Aulas práticas

Imunologia 2014.1

Objetivos

Apresentar os diversos métodos imunológicos, dando ênfase naqueles que possuem uma maior importância no desempenho profissional.

O aluno deverá ser capaz de: entender as bases racionais dos diversos métodos compreender as suas aplicações avaliar as suas limitações e vantagens em relação a

outros testes de finalidade semelhante interpretar os seus resultados

Métodos imunológicos

Métodos imunológicos - Princípio

• Interação Antígeno-Anticorpo

Detecção:

– Antígeno: Anticorpo: diagnóstico de diversas

enfermidades

– Imunidade celular: hipersensibilidade cutânea,

percentual de células T (HIV/inf. Fúngicas)

Aplicação

• Os usos de testes imunológicos incluem: – confirmação de uma impressão clínica; – diagnóstico precoce de uma doença; – exclusão de determinada enfermidade; – acompanhamento do progresso da doença; – avaliação da efetividade da terapêutica

• O teste imunodiagnóstico ideal deveria ser de fácil execução, barato e de resultado sempre preciso. Tal teste não existe.

1. Mét. para detecção de antígenos 2. Mét. para detecção de anticorpos 3. Mét. para avaliação da imunidade celular 4. Testes de Histocompatibilidade 5. Imunohematologia

Metodologias que utilizam reagentes não marcados:

•Precipitação

•Aglutinação

•Hemólise (Fixação de Complemento)

Metodologias que utilizam reagentes marcados

•Radioimunoensaios

•ELISA

•Imunofluorescência

•Western Blotting

•Citometria de Fluxo

Técnicas Imunológicas

AGLUTINACAO

• A reação de aglutinação caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superficie.

• A aglutinação pode ocorrer:– partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua

superficie (hemácias, bactérias, protozoários, etc.) – partículas inertes (partículas de látex, poliestireno, bentonita, etc.)– células antigenicamente não relacionadas (hemácias, bactérias) as quais se

adsorvem ou se fixam antígenos solúveis.

AGLUTINACAO As reacoes de aglutinacao sao muito empregadas para o diagnostico laboratorial de doencas causadas por virus, bacterias, protozoarios e fungos, doenca auto-imune, na tipagem de grupos sanguineos dos sistemas ABO e Rh

ELISA

• ELISA é um teste imunoenzimático é

usado no diagnóstico de várias doenças

que induzem a produção de

imunoglobulinas.

• Imunoensaio usa anticorpos específicos

para detectar antígenos e anticorpos.

• O complexo que contém o anticorpo é

visualizado pelo acoplamento da

enzima ao anticorpo. A adição de

substrato ao complexo enzima-

anticorpo-antígeno resulta num

produtocolorido

TESTE DE IMUNOFLUORESCENCIA • Certos materiais têm a propriedade de absorção de energia, quando exposto a

luz de um determinado comprimento de onda. A luz que é emitida tem uma energia mais baixa e, por conseguinte, uma cor diferente da da luz incidente. A luz emitida é chamada fluorescência

• Imunofluorescência direta, os anticorpos já são conjugados com um Qdye fluorescente.

• Imunofluorescência indireta, por outro lado, um anticorpo secundário marcado com fluorocromo são adicionados num segundo passo, após o anticorpo primário antigen-específica foi ligado.

• Imunofluorescência direto pode ser usado para estudar dois ou mais antigénios de cada vez.

• é um meio eficaz para corar as células em suspensão, as secções de tecido, ou citospinas.

Citometria de fluxo

Figure A-25 part 2 of 2

ASLO

ASLO

• Anticorpo antiestreptolisina O

• Estreptolisina O

• Streptococcus -hemolíticos (grupo A)– S. pyogenes

• Amigdalite• Eripisela• Gromerulonefrite• Febre reumatica

ASLO

• Antiestreptolisina O

– 7º dia apos infeccao – aumento da secrecao

– 3ª a 5ª semana – pico– 2º - 4º mês – nivel normal

ASLO - PRINCÍPIO

• Particulas de latex revestidas com estreptolisina O,

purificadas e estabilizadas mostram nitida aglutinacao

quando misturadas, em uma area do cartao-teste, com um

soro contendo niveis elevados de anticorpos

antiestreptolisina.

