ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DE AÇÃO DA DEFENSINA

PvD1 ISOLADA DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris L.

ÉRICA DE OLIVEIRA MELLO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY

RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

FEVEREIRO – 2010

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ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DE AÇÃO DA DEFENSINA

PvD1 ISOLADA DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris L.

ÉRICA DE OLIVEIRA MELLO

ORIENTADORA: PROF ª VALDIRENE MOREIRA GOMES

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

FEVEREIRO – 2010

Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia, da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como parte

das exigências para a obtenção do título

de Mestre em Biociências e

Biotecnologia

ATIVIDADE ANTIFÚNGICA E MECANISMO DE AÇÃO DA DEFENSINA

PvD1 ISOLADA DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris L.

Aprovada em 22 de fevereiro de 2010.

Comissão examinadora:

Profª Michelle Frazão Muzitano (Drª em Química – UFRJ)

Profª Claudete Santa Catarina (Drª em Biotecnologia – UENF)

Profª Maura da Cunha (Drª em Ciências – UENF)

Profª Valdirene Moreira Gomes (Drª em Ciências – UENF)

Orientadora

Dissertação apresentada ao Centro de

Biociências e Biotecnologia, da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, como parte

das exigências para a obtenção do título

de Mestre em Biociências e

Biotecnologia

DEDICO...

A minha mãe Nádia, ao meu pai José Aurélio e aos

meus irmãos Rômulo, Milla e Thaís por todo o

incentivo e apoio, por acreditarem em mim,

investirem nos meus sonhos e por compreenderem,

há tanto tempo, a minha ausência. Essa vitória é

nossa!!!! Muito obrigada por tudo!!!!

AGRADECIMENTOS

À prof ª Valdirene Moreira Gomes não só pela orientação e pelo aprendizado, mas

também pela experiência de vida passada a mim durante todo esse tempo. Obrigada

por toda força, paciência e pela confiança depositada em mim para que hoje eu

pudesse enfim alcançar mais essa vitória!!

Ao prof ° André de Oliveira Carvalho por ter aceitado revisar essa dissertação, por

todos os ensinamentos desde a minha graduação, por todas as dicas, pela paciência

e sabedoria, pelo companheirismo. Grande parte do que sou hoje devo a você!!

À prof ª Rosana Rodrigues por ter me cedido as sementes de feijão comum para que

eu pudesse dar continuidade ao desenvolvimento deste trabalho.

Ao prof ° Wilmar Dias da Silva e à técnica Claudia Letícia que com toda a

experiência e sabedoria colaboraram na produção do anticorpo.

À prof ª Maura Da Cunha e a Germana pela colaboração e pela ajuda durante os

experimentos de microscopia.

Aos meus companheiros de bancada: Izabella (agora Drª, né?) pela colaboração nos

ensaios antifúngicos, Gabriela, Umberto, Nádia, Júlia, Marcielle e Layrana por toda a

ajuda prestada durante todo esse tempo e em especial aos meus amigos

Mariângela, Suzanna, Luana e Gabriel que além de toda a ajuda prestada, sempre

me proporcionaram momentos de descontração, fazendo meu dia-a-dia muito

melhor!!!

À Suzanna por toda ajuda, ensinamentos passados e colaboração com os ensaios

de inibição do crescimento e inibição da acidificação. Valeu Su!!

Ao Luis pela dedicação e manutenção do nosso laboratório.

A todos os alunos, professores e funcionários do LFBM.

A amiga de república Géssika pela amizade, pelas risadas até altas horas da noite e

também por aguentar meu mau humor no dia-a-dia (rsrsrs). Não posso deixar de

agradecer também as ex integrantes da eterna República Blush: Xxxxúúú, Priscilla,

Paty (tenso), Lidy (dinda) e também as meninas do Caju, valeu pela força e amizade

de sempre!!!!!

Aos meus cunhados Fábio, Carla e Reginaldo por todo o incentivo! E a minha

sobrinha Anita, por ser a minha alegria de viver e principal fonte para recarregar

minhas energias! Titia te ama muito!!!!

À minha família campista e em especial ao meu namorado e anjo da guarda

Raphael Santiago. Obrigada por toda a paciência, dedicação, cuidado, amizade,

pelas palavras de conforto nos momentos mais difíceis e por toda atenção e carinho

a mim dedicados! Te amo!!

