de um modo tudo-ou-nada. Um pequeno número de ligações de hidrogênio é responsável por manter a estrutura de um domínio (Figura R3-1), e o rompi-mento destas ligações desencadeia o processo tudo-ou-nada de perda da estrutu-ra tridimensional.

Referência: Rief M, Gutel M, Oesterhelt F, Fernandez JM e Gaub HE (1997) Reversible folding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Scien-ce 276, 1109-1112.

3-11 A. Estima-se que a síntese de uma proteína composta por 10.000 aminoácidos ocorra

da maneira correta em 37% das vezes.

PC � (fc)n � (0,9999)10.000

� 0,37

Já a síntese de cada subunidade composta por 200 aminoácidos apresentará uma taxa de sucesso de 98% (PC � [fC]n � [0,9999]200 � 0,98). A formação de uma mis-tura de subunidades em ribossomos corretos seguirá a mesma equação (PC � [fC]n � [0,98]50 � 0,37). Portanto, a formação de um ribossomo a partir de subunidades tem a mesma taxa de sucesso que a sua formação a partir de uma única proteína.

Figura R3-1 Ligações de hidrogênio que mantêm o domínio enovelado na sua conformação (Resposta 3-10). As ligações de hidrogênio indicadas (linhas em cinza), quando rompidas, induzem à perda da estrutura do domínio. Por meio da comparação desta represen-tação topológica com a estrutura tridi-mensional na Figura Q3-2A (p. 151 da obra), é possível identificar as duas pe-quenas fitas � que estão envolvidas na formação destas ligações de hidrogênio.

N

C


Capítulo 3 Proteínas 15

B. A premissa apresentada em A de que subunidades corretas e incorretas são in-corporadas ao ribossomo com igual probabilidade não é verdadeira. Qualquer erro que interfira no enovelamento correto de uma subunidade, ou na habilidade desta subunidade de se ligar às demais, a elimina da formação do ribossomo. Por-tanto, a vantagem da síntese de subunidades não está na maior taxa de sucesso de síntese, e sim em permitir que um mecanismo de controle de qualidade rejeite as subunidades incorretas eficientemente.

3-12 A. As concentrações relativas das proteínas Src normal e mutante são inversamente

proporcionais ao volume em que elas estão distribuídas. A proteína mutante Src está distribuída no mesmo volume celular, que é:

Vcélula � (4/3)�r3 � 4�(10 � 10�6 m)3/3 � 4,1888 � 10�15 m3

A proteína Src normal se encontra restrita à camada de 4 nm adjacente à membra-na, que apresenta um volume igual ao da célula, menos o volume de uma esfera com um raio 4 nm menor que o raio da célula:

Vcamada � Vcélula � 4 �(r � 4 nm)3/3� Vcélula � 4 �([10 � 10�6 m] � [4 � 10�9 m])3/3� (4,1888 � 10�15 m3) � (4,1888 � 10�15 m3)

Vcamada � 0,0050 � 10�15 m3

Portanto, o volume da célula é 838 vezes maior que o volume da camada de 4 nm adjacente à membrana (4,1888 � 10�15 m3/0,0050 � 10�15 m3).

Mesmo considerando as regiões internas da célula às quais a proteína Src mu-tante não tem acesso, como núcleo e organelas, a proteína mutante ainda apre-sentará concentração algumas ordens de magnitude a menos que a proteína Src normal.

B. A proteína mutante Src não causa a proliferação celular, pois está presente em concentrações mais baixas na região onde o seu alvo X se encontra. Esta afirmati-va pode ser quantificada considerando-se o equilíbrio de ligação de Src e seu alvo X:

Src � X → Src � X

K � [Src – X]

[Src] [X]

A baixa concentração da proteína mutante nas regiões adjacentes à membrana irá deslocar o equilíbrio no sentido dos componentes livres, reduzindo a quantidade de complexos formados, resultando na ausência de efeito da proteína mutante em induzir a proliferação celular.

3-13 O anticorpo se liga à segunda proteína com uma constante de equilíbrio, K, igual a 5 � 107 M�1.

Uma possível solução para este tipo de problema é considerar o valor de ΔG° relacionado ao valor do log K através de um fator ~2,3 RT, que equivale a �1,4 kcal/mol a 37°C. Desta forma, um aumento de 10 na constante de equilíbrio (um aumento de 1 no valor de log K) corresponde a um decréscimo de �1,4 kcal/mol no valor de ΔG°. Um aumento de 100 na constante de equilíbrio corresponde a um decréscimo de �2,8 kcal/mol no valor de ΔG°, e assim sucessivamente. Esta relação permite uma estimativa rápida das alterações induzidas na constante de equilíbrio por alterações na energia livre, e vice-versa. No problema apresentado, o aumento total no valor de ΔG° é igual a 2,8 kcal/mol, o que requer uma dimi-nuição de 100 vezes no valor de K, e a constante de equilíbrio para a ligação da segunda proteína é igual a 5 � 107 M�1.

A solução deste problema requer o cálculo da variação da energia livre repre-sentada pela ligação da primeira proteína:

ΔG° � �2,3 RT log K

Substituindo K:


16 Capítulo 3 Proteínas

ΔG° � �2,3 (1,98 � 10�3 kcal/K mol) (310 K) log (5 �109)ΔG° � �1,41 kcal/mol � 9,7ΔG° � �13,68 kcal/mol

A energia livre associada à ligação da segunda proteína é obtida com a adição de 2,8 kcal/mol à variação de energia livre para a ligação da primeira proteína, com valor igual a –10,88 kcal/mol. Portanto, a constante de equilíbrio para a ligação da segunda proteína é:

log K � (�10,88 kcal/mol)/(�1,41 kcal/mol) � 7,7K � 5 � 107 M�1

3-14 Os valores calculados para a fração ligada de tmRNA em função da concentração de SmpB são mostrados na Tabela R3-1. Também são mostrados os valores arre-dondados, mais fáceis de memorizar.

Estas relações são úteis não apenas quando pensamos em valores de Kd, mas também para a cinética enzimática. A velocidade de reação expressa como uma fração da velocidade máxima é:

velocidade/Vmáx � [S]/ ([S] � Km)

tendo a mesma forma da equação para a fração ligada. Portanto, quando a con-centração de substrato, [S], é 10 vezes maior que a constante de Michaelis, Km, a velocidade é igual a 90% da velocidade máxima, Vmáx. Quando [S] é 100 vezes menor que o valor de Km, a velocidade é 1% da Vmáx.

Estas relações também são válidas para a dissociação de grupos ácidos, HA, como função dos valores de pH. Quando o valor de pH se encontra 2 unidades acima do valor de pK, 99% dos grupos ácidos estão ionizados. Quando o valor de pH é 1 unidade menor que o valor de pK, 10% destes grupos estão ionizados.

3-15 Quando [S] � zero, a velocidade é igual a 0/Km e, portanto, igual a zero. Quando [S] � Km, a razão de [S]/([S] � Km) é igual a ½, e a velocidade é igual a 1/2 Vmáx. Em valores infinitos de [S], a razão [S]/([S] � Km) é igual a 1, e a velocidade é igual a Vmáx.

3-16 A. Uma enzima composta inteiramente por D-aminoácidos apresentará a mesma

conformação da enzima composta por L-aminoácidos, sendo a sua imagem espe-cular exata.

B. Espera-se que esta enzima correspondente à imagem especular seja capaz de re-conhecer a imagem especular do seu substrato. Desta forma, uma “D-hexoina-se” adicionaria um fosfato a uma molécula de l-glicose, mas não à molécula de d-glicose.

Este experimento foi conduzido com a protease do HIV. A protease especular é capaz de reconhecer e clivar a estrutura especular do seu substrato.

Referência: Milton RC, Milton SC e Kent SB (1992) Total chemical synthesis of a D-enzyme: the enantiomers of HIV-1 protease show reciprocal chiral substrate specificity. Science 256, 1445-1448.

3-17 A hemoglobina é capaz de ligar moléculas de oxigênio de maneira eficaz nos pul-mões, pois ali a pressão parcial de oxigênio é alta. Nos tecidos, a pressão parcial de oxigênio é mais baixa, pois ele está presente em concentrações menores, uma vez que é consumido constantemente no metabolismo. Em condições de menor pressão parcial de oxigênio, a hemoglobina libera estas moléculas. Este fenômeno, que é causado pelo equilíbrio de ligação, é favorecido por interações alostéricas entre as quatro subunidades que compõem uma molécula funcional de hemoglo-bina.

3-18 Uma hipótese viável seria o excesso de AMP mediar a inibição por retroalimenta-ção da enzima que converte E em F, e o excesso de GMP mediar a inibição por re-troalimentação da etapa que converte E em H. O intermediário E, que acumularia pela inibição destas enzimas, por sua vez mediaria a inibição por retroalimenta-ção da etapa que converte R5P em A. Diversas vias metabólicas, que se subdivi-

Tabela R3-1 Valores calculados para a fração ligada em função da concentração de proteína (Resposta 3-14).

[Proteína]

Fração Ligada (%)

Valores arredondados

104 Kd 99,99 99,99103 Kd 99,9 99,9102 Kd 99 99101 Kd 91 90

Kd 50 5010-1 Kd 9,1 1010-2 Kd 0,99 110-3 Kd 0,099 0,110-4 Kd 0,0099 0,01


Capítulo 3 Proteínas 17

dem em duas ou mais vias distintas, são reguladas desta maneira. No entanto, a via de síntese de nucleotídeos de purina é regulada de um modo distinto (Figura R3-2). As moléculas de AMP e GMP regulam as etapas de E para F e de E para H, como descrito anteriormente, mas também regulam a etapa que converte R5P em A. Para evitar que o excesso de um destes nucleotídeos seja capaz de inibir toda a via, cada um deles, individualmente, é capaz de inibir a enzima que converte R5P em A em apenas 50% da sua atividade normal; somente quando os dois nu-cleotídeos estão presentes em excesso é que esta enzima – e toda a via metabólica subsequente – é completamente inibida.

Figura R3-2 Padrão de inibição da via metabólica de síntese de nucleotídeos de purina (Resposta 3-18).

R5P A B C D E

H I

F G50%

50% 100%

100% AMP

GMP



DNA, Cromossomos e Genomas 4 4-1 Verdadeiro. Os homens possuem um total de 24 cromossomos diferentes (22 au-

tossomos, um X e um Y) e as mulheres 23 cromossomos diferentes (22 autosso-mos e 2 cromossomos X).

4-2 Verdadeiro. Camundongos e humanos divergiram a partir de um ancestral co-mum. Suas sequências de DNA sofreram mutações aleatórias. As regiões que fo-ram conservadas são aquelas com funções importantes. Quando as mutações têm efeitos deletérios, a seleção natural se encarrega da eliminação.

4-3 Verdadeiro. A carga negativa do esqueleto de DNA pode ser neutralizada pelas cargas positivas das cadeias laterais básicas de lisina e arginina, que são os amino-ácidos presentes no cerne das histonas.

4-4 Falso. O movimento dos nucleossomos ao longo do DNA ou mesmo entre seg-mentos de DNA pode ser catalisado pelos complexos de remodelamento da cro-matina utilizando a energia da hidrólise de ATP.

4-5 Verdadeiro. A duplicação gênica permite que um dos dois genes sofra divergência, isto é, adquira funções diferentes, mas relacionadas.

4-6 O resultado não surpreenderia, pois o DNA do M13 é de fita simples, onde não ocorre o pareamento de A com T e G com C. Já em DNAs de fita dupla vale a regra de equivalência de moles entre A-T e G-C.

4-7 Os carbonos na ribose são numerados no sentido horário, iniciando com C1´, o carbono ao qual a base se liga, e terminando com C5´.

4-8 Como C sempre forma par com G nos DNAs de fita dupla, então a quantidade de G é igual a de C, ou seja, 20% em base molar. O restante é a quantidade de A e T, que também se equivalem, sendo de 30% cada.

4-9 O cromossomo intermediário e os locais de inversão estão indicados na Figura R4-1.

4-10 Um total de 1.360 nm de DNA dúplex reduzido a 50 nm de fibra de cromatina ([20 nucleossomos] x [200 pb/nucleossomo] x [0,34 nm/pb] = 1.360 nm) representa uma condensação de 27 vezes (1.360 nm/50 nm = 27,2). Esse nível de empacota-mento representa 0,27% (27/10.000) da condensação total que ocorre na mitose.

Figura R4-1 Inversões e cromossomo intermediário na evolução do cromos-somo 3 em orangotangos e humanos. (Resposta 4-9).Orangotango

Primeira inversão

Intermediário

Segunda inversão

Humano


20 Capítulo 4 DNA, Cromossomos e Genomas

4-11 Os efeitos biológicos da metilação das histonas dependem do local da metilação e dos aminoácidos ao redor do sítio. Isso determinará quais proteínas efetoras se ligarão e seus efeitos.

4-12 A presença de dois centrômeros torna o cromossomo instável, pois os microtúbu-los de cada polo se ligariam aos cinetocoros que estão associados com cromátides diferentes. Quando isso ocorre, cada cromátide será puxada para os polos opostos dos fusos com força suficiente para quebrar os cromossomos.

4-13 Todas as proteínas HP1 se ligam especificamente à forma dimetilada na lisina –9 do peptídeo N-terminal H3. Essa associação sugere que esta forma seja encontra-da na heterocromatina.

Referência: Lachner M, O’Carroll D, Rea S, Mechtier K e Jenuwein T (2001) Methylation of H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature 410, 116-120.

4-14 Como os blocos dos gene Hox são ricos em segmentos não codificantes conser-vados e, provavelmente, elementos reguladores, as inserções de elementos trans-poníveis nesses blocos são eliminadas por seleção de purificação. Essas inserções provavelmente interrompem a regulação apropriada dos genes Hox.

Referência: Lander ES et al. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 860-921.


Replicação, Reparo e Recombinação de DNA 5 5-1 Esta afirmação pode ser verdadeira. A cada divisão celular existe a chance de

ocorrerem mutações (6,4 mutações cada vez que o genoma é copiado). Dessa for-ma, normalmente duas células-filhas serão diferentes uma da outra e diferentes da célula parental. Ocasionalmente, o genoma pode ser copiado perfeitamente e dar origem a células-filhas idênticas.

5-2 Verdadeiro. Se a forquilha de replicação se mover 500 pares de nucleotídeos por segundo, o DNA à frente deve rotar a 48 revoluções por segundo ou 3.000 revolu-ções por minuto.

5-3 Verdadeiro. Considerando uma fita-molde simples e o sentido da transcrição sem-pre 5’-3’, a fita-líder sempre encontra uma fita descontínua, independentemente da origem.

5-4 Falso. O reparo de um erro em ambas as fitas de um dúplex requer a informação de uma cromátide-irmã ou de um homólogo, e o reparo de erro em uma fita simples depende apenas da informação contida nas duas fitas do DNA de hélice dupla.

5-5 A variação na frequência dos mutantes depende do momento em que ocorreu a mutação. Culturas com apenas uma mutação a adquiriram na última geração e culturas com muitas mutações a adquiriram na fase inicial do crescimento, antes de se dividirem várias vezes.

Referência: Luria SE e Delbruck M (1943) Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics 28, 491-511.

5-6 Se as enzimas de reparo não distinguissem entre a fita-molde e a recém-sinte-tizada, haveria uma chance de apenas 50% do erro ser corrigido, resultando em 50% de mutantes e 50% de não mutantes na progênie, número equivalente ao do reparo indiscriminado.

5-7 A maioria dos nucleotídeos pareados incorretamente é removida pela exonuclea-se de reparo associada com a DNA-polimerase, mas as DNA-polimerases também são capazes de estender um iniciador mal pareado.

Referência: Johnson KA (1993) Conformational coupling in DNA polymerase fi-delity. Annu. Rev. Biochem. 62, 685-713.

5-8 A forma de H representa a clivagem que ocorreu em um sítio dentro da bolha. Se as estruturas forem colocadas em ordem de acordo com o tamanho crescente da bolha (Figura R5-1), poderá ser visualizado um caso de replicação bidirecional a partir de uma única origem de replicação, provavelmente. Não se pode descartar a possibilidade de duas origens de replicação a pontos equidistantes do sítio de restrição usado. Isso pode ser esclarecido repetindo o experimento e utilizando uma enzima de restrição diferente.

5-9 Em vários locais nas células de vertebrados, a sequência CG é metilada. A desa-minação espontânea do C metilado dá origem a um T. Esse T é removido por uma DNA-glicosilase que o reconhece como mal pareado. Com o tempo, as mutações elevadas dos dinucleotídeos CG resultaram em sua perda preferencial, levando a sua subrepresentação no genoma humano.

Figura R5-1 Replicação bidirecional a par-tir de uma única origem (Resposta 5-8).


22 Capítulo 5 Replicação, Reparo e Recombinação do DNA

5-10 Caso as quebras com reparo impreciso estejam distribuídas aleatoriamente pelo genoma, então é esperado que 2% alterem genes ou reguladores importantes. Desta forma, as funções de cerca de 40 genes estariam comprometidas em cada célula. Como o genoma humano é diploide, para alguns loci o alelo não afetado seria suficiente para a função normal da proteína, já para outros a função poderia ser afetada.

Referência: Lieber MR, Ma Y, Pannicke U e Schwarz K (2003) Mechanism and regulation of human non-homologous DNA end-joining. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 712-720.

5-11 Duas versões da junção Holliday dupla resultante de uma invasão de fitas estão mostradas na Figura R5-2.

5-12 A recombinação irrestrita entre sequências repetidas rearranjaria rapidamente o genoma, o que levaria a um grande número de descendentes inviáveis, colo-cando a espécie em risco. Essa calamidade é evitada pelo sistema de reparo de erros. As sequências repetidas diferem um pouco umas das outras. Quando os intermediários da recombinação se formam entre essas sequências, muitos erros estão presentes nas regiões de heterodúplex. Esses erros em grande quantidade são detectados pelo sistema de reparo, que aborta o processo de recombinação assegurando que as sequências em recombinação sejam bastante idênticas.

5’

5’

5’

5’

ou

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

Figura R5-2 Junção Holliday dupla (Res-posta 5-11). A nova síntese de DNA está indicada por linhas onduladas.


Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína 6 6-1 Verdadeiro. Quando ocorre um erro na duplicação do DNA, isso poderá afetar to-

das as células que se originarem a partir da célula que carrega a alteração. No caso de células mitóticas, as células-filhas e as gerações celulares posteriores serão po-tencialmente afetadas, e no caso de células da linhagem germinativa, o novo or-ganismo que for gerado carregará a alteração em todas as suas células. Quando se consideram erros de transcrição, apenas algumas moléculas de RNA produzidas vão conter estes erros. Como as moléculas de RNA geralmente apresentam uma meia-vida curta, sendo degradadas com relativa rapidez, e como também existem outros mecanismos de controle de qualidade em pontos posteriores da cascata, alterações na transcrição são menos “perigosas” do que alterações na duplica-ção do DNA. Entre as evidências que apontam para esta diferença entre as con-sequências de alterações sobre a duplicação e a transcrição salienta-se o fato de RNA-polimerases apresentarem uma taxa de erro de aproximadamente um erro a cada 104 nucleotídeos copiados, ao passo que as DNA-polimerases cometem um erro a cada 107 nucleotídeos. Assim, em termos de seleção natural, parece que erros cometidos por RNA-polimerases são mais tolerados do que erros cometidos por DNA-polimerases.

6-2 Falso. As sequências dos íntrons apenas são potencialmente menos importantes se não for considerada a ocorrência de splicing alternativo. Além disso, os íntrons devem ser removidos com total precisão para que não ocorram alterações na fase de leitura do mRNA resultante e consequente tradução de proteínas alteradas. Um outro fator associado aos íntrons tem relação com as sequências de microRNAs, que são sequências reguladoras da expressão gênica. Como pode ser percebido, a própria afirmação de que os íntrons são “lixo” genético está inadequada.

6-3 Falso. O pareamento oscilante ocorre entre a terceira posição do códon e a primei-ra posição do anticódon. Lembre-se sempre que a contagem dos nucleotídeos é feita na direção de 5� para 3� da fita de ácidos nucleicos que está sendo considera-da.

