Paula Ramos Pinto

Restrição intensa de sódio alimentar altera espécies de

glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, favorece

resistência insulínica e elevação de triacilgliceróis plasmáticos

em camundongos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Endocrinologia

Orientadora: Profa. Dra. Marisa Passarelli

São Paulo

2020

Paula Ramos Pinto

Restrição intensa de sódio alimentar altera espécies de

glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, favorece

resistência insulínica e elevação de triacilgliceróis plasmáticos

em camundongos

Tese apresentada à Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo para obtenção do

título de Doutor em Ciências

Programa de Endocrinologia

Orientadora: Profa. Dra. Marisa Passarelli

São Paulo

2020

Este estudo foi desenvolvido no Laboratório de Lípides (LIM-10) da Faculdade

de Medicina da Universidade de São Paulo (USP) com a colaboração do

Laboratório de Carboidratos do Instituto de Ciências Biomédicas da USP e do

Laboratório de Lipídeos Modificados do Instituto de Química da USP.

DEDICATÓRIA

Dedico esta tese à minha mãe Heloisa e à minha irmã Márcia, minhas grandes incentivadoras. Amo vocês incondicionalmente.

EPÍGRAFE

“Que nada nos limite. Que nada nos defina. Que nada nos sujeite. Que a liberdade seja a nossa própria substância, já que viver é ser livre”. Simone de Beauvoir

AGRADECIMENTOS

Dra. Marisa Passarelli, a vida me presenteou com a sua orientação. Na sua

exigência, sede de conhecimento e instinto questionador me vi amadurecer na

pesquisa. Aprendemos e amadurecemos juntas com as nossas diferenças.

Minha gratidão a você é infinita.

Dr. Sérgio Catanozi, agradeço antes de tudo, pelo convite a participar do

projeto sobre restrição dietética de sódio, linha de estudo que introduziu no

laboratório de lípides há muitos anos. Agradeço também pelos ensinamentos

que me proporcionou direta e indiretamente tanto no campo acadêmico como

em meu desenvolvimento pessoal.

Meus amigos-colaboradores de projeto Ana Paula Bochi, Me Guilherme

Ferreira da Silva, Vanessa Del Bianco, Mayara Trevisani e Letícia Gomes,

partilhar este estudo com vocês trouxe o dobro de trabalho, mas multiplicou de

maneira inenarrável as minhas possibilidades de aprendizado. A vocês os

meus mais sinceros agradecimentos pela constante parceria e ajuda. Gui,

obrigada pelas discussões acadêmicas, pelos conselhos e pelas conversas

filosóficas e políticas durante os experimentos e almoços no bandejão. Ana, de

uma maneira que nunca imaginei que aconteceria, nossas diferenças nos

uniram, na ciência e na nossa amizade, obrigada por me ensinar sempre um

jeito diferente de ver as coisas e por estar sempre presente. À Van agradeço a

companhia e as conversas malucas nos experimentos de western blotting e por

dividir as marmitas do seu Chico comigo. Letícia, obrigada por me ajudar em

diversos momentos de aperto. Mayara obrigada por me ensinar a lidar com

meus erros.

À Dra. Edna Regina Nakandakare agradeço imensamente por fazer o LIM-10

acolhedor e parecer uma família. Agradeço ainda todo suporte, carinho e

paciência no dia-a-dia do laboratório, a companhia e orientação nos

congressos que participamos juntas e pelo inesquecível pavê de amendoim.

Ao Dr Éder Quintão agradeço cada momento de discussão e cada história

compartilhada, as separatas mensais e os divertidos encontros anuais de

confraternização de final de ano. É sempre inspirador compartilhar alguns

minutos de conversa com o senhor.

Ao Dr. Ubiratan Fabres Machado e à Dra. Sayuri Miyamoto agradeço por

abrirem as portas dos seus respectivos laboratórios. Agradeço a ajuda dos

colaboradores envolvidos neste projeto, em especial a Dra. Maristela Okamoto

e Dr. Marcos Yoshigana, por toda orientação, ensinamento e socorro durante

os ensaios, tratamento e discussão de resultados.

Dra. Valéria Sutti Nunes, Dra. Patrícia Cazita, Fabiana Ferreira e Kelly Gomes,

obrigada por toda a ajuda do dia-a-dia, por me tirarem infinitas dúvidas, pelas

conversas prazerosas, as terapias em grupo e por compartilhar um pouco da

vida de vocês comigo.

À Dra. Ana Maria Lottenberg obrigada pelo carinho, pelas palavras acolhedoras

em diversos momentos do doutorado, e do amor que compartilha com a gente

na forma de torta de ricota e bolo de chocolate com coco.

À Dra. Lígia Shimabukuro Okuda, presente na minha trajetória antes ainda de

ingressar no mestrado. Dos protocolos as conversas reflexivas sobre a vida

não consigo dizer o quanto aprendi e aprendo com você a cada dia. Muito

obrigada por tudo.

Ao Dr. Raphael de Souza Pinto agradeço à amizade, companhia e pelas

cervejas quando as nossas padronizações de RNA deram errado. Pelas

discussões científicas e sobre os temas mais polêmicos.

À Me Monique F. Mello Santana foi incrível sermos laureadas com o Young

Investigator Fellowship do EAS no mesmo ano e compartilharmos a

experiência de viajarmos juntas, ficarmos nervosas juntas para fazer uma

apresentação oral, de caminharmos infinitamente até ficarmos cansadas.

Obrigada por dividir essa experiência comigo, por me permitir te conhecer

melhor, por conversar comigo sobre reality shows.

A minha eterna gratidão aos melhores secretários do mundo Claudia Souza,

Rubens J. da Silva e Maria Aparecida da Silva, estes queridos que sempre

estiveram à disposição para me ajudar com as questões administrativas e

burocráticas da pós-graduação e com quem compartilhei momentos de alegria

e descontração ao longo do processo.

Ao professor Dr. Chin Jia Lin, Dra. Natália Gomes Gonçalves e Dra. Aritania

Santos muito obrigada pelo espaço cedido para ensaios de PCR e por toda

disposição em discutir as minhas dúvidas sobre a técnica e padronizações.

Francisca Elda B. Dantas, Guilherme André Marcelino, Mariana Ribeiro e

Sayonara Assis, obrigada pelas conversas descontraídas nos intervalos dos

experimentos, pela companhia no almoço, pelos bolos e doces trazidos para

alegrar nossos dias e pela ajuda nos protocolos. Um futuro acadêmico lindo

para vocês

Aos médicos Aécio Lira e Carlos Minanni muito obriga pelas orientações que

carinhosamente me dedicaram nesses anos, pelas conversas na bancada e no

escritório sobre cerveja, shows de rock, comida e corrida.

À querida Rosibel, obrigada pelo cuidado com os nossos materiais, pela

companhia nos experimentos, pelas dicas sobre plantinhas e pelo café que

sempre me deixava pronta para trabalhar todos os dias.

Agradeço a um time de amigos, doutores e mestres, que tive o prazer de

conhecer no LIM-10, Adriana M. S. de Lima, Diego J. Gomes, Gabriela

Castilho, Juliana Tironi, Karolline S. da Silva, Maria Silvia F. Lavrador, Milessa

Afonso, Rodrigo Tallada Iborra e Tatiana Venâncio. Com vocês, compartilhei as

bancadas do laboratório, discussões sobre experimentos, participações em

congressos e momentos de alegria em churrascos e mesas de bar. Não se faz

ciência sozinho, vocês me ensinaram muito e tornaram minha jornada

acadêmica muito especial.

Aos meus tios Ronaldo, Carmelita, Boaventura e Rose agradeço o carinho,

incentivo e apoio. Amo vocês.

Aos amigos Alessandro, Aline Marques e Nozima, Bruna, Daniele, Elis, Juliana,

Luanny, Miriam, Natália, Patrícia e Rita agradeço a paciência com meus

desabafos sobre a vida acadêmica, a ajuda com figuras e planilhas, por

entenderem a minha ausência em alguns momentos e por comemorarem

comigo as minhas conquistas.

À minha irmã Márcia, agradeço todo aprendizado fruto das nossas

semelhanças e diferenças. Aprecio e valorizo o seu jeito único de torcer pela

minha trajetória acadêmica e pessoal e agradeço por comemorar comigo

minhas conquistas.

À minha mãe, Heloisa, agradeço imensamente pelo apoio e amor incondicional.

Da sua simplicidade nasceram as lições mais valiosas da minha vida. Te amo,

admiro e respeito mais que qualquer outro ser neste mundo.

Agradeço ao apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior, Brasil – Capes (Código de Financiamento 001).

SUMÁRIO

DEDICATÓRIA

EPÍGRAFE

AGRADECIMENTOS

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

ABSTRACT

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1

1.1. Restrição de sódio e risco cardiovascular ............................................. 1

1.2. Conteúdo intramuscular e intramiocelular de lipídeos e sensibilidade

insulínica ......................................................................................................... 8

2. JUSTIFICATIVA ......................................................................................... 12

3. OBJETIVO ................................................................................................. 13

4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 14

4.1. Modelo Animal .................................................................................... 14

4.2. Protocolo experimental ........................................................................ 15

4.3. Dietas normossódica e hipossódica .................................................... 16

4.4. Dosagens bioquímicas ........................................................................ 17

4.5. Excreção urinária de sódio .................................................................. 18

4.6. Mensuração da pressão arterial caudal .............................................. 18

4.7. Perfil plasmático de lipoproteínas ....................................................... 19

4.8. Teste de tolerância à insulina .............................................................. 20

4.9. Obtenção do gastrocnêmio ................................................................. 20

4.10. Análise da expressão gênica por reação de polimerase em cadeia

quantitativa em tempo real (RT-qPCR). ........................................................ 20

4.11. Determinação do conteúdo proteico de AKT e GLUT4 .................... 23

4.12. Análise de espécies lipídicas no gastrocnêmio ................................ 24

Extração lipídica do tecido muscular ............................................................. 24

Lipidômica ..................................................................................................... 24

4.13. Análise Estatística ............................................................................ 27

5. RESULTADOS .......................................................................................... 28

6. DISCUSSÃO .............................................................................................. 51

7. CONCLUSÃO ............................................................................................ 60

8. ANEXOS .................................................................................................... 61

9. REFERÊNCIAS ......................................................................................... 70

LISTA DE ABREVIATURAS

AC acilcarnitina

Acacb acetil CoA carboxilase beta

Actb beta actina

AGL ácidos graxos livres

AKT1 proteína cinase B

Akt1 gene que codifica para proteína cinase B

ANG angiotensina

apo E apolipoproteína E

AT-1 receptor de angiotensina tipo 1

B2m beta 2 microglobulina

Cd36 gene que codifica para proteína de transporte de ácidos graxos CD36

CE colesterol esterificado

Cer ceramida

CL cardiolipina

Cpt1b carnitina palmitoil transferase 1b

CT colesterol total plasmático

DAG diacilglicerol

DCV doenças cardiovasculares

DM diabetes mellitus

ECA enzima conversora de angiotensina

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético

Fabp3 proteína de ligação de ácidos graxos

FPLC cromatografia líquida para separação rápida de proteínas

Gapdh gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

GLUT4 transportador de glicose 4

HAS hipertensão arterial sistêmica

HDL lipoproteína de densidade alta

HDLc colesterol na lipoproteína de densidade alta

Hprt hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase

HS grupo do protocolo experimental alimentado com dieta hipossódica

ICAM-1 molécula de adesão intercelular

IGF-1 fator 1 de crescimento semelhante à insulina

IL-6 interleucina 6

IRS1 substrato do receptor de insulina

Irs1 gene que codifica para o substrato do receptor de insulina

ITT teste de tolerância à insulina

LC cromatografia líquida

LDL lipoproteína de densidade baixa

LDLc colesterol na lipoproteína de densidade baixa

LDLR KO camundongo knockout para a o receptor de LDL

Lpl lipoproteína lipase

LysoPC lisofosfatidilcolina

LysoPE lisofosfatidiletanolamina

MAPK proteína cinase ativada por mitogênio

MCP-1 proteína quimoatraente de monócitos 1

mEq miliequivalente

NF-KB fator de transcrição nuclear

NS grupo do protocolo experimental alimentado normossódica

PS fosfatidilserina

PA pressão arterial

PBS solução salina tamponada de fosfato

PC fosfatidilcolina

PC fosfatidilcolina

PKC Proteína cinase C

PCR proteína C reativa

PE fosfatidiletanolamina

PE fostatidiletanolamina

PI fosfatidilinositol

PG fosfatidilglicerol

Ppargc1a coativador 1-alpha do receptor ativador da proliferação de peroxissomos gama

Prkaa1 subunidade alfa 1 da proteína cinase tivada pelo AMP (

RI resistência à insulina

ROS espécies reativas de oxigênio

Rplp0 proteína ribossomal P0

RT-qPCR reação de polimerase em cadeia quantitativa em tempo real

Slc2a4 gene que codifica para o transportador de glicose 4, GLUT4

SM esfingomielina

SNS sistema nervoso simpático

SOD superóxido dismutase

SRAA sistema renina-angiotensina-aldosterona

TAG triacilglicerol

TNF-alfa fator de necrose tumoral alfa

VCAM-1 molécula de adesão vascular 1

VLDL lipoproteína de densidade muito baixa

RESUMO

Pinto PR. Restrição intensa de sódio alimentar altera espécies de

glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, favorece resistência

insulínica e elevação de triacilgliceróis plasmáticos em camundongos. [tese].

São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2020.

A restrição alimentar de sódio reduz a pressão arterial (PA) e a

morbimortalidade por doenças cardiovasculares. Entretanto, quando intensa e

crônica, favorece resistência insulínica (RI), alteração nos lipídeos plasmáticos

e sua infiltração no arco aórtico em modelos animais de dislipidemia. Avaliou-

se o efeito da restrição dietética intensa e crônica de sódio sobre o perfil de

espécies lipídicas e a expressão de genes e proteínas envolvidas na

homeostase de lipídeos e glicose no gastrocnêmio de camundongos knockout

para o receptor de lipoproteínas de densidade baixa (LDLR KO) como possível

determinante para o aumento da concentração plasmática de lipídeos e RI.