ÍNDICE

AGRADECIMENTOS................................................................................................ I

ÍNDICE ..................................................................................................................... III

LISTA DE FIGURAS................................................................................................. VII

ABREVIATURAS...................................................................................................... IX

RESUMO.................................................................................................................. XI

ABSTRACT.............................................................................................................. XII

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................... 1

1.1. PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS................................................................. 1

1.2. PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE PLANTAS.......................................... 2

1.3. DEFENSINAS................................................................................................. 3

1.3.1. ASPECTOS ESTRUTURAIS................................................................... 4

1.3.2. ATIVIDADES DESCRITAS IN VITRO PARA AS DEFENSINAS DE

PLANTAS .................................................................................................................

5

1.3.3. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DAS DEFENSINAS DE

PLANTAS..................................................................................................................

6

1.3.4. MECANISMO DE AÇÃO DAS DEFENSINAS DE PLANTAS................. 9

1.4. LEVEDURAS.................................................................................................. 11

1.5. FUNGOS FILAMENTOSOS........................................................................... 15

1.6. FEIJÃO COMUM Phaseolus vulgaris ............................................................. 12

2. OBJETIVOS..........................................................................................................

14

2.1. OBJETIVO GERAL.......................................................................................... 14

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................ 14

3. MATERIAIS ........................................................................................................

15

3.1. MATERIAL BIOLÓGICO................................................................................. 15

3.1.1. SEMENTES............................................................................................. 15

3.1. 2. MICRORGANISMOS.............................................................................. 15

3.1.3. COELHOS............................................................................................... 15

3.2. REAGENTES E OUTROS MATERIAIS.......................................................... 15

3.3. INSTRUMENTAL............................................................................................. 17

4. MÉTODOS............................................................................................................ 18

4.1. EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO DA DEFENSINA PvD1 DE Phaseolus

vulgaris......................................................................................................................

18

4.1.1. EXTRAÇÃO PROTÉICA DAS SEMENTES.............................................. 18

4.1.2. CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA DEAE-SEPHAROSE............... 20

4.1.3. CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA EM COLUNA C2C18 EM

HPLC.........................................................................................................................

20

4.2. QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS .......................................................... 21

4.3.ELETROFORESE EM GEL DE TRICINA NA PRESENÇA DE

SDS...........................................................................................................................

21

4.3.1. CORAMENTO E DESCORAMENTO DO GEL ........................................ 21

4.4. PRODUÇÃO DE ANTICORPO E WESTERN BLOTTING............................... 21

4.4.1. OBTENÇÃO DO SORO PRÉ-IMUNE E IMUNIZAÇÃO............................ 21

4.4. 2. PURIFICAÇÃO DE IgG DO SORO.......................................................... 22

4.4.3.ELETROTRANSFERÊNCIA DE PROTEÍNAS PARA WESTERN

BLOTTING................................................................................................................

23

4.4.4. IMUNODETECÇÃO DE PROTEÍNAS .................................................... 23

4.5. ENSAIO DE INIBIÇÃO DA GERMINAÇÃO DOS ESPOROS FÚNGICOS EM

MEIO LÍQUIDO..........................................................................................................

24

4.5.1. OBTENÇÃO DE ESPOROS DE FUNGOS FILAMENTOSOS.................. 24

4.5.2. ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DOS ESPOROS

FÚNGICOS...............................................................................................................

24

4.6. AVALIAÇÃO DO MECANISMO DE AÇÃO DA PvD1 SOBRE FUNGOS.......... 24

4.6.1. EFEITOS DA DEFENSINA PvD1 SOBRE A PERMEABILIZAÇÃO DE

MEMBRANA DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS................................

24

4.6.2. ANÁLISE DO EFEITO DA DEFENSINA PvD1 SOBRE A INIBIÇÃO DA

ACIDIFICAÇÃO DO MEIO INDUZIDO POR GLICOSE POR CÉLULAS DE

LEVEDURAS............................................................................................................

25

4.6.2.1. MANUTENÇÃO E PREPARO DAS CÉLULAS................................... 25

4.6.2.2. ENSAIO DE ACIDIFICAÇÃO............................................................. 25

4.6.3. EFEITOS DA DEFENSINA ISOLADA PvD1 SOBRE A INDUÇÃO DA A

PRODUÇÃO ENDÓGENA DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS) EM))

CÉLULAS DE C. albicans..........................................................................................