• Qualitativo

• Semi-quantitavo

ASLO – MATERIAL NECESSÁRIO

• Suspensao de latex revestida com estreptolisina O• Cartao teste• Varetas plasticas• Controle + e –• Amostra

– Soro• Livre de hemolise, lipemia e contaminacoes externas• Nao utilizar plasma – fibrinogênio • Qualitativo – amostra pura• Semi-quantitativo – diluicoes (1:2; 1:4; 1:8; 1:16)

ASLO – TÉCNICA

• 1. Pipetar 25µl do soro do paciente em uma area do cartao-teste.

• 2. Homogeneizar a suspensao de latex (1) e pipetar 25µl na mesma area da amostra.

• 3. Misturar muito bem o soro com o latex, espalhando cuidadosamente com uma vareta plastica.

• 4. Atraves de movimentos suaves de rotacao, sob uma boa fonte de luz, observar durante 2 minutos a formacao de uma eventual aglutinacao.

ASLO - Resultados• Qualitativo

– Positivo – Aglutinacao tênue ou nitida. Concentracao igual ou superior a 200Ul/ml.

– Negativo – Total ausência de aglutinacao. Concentracao inferior a 200Ul/ml.

• Semi-quantitativo– Negativo – Total ausência de aglutinacao. Concentracao inferior a

200Ul/ml– Positivo

• Concentracao (Ul/ml) = 200 x D, – onde 200 e a sensibilidade do teste e D, a maior diluicao que

apresenta aglutinacao.

• Se o titulo obtido for 1:8, a concentracao aproximada de ASLO existente na amostra sera:

– 200x8 = 1600Ul/ml.

ASLO – VALORES DE REFERÊNCIA

• < 200UI/mL• < 333UI/mL – ate 5 anos• < 500UI/mL – maiores de 5 anos

Não expressa gravidade da doença

Resposta a uma prévia infecção estreptocócica

Os Neutrófilos são os granulócitos mais comuns no sangue. (55-70% de todos os Leucócitos são Neutrófilos). Eles tem núcleo segmentado, tipicamente com 2 a 5 lobos conectados entre si através de finas fitas de cromatina as quais podem ser dificeis de se ver. A célula pode aparentar ser multinucleada.

Os Eosinófilos correrspondem a 2-5% do total de leucócitos, e são distinguíveis pelos seus grânulos acidofilicos (vermelho/laranja) proeminente contendo um componente conhecido como Proteína Básica Principal, a qual é tóxica para muitas larvas de parasitas. O núcleo tem usualmente apenas 2 a 3 lobos. As funções desse tipo de granulócito estão associadas com respostas alérgicas e defesa contra parasitas.

Os Basófilos compreendem menos de 1% do total de leucócitos,e são distinguidos pelos grânulos azul escuro específicos proeminentes que contém histamina, heparina e outros componentes.O núcleo está usualmente obscurecido pelo densidade dos grânulos.

Os Basófilos estão associados com a resposta imune inata a antígenos externos, assim como na ocorrência de asma e anafilaxias.

Os Monócitos são as maiores células vistas no esfregaço sangüíneo e constitue5 a 8% dos leucócitos. Seu núcleo não é multilobular como os granulócitos,mas pode ser em forma de “U” com cromatina aparentemente reticular. O citoplasma dos monócitos contém numerosos grânulos lisossomais os quais dão a ele uma aparência acinzentada de vidro fosco.

Os Monócitos saem eventualmente da corrente sangüínea e se tornam macrófagos tissulares, os quais são responsáveis pela remoção de ‘debris’ assim como pela defesa contra certos tipos de invasores

O linfócito é uma célula arredondada ou ovalada com um núcleo oval ou em forma de rim que ocupa a maior parte da célula. O nucléolo pode estar presente mas a cromatina densa impede a distinção. Possui um diâmetro de 6 a 16 micrômetros. Normalmente são menores que os monócitos. Os linfócitos desempenham inúmeros papéis na resposta imune adquirida.

LeucogramaLeucogramaLeucocitose: elevacao acima de 9000/mm3. Pode ser devido ao aumento de uma. Duas, ate três tipos de celulas, sendo as mais importantes neutrofilos, linfocitos e eosinofilos

Leucopenia:reducao dos leucocitos abaixo de 5000/mm3, o que se deve, na maioria das vezes, a baixa de neutrofilos.