Camundongos LDLR KO, machos com 3 meses de idade, foram tratados com

dieta normossódica (0,5% Na; n = 13 - 19) ou hipossódica (0,06% Na; n = 14 -

20), por 90 dias. Massa corporal (MC), PA, colesterol total (CT) e triacilglicerol

(TAG) plasmáticos, glicose, hematócrito, sensibilidade à insulina e excreção

urinária de sódio foram determinados. No gastrocnêmio foi avaliada a

expressão gênica (RT-qPCR) e proteica (imunoblot) de mediadores da via de

sinalização da insulina e fluxo de lipídeos e o conteúdo de espécies lipídicas

(lipidômica global). A dieta hipossódica, em comparação à normossódica,

elevou a MC (9%), TAG (51%), glicemia (19%) e RI (46%). No gastrocnêmio,

aumentou as espécies de fosfatidilcolinas (68%), fosfatidilinositol (90%) e

ácidos graxos (59%), e reduziu cardiolipinas (41%) e acilcarnitinas (9%). A

expressão de genes envolvidos na captação e oxidação muscular de lipídeos

foi aumentada pela dieta hipossódica (Fabp3,106%; Prkaa1, 46% e Cpt1,

74%). Em conclusão, a redução intensa de sódio alimentar em camundongos

altera espécies de glicerofosfolipídeos e ácidos graxos no gastrocnêmio, o que

pode se vincular à elevação da RI e triacilgliceróis plasmáticos nestes animais.

Descritores: Dieta hipossódica; Resistência à insulina; Músculo esquelético,

Metabolismo dos lipídeos; Ácidos graxos, Lipidômica.

ABSTRACT

Pinto PR. Severe sodium diet restriction alters glycerophospholipid and free

fatty acid species in gastrocnemius and induces insulin resistance and plasma

triacylglycerol increase in mice. [thesis]. São Paulo: Faculdade de Medicina,

Universidade de São Paulo; 2020.

Dietary sodium restriction reduces blood pressure (BP) and cardiovascular

disease morbidity and mortality. However, when intense and chronic, it favors

insulin resistance (IR), changes in plasma lipids and infiltration of lipids in the

aortic arch in animal models of dyslipidemia. The effect of intense and chronic

sodium restriction on the profile of lipid species and the expression of genes

and proteins involved in lipid and glucose homeostasis in the gastrocnemius of

knockout mice for the low-density lipoprotein receptor (LDLR KO) was

evaluated as a possible determinant for the increase in plasma lipids and IR.

Three-months old male LDLR KO mice were fed a normal diet (0.5% Na; n = 13

- 19) or low-sodium diet (0.06% Na; n = 14 - 20), for 90 days. Body mass (BM),

BP, plasma total cholesterol (TC) and triacylglycerol (TAG), glucose,

hematocrit, insulin sensitivity and urinary sodium excretion were determined.

Gene (RT-qPCR) and protein (immunoblot) expression of the insulin signaling

pathway and lipid flow mediators, as well as lipid species (global lipidomics)

were evaluated in the gastrocnemius. Low-sodium diet as compared to the

normal-sodium diet increased BM (9%), TAG (51%), blood glucose (19%) and

IR (46%). In the gastrocnemius species of phosphatidylcholines (68%),

phosphatidylinositol (90%) and fatty acids (59%) were increased, and

cardiolipins (41%) and acylcarnitines (9%) reduced. The expression of genes

involved in lipid uptake and oxidation was increased by the low-sodium diet

(Fabp3,106%; Prkaa1, 46% and Cpt1, 74%). In conclusion, severe sodium diet

restriction in mice alters glycerophospholipid and fatty acid species in the

gastrocnemius, which can be linked to the elevation of IR and plasma

triacylglycerols in these animals.

Descriptors: Sodium-restricted diet; Insulin resistance; Skeletal muscle; Lipid

metabolism; Fatty acids, Lipidomics.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Restrição de sódio e risco cardiovascular

As doenças cardiovasculares (DCV) e cerebrovasculares estão entre as

principais causas de mortalidade no cenário mundial. As doenças isquêmicas

do coração e os acidentes vasculares encefálicos ocupam a primeira e a

terceira posição, respectivamente, na classificação das principais causas de

morte (GBD 2017 Mortality and Causes of Death Collaborators, 2018). No

Brasil, um panorama semelhante foi observado por França et al. (2017), em

2015, onde 31,2% dos óbitos foram atribuídos as DCV.

Contribuem para tais doenças fatores de risco primários, como: idade,

sexo, histórico familiar prévio de DCV, hipertensão arterial sistêmica (HAS),

dislipidemia, diabetes mellitus (DM) e tabagismo, além de fatores de risco

secundários, como obesidade e sedentarismo (Lim et al., 2012; Hajifathalian et

al., 2015).

A HAS é o principal fator de risco para mortes por DCV, doença renal

crônica e DM e foi responsável por mais de 40% das mortes por estas doenças

no mundo, em 2010 (Global Burden of Metabolic Risk Factors for Chronic

Diseases Collaboration, 2014). A HAS, caracterizada por valores de pressão

sistólica ≥ 140 mmHg ou pressão diastólica ≥ 90 mmHg, se apresenta em

24,1% dos homens e 20,1% das mulheres da população global (James et al.,

2014; WHO, 2013; NCD-RisC, 2017). Por se tratar de uma doença altamente

prevalente e associada à morbidade e mortalidade, abordagens para a redução

2

da HAS amplamente são recomendadas, o que se reflete na prevenção das

DCV (Oparil, 2014).

O elevado consumo de sódio é considerado o principal fator ambiental

para o desenvolvimento da HAS (Stamler et al., 1991). Observa-se uma

relação direta entre a alta ingestão de sódio e o aumento crônico de pressão

arterial, tanto em indivíduos hipertensos como em normotensos (Weinberger et

al., 1996; Orlov et al., 2007, Mente et al., 2016).

Em 2010, 1,65 milhão de mortes por causas cardiovasculares foram

atribuídas ao consumo de sódio acima do valor de referência (2 g de sódio/dia),

sendo que a ingestão média de sódio estimada na população mundial foi de

3,95 g/dia (Mozaffarian et al., 2014; Powles et al., 2013). De acordo com a

Organização Mundial de Saúde (OMS), a recomendação para consumo diário

de sódio não deve ultrapassar 2 g (5 g de sal - NaCl) (WHO, 2019). A

Associação Americana do Coração (American Heart Association) sugere

consumo inferior a 1,5 g de sódio (3,8 g de sal) para portadores de HAS, DM,

doença renal crônica, negros e adultos com mais de 51 anos, e 2,3 g de sódio

(5,8 g de sal) para o restante da população (Lloyd-Jones et al., 2020). Isto

porque a alta ingestão de sódio é apontada como fator de risco independente

para modificações patológicas como, remodelamento vascular, hipertrofia

cardíaca, acidente cerebrovascular e risco de mortalidade por todas as causas

(Meneton et al., 2005; Muntzel et al., 1992; Katayama et al., 2014; Cook et al.,

2016).

Juntamente com a intervenção medicamentosa, alterações do estilo de

vida, como a redução da ingestão de sódio, interrupção de tabagismo e a

prática regular de exercício físico conferem êxito no tratamento não-

3

farmacológico da HAS (Brook et al., 2013). No estudo epidemiológico DASH

(Dietary Approaches to Stop Hypertension) que preconizou a adoção de

hábitos alimentares com ingestão de frutas e vegetais, menor quantidade de

gordura e redução de aproximadamente 30% do consumo de sal, observou-se

redução de pressão arterial em pacientes hipertensos e normotensos (Sacks et

al., 2001). He, Li e Macgregor (2013), em uma metanálise que avaliou 35

estudos (3.230 participantes), descreveram que a redução moderada da

ingestão de sal levou a importante redução da pressão arterial. Além deste

benefício, a redução do consumo de sódio reflete-se na redução de custos

médicos e prevenção de morbidades associadas à HAS (Tuomilehto et al.,

2001; Krikken et al., 2009; Bibbins-Domingo et al., 2010; Del Rio et al., 1993).

Neste sentido, programas de incentivo à redução do consumo de sódio

dietético foram apresentados por diversas organizações. Como por exemplo, o

plano de ação global para prevenção e controle de doenças crônicas não-

transmissíveis, implementado pela OMS, no qual estimula-se a redução relativa

de 30% da ingestão média de sal e sódio (WHO, 2013; Cappuccio et al., 2019).

De modo semelhante, o programa europeu de implementação de redução de

sal, abrangeu campanhas de políticas sociais e de saúde, sugerindo menor

consumo de sal, além de priorizar ações de reformulação da composição de

nutrientes nos alimentos industrializados (European Commission, 2013).

Em contrapartida, estudos de coorte que examinaram a associação

entre a excreção urinária de sódio de 24 h (que reflete o consumo dietético

diário de sódio) e desfechos cardiovasculares e mortalidade, em mais de 100

mil participantes, demonstraram, de forma surpreendente, que o consumo de

sódio inferior a 3 g por dia também se associou com o aumento de risco de

4

eventos cardiovasculares para indivíduos com ou sem HAS (Mente et al., 2016;

O’Donnell, 2014 e 2019). Em ambos os estudos, o consumo estimado de sódio

entre 3 e 6 g ao dia foi associado com menor risco de morte por eventos

cardiovasculares em comparação ao consumo maior ou menor que esta faixa,

sugerindo uma associação em forma de jota (J-shaped) entre o consumo de

sódio e desfechos cardiovasculares.

Apesar do seu importante efeito hipotensor, a restrição alimentar intensa

de sódio promove efeitos metabólicos adversos, como o estímulo à atividade

do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA), do sistema nervoso

simpático (SNS) e hiperlipidemia. Esses efeitos foram confirmados por Graudal

et al. (2017), em um levantamento de 125 ensaios clínicos randomizados até

2016 que incluiu indivíduos normotensos e hipertensos. Tais estudos

empregaram redução dietética média de sódio de 201 mmol (4,6 g) para 66

mmol (1,5 g) e os indivíduos com baixo consumo de sódio apresentaram

concentrações plasmáticas mais altas de renina (55%), aldosterona (127%),

epinefrina (14%), norepinefrina (27%), colesterol total (CT; 2,9%) e triacilglicerol

(TAG; 6,3%) em comparação aos indivíduos que ingeriram dieta com alto teor

de sódio.

Homens jovens e saudáveis que participaram de protocolo de restrição

de sódio na dieta, com duração de uma semana, apresentaram modesta

redução da concentração de colesterol na lipoproteína de densidade alta

(HDLc) e apolipoproteina A-I (apo A-I), principal constituinte das HDL (Krikken

et al., 2012). No entanto, as alterações mais proeminentes, em modelos

animais e humanos hipertensos, foram relacionadas ao aumento da

colesterolemia, colesterol na lipoproteína de densidade baixa (LDLc) e

5

trigliceridemia (Catanozi et al., 2001, 2003; Nakandakare et al., 2008). A

elevação das concentrações plasmáticas de colesterol, principalmente, nas

LDL e a redução da concentração de HDLc são os componentes da

dislipidemia, diretamente associados à gênese da lesão aterosclerótica

(Tanabe et al., 2010 e Wilson et al., 1988).

Em ratos Wistar alimentados com dieta pobre em cloreto de sódio

observou-se maior concentração plasmática de ácidos graxos livres (AGL) e

TAG, em comparação aos animais que receberam dieta normossódica (NS -

0,5% de sódio) (Catanozi et al., 2001). Este evento foi atribuído à diminuição da

remoção plasmática de lipoproteínas ricas em TAG (quilomícrons e

lipoproteínas de densidade muito baixa, VLDL), independentemente de

alterações na síntese hepática de TAG.

Em camundongos knockout para o receptor de LDL ou para

apolipoproteína E (apo E), além do aumento da trigliceridemia, observou-se

maior concentração circulante de AGL nos animais que receberam dieta pobre

em sódio em comparação aos alimentados com dieta normossódica (Catanozi

et al., 2003). Neste estudo, apenas os animais knockout para o receptor de

LDL sob restrição de sódio apresentaram elevação da colesterolemia e maior

infiltrado lipídico no arco aórtico, em comparação aos animais em dieta

normossódica. Todavia, em outros protocolos experimentais com

camundongos knockout para apo E que receberam dieta pobre em sal também

se observou maior desenvolvimento de aterosclerose em comparação aos

grupos alimentados com dieta normo ou hiperssódica (Ivanovski et al., 2005;

Tikellis et al., 2012).

6

Em camundongos dislipidêmicos, com hipertensão renovascular,

caracterizada por aumento crônico de angiotensina (ANG) II circulante, a

restrição de sódio na dieta, a partir do desmame, aumentou o infiltrado de

lipídeos arteriais. Este evento foi prevenido pela losartana, bloqueador seletivo

do receptor de ANG II (receptor de ANG tipo 1, AT1) a qual,

independentemente da redução pressórica, diminuiu a concentração de

carboximetil-lisina, marcador de glicoxidação (Fusco et al., 2017).

Em humanos hipertensos, a dieta com concentração reduzida de sódio,

apesar da ativação do SRAA, não alterou parâmetros inflamatórios, como

interleucina 6 (IL-6) e proteína C reativa (PCR) no plasma (Chamarthi et al.,

2011). Em contraste, estudos que utilizaram animais knockout para apo E ou

duplo knockout para apo E e enzima conversora de ANG (ECA) 2, a restrição

de sódio na dieta promoveu aumento tecido-específico da expressão gênica e

conteúdo da molécula de adesão vascular 1 (VCAM-1), molécula de adesão

intercelular (ICAM-1), IL-6, fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) e proteína

quimoatraente de monócitos 1 (MCP-1) (Tikellis et al., 2012; Thomas et al.,

2010). A restrição alimentar crônica de cloreto de sódio em indivíduos com

HAS moderada favoreceu o aumento de citocinas inflamatórias, concentrações

plasmáticas de TAG, renina e aldosterona, insulina de jejum e o HOMA-IR

(Nakandakare et al., 2008).

Ao lado das alterações provocadas na circulação, evidenciam-se efeitos

deletérios em diversos órgãos como, rim, cérebro, pâncreas, musculatura

esquelética, órgãos reprodutivos, tecido adiposo e vascular, resultantes da

ativação sustentada do SRAA (Benigni et al., 2010).

7

Modelos experimentais demonstram relação entre a restrição de sal e o

prejuízo da sinalização insulínica. A dieta pobre em sal levou ao aumento da

massa corpórea, adiposidade e percentual de gordura na carcaça de ratos, e

tais alterações se correlacionaram diretamente à RI (Okamoto et al., 2004;

Prada et al., 2005). Prada et al. (2005) verificaram redução da fosforilação do

receptor de insulina e do substrato do receptor de insulina 1 (IRS1) no músculo

e fígado destes animais em comparação aos tratados com dieta normossódica.