6-4 Falso. Este argumento sempre levou em consideração que poucos tipos de reações estão representados nas ribozimas das células atuais, mas sabe-se que muitos processos catalíticos nas células atuais são realizados por ribozimas (a tradução é o melhor exemplo). Além disso, experimentalmente já foi possível identificar diversas ribozimas com capacidades de catálise relativas a uma ampla gama de reações biológicas e tão ou quase tão eficientes quanto enzimas proteicas. Se as ri-bozimas estão subrepresentadas nas células modernas isso provavelmente ocorra devido à disponibilidade de 20 aminoácidos, em contrapartida às quatro bases. Essa diferença entre os componentes de ácidos nucleicos e proteínas permite po-tencialmente que as enzimas proteicas utilizem um número maior de estratégias catalíticas e lhes fornece maior possibilidade de ligação a diferentes substratos.

6-5 Na Figura Q6-1 (p. 409, do original), a RNA-polimerase deve estar se movimentan-do da direita para a esquerda e não apresenta possibilidade de girar livremente em torno da fita-molde, pois pode-se observar tanto supertorções positivas, a sua frente (representando uma compactação), quanto supertorções negativas, atrás dela (representando relaxamento da fita de DNA). Isso só está ocorrendo porque,


24 Capítulo 6 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína

como salientado anteriormente, algo impede que a RNA-polimerase gire livre-mente em torno do molde à medida que se movimenta sobre o DNA. Caso não houvesse esse impedimento, a RNA-polimerase poderia girar sobre a fita de DNA e não haveria nem compactação e nem relaxamento da fita e, consequentemente, não haveria formação das supertorções.

Referência: Liu LF e Wang JC (1987) Supercoiling of the DNA template during transcription. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 84, 7024-7027.

6-6 A fosforilação do CTD permite o início da transcrição, pois libera a RNA-poli-merase das outras proteínas, fazendo com que ela possa movimentar-se sobre a fita-molde. Ao ocorrer a fosforilação do CTD, e a consequente dissociação destas proteínas, criam-se as condições para que um outro grupo de proteínas se asso-cie à RNA-polimerase. Estas novas proteínas associadas à RNA-polimerase são de extrema importância para o processamento da fita de RNA que está sendo sin-tetizada, e entre as funções que desempenham pode-se citar o capeamento da extremidade 5’, o splicing de íntrons e a poliadenilação da extremidade 3’.

6-7 Para responder esta questão, deve-se inicialmente considerar que a fase de leitura de qualquer um dos transcritos maduros originados é dada pelo éxon 1. Assim, seja qual for a sequência ou o número de nucleotídeos dos demais éxons, impre-terivelmente a fase de leitura já estará estabelecida quando a maquinaria de tra-dução alcançar um ponto determinado qualquer. As afirmações A e B “podem” ser verdadeiras, mas não são “obrigatoriamente” verdadeiras. Tanto no caso dos éxons 2 e 3 quanto no caso dos éxons 7 e 8, o importante é que a fase de leitura de-finida não seja alterada, visto que a sequência proteica deve ser a mesma para os segmentos do mRNA que correspondem aos éxons 1 e 10. Assim, se for utilizado o éxon 2 ou o éxon 3 (ou o 7 versus o 8), o importante é que a “entrada” no éxon a seguir respeite a fase de leitura normal (ou padrão) para aquele éxon, e isso só poderá ocorrer seguindo-se obrigatoriamente a afirmação C, ou seja, os éxons al-ternativos devem possuir um número de nucleotídeos que, quando dividido por três (o número de nucleotídeos em um códon), apresente o mesmo resto. Pode-se testar este exercício visto que a sequência do gene da -tropomiosina é conhe-cida: tanto o éxon 2 quanto o éxon 3 contêm o mesmo número de nucleotídeos (126), que é divisível por três, sem resto, e portanto permitem a entrada no éxon seguinte na mesma fase. Os éxons 7 e 8 também contêm o mesmo número de nucleotídeos, que dividido por três fornece um resto igual a um. Conforme salien-tado anteriormente, apesar de conterem o mesmo número de nucleotídeos (o que parece dar razão à resposta A), este fato não é obrigatório. Se o éxon 2 tivesse 126 nucleotídeos e o éxon 3 possuísse 129 nucleotídeos, a entrada no éxon seguinte ocorreria na mesma fase de leitura.

6-8 Como está sendo considerado que todas as mutações envolvem uma única altera-ção nucleotídica, consultando uma Tabela do código genético pode ser concluído que só os seguintes códons poderiam estar envolvidos: GUG para valina, GCG para alanina, AUG para metionina e ACG para treonina. Para que houvesse isola-mento de um mutante valina para treonina em um único passo, seria necessário que dois nucleotídeos adjacentes sobre o códon GUG (valina) fossem alterados (o primeiro G para A e o U para C), originando o ACG que codifica para treoni-na. Deve ser considerado que, apesar de estarmos trabalhando com mutagênese induzida, cada uma das alterações, individualmente, é resultante de um evento relativamente pouco frequente e que, portanto, a ocorrência de dois eventos de mutação em dois nucleotídeos adjacentes seria ainda menos frequente; ou seja, um duplo mutante deve ser bastante raro.

6-9 A tradução depende do encaixe dos tRNAs carregados no sítio adequado, encaixe este determinado pelo pareamento correto entre códon e anticódon. O EF-Tu po-siciona um tRNA-aminoacil (o tRNA carregado) no sítio aceptor do ribossomo e sofre hidrólise do GTP ligado, o que faz com que ele deixe o sítio, abandonando o tRNA-aminoacil. Como a taxa de hidrólise do GTP é mais rápida quando um pa-reamento códon-anticódon correto está formado, se um tRNA-aminoacil pareado incorretamente encontra-se no sítio aceptor, o GTP do EF-Tu demora mais tempo


Capítulo 6 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína 25

para ser hidrolisado e, consequentemente, há uma maior possibilidade de que o tRNA-aminoacil deixe o sítio aceptor sem que tenha depositado ali sua carga. Este é, portanto, o primeiro momento de parada para controle da exatidão da síntese. O segundo momento refere-se ao tempo existente entre a dissociação do EF-Tu e a acomodação completa do tRNA no sítio A. Este intervalo também é menor quando há um pareamento correto entre códon-anticódon. Assim, tRNAs con-tendo um pareamento correto se acomodam no sítio A mais rapidamente (devido ao maior número de ligações de hidrogênio entre códon-anticódon), enquanto tRNAs pareados incorretamente apresentarão um maior potencial para a disso-ciação.

6-10 As proteínas normais e adequadamente dobradas possuem a maior parte dos aminoácidos hidrofóbicos no interior de sua estrutura, distante da água. É pos-sível encontrar proteínas com porções hidrofóbicas expostas, mas em geral estas proteínas correspondem a subunidades cuja formação de complexos com outras subunidades leva ao sequestro dos aminoácidos hidrofóbicos. Como geralmente não se encontram porções hidrofóbicas extensas na superfície de proteínas nor-mais (o que parece ser bastante lógico devido à necessidade de constante intera-ção das proteínas com seu microambiente), a presença deste tipo de região indi-ca que algo está errado na conformação da proteína em questão. Diversas são as possíveis razões para a presença de porções hidrofóbicas extensas na superfície de uma proteína, tais como um dobramento incorreto devido à síntese truncada da proteína ou a ocorrência de degradação ou outro incidente após sua saída do ribossomo. Pode-se imaginar também que esta é uma subunidade que ainda não encontrou seu par, seja devido a algum desequilíbrio na taxa de expressão das diferentes subunidades de um dado complexo proteico ou devido à incapacidade de interação com a subunidade adequada. Seja qual for a razão, estas proteínas serão identificadas pelas chaperonas.

6-11 As chaperonas são proteínas que desempenham uma atividade biológica pela interação com outras moléculas e consequentemente também devem ser dobra-das sob uma conformação específica e adequada para seu funcionamento. Como qualquer outra proteína, as chaperonas também são sintetizadas nos ribossomos. Quando uma proteína está sendo sintetizada nos ribossomos, ela entra em con-tato com as chaperonas Hsp70 e semelhantes a Hsp60, que as auxiliam a adotar um dobramento correto. As chaperonas que se encontram nos ribossomos não selecionam as moléculas que irão auxiliar de acordo com a função que eventual-mente desempenharão (seria impossível para as proteínas desempenharem suas funções no ribossomo, mesmo antes de estarem adequadamente dobradas). As-sim, sejam quais forem as moléculas que estão sendo sintetizadas (mesmo chape-ronas), elas serão auxiliadas no processo de dobramento por chaperonas Hsp70 e semelhantes a Hsp60 adequadamente dobradas que já estão presentes. Um im-portante ponto a salientar é que, na divisão celular, as células-filhas devem herdar uma certa quantidade de moléculas chaperonas funcionais da célula original para que possam dar seus primeiros passos no processo de síntese de proteínas ade-quadamente dobradas.

6-12 O RNA é capaz de atuar tanto no estoque da informação genética, atividade que ainda desempenha em certos organismos, como determinados vírus, quanto na catálise de reações químicas, atividade representada pelas ribozimas. Ou seja, o RNA apresenta características que o aproximam tanto do DNA quanto das proteí-nas. O somatório destas características nos permite imaginar um processo original de duplicação de moléculas de RNA que aliasse a atividade catalítica à manutenção desta informação (referente à capacidade catalítica) nas moléculas-filhas. A con-tinuidade deste processo de duplicação, a geração de novas moléculas-filhas e a incorporação de novas informações representariam os passos iniciais da evolução da vida naquele que é chamado o “mundo de RNA”. Como ainda hoje moléculas de RNA podem ser observadas atuando como catalisadoras de diferentes reações fundamentais nas células, esta proposta é bastante atraente e parece viável.

Apesar de poder estocar informação, o RNA é uma molécula muito mais frá-gil que o DNA. Geralmente composta por uma fita simples, a molécula de RNA é mais sensível a lesões do que o DNA. No RNA, o grupo hidroxila no carbono 2 do


26 Capítulo 6 Como as Células Leem o Genoma: Do DNA à Proteína

açúcar ribose é um agente para a catálise da ligação fosfodiéster 3’-5’, que une os nucleotídeos adjacentes. Como o DNA usa desoxirribose, escapa deste mecanis-mo de quebra da cadeia. Além disso, como a hélice dupla do DNA é composta por duas fitas complementares, no caso de lesão ou mesmo de incorporação de um nucleotídeo errôneo durante o processo de duplicação do DNA, há a possibilida-de de que estes danos sejam reparados eficientemente pela comparação com a sequência da fita complementar. A própria composição de bases do DNA torna-o mais eficiente como estoque mais estável de informação. O uso de timina no DNA (no RNA é usada a uracila) estabelece uma proteção contra os efeitos da deamina-ção. A deaminação de T dá origem a uma base anormal (metil C), que é facilmente identificada como estranha aos ácidos nucleicos, ao passo que a deaminação de U dá origem a um C, que é uma base normalmente presente.

6-13 O sistema de complementaridade reversa faz com que uma molécula comple-mentar a este RNA possua uma sequência que formará um grampo bastante se-melhante ao desta molécula, como ilustrado na Figura R6-1.

As estruturas destas duas moléculas em grampo serão bastante semelhantes, sendo idênticas nas regiões de fita dupla que envolvem pareamentos de base GC e AU tradicionais. As regiões de fita simples seriam distintas entre as duas molé-culas em grampo. Além dos pareamentos tradicionais de base (GC e AU), no RNA pareamentos GU também podem estar presentes e são estáveis. Desta forma, a molécula complementar à sequência de RNA que foi dada nesta questão formaria um grampo com um pareamento a mais do que o grampo da molécula original. Essa diferença está representada na Figura R6-1.

5’

5’3’

5’

3’

3’5’

G

GCACUCCGUCGGCAUGCCGUGAGGCAGCCGUACG

C C C

CU

G

G G

AC U

A CC G U

G C C C

C

G

G G

A

C G

G

A

AGU

U

3’

Figura R6-1 Estruturas em grampo formadas por uma fita de RNA, cuja se-quência foi dada na Questão 6-13, e sua fita complementar (sequência inferida a partir da sequência de RNA original for-necida). Na parte central da figura estão ilustradas as sequências de RNA de fita simples (emparelhadas para evidenciar sua complementaridade), e acima e abaixo estão ilustradas as respectivas estruturas em grampo derivadas. O pa-reamento incomum GU na estrutura em grampo, abaixo do dúplex, está salien-tado em um quadro tracejado.


Controle da Expressão Gênica 7 7-1 Verdadeiro. Tanto o motivo hélice-alça-helice quanto o motivo zíper de leucina

são motivos estruturais que permitem a formação de dímeros de proteínas regu-ladoras, de maneira que cada subunidade do par possa se posicionar no sulco maior da cadeia de DNA.

7-2 Falso. Apesar de existirem numerosos exemplos de rearranjos reversíveis como mecanismo regulador em procariotos, não existem evidências de que o mesmo ocorra em mamíferos.

7-3 Verdadeiro. Nas regiões não metiladas do genoma, a deaminação espontânea da citosina em uracila pode ser prontamente reconhecida e reparada. No entanto, a deaminação da base 5-metil-citosina origina uma timina, uma base de ocorrência normal no DNA, o que dificulta o reconhecimento deste dano pela maquinaria de reparo celular. Consequentemente, dinucleotídeos CG metilados foram elimina-dos da linhagem germinativa durante a evolução, deixando as chamadas “ilhas CG” associadas às sequências de promotores ativados.

7-4 Cada fosfato adicionado altera a carga da proteína em uma unidade, mas tem pou-co efeito sobre a sua massa molecular. Como consequência, as proteínas que di-ferem apenas no número de fosfatos adicionados irão apresentar a mesma massa, mas diferentes pontos isoelétricos, formando um conjunto de bandas horizontais, conforme mostrado na Figura R7-1. É importante ressaltar que um conjunto de bandas horizontais não prova que estas proteínas estejam relacionadas por fos-forilação; podem ser proteínas de mesma massa molecular e pontos isoelétricos distintos. Para resolver este problema, é possível tratar as amostras com fosfatase antes da separação por eletroforese.

7-5 A expressão gênica de células concerosas varia em apenas alguns oncogenes e genes supressores de tumores. Comparando a abundância de centenas a milha-res de mRNAs, como ocorre nos microarranjos de DNA, os padrões de expressão dos genes não alterados (a grande maioria) permitem a identificação do tecido de origem do câncer.

7-6 Sob condições específicas (mesma concentração de DNA e de proteínas regulado-ras), uma proteína encontrará o seu sítio de reconhecimento com a mesma eficá-cia no núcleo de uma célula eucariótica e no interior de uma bactéria. Considere o volume do núcleo de uma célula eucariótica, que é diretamente comparável ao interior de uma bactéria. Nestes volumes aproximados, a habilidade de uma pro-

Figura R7-1 Proteínas em um gel bidi-mensional que podem diferir entre si apenas pelo número de fosfatos ligados (Resposta 7-4). Um pequeno conjunto de bandas horizontais, que pode es-tar relacionado por fosforilação, está destacado. Nem todos os conjuntos de proteínas estão indicados.

men

or

ácido básico

mai

or


28 Capítulo 7 Controle da Expressão Gênica

teína reguladora de encontrar o seu sítio de ligação é equivalente. Desde que as concentrações de DNA e de proteínas reguladoras sejam as mesmas, o volume total da célula não fará diferença.

Referência: Ptashne M (1986) A Genetic Switch: Gene Control and Phage λ, p. 114. Oxford, UK: Blackwell Scientific Press.

7-7 A. Algumas das moléculas de RNA-polimerase desviaram do fluxo principal, pois

se ligam ao DNA e deslizam antes de se desligarem e retornarem ao fluxo prin-cipal das moléculas. Esta ligação não deve ser específica, pois as moléculas de RNA-polimerase se deslocam por longas distâncias de DNA. Algumas regiões da molécula de RNA-polimerase, normalmente envolvidas na ligação a sequências promotoras, também estão envolvidas no seu deslocamento pela cadeia de DNA, pois esta ligação não específica é eliminada quando a RNA-polimerase encontra uma região da cadeia de DNA que contenha uma sequência promotora forte.

B. O deslocamento ao longo da cadeia de DNA permite que proteínas que se ligam ao DNA em locais específicos possam encontrar seus alvos muito mais rapida-mente do que seria esperado através de uma difusão tridimensional, pois reduz a dimensão de busca pela região de ligação para apenas uma. Acredita-se que a maior parte das proteínas que se liga ao DNA em locais específicos acelere a sua ligação por deslocamento pela cadeia de DNA e transferência entre segmentos da cadeia.

C. Se as sequências-alvo estiverem presentes em moléculas curtas de DNA, o tempo de busca por estas sequências será lento e muito próximo ao de uma busca tridi-mensional. Por outro lado, se estas sequências-alvo estiverem presentes em lon-gas moléculas de DNA, esta busca será acelerada pelo processo de deslocamento. Desta forma, proteínas que se ligam ao DNA em locais específicos encontrarão seus alvos mais rapidamente em uma população de longas moléculas de DNA.

Referências: Kabata H, Kurosawa O, Arai I, Washizu M, Margarson SA, Glass RE e Shimamoto N (1993) Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science 262, 1561-1563.

Shimamoto N (1999) One-dimension diffusion of proteins along DNA. J. Biol. Chem. 274, 15293-15296.

7-8 Um conjunto de células especializadas, localizadas no hipotálamo – as células do núcleo supraquiasmático (SCN, do inglês suprachiasmatic nucleus) – regula o ritmo circadiano. Estas células recebem estímulos da retina, não dos cones e bas-tonetes – as células responsáveis pela percepção da luz – mas sim de um subcon-junto de células do gânglio da retina, que também respondem à luz. Estes sinais originados na retina chegam às células do SCN, fornecendo informações sobre o ciclo de claro e escuro. Nas pessoas completamente cegas, estas informações do ciclo claro e escuro não chegam ao SCN, e estas células funcionam então em um ritmo próprio, um pouco mais longo que 24 horas, não reguladas por estímulos externos. Pessoas cegas normalmente apresentam períodos de insônia ou de sono durante o dia, consequência de oscilações no ritmo circadiano.

Referência: Sack RL, Brandes RW, Kendall AR e Lewy AJ (2000) Entrainment of free-running circadian rhythms by melatonin in blind people. N. Engl. J. Med. 343, 1114-1116.

7-9 Estes resultados indicam que a síntese tecido-específica da ApoB100 nas células do fígado e da proteína ApoB48 nas células do intestino é resultado da diferença no processamento dos transcritos de RNA. Os resultados apresentados na Tabela Q7-1 (p. 498 da obra) mostram que o DNA oriundo do fígado e do intestino apre-senta a sequência oligo-Q, mas não a sequência oligo-STOP. Portanto, as diferen-ças observadas nos tecidos não podem resultar da presença de genes indepen-dentes. Como o mRNA ApoB do intestino apresenta um códon de parada onde o mRNA ApoB do fígado apresenta um códon da glutamina, as duas moléculas de mRNA não codificam a mesma proteína. As proteínas ApoB48 e ApoB100 não estão relacionadas por clivagens tecido-específicas. Um destes dois tecidos altera


Capítulo 7 Controle da Expressão Gênica 29

um nucleotídeo específico durante a expressão do gene ApoB. Os resultados da Tabela Q7-1 mostram que as sequências complementares de nucleotídeos com o códon de terminação (oligo-STOP) estão presentes apenas no RNA intestinal. Portanto, o intestino altera especificamente um nucleotídeo na sequência do transcrito, o que marca uma das primeiras descobertas do processo de edição de sequências de RNA.

Referências: Powell LM, Wallis SC, Pease RJ, Edwards YH, Knott TJ e Scott J (1987) A novel form of tissue-specific RNA processing produces apolipoproteins-B48 in intestine. Cell 50, 831-840.

Chen S-H, Habib G, Yang CY, Gu ZW, Lee BR, Weng S-A, Silbermann SR, Cai S-J. Deslypere JP, Rosseneu M, Gotto AM, Li W-H e Chan L (1987) Apolipoprotein B-48 is the product of a messenger RNA with an organ-specific in-frame stop codon. Science 238, 363-366.