26

5. RESULTADOS..................................................................................................... 27

5.1. PURIFICAÇÃO DA DEFENSINA.................................................................... 27

5.2. ELETROFORESE EM GEL DE TRICINA NA PRESENÇA DE SDS.............. 29

5.3. WESTERN BLOTTING.................................................................................... 30

5.4. ANÁLISE DA INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE ESPOROS FÚNGICOS

EM MEIO LÍQUIDO...................................................................................................

31

5.5. EFEITOS DA DEFENSINA PvD1 SOBRE A PERMEABILIZAÇÃO DE

MEMBRANA DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS................................

32

5.6. ENSAIO DE ACIDIFICAÇÃO DO MEIO INDUZIDO POR GLICOSE EM

CÉLULAS DE LEVEDURAS.....................................................................................

41

5.7. EFEITOS DA DEFENSINA ISOLADA PvD1 SOBRE A INDUÇÃO DA

PRODUÇÃO ENDÓGENA DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS) EM

CÉLULAS DE C. albicans.........................................................................................

45

6. DISCUSSÃO......................................................................................................... 47

7. CONCLUSÕES..................................................................................................... 53

8. BIBLIOGRAFIA.................................................................................................... 54

LISTA DE ESQUEMAS, FIGURAS E TABELAS

FIGURA 1. Comparação entre estruturas elucidadas de diferentes defensinas de

plantas.......................................................................................................................

5

TABELA 1. Atividade antifúngica de defensinas contra fungos, leveduras,

oomicetos e bactérias................................................................................................

9

ESQUEMA 1. Fracionamento com sulfato de amônio do homogeneizado obtido a

partir da extração da farinha das sementes de feijão comum..................................

19

FIGURA 2. Cromatograma da F/0-70 de sementes de feijão comum obtido após

cromatografia em coluna DEAE–Sepharose............................................................

27

FIGURA 3. Cromatograma obtido após cromatografia de fase reversa em coluna

C2/C18 em HPLC do pico D1 obtido após cromatografia em DEAE-Sepharose.....

28

FIGURA 4. Visualização eletroforética em gel de tricina na presença de SDS da

F/0-70 e dos picos obtidos após cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose e

cromatografia em coluna de fase reversa C2C18.................................................. 29

FIGURA 5. Western Blotting do anticorpo produzido em coelhos contra a

defensina PvD1 isolada de sementes de P. vulgaris................................................

30

FIGURA 6. Curva de crescimento mostrando a alteração do crescimento dos

fungos filamentosos (A) F. oxysporum, (B) F. solani e (C) F. laterithium na

ausência (controle) e na presença da defensina isolada PvD1, obtida após

cromatografia em coluna de DEAE-Sepharose........................................................

31

TABELA 2. Atividade antifúngica da defensina PvD1 para fungos filamentosos.... 32

TABELA 3. Atividade antifúngica da defensina PvD1 para leveduras..................... 32

FIGURA 7. Microscopia dos fungos filamentosos Fusarium oxysporum (A-D),

Fusarium solani (E-H), Fusarium laterithium (I-L) tratados com Sytox Green..........

35

FIGURA 8. Microscopia das células das leveduras C. parapsilosis (A-D), P.

membranifaciens (E-H), C. tropicalis (I-L) tratadas com Sytox Green......................

38

FIGURA 9. Microscopia das células das leveduras C. albicans (A-D), K.

marxiannus (E-H) e S. cerevisiae (I-L) tratadas com Sytox Green...........................

41

FIGURA 10. Porcentagem de acidificação do meio por células da levedura S.

cerevisiae, na presença da defensina PvD1 de sementes de feijão comum obtida

após cromatografia em coluna DEAE-Sepharose, nas várias concentrações

testadas. (A) 1 h de pré-incubação; (B) 2 h de pré-incubação; (C) 4 h de pré-

incubação..................................................................................................................

43

FIGURA 11. Porcentagem de acidificação do meio por células da levedura C.

albicans, na presença da defensina PvD1 isolada de sementes de feijão comum

obtida após cromatografia em coluna DEAE-Sepharose, nas várias

concentrações testadas. (A) 1 h de pré-incubação; (B) 2 h de pré-incubação e (C)

4 h de pré-incubação................................................................................................

45

FIGURA 12. Microscopia das células da levedura C. albicans tratadas com o

corante 2’,7’ diclorofluoresceína diacetato.............................................................