Embora exista uma grande associação entre HAS e RI, alguns estudos

demonstraram que, mesmo na ausência de elevação da pressão arterial, a

ativação do SRAA, por si, pode promover alteração na via de sinalização da

insulina (Garg et al., 2010; Bentley-Lewis et al., 2007). Estresse oxidativo e

inflamatório e aumento da atividade simpática, gerados pela ativação do SRAA,

vinculam-se à gênese e perpetuação da RI (Wei et al., 2006; Diamond-Stanik et

al., 2010), na qual prevalecem alterações no metabolismo de lipídeos e

lipoproteínas que contribuem para um perfil aterogênico.

A ativação do SRAA vincula-se à redução da captação muscular de

glicose com redução da translocação do transportador de glicose, GLUT4

(Ogihara et al., 2002; Wei et al., 2006). A sinalização desencadeada a partir da

ligação da ANG II ao receptor AT-1 leva à geração de espécies reativas de

oxigênio (ROS) as quais, cronicamente, aumentam o estresse oxidativo

tecidual e ativam fator de transcrição nuclear (NF-KB) que pode agir como um

regulador negativo da sinalização insulínica (Cabello-Verrugio et al., 2015). O

aumento do estresse inflamatório crônico, promovido pela elevação de AGL e

pela maior geração de citocinas por macrófagos do subtipo M1 que infiltram o

8

tecido adiposo ou ativação do SRAA também perpetua a redução do sinal

insulínico (Waki et al., 2007).

O tratamento do músculo sóleo de ratos Zucker não-obesos com ANG II

reduziu a sinalização insulínica e a captação de glicose dependente de insulina

(Diamond-Stanic et al., 2010). Além disso, por aumento de atividade da via

proteolítica dependente de ubiquitina, a ANG II diminuiu a massa muscular

esquelética. Ratos Sprague-Dawley, infundidos com ANG II apresentaram

redução de musculatura esquelética (sóleo e gastrocnêmio) que foi atribuída ao

aumento de proteólise muscular (Brink et al., 2001). Estudo em ratos evidencia

que a infusão de ANG II aumenta a proteólise muscular, reduz a concentração

circulante e muscular do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1),

diminui a fosforilação da proteína cinase B (AKT) e ativa a caspase-3 na

musculatura esquelética, favorecendo a clivagem de actina e aumento de

apoptose. Tais achados indicam que uma possível downregulation na via de

sinalização da IGF-1 desempenhe importante função na proteólise muscular

induzida pela ANG II (Song et al., 2005).

1.2. Conteúdo intramuscular e intramiocelular de lipídeos e sensibilidade

insulínica

No final dos anos 90, diversos estudos investigaram a relação entre o

acúmulo ectópico de TAG e a sensibilidade insulínica avaliada por clamp

euglicêmico. Nestes estudos, uma forte associação foi observada entre o

conteúdo intramiocelular de TAG e a RI em indivíduos saudáveis, obesos e

9

portadores de DM do tipo 2 (Forouhi et al., 1997; Goodpaster et al., 1997;

Perseghin, 1999; Jacob et al., 1999).

Nessa perspectiva, o acúmulo inter e intramiocelular de TAG passou a

ser reconhecido como importante marcador de RI. Esta atribuição, no entanto,

foi revista diante dos achados de Goodpaster et al. (2001), nos quais indivíduos

com DM2 e atletas de endurance apresentaram conteúdo intramuscular de

TAG expressivamente maior que indivíduos sedentários saudáveis e magros.

Entretanto, apenas nos atletas observou-se maior capacidade oxidativa das

fibras musculares, determinada pela medida da succinato desidrogenase. As

características do tipo de lipídeo acumulado na musculatura dos atletas de

endurance, em comparação aos indivíduos obesos, foi outro importante achado

que se associou à sensibilidade insulínica (Amati et al., 2011).

Em meio a diversas alterações metabólicas, a hipertrigliceridemia é um

dos mecanismos promotores da menor sensibilidade insulínica tecidual em

indivíduos obesos e diabéticos. O maior aporte de AGL e o prejuízo em sua

oxidação resulta no acúmulo intramuscular de TAG e substratos metabólicos

dos AGL, como acil-Coa (ácidos graxos acilados) de cadeia longa, ceramidas

(Cer) e diacilglicerol (DAG) (Pan et al., 1999). Em modelos experimentais, a

relação entre o aumento de TAG e AGL circulantes e o acúmulo de tais

substratos na musculatura esquelética de animais diabéticos e obesos também

foi evidenciada (Zabielski et al., 2014; Kim et al., 2001; Lee et al., 2006).

Na musculatura esquelética, os DAG ativam a proteína cinase C (PKC)

teta que promove a fosforilação do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1)

em resíduos de serina ao invés de tirosina, suprimindo a sinalização insulínica

e reduzindo a captação de glicose via insulina, pelo GLUT4 (Griffin et al., 1999;

10

Yu et al., 2002). As Cer, por sua vez, promovem a hiperglicemia pela ativação

da proteína fosfatase 2A, que desfosforila AKT e estimula outras proteínas da

família PKC, lambda e zeta, que também inibem a atividade da AKT (Bourbon

et al., 2002; Chalfant et al., 1999). Em outros estudos, a redução da

translocação de GLUT4 para a membrana das fibras musculares também se

associou com a redução da capacidade oxidativa e aumento de esfingolipídeos

totais, os quais se relacionam igualmente com RI (Collino et al., 2014; Coen et

al., 2013).

Além de lipídeos de depósito como os glicerolipídeos, TAG e DAG, e dos

esfingolipídeos, em especial as Cer, outras moléculas lipídicas envolvidas na

sinalização celular e nos componentes de membrana também têm sido

investigadas quanto ao seu papel na sensibilidade insulínica. Entre elas estão

os glicerofosfolipídeos.

Os lipídeos estruturais mais abundantes nas membranas eucarióticas

são os glicerofosfolipídeos, também descritos como fosfolipídeos, e suas

principais classes são fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE),

fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) e cardiolipinas (CL) (van Meer et al.,

2008). Os fosfolipídeos são componentes estruturais importantes das

membranas celulares e podem influenciar diversas propriedades relacionadas

a função das membranas como permeabilidade, fluidez e ancoragem de

proteínas relacionadas à membrana (Senoo et al., 2015). São importantes

ainda para o funcionamento mitocondrial, como PE e CL que desempenham

papel em manter o potencial da membrana interna e a atividade das cadeias

respiratórias, em especial da enzima citocromo c oxidase que, por sua vez,

diminui na depleção dos dois fosfolipídeos (Böttinger et al., 2012). Embora

11

exista evidências que fosfolipídeos do músculo esquelético sofram

remodelamento em resposta a vários estímulos metabólicos que incluem dieta

rica em gordura e exercício físico (Funai et al., 2013), pouco se sabe sobre o

papel da dieta hipossódica sobre os lipídeos musculares. Tais mudanças

podem influenciar a sensibilidade insulínica e a tolerância a glicose sistêmica.

12

2. JUSTIFICATIVA

A redução do consumo de sal é importante conduta não-farmacológica

para o controle da pressão arterial, contribuindo, desta forma, para a redução

de eventos cardio e cerebrovasculares. Não obstante, a restrição intensa e

crônica de sódio alimentar vincula-se à ativação do SRAA, piora da

sensibilidade hepática e muscular à insulina, perfil inflamatório, prejuízo no

metabolismo de lipoproteínas e acúmulo de lipídeos na parede arterial de

animais dislipidêmicos. Em humanos, a restrição intensa de sódio alimentar

também eleva a trigliceridemia e a concentração de marcadores inflamatórios

na circulação, com piora da sensibilidade insulínica. A elevação dos

triacilgliceróis plasmáticos se associa ao prejuízo da sinalização insulínica na

musculatura esquelética. Além disso, o conteúdo intramuscular de

triacilgliceróis e outras espécies lipídicas vinculam-se, diretamente, à redução

na cascata de sinalização do receptor de insulina. Não há estudos na literatura

que avaliem os efeitos da dieta hipossódica sobre a distribuição de lipídeos

musculares. A hipótese deste estudo é de que a restrição intensa e crônica de

sódio dietético altere o conteúdo de espécies lipídicas e a expressão de genes

envolvidos na captação de lipídeos e sinalização insulínica no gastrocnêmio,

contribuindo para a RI e elevação de triacilgliceróis plasmáticos induzidos pela

restrição intensa de sódio dietético.

13

3. OBJETIVO

Avaliar em camundongos knockout para o receptor de LDL (LDLR KO) o

perfil de subespécies lipídicas, por lipidômica global, e a expressão de

proteínas e genes envolvidos na sinalização insulínica, captação e oxidação de

lipídeos no gastrocnêmio, como elementos contribuintes à RI e elevação de

triacilgliceróis plasmáticos induzidos pela restrição intensa de sódio dietético.

14

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1. Modelo Animal

Para este estudo, foram utilizados camundongos com base genética

C57BL/6J, knockout para o receptor de LDL (LDLR KO) procedentes do The

Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, EUA). O receptor de LDL se localiza

na membrana plasmática de diversos tipos celulares e é responsável pela

endocitose de lipoproteínas que contêm apoB. A ausência deste receptor

favorece o acúmulo de LDL e VLDL na circulação (Ishibashi et al., 1993;

Ishibashi et al., 1994) e consequente elevação da colesterolemia. Os valores

séricos de colesterol total (CT) são de, aproximadamente, 200 a 275 mg/dL,

duas a três vezes maior que as concentrações observadas nos animais

selvagens.

Em camundongos selvagens, as principais lipoproteínas carreadoras de

colesterol são as HDL, enquanto no modelo LDLR KO, pelo defeito de

remoção, as LDL e VLDL passam a ser as principais transportadoras de

lipídeos. Sendo assim, sob este aspecto, os camundongos LDLR KO

assemelham-se aos humanos (Veseli et al., 2017; Goldstein e Brown, 2001),

sendo sensíveis ao desenvolvimento de aterosclerose, quando alimentados

com dieta rica em gordura saturada e/ou colesterol.

Ademais, a base genética C57BL6/J é muito utilizada para detecção de

alterações na composição e conteúdo de espécies lipídicas envolvidas no

metabolismo energético e atividade mitocondrial na musculatura esquelética

15

(Frangioudakis et al., 2010; Montgomery et al., 2013; Senoo et al., 2015; llo et

al., 2017).

Os animais foram criados em colônia homozigótica em biotério

convencional (Centro de Manutenção e Experimentação de Animais da Clínica

Médica – Disciplina de Reumatologia), em ciclo 12 h claro – 12 h escuro, em

temperatura de 22±2 ºC e receberam água filtrada e ração padrão ad libitum

até o início do protocolo experimental.

4.2. Protocolo experimental

Todos os protocolos deste estudo envolvendo o uso de animais foram

realizados de acordo com a “Diretriz Brasileira para o cuidado e utilização de

animais para fins científicos e didáticos” elaborada pelo Conselho Nacional de

Controle de Experimentação Animal (CONCEA, 2013). Este projeto foi

aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de

Medicina da Universidade de São Paulo (nº 071/16). Documento de aprovação

encontra-se no anexo G.

Antes de iniciar o protocolo experimental, todos os animais foram

avaliados quanto à massa corporal, perfil plasmático de lipídeos (CT e TAG),

glicemia, hematócrito e pressão arterial. Destas variáveis, massa corporal, CT

e TAG plasmáticos foram utilizados para distribuir os camundongos LDLR KO,

com 12 semanas de idade, de maneira semelhante em dois grupos: um grupo

que passou a receber dieta normossódica (n = 19) e outro, dieta hipossódica (n

= 20).

16

O protocolo experimental teve duração de 90 dias. No período final, além

dos parâmetros citados anteriormente, foram determinados o perfil qualitativo

de lipoproteínas, excreção urinária de sódio de 24 h e teste de tolerância à

insulina (kITT) (Figura 1). Ao longo do protocolo, a massa corporal e o

consumo alimentar foram monitorados semanalmente.

Peso

PA

Glicose

CT

TAG

Hematócrito

Peso

PA

Glicose

CT

TAG

Hematócrito

Perfil de lipoproteínas

0 90 diasTratamento

ITT

Excreção urinária

de sódio

Remoção do

gastrocnêmio

Dieta

Normossódica

(n = 19)

Camundongos

LDLR KO

Machos

12 semanas de idade

Dieta

Hipossódica

(n = 20)

Figura 1. Protocolo experimental. PA = pressão arterial; CT = colesterol total; TAG = TAG; kITT = teste de tolerância à insulina.

O gastrocnêmio do lado direito e esquerdo foram extraídos e

armazenados em ultracongelador a -80º C até a realização das análises de

expressão gênica, conteúdo proteico, caracterização e quantificação lipídica.

4.3. Dietas normossódica e hipossódica

As dietas normossódica (0,5% Na) e hipossódica (0,06% Na) foram

obtidas da Teklad Custom Diet (Envigo, Estados Unidos). Ambas contêm 3,6

Kcal/g e a mesma composição em macronutrientes e demais ingredientes,

diferindo apenas em relação à quantidade de sódio (Tabela 1). A concentração

17

de sódio presente na dieta hipossódica é bastante restrita, porém suficiente

para garantir o desenvolvimento normal dos animais.

Tabela 1. Composição das dietas normossódica e hipossódica

Dieta Normossódica Dieta Hipossódica

Macronutrientes % por peso % kcal % por peso % kcal

Proteína 25,0 28,1 25,0 28,1

Carboidrato 49,8 56,0 49,8 56,0

Gordura 6,3 15,9 6,3 15,9

Fórmula

Caseína 287,0 g/kg 287,0 g/kg

Sucarose 313,4 g/kg 313,4 g/kg

Amido 200,0 g/kg 200,0 g/kg

Óleo de soja 60,0 g/kg 60,0 g/kg

Celulose 97,9 g/kg 97,9 g/kg

Mix de vitamina Teklad 10,0 g/kg 10,0 g/kg

Etoxiquina, antioxidante 15,0 g/kg 15,0 g/kg

Cloreto de Sódio 10,0 g/kg 1,27 g/kg

Cloreto de Sódio 0,50% 0,06%

Fonte: Teklad Custom Diet (Envigo, Estados Unidos).

4.4. Dosagens bioquímicas

Após 12 h de privação alimentar, sangue da veia caudal dos animais foi

coletado, utilizando-se capilares previamente heparinizados. Estas coletas

foram realizadas no início e final do estudo (após 90 dias de tratamento). A

determinação da concentração plasmática de CT e TAG foi realizada por kits

enzimáticos colorimétricos (Labtest, Brasil). A glicemia foi avaliada por

glicosímetro Accu Check Performa (Roche, Brasil).

18

4.5. Excreção urinária de sódio

Ao final do protocolo, os animais foram colocados em gaiolas

metabólicas individuais e mantidos, por 24 h, com livre acesso à água e ração.