Manipulação de Proteínas, DNA e RNA 8 8-1 Falso. Um anticorpo monoclonal reconhece um sítio antigênico específico, mas

isso não significa que ele se ligará apenas a uma proteína específica. Os sítios an-tigênicos podem ser similares, mas não idênticos, podendo ligar o anticorpo com afinidades diferentes. Também não é incomum que diferentes proteínas tenham uma mesma sequência de 5 a 6 aminoácidos na sua superfície, ou seja, o mesmo sítio antigênico.

8-2 Falso. Nenhum instrumento é capaz de detectar menos do que uma molécula, ou seja, 1,7 yoctomol. Um yoctomol equivale a 0,6 molécula.

Referência: Castagnola M (1998) Sensitive to the yoctomole limit. Trends Bio-chem. Sci. 23, 283.

8-3 Falso. A determinação das velocidades de associação e dissociação permite o cál-culo da constante de ligação por SPR, K = koff/kon

8-4 Verdadeiro. Se cada ciclo duplica a quantidade de DNA, então 10 ciclos equivalem a 210 amplificações, 20 ciclos a 220 e 30 ciclos a 230.

8-5 A tripsina é uma protease que cliva a maioria das proteínas. A colagenase é es-pecífica para o colágeno e o EDTA quela Ca2+, que é necessário para manter as caderinas unidas nas ligações entre as células. O tratamento não mata as células, pois os danos ocorrem nos componentes extracelulares que as células podem res-tabelecer.

8-6 Sim. Normalmente isso é feito pela introdução de anticorpos de uma espécie em uma segunda espécie, por exemplo, injetando anticorpos de camundongo em co-bras. Também é possível obter anticorpos contra anticorpos em uma mesma es-pécie. Nesse caso, a maior parte das moléculas injetadas será reconhecida como própria, mas a porção da molécula de anticorpo que se liga ao antígeno, idiotipo, poderá desencadear uma resposta imune.

8-7 A velocidade de sedimentação serve para separar componentes por tamanho ou forma. Durante a centrifugação, os componentes se moverão através de um gra-diente (normalmente de sacarose) de acordo com seu tamanho e forma. O equilí-brio de sedimentação separa os componentes por sua densidade de flutuação. Os componentes são centrifugados em um gradiente de sacarose até atingirem sua densidade de equilíbrio. Para separar duas proteínas de diferentes tamanhos a velocidade de sedimentação seria mais indicada.

8-8 A velocidade de sedimentação depende do tamanho e da forma da proteína. Como a hemoglobina tem uma forma mais esférica comparada com a forma mais alongada da tropomiosina, a hemoglobina tende a sedimentar mais rapidamente por sofrer uma menor resistência. A analogia deste efeito pode ser demonstrada como duas folhas de papel idênticas, uma amassada e outra enrolada. Deixando-as cair, a folha amassada atingirá mais rapidamente o chão do que a enrolada, o que é fundamentado pelos mesmos princípios.

8-9 A. Como mostrado na Figura R8-1A, no início o DNA está distribuído uniformemen-

te na solução de CsCl de densidade uniforme. Após a centrifugação, o CsCl é em-purrado para baixo no tubo, formando um gradiente linear em equilíbrio (Figura


32 Capítulo 8 Manipulação de Proteínas, DNA e RNA

R8-1B), onde o DNA vai se concentrando na sua densidade de flutuação, forman-do uma banda.

B. No centro do tubo de centrifugação, a densidade da solução de CsCl se iguala à densidade média. Como o DNA forma uma banda próximo ao centro, sua densi-dade de flutuação é de cerca de 1,71 g/mL.

C. A espessura da banda no gradiente de CsCl pode ser influenciada pela velocidade de centrifugação. Quanto mais alta a força centrífuga, mais estreita é a banda. A expessura também pode ser influenciada pela composição dos nucleotídeos. Nes-se experimento, os fragmentos possuem composições diferentes, cada uma com uma densidade levemente diferente, contribuindo para a espessura da banda ob-servada. Além desses dois fatores, ainda existe a difusão do DNA.

Referência: Meselson M e Stahl FW (1958) The replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 44, 671-682.

8-10 A tecnologia do hibridoma é bastante trabalhosa e demorada. A técnica de adi-cionar um epítopo marcador e depois usar um anticorpo comercial é muito mais simples. A adição do epítopo na extremidade terminal N ou C da proteína normal-mente é compatível com a sua função.

8-11 Como mostrado abaixo para células de mamíferos, 100 μg/mL correspondem a 5 � 105 células de mamíferos e 5 x 108 células bacterianas.

células�

100 g�

mL�

célula�

mg�

(104 m)3

�cm3

gel gel 200 mg 1.000 m3 1.000 g (cm)3 mL

� 5 � 105 células/gel

Existem 5 � 1010 proteínas de 120 kD em uma banda de 10 ng.

moléculas�

10 ng�

nmol�

6 � 10 14 moléculas

banda banda 120.000 ng nmol

� 5 � 1010 moléculas/banda

Assim, se forem detectadas 5 � 1010 proteínas em uma banda e aplicado o equiva-lente a 5 � 105 células de mamíferos por gel, então deve haver 105 cópias da pro-teína por célula (5 � 1010/5 � 105) para que ela seja detectada como uma banda em um gel corado com prata. Para uma célula bacteriana, deve haver 100 cópias da proteína por célula (5 � 1010/5 � 108).

8-12 O iniciador 1 hibridizará com a fita inferior e realizará a síntese para a direita, en-quanto o iniciador 8 hibridizará com a fita superior e realizará a síntese para a esquerda. Os iniciadores 2, 3, 6 e 7 não hibridizariam com as fitas. Os iniciadores 4 e 5 hibridizariam, mas sintetizariam as fitas para as direções erradas.

8-13 Um fragmento de fita dupla de DNA do tamanho correto é gerado no terceiro ciclo da reação de amplificação (Figura R8-2).

8-14 Uma mutação de ganho de função normalmente é dominante, pois muitas vezes tem uma consequência fenotípica mesmo quando a proteína está presente em apenas metade da concentração da proteína do tipo selvagem. Essas mutações podem aumentar a atividade da proteína tornando-a ativa em momentos inapro-

Figura R8-1 Sedimentação de equilí-brio do DNA em uma solução de CsCl (resposta 8-9). (A) Densidade do CsCl e distribuição do DNA no início do experi-mento. (B) Densidade de distribuição do CsCl e DNA em equilíbrio.

(A) CONDIÇÃO INICIAL (B) APÓS CENTRIFUGAÇÃO

Den

sida

de d

o C

sCl 1,76

1,70

1,64 DNA

CsCI

CsCI


Capítulo 8 Manipulação de Proteínas, DNA e RNA 33

priados. Uma mutação dominante negativa é dominante, pois um único alelo de-fectivo é capaz de determinar o fenótipo, ou seja, mesmo na presença de um alelo normal, o produto gênico mutante interfere com a função do produto normal, causando uma perda de função.

8-15 Com certeza, assim como ocorreu com outras enfermidades, se a doença não exis-tisse, o papel da insulina e de outras proteínas não seria notado e a identificação e o seu papel na fisiologia não seriam tão bem estudados.

Figura R8-2 Os produtos de PCR ge-rados durante os três primeiros ciclos (Resposta 8-13). O DNA que foi sinteti-zado durante um ciclo está mostrado como uma linha em cinza. As posições dos iniciadores nos produtos novos e velhos estão indicadas. Os primeiros produtos com tamanho correto estão dentro do retângulo no ciclo 3.

5’

5’

5’

3’

3’

3’

PRIMEIRO CICLO DA PCR

SEGUNDO CICLO

TERCEIRO CICLO



Visualização de Células 9 9-1 Falso. Os cromossomos humanos condensados tem mais de 1 μm de largura, sen-

do possível visualizá-los por microscopia de contraste de fase ou por contraste de interferência diferencial Nomarski.

9-2 Verdadeiro. Comprimentos de onda mais longos correspondem a uma energia mais baixa, que ocorre durante a absorção e re-emissão.

9-3 Verdadeiro. Um feixe de laser pode ser focado com precisão, e assim ativar molé-culas encarceradas em um determinado momento e local preciso na célula.

9-4 As lentes de imersão no óleo aumentam a largura do cone de luz que alcança a objetiva, o que é uma limitação-chave na resolução.

9-5 A principal refração no olho humano ocorre na interface entre o ar e a córnea. As lentes servem como um ajuste fino para o foco, por causa das pequenas diferenças no índice de refração entre a córnea e as lentes e entre as lentes e o humor vítreo.

9-6 Como o índice de refração da água é muito próximo ao da córnea, a principal for-ça refratária da córnea é eliminada. Óculos melhoram a visão embaixo da água, pois colocam ar em frente da córnea, restaurando a diferença normal nos índices refratários nessa interface.

9-7 Resolução se refere à habilidade de ver dois objetos pequenos como entidades se-paradas, e magnificação se refere ao tamanho da imagem em relação ao tamanho do objeto.

9-8 Ambos os tipos de anticorpos secundários amplificam o sinal inicial, mas a am-plificação por anticorpos que carregam enzimas ligadas pode ser até 1.000 vezes mais eficiente e mais sensível.

9-9 GFPs mutantes foram geradas com diferentes aminoácidos em torno do cromófo-ro, o que influencia a capacidade do cromóforo de interagir com a luz. O compri-mento de onda no qual o cromóforo é excitado e no qual ele emite fluorescência depende do seu ambiente molecular.

Referência: Service RF (2004) Immune cells speed the evolution of novel protein. Science 306, 1457.

9-10 O aumento na FRET depende da fosforilação da proteína, uma vez que nenhum aumento ocorre na ausência de proteína Abl ou ATP, ou quando o fosfato é remo-vido por uma tirosina-fosfatase. Assim, a fosforilação deve fazer com que CFP e YFP se aproximem. Uma possível explicação é que a adição de um fosfato à tiro-sina no substrato permite que o segmento da proteína se dobre para se ligar ao domínio adjacente de ligação da fosfotirosina, diminuindo a separação dos domí-nios CFP e YFP (Figura R9-1).

9-11

Resolução �0,61 λn sin θ

sin θ �0,61 (0,004 nm)

(0,1 nm)

θ � arcsin 0,0244 = 1,4°


36 Capítulo 9 Visualização de Células

θ = 1,4° é cerca de 43 vezes (60°/1,4°) menor do que o θ para um microscópio óptico típico.

9-12 Estruturas protuberantes lançam uma sombra atrás delas mesmas, enquanto que depressões não. Como mostrado na Figura R9-2, na microscopia a sombra parece mais brilhante pela ausência de metal.

Figura R9-1 Alteração conformacional na proteína repórter FRET após fosfori-lação da tirosina (Resposta 9-10).

CFP

YFP

YFP

CFP

(A) NÃO FOSFORILADA

434 nm

476 nm

526 nm

434 nm

Substrato

Proteína de ligação à

fosfotirosina

Cinase + ATP

fosfatase

(B) FOSFORILADA

FRET

P

depressões

protuberâncias

Figura R9-2 Protuberâncias e depres-sões podem ser distinguidas, pois as protuberâncias lançam sombras (Res-posta 9-12).


Estrutura da Membrana 10 10-1 Verdadeiro. Embora os fosfolipídeos difundam rapidamente no plano da membra-

na, os seus grupos polares não podem passar facilmente através do centro hidro-fóbico da bicamada, limitando a sua difusão nessa dimensão. Assim, este evento ocorre muito raramente, e tipos específicos de moléculas lipídicas inseridas em uma monocamada ali permanecem, a menos que sejam transferidos ativamente por translocadores de fosfolipídeos.

10-2 Falso. Nos compartimentos internos, os carboidratos das membranas internas também estão voltados para o interior da bicamada, em direção ao lúmen do compartimento limitado por membrana.

10-3 Falso. As células ajustam a fluidez de suas membranas por meio da modificação dos lipídeos que as compõem. Exemplos clássicos incluem as balsas lipídicas e as membranas apicais de células epiteliais polarizadas.

10-4 Qualquer ruptura na bicamada cria uma ponta exposta à água. Como isso é ener-geticamente desfavorável, as moléculas da bicamada rompida se arranjarão de forma espontânea para eliminar a extremidade livre, pois a conformação de bica-mada é mais favorável energeticamente do que a de micelas.

10-5 Este processo converte ácido graxo insaturado em saturado, já que ocorre redução das ligações duplas por hidrogenação. O óleo vegetal é convertido em margarina porque as cadeias de ácidos graxos das moléculas lipídicas ficam bem próximas umas das outras, aumentando a viscosidade. A margarina é feita a partir de óleos vegetais hidrogenados, cujas ligações duplas foram removidas pela adição de áto-mos de hidrogênio, tornando-a mais sólida à temperatura ambiente.

10-6 Uma balsa lipídica composta somente por lipídeos deverá possuir 19.000 molécu-las de lipídeos por monocamada, portanto 38.000 moléculas por balsa. O cálculo é feito considerando que uma balsa de 70 nm de diâmetro tem aproximadamente 3,8 � 103 nm2 de área (3,14 � 352) e uma molécula lipídica de 0,5 nm de diâmetro tem 0,2 nm2 (3,14 � 0,252). Logo, o número de moléculas é dado por 3,8 � 103/0,2. Cerca de 760 proteínas deverão estar presentes nessa mesma balsa (38.000/50).

10-7 A. Ocorre que o fosfolipídeo 1 está mais acessível ao ascorbato que o fosfolipídeo 2,

sendo reduzido mais rapidamente. Mais detalhadamente, o radical nitróxido do fosfolipídeo 1 está na cabeça hidrofílica que, por sua vez, está em contato direto com o meio extracelular. Essa proximidade propicia uma rápida reação com o as-corbato. Já o radical nitróxido do fosfolipídeo 2 encontra-se ligado à cadeia de áci-do graxo, estando parcialmente enterrado no interior da membrana e, portanto, menos acessível ao ascorbato.

B. Percebe-se que não há alteração no perfil da perda de sinal da ESR dos eritrócitos fantasmas, com relação à ausência ou presença de ascorbato, em comparação ao perfil dos eritrócitos normais. É provável que exista algum agente redutor no ci-toplasma dos eritrócitos normais que seja capaz de reduzir o fosfolipídeo 1 (mais exposto), mas não o fosfolipídeo 2 (menos exposto). Em resumo, nos eritrócitos normais, o fosfolipídeo 2 fica estável na ausência de ascorbato e o fosfolipídeo 1 fica instável, pois os fosfolipídeos da monocamanda citoplasmática são expostos ao agente redutor citoplasmático, eliminando metade do sinal.

C. Sim. É possível observar na Figura Q10-3 (p. 649 da obra) que a metade dos fos-folipídeos 2 era sensível ao ascorbato, quantidade esta equivalente ao marcador


38 Capítulo 10 Estrutura da Membrana

presente na monocamada externa; a outra metade era insensível ao ascorbato, indicando sua localização na monocamada citoplasmática. Outro indicativo é o fato de que o fosfolipídeo 1 apresentou uma sensibilidade de 50% para o agente redutor citoplasmático e também para o ascorbato.

Referência: Rousselet A, Guthmann C, Matricon J, Bienvenue A e Devaux PF (1976) Study of the transverse diffusion of spin labeled phospholipids in biological membranes: 1. Human red blood cells. Biochim. Biophys. Acta 426, 357-371.

10-8 A sequência A é a candidata mais provável a formar uma hélice α transmembra-na, visto que é composta principalmente por aminoácidos hidrofóbicos, poden-do, portanto, estar integrada à bicamada lipídica de forma estável. O fato desta sequência conter os aminoácidos polares treonina e serina não é excludente, já que não são incomuns em domínios hélice α. Já a sequência B contém três pro-linas, o que ocasionaria a interrupção da hélice α, expondo os grupos polares ao ambiente hidrofóbico da bicamada lipídica. A sequência C, por sua vez, possui três aminoácidos carregados (ácido glutâmico, arginina e ácido aspártico), que seriam energeticamente desfavoráveis no interior hidrofóbico de uma bicamada lipídica.

10-9 Essa sugestão considerou as diferenças significativas entre vesículas do avesso da membrana plasmática e vesículas da forma normal. Estas últimas carregarão car-boidratos na sua superfície exposta e serão retidas em uma coluna de afinidade de lecitina. O resultado será a eluição apenas das vesículas do avesso.

10-10 Essa associação pode ser mediada por forças de van der Waals, as quais têm papel fundamental em biologia estrutural. Embora sejam relativamente fracas, as forças de van der Waals tornam-se importantes quando duas superfícies macromolecu-lares são complementares e muitos átomos estão envolvidos, pois desta forma são capazes de manter as moléculas unidas.


Transporte de Membrana de Pequenas Moléculas e as Propriedades Elétricas das Membranas

11 11-1 Verdadeiro. O transporte passivo é caracterizado por desconsiderar diferenças

de concentração e gradientes para que íons e moléculas atravessem as membra-nas. Os transportadores, que se ligam a moléculas específicas e sofrem alterações conformacionais, podem transportar passivamente no sentido do gradiente ele-troquímico, ou podem associar estas alterações conformacionais a uma fonte de energia metabólica, como a hidrólise de ATP, para realizar um transporte ativo. Os canais formam poros aquosos que podem ser abertos ou fechados em resposta a diferentes sinais, mas que sempre transportam no sentido do gradiente, ou seja, de forma passiva. Em comparação com os transportadores, os canais interagem muito mais fracamente com o soluto a ser transportado e não sofrem alterações conformacionais que interfiram no transporte. Além disso, os canais são incapa-zes de associar uma fonte de energia ao transporte. Desta forma, os canais não são capazes de “nadar contra a corrente” e limitam-se ao transporte passivo.

11-2 Falso. A saturação dos transportadores é fácil de imaginar, pois eles devem ligar-se à molécula que será transportada e, portanto, sua capacidade de carga é limita-da pela disponibilidade dos sítios de ligação. No caso dos canais, pode-se fazer uma analogia com uma autoestrada interrompida por um túnel estreito através do qual os veículos devem passar em fila única. Apesar de ainda não ser totalmente compreendido como ocorre a passagem dos íons nos canais, acredita-se que íons permeáveis devem esconder a maior parte das moléculas de água associada a eles para poder atravessar, em fila única, a porção mais estreita – o filtro de seletivida-de – do canal. Como no caso do túnel estreito com uma única pista de passagem, esta situação limita a passagem dos íons, e conforme as concentrações iônicas aumentam, o fluxo de íons através do canal também aumenta, até alcançar um nível de saturação devido ao efeito de gargalo da entrada do túnel (lembre-se que a passagem deve ser feita em fila única). Assim, tanto os transportadores como os canais sofrem saturação.

11-3 Verdadeiro. O potencial de membrana, por suas próprias características, é extre-mamente sensível a pequenas flutuações no número de íons. Uma alteração de um número bastante pequeno de íons é suficiente para disparar o potencial de membrana.

11-4 Se as moléculas citadas fossem ordenadas em relação a sua capacidade de difusão através de uma bicamada lipídica, isso resultaria naquela que atravessa mais facil-mente até a que atravessa mais dificilmente:

CO2 (pequena e não polar)etanol (pequena e fracamente polar)H2O (pequena e polar)glicose (grande e polar)Ca2� (pequena e carregada)RNA (muito grande e altamente carregada)

Observe que a sequência da lista é ditada pelo somatório das duas proprie-dades que governam a capacidade de difusão das moléculas através de uma bi-


40 Capítulo 11 Transporte de Membrana de Pequenas Moléculas e as Propriedades Elétricas das Membranas

camada lipídica: tamanho (pequena > grande) e polaridade (não polar > polar > carregada).