46

ABREVIATURAS

ACN – Acetonitrila

AMP – Peptídeo antimicrobiano

BSA – Albumina bovina sérica

D1 – Pico não retido na cromatografia em coluna DEAE- Sepharose

D2 – Pico retido na cromatografia em coluna DEAE- Sepharose

Da – Dalton

DAD – Detector de arranjo de diodo

DAB – Diaminobenzidina

DAPI – 4,6 diamidino 2 fenilindol

DEAE – Dietilaminoetil

EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético

ELISA – Ensaio imunosorvente ligado à enzima

FITC – Isotiocianato fluoresceína

F/0-70 – Fração 0-70 obtida após fracionamento com sulfato de amônio 0-70%

H1 – Pico obtido em coluna de fase reversa

HPLC – Cromatografia líquida de alto desempenho

IC50 – Concentração de proteína necessária para de obter 50% de inibição do

crescimento da levedura

IgG – Imunoglobulina G

kDa – Quilodaltons

M – Marcador de massa molecular

nm – Nanômetro

PvD1 – Defensina 1 de Phaseolus vulgaris

TEMED – N, N, N’ ,N’ -tetrametiletilenodiamina

TFA – Ácido trifluoroacético

Tris – Tris-hidroximetil-aminometano

SDS – Dodecil sulfato de sódio

VrD1 – Defensina 1 de Vigna radiata

PhD1 e PhD2 – Defensinas 1 e 2 de Petunia hybrida,

PsD1 – Defensina de Pisum sativum

Rs-AFP2 – Defensina 2 de Raphanus sativus

NaD1 – Defensina 1 de Nicotiana alata

alfAFP – Defensina de Medicago sativa

Hs-AFP1 – Defensina 1 de Heuchera sanguinea

ROS – Espécies reativas de oxigênio

Bisacrilamida – N,N’-metileno bisacrilamida

PBS – Tampão fosfato salino

RESUMO

Nos últimos anos muitos trabalhos vêm demonstrando a função de algumas

proteínas e peptídeos com atividade antimicrobiana isolados de diferentes espécies

de plantas contra um vasto número de microrganismos, os quais vêm sendo

utilizados como modelo no estudo dos diferentes processos celulares relacionados à

ação destes peptídeos antimicrobianos. Em 2008, nosso grupo isolou e caracterizou

uma defensina de sementes de Phaseolus vulgaris (L.), denominada PvD1. O

objetivo deste trabalho estudar o mecanismo de ação e atividade antifúngica desta

defensina contra diferentes espécies de fungos filamentosos e leveduras.

Inicialmente, proteínas foram extraídas da farinha da semente em tampão fosfato pH

5,4 na proporção de 1:5 por duas horas sob constante agitação a 4 °C. O

sobrenadante obtido foi submetido a precipitação com sulfato de amônio (0-70%).

Este precipitado foi ressuspenso em água destilada e aquecido a 80 °C por 15 min.

A solução resultante foi centrifugada e o sobrenadante dialisado contra água

destilada e liofilizado. Uma cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-

Sepharose foi empregada inicialmente para a purificação da PvD1 a qual resultou

em dois diferentes picos denominados D1 e D2. O pico D1 contendo a PvD1, foi

submetido a uma cromatografia de fase reversa em coluna C2C18 em HPLC

confirmando sua pureza. Então, a fração D1 foi utilizada para a produção do

anticorpo contra PvD1 e também foram feitos testes antifúngicos com os fungos

filamentosos Fusarium oxysporum, F. solani e F. laterithium e foi possível observar

que a inibição foi mais acentuada na presença de 100 µg.mL-1 da PvD1. Foi

mostrado também que PvD1 é capaz de causar permeabilização de membrana tanto

nos fungos filamentosos testados quanto nas células das leveduras Candida

parapsilosis, Pichia membranifaciens, C. tropicalis, C. albicans, Kluyveromyces

marxiannus e Saccharomyces cerevisiae. PvD1 também foi capaz de inibir a

acidificação do meio, estimulada por glicose por células das leveduras S. cerevisiae

e C. albicans bem como induzir também a produção de espécies reativas de

oxigênio em células de C. albicans.