Após este período, o conteúdo total de urina foi coletado, centrifugado a 2500

rpm, por 15 min, para precipitação de partículas sólidas e armazenado a -80°

C. Para análise, as amostras de urina foram homogeneizadas e centrifugadas a

2500 rpm, por 5 min, em temperatura ambiente. Um volume de 50 µL de urina

acrescido com lítio, um padrão de reação, foi aspirado em aparelho acoplado

ao fotômetro de chama. A determinação da excreção de sódio foi realizada por

fotômetro de chama Celm FC280 (São Paulo, Brasil). Os valores foram

corrigidos pelo volume total de urina e as concentrações foram expressas em

mEq/24h.

4.6. Mensuração da pressão arterial caudal

A mensuração da pressão arterial foi realizada por fotopletismografia de

transmissão, a qual é baseada na detecção da distensão do vaso arterial

causada pelo pulso de sangue que flui na cauda. Os animais foram

previamente aquecidos e posicionados em contensor metálico sobre uma

plataforma em temperatura de 36ºC. A cauda foi posicionada em manguito de

oclusão e sobre um sensor óptico. Após a frequência de pulso ser determinada

pelo software BP-2000, automaticamente o manguito de oclusão foi inflado.

Assim que a pressão de oclusão se equipara, inicialmente, à pressão diastólica

e, posteriormente, à sistólica, a amplitude do traçado da onda pressórica

diminui, fornecendo a aferição diastólica e sistólica, respectivamente. O

19

software BP-2000 possui processadores de sinais extremamente sensíveis

para detectar e desconsiderar movimentação do animal. Desta maneira, o

equipamento considera somente medidas obtidas na ausência de

movimentação. O aparelho utilizado é da marca Visitech Systems, modelo BP-

2000-M2 Blood Pressure Analysis System (Carolina do Norte, EUA). Dois dias

antes das análises definitivas, os animais foram submetidos à adaptação de

contenção física e insuflação do manguito caudal por, aproximadamente, 15

min. Os valores de pressão arterial foram obtidos pela média de seis a oito

aferições.

4.7. Perfil plasmático de lipoproteínas

O perfil plasmático das lipoproteínas (VLDL, LDL e HDL) foi determinado

por cromatografia líquida para separação rápida de proteínas (FPLC), apenas

ao final do protocolo experimental. Uma alíquota de plasma (100 µL) foi

injetada em coluna Superose 6HR 10/30 (FPLC System, Pharmacia, Upsalla,

Suécia), com eluição em fluxo constante de 0,5 mL/min de tampão Tris (Tris 10

mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e NaN3 0,03% - pH 7,4). As frações

separadas de lipoproteínas foram depositadas em placas de 96 poços. Para

determinação do conteúdo de CT e TAG, utilizaram-se ensaios enzimáticos

colorimétricos (Labtest, Brasil) e espectrofotômetro de microplaca SpectraMax

plus 384 (Molecular devices, Califórnia, Estados Unidos). A área sob a curva de

cada fração de lipoproteína foi utilizada para comparação.

20

4.8. Teste de tolerância à insulina

Após privação alimentar de 4 h, uma pequena amostra de sangue foi

coletada da veia caudal dos camundongos para determinação da concentração

de glicose, por meio da utilização de glicosímetro (Accu Check Performa -

Roche do Brasil). Em seguida, foi realizada administração intraperitoneal de

insulina (1 U/kg – Humulin, Lilly) e a concentração de glicose foi novamente

avaliada a cada 10 min, em período total de 30 min. A constante da taxa de

decaimento da glicose plasmática (kITT) foi calculada baseando-se no declínio

linear da curva de concentração de glicose entre 10 e 30 min após a injeção de

insulina (Goren et al., 2004).

4.9. Obtenção do gastrocnêmio

Os animais foram submetidos à eutanásia com injeção intraperitoneal

(150 mg/kg de massa corporal) de tiopental sódico (THIOPENTAX®). Após

este procedimento, o gastrocnêmio foi retirado de ambos os membros. A

massa dos tecidos musculares foi aferida em balança de precisão Metler

Toledo (Ohio, Estados Unidos), colocada em tubos de congelamento e imersa

em nitrogênio líquido, imediatamente, ou armazenada em Invitrogen

RNAlaterTM (Vilnius, Lituânia) e, posteriormente, conservada a -80°C.

4.10. Análise da expressão gênica por reação de polimerase em cadeia

quantitativa em tempo real (RT-qPCR).

Para a extração de RNA total dos gastrocnêmios, os tecidos foram

macerados com homogeneizador Tissue-Tearor modelo 985370 (Biospec,

21

Oklahoma, Estados Unidos) em 1 mL de TRIzol Invitrogen (Life Technologies

Corporation, Califórnia, EUA) e acrescidos de 200 µL de clorofórmio. Após

centrifugação a 13.000 g por 15 min, a fase aquosa superior foi retirada

cuidadosamente e transferida para coluna de extração do kit de isolamento de

RNA Qiagen RNeasy Mini Colums (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha). As

etapas seguintes foram realizadas de acordo com o fabricante. A presença das

bandas correspondentes aos RNA ribossomais 18S e 28S e avaliação da

qualidade e integridade do RNA total foi determinada por 2100 Bioanalyzer

(Agilent Thecnologies, EUA) utilizando-se Agilent RNA 6000 Nano kit

(Waldbronn, Alemanha). Foram obtidos 200 ng de cDNA a partir do RNA total

dos tecidos musculares usando kit High Capacity RNA-to-cDNA da Applied

Biosystems (Vilnius, Lituânia). Utilizaram-se sondas marcadas com FAM (6-

carboxy-fluorescein) no formato TaqMan Gene Expression Assays (Applied

Biosystems, Califórnia, Estados Unidos) dos genes- alvo Fabp3, Cd36, Cpt1,

Acacb, Irs1, Akt1, Slc2a4, Lpl, Ppargc1a e Prkaa1 (Tabela 2). A escolha do

normalizador adequado para o tecido investigado foi determinada por meio de

ensaios com 5 genes endógenos descritos na literatura (Gapdh, Actb, B2m,

Rplp0 e Hprt), sendo que o B2m (Tabela 2) apresentou maior estabilidade, de

acordo com o programa geNorm. A reação de polimerase em cadeia em tempo

real foi efetuada com o sistema de amplificação TaqMan Two Step RT-qPCR

(Applied Biosystems, CA, EUA) na presença do cDNA de cada amostra, da

sonda do gene alvo e endógeno e de Taqman Gene expression Master Mix

(Applied Biosystems, CA, EUA).

22

Tabela 2. Lista de genes analisados no estudo, de acordo com símbolo e nomenclatura oficial e número de catálogo das sondas (Applied Biosystems) utilizadas para PCR.

Símbolo oficial

Nome completo oficial de acordo com banco de genes da NCBI

Número de cátalogo

Fabp3 Fatty acid binding protein 3, muscle and heart Mm02342495_m1

Cd36 CD36 antigen Mm00432403_m1

Cpt1b Carnitine palmitoyltransferase 1b, muscle Mm00487191_g1

Acacb Acetyl-Coenzyme A carboxylase beta Mm01204671_m1

Irs1 Insulin receptor substrate 1 Mm01278327_m1

Akt1 Thymoma viral proto-oncogene 1 Mm01331626_m1

Slc2a4 Solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 4

Mm00436615_m1

Lpl Lipoprotein lipase Mm00434764_m1

Ppargc1a Peroxisome proliferative activated receptor, gamma, coactivator 1 alpha

Mm01208835_m1

Prkaa1 Protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 1

Mm01296700_m1

Gapdh Glyceraldehyde-3-phosphate dehidrogenase Mm99999915_g1

Actb Actin, beta Mm02619580_g1

B2m Beta-2 microglobulin Mm00437762_m1

Hprt hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase

Mm03024075_m1

Rplp0 ribosomal protein, large, P0 Mm00725448_s1

Os dados foram analisados utilizando-se o programa StepOne Software

2.0 (Applied Biosystems, CA, EUA). O programa fornece o ciclo em que o sinal

de fluorescência é significativo, denominado cycle threshold (Ct) (Kubista et al.,

2006). Para cada amostra de cDNA, o Ct do gene alvo é registrado e

comparado com o controle endógeno escolhido. Os valores de expressão

gênica foram calculados pela fórmula 2-ΔΔCt de acordo com Livak e Schmitgen

(2001).

23

4.11. Determinação do conteúdo proteico de AKT e GLUT4

A quantificação proteica de GLUT4, AKT1 total e AKT1 fosforilada foi

realizada por Western Blotting. As amostras foram maceradas em tampão

contendo Tris HCL 10 mM, EDTA 1 mM, sacarose 250 mM e inibidores de

protease e fosfatase, com auxílio de homogeneizador politron (1000 rpm). A

quantificação de proteína do homogenato foi determinada pelo método

Bradford (1976). Cinquenta microgramas das amostras preparadas em

Laemmly e β-mercaptoetanol foram submetidas à eletroforese em gel de

poliacrilamida 10%, seguindo-se transferência para membrana de nitrocelulose.

O carregamento das bandas foi avaliado por Ponceau e o gel corado com

Comassie blue. Após bloqueio de sítios inespecíficos, as membranas foram

incubadas, por 24 h, com anticorpos anti-Akt 1/2/3 (Sc-8312, Santa Cruz

Biotechnology, California, EUA) e anti-p-Ak1 1/2/3 – serina 473 (Sc-7985-R,

Santa Cruz Biotechnology, California, EUA) e anti-GLUT4 (07-1404, Milipore

Corporation, California, EUA), para os quais as diluições foram padronizadas

em experimentos piloto (AKT 1:1000 e GLUT4 1:3000). Seguiu-se incubação

com anticorpo secundário anti-rabbit IgG (horseradish peroxidase linked whole

anitbody - NA93A, Amershan, Buckinghamshire, Reino Unido), diluição 1:5000,

e reação de quimioluminescência (Mruk e Cheng, 2011). As bandas foram

obtidas em câmara de revelação utilizando-se filme, revelador e fixador. A

intensidade das bandas foi avaliada por densitometria em fotodocumentador

(software Image Quant TL, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, SW). A

densidade óptica de cada banda foi normalizada pela densidade óptica da

24

marcação da membrana com Ponceau. O conteúdo proteico foi expresso em

unidades arbitrárias (UA) corrigidas por grama de tecido muscular.

4.12. Análise de espécies lipídicas no gastrocnêmio

Extração lipídica do tecido muscular

Os gastrocnêmios dos animais que receberam dieta normossódica ou

hipossódica foram macerados em solução de tampão fosfato (PBS, phosphate-

buffered saline) 10 mM (pH 7,4) com 100 µM de desferroxamina. O extrato

lipídico foi obtido de acordo com o método de Yoshida et al. (2008), no qual

500 µL do homogenato do gastrocnêmio (100 mg/1mL) foi acrescido com 500

µL metanol e hidroxitolueno butilado (0,1 mM), dos padrões internos de

espécies lipídicas (Tabela 3) e 1,5 mL de clorofórmio: acetato de etila

(proporção 4:1).

Após centrifugação (1500 g por 3 min a 4ºC), a fase orgânica foi retirada

e seca em fluxo de nitrogênio. As amostras foram ressuspendidas em 200 µL

de isopropanol, centrifugadas novamente e separadas para análise

cromatográfica.

Lipidômica

Para análise lipidômica global, o extrato lipídico total do tecido foi

analisado por cromatografia líquida (liquid cromatrography - LC) de alta

eficiência (Nexera, Shimadzu, Kyoto, Japan) acoplada à ESI-Q-TOF-MS

(TripleTOF 6600, Sciex, Concord, Estados Unidos). ESI (electrospray

ionozation), ionização por electrospray foi o método utilizado como fonte de

25

ionização para as espécies lipídicas. Em seguida, as moléculas ionizadas

foram processadas por espectrômetro de massa de alta resolução em método

de escaneamento de múltiplos íons precursores, com instrumento quádruplo

(Q) com tempo de voo (time off flight – TOF), que separa os íons por razão

massa-carga (m/z) e gera um espectro de massa, no qual é gerado um gráfico,

evidenciando a abundância relativa de íons na forma de picos.

Tabela 3. Lista de padrões internos das espécies lipídicas utilizados nas análises de lipidômica.

Padrões internos Concentração Empresa

Ceramida Cer d18:1/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Esfingomielina SM d18:1/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Cardiolipina CL 14:0/14:0/14:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Fosfatidilcolina PC 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Fosfatidiletanolamina PE 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Fosfatidilserina PS 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Fosfatidilglicerol PG 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Ácido fosfatídico PA 17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Lisofosfatidilcolina Lyso PC 17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Lisofosfatidiletanolamina Lyso PE 17:1 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Triacilglicerol TAG 17:0/17:0/17:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Ceramida Cer d18:1/10:0 10 (µg/mL) Avanti Polar Lipids

Fosfatidilcolina PC 14:0/14:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich

Fostatidiletanolamina PE 14:0/14:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich

Triacilglicerol TAG 14:0/14:0/14:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich

Colesterol esterificado CE 10:0 10 (µg/mL) Sigma Aldrich

Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA); Sigma Aldrich (St Louis, MO, EUA).

As amostras foram injetadas (1 µL) em coluna CORTECS® (coluna C18,

1.6 μm, 2.1 mm i.d. × 100 mm) com taxa de vazão de 0,2 mL min-1 a 35°C de

26

temperatura. A fase móvel A da cromatografia líquida reversa, consistiu em

água/acetonitrila (proporção 60:40), enquanto a fase móvel B, em

isopropanol/acetonitrila/água (88:10:2). Ambas as fases continham acetato de

amônio ou formato de amônio para os ensaios no modo ionização positivo ou

negativo, na concentração final de 10 mM. A separação dos lipídeos aconteceu

em gradiente linear (40 a 100%) durante 20 min. A espectrometria de massas

foi operada nos modos positivo e negativo, sendo o intervalo de varredura da

razão massa-para-carga de 200-2000 Da. A identificação e a quantificação das

espécies lipídicas foram realizadas por Information Dependent Acquisition

(IDA®). A aquisição por Analyst® 1.7.1 foi realizada com ciclo de 1,05 s com 10

ms de tempo de aquisição para escaneamento MS1 e 25 ms de tempo de

aquisição para obter os 36 primeiros ions precursores. Para as análises a

voltagem spray dos íons foi -4,5 kV e 5.5 kV (para modo negativo e positivo,

respectivamente) e a voltagem de cone é +/- 80 V.