11-5 Dois gradientes são determinantes para o equilíbrio de distribuição de uma mo-lécula através de uma membrana: o gradiente químico e o gradiente elétrico, os quais refletem, respectivamente, a concentração da molécula e o potencial de membrana. Ao considerar uma molécula não carregada, nota-se que ela não es-tará sob a ação de um gradiente elétrico e que, portanto, seu equilíbrio de distri-buição depende unicamente da concentração. Neste caso específico, o equilíbrio será alcançado quando a molécula estiver na mesma concentração em ambos os lados da membrana. Uma molécula carregada, no entanto, estará sob a ação dos dois gradientes citados acima e se distribuirá de acordo com esta situação. Se tomarmos os íons K� como exemplo, veremos que, mesmo que haja uma gran-de diferença entre a sua concentração no interior da célula e a sua concentração externa, eles estarão bastante próximos do seu equilíbrio de distribuição através da membrana plasmática. Essa situação ocorre devido ao balanceamento da dife-rença na concentração pelo potencial de membrana (negativo no interior), que se opõe ao movimento de cátions para o exterior da célula.

11-6 A. Sim, eles podem normalizar tanto as concentrações de H� quanto de Na�. Para

cada três ciclos de antiporte Na�-H�, que importa um Na� e exporta um H�, a bomba de Na�-K� cicla uma vez, exportando três íons Na� em cada operação. A cada ciclo da bomba de Na�-K� ocorrerá também hidrólise de ATP. Esta hidrólise de ATP por H2O gera ADP e H2PO4

� (o qual possui um pK de 6,86). Assim, em um pH intracelular de 7,2, aproximadamente 70% serão ionizados em HPO4

2� e H�. Não há necessidade de preocupação com a ocorrência de hidrólise e o conse-quente possível desbalanço das concentrações de H�, pois, em outros pontos da célula, diferentes processos convertem os produtos de hidrólise novamente em ATP e mantêm uma concentração basal.

B. A ação conjunta destas duas bombas promove o aumento tanto da concentração interna de K� quanto do potencial de membrana, pois remove 3H� a cada 2K� que são introduzidos na célula.

11-7 Para calcular o aumento na área de superfície devido à presença de microvilosi-dades, deve-se inicialmente calcular, de acordo com os dados da Figura Q11-1 (p. 693 da obra), as dimensões de cada microvilosidade, considerando que cada uma destas estruturas corresponde a um cilindro de 0,1 m de diâmetro e 1,0 m de altura. A área lateral do cilindro corresponde à área de superfície nova que não estaria presente em um tecido totalmente plano, e o topo do cilindro é equivalen-te à membrana plasmática que estaria presente mesmo que não houvessem mi-crovilosidades. A área dos lados de um cilindro (2�rh, onde r é o raio e h a altura) é de 0,31 m2 (2 � 3,14 � 0,05 m � 1,0 m); a área do topo do cilindro (�r2) é de 0,0079 m2 (3,14 � [0,05] 2). Assim, o aumento na área de superfície para uma microvilosidade é de 0,31 m2/0,0079 m2 ou 40. O valor obtido corresponde à razão entre a área lateral e a área do topo e, portanto, indica um acréscimo da ordem de 40X na área disponível. No entanto, este valor só poderia ser considera-do por completo se as microvilosidades recobrissem totalmente a superfície, sem que houvesse espaçamento entre elas, o que não corresponde à realidade. Ao ob-servar a secção transversal na Figura Q11-1 (p. 693 da obra), pode-se estimar que as microvilosidades ocupam aproximadamente metade da superfície das células intestinais e, portanto, deve-se dividir o valor obtido por dois, chegando à con-clusão que as microvilosidades são capazes de aumentar a área da superfície de contato entre as células do intestino e o lúmen em um fator de aproximadamente 20 vezes.

Referência: Adaptada de Kristic RV (1997) Ultrastructure of the Mammalian Cell, p.207. Berlin, Alemanha: Springer-Verlag.

11-8 Assim como há um paralelo entre um corpo em queda no vácuo e o deslocamento de um íon exposto a um campo elétrico também no vácuo, pode-se fazer um pa-ralelo entre um corpo em queda no ar e o deslocamento de um íon na água. Assim


Capítulo 11 Transporte de Membrana de Pequenas Moléculas e as Propriedades Elétricas das Membranas 41

como um corpo em queda no ar alcança uma velocidade final que é dependente do atrito com as moléculas de ar, um íon na água também sofre a ação do atrito (neste caso, com as moléculas de água) e sua velocidade será limitada por este fator. Um íon na água acelerará por um certo período, calculado como inferior a 10 nanossegundos, antes de atingir sua velocidade final.

11-9 Para calcular a concentração relativa a uma bola neste hemisfério, é necessário inicialmente calcular o volume do hemisfério que pode ser explorado pela bola ligada a uma “corrente” que controla o canal. De acordo com os dados forneci-dos na figura, este hemisfério corresponde a 2,05 � 104 nm3 ([2/3] � 3,14 � [21,4 nm]3), o que corresponde a 2,05 � 10-20 litros ([2,05 � 104 nm3] � [cm/107 nm] 3 � [litro/1.000 cm3]). Uma única bola ocupa este espaço e, portanto, a concentração de uma bola neste volume equivale a 8,13 � 10-5 M ou 81,3 M (1 molécula/2,05 � 10-20 litros) � (mole/6 � 1023 moléculas)]. Assim, a concentração local da bola é aproximadamente a mesma que a concentração de peptídeos livres necessária para inativar o canal.

Referência: Zagotta WN, Hoshi T e Aldrich RW (1990) Restoration of inactivation in mutants of shaker potassium channels by a peptide derived from ShB. Science 250, 568-570.

11-10 Usando a equação de Nernst e os dados apresentados na tabela Q 11-1 (p. 694 da obra), podemos calcular o potencial de membrana esperado devido às diferenças na concentração de K� através da membrana em repouso:

V � 58 mV � logC0

Ci

V � 58 mV � log9 mM

344 mM

V � � 92 mV

O mesmo raciocínio aplicado ao Na� resulta em um valor de �48 mV. De acordo com a questão, o potencial de membrana medido em um axônio gigante de lula intacto (potencial de repouso) é igual a �70 mV, valor este que se aproxima do valor calculado considerando-se apenas o K�. Ainda na questão, é informado que, quando o axônio, suspenso em água do mar, é estimulado para a condução do im-pulso nervoso, o potencial de membrana é transientemente alterado e alcança um valor de �40 mV (potencial de ação). Este valor é bastante semelhante ao obtido quando o potencial de membrana devido apenas ao Na�

é considerado.Para entender estas duas situações (potencial de repouso com valor semelhan-

te ao potencial de membrana considerando-se apenas o envolvimento de K� e potencial de ação com valor semelhante ao potencial de membrana no momento em que se considera apenas o envolvimento de Na�), é preciso lembrar que o K� é responsável majoritariamente pelo potencial de repouso e o Na� é responsável pelo potencial de ação. Uma membrana em repouso é 100 vezes mais permeá-vel ao K� do que ao Na�, pois canais de liberação de K� permitem a saída do K� até que o potencial de membrana seja suficientemente elevado para se opor ao gradiente de concentração de K�. A entrada de Na�compensa a perda de cargas positivas representada pela saída de K� e reduz o gradiente máximo. Se não fosse a bomba de Na�-K�, que continuamente remove Na�, o potencial de repouso da membrana seria completamente dissipado.

O canal de Na� controlado por voltagem, por sua vez, controla o potencial de ação. Quando a membrana é estimulada, há a abertura deste canais, permitindo que íons Na� entrem na célula. A magnitude do potencial de membrana resultan-te é limitada pela diferença nas concentrações de Na� através da membrana. O influxo de Na� reverte o potencial de membrana localmente, o que leva à abertura de canais de Na� adjacentes e, em última instância, faz com que um potencial de ação se propague a partir do sítio de estímulo original.

Referência: Hille B (1992) Ionic Channels of Excitable Membranes, 2a edição, p. 23-58. Sunderland, MA: Sinauer.



Compartimentos Intracelulares e Endereçamento de Proteínas 12 12-1 Falso. O núcleo é circundado por uma membrana dupla (envelope nuclear) e se

comunica com o citosol pelos poros nucleares que atravessam esse envelope. As-sim, o envelope nuclear permite a passagem livre de íons, nucleotídeos e outras pequenas moléculas, fazendo com que sua composição seja muito semelhante à do citoplasma. Já o lúmen do retículo endoplasmático é separado do citosol por uma camada de membrana.

12-2 Verdadeiro. Os ribossomos livres e aqueles ligados à membrana diferem apenas em suas distribuições espaciais. O que define se um ribossomo ficará livre ou liga-do é a presença de uma sequência-sinal na proteína que está sendo sintetizada.

12-3 Falso. O tráfego ocorre pelos poros em ambas as direções e não está claro como os poros coordenam este tráfego para evitar colisões.

12-4 Falso. Todas as células eucarióticas contêm peroxissomos, os quais têm grande importância devido a sua capacidade de degradar compostos tóxicos para a célu-la.

12-5 Falso. Seria verdadeiro se todas as proteínas tivessem a porção N-terminal virada para o citosol. No caso das proteínas que possuem a porção N-terminal voltada para o lúmen, o segundo segmento transmembrana e os demais segmentos pares atuarão como sinais de início de transferência e os segmentos subsequentes ím-pares atuarão como sinais de parada.

12-6 Sem um sinal de distribuição que a direcione para a organela onde é requerida, a proteína permanece no citosol.

12-7 A. Neste caso, em que o sinal de importação ao RE está localizado na região N-ter-

minal da proteína e atua antes que o sinal interno de importação ao núcleo seja sintetizado, a proteína entrará no RE. Uma vez dentro do RE, a sequência-sinal de importação ao núcleo não funcionará mais, pois os receptores citosólicos de importação nuclear estarão ausentes.

B. Como anteriormente, o sinal de importação ao RE atuará antes que o sinal interno de importação ao peroxissomo seja sintetizado. Logo, a proteína entrará no RE e o sinal de importação ao peroxissomo não poderá funcionar.

C. Para que o sinal de retenção no RE pudesse atuar, a proteína deveria possuir tam-bém o sinal de importação ao RE. Portanto, seu destino será a mitocôndria.

D. Neste caso, a proteína iria alternar entre o citosol e o núcleo, pois os sinais respon-sáveis não são excludentes.

12-8 Considerando que, a cada 24 h, o equivalente a uma membrana plasmática tran-sita no RE e que as proteínas de membrana permanecem no RE por 0,5 h, tem-se que, em um dado momento, 0,021 equivalente de membrana plasmática está pre-sente no RE (0,5 h/24 h). Já que a área da membrana plasmática do RE é 20 vezes maior que a área da membrana plasmática, a fração de proteínas de membrana no RE é de 0,001 (0,021/20). Logo, de cada mil proteínas presentes na membrana plasmática do RE, apenas uma está em trânsito para a membrana plasmática.


44 Capítulo 12 Compartimentos Intracelulares e Endereçamento de Proteínas

12-9 A. As cabeças foram as únicas formas que não se acumularam no núcleo quando

injetadas no citoplasma, logo a porção da nucleoplasmina responsável pela loca-lização no núcleo deve estar presente na cauda.

B. Os resultados a partir de nucleoplasmina completa ou de seus fragmentos con-tendo a cauda não são suficientes para distinguir entre difusão passiva e trans-porte ativo; eles apenas mostram que a cauda carrega uma porção importante da nucleoplasmina, podendo ser um sinal de localização ou um sítio de ligação. Já os resultados com as cabeças de nucleoplasmina são mais determinantes e corro-boram contra a possibilidade de difusão passiva. As cabeças não difundem para o citoplasma quando injetadas no núcleo e vice-versa, sugerindo que são muito grandes para passar pelos poros nucleares.

Referência: Dingwall C, Sharnick SV e Laskey RA (1982) A polypeptide domain that specifies migration of nucleoplasmin into the nucleus. Cell 30, 449-458.

12-10 Aproximadamente uma histona deve ser transportada por cada poro nuclear a cada segundo:

n° de moléculas de histona�

32.000.000 octâmeros

�8 histonas

�dia

�1

dia octâmero 8,64 x 104 s 3.000 poros

� 0,99 histonas/segundo/poro

É durante a fase S do ciclo celular que as histonas são sintetizadas e importadas ao núcleo. Esta fase normalmente dura 8 h. Logo, a taxa de transporte fica a 3 histo-nas por segundo e restrita à fase S do ciclo celular.

12-11 A. Isso se deve ao fato de RanQ69L não ser capaz de hidrolisar GTP eficientemente.

Se fosse utilizado Ran-GTP, parte dele seria convertida em Ran-GDP, deixando os resultados inconclusivos. Utilizando uma forma de Ran que não hidrolisa GTP, pode-se assumir que a forma de Ran presente no ensaio será Ran-GTP.

B. A proteína candidata está entre as presentes na canaleta 1, entre 7 kD e 14 kD (ver Figura Q12-3 (p. 747 da obra)), já que o fator de importação nuclear foi eluído a partir da coluna de afinidade por Ran-GDP e não RanQ69L-GTP. Esta, por sua vez, capturou um conjunto de proteínas entre 97 kD e 116 kD que a coluna de Ran-GDP não capturou. Trata-se de receptores de importação nuclear, os quais não possuem envolvimento algum na internalização de Ran-GDP no núcleo.

C. Outra proteína à qual o fator de importação de Ran-GDP liga-se é a NTF2 (Fator de transporte nuclear 2). Após se ligar fortemente a Ran-GDP, a NTF2 se liga às regiões repetidas de FG (fenilalanina-glicina) das nucleoporinas do complexo de poro nuclear. O complexo NTF2-Ran-GDP cursa a trilha de FG até entrar no núcleo, onde Ran-GDP é convertido em Ran-GTP por Ran-GEF. Assim, o com-plexo se desfaz e NTF2 retorna ao citoplasma para trazer uma nova molécula de Ran-GDP.

D. Poderiam ser utilizadas formas de NTF2 contendo mutações em regiões críticas para sua interação com Ran-GDP. Se a proteína portadora de uma substituição de aminoácido impedir a formação do complexo, ela não será mais capaz de pro-mover a captação de Ran-GDP para o núcleo, comprovando sua participação no processo.

Referência: Ribbeck K, Lipowsky G, Kent HM, Stewart M e Görlich D (1998) NTF2 mediates nuclear import of Ran. EMBO J. 17, 6587-6598.

12-12 As células normais com o gene Ura3 modificado não cresceram na ausência de uracila, porque a modificação inserida sinalizava para que Ura3 fosse importada para dentro da mitocôndria. Já as células que são defectivas para a importação mitocondrial são capazes de crescer sem suplementação de uracila, pois o sinal de importação inserido não é interpretado e Ura3 permanece no citosol para par-ticipar da via metabólica de síntese de uracila.


Capítulo 12 Compartimentos Intracelulares e Endereçamento de Proteínas 45

Referência: Maarse AC, Blom J, Grivell LA e Meijer M (1992) MPI1, an essential gene encoding a mithocondrial membrane protein, is possibly involved in protein import into yeast mitochondria. EMBO J. 11, 3619-3628.

12-13 Para que a DHFR possa entrar na mitocôndria, ela precisa desdobrar-se. Ocorre que o metotrexato se liga fortemente ao sítio ativo da enzima, que impede a atua-ção de chaperonas e consequentemente qualquer modificação de conformação.

Referência: Eilers M e Schatz G (1986) Binding of specific ligand inhibits import of a purified precursor protein into mitochondria. Nature 322, 228-232.

12-14 Os poros formados pelas porinas permitem a passagem de todos os íons e inter-mediários metabólicos, porém seu tamanho não comporta proteínas maiores que 10 kD.

12-15 Nas células sem peroxissomos, a catalase está localizada no citosol, como mostra a coloração uniformemente distribuída fora do núcleo (Figura Q12-4B, p. 747 da obra). Nas células normais, a catalase aparece como pequenos pontos, justamen-te por estar internalizada nos peroxissomos.

Referência: Kinoshita N, Ghaedi K, Shimozawa N, Wanders RJA, Matsuzono Y, Imanaka T, Okumoto K, Suzuki Y, Kondo N e Fujiki Y (1998) Newly identified Chinese hamster ovary cell mutants are defective in biogenesis of peroxisomal membrane vesicles (peroxisome ghosts), representing a novel complementation group in mammals. J. Biol. Chem. 273, 24122-24130.

12-16 Se o primeiro segmento hidrofóbico transmembrana fosse convertido em um segmento hidrofílico, o segmento N-terminal ficaria no citosol, pois o primeiro segmento transmembrana que serviria de sinal de início de transferência estaria ausente. No entanto, a eliminação desse sinal não afetaria a função do segundo sinal de transferência, o qual iniciaria a transferência dos segmentos C-terminais, mantendo-os na conformação original da proteína (Figura A12-1).

12-17 A assimetria da membrana plasmática é estabelecida na sua produção. As novas moléculas de fosfolipídeos são sintetizadas pelo RE e liberadas na monocamada citosólica da bicamada lipídica. Para que a membrana cresça por igual, uma parte dos fosfolipídeos recém-sintetizados precisa ser transferida para a camada opos-ta, o que é realizado por enzimas denominadas flipases. Algumas flipases transfe-rem seletivamente moléculas específicas de fosfolipídeos, fazendo com que cada monocamada tenha uma concentração diferente de fosfolipídeos específicos. Na membrana do RE, os fosfolipídeos equilibram-se por meio de um translocador de fosfolipídeo não específico quase cem mil vezes mais rápido que o “flip-flop” espontâneo. Assim, os diferentes tipos de fosfolipídeos ficam simetricamente dis-tribuídos entre as duas lâminas da membrana do RE.

CONFORMAÇÃO ORIGINAL

COOH

NH2

NH2

COOH

Citosol

Lúmendo RE

1 3 5

2 4 6

31 5

42 6

Citosol

Lúmendo RE

NOVA CONFORMAÇÃO

Figura A12-1 Conformação da pro-teína de múltiplas passagens e da nova proteína resultante da transformação do seu primeiro segmento hidrofóbico em um segmento hidrofílico (Resposta 12-16).



Tráfego Intracelular de Vesículas 13 13-1 Verdadeiro. Se não fosse esse padrão de fusão, a topologia das proteínas de mem-

brana não seria mantida e os domínios proteicos poderiam mudar de face (ci-tosólica ou não citosólica) a cada mudança de compartimento. Logo, as lâminas citosólicas das duas bicamadas são sempre as primeiras a entrar em contato e fu-sionar.

13-2 Verdadeiro. As proteínas processadas de forma incorreta e as proteínas diméricas ou multiméricas que tenham falhas de montagem são retidas no RE pela ligação a chaperonas como BiP e calnexina. A interação com as chaperonas retém as proteí-nas no RE até que elas sejam processadas apropriadamente; caso contrário, elas são degradadas.

13-3 Verdadeiro. As cadeias de oligossacarídeos são adicionadas nos lumens do RE e do aparelho de Golgi. Como os lumens em questão possuem topologia equivalen-te à do exterior celular, essas cadeias estarão topologicamente sempre voltadas para o exterior celular.

13-4 Falso. Em células polarizadas, como as epiteliais, o movimento de materiais pode ser em qualquer direção, apical para basolateral, ou ao contrário, dependendo do tipo de carga e do contexto particular do processo.

13-5 O fluxo de membrana entre compartimentos de células que não se dividem é intenso e balanceado para assegurar que mantenham tamanhos relativamente iguais, condição essencial para o funcionamento dessas células. Já em uma célula epitelial do intestino, que está se dividindo ativamente, há síntese de membrana para suprir a montagem dos compartimentos das células-filhas geradas. Assim, haverá um favorecimento do fluxo de saída.

13-6 A própria clatrina não participa na captura de moléculas específicas para trans-porte. Esta é a função de uma segunda classe de proteínas de revestimento – as proteínas adaptadoras – as quais mantêm a capa de clatrina à membrana da vesí-cula e ajudam a selecionar as moléculas a serem carregadas no transporte. As mo-léculas de transporte carregam sinais de transporte específicos, que são reconhe-cidos por receptores de carga localizados na membrana do compartimento. Dessa forma, um conjunto selecionado de moléculas-carga, ligadas aos seus receptores específicos, é incorporado ao lúmen de cada vesícula.

Referências: Kirchhausen T (2000) Clathrin. Annu. Rev. Biochem. 69, 699-727.