ABSTRACT

In the last years studies have demonstrated the function of some proteins and

peptides with antimicrobial activity isolated from different plant species against an

extensive number of microorganisms, which have been used as a model in the study

of different cellular processes connected with the action of these antimicrobial

peptides. In 2008, our group isolated and characterized an defensin from Phaseolus

vulgaris seeds (L.), named PvD1. The aim of this study was to study the mechanism

of the action and the antifungal activity of the defensins against different species of

filamentous fungi and yeasts. Initially, the proteins from seed flour were extracted in

phosphate buffer pH 5.4 in the ratio 1:5, for two hours under constant agitation at 4

°C. The supernatant obtained was submitted to precipitation with ammonium sulfate

(0-70%). This precipitate was resuspended in distilled water and heated at 80 °C for

15 min. The resulting solution was centrifuged and the supernatant dialyzed against

distilled water and freeze dried. An ion exchange chromatography on a column of

DEAE-Sepharose was initially employed for the purification of the PvD1 which

resulting in two different peaks named D1 and D2. The peak D1 containing the PvD1,

was submitted to a C2C18 HPLC reverse phase column to assure its purity. Then,

D1 fraction used for production of the antibody against the defensin PvD1 and also

for antifungal tests were made with the filamentous fungi Fusarium oxysporum, F.

solani e F. laterithium and was possible to observe that the inhibition was more

accentuated in the presence of 100 µg.mL-1 of the PvD1. It was also shown that the

defensin PvD1 is capable of causing membrane permeabilization in filamentous fungi

and in yeast cells Candida parapsilosis, Pichia membranifaciens, C. tropicalis, C.

albicans, Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae. PvD1 was also

able to inhibit the acidification of the medium, stimulated with glucose by yeast cells

of S. cerevisiae e C. albicans, as well as to induce too production the reactive oxygen

species in the cells of C. albicans.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Peptídeos antimicrobianos

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) são moléculas de baixa massa molecular

com uma vasta atividade inibitória contra vírus, bactérias e fungos (Izadpanah e

Gallo, 2005). Estes peptídeos pertencem a um grupo diverso e abundante de

moléculas que são produzidas por diversas células tanto em plantas quanto em

animais e, que são agrupados de acordo com a sua atividade antimicrobiana

intrínseca (Gallo et al., 2002; Brodgen, 2005).

Grande parte desses AMPs consistem em aproximadamente 50 resíduos de

aminoácidos, são anfipáticos e carregam uma carga líquida positiva em pH

fisiológico (Van’t Hof et al., 2001). Os AMPs foram agrupados em cinco classes

baseando-se em suas estruturas tridimensionais e sequências. O primeiro grupo é

constituído por AMPs que adotam conformação de α-hélice em ambientes

hidrofóbicos tais como a cecropina e a magainina. O segundo grupo encerra

peptídeos que tem estrutura secundária formada por folhas β como exemplificado

pela taquiplesina, tanatina e polifemusina. O terceiro grupo é rico no aminoácido

cisteína o qual está ligado entre si formando pontes dissulfeto e são representados

por vários peptídeos de plantas como as defensinas, tioninas, proteínas

transportadoras de lipídeos e quinotinas. O quarto grupo engloba peptídeos ricos em

aminoácidos regulares como a histidina (histatinas) e triptofano (indolicidinas). A

última classe é representada pelos peptídeos ricos em aminoácidos raros tais como

gramicidinas (Broekaert et al., 1997; Reddy et al., 2004).

Os AMPs são componentes importantes do sistema de defesa das plantas,

animais e humanos (Hancock e Scott, 2000; Thevissen et al., 2003a). Evidências

indicam que eles atuam na permeabilização da membrana celular dos

microrganismos (Huang et al., 2000). Devido à capacidade que os AMPs possuem

de interagir com determinadas membranas celulares e, dessa forma, conferir uma

eficiente atividade antimicrobiana contra determinados agentes patogênicos, tem-se

observado nos últimos anos um grande interesse biológico em estudar esse grupo

de proteínas (Gallo et al., 2002).

A seleção de um número cada vez maior de microrganismos resistentes a

antibióticos e a outros agentes antimicrobianos tem despertado a atenção de muitos

pesquisadores na tentativa de se desenvolver novos agentes terapêuticos (Gallo et

al., 2002). O potencial terapêutico dos AMPs é valorizado graças à capacidade

destes compostos de matar rapidamente um grande número de microrganismos

incluindo bactérias, vírus e fungos que são multiresistentes a drogas.

1.2. Peptídeos antimicrobianos de plantas

As plantas, por serem organismos sésseis, estão constantemente expostas a

uma grande variedade de organismos potencialmente patogênicos, como vírus,

bactérias, micoplasmas, fungos, protozoários e nematódeos, e podem ainda ser

afetadas por diversos animais herbívoros e por condições ambientais adversas.

Sendo assim, sua sobrevivência nessas condições exige uma rápida resposta de

defesa (Castro e Fontes, 2005). Evolutivamente, todas as plantas desenvolveram

eficientes sistemas de defesa com a capacidade de reconhecer patógenos invasores

e agressores herbívoros e acionar o sistema de defesa (Castro e Fontes, 2005).

As defesas empregadas pela planta para sua proteção contra herbívoros e

patógenos são de múltipla ordem e de diversos tipos e, embora as plantas possam

sofrer danos de maior ou menor extensão, a enorme maioria sobrevive (Nürnberger

e Lipka, 2005).

Diversos mecanismos estão envolvidos na defesa de plantas contra seus

agressores seja pelo acúmulo de componentes fenólicos, de alcalóides, de

aminoácidos não protéicos, de glicosídeos ou de proteínas e peptídeos com

atividade antimicrobianas e inseticidas (Wittstock e Gershenzon, 2002; Castro e

Fontes, 2005).

Várias classes de proteínas de plantas têm sido implicadas nos mecanismos

de defesa de plantas contra patógenos e insetos, sejam estas induzidas ou

constitutivas. Dependendo de sua função durante a resposta de defesa, proteínas

envolvidas nesses processos podem atuar fortalecendo ou reparando a parede

celular ou modificando as propriedades da matriz extracelular. A grande maioria,

porém, atua diretamente sobre o patógeno ou herbívoro agressor (Shewry e Lucas,

1997; Carline e Grossi-de-Sá, 2002).

Muitos AMPs têm sido isolados de plantas, especialmente de sementes, local

em que podemos encontrá-los em nível elevado se comparado a outros órgãos da

planta (Broekaert et al., 1997; Wang et al., 2001; Sels et al., 2008). Nos últimos anos

nosso grupo, por exemplo, vem isolando e caracterizando diferentes proteínas e

AMPs presentes em sementes, os quais estão envolvidos nos mecanismos de

defesa de plantas. Até o momento Foram purificadas e caracterizadas uma

defensina e uma proteína transportadora de lipídeos (LTP) de sementes de feijão-

de-corda (Vigna. unguiculata) (Carvalho et al., 2001; Carvalho et al., 2004), uma

albumina 2S de sementes de maracujá amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa)

(Agizzio et al., 2003), uma LTP exsudada de sementes de feijão-de-corda (Diz et al.,

2003), um peptídeo com alta homologia à LTP isolado de sementes de pimenta

(Capsicumm annuum) (Diz et al., 2006) e um inibidor de proteinase isolado também

de sementes de pimenta (Ribeiro et al., 2007).

A expressão dos AMPs em plantas transgênicas pode ter aplicações na

proteção das plantas contra doenças (Kanzaki et al., 2002) e alguns AMPs estão

sendo desenvolvidos como novos antibióticos potenciais com aplicações médicas

(Hancock e Scott, 2000). No momento existe um forte interesse em se identificar os

processos celulares que determinam a susceptibilidade dos microrganismos aos

AMPs, devido à sua função no sistema de defesa natural e sua potencial aplicação

(Stephens et al., 2005).

Nos últimos anos, os pesquisadores vêm aumentando o interesse no estudo

das proteínas e dos peptídeos presentes em sementes de plantas, devido ao seu

forte papel antimicrobiano, dentre eles podemos citar: as tioninas, as heveínas, as

knotinas, as LTPs e as defensinas (Broekaert et al., 1997; Carvalho e Gomes, 2007,

Carvalho e Gomes, 2009).

1.3. Defensinas

As defensinas de plantas são peptídeos pequenos (45-54 resíduos de

aminoácidos), que apresentam peso molecular entre 5 e 8 kDa, altamente básicos,

ricos em cisteínas (oito resíduos) e que possuem atividade antifúngica e/ou

antimicrobiana em concentrações micromolares (Thevissen et al., 2003a; Carvalho e

Gomes, 2009). Estes peptídeos foram primeiramente isolados a partir de sementes

de trigo e cevada em 1990 (Colilla et al., 1990). Estes são ativos contra várias

classes de fungos fitopatogênicos e patógenos humanos, como por exemplo,

Candida albicans (Thevissen et al., 2003a).

Inicialmente