A espectrometria de massas foi analisada com Peak View®. As espécies

lipídicas foram identificadas manualmente, de acordo com sua massa exata,

fragmentos específicos e/ou perdas neutras com o auxílio de documentação

Excel fabricada internamente. Um erro máximo de 5 mDa foi definido para

atribuição do íon precursor. Após a identificação, a área das espécies lipídicas

foi obtida por MS utilizando-se MultiQuant®. A integração de cada pico foi

inspecionada cuidadosamente para a determinação correta e acurada da área.

A quantificação da razão de área foi calculada dividindo o pico de área de cada

lipídeo pelo padrão interno correspondente.

27

4.13. Análise Estatística

Os grupos alimentados com dieta normossódica e hipossódica foram

comparados com o teste não paramétrico de Mann Whitney ou por teste t de

Student, utilizando-se o programa estatístico Minitab® versão 18 (Mintab LLC,

Pensilvânia, EUA). Os dados foram apresentados como mediana e erro

padrão, considerando-se o nível descritivo de significância igual ou inferior a

5% (P ≤ 0,05).

28

5. RESULTADOS

Na tabela 4, estão apresentados os valores de massa corporal,

dosagens bioquímicas do plasma, pressão arterial, frequência cardíaca,

excreção urinária de sódio e consumo diário de ração dos animais alimentados

com dieta normossódica ou hipossódica.

Tabela 4. Massa corporal, perfil bioquímico, hematócrito, pressão arterial e frequência cardíaca dos animais que receberam dieta normossódica e hipossódica nos períodos basal e final (após 90 de dieta).

P

Massa corporal Basal 25,0 ± 0,4 24,8 ± 0,5 0,907

(g) Final 24,8 ± 0,4 26,6 ± 0,9 0,005

Colesterol total Basal 256 ± 8,1 257 ± 10,0 0,678

(mg/dL) Final 330 ± 49,0 345 ± 37,4 0,979

Triacilglicerol Basal 158 ± 8,6 159 ± 9,4 0,714

(mg/dL) Final 123 ± 8,0 148 ± 26,4 0,035

Glicose Basal 83 ± 2,9 85 ± 3,3 0,822

(mg/dL) Final 99 ± 3,5 117 ± 3,7 0,001

Hematocrito Basal 50 ± 1,3 50 ± 1,4 0,891

(%) Final 49 ± 0,5 49 ± 0,7 0,815

Pressão arterial sistólica Basal 112 ± 2,3 111 ± 2,6 0,482

(mmHg) Final 106 ± 1,7 102 ± 2,0 0,252

Pressão arterial diastólica Basal 43 ± 2,1 46 ± 3,5 0,528

(mmHg) Final 43 ± 2,2 45 ± 2,7 1,000

Frequência cardíaca Basal 481 ± 21,0 474 ± 16,9 0,808

(bpm) Final 529 ± 16,2 532 ± 15,4 0,961

Consumo de ração (g/24h) Final 2,94 ± 0,04 2,99 ± 0,04 0,535

Sódio urinário (mEq/24h) Final 0,17 ± 0,022 0,03 ± 0,004 0,000

Dieta

normossódica

Dieta

hipossódica

Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

No período basal, que antecedeu o consumo das dietas, ambos os

grupos experimentais foram semelhantes em relação à massa corporal,

29

colesterolemia, triacilglicerolemia, glicemia, hematócrito, pressão arterial

sistólica e diastólica e frequência cardíaca.

Após 90 dias do protocolo experimental, o grupo com dieta hipossódica

apresentou aumento da massa corporal, triacilglicerolemia e da glicemia de

jejum, em comparação ao que recebeu dieta normossódica (Tabela 4).

Conforme esperado, os camundongos que receberam dieta restrita em sal

apresentaram menor excreção urinária de sódio. O perfil plasmático de

lipoproteínas, no qual avaliou-se CT nas frações de VLDL, LDL e HDL, foi

similar entre os grupos que receberam dieta normossódica ou hipossódica

(Figura 2).

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

VLDL LDL HDL

Co

les

tero

l T

ota

l

Ab

so

rbâ

nc

ia (

50

0n

m)

0 10 20 30 40 50 60

Frações

Dieta NormossódicaDieta Hipossódica

Figura 2. Perfil de distribuição de colesterol total entre as lipoproteínas plasmáticas dos camundongos alimentados cronicamente com dieta normossódica (n = 15) ou hipossódica (n = 16). O plasma de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos por 90 dias com ração normossódica ou hipossódica ad libitum, foi utilizado para determinar o perfil de lipoproteínas por cromatografia líquida para separação rápida de proteínas (FPLC) no período final do estudo. O percentual da área sob a curva de CT nas frações de VLDL, LDL e HDL foi utilizado para a comparação entre os grupos. As comparações foram realizadas pelo teste de Mann- Whitney.

30

Observou-se, no entanto, elevação do percentual de TAG na fração de

VLDL (dieta normossódica: 15 % ± 0,6 % vs dieta hipossódica: 19 % ± 0,7 %; P

= 0,003) e redução do percentual TAG na fração de HDL (dieta normossódica

34 % ± 0,9 % vs dieta hipossódica: 31 % ± 0,8 %; P = 0,02) nos animais

submetidos à restrição de sódio em comparação aos alimentados com dieta

normossódica (Figura 3).

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

Tri

ac

ilg

lic

ero

l

Ab

so

rbâ

nc

ia (

50

0n

m)

0 10 20 30 40 50 60

Frações

VLDL LDL HDL

Dieta NormossódicaDieta Hipossódica

*

* *

Figura 3. Perfil de distribuição de triacilglicerol entre as lipoproteínas dos camundongos alimentados cronicamente com dieta normossódica (n = 15) ou hipossódica (n = 16). O plasma de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos por 90 dias com ração normossódica ou hipossódica ad libitum, foi utilizado para determinar o perfil de lipoproteínas por cromatografia líquida para separação rápida de proteínas (FPLC) no período final do estudo. O percentual da área sob a curva de TAG nas frações de VLDL, LDL e HDL foi utilizado para a comparação entre os grupos. *P = 0,003; **P = 0,02. As comparações foram realizadas pelo teste de Mann- Whitney.

Os animais do grupo hipossódico apresentaram menor taxa de

decaimento de glicose, evidenciada no kITT, o que caracteriza o

31

estabelecimento de RI induzida pela restrição crônica de sódio dietético

(Figura 4).

Dieta

Normossódica

Dieta

Hipossódica

kIT

T-%

min

P = 0,012

0

1

2

3

4

Figura 4. Teste de tolerância à insulina (kITT) dos camundongos alimentados cronicamente com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 6). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos por 90 dias com ração normossódica ou hipossódica ad libitum, foram submetidos ao kITT, realizado após 4 h de restrição alimentar. A constante da taxa de decaimento da glicose plasmática (kITT) foi calculada baseando-se no declínio linear da curva de concentração de glicose entre 10 e 30 min após injeção intraperitoneal de insulina (1 U/kg). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

A massa do gastrocnêmio foi menor nos animais alimentados com dieta

hipossódica em comparação aos que receberam a dieta normossódica (Figura

5).

32

P = 0,047

Mas

sa

gas

tro

cn

êm

io

(mg

)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Dieta

Normossódica

Dieta

Hipossódica

Figura 5. Massa do gastrocnêmio isolado dos camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 18) ou hipossódica (n = 19). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade foram alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. O gastrocnêmio destes animais foi isolado de ambos os membros por dissecação e sua massa aferida em balança de precisão. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Expressão relativa

Irs1

Akt1

Slc2a4

0 1 2

Dieta Normossódica

Dieta Hipossódica

Figura 6. Expressão de genes envolvidos na sinalização insulínica no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 5-7) ou hipossódica (n = 5-7). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade foram alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. A RT-qPCR foi realizada utilizando-se sistema TaqMan Two Step na presença de 200 ng de cDNA (obtido do RNA total extraído do gastrocnêmio do membro esquerdo dos animais), da sonda dos genes alvo (Slc2a4, Akt1 e Irs1) e endógeno (B2m) e de Master Mix

33

(TaqMan Gene expression - Applied Biosystems, CA, EUA). A expressão dos genes foi calculada pela fórmula 2-ΔΔCt, na qual ΔCt = Ct gene alvo – Ct do controle endógeno. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Da mesma forma, não houve alteração no conteúdo proteico de AKT

total e fosforilada e GLUT4 entre os grupos normossódico e hipossódico. O

conteúdo proteico foi corrigido por grama de tecido muscular, visto que os

animais que receberam dieta hipossódica apresentaram menor massa do

gastrocnêmio em relação aos animais que receberam dieta normossódica

(Figura 7).

A expressão de genes envolvidos na captação e metabolização de

ácidos graxos também foi avaliada no tecido muscular. Evidenciou-se maior

expressão de Fabp3, que codifica para o transportador de ácidos graxos na

membrana plasmática, no grupo que recebeu ração pobre em sódio (Figura 8).

Por outro lado, a expressão do gene Cd36, outro receptor muscular de ácidos

graxos de cadeia longa, foi similar entre os grupos alimentados com dieta

hipossódica e normossódica (Figura 8). A restrição crônica de sódio dietético

modulou a expressão dos genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos no

músculo esquelético. Prkaa1, o gene que codifica para AMPK, e Cpt1, que

codifica a carnitina palmitoil transferase 1, que foram elevados no grupo de

animais alimentados com dieta hipossódica A expressão dos genes Lpl,

Ppargc1a e Acacb foi similar nos dois grupos.

34

0,0

0,5

1,0

1,5

AK

T f

os

fori

lad

a

UA

/g p

rote

ína

0,0

0,5

1,0

1,5

AK

T t

ota

l

UA

/g p

rote

ína

0,0

0,5

1,0

1,5

GL

UT

4

UA

/g p

rote

ína

Dieta

Normossódica

Dieta

Hipossódica

Figura 7. Conteúdo proteico de GLUT4, AKT total, AKT fosforilada no gastrocnêmio de camundongos alimentados com dieta normossódica (n = 8-10) ou hipossódica (n = 8-10). O gastrocnêmio do membro direito foi extraído de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. Para análises de Western Blotting, 50 µg de proteína do homogenato muscular total foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 10% e transferidos para membrana de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos primários GLUT4 (diluição1:3000), AKT total e AKT fosfotilada (1:1000) e anticorpo secundário anti-rabbit (1:5000) e colocadas em reação de quimiluminescência (ECL). A densidade óptica de cada banda foi normalizada pela densidade óptica da marcação da membrana com Ponceau. Os resultados estão apresentados em unidades arbitrárias corrigidas por grama de tecido,

35

como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Acacb

Cpt1

Pparg1a

Lpl

Prkaa1

Cd36

Fabp3 P = 0,036

P = 0,002

P = 0,012

0 1 2 3

Expressão relativa

Dieta Normossódica

Dieta Hipossódica

Figura 8. Expressão de genes envolvidos na captação e metabolização de lipídeos no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com normossódica (n = 5-7) ou hipossódica (n = 5-7). Camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade foram alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. A RT-qPCR foi realizada utilizando-se sistema TaqMan Two Step na presença de 200 ng de cDNA (obtido do RNA total extraído do gastrocnêmio do membro esquerdo dos animais), da sonda dos genes alvo (Fabp3, Cd36, Prkaa1, Lpl, Ppargc1a, Cpt1 e Acacb) e endógeno (B2m) e de Master Mix (TaqMan Gene expression - Applied Biosystems, CA, EUA). A expressão dos genes foi calculada pela fórmula 2-ΔΔCt, na qual ΔCt = Ct gene alvo – Ct do controle endógeno. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

36

A análise da expressão de subespécies lipídicas foi realizada por

lipidômica global em cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à

espectrometria de massa, a partir do extrato total do gastrocnêmio obtido de

ambos os grupos experimentais. Foram identificadas 298 espécies lipídicas

distribuídas nas seguintes categorias: glicerofosfolipídeos (145 espécies),

glicerolipídeos (79 espécies), esfingolipídeos (40 espécies), ácidos graxos

livres (33 espécies) e lipídeo de prenol (1 espécie). As espécies lipídicas

identificadas em cada categoria podem ser observadas na figura 9.

Figura 9. Espécies lipídicas identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Número de espécies lipídicas por categoria identificadas em análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS no extrato lipídico do gastrocnêmio de camundongos alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. Q-9: coenzima Q9; Cer: ceramida;

37

SM: esfingomielina; 1G-Cer: monoglicosil ceramida; AC: acilcarnitina; AGL: ácidos graxos livres; DAG: diacilglicerol; TAG: triacilglicerol; oPE: alquil fofsfatidiletanolamina; pPC: plasmenil fosfatidilcolina: PI: fosfatidilinositol; PG: fosfatidilglicerol; CL: cardiolipinas; pPE: plasmenil fosfaftidiletanolamina; PE: fosfatidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina.

A análise discriminante por mínimos quadrados observada na figura 10,

demonstra a separação entre os grupos normossódico e hipossódico no perfil

de lipidômica realizado por LC-MS.

Figura 10. Análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) de lipídeos no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com normossódica (NS, n = 7) ou hipossódica (HS, n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. A análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA)

38

evidencia a separação das espécies lipídicas dos grupos dieta normossódica (círculos verdes) e dieta hipossódica (círculos vermelhos).

O agrupamento hierárquico em heatmap ou mapa de calor permite a

visualização dos dados lipidômicos de forma simplificada. A intensidade relativa

de cada subespécie lipídica é apresentada de acordo com a coloração indicada

na escala lateral, na qual valores entre 0 e 2 se apresentam em tonalidades de

vermelho e valores de -2 a 0 se apresentam em tonalidades de azul. Os

valores entre -2 e 2 correspondem a média normalizada para cada espécie

lipídica.

O mapa de calor, apresentado na Figura 11, exibe 39 espécies lipídicas

significativamente alteradas pela dieta hipossódica apresentadas em linhas. As

colunas mostram a separação dos aglomerados de animais alimentados com

dieta hipossódica e normossódica. O agrupamento das amostras neste gráfico

evidencia a maior expressão de acilcarnitina (AC) e CL no grupo de animais

que receberam dieta normossódica e maior expressão de espécies plasmenil

fosfatidiletanolamina pPE, PC, PI e AGL no grupo que recebeu dieta

hipossódica.

39

Figura 11. Gráfico em mapa de calor mostrando as 39 espécies lipídicas alteradas pela dieta hipossódica no gastrocnêmio de camundongos animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (aglomerado verde, n = 7) ou hipossódica (aglomerado vermelho, n = 7). Lipídeos foram extraídos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica ou hipossódica ad libitum. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. Análises estatísticas realizadas por teste t de Student com false Discovery rate (FDR) considerando P ≤ 0,05. AC: acilcarnitina; CL: cardiolipinas; pPE: plasmenil fosfaftidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina; AGL: ácidos graxos livres; PI: fosfatidilinositol;

A análise lipidômica global revelou que as espécies mais abundantes

encontradas no músculo esquelético dos camundongos, em ordem

40

decrescente, foram as subclasses fosfatidiletanolamina (PE) e plasmenil

fosfatidiletanolamina (pPE), fosfatidilcolina (PC), ácidos graxos livres (AGL),

cardiolipinas (CL) e fosfatidilinositol (PI), representando 42%, 22%, 18%, 12%,

4% e 1% da massa média total dos lipídeos, respectivamente (Figura 12). A

expressão de PE e pPE foi semelhante nos grupos que receberam dieta

normossódica e hipossódica. A massa de PC, AGL e PI foi maior no grupo

alimentado com dieta hipossódica em comparação aos alimentados com dieta

normossódica. Em contrapartida, observou-se que a massa lipídica total de CL

foi menos expressa nos animais que receberam dieta hipossódica em

comparação à normossódica. Os valores referentes as espécies identificadas

similares nos grupos normossódico e hipossódico podem ser observadas nos

anexos A a F.

A razão PC:PE foi mais alta nos animais alimentados com dieta

hipossódica em comparação aos que foram alimentados com dieta

normossódica (Figura 13).

Ceramidas (Cer), DAG, TAG e esfingomielina (SM) apresentaram massa

lipídica total semelhante no gastrocnêmio dos animais de ambos os grupos

(Figura 14).

Das 59 espécies de fosfatidilcolinas identificadas no gastrocnêmio, 32

espécies foram mais abundantes nos animais HS em comparação aos NS

(Figura 15A) e 27 espécies foram semelhantes em ambos os grupos (Figura

15B).

41

Dieta Normossódica

Dieta Hipossódica

Percentual relativo

0 10 20 30 40 50

PI

CL

AGL

PC

pPE

PE

P = 0,011

P = 0,011

P = 0,003

P = 0,005

Figura 12. Percentual relativo das seis espécies mais abundantes identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. PE: fosfatidiletanolamina; pPE plasmenil fosfatidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina, AGL: ácidos graxos livres, CL: cardiolipinas; PI: fosfatidilinositol. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

42

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Dieta

Normossódica

Dieta

Hipossódica

P = 0,005

Ra

zã

o P

C:P

E

Figura 13. Razão PC:PE no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. PE: fosfatidiletanolamina; PC: fosfatidilcolina. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Figura 14. Massa total de lipídeos de Cer, DAG, TAG e SM identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). O extrato lipídico do gastrocnêmio foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. Cer: ceramidas; DAG: diacilgliceróis; TAG: triacilgliceróis; SM: esfingomielina. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

43

44

45

Figura 15. Espécies de fosfatidilcolinas mais abundantes no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta hipossódica. Os lipídeos foram extraídos do gastrocnêmio de camundongos machos, LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7) ad libitum. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. A) PC modificadas pela dieta hipossódica. B) PC semelhantes em ambos grupos. pPC plasmenil fosfatidilcolina; PC: fosfatidilcolina. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Seis espécies de fosfatidilinositol, dentre as 7 identificadas, foram mais

expressas no grupo alimentado com dieta hipossódica (Figura 16).

Em contrapartida, quando comparado aos camundongos HS, o grupo

NS apresentou maior abundância de CL, em 16 espécies das 17 identificadas

na análise lipidômica global (Figura 17).

Oitenta e dois por cento das espécies de AGL observadas no

gastrocnêmio dos animais foram mais expressas nos animais do grupo

hipossódico e 18% dos AGL foram semelhantes nos animais de ambos os

grupos (Figura 18).

Onze espécies de acilcarnitinas (AC) foram identificadas no

gastrocnêmio. Seis destas foram mais abundantes em animais NS em

comparação aos HS (Figura 19). As demais espécies de AC foram similares

em ambos os grupos.

46

Figura 16. Espécies de fosfatidilinositol identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os lipídeos foram extraídos do gastrocnêmio de camundongos machos, LDLR KO de 12 semanas de idade, alimentandos, por 90 dias, com ração normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7) ad libitum. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. PI fosfatidilinositol. As comparações foram realizadas pelo teste de Mann- Whitney.

47

Figura 17. Espécies de cardiolipinas identificadas no gastrocnêmio de camundongos LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Realizamos a extração de lipídeos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. CL: cardiolipinas; Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

48

49

Figura 18. Espécies de ácidos graxos livres identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Realizamos a extração de lipídeos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. AGL: ácidos graxos livres. Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Figura 19. Espécies de acilcarnitinas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Realizamos a extração de lipídeos do gastrocnêmio de camundongos machos LDLR KO de 12 semanas de idade. O extrato lipídico foi submetido à análise lipidômica global realizada com espectrometria de massas de alta resolução, LC-MS/MS acoplada à ESI-Q-TOF-MS. AC: acilcarnitinas.

50

Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

As análises de regressão univariada evidenciaram correlação negativa

entre a taxa de decaimento de glicose (kITT) e as espécies de PC, AGL e PI e

correlação positiva com CL. No que diz respeito as concentrações plasmáticas

de TAG, destacou-se a correlação positiva com as espécies de PC, AGL e PI

(Tabela 5).

Tabela 5. Análise de regressão univariada entre kITT ou TAG plasmáticos com espécies lipídicas identificadas no gastrocnêmio de animais alimentados com dieta normossódica ou hipossódica por 90 dias.

kITT TAG Plasmático

r P r P

PC -0,665 0,013 0,569 0,034

AGL -0,604 0,029 0,578 0,030

CL 0,637 0,019 -0,323 0,260

PI -0,659 0,014 0,560 0,037

AC 0,533 0,061 -0,257 0,345

TAG -0,181 0,533 0,029 0,923

DAG -0,324 0,280 0,231 0,427

Cer -0,203 0,505 0,503 0,067

SM -0,126 0,681 0,156 0,594

Coeficiente de correlação de Spearman. kITT – teste de tolerância à insulina (n = 13); TAG (triacilglicerol) plasmático (n =14).

51

6. DISCUSSÃO

A restrição alimentar de sódio é utilizada como coadjuvante no

tratamento da HAS, contribuindo para a redução no desenvolvimento das DCV.

No entanto, a despeito de seu efeito hipotensor benéfico, a restrição crônica e

acentuada de sódio altera a sensibilidade periférica à insulina, a qual se vincula

à piora no metabolismo de lipídeos e lipoproteínas. No presente estudo,

avaliou-se o perfil de subespécies lipídicas no músculo esquelético

(gastrocnêmio) de camundongos hiperlipidêmicos submetidos à restrição

intensa de sódio alimentar por 90 dias. A escolha do gastrocnêmio para o

presente estudo deu-se por este apresentar composição de fibras musculares,

predominantemente glicolíticas de contração rápida (76%), semelhantes à

composição das fibras do músculo esquelético total de murinos (Dean et al.,

1998; Armstrong e Phelps, 1984). Ademais, as fibras glicolíticas parecem

desenvolver maior RI frente ao acúmulo lipídico, em comparação às fibras

oxidativas (Levin et al., 2007).

Conforme descrito previamente, em comparação aos animais NS, o

grupo HS apresentou aumento da massa corporal e prejuízo na homeostase de

carboidratos, evidenciada pela maior glicemia e redução da sensibilidade

periférica à insulina. Estes achados vão ao encontro daqueles reportados por

Coelho et al. (2006), Okamoto et al. (2004) e Prada et al. (2000), os quais

demonstraram redução de sensibilidade insulínica, aumento de glicose e

insulina de jejum, massa corporal, adiposidade e percentual de gordura na

carcaça de ratos Wistar tratados com dieta pobre em sal, do desmame até

52

atingirem 3 meses de idade. Naqueles animais, a sinalização insulínica foi

avaliada no tecido hepático e muscular, com prejuízo na fosforilação de IRS-1 e

AKT, além da menor fosforilação de IRS-2 no fígado (Prada et al., 2005).

Observou-se ainda o aumento da fosforilação JNK e IRS-1 em serina (307) o

que contribuiu para a RI no músculo e fígado. Surpreendentemente, no

presente estudo não foi observada alteração na expressão de genes (Irs1, Akt1

e Slc2a4) e conteúdo proteico (AKT total, pAKT e GLUT4) de marcadores

envolvidos na via clássica de sinalização insulínica no gastrocnêmio após 90

dias de tratamento com a restrição dietética de sódio. Vale ressaltar, que a

determinação da expressão desses sinalizadores foi realizada na ausência de

estímulo pela insulina.

A RI promovida pela restrição de cloreto de sódio alimentar vincula-se,

em parte, à ativação do SRAA. Este efeito foi observado após restrição aguda

(7 dias) de sódio dietético em indivíduos saudáveis, com idade de 39 anos.

Observou-se nestes indivíduos maior produção de aldosterona e ANG II, pela

ativação do SRAA, o que se associou à RI avaliada por HOMA-IR (Garg et al.,

2010b). Em ratos Sprague-Dawley e Wistar, a redução de sódio alimentar

proporcionou, igualmente, a ativação do SRAA, nos quais foram observados

aumento de atividade de renina, ANG II e aldosterona plasmáticas (Shao et al.,

2013; Nagata et al., 2010).

Os mecanismos pelos quais o prejuízo à sinalização insulínica clássica

acontece mediante a ativação do SRAA na musculatura esquelética foram

investigados em miotubos L6 e sóleo excisado de ratos Zucker tratados com

ANG II. Observou-se, em ambos os casos, inibição da translocação de GLUT4,

redução da fosforilação de AKT em serina (473) e treonina (308), assim como

53

de glicogênio sintase cinase 3, e, em consequência, diminuição da sua

atividade. Além disso, houve maior ativação do sistema NAD(P)H oxidase, com

estímulo à proteína cinase ativada por mitogênio (MAPK), culminando na maior

geração de ROS. A inibição de óxido nítrico sintase e da NAD(P)H oxidase,

eliminação de radicais livres com miricetina ou tratamento com mimético de

superóxido dismutase (SOD), restaurou a fosforilação de AKT e a translocação

do GLUT4, sugerindo que, no tecido muscular, a RI mediada pela ativação do

SRAA é, em parte, mediada pela geração de ROS (Diamond-Stanic e

Henriksen, 2010; Csibi et al., 2010). Resultados semelhantes foram verificados

por Surapongchai et al. (2017), no sóleo de ratos Sprague-Dawley que

receberam infusão constante de ANG II por bomba osmótica, durante 14 dias.

Apesar de o aumento de massa corporal promovido pela dieta

hipossódica, independente do consumo similar de ração nos dois grupos,

observou-se redução na massa do gastrocnêmio. O mecanismo que levou a

este evento não foi analisado na presente investigação, mas pode estar

relacionado à maior atividade proteolítica muscular, desencadeada pela

ativação do SRAA. A ativação deste sistema, pela infusão de ANG II em ratos

Sprague-Dawley, levou à redução de musculatura esquelética (sóleo e

gastrocnêmio), atribuída ao aumento da proteólise muscular e redução da

concentração circulante e muscular de fator de crescimento semelhante à

insulina (insulin-like growth factor-1; IGF-1) (Brink et al., 2001). Outro estudo

em ratos evidenciou que a infusão de ANG II aumentou a proteólise muscular,

reduziu a concentração circulante e muscular IGF-1, diminuiu a fosforilação da

AKT e ativou a caspase-3 na musculatura esquelética, favorecendo a clivagem

de actina e aumento de apoptose. Tais achados indicam que uma possível

54

inibição na via de sinalização da IGF-1 desempenhe importante função na

proteólise muscular induzida pela ANG II (Song et al., 2005).

A restrição dietética de sódio modulou a expressão dos genes

envolvidos na oxidação de ácidos graxos no músculo esquelético. Prkaa1, o

gene que codifica para AMPK, e Cpt1, que codifica a carnitina palmitoil

transferase 1, foram elevados no grupo de animais alimentados com dieta

hipossódica em comparação aos alimentados com dieta normossódica. A

AMPK é uma proteína que favorece a beta oxidação de ácidos graxos pela

inibição da acetil-CoA carboxilase - ACC (gene Acacb). A redução da atividade

da ACC se associa com redução das concentrações de malonil-CoA no citosol

e promove a ativação da carnitina palmitoil transferase 1(CPT-1), enzima que

transfere ácidos graxos de cadeia longa do citosol dos miócitos para dentro da

mitocôndria, promovendo a oxidação de ácido graxos. Em nosso estudo, o

aumento da expressão de Prkaa1 e Cpt1, genes relacionados com a oxidação

de AGL, pode estar associado ao aumento da captação desses lipídeos pelo

tecido muscular esquelético, visto que o mRNA de Fabp3, que codifica para o

transportador de AGL, aumentou duas vezes nos camundongos que receberam

dieta hipossódica em relação aos tratados com dieta normossódica. Estudos

prévios demonstraram que a dieta hipossódica promove o aumento das

concentrações de TAG circulantes em modelos experimentais de dislipidemia,

camundongo LDLR KO, o mesmo utilizado na presente investigação, além do

camundongo knockout para o receptor apo E (Catanozi et al., 2003). O

aumento da trigliceridemia pela restrição alimentar de sódio também foi

observado em ratos Wistar normolipidêmicos (Catanozi et al., 2001).

55

A composição de lipídeos no tecido muscular esquelético pode ser

influenciada por vários fatores, como envelhecimento, obesidade e outras

condições metabólicas, além da dieta e prática de exercícios físicos. Por outro

lado, os lipídeos musculares podem interferir na homeostase glicêmica, por

modular a sensibilidade insulínica. Sendo assim, avaliou-se a lipidômica do

extrato total do gastrocnêmio e sua associação com a taxa de decaimento de

glicose e lípides plasmáticos nos camundongos submetidos à dieta normo e

hipossódica.

Dentre as espécies de fosfolipídeos identificadas neste estudo, as mais

profusas no gastrocnêmio foram PE e PC, respectivamente. Os PC são os

fosfolipídeos celulares mais abundantes representando 40 a 50% dos

fosfolipídeos totais, enquanto os PE, localizados nas membranas internas da

mitocôndria, são a segunda espécie mais abundante nas células (Yang et al.,

2018). Investigações em humanos e animais tem demonstrado relação entre a

RI e as alterações destes glicerofosfolipídeos, bem como da razão de ambos

(razão PC:PE). Funai et al. (2013; 2016), que submeteram camundongos com

base genética C57BL6/J à dieta rica em gordura, observaram aumento de PC e

PE e prejuízo na sinalização muscular à insulina, sem observar alteração na

razão PC:PE. Em miócitos isolados por biópsia do músculo esquelético de

indivíduos obesos que apresentavam aumento do índice HOMA-IR e insulina

plasmática em comparação a indivíduos magros, houve aumento das

concentrações de PC, da razão PC:PE, piora da sinalização insulínica e

redução da oxidação de AGL (Paran et al., 2015). Em protocolo de exercício

físico aeróbio agudo de 2 h ou durante 12 semanas de treinamento concorrente

que incluiu treinamento aeróbio e de força, observou-se redução da razão

56

PC:PE no músculo vasto lateral (5% e 16%, respectivamente) de indivíduos

normoglicêmicos e sem compensação glicêmica. No protocolo de 12 semanas

de exercício físico houve melhora de 33% da sensibilidade insulínica e, apesar

do aumento de 21% de PC no músculo esquelético, a razão PC:PE mostrou-se

elevada em condições de RI e reduzida com o aumento da sensibilidade à

insulina (Lee et al., 2018). Mediante dieta pobre em sódio, evidenciou-se no

presente estudo, aumento das espécies de PC e da razão PC:PE no extrato

lipídico total do gastrocnêmio, o que se associou com aumento da glicemia de

jejum e piora da sensibilidade insulínica sistêmica. O mecanismo pelo qual a

ativação do SRAA promoveu o aumento de PC nesta musculatura é

desconhecido.

O aumento das espécies de AGL no músculo esquelético dos animais

que foram alimentados com dieta hipossódica em comparação aos que

receberam dieta normossódica, revelado pela análise lipidômica, vão ao

encontro da hipertrigliceridemia verificada nestes animais, e de estudos prévios

de nosso laboratório nos quais foram observados o aumento dos AGL

circulantes em modelo de restrição dietética de sódio em animais

hiperlipidêmicos (Fusco et al., 2017; Catanozi et al., 2003). O aumento de AGL

circulantes se correlaciona com aumento de AGL de cadeia longa no músculo

de camundongos (Zabielski et al., 2014). Em contrapartida, as espécies

lipídicas de TAG, DAG, Cer e SM, descritas amplamente na literatura por sua

relação com a RI, obesidade e diabetes mellitus, não sofreram alterações na

intervenção com restrição de sódio. No sóleo de camundongos, o aumento de

espécies específicas de DAG (16:0/18:1, 16:0/18:2 e 18:1/18:1) e Cer

(d18:1/24:0 e d18:1/24:1), após tratamento com dieta com alto teor de

57

gorduras, se relacionou com a RI (Eum et al., 2020). Das espécies

supracitadas, identificou-se DAG 18:1/18:1 e Cer d18:1/24:0 e d18:1/24:1,

todavia nenhuma delas foi modificada pela dieta hipossódica.

Alterações teciduais de glicerofosfolipídeos também favorecem a

alteração da função mitocondrial no tecido muscular, visto que a mitocôndria

apresenta uma plasticidade extraordinária em resposta a estressores

metabólicos (Heden et al., 2016). O excesso de PC nas membranas, por

exemplo, prejudica a função mitocondrial e reduz a atividade dos complexos I,

II e IV do sistema de transporte de elétrons (Shaikh et al., 2014). No que diz

respeito as PE, investigações avaliando a inibição da sua síntese apresentam

resultados contraditórios. A deleção de CTP: fosfoetanolamina

citidililtransferase que inibiu a síntese de PE no músculo esquelético de

camundongos promoveu acúmulo de DAG, aumento do conteúdo mitocondrial

e da capacidade oxidativa, sem alterar a sinalização insulínica (Selathurai et

al., 2015). Em contrapartida, a inibição da síntese de PE mitocondrial no

diafragma promoveu atrofia robusta da musculatura devido a reduzida atividade

dos complexos I a IV, menor formação de supercomplexos e elevado

vazamento de elétrons (Heden et al., 2019).

As CL, fosfolipídeos tetra acil presentes unicamente nas mitocôndrias e

sintetizadas na membrana interna por cardiolipina sintase ou tafazzina, também

se relacionam diretamente com a função mitocondrial (Mejia e Hatch, 2016). O

aumento do conteúdo de CL na mitocôndria musculatura aumenta a função

respiratória e a atividade dos complexos do sistema de transferência de

elétrons (Das et al., 2015). Estas moléculas se fazem necessárias para

atividade adequada de diversos complexos da cadeia respiratória mitocondrial,

58

além de ancorar eletrostaticamente o citocromo c à membrana interna e

desempenhar papel na sua liberação. A importância da CL se deve à sua

habilidade de interagir com tais proteínas e seu papel na manutenção da

fluidez e estabilidade osmótica da membrana interna (Chicco e Sparagna et al.,

2007). A perda da formação de CL maduras causa desorganização da

estrutura da crista da membrana mitocondrial interna e a dissociação de

complexos, que são imprescindíveis para o transporte de elétrons mais

eficiente (Gogliati et al., 2016). A redução do conteúdo de CL no homogenato

total de tecidos pode refletir a redução de massa mitocondrial (Chicco e

Sparagna et al., 2007). No modelo de restrição dietética de sódio utilizado no

presente estudo, observou-se a redução de 16 das 17 espécies de CL

identificadas na lipidômica global, o que sugere que a dieta hipossódica pode

contribuir para o prejuízo da função mitocondrial no gastrocnêmio.

As espécies de PI identificadas na análise lipidômica foram mais

expressas nos animais que receberam dieta pobre em sódio. A espécie mais

abundante afetada pela dieta hipossódica no gastrocnêmio foi a PI 18:0/20:4.

Esta espécie foi descrita por Eum et al. (2020) como um dos lipídeos

envolvidos na RI no sóleo de camundongos alimentados com dieta enriquecida

com gordura. Além disso, o ácido araquidônico (20:4), um mediador lipídico de

inflamação, ao acumular-se em espécies de glicerofosfolipídeos como PI. PC e

PE foi associado a obesidade em ratos Wistar (Goto-Inoue et al., 2013).

Observou-se a redução de seis espécies de acilcarnitinas de cadeia

longa nos animais que receberam dieta hipossódica em comparação aos que

receberam dieta normossódica. Os mecanismos que levaram a esta redução

merecem investigação futura, visto que em modelos clássicos de RI, animais

59

obesos ou diabéticos que receberam dieta rica em gordura, foram evidenciadas

perturbações no metabolismo mitocondrial, que incluíram baixas taxas da

oxidação completa dos AGL e estresse oxidativo, como resultado do acúmulo

de acilcanitinas na musculatura esquelética (Aguer et al., 2015; Koves et al.,

2008).

A dieta hipossódica, nas condições experimentais analisadas, não

alterou a concentração de moduladores clássicos de sinalização insulínica em

humanos, como TAG, DAG e ceramidas, o que vai ao encontro da manutenção

da expressão e do conteúdo proteico de IRS-1, AKT e GLUT4. O tempo de

administração da dieta hipossódica e o modelo experimental utilizado podem

ter sido limitantes aos resultados obtidos. No entanto, a restrição crônica de

sódio aumentou a razão PC:PE, bem como as espécies de PC, PI e AGL as

quais se correlacionaram com a RI e as concentrações plasmáticas de TAG.

É possível que alterações nos lipídeos musculares, em função da

restrição intensa de sódio, possam ocorrer também em humanos e mais

estudos são necessários para estabelecer o papel das várias espécies lipídicas

na modulação do sinal insulínico. Essas investigações serão importantes para

detalhar a ação da restrição de sódio utilizada no manejo da hipertensão

arterial, especialmente naqueles indivíduos com dislipidemia, obesidade ou

componentes de síndrome metabólica, que seriam mais sensíveis à restrição

de sódio como potencializadora do risco cardiovascular.

60

7. CONCLUSÃO

Em conclusão, a restrição crônica de sódio alimentar (90 dias) promoveu

aumento da massa corporal e prejuízo na sensibilidade insulínica sistêmica.

Estes eventos vincularam-se à elevação da concentração circulante de

triacilglicerol e ao aumento das espécies lipídicas de fosfatidilcolina,

fosfatidilinositol e ácidos graxos livres e redução das cardiolipinas e

acilcarnitinas e maior expressão de genes envolvidos na captação e oxidação

de ácidos graxos (Fabp3, Prkaa1 e Cpt1) no gastrocnêmio de camundongos

LDLR KO.

61

8. ANEXOS

Espécies Dieta Normossódica Dieta Hipossódica P

pPE (p16:0/22:4) 0,4525 ± 0,078 0,3579 ± 0,014 0,523

pPE (p16:0/20:4) 0,8910 ± 0,178 0,7052 ± 0,037 0,898

pPE (p16:0/22:6) 13,2600 ± 2,560 10,9970 ± 0,834 1,000

pPE (p16:0/22:5) 1,9640 ± 0,377 1,7540 ± 0,113 0,609

pPE (p17:0/18:1) 0,1221 ± 0,024 0,1107 ± 0,009 0,523

pPE (p18:0/18:1) 1,0610 ± 0,477 3,2150 ± 0,264 0,011

pPE (p18:0/22:4) 0,5970 ± 0,128 0,4042 ± 0,023 0,443

pPE (p18:0/20:4) 0,7730 ± 0,142 0,6145 ± 0,034 1,000

pPE (p18:0/22:6) 4,4210 ± 0,830 3,9720 ± 0,223 0,443

pPE (p18:0/22:5) 0,7920 ± 0,153 0,7628 ± 0,040 0,371

pPE (p18:1/16:0) 0,8570 ± 0,159 0,6048 ± 0,045 0,250

pPE (p18:1/18:1) 4,0060 ± 0,653 3,6860 ± 0,299 0,701

pPE (p18:1/18:2) 0,2679 ± 0,053 0,2544 ± 0,016 0,523

pPE (p18:1/20:4) 0,0695 ± 0,015 0,0708 ± 0,013 0,523

pPE (p18:1/22:6) 3,1450 ± 0,574 2,7460 ± 0,201 1,000

pPE (p18:1/22:5) 0,3295 ± 0,056 0,3032 ± 0,020 0,701

pPE (p18:2/18:1) 0,4212 ± 0,090 0,3613 ± 0,029 0,609

pPE (p18:2/22:6) 0,6910 ± 0,157 0,5001 ± 0,047 1,000

pPE (p20:0/22:6) 0,1693 ± 0,042 0,1238 ± 0,009 0,898

oPE (o16:0/22:6) 0,9280 ± 0,206 0,6994 ± 0,075 0,898

Anexo A. Espécies de plasmenil e alquil fosfatidiletanolamina identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

62

Espécies Dieta Normossódica Dieta Hipossódica P

PE (16:0/18:1) 0,3197 ± 0,044 0,3529 ± 0,021 0,160

PE (16:0/18:2) 0,7260 ± 0,161 0,5738 ± 0,033 0,898

PE (16:0/20:3) 0,1343 ± 0,031 0,0822 ± 0,005 0,443

PE (16:0/22:4) 1,1120 ± 0,220 0,7312 ± 0,026 0,250

PE (16:0/20:4) 1,4250 ± 0,283 1,0725 ± 0,060 0,701

PE (16:0/22:6) 12,1900 ± 2,000 10,7250 ± 0,412 0,371

PE (16:0/22:5) 1,9190 ± 0,334 1,4034 ± 0,058 0,443

PE (16:1/18:0) 0,2880 ± 0,062 0,1657 ± 0,010 0,021

PE (16:1/22:6) 0,5932 ± 0,090 0,5407 ± 0,044 1,000

PE (17:0/22:6) 0,4266 ± 0,076 0,3741 ± 0,038 0,798

PE (18:0/18:1) 0,5670 ± 0,567 0,4841 ± 0,484 0,898

PE (18:0/18:2) 1,3670 ± 0,302 1,0578 ± 0,063 0,898

PE (18:0/20:3) 0,1893 ± 0,040 0,1525 ± 0,013 0,898

PE (18:0/22:4) 0,5930 ± 0,112 0,4338 ± 0,020 0,701

PE (18:0/20:4) 3,7250 ± 0,728 2,9470 ± 0,218 0,798

PE (18:0/22:6) 22,1500 ± 3,420 20,3400 ± 1,290 1,000

PE (18:0/22:5) 3,9580 ± 0,580 3,1560 ± 0,131 0,798

PE (18:1/18:1) 0,3297 ± 0,067 0,3229 ± 0,016 0,250

PE (18:1/18:2) 0,5380 ± 0,132 0,3905 ± 0,027 1,000

PE (18:1/24:0) 0,1069 ± 0,021 0,0844 ± 0,007 0,701

PE (18:1/20:4) 1,9620 ± 0,359 1,6943 ± 0,073 0,609

PE (18:1/22:6) 7,1200 ± 1,250 5,5580 ± 0,281 0,798

PE (18:1/22:5) 0,6353 ± 0,092 0,4649 ± 0,033 0,201

PE (18:2/18:2) 0,1921 ± 0,050 0,1349 ± 0,007 0,798

PE (18:2/20:4) 3,5500 ± 0,554 3,2010 ± 0,407 0,898

PE (18:2/22:6) 2,4410 ± 0,438 2,0360 ± 0,102 1,000

PE (18:2/22:5) 0,1080 ± 0,019 0,1007 ± 0,006 0,443

PE (19:0/22:6) 0,1407 ± 0,021 0,1495 ± 0,011 0,443

PE (20:1/22:6) 0,2010 ± 0,037 0,1647 ± 0,011 1,000

PE (22:4/22:6) 1,3650 ± 0,221 0,8639 ± 0,073 0,125

PE (20:4/22:6) 0,1864 ± 0,026 0,1387 ± 0,011 0,201

PE (22:5/22:6) 0,1619 ± 0,022 0,1507 ± 0,016 0,798

pPE (p16:0/18:1) 0,5039 ± 0,067 0,5838 ± 0,045 0,160

Anexo B. Espécies de fosfatidiletanolamina identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

63

Espécies Dieta Normossódica Dieta Hipossódica P

PG (16:0/18:1) 0,3504 0,063 0,3701 0,018 0,307

PG (16:0/18:2) 0,0608 0,013 0,0563 0,002 0,609

PG (16:0/20:4) 0,0173 0,004 0,0177 0,002 0,609

PG (16:1/18:1) 0,0056 0,001 0,0068 0,000 0,097

PG (18:0/18:1) 0,3822 0,066 0,3593 0,022 0,701

PG (18:0/18:2) 0,3593 0,359 0,2462 0,246 0,007

PG (18:1/18:2) 0,0602 0,014 0,0458 0,005 0,898

Anexo C. Espécies de e fosfatidilglicerinas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Espécies Dieta

Normossódica Dieta Hipossódica P

SM (d18:0/16:0) 0,0334 ± 0,004 0,0372 ± 0,004 0,701

SM (d18:1/16:0) 0,3553 ± 0,047 0,4070 ± 0,045 0,443

SM (d18:1/18:0) 1,6510 ± 0,190 1,8780 ± 0,136 0,443

SM (d18:1/20:0) 0,2327 ± 0,035 0,2542 ± 0,026 0,701

SM (d18:1/22:0) 0,6710 ± 0,115 0,6473 ± 0,063 0,798

SM (d18:1/22:1) 0,0656 ± 0,010 0,0705 ± 0,007 0,523

SM (d18:1/23:0) 0,1605 ± 0,022 0,1716 ± 0,017 0,609

SM (d18:1/24:0) 0,8160 ± 0,132 0,8292 ± 0,088 0,701

SM (d18:1/24:1) 1,5650 ± 0,265 1,5210 ± 0,161 0,898

SM (d18:1/24:2) 0,2057 ± 0,034 0,2176 ± 0,028 0,701

Anexo D. Espécies de esfingomielinas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

64

Espécies Dieta

Normossódica Dieta Hipossódica P

TAG (12:0/16:1/18:2) 0,0853 ± 0,026 0,0773 ± 0,013 1,000

TAG (14:0/16:0/16:1) 0,5100 ± 0,220 0,3323 ± 0,044 0,798

TAG (14:0/16:0/18:1) 0,6400 ± 0,319 0,4380 ± 0,122 0,898

TAG (14:0/16:1/18:1) 0,5600 ± 0,221 0,4697 ± 0,066 0,609

TAG (14:0/16:1/16:1) 0,7830 ± 0,264 0,7222 ± 0,085 0,443

TAG (14:0/18:1/18:1) 1,6540 ± 0,751 1,3730 ± 0,382 0,898

TAG (14:0/18:2/18:2) 0,8110 ± 0,212 0,8530 ± 0,130 0,943

TAG (14:1/16:0/16:1) 0,0678 ± 0,032 0,0549 ± 0,017 1,000

TAG (14:1/16:1/18:1) 0,4770 ± 0,166 0,5222 ± 0,060 0,371

TAG (14:1/16:1/18:2) 0,5140 ± 0,133 0,5978 ± 0,076 0,609

TAG (14:1/16:1/16:1) 0,2791 ± 0,079 0,3116 ± 0,044 0,523

TAG (14:1/18:2/18:2) 0,5950 ± 0,144 0,8210 ± 0,105 0,307

TAG (15:0/16:1/18:1) 0,0633 ± 0,019 0,0578 ± 0,007 0,898

TAG (15:0/16:1/18:2) 0,1405 ± 0,042 0,1273 ± 0,013 0,898

TAG (15:0/18:1/18:2) 0,3560 ± 0,103 0,3317 ± 0,043 0,701

TAG (15:0/18:1/18:1) 0,1236 ± 0,052 0,0973 ± 0,024 0,701

TAG (15:0/18:2/18:2) 0,0292 ± 0,006 0,0319 ± 0,006 1,000

TAG (16:0/16:1/17:1) 0,2317 ± 0,075 0,1900 ± 0,023 0,701

TAG (16:0/16:1/18:1) 6,5800 ± 2,120 6,2750 ± 0,833 0,609

TAG (16:0/16:1/22:6) 0,1707 ± 0,046 0,2000 ± 0,030 0,701

TAG (16:0/16:1/16:1) 2,3410 ± 0,748 2,2290 ± 0,247 0,523

TAG (16:0/17:1/18:1) 0,3830 ± 0,113 0,3434 ± 0,044 0,701

TAG (16:0/17:1/18:2) 0,1384 ± 0,034 0,1296 ± 0,014 0,898

TAG (16:0/18:0/18:1) 0,9270 ± 0,390 0,5511 ± 0,083 0,898

TAG (16:0/18:0/18:2) 2,3900 ± 1,010 2,0870 ± 0,531 0,701

TAG (16:0/18:1/18:2) 2,3900 ± 1,010 2,0870 ± 0,531 0,609

TAG (16:0/18:1/19:1) 0,1402 ± 0,060 0,1066 ± 0,022 0,701

TAG (16:0/18:1/20:1) 1,1480 ± 0,460 0,9530 ± 0,238 0,798

TAG (16:0/18:1/22:6) 0,1592 ± 0,047 0,1951 ± 0,032 0,443

TAG (16:0/18:1/18:1) 6,5300 ± 1,730 6,3190 ± 0,926 1,000

TAG (16:0/18:2/22:4) 0,1037 ± 0,041 0,1041 ± 0,025 0,609

TAG (16:0/18:2/22:6) 0,1037 ± 0,041 0,1041 ± 0,025 0,371

TAG (16:0/18:2/18:2) 1,1600 ± 0,474 1,1610 ± 0,303 0,701

Anexo E. Espécies de triacilglicerol (TAG) identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7).

65

Espécies Dieta

Normossódica Dieta Hipossódica P

TAG (16:0/16:0/16:1) 1,7990 ± 0,756 1,2650 ± 0,171 0,798

TAG (16:0/16:0/18:1) 4,1000 ± 1,670 2,7890 ± 0,400 1,000

TAG (16:0/16:0/16:0) 0,3030 ± 0,107 0,3360 ± 0,049 0,371

TAG (16:1/17:1/18:2) 0,2583 ± 0,070 0,2644 ± 0,034 0,898

TAG (16:1/18:1/18:2) 10,4100 ± 2,700 11,0600 ± 1,170 0,609

TAG (16:1/18:1/18:1) 3,1140 ± 0,778 3,2400 ± 0,393 0,609

TAG (16:1/18:2/18:3) 0,6790 ± 0,173 0,9630 ± 0,139 0,307

TAG (16:1/18:2/22:5) 0,0290 ± 0,011 0,0420 ± 0,011 0,443

TAG (16:1/18:2/18:2) 5,3000 ± 1,270 6,4130 ± 0,853 0,523

TAG (16:1/16:1/17:1) 0,0651 ± 0,017 0,0712 ± 0,011 0,798

TAG (16:1/16:1/18:1) 7,3700 ± 1,830 7,7770 ± 0,829 0,701

TAG (16:1/16:1/18:2) 3,6020 ± 0,840 4,4090 ± 0,515 0,609

TAG (16:1/16:1/18:3) 0,1419 ± 0,037 0,1797 ± 0,029 0,609

TAG (16:1/16:1/20:4) 0,4200 ± 0,102 0,5917 ± 0,082 0,201

TAG (16:1/16:1/16:1) 1,9790 ± 0,507 2,3070 ± 0,283 0,609

TAG (17:0/18:1/18:2) 0,1100 ± 0,044 0,0905 ± 0,021 0,701

TAG (17:1/18:1/18:2) 0,3428 ± 0,095 0,3364 ± 0,042 0,898

TAG (17:1/18:1/18:1) 0,3790 ± 0,104 0,3543 ± 0,043 0,701

TAG (17:1/18:2/18:2) 0,1410 ± 0,038 0,1464 ± 0,019 0,898

TAG (18:0/18:1/18:2) 0,0472 ± 0,012 0,0463 ± 0,007 1,000

TAG (18:0/18:1/18:1) 1,0160 ± 0,309 0,8320 ± 0,114 0,898

TAG (18:1/18:2/18:3) 0,8150 ± 0,199 0,9990 ± 0,125 0,250

TAG (18:1/18:2/19:1) 0,1143 ± 0,034 0,0944 ± 0,013 0,898

TAG (18:1/18:2/20:1) 0,4070 ± 0,137 0,3487 ± 0,052 0,798

TAG (18:1/18:2/20:2) 0,2163 ± 0,067 0,2460 ± 0,035 0,443

TAG (18:1/18:2/20:3) 0,2421 ± 0,074 0,2247 ± 0,036 0,798

TAG (18:1/18:2/22:4) 0,1231 ± 0,038 0,1287 ± 0,022 0,701

TAG (18:1/18:2/20:4) 0,4620 ± 0,127 0,5369 ± 0,076 0,701

TAG (18:1/18:2/22:6) 0,1084 ± 0,028 0,1561 ± 0,026 0,443

TAG (18:1/18:2/18:2) 5,9300 ± 1,500 6,3380 ± 0,708 0,523

TAG (18:1/18:1/17:0) 0,2068 ± 0,061 0,1769 ± 0,024 0,898

TAG (18:1/18:1/18:2) 6,4600 ± 1,570 7,0610 ± 0,836 0,701

TAG (18:1/18:1/20:1) 0,3840 ± 0,114 0,3272 ± 0,042 1,000

TAG (18:1/18:1/20:2) 0,1219 ± 0,044 0,0615 ± 0,016 0,443

Anexo E continuação. Espécies de triacilgliceróis (TAG) identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana

66

e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Espécies Dieta

Normossódica Dieta Hipossódica P

TAG (18:1/18:1/20:4) 0,2898 ± 0,075 0,3327 ± 0,047 0,523

TAG (18:1/18:1/22:5) 0,1038 ± 0,032 0,1099 ± 0,020 0,701

TAG (18:2/18:2/18:3) 0,8600 ± 0,232 1,2130 ± 0,181 0,201

TAG (18:2/18:2/20:1) 0,1462 ± 0,049 0,0883 ± 0,008 0,701

TAG (18:2/18:2/20:4) 0,1726 ± 0,044 0,2353 ± 0,035 0,523

TAG (18:2/18:2/22:6) 0,0538 ± 0,015 0,0921 ± 0,017 0,160

TAG (18:2/18:2/22:5) 0,0258 ± 0,009 0,0331 ± 0,006 0,250

TAG (18:2/18:2/18:2) 0,0258 ± 0,009 0,0331 ± 0,006 0,701

DAG (16:1/18:1) 2,9920 ± 0,339 3,5780 ± 0,366 0,250

DAG (18:2/18:2) 1,2210 ± 0,259 1,3850 ± 0,216 0,609

DAG (18:1/18:2) 4,0620 ± 0,524 4,5460 ± 0,490 0,371

DAG (18:1/18:1) 1,9750 ± 0,223 2,0650 ± 0,207 0,701

Anexo F. Espécies de trigliceróis e diacilgliceróis identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

Espécies Dieta

Normossódica Dieta Hipossódica P

Q-9 0,1789 ± 0,024 0,1950 ± 0,016 0,443

Anexo G. Espécie de coenzima Q-9 identificada no gastrocnêmio de animais LDLR KO alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

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Espécies Dieta

Normossódica

Dieta

Hipossódica P

1G-Cer (d18:0/20:1-OH) 0,0302 ± 0,0045 0,0351 ± 0,0036 0,523

1G-cer (d18:0/22:0-OH) 0,0018 ± 0,0005 0,0014 ± 0,0003 0,307

1G-cer (d18:0/22:1-OH) 0,1722 ± 0,0270 0,1832 ± 0,0220 0,701

1G-cer (d18:0/23:1-OH) 0,0113 ± 0,0019 0,0112 ± 0,0012 0,798

1G-Cer (d18:0/24:0-OH) 0,0125 ± 0,0019 0,0147 ± 0,0018 0,371

1G-cer (d18:0/24:1-OH) 0,2869 ± 0,0433 0,3154 ± 0,0368 0,609

1G-cer (d18:0/24:2-OH) 0,0218 ± 0,0037 0,0235 ± 0,0027 0,609

1G-cer (d18:1/22:0-OH) 0,0018 ± 0,0005 0,0014 ± 0,0003 0,307

1G-cer (d18:1/23:0-OH) 0,0035 ± 0,0006 0,0038 ± 0,0005 0,609

1G-cer (d18:0/24:0) 0,0119 ± 0,0022 0,0123 ± 0,0017 0,701

1G-Cer (d18:1/20:0) 0,0100 ± 0,0017 0,0116 ± 0,0015 0,701

1G-cer (d18:1/22:0) 0,0342 ± 0,0058 0,0403 ± 0,0057 0,523

1G-cer (d18:1/23:0) 0,0132 ± 0,0022 0,0149 ± 0,0022 0,523

1G-cer (d18:1/24:0) 0,1972 ± 0,0328 0,2063 ± 0,0302 0,701

1G-cer (d18:1/24:1) 0,1060 ± 0,0175 0,1181 ± 0,0162 0,523

1G-Cer (d18:1/24:2) 0,0097 ± 0,0017 0,0107 ± 0,0015 0,798

Sulfatido Cer (d18:1/18:0) 0,0035 ± 0,0005 0,0046 ± 0,0006 0,125

Sulfatido Cer (d18:1/20:0) 0,0022 ± 0,0003 0,0034 ± 0,0005 0,097

Sulfatido Cer (d18:1/22:0) 0,0066 ± 0,0014 0,0069 ± 0,0008 0,701

Sulfatido Cer (d18:1/23:0) 0,0024 ± 0,0005 0,0025 ± 0,0002 0,443

Sulfatido Cer (d18:1/24:0) 0,0311 ± 0,0051 0,0370 ± 0,0053 0,701

Sulfatido Cer (d18:1/24:1) 0,0369 ± 0,0072 0,0383 ± 0,0051 0,798

Sulfatido Cer (d18:2/24:1) 0,0048 ± 0,0011 0,0056 ± 0,0008 0,307

Sulfatido Cer (d18:1/22:0-OH) 0,0042 ± 0,0008 0,0050 ± 0,0006 0,201

Sulfatido Cer (d18:1/24:0-OH) 0,0063 ± 0,0012 0,0070 ± 0,0007 0,250

Cer (d18:1/18:0) 0,2581 ± 0,0403 0,2621 ± 0,0156 0,443

Cer (d18:1/22:0) 0,0107 ± 0,0018 0,0115 ± 0,0007 0,250

Cer (d18:1/24:0) 0,0118 ± 0,0020 0,0131 ± 0,0010 0,160

Cer (d18:1/24:1) 0,0288 ± 0,0049 0,0272 ± 0,0022 0,609

Cer (d18:1/24:2) 0,0060 ± 0,0012 0,0058 ± 0,0007 0,201

Anexo H. Espécies de monoglicosil (1G) ceramidas, Sulfatido ceramidas e ceramidas identificadas no gastrocnêmio de animais LDLR KO dos alimentados com dieta normossódica (n = 7) ou hipossódica (n = 7). Os dados foram apresentados como mediana e erro padrão. As comparações entre os grupos foram feitas pelo teste de Mann-Whitney.

68

69

Anexo I. Documento de aprovação do estudo pela Comissão de Étida no Uso de Animais.

70

9. REFERÊNCIAS

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