Pearse BMF, Smith CJ e Owen DJ (2000) Clathrin coat construction in endocytosis. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 220-228.

13-7 Assim que ocorre a fusão, os complexos trans-SNARE resultantes unem as duas membranas, inativando as v-SNAREs e as t-SNAREs. Quando os complexos são dissociados pela NSF, as v-SNAREs podem permanecer inativadas, ligando-se a proteínas inibidoras. É possível que o acúmulo de v-SNAREs igual ou maior que a população de t-SNAREs nas membranas-alvo seja prevenido por vias de recupe-ração de v-SNAREs que as retornam para a membrana doadora.

13-8 Como abordado na resposta à Questão 13-1, as lâminas citosólicas das duas bica-madas são sempre as primeiras a entrar em contato e fusionar, e todas as SNAREs


48 Capítulo 13 Tráfego Intracelular de Vesículas

ligam-se à superfície citosólica. Os vírus envelopados não podem utilizar as SNA-REs da célula porque precisam fusionar sua superfície externa com a superfície externa da membrana. Por isso, codificam suas próprias proteínas de fusão, as quais são glicoproteínas que contêm uma sequência de aminoácidos com grande número de resíduos hidrofóbicos e glicinas, capaz de interagir com a membrana-alvo, conhecida como peptídeo de fusão.

13-9 Aproximadamente 88 moléculas de água poderiam permanecer entre as mem-branas. Considerando que o cilindro tem um volume de 2,65 � 10–24 (3,14 � [0,75 nm]2 � 1,5 nm) e que a água é 55,5 M, tem-se:

moléculas de água�

2,65 � 10�24

�55,5 mol

�6 � 1023 moléculas

cilindro cilindro L mol

� 88,2

Cerca de 9 fosfolipídeos deveriam estar presentes em cada uma das monocama-das opostas no local da fusão (3,14 � [0,75 nm]2 � [PL/0,2 nm2] � 8,8). Conse-quentemente, haveria em torno de 5 moléculas de água para cada grupo-cabeça hidrofílico, sendo menor do que a quantidade normalmente associada nessas circunstâncias.

Referência: Meuse CW, Krueger S, Majkrezak CF, Dura JA, Fu J, Connor JT e Plant AL (1998) Hybrid bilayer membranes in air and water: infrared spectroscopy and neutron reflectivity studies. Biophys. J. 74, 1388-1398.

13-10 No experimento 1, a alta atividade de fosfatase alcalina foi gerada porque as vesí-culas de cada linhagem carregavam tanto v-SNAREs quanto t-SNAREs. No caso de alguma das vesículas não possuir v-SNAREs ou t-SNAREs, a atividade reduz para 30-60%, como pode ser visto nos experimentos 3, 4, 6, 7, 8 e 9. Nos experimentos 2 e 5, nos quais ambas as vesículas não apresentam v–SNAREs ou t-SNAREs, res-pectivamente, a atividade da fosfatase é tão baixa quanto a detectada para uma vesícula que não possui as duas SNAREs (experimentos 10 e 11). Logo, na fusão de vesículas vacuolares, não é importante qual tipo de SNARE está em que vesícula, e sim que a vesícula correspondente esteja portando uma SNARE complementar.

Referência: Nichols BJ, Undermann C, Pelham HRB, Wickner WT e Haas A (1997) Homotypic vacuolar fusion mediated by t-and v-SNAREs. Nature 387, 199-202.

13-11 Sem o sinal de recuperação, a PDI seria enviada para fora da célula. Isso aconte-ceria porque o fluxo de PDI do RE para o Golgi seria unicamente de ida – devido à ausência do sinal de recuperação – e, a partir do Golgi, a PDI seria secretada assim como o restante das proteínas que não possuem sinal de localização.

Referência: Munro S e Pelham HR (1987) A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell 48, 899-907.

13-12 O receptor tem uma alta afinidade pela sequência KDEL nos agrupamentos tu-bulares das vesículas e do aparelho de Golgi, de forma que captura proteínas resi-dentes no RE que escaparam ou que estejam presentes em baixas concentrações, e apresenta uma baixa afinidade pela sequência KDEL no RE, para descarregar a carga, apesar da altíssima concentração de proteínas residentes do RE que contêm KDEL. Acredita-se que este controle de afinidade esteja relacionado às diferentes condições iônicas e de pH estabelecidas nos diferentes compartimentos.

Como mencionado anteriormente, o receptor de KDEL tem como principal função capturar proteínas que escaparam do RE. Logo, o sistema ideal é o que concentra os receptores de KDEL no aparelho de Golgi. Não seria esperado que o receptor de KDEL apresentasse um sinal de recuperação para o RE, já que ele deve ficar o maior tempo possível no aparelho de Golgi. Porém, ele possui um sinal condicional capaz de se ligar à COPI e, assim, pode ser internalizado em vesículas que têm o RE como destino.

Referência: Teasdale RD e Jackson MR (1996) Signal-mediated sorting of membrane proteins between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 27-54.


Capítulo 13 Tráfego Intracelular de Vesículas 49

13-13 Todas as enzimas hidrolíticas dos lisossomos possuem atividade ótima em con-dições ácidas (pH ~5). A membrana dos lisossomos normalmente mantêm essas enzimas destrutivas fora do citosol (cujo pH é em torno de 7,2), mas sua depen-dência de um pH ácido protege o conteúdo do citosol contra danos, mesmo que ocorra um vazamento.

13-14 As proteínas adaptadoras selecionam a carga a ser internalizada nas vesículas re-vestidas por clatrina. Assim, fica claro que a perda de AP3 resulta em um defeito na rede trans de Golgi. Logo, o transporte de pigmento do Golgi para os lisosso-mos fica prejudicado, resultando no fenótipo apresentado. Em humanos, acredi-ta-se que a síndrome de Hermansky-Pudlak seja decorrente de uma deficiência na produção de lisossomos especializados. Portadores dessa síndrome possuem alteração de pigmentação similar à do camundongo Mocha, com tendência he-morrágica e doença pulmonar.

Referências: Kantheti P, Qiao X, Diaz ME, Peden AA, Meyer GE, Carskadon SI, Kapfhamer D, Sufalko D, Robinson MS, Noebels JL e Burmeister M (1998) Muta-tion in AP-3 delta in the mocha mouse links endosomal transport to storage defi-ciency in platelets, melanosomes, and synaptic vesicles. Neuron 21, 111-122.

Zhen L, Jiang S, Feng L, Bright NA, Peden AA, Seymour AB, Novak EK, Elliot R, Gorin MB, Robinson MS e Swank RT (1999) Abnormal expression and subcellular distribution of subunits proteins of the AP-3 adaptor complex lead to platelet sto-rage pool deficiency in the pearl mouse. Blood 94, 146-155.

13-15 A. Como as células Hurler suplementam a enzima que falta nas células Hunter e

vice-versa, pode-se concluir que os fatores corretivos são as próprias enzimas lisossomais. Essas enzimas vão para o meio provavelmente porque escapam da via lisossomal e são secretadas. Após serem internalizadas pela célula, as enzimas chegam aos lisossomos via endocitose mediada por receptor (M6P) e ali perma-necem, pois é o local de atuação dessas enzimas de degradação.

B. A protease degrada as enzimas diretamente. O periodato e a fosfatase alcalina ina-tivam o receptor M6P, que é crucial para a entrada das enzimas na célula.

C. Dificilmente um programa de compensação como esse funcionaria para enzimas citosólicas. Mesmo que conseguissem atravessar a membrana, as proteínas exter-nas ficariam retidas em algum compartimento e, finalmente, seriam levadas aos lisossomos para serem degradadas.

Referência: Kaplan A, Achord DT e Sly WS (1977) Phosphohexosyl components of a lysosomal enzyme are recognized by pinocytosis receptors on human fibro-blasts. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 74, 2026-2030.

13-16 A membrana deve ser retornada a uma taxa de 100% a cada meia hora, pois o macrófago mantém sua área de membrana relativamente constante ao longo do tempo.

13-17 A. Os formatos das curvas de HRP e EGF são diferentes porque só EGF se liga a um

receptor específico para ser internalizado. O HRP entra por endocitose de fase fluida. Assim, sua taxa de internalização é contínua e depende apenas da sua con-centração no meio. Já a taxa de captação de EGF depende do número de recepto-res presente nas células, sendo passível de saturação.

B. Tem-se que a taxa de captação de EGF é de 16 pmol/h na concentração de 40 nM e que HRP é capturado a uma taxa de 2 pmol/h na concentração de 40 M. Logo, a taxa de captação de HRP na concentração de 40 nM é de 2 � 10�3 pmol/h, já que ocorre uma diluição de 1.000 vezes. Comparando-se as duas taxas na concentra-ção de 40 nM, o EGF seria internalizado 8.000 vezes mais rápido do que o HRP (16/2 � 10�3).

A 40 M, tanto EGF como HRP seriam captados por pinocitose a uma taxa de 2 pmol/h. A diferença é que o EGF também seria internalizado por endocitose mediada por receptor a uma taxa de 16 pmol/h, o que faria sua internalização ser 9 vezes mais rápida do que a do HRP (2�16/2).


50 Capítulo 13 Tráfego Intracelular de Vesículas

C. Uma vesícula de 20 nm (2 � 10-6 cm) de raio contém 3,4 � 10-17 mL de fluido:

Volume � 4�r3

3

� (4/3) � 3,14 � (2 � 10-6 cm)3

� 3,4 � 10�17 cm3 (mL)

Uma solução de 40 M de HRP contém 2,4 � 1016 moléculas HRP/mL:

HRP �40 μmol HRP

�L

�6 � 1017 moléculas

L 1.000 mL mol

� 2,4 � 1016 moléculas/mL

O número de moléculas de HRP por vesícula é dado por 2,4 � 1016 � 3,4 � 10-17 � 0,8.

D. Os cientistas quiseram enfatizar que, ao utilizar receptores específicos, a célula consegue captar moléculas do seu meio a taxas muito maiores do que por endoci-tose de fase fluida. O receptor aumenta as chances de uma molécula ser internali-zada, levando em consideração as baixas concentrações em que essas moléculas se encontram nos fluidos biológicos.

Referência: Haigler HT, McKanna JA e Cohen S (1979) Rapid stimulation of pino-cytosis in human A-431 carcinoma cells by epidermal growth factor. J. Cell Biol. 83, 82-90.


Conversão de Energia: Mitocôndrias e Cloroplastos 14 14-1 Falso. Os dois componentes que carregam elétrons entre os três principais com-

plexos enzimáticos da cadeia respiratória – ubiquinona e citocromo c – difundem-se rapidamente no plano da membrana mitocondrial interna. A taxa de colisões aleatórias entre os carreadores móveis e os complexos enzimáticos explica as taxas de transferência de elétrons. Assim, não há necessidade de postular uma cadeia estruturalmente ordenada na bicamada lipídica; na verdade, os três complexos enzimáticos existem como entidades independentes no plano da membrana in-terna, e a transferência ordenada de elétrons é devida inteiramente à especificida-de das interações funcionais entre os componentes da cadeia.

14-2 Falso. De fato, os ácidos lipofílicos são desacopladores da fosforilação oxidativa. No entanto, o transporte de elétrons aumenta, o que reflete a existência de um controle respiratório. Quando o gradiente sofre um colapso, o transporte de elé-trons está livre para transcorrer sem controle, em velocidade máxima. À medida que o gradiente aumenta, o transporte de elétrons torna-se mais difícil, e o proces-so reduz a velocidade.

14-3 Verdadeiro. Mitocôndria e cloroplastos possuem genomas que não apresentam herança mendeliana, logo mutações herdadas dessa forma dificilmente afetariam genes nucleares.

14-4 A queda no consumo de glicose na presença de O2 ocorre porque as leveduras precisam processar cerca de 15 vezes menos moléculas de glicose para suprir suas necessidades energéticas, uma vez que as leveduras podem gerar cerca de 15 ve-zes mais ATP a partir de cada molécula de glicose.

14-5 Aproximadamante 10 prótons encontram-se na matriz de mitocôndrias em respi-ração no fígado:

H�

�3,16 � 10�8 mol H�

�6 � 1023 H�

�(4/3)(3,14)(0,5 m)3

�L

mitocôndria L mol H� mitocôndria 1015 m3

� 9,9

Considerando que a matriz da mitocôndria iniciou com pH 7 (10-7 M H�), ela de-veria conter aproximadamente 31 prótons (31,4), e teria de bombear para fora cer-ca de 21 prótons para alcançar o pH 7,5.

14-6 Tem-se que cada par de elétrons reduz um átomo de oxigênio. Logo, 12 pares re-duziriam 6 átomos de oxigênio e, consequentemente, 30 ATPs seriam gerados. Como no estado estacionário a taxa de produção de ATP é igual à de consumo, o coração levaria 6 segundos para consumir uma quantidade de ATP igual aos seus níveis de estado estacionário:

Tempo �5 mol ATP�

6 O2�

min g�

60 s

g 30 ATP 10 mol O2 min

� 6 s

14-7 A ordem dos carreadores de elétrons na cadeia respiratória pode ser determinada pela taxa de oxidação: quanto mais próximo o carreador estiver do oxigênio, mais rapidamente ele será oxidado. Assim, teremos:

citocromo b → citocromo c1 → citocromo c → citocromo (a � a3) → O2


52 Capítulo 14 Conversão de Energia: Mitocôndrias e Cloroplastos

14-8 O denitrofenol não é mais prescrito pois seu uso levou à várias mortes. Esse desa-coplador da fosforilação oxidativa reduz a eficiência da fosforilação oseidativa e com isso não há ATP suficiente para suprir todas as funções celulares.

14-9 A. Considerando que a energia de um mol de fótons é dada pela energia de um fóton

vezes o número de Avogadro (N), a energia a 400 nm será:

E � Nhc/�

�6 � 1023 fótons

�1,58 � 10-37 kcal/s

�3 � 1017 nm

�1

mol fóton s 400 nm

� 71 kcal/mol

Para os comprimentos de 680 nm e 800 nm, tem-se 42 kcal/mol e 36 kcal/mol, respectivamente.

B. Levaria 140 segundos para que um mol de fótons atingisse um metro quadrado. Considerando que um metro quadrado recebe 0,3 kcal de uma luz cujo compri-mento de onda gera 42 kcal/mol, o cálculo é dado por:

Tempo �s

�42 kcal

0,3 kcal mol

� 140 s/mol

C. Uma planta de tomate com uma folha de um metro quadrado de área levaria me-nos de duas horas para fazer um mol de glicose a partir de CO2:

Tempo �140 s

�8 moles de fótons

�6 moles de CO2

mol de fótons mol de CO2 mol de glicose

� 6.720 s (112 min)

Na realidade, a eficiência de captura de fótons pelas plantas está longe de ser 100%. Mesmo sob condições ótimas de luz solar, água e temperatura, a eficiência fica em torno de 5%. Na maioria dos casos, não chega a 1%, como é o caso da be-terraba, que fica em 0,02%.

D. A eficiência da conversão de energia luminosa em energia química, após a captu-ra dos fótons nas condições dadas, é de 33%.

Eficiência �mol de CO2 �

mol de fótons�

112 kcal8 moles de fótons 42 kcal mol de CO2

� 0,33 ou 33%

14-10 Como as duas plantas fixam CO2, a concentração de CO2 na câmara diminuirá. Em termos de competição por CO2, o milho leva vantagem, pois sua enzima de fixação de CO2 é de alta afinidade. Já a enzima do gerânio-ribulose-bifosfato-carboxilase –, além de possuir uma afinidade mais baixa por CO2, irá capturar oxigênio quando o CO2 estiver em baixas concentrações. A consequência dessa via (fotorrespira-ção) é a liberação de CO2, sem a produção de estoques de energia útil, o que é extremamente favorável ao milho.

14-11 A variegação é um fenótipo decorrente da mistura de cloroplastos normais e de-fectivos, produzindo um padrão de manchas verdes e amarelas nas folhas. Nas regiões verdes, existem células que ainda podem ser portadoras de cloroplastos deficientes, além dos funcionais. Por ocasião da divisão celular, essas células po-dem dar origem a uma ilha de células só com cloroplastos deficientes, resultando na mancha amarela circundada por verde. No entanto, não existem manchas ver-des circundadas por amarelo, porque células com cloroplastos defectivos não são capazes de dar origem a células com cloroplastos funcionais.


Mecanismos da Comunicação Celular 15 15-1 Falso. Os receptores envolvidos em diferentes tipos de sinalização possuem afi-

nidades distintas a seus ligantes. Esta situação pode ser inferida a partir da con-centração dos diferentes tipos de ligantes. Por exemplo, a concentração de um neurotransmissor em uma fenda sináptica é bastante elevada e muito maior do que a concentração de um hormônio na circulação sanguínea ou a de um me-diador local na vizinhança de uma célula sinalizadora. Pode-se dizer que recep-tores de neurotransmissores possuem, em geral, uma afinidade mais baixa por seus ligantes em comparação aos receptores de hormônios e aos receptores para mediadores locais. A combinação destas duas características (alta concentração de neurotransmissor e baixa afinidade de seus receptores) permite uma rápida dissociação do complexo neurotransmissor receptor e favorece respostas rápidas a um dado estímulo.

15-2 Falso. Na biologia é sempre possível encontrar exceções. Apesar da maioria dos segundos mensageiros, incluindo o AMP cíclico, o Ca2+ e o IP3, ser solúvel em água e difundir livremente pelo citosol, existem segundos mensageiros como o diacil-glicerol que são solúveis em lipídeos e difundem no nível da membrana.

15-3 Falso. Assim como na questão anterior, na biologia existem regras gerais, mas não necessariamente universais. Se podemos dizer que as proteínas de ligação a GTP estão uniformemente ativas quando estão ligadas a GTP e inativas quando estão ligadas a GDP, de forma que GEFs ativam proteínas ligadas a GTP e GAPs as ina-tivam, o mesmo raciocínio não é verdadeiro para proteína-cinases e fosfatases. Dependendo do sítio de ligação de fosfato que está sendo usado, poderá mesmo ocorrer ativação ou inativação de uma dada proteína. Além disso, a ligação de um fosfato pode ativar algumas proteínas-alvo e inativar outras, ou seja, comutadores moleculares acionados por proteína-cinases podem responder tanto por ativação quanto por inativação.

15-4 Verdadeiro. As cascatas catalíticas de mediadores intracelulares que envolvem enzimas ou canais iônicos podem amplificar de forma significativa um sinal, em contraste ao que ocorre com receptores nucleares, onde o ligante associa-se dire-tamente a sequências de DNA no genoma em uma relação de um-para-um e ativa ou inibe um gene específico. No caso de cascatas catalíticas, há a possibilidade de uma única molécula de proteína-cinase ativada, por exemplo, fosforilar várias moléculas de sua proteína-alvo.

15-5 Falso. Ao invés de induzir uma mudança conformacional direta, a interação de ligantes extracelulares geralmente faz com que um receptor tirosina-cinase se as-socie em dímeros. Neste ponto, a proximidade de dois receptores tirosina-cinase permite que os domínios cinases sejam ativados, os receptores se autofosforilam e então a cascata de sinalização intracelular é iniciada. Assim, pode-se considerar a dimerização como fator inicializador do processo, mas, em alguns casos (o recep-tor de insulina, p. ex.), já ocorre sob a forma de dímero e provavelmente a ligação do ligante seja importante na indução de um rearranjo das cadeias do receptor, que então leva à aproximação dos domínios cinase.

15-6 Verdadeiro. As proteínas tirosina-fosfatases removem grupos fosfato apenas de fosfotirosinas selecionadas em um subgrupo de proteínas tirosina-fosforiladas, diferentemente das proteínas serinatreonina-fosfatases, que efetivamente apre-sentam uma especificidade ampla.


54 Capítulo 15 Mecanismos da Comunicação Celular

15-7 Falso. Plantas e animais lidam de forma diferente com as questões de sinalização célula-célula, apesar de existir uma certa sobreposição nas moléculas de comuni-cação. Algumas das famílias de receptores nucleares como Ras, JAK, STAT, TGFβ, Notch, Wnt ou Hedgehog são exclusivas de animais, não estando presentes em plantas.

15-8 Sob uma concentração circulante de hormônio igual a 10-10 M e considerando o Kd da ligação ao seu receptor igual a 10-8 M, aproximadamente 1% dos receptores está ligado a uma molécula de hormônio {[R-H]/[R]TOT = 10-10 M/(10-10 M + 10-8 M) = 0,0099}. A metade dos receptores possuirá uma molécula de hormônio ligada quando a concentração de hormônio for igual ao Kd; ou seja, em 10-8 M {[R-H]/[R]

TOT = 10-8 M/(10-8 M + 10-8 M) = 0,5}. Para uma discussão sobre as relações entre a concentração do ligante (neste caso o hormônio), o Kd e a fração ligada, ver Res-posta 3-14.

15-9 A analogia dos diversos tipos de comunicação entre seres humanos e sinalizações celulares é bastante esclarecedora.

A. Uma conversa telefônica é uma comunicação entre duas pessoas que ocorre de maneira privada e que pode envolver a troca de informações a uma grande dis-tância. Assim, podemos considerar esta conversa como análoga à sinalização si-náptica, apesar de a sinalização sináptica ser unidirecional, enquanto uma con-versa telefônica envolve um diálogo.

B. A conversa entre pessoas que estão presentes em um coquetel diferencia-se da anterior não apenas por envolver um conjunto de indivíduos, mas também por estar restrita localmente, o que a coloca como análoga à sinalização parácrina.

C. Um anúncio pelo rádio pode ser comparado a um sinal endócrino, pois é enviado para todo o organismo, mas é recebido apenas pelas células-alvo que possuem um receptor específico. Em outras palavras, o sinal de rádio é emitido e está dispo-nível para todos, mas apenas será recebido pelos ouvintes sintonizados naquela estação de rádio.

D. Finalmente, quando uma pessoa fala consigo mesma ela está fazendo algo seme-lhante a um sinal autócrino, ou seja, ela é simultaneamente quem envia e quem recebe a mensagem.

15-10 As respostas de sinalização que envolvem alterações em proteínas já presentes nas células são extremamente rápidas e ocorrerão em milissegundos, pois a pro-teína em questão já está disponível e, como consequência, sua atividade será al-terada imediatamente. No entanto, se houver uma dependência de uma alteração na expressão gênica, o primeiro passo ou os passos iniciais da sinalização ocor-rerão tão rapidamente quanto na situação anterior, e após haverá um intervalo de tempo correspondente ao tempo necessário para que mRNA e proteína sejam sintetizados. Além disso, será necessário que os níveis celulares da proteína sejam alterados o suficiente para evocar a resposta desejada, e este processo pode envol-ver um período igual ou superior a uma hora.

15-11 Mesmo que se considere que a recepção do sinal em nível da membrana celular é o evento primordial para que uma dada célula responda a um estímulo, a sinali-zação completa dependerá do processamento deste sinal inicial pela maquinaria intracelular. Desta forma, células com receptores idênticos, mas associados a dis-tintas maquinarias ou cascatas internas de sinalização, responderão de diferentes formas a uma mesma molécula sinalizadora. Mesmo que as cascatas de sinaliza-ção disparadas sejam muito semelhantes, basta a ocorrência de proteínas efeto-ras distintas no final das cascatas para que a resposta seja diferente. Além disso, fatores como a quantidade de receptores presentes na superfície celular também podem interferir na resposta celular a um dado ligante.

15-12 A passagem de um sinal ou informação através de uma via de sinalização depende da interação sequencial dos diversos componentes (proteínas) que a compõem. As diferentes proteínas devem ser capazes de receber o sinal, alterar sua estrutura de forma que possam perceber este sinal e, rapidamente, transmitir o sinal para o próximo membro da cascata, retornando, elas mesmas, ao estado anterior. Esta


Capítulo 15 Mecanismos da Comunicação Celular 55

necessidade de alterações entre os estados ativo e inativo, em um curto espaço de tempo, é um requerimento essencial para que a transmissão de sinal ocorra eficientemente. A fosforilação/desfosforilação é uma resposta eficiente e simples para a questão do controle da atividade proteica. A ligação de um fosfato negativa-mente carregado a uma proteína é uma forma eficiente de alterar sua conforma-ção e sua atividade, e esta alteração é facilmente reversível. Além disso, o processo de fosforilação e desfosforilação pode ser considerado uma solução geral, pois uma atividade – a de proteína-cinase – pode ser usada para ligar um fosfato, e uma segunda atividade – uma proteína-fosfatase – pode ser usada para a remoção do fosfato. Acredita-se que as proteína-cinases encontradas no genoma humano (e que correspondem a aproximadamente 2% de nossos genes) tenham se originado a partir de duplicação gênica. Assim, pode-se inferir que uma solução desenvol-vida para a utilização em uma determinada cascata de sinalização pode ter sido facilmente adaptada para outras cascatas. A facilidade para a alocação de alvos também deve ter contribuído para a expansão do uso do sistema de fosforilação/desfosforilação, pois serinas, treoninas e tirosinas são aminoácidos comuns na superfície de proteínas. Uma última vantagem é que os processos de fosforilação/desfosforilação permitem tanto respostas rápidas como alterações de duração mais longa.

Em contrapartida, a ativação e a inativação de proteínas mediadas pela ligação alostérica de pequenas moléculas, apesar de possíveis e teoricamente eficientes, não seria um processo universal. Se moléculas pequenas fossem reguladoras, mo-léculas específicas teriam que ser “desenhadas” para cada proteína-alvo, o que envolveria necessariamente a evolução de uma via metabólica de síntese e de-gradação para cada molécula reguladora. Diferentes soluções teriam que ser em-pregadas para cada via metabólica, e o processo de duplicação gênica que talvez tenha ocorrido na multiplicação das proteína-cinases humanas e o que deve ter facilitado a evolução destas complexas vias de sinalização seria inútil nesse caso. Além disso, a regulação através de ligação a pequenas moléculas é extremamente sensível à concentração do regulador, sendo portanto a amplitude de variação da concentração do regulador mais uma limitação para a utilização de ligação alos-térica de pequenas moléculas como estratégia de regulação.

15-13 Ambos os tipos de organização trarão vantagens e desvantagens específicas. Se for considerado inicialmente o uso de uma proteína de suporte para manter as três cinases em um complexo de sinalização, esta organização acelerará a velocidade de transmissão do sinal, direcionando-o e mantendo as diferentes cinases próxi-mas e disponíveis para contato. O direcionamento do sinal reduz a interligação entre vias, mas limita o potencial de amplificação do sinal, pois estabelece uma relação quase que individual entre os componentes da via. Quando a estratégia de cinases livres é utilizada, a grande vantagem que aparece é exatamente a pos-sibilidade de uma maior amplificação do sinal, pois a primeira cinase pode fosfo-rilar muitas moléculas da segunda cinase, que, por sua vez, pode fosforilar muitas moléculas da terceira cinase. Em contrapartida, a velocidade de transmissão do sinal, a menos que as cinases estejam em alta concentração e que a amplificação do sinal compense seu distanciamento, será mais lenta. A organização usada em uma via de sinalização específica é dependente da tarefa que se espera que a via de sinalização desempenhe; por exemplo, cinases livres podem proporcionar a difusão do sinal para outras vias de sinalização e para outras partes da célula, uma situação que pode ser vantajosa em vias que devem abranger grandes espaços ou alvos, ou desvantajosa se quisermos respostas mais restritas.

15-14 São diversos os cenários imagináveis em termos de respostas do tipo tudo-ou-nada em sistemas de resposta à sinalização extracelular. a) Se for necessária a li-gação de duas ou mais moléculas efetoras para ativar uma única molécula-alvo, sob baixas concentrações de moléculas efetoras, a maioria das proteínas-alvo estará inativa, pois possuirá uma única cópia efetora ligada a ela. Conforme hou-ver aumento na concentração de moléculas efetoras, o número de proteínas-alvo ligadas (com o número necessário de efetoras para proporcionar a ativação) au-mentará rapidamente, gerando um forte e correspondente aumento na resposta


56 Capítulo 15 Mecanismos da Comunicação Celular

celular. b) Se a efetora simultaneamente ativar uma enzima e inibir outra que ca-talisa a reação reversa, a reação direta responderá fortemente a um aumento gra-dual da concentração da efetora. Esta é uma estratégia comum muito utilizada em vias metabólicas envolvidas na produção e no consumo de energia. c) Apesar de as duas proposições anteriores serem capazes de gerar respostas abruptas, uma resposta verdadeiramente do tipo tudo-ou-nada ocorrerá se a molécula efetora induzir uma retroalimentação positiva envolvendo uma molécula-alvo ativada, o que contribuirá para sua própria ativação futura. Isso acontece, por exemplo, quando o produto de uma enzima ativada liga-se à enzima para ativá-la.

15-15 Quando os oócitos de sapo são analisados individualmente, é possível determinar que a resposta à progesterona é do tipo tudo-ou-nada, mesmo apresentando-se como uma resposta gradual em termos populacionais. Ou seja, não há oócitos que apresentem MAP-cinase parcialmente ativada. Portanto, diferentes misturas de oó-citos imaturos ou completamente maduros respondendo de forma tudo-ou-nada dão origem aos níveis intermediários de ativação MAP-cinase observados na Figura R15-1. Mesmo considerando que existem diferenças entre os oócitos em termos de idade e tamanho e provavelmente também em relação ao número de receptores de progesterona e à concentração de componentes do módulo de sinalização da MAP-cinase e de alvos da cascata subsequente, não é possível determinar por que oócitos individuais respondem de forma distinta a diferentes concentrações de pro-gesterona. Em diversos contextos biológicos, a observação de uma resposta gradual em termos de população celular pode indicar a ocorrência tanto de uma resposta gradual em cada uma das células que compõem a população quanto uma mistura de respostas tudo-ou-nada.

Referência: Ferrell JE e Machleder EM (1988) The biochemical basis of an all-or-none cell fate switch in Xenopus oocytes. Science 280, 895-898.

15-16 Quando a subunidade catalítica não está ligada a uma subunidade reguladora, ela está ativa. Assim, para que haja uma PKA permanentemente ativa, basta que ocorra uma mutação que torne uma subunidade reguladora incapaz de se ligar a uma subunidade catalítica. A recíproca, ou seja, uma PKA permanentemente inativa, poderá ser obtida por mutações que evitem a dissociação das subuni-dades reguladora e catalítica. Se ocorrer uma mutação que não interfira na liga-ção entre as subunidades reguladora e catalítica, mas que faça com que não haja posterior ligação ao AMP cíclico, não haverá liberação da subunidade catalítica, e a PKA permanecerá inativa. Ainda, caso haja ligação entre o AMP cíclico e uma subunidade reguladora mutante incapaz de sofrer a alteração conformacional necessária para a liberação da subunidade catalítica, a PKA também ficará per-manentemente inativa.

15-17 A fosforilase-cinase é composta por três subunidades reguladoras e uma subuni-dade catalítica. O grau de modificação das subunidades reguladoras é determi-nante para definir quanto tempo a subunidade cinase catalítica permanecerá em sua conformação ativa. Cada modificação por fosforilação ou por ligação a Ca2+ sobre as subunidades reguladoras impele o equilíbrio rumo à conformação ativa da subunidade cinase; ou seja, cada modificação aumenta o tempo despendido no estado ativo. Assim, pela soma dos impulsos provenientes de múltiplas vias, a fosforilase-cinase integra os sinais que controlam a degradação do glicogênio.

15-18 Para que a ativação de Ras dependa da inativação de uma GAP, tanto GAP quanto GEF devem ser ativas na ausência do sinal. Desta forma, a GEF irá constantemen-te carregar Ras com GTP, e a GAP irá manter a concentração de Ras-GTP baixa via indução constante de hidrólise de GTP, para fazer com que Ras retorne a seu estado ligado a GDP. Sob estas condições, a inativação de GAP resultaria em um rápido aumento nos níveis de Ras-GTP, permitindo uma rápida sinalização. Ape-sar de ser efetivo em termos de regulação dos níveis de Ras ativo, este processo também leva a um grande desperdício de energia. Para manter Ras em seu estado inativo, o GTP deve ser constantemente hidrolisado para GDP, o qual deve então ser reconvertido em GTP (por ATP) via energia desviada do metabolismo energé-tico celular. A regulação via ativação de uma GEF evita este problema.

RESPOSTA GRADUAL

RESPOSTA TUDO-OU-NADA

MA

P-ci

nase

ativ

a (%

)

Progesterona (μM)

0,0010

50

100

0,01 0,1 1 10

Figura R15-1 Respostas graduais ou tudo-ou-nada em oócitos individuais que resultam em respostas graduais na população (Resposta 15-15).


Capítulo 15 Mecanismos da Comunicação Celular 57

15-19 Uma hipótese de trabalho provável e bastante simples consiste em postular que células de Drosophila com genótipo heterozigoto DshΔ/+ expressam apenas a me-tade da quantidade normal de Dishevelled. Como as células com baixa expressão (presumida) de Dishevelled apresentam um fenótipo normal, pode-se imaginar que Frizzled esteja antes de Dishevelled na cascata. Se Frizzled está sendo su-perexpressa, mas Dishevelled atua como gargalo, então o defeito é corrigido. A hipótese acima é apoiada pelas funções conhecidas dos produtos dos genes em questão: Frizzled é um receptor Wnt e Dishevelled é uma proteína de sinalização intracelular. Optando por uma hipótese simples e apoiada pelo conhecimento da função dos produtos gênicos, se as funções de Dishevelled e Frizzled fossem des-conhecidas e fôssemos guiados apenas pelas interações genéticas, poderíamos imaginar relações bem mais complexas nas quais Dishevelled atuaria na cascata antes de Frizzled.

Referência: Winter CG, Wang B, Ballew A, Royou A, Karess R, Axelrod JD e Luo L (2001) Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton. Cell 105, 81-91.



Citoesqueleto 16 16-1 Verdadeiro. No entanto, é importante salientar que a hidrólise de ATP nos fila-

mentos de actina ou a hidrólise de GTP nos microtúbulos não promove a despo-limerização, mas direciona o equilíbrio rumo à despolimerização. Isso acontece porque, quando ocorre a hidrólise de ATP ou GTP, dependendo de estarmos fa-lando de actina ou microtúbulos, grande parte da energia livre liberada pela cliva-gem da ligação de alta energia é estocada na estrutura do polímero. Assim, a ener-gia livre de polímeros que contêm ADP (ou GDP) é maior do que a de polímeros que contêm ATP (ou GTP). Esta maior energia livre direciona o equilíbrio rumo à despolimerização, como comentado anteriormente, e faz com que os filamentos de actina que contêm ADP dissociem mais rapidamente do que os filamentos de actina que contêm ATP. O mesmo raciocínio se aplica aos microtúbulos contendo GDP ou GTP.

16-2 Falso. O principal arranjo de microtúbulos na maioria das células animais é o centrossomo, o qual pode ser representado, em termos gerais, como uma estrela tridimensional, com microtúbulos partindo do centro rumo à periferia celular. Na parte central desta estrela, e portanto na região central da célula, estão imersas as extremidades menos (-) dos microtúbulos, e na periferia celular encontram-se as extremidades mais (+) dos microtúbulos. Esta orientação constante e precisa do centrossomo faz com que sejam utilizados motores direcionados para as extremi-dades mais (+) para o transporte de cargas rumo à periferia da célula e motores direcionados para as extremidades menos (-) para o transporte de cargas em dire-ção ao centro da célula.

16-3 Falso. Apesar de estar parcialmente correta no que se refere à entrada de Ca2+ atra-vés de canais de Ca2+ sensíveis à voltagem nos túbulos T, a afirmação está incorreta ao definir que este estímulo é suficiente, per se, para gerar uma contração muscu-lar rápida. Para que essa contração muscular rápida ocorra, e para que a contração seja organizada, a entrada inicial de Ca2+ deve atuar abrindo canais de liberação de Ca2+ no retículo sarcoplasmático. Estes canais de liberação de Ca2+ permitem um rápido e organizado fluxo de Ca2+ no citoplasma, o que então propiciará uma contração muscular rápida e coordenada através de sua ligação à troponina C.

16-4 Para responder a esta questão, deve-se partir do comprimento referente a um dí-mero de αβ-tubulina (8 nm de comprimento). Assim, uma taxa de crescimento de 2 μm/min (2.000 nm/60 s = 33 nm/s) corresponde a uma adição de 4,2 dímeros de αβ-tubulina ([33 nm/s] X [αβ-tubulina/ 8 nm] = 4,17 dímeros/s) a cada um dos 13 protofilamentos, ou seja, 54,21 dímeros de αβ-tubulina/s (4,17 dímeros por fila-mento X 13 protofilamentos) às extremidades de um microtúbulo.

Referência: Detrich WH, Parker SK, Williams RC, Nogales E e Downing KH (2000) Cold adaptation of microtubule assembly and dynamics. J. Biol. Chem. 275, 37038-37047.

16-5 A Figura R16-1 ilustra tanto a possibilidade de crescimento de microtúbulos de forma linear como o crescimento por associação lateral. Ao observarmos esta figura, é fácil imaginar que o crescimento de microtúbulos através de uma as-sociação lateral parece mais estável do que o crescimento linear. Efetivamente, após a primeira associação lateral, o próximo dímero αβ pode se ligar muito mais facilmente, pois será estabilizado pelos contatos tanto laterais quanto longitudi-nais. Como os contatos laterais fortalecem o processo de estabilização tanto do


60 Capítulo 16 Citoesqueleto

protofilamento preexistente quanto do novo protofilamento, uma rápida adição de novos dímeros de αβ-tubulina tanto para a formação de protofilamentos ad-jacentes quanto para a extensão dos já existentes é favorecida. Após a montagem de um conjunto determinado de protofilamentos, o arranjo plano de tubulinas se curvará, dando origem a um tubo que formará o microtúbulo.

Referência: Leguy R, Melki R, Pantaloni D e Carlier M-F (2000) Monomeric γ-tubulin nucleates microtubules. J. Biol. Chem. 275, 21975-21980.

16-6 É a partir do centrossomo que se estende um arranjo tridimensional de microtú-bulos, em forma de estrela em crescimento (como discutido na Resposta 16-2). Os microtúbulos estão permanentemente sob a ação do fenômeno de instabili-dade dinâmica e em geral estendem-se até que um obstáculo, frequentemente representado pela membrana plasmática, interponha-se em seu caminho. Neste momento, e devido à instabilidade dinâmica, o microtúbulo exerce um impulso sobre o obstáculo em questão. Considerando-se que o centrossomo lança micro-túbulos em crescimento em todas as direções, o impulso exercido pelos diferen-tes microtúbulos em crescimento sobre a membrana celular tende a posicionar o centrossomo no centro da célula. O centrossomo “sabe” que ali é seu lugar, pois as diferentes forças exercidas pelos microtúbulos em crescimento sobre a mem-brana, em direções opostas, são somadas e tendem a se anular (microtúbulos de comprimentos iguais, crescendo em sentidos opostos a partir do centrossomo, devem exercer forças iguais, mas opostas). O equilíbrio é alcançado e o centrosso-mo é posicionado.

16-7 As células devem manter um estoque de subunidades livres de actina para que exista a possibilidade de um crescimento rápido em resposta a um estímulo es-pecífico em um local determinado. Nas células, as subunidades de actina não se encontram sob a forma de actina pura, mas, em grande parte, ligadas à timosina. A timosina atua bloqueando a actina sob uma forma que não pode hidrolisar o ATP ligado, o que consequentemente a impede de ser adicionada às extremidades de um filamento. A concentração de subunidades livres de actina nas células é portanto, reduzida pela timosina e se aproxima da concentração crítica. Para que sejam incorporadas em um filamento, as subunidades de actina devem ser resga-tadas deste pool inativo pela profilina. Como a atividade da profilina é altamente regulada, a polimerização ocorrerá também sob um controle severo.

16-8 A. A cinesina apresenta movimento unidirecional sobre um microtúbulo. Este mo-

vimento unidirecional é ditado pela ligação e pela hidrólise de ATP, etapas que estão associadas a alterações conformacionais na cabeça de cinesina. Estas alte-rações conformacionais são finamente coordenadas e resultam no deslocamento dos domínios motores da cinesina sobre o microtúbulo.