Desvio para a esquerda: aparecimento de formas imaturas, bastoes e metamielocitos

2- Granulócitos Incluem neutrofilos (bandas e segmentos), eosinofilos e basofilos. Na avaliacao numerica das aberracoes dessas celulas (e em qualquer dos outros leucocitos), primeiro deve-se determinar a contagem absoluta por multiplicacao do valor percentual da celula pelo total de leucocitos. Por exemplo, 2% de basofilos em 6.000/L de Leucocitos totais, resulta em 120 basofilos por L, o que e normal. Entretanto, 2% de basofilos em 75000/L resulta em 1500 basofilos por L, o que e grosseiramente anormal e estabelece o diagnostico de Leucemia Mieloide Crônica.

A) Neutrófilos- Neutrofilia -

Avaliacao Laboratorial: A contagem absoluta de neutrofilos esta maior que 6.5X109/L(>25000/L). Causas:

Producao e liberacao aumentada da medula ossea em conseqüência de desordens como infeccoes bacterianas, lesoes agudas, leucemias ou necrose celular. O número aumentado e normalmente acompanhado por um "deslocamento para esquerda" indicando uma liberacao de granulocitos imaturos da medula ossea.

Mal distribuicao entre os "pools" marginais e circulantes em conseqüência de desordens fisicas ou estresse emocional. Fumantes tendem a ter uma contagem de granulocitos maior que os nao fumantes.

Neutropenia - Avaliação Laboratorial: a contagem absoluta de Neutrófilos está menor que 1.5X109/L. Causas: Diminuição da produção pela medula óssea em

conseqüência de desordens como Anemia de Falconi, Anemia Aplástica, Lesão tóxica ou Anemia Perniciosa.

Bloqueio da liberação da medula óssea em conseqüência de desordens como neutropenia cíclica ou agranulocitose.

Aumento da destruição na circulação periférica em conseqüência de desordens como esplenomegalia, neutropenia neonatal isoimune ou por certas infecções, incluindo febre tifóide, brucelose e malária.

Mal distribuição entre os "pools" circulantes e marginais em conseqüência de desordens como viremias, diálise ou descanso prolongado em leitos.

B) Eosinófilos Eosinofilia - Avaliacao Laboratorial: A contagem direta de eosinofilos esta maior que 0.7X109/L. Causas:

Aumento na producao pela medula ossea em conseqüência de desordens alergicas, infestacoes parasitarias, certos tumores malignos. Outras causas incluem febre escarlate, artrite reumatoide, febre reumatica aguda, sarcoidose, tuberculose e fumo.

Eosinopenia - Avaliacao Laboratorial: Contagem direta de eosinofilos menor que 0.05X109/L. Causas:

Diminuicao na producao da medula ossea em conseqüência de condicoes similares as que causam neutropenia. Alem dessas, a administracao de hormônio adrenocorticotrofico (ACTH) resulta em contagem diminuidas em individuos normais. Certas drogas tambem produzem eosinopenia como corticosteroides, adrenalina, niacina, niacinamida e procainamida.

C) Basófilos Basofilia - Avaliacao Laboratorial: A contagem direta de basofilos maior que 0.3X109/L. Causas:

Aumento da producao da medula ossea em conseqüência de desordens como hipersensibilidades ou doencas mieloproliferativas. Estrogenos, drogas anti-tireoide e desipramina podem tambem aumentar os basofilos.

Basopenia - Avaliacao Laboratorial: As contagens de diminuicao de basofilos sao dificeis de determinar visto que os valores normais sao muito baixos. Causas:

Diminuicao da producao pode ocorrer durante o estresse e infeccoes.

Nao e geralmente um problema clinico.

2- Monócitos Monocitose Avaliacao Laboratorial: A contagem absoluta de monocitos esta maior que 0.9X109/L. Causas:

Aumento da producao e liberacao da medula ossea em conseqüência de distúrbios como tuberculose, infeccoes bacterianas e parasitarias crônicas, estados mieloproliferativos, apos quimioterapia e em anemias hemoliticas. É caracteristico de inflamacoes granulomatosas crônicas. Envenenamento por fosforo e tetracloretano, assim como administracao de haloperidol, pode causar monocitose.

Monocitopenia Avaliacao Laboratorial: a contagem absoluta de monocitos esta menor que 0.2X109/L Causas:

Infeccoes extremamente graves e administracao de glicocorticoides pode produzir uma diminuicao de monocitos.