B. Os pequenos traços que, em conjunto, indicam a caminhada da cinesina refletem os movimentos desta molécula sobre um microtúbulo. É possível observar que a cinesina locomoveu-se 80 nm em 9 s, o que resulta em uma velocidade média

Figura R16-1 A adição rápida de dí-meros de αβ-tubulina para a nuclea-ção estrutural (Resposta 16-5).

Crescimento linear Associação lateral


Capítulo 16 Citoesqueleto 61

de 9 nm/s. A velocidade in vivo da cinesina é 100 vezes mais rápida. Nesse expe-rimento, as condições de concentração de ATP e a força exercida pelo padrão de interferência foram ajustadas para facilitar a observação dos passos individuais da cinesina.

C. Contando os passos da molécula de cinesina na Figura Q 16-2 (p. 1.051 da obra), chega-se a um total de 10 passos em um percurso de 80 nm de comprimento, o que indica um comprimento médio de cada passada individual de aproximada-mente 8 nm.

D. Tanto o comprimento dos passos da cinesina, apresentado na resposta anterior (letra C), quanto o intervalo entre as subunidades de cada β-tubulina sobre um protofilamento de microtúbulo é igual a 8 nm. Visto que a cinesina possui dois domínios que podem se ligar à β-tubulina, pode-se imaginar um movimento sequencial de cada domínio, ou seja, ela provavelmente mantém um dos domí-nios ancorados e dá uma passada com o outro domínio rumo ao próximo sítio de ligação da β-tubulina. Assim, uma cinesina parece se mover saltando de uma β-tubulina para a próxima sobre o protofilamento, como se fosse uma pessoa que atravessa um riacho sobre pedras.

E. Não são fornecidos dados sobre o número de ATPs hidrolisados a cada passada. Experimentos realizados pelos mesmos pesquisadores sugerem que a hidrólise de um ATP não é capaz de induzir vários passos: uma menor concentração de ATP foi capaz de promover o mesmo padrão de passos, mas estes foram realizados em uma escala de tempo mais longa. Ou seja, se a hidrólise de um único ATP pudesse gerar vários passos sob estas condições experimentais, deveriam ter sido obser-vados agrupamentos de passos. Nenhum dos experimentos realizados conseguiu eliminar a possibilidade de que a hidrólise de um ATP é necessária para a realiza-ção de cada passo.

Referência: Svoboda K, Schimidt CF, Schnapp BJ e Block SM (1993) Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature 365, 721-727.

16-9 O movimento unidirecional de um lamelipódio segue um processo de nucleação e crescimento de filamentos de actina na borda anterior da célula (filamentos re-centes) e de despolimerização da rede de actina mais antiga e mais distante. Para a identificação dos filamentos mais recentes ou mais antigos de actina, é necessária a ajuda da cofilina, a qual se liga de forma cooperativa e preferencial a filamentos de actina que contêm ADP-actina. Filamentos com ADP representam filamentos antigos e estão predominantemente presentes na região mais distante da borda do lamelipódio, em contraposição aos filamentos novos, que contêm ATP-actina e que são resistentes à despolimerização mediada pela cofilina. Estes filamentos recentes de ATP-actina encontram-se predominantemente na borda anterior do lamelipódio em crescimento. A hidrólise de ATP em ADP ocorre conforme ocorre o envelhecimento dos filamentos, permitindo que a cofilina possa dissociar de forma eficiente e preferencial os filamentos velhos. Este processo direciona, por-tanto, o movimento do lamelipódio.

16-10 A Figura R16-2 ilustra como devem estar estendidos os sarcômeros em cada um dos pontos indicados pelas setas da Questão 16-3. No segmento I, o aumento na tensão associado à diminuição no comprimento do sarcômero deve-se ao incre-mento no número de interações entre as cabeças de miosina e a actina. No seg-mento II, a actina começa a se sobrepor à zona nua da miosina, gerando um plate-au no qual o número de interações com cabeças de miosina permanece constante. No segmento III, os filamentos de actina começam a se sobrepor, o que interfere na interação ótima entre actina e miosina e produz um relaxamento na tensão. No segmento IV, o espaçamento entre os discos Z é menor do que o comprimento dos filamentos espessos de miosina, fazendo com que eles se deformem. Isto gera uma súbita queda na tensão muscular.

Referência: Gordon AM, Huxley AF e Julian FJ (1966) The variation in isomet-ric tension with sarcomere length in vertebrate muscle fibres. J. Physiol. 184, 170-192.

Idisco Z2,2

2,0

1,6

1,3

1,0 1,6

3,6

1,0

II

III

IV

Figura R16-2 Diagramas esquemáticos de sarcômeros nos pontos indicados por setas na Figura Q16-3 (Resposta 16-10). Os números referem-se ao comprimento em micrômetros.



Ciclo Celular 17 17-1 Falso. Várias células do corpo humano adulto são substituídas por novas a cada

três anos, mas nem todas são substituídas à mesma taxa. As células sanguíneas e aquelas do epitélio intestinal, por exemplo, são repostas a taxas elevadas, mas as células da maioria dos órgãos são repostas mais lentamente. Os neurônios rara-mente são repostos.

17-2 Falso. A regulação dos complexos de ciclina-Cdk não depende somente de me-canismos de fosforilação e desfosforilação, pois os complexos também podem ser regulados pela ligação de proteínas inibidoras de Cdk (CKIs), que suprimem a atividade das Cdks. Deve-se também considerar que as taxas de síntese e degra-dação (proteólise) das subunidades de ciclinas são fundamentais à regulação da atividade de Cdk.

17-3 Verdadeiro. A duração do ciclo celular deve, de fato, condizer com o tempo que a célula leva para dobrar de tamanho. Se a duração do ciclo celular fosse diminuída (ou aumentada) em relação ao tempo requerido pela célula em proliferação para dobrar de tamanho, a célula se tornaria gradativamente menor (ou maior) a cada ciclo de divisão, levando a problemas de multiplicação.

17-4 Verdadeiro. Nas células eucarióticas, as proteínas do complexo de reconhecimen-to da origem permanecem constantemente ligadas ao DNA e constituem um im-portante ponto de apoio nas origens de replicação, permitindo que várias outras proteínas sejam agrupadas e ativadas durante a replicação do DNA.

17-5 Falso. Se forças iguais e opostas puxassem os cromossomos em direção aos dois polos opostos do fuso, eles não seriam posicionados na placa metafásica, mas sim em locais aleatórios entre os polos. Acredita-se que três forças principais sejam importantes ao movimento dos cromossomos nos microtúbulos do fuso mitótico: a força em direção aos polos gerada pelo cinetocoro, a força em direção aos polos gerada pelo fluxo de microtúbulos (em alguns tipos celulares) e a força de ejeção polar. Cada cromossomo é submetido a uma força em direção aos polos que é contrabalançada por uma força de ejeção polar, isto é, que afasta os cromossomos do polo. Quando um cromossomo se aproxima do fuso, a força de ejeção polar aumenta de intensidade. Isso temporariamente diminui a força em direção aos polos, fazendo com que o cromossomo seja afastado do polo e posicionado exata-mente no equador dos polos, dando origem à placa metafásica.

17-6 Falso. O processo denominado senescência do organismo (envelhecimento) é diferente da senescência celular replicativa, que ocorre na ausência da enzima telomerase. O processo de envelhecimento é causado, entre outros fatores, pelos contínuos danos oxidativos sofridos pelas macromoléculas – como o DNA e en-zimas, por exemplo. A diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio, por meio da redução da atividade metabólica do organismo ou pela ingestão de moléculas antioxidantes, pode aumentar a expectativa de vida em certos modelos experimentais animais.

17-7 Tal fato pode ser considerado notável porque os genes e as proteínas do ciclo ce-lular, diferentemente das enzimas da maioria das reações metabólicas (que em geral funcionam bem isoladamente, ou seja, na ausência de outras proteínas essenciais à sua atividade), devem necessariamente interagir com várias outras proteínas. A formação de complexos proteicos entre os diferentes componentes do ciclo celular é uma característica importante e crítica à progressão do ciclo,


64 Capítulo 17 Ciclo Celular

sendo que o funcionamento de genes humanos em células de levedura indica que as sequências de aminoácidos responsáveis por essas interações nas superfícies de cada componente foram preservadas ao longo da história evolutiva dos dois organismos – que são distantemente relacionados.

17-8 A fim de isolar o gene selvagem correspondente ao gene defeituoso no mutan-te Cdc, deve-se, inicialmente, crescer as células do mutante Cdc à temperatura de 25°C. Essas células serão transfectadas com a biblioteca de DNA preparada a partir de células selvagens de levedura e crescidas a 37°C. As células que forem transformadas com um plasmídeo contendo um DNA que não corresponde ao gene mutante não serão viáveis e não formarão colônias na temperatura restritiva. Por outro lado, as células que receberem o plasmídeo contendo um DNA que cor-responde ao alelo selvagem do gene mutante serão viáveis, completando o ciclo celular normal e formando colônias na temperatura restritiva. Assim, o DNA plas-midial dessas colônias pode ser extraído e sequenciado, determinando-se preci-samente a sequência de bases do gene isolado.

17-9 A. O ponto de execução do mutante sensível à temperatura está indicado na Figura

R17-1. Quando a temperatura foi aumentada, as células que não haviam alcan-çado o ponto de execução no ciclo celular se multiplicaram e formaram brotos grandes, mas não se dividiram. Paralelamente, as células que haviam ultrapas-sado o ponto de execução no ciclo celular se dividiram e então interromperam sua multiplicação, originando a morfologia-marco característica do próximo ciclo celular.

B. A morfologia-marco define o momento exato em que a célula pára sua progressão ao longo do ciclo celular. No caso deste mutante sensível à temperatura, como in-dicado na Figura R17-1, a morfologia-marco é claramente distinta da morfologia no ponto de execução. Portanto, o ponto de execução e o ponto de parada do ciclo celular não são equivalentes no mutante que foi isolado.

Referência: Hartwell LH (1978) Cell division from a genetic perspective. J. Cell Biol. 77, 627-637.

17-10 Para que as células se dividam normalmente, as coesinas devem estar presentes durante a fase S, pois a identificação das cromátides-irmãs pelos componentes da maquinaria celular responsáveis por sua união somente pode ser realizada quan-do o DNA está sendo replicado. Como as coesinas não apresentam especificidade de ligação ao DNA, torna-se impossível distinguir quais cromossomos são efeti-vamente irmãos após a separação das cromátides-irmãs. Portanto, as cromátides-irmãs devem ser mantidas unidas após sua formação, a fim de que sejam correta-mente segregadas às duas células-filhas durante a mitose.

Figura R17-1 O ponto de execução e o ponto de parada do produto gênico afetado no mutante isolado (Resposta 17-9).

aumento dotamanho dobroto com amudança de temperatura

ponto deexecução

ponto de parada no ciclo celular


Capítulo 17 Ciclo Celular 65

Referência: Uhlmann F e Nasmyth K (1998) Cohesion between sister chromatids must be established during DNA replication. Curr. Biol. 8, 1095-1101.

17-11 Isso é possível porque a maior parte das moléculas de coesina é liberada dos bra-ços cromossômicos no início da mitose, quando, então, as moléculas de conden-sina começam a efetuar a condensação dos cromossomos. Assim, na ausência de uma grande quantidade de moléculas de coesina, as condensinas compactam as cromátides-irmãs como domínios separados, sendo que a pequena quantidade de moléculas de coesina restante é suficiente para que as cromátides-irmãs se mantenham unidas até o estágio de anáfase.

17-12 Os médicos ainda não emitiram alerta sobre o consumo excessivo de cafeína por-que a dose necessária para a interferência no mecanismo do ponto de verificação da replicação do DNA é extremamente alta, muito maior que a quantidade ingeri-da por pessoas que consomem muito café (ou café forte) e bebidas à base de cola. Considerando que uma xícara de café típica (150 mL) contém 100 mg de cafeína (196 g/mol), chegamos à conclusão de que a concentração de cafeína em uma xícara de café é de cerca de 3,4 mM, estando, portanto, abaixo dos 10 mM necessá-rios para a interferência no mecanismo do ponto de verificação da replicação do DNA. Devemos levar em consideração, ainda, que a cafeína ingerida será diluída no volume de água (cerca de 40 L) presente no corpo de um adulto típico. Assim, supondo que a cafeína ingerida não será metabolizada ou excretada pelo orga-nismo, seriam necessárias 784 xícaras de café (contendo 100 mg de cafeína cada xícara) para que se alcançasse a concentração de 10 mM.

17-13 A ordem é: prófase (Figura Q17-3E), prometáfase (Figura Q17-3D), metáfase (Fi-gura Q17-3C), anáfase (Figura Q17-3A), telófase (Figura Q17-3F) e citocinese (Fi-gura Q17-3B), ver p. 1.113 da obra.

17-14 Como existem 46 cromossomos na espécie humana e cada um possui dois cineto-coros, existem, no total, 92 cinetocoros em uma célula humana em mitose.

17-15 A. Basicamente, os microtúbulos do cinetocoro são estáveis porque suas duas extre-

midades não são desagregadas, o que é possível pela ligação do centrossomo em uma extremidade e do cinetocoro na outra.

B. A desagregação dos microtúbulos astrais ocorre quando as moléculas de tubu-lina estão abaixo da concentração celular mínima necessária à montagem des-sas estruturas, uma vez que a taxa de adição não equilibra a taxa de dissociação. Desse modo, os microtúbulos se tornam cada vez mais curtos. Devido à presença e estabilidade dos microtúbulos do cinetocoro, o destacamento do centrossomo e a desintegração ao acaso dos microtúbulos não são explicações plausíveis ao desaparecimento dos microtúbulos astrais após a diluição.

C. O número e o comprimento dos microtúbulos possibilitariam a identificação dos prováveis mecanismos de desaparecimento dos microtúbulos astrais operantes ao longo do tempo. Na hipótese de destacamento dos microtúbulos, o número de microtúbulos por centrossomo diminuiria, mas seu comprimento permaneceria igual. Na hipótese de despolimerização dos microtúbulos, o número de micro-túbulos por centrossomo permaneceria constante, mas seu comprimento dimi-nuiria uniformemente. Na hipótese de desintegração aleatória dos microtúbulos (isto é, ao longo de sua extensão), o número de microtúbulos por centrossomo permaneceria constante, mas seu comprimento seria variável.

Referência: Mitchison TJ e Kirschner MW (1985) Properties of the kinetochore in vitro. II. Microtubule capture and ATP-dependent translocation. J. Cell. Biol. 101, 766-777.

17-16 As duas máquinas citoesqueléticas montadas nas células animais para a execu-ção dos processos de mitose e citocinese são o fuso mitótico e o anel contrátil. O fuso mitótico é responsável pela segregação e distribuição dos cromossomos às células-filhas durante a mitose, sendo composto de microtúbulos e uma série de outras proteínas, incluindo proteínas motoras. O anel contrátil é responsável


66 Capítulo 17 Ciclo Celular

pela divisão de uma célula animal em duas células-filhas durante a citocinese e é composto de filamentos de actina e miosina.

17-17 Os fatores de sobrevivência promovem a sobrevivência celular, suprimindo a apoptose. Os fatores de crescimento estimulam um aumento de massa celular, promovendo a sintese de proteínas e outras macromoléculas e inibindo sua de-gradação. Já os mitógenos estimulam a tona de divisão celular pela atenuação dos controles intracelulares negativos que, de outra maneira, bloqueariam a progres-são pelo ciclo celular.


Apoptose 18 18-1 Verdadeiro. Em tecidos adultos normais, as taxas de morte celular geralmente são

contrabalançadas pelas taxas de divisão celular, pois o tamanho dos tecidos se mantém constante e estável.

18-2 Verdadeiro. O citocromo c é um mediador de apoptose que atua na via intrínse-ca da apoptose, dependente da liberação no citoplasma de proteínas mitocon-driais que ativam a cascata proteolítica de caspases. A geração de fibroblastos embrionários de camundongos deficientes na produção de citocromo c sustenta a afirmação de que células de mamíferos que não possuem citocromo c podem ser resistentes à apoptose induzida por luz UV. Quando cultivados sob condições especiais, esses fibroblastos embrionários são resistentes a uma série de agentes indutores da via intrínseca da apoptose.

Referência: Li K, Li Y, Shelton JM, Richardson JA, Spencer E, Chen ZJ, Wang X e Williams RS (2000) Cytochrome c deficiency causes embryonic lethality and attenuates stress-induced apoptosis. Cell 101, 389-399.

18-3 A superexpressão da proteína secretada que se liga ao ligante Fas poderia contri-buir à sobrevivência dessas células tumorais protegendo-as contra o ataque de linfócitos T citotóxicos. No momento em que se liga ao ligante Fas presente na superfície dos linfócitos T citotóxicos, a proteína secretada impede o ligante Fas de se ligar ao Fas presente na superfície das células tumorais. Desta maneira, as células tumorais estariam protegidas contra a atividade indutora de morte celular dos linfócitos T citotóxicos.

Referência: Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, Roy M, Kischkel FC, Dowd P, Huang A, Donahue CJ, Sherwood SW, Baldwin DT, Godowski PJ, Wood WI, Gurney AL, Hillan KJ, Cohen RL, Goddard AD, Botstein D e Ashkenazi A (1998) Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Nature 396, 699-703.

18-4 Em princípio, o citocromo c não parece ser necessário à apoptose em C. elegans. Contudo, o fato de nenhum mutante para o gene do citocromo c ter sido encontra-do nesse organismo simplesmente reflete o papel essencial e indispensável de seu produto ao funcionamento da cadeia transportadora de elétrons nas mitocôn-drias, resultando, portanto, na inviabilidade de mutantes de C. elegans deficientes na produção de citocromo c.

Referência: Ellis HM e Horvitz RH (1986) Genetic control of programmed cell de-ath in the nematode C. elegans. Cell 44, 817-829.

18-5 Os dois tipos celulares (selvagem e duplamente deficiente na produção de Bax e Bak) entrariam em apoptose após a microinjeção de citocromo c em seu citoplas-ma. A presença de citocromo c no citoplasma sinaliza o início da montagem dos apoptossomos e de todos os eventos subsequentes que levam à apoptose. Embora as células deficientes na produção de Bax e Bak não sejam capazes de liberar cito-cromo c das mitocôndrias, elas são inteiramente capazes de responder aos sinais posteriores da via, que são ativados pela presença de citocromo c no citoplasma.


68 Capítulo 18 Apoptose

Referência: Wei MC, Zong W-X, Cheng EH-Y, Lindsten T, Panoutsakopou-lou V, Ross AJ, Roth KA, MacGregor GR, Thompson CB e Korsmeyer SJ (2001) Proapoptotic BAX and BAK: A requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science 292, 727-730.

18-6 Apesar de Apaf1 e Casp9 funcionarem na mesma via apoptótica, as diferenças observadas entre camundongos deficientes na produção de Apaf1 (patas anor-mais, com retenção de células das membranas interdigitais) e camundongos de-ficientes na produção de Casp9 (patas normais) indicam que a atividade de Apaf1 é essencial à apoptose de células das membranas interdigitais, ao passo que a ati-vidade de caspase-9 não é necessária ao processo. É possível, por exemplo, que Apaf1 interaja com uma caspase diferente nas células das membranas interdigi-tais de camundongos.

Referência: Earnshaw WC, Martins LM e Kaufmann SH (1999) Mammalian caspases. Annu. Rev. Biochem. 68, 383-424.

18-7 As duas células na Figura Q18-2 (p. 1.129 da obra) liberaram a proteína de fusão citocromo c-GFP de suas mitocôndrias dentro de alguns minutos: 6 minutos para a célula na Figura Q18-2A e 8 minutos para a célula na Figura Q18-2B. O tem-po após a exposição à luz UV em que a liberação ocorreu variou muito entre as duas células, o que indica que as células individuais liberam citocromo c de suas mitocôndrias muito rapidamente, mas que a liberação é acionada em diferentes intervalos de tempo, sendo, portanto, dependente de cada célula.

Referência: Goldstein JC, Waterhouse NJ, Juin P, Evan GI e Green DR (2000) The coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid, complete and kine-tically invariant. Nat. Cell Biol. 2, 156-162.


Junções Celulares, Adesão Celular e Matriz Extracelular 19 19-1 Falso. Não é provável que as adesões célula-célula dependentes de Ca2+ sejam re-

guladas por alterações nas concentrações de Ca2+, uma vez que as células não são capazes de modular a concentração externa de Ca2+ do meio.

19-2 Verdadeiro. As junções compactas são importantes à organização dos epitélios nos vertebrados. Trata-se de um tipo de junção célula-célula formado entre cé-lulas epiteliais adjacentes que impede a difusão das macromoléculas, de muitas moléculas pequenas e de íons no espaço entre as células, assim como a difusão de algumas proteínas de membrana (e lipídeos) entre os domínios apicais e basola-terais da membrana plasmática.

19-3 Verdadeiro. As integrinas constituem uma grande família de proteínas heterodi-méricas transmembrana que promovem a ligação das células à matriz celular e também fazem as importantes adesões célula-célula. Basicamente, as integrinas podem existir em duas conformações: uma forma de baixa afinidade (inativa) e uma forma de alta afinidade (ativa), que se refletem na conformação dos domínios que compõem o sítio de ligação e no posicionamento das caudas citoplasmáticas. A ligação de certas moléculas da matriz extracelular (assim como a aplicação de certos sinais mecânicos) à integrina faz com que a molécula assuma uma posição estendida (ativa) e, assim, separe as caudas citoplasmáticas. Isso é percebido por moléculas sinalizadoras intracelulares, que se ligam ou se dissociam das integri-nas. As mudanças observadas nessas moléculas sinalizadoras podem, então, alte-rar o citoesqueleto e ativar ou inibir diversas vias de sinalização intracelular.

19-4 Falso. A elastina é composta principalmente por dois tipos de pequenos segmen-tos que se alternam na cadeia polipeptídica: segmentos hidrofóbicos (responsá-veis pelas propriedades elásticas da molécula) e segmentos de hélice α ricos em lisina e alanina (que formam ligações cruzadas entre as moléculas adjacentes). A elasticidade da elastina é essencialmente devida à falta de estrutura secundária.

19-5 A citação de Warren Lewis está correta, pois as propriedades de adesão das células (entre si e com a matriz extracelular) são fundamentais à estruturação e manuten-ção dos diferentes tecidos do corpo. Contudo, deve-se ressaltar que uma grande fração do corpo é constituída de tecido conjuntivo (ossos e tendões) e, nesse caso, a coesão e a integridade dependem primordialmente da qualidade da matriz ex-tracelular, e não das células lá presentes.

19-6 Os fragmentos Fab, derivados da digestão de anticorpos IgG com papaína (que se-para os dois sítios de ligação do anticorpo), foram utilizados no bloqueio da agre-gação celular porque os dois sítios de ligação dos anticorpos IgG são idênticos. Isso gera a possibilidade de ligações cruzadas entre as moléculas reconhecidas por esses anticorpos. Assim, se os anticorpos intactos fossem utilizados no blo-queio da agregação celular, poderiam ocorrer ligações cruzadas entre as molécu-las de superfície das células em estudo, que não seriam adequadamente separa-das (Figura R 19-1).

Referência: Beug H, Katz FE e Gerisch G (1973) Dynamics of antigenic membrane sites relating to cell aggregation in Dictyostelium discoideum. J. Cell Biol. 56, 647-658.

19-7


70 Capítulo 19 Junções Celulares, Adesão Celular e Matriz Extracelular

A. Os dois filamentos nas junções compactas podem permanecer mesmo após o desaparecimento de toda a claudina-4, pois as células continuam expressando a claudina-1, cuja atividade não foi afetada pela presença da toxina.

B. Há várias possibilidades para a desintegração dos filamentos de claudina-4 oca-sionada pela ligação da toxina de Clostridium perfringens. A toxina pode alterar diretamente a conformação das moléculas de claudina-4, desestabilizando sua interação com outras moléculas de claudina-4 (no mesmo filamento). A toxina também pode desestabilizar as interações entre as moléculas de claudina-4 em fi-lamentos adjacentes. A toxina pode, ainda, se ligar aos monômeros de claudina-4, deslocando, assim, o equilíbrio para a forma dissociada.

C. A principal função das junções compactas é impedir a difusão de moléculas no espaço entre as células dos epitélios. Assim, quando a toxina é adicionada à por-ção basolateral da camada epitelial, ela tem acesso a apenas um lado da junção. O fato de a toxina não ter efeito quando adicionada à porção apical sugere que seus sítios de ligação nas moléculas de claudina-4 somente são acessíveis a partir da porção basolateral.

Referência: Sonoda N, Furuse M, Sasaki H, Yonemura S, Katahira J, Horiguchi Y e Tsukita S (1999) Clostridium perfringens enterotoxin fragment removes specific claudins from tight junction strands: evidence for direct involvement of claudins in tight junction barrier. J. Cell Biol. 147, 195-204.

19-8 Os camundongos homozigotos nocauteados para o gene do nidogênio-1 ou para o gene do nidogênio-2 são saudáveis e apresentam fenótipo normal, pois as duas formas de nidogênio são equivalentes, podendo compensar a eventual ausência de um dos componentes. Por outro lado, os camundongos que possuem uma mu-tação definida no gene da laminina-γ1 (eliminando o sítio de ligação do nidogê-nio) apresentam fenótipo anormal, pois não há sítio ao qual tanto o nidogênio-1 como o nidogênio-2 possam se ligar na laminina, levando a defeitos severos na formação dos pulmões e dos rins. Da mesma forma, espera-se a ocorrência de um fenótipo anormal semelhante em camundongos homozigotos nocauteados para os dois genes do nidogênio.

Referência: Sasaki T, Fassler R e Hohenester E (2004) Laminin: the crux of basement membrane assembly. J. Cell Biol. 164, 959-963.

19-9 Tal afirmação remete à atual percepção dos diversos papéis desempenhados pela lâmina basal das fibras musculares, que não se restringem à sustentação estrutu-ral de células e tecidos. As células podem, de fato, deixar mensagens químicas na lâmina basal, as quais dirigem a diferenciação e a função das células subjacentes, como no caso da regeneração de músculos e neurônios motores. Moléculas es-pecíficas contidas na lâmina basal, por exemplo, definem o local exato da junção neuromuscular e orientam sua reconstituição, o que também pode ocorrer e ser importante durante o desenvolvimento embrionário e fetal do organismo.

Referência: Sanes JR (2003) The basement membrane/basal lamina of skeletal muscle. J. Biol. Chem. 278, 12601-12604.

19-10 Como a substituição de uma alanina por D723 na cadeia β e por R995 na cadeia α levou a altos níveis de ativação espontânea da integrina αIIbβ3, isso sugere que

TRIPSINA,EDTA

LAVAR,ADICIONAR

Fab

Figura R19-1 Os fragmentos Fab de anticorpos bloqueiam a adesão celular (Resposta 19-6).


Capítulo 19 Junções Celulares, Adesão Celular e Matriz Extracelular 71

esses resíduos são importantes à manutenção da molécula em seu estado inativo. Já a comparação entre as mutações D723R e R995D indica que esses dois resíduos provavelmente estabeleçam uma interação eletrostática (através de uma ponte de sal) que mantém a integrina αIIbβ3 em seu estado inativo. Portanto, a integrina αIIbβ3 parece manter seu estado inativo por meio da formação dessa ponte de sal específica.

Referência: Hughes PE, Diaz-Gonzalez F, Leong L, Wu C, McDonald JA, Shattil SJ e Ginsberg MH (1996) Breaking the integrin hinge: A defined structural constraint regulates integrin signaling. J. Biol. Chem. 271, 6571-6574.

19-11 A resina incha devido a efeitos osmóticos. Como o polímero é negativamente car-regado, ele aprisiona um número equivalente de cátions (presentes no gel ainda seco) para manter a neutralidade elétrica. Devido a forças eletrostáticas, essas car-gas (negativas e positivas) estão confinadas ao volume ocupado pelo polímero. A Sephadex incha rapidamente quando em contato com a água porque a concen-tração de partículas no volume do gel é maior que na água, o que faz com que a água, para equilibrar as concentrações dentro e fora das unidades da estrutura, flua para dentro do gel. O efeito osmótico contrário ocorre quando o tampão con-tendo 50 mM de NaCl é adicionado ao gel inchado: a concentração de partículas é muito maior na solução salina que no gel inchado, o que faz com que a água, para equilibrar a concentração de íons, flua para fora do gel.

19-12 A maioria das proteínas do organismo possui níveis baixos de d-aspartato em sua composição, pois o processo de racemização de l-aspartato a d-aspartato ocorre lentamente. Assim, as proteínas que possuem uma meia-vida curta (com um tem-po de reciclagem rápido) apresentam níveis baixos de d-aspartato em sua compo-sição, ao passo que as proteínas que possuem uma meia-vida mais longa (com um tempo de reciclagem lento) apresentam níveis mais altos de d-aspartato em sua composição. O fato de a elastina possuir níveis relativamente altos de d-aspartato (e que aumentam com o passar do tempo) sugere que essa proteína é sintetizada muito cedo durante o desenvolvimento do organismo e é degradada muito lenta-mente. Isso foi comprovado em seres humanos que incorporaram o radioisótopo 14C em suas moléculas de elastina devido à contaminação ambiental gerada em testes com armas nucleares.

Referência: Shapiro SD, Endicott SK, Province MA, Pierce JA e Campbell EJ (1991) Marked longevity of human lung parenchymal elastic fibers deduced from preva-lence of d-aspartate and nuclear weapons-related radiocarbon. J. Clin. Invest. 87, 1828-1834.

19-13 A melhor opção é simplesmente deixar a alface murcha de molho em água pura: devido à osmose, a alface absorverá água e ficará mais fresca. Se a alface murcha for deixada de molho em água salgada ou água com açúcar, o efeito osmótico con-trário ocorrerá e ela ficará mais flácida, pois mais água será retirada dela. A luz clara e intensa também não ajudará a melhorar o aspecto da alface murcha, uma vez que a fotossíntese não está mais ativa após um certo período de tempo. Assim, com a luz, a alface ficará ressecada.

19-14 A condutividade hidráulica de um único canal de água à pressão atmosférica de 0,1 MPa é 4,4 x 10-23 m3/s ([4,4 x 10-22 m3/s MPa] x 0,1 MPa = 4,4 x 10-23 m3/s). Assim, é preciso definir quantas moléculas de água estão presentes em 4,4 x 10-23 m3. Existem 3,33 x 1028 moléculas de água por m3 ([55,5 moles/L] [103 L/m3] [6 x 1023 moléculas de água/mol]). Portanto, 1,5 x 106 moléculas de água fluem através de um canal de água por segundo à pressão atmosférica de 1 atm ([4,4 x 10-23 m3/s] [3,33 x 1028 moléculas de água/m3]).

Referência: Tyerman SD, Bohnert HJ, Maurel C, Steudle S e Smith JAC (1999) Plant aquaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. J. Exp. Bot. 50, 1055-1071.



Câncer 20 20-1 Falso. Para que o câncer se desenvolva, existe um patamar ótimo de instabilidade

genética. A célula cancerosa deve ser mutável apenas até um certo ponto, pois um nível muito alto de mutabilidade leva ao acúmulo excessivo de mutações e à inviabilidade celular.

20-2 Verdadeiro. É provável que a terapia anticâncer direcionada somente à elimina-ção das células que se dividem rapidamente em um tumor não elimine o câncer de muitos pacientes, porque muitos tipos de câncer são mantidos por um peque-no grupo de células-tronco. Em comparação às células de multiplicação rápida, as células-tronco que mantêm o tumor em geral se dividem mais lentamente e são mais resistentes à ação das drogas anticancerígenas, exigindo um tratamento específico para serem eliminadas.

20-3 Falso. Existem poucas evidências que sustentam tal afirmação, com exceção de casos bastante específicos, como 2-naftilamina e asbestos.

20-4 Falso. O DMBA não é um agente mutagênico específico, uma vez que ocasiona mutações em todo o genoma do organismo. Como o gene Ras é ativado à sua ver-são cancerígena por uma alteração específica de A para T, levando a uma altera-ção específica de aminoácido, somente aquelas mutações induzidas pelo DMBA nesse sítio do gene Ras darão origem a células cancerosas.

20-5 Verdadeiro. Os produtos dos oncogenes apresentam propriedades estimuladoras e os produtos dos genes supressores de tumor apresentam propriedades inibido-ras. Assim, quando mutados, os produtos dos oncogenes tendem a aumentar ain-da mais o crescimento e a proliferação celular, e os produtos dos genes supresso-res de tumor tendem a perder suas funções de bloqueio e repressão dessas vias.

20-6 A incidência de osteossarcoma não mostra o mesmo tipo de idade-dependência que o câncer de colo devido às diferenças existentes entre o número de células em cada tecido em períodos específicos da vida. O número de células no colo é relativamente constante ao longo da vida do organismo, o que implica que, com o passar do tempo, as células podem acumular um maior número de mutações, aumentando, assim, a incidência desse tipo de câncer à medida que o corpo enve-lhece. Já as células responsáveis pelo osteossarcoma estão em seu maior número durante a adolescência (em comparação com crianças e adultos), quando se dá o incremento da massa óssea. Portanto, é nessa idade que se observa a maior in-cidência desse tipo de câncer, sendo o número relativo de células em risco de de-senvolver a doença o fator determinante às diferenças observadas na incidência de osteossarcoma.

Referência: Knudson AG (2001) Two genetic hits (more or less) to cancer. Nat. Rev. Cancer 1, 157-162.

20-7 Em mulheres com mais de 50 anos, as taxas de morte por câncer de mama e cér-vice se reduzem devido à menopausa, quando a produção de hormônios (prin-cipalmente estrogênio) diminui. O estrogênio promove a proliferação de células nos seios e no útero. Portanto, com a diminuição da produção de estrogênio, a população de células em proliferação nesses órgãos também diminui, o que reduz o risco de desenvolvimento de câncer.


74 Capítulo 20 Câncer

Referência: Armitage R e Doll R (1954) The age distribution of cancer and a multi-stage theory of carcinogenesis. Br. J. Cancer 8, 1-12. Reimpresso em (2004) Br. J. Cancer 91, 1983-1989.

20-8 Os oncogenes equivalem a aceleradores estragados, uma vez que, em sua forma mutada, induzem a proliferação celular anormal, não respondendo aos controles normais de multiplicação. Os genes supressores de tumor equivalem a freios que-brados, pois normalmente funcionam inibindo etapas das vias de sinalização que regulam o crescimento e a proliferação celular. Sem a ação inibidora dos genes supressores de tumor, as vias de sinalização perdem o controle. Os genes de ma-nutenção do DNA equivalem a maus mecânicos. Como esses genes são respon-sáveis pela manutenção adequada dos cromossomos no genoma (durante sua replicação e em resposta a danos causados ao DNA), haverá, se forem mutados, um aumento do número de mutações genéticas deletérias, o que pode levar a al-terações nos proto-oncogenes e genes supressores de tumor.

Referência: Vogelstein B e Kinzler KW (2004). Cancer genes and the pathways they control. Nat. Med. 10, 789-798.

20-9 A base biológica dos dados observados está relacionada à noção de que o desen-volvimento do câncer pode ser encarado como um processo microevolutivo no qual o acúmulo crescente de mutações em determinados genes leva à perda dos controles que regulam o crescimento e a multiplicação celular. No caso dos ho-mens que continuaram a fumar após os 50 anos, o risco de acúmulo dessas muta-ções é aumentado devido à contínua exposição aos efeitos tóxicos das substâncias presentes no cigarro. O contrário ocorre naqueles que pararam de fumar aos 30 anos, nos quais a taxa de acúmulo de mutações é bastante diminuída e compará-vel à de pessoas que nunca fumaram, reduzindo, assim, o risco de ocorrência de neoplasias.

Referência: Peto R, Darby S, Deo H, Silcocks P, Whitely E e Doll R (2000) Smoking, smoking cessation, and lung cancer in the UK since 1950: combination of national statistics with two case-control studies. Br. Med. J. 321, 323-329.

20-10 Como os cariótipos das células tumorais analisadas são altamente rearranjados em relação aos do animal selvagem, é de se esperar que as células cancerosas es-tejam sendo transmitidas de um animal ao outro. Não é provável que esse tipo de tumor maligno tenha surgido em consequência de uma infecção por um vírus ou microrganismo, pois esses agentes não são capazes de dar origem a um conjunto semelhante de rearranjos complexos em animais diferentes. Além disso, o fato de um dos animais apresentar uma inversão no cromossomo 5 que não está presente em seu tumor oral-facial sugere que os tumores não estão sendo endogenamente gerados. É possível, portanto, que esse tipo de câncer tenha surgido de uma linha-gem de células cancerosas que adquiriu a capacidade de transmissão e persistên-cia parasítica.

Referência: Pearse A-M e Swift K (2006) Transmission of devil facial-tumour disease. Nature 439, 549.

20-11 A. Neste estudo, seis filtros de seleção foram aplicados para eliminar as alterações de

sequências que aparentemente não contribuem para o tumor. 1. Filtros para mutações silenciosas que geram códons sinônimos (eliminação

de 163.006 alterações). 2. Filtros para alterações também presentes no DNA dos indivíduos normais (eli-

minação de 163.006 alterações). 3. Filtros para alterações que correspondem a polimorfismos conhecidos (elimi-

nação de 11.004 alterações). 4. Filtros para alterações de sequências que não podem ser confirmados após

reamplificação e novo sequenciamento (eliminação de 9.295 alterações). 5. Filtros para alterações que também estão presentes nos tecidos normais do

mesmo indivíduo com tumor (eliminação de 4 alterações).


Capítulo 20 Câncer 75

6. Filtros para alterações nas sequências que possuem sequências intimamente relacionadas em outras regiões do genoma (eliminação de 265 diferenças).

Ao final, resultaram 1.307 mutações potencialmente implicadas nos cânce-res.

B. Uma abordagem possível é investigar os genes mutantes sejam encontrados em múltiplos tumores de mama e colorretais, a fim de estabelecer um perfil caracte-rístico que revele eventuais conjuntos similares das mutações atuantes em tipos similares de tumor.

C. A estratégia de sequenciamento usada no estudo em questão envolveu a ampli-ficação e o sequenciamento de éxons, tendo sido projetada para a detecção de pequenas alterações de sequência, como mutações pontuais e deleções peque-nas. Deleções maiores e rearranjos gênicos não seriam detectados por esse méto-do, pois há um limite para a amplificação de fragmentos de DNA pela técnica de PCR.

Referência: Sjoblom T et al. (2006) The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 314, 268-274.

20-12 Os pró-mielócitos da leucemia pró-mielocítica aguda (APL) estão bloqueados em um estágio intermediário de seu desenvolvimento celular, no qual se dividem sem controle. Desse modo, o número de células aumenta e surge o câncer. A alteração no estágio de diferenciação das células cancerosas da APL, promovida pelo trata-mento com ácido trans-retinoico, ajuda o paciente na medida em que, com a con-versão dos pró-mielócitos em neutrófilos terminalmente diferenciados (que não se multiplicam mais), o processo de proliferação celular anormal é interrompido.

Referência: Warrell RP Jr, de The H, Wang Z-Y e Degos L (1993) Acute promye-locytic leukemia. N. Engl. J. Med. 329, 177-189.

20-13 Nesse caso, os produtos dos oncogenes são os únicos alvos moleculares possíveis para essas pequenas moléculas. Como o produto de um oncogene exibe um fenó-tipo dominante, que promove o crescimento e a proliferação celular, sua inibição pode fazer com que a célula cancerosa retorne a um estado mais normal de ativi-dade. Já os produtos dos genes supressores de tumor e dos genes de manutenção do DNA não são alvos moleculares viáveis à busca e ao desenvolvimento de dro-gas anticancerígenas, pois essas classes de genes causam câncer pela ausência de produção de suas respectivas proteínas inibidoras.



Documents

Respostas Alberts