- Linfócitos Linfocitose Avaliacao Laboratorial: Contagem absoluta de linfocitos maior que 4,5X109/L Causas:

É encontrado na mononucleose infecciosa, hepatites virais, infeccoes por citomegalovirus, outras infeccoes virais, Coqueluche, Toxoplasmose, Brucelose, Tuberculose, Sifilis, Leucemias linfociticas e envenenamento por arsênico e tetracloretano. A contagem de linfocitos maduros maior que 7000/L e num individuo apos os 50 anos muito sugestivo de Leucemia linfocitica crônica. Certas drogas aumentam a contagem de linfocitos incluindo acido aminosaliciclico, griseofulvina, haloperidol, levodopa, niacinamida e fenitoina.

Linfopenia Avaliação Laboratorial: Contagem absoluta de linfócitos menor que 1.2X109/L. Na SIDA o número de linfócitos T CD4 está permanentemente diminuído. Causas:

É característico da SIDA. É também encontrado em infecções agudas, doença de Hodgkin, Lupus Eritematoso Sistêmico, Insuficiência Renal, Carcinomatose e em administração de corticosteróides, lítio, niacina e radiações ionizantes. De todas as células hematopoéticas, os linfócitos são as mais sensíveis à irradiação.

VALORES DE REFERÊNCIAGlobal de Leucócitos.: 1.700/mm3 4.000 a 11.000 /mm3Bastonetes ...............: 0 % 0/mm3 0 a 5 % 0 a 500/mm3Segmentados ............: 7 % 119/mm3 40 a 80 % 2.000 a 7.000/mm3Eosinófilos ................: 2% 34/mm3 1 a 6% 2 a 500/mm3Basófilos ..................: 0 % 0/mm3 0 a 2 % 0 a 100/mm3Monócitos .................: 19 % 323/mm3 2 a 10% 200. a 1.000/mm3Linfócitos ..................: 72 % 1.224/mm3 20 a 40 % 1.000 a 3000/mm3Linfócitos Reativos ....: 0 % 0/mm3Outros ................: 0 % 0/mm3Hematoscopia: Anisocitose acentuada.

Teste

DOENÇA

Presente Ausente

Positivo

Verdadeiro Positivo

(a)

Falso Positivo(b)

Negativo

Falso Negativo

(c)

Verdadeiro Negativo

(d)

Sensibilidade

é a capacidade que um teste tem de detectar os positivos dentre os doentes - % doentes com teste positivo

Alta sensibilidade - rastreamento diagnóstico, quando não se pode correr o risco de detectar a doença - AIDS

mais útil quando negativo - pode dar falso positivo, pouco falso negativo

S = a

a c =

DOENTES

Especificidade

é a capacidade que um teste tem de detectar os não doentes dentre os sadios - % sadios com teste negativo

Alta especificidade - quando se quer detectar sadios, útil para confirmar diagnóstico

mais útil quando positivo - pouco falso positivo, pode dar falso negativo

E = db

d

=

SADIOS

Valor Preditivo Positivo

é a proporção de doentes dentre aqueles que têm o teste positivo

Ou probabilidade pós-teste positivo

VP+ = a

a b = DOENTES

Valor Preditivo Negativo

é a proporção de sadios dentre aqueles que têm o teste negativo

Ou probabilidade pós-teste negativo

VP- = dc

d

= SADIOS

Propriedades dos testes diagnósticos

A sensibilidade e a especificidade são características dos testes - quando a sensibilidade a especificidade tende a

sensibilidade valor preditivo negativoespecificidade valor preditivo positivo

Relação entre valores preditivos e prevalência

• Os valores preditivos dependem da prevalência - doença rara:

• VP+ baixo (muito falso positivo) - não se faz rastreamento em indivíduos sadios.

• VP- alto (pouco falso negativo)

CALCULANDO SENSIBILIDADE, ESPECIFICIDADE E OS VALORES PREVISTOS

Um teste é utilizado em 50 pessoas com uma doença e 50 pessoas sem a doença.

Estes são os resultados:

DOENÇA

+ -

TESTE+ 48 3 51

- 2 47 49

50 50 100

Sensibilidade = 48/50 x 100 =

96%

Especificidade = 47/50 x 100 =

94%.

Valor previsto positivo = 48/51 x 100 =

94%.

Valor previsto negativo = 47/49 x 100 =

96%.

DOENÇA

+ -

TESTE+ 48 3 51

- 2 47 49

50 50 100

Agora, vamos aplicar este teste numa população onde 2% das pessoas têm a doença, não os 50% como no exemplo anterior. Suponha que existem 10.000 pessoas, e a mesma sensibilidade e especificidade anterior, com valores de 96% e 94% respectivamente.

DOENÇA

+ -

TESTE+ 192 588 780

- 8 9.212 9.220

200 9.800 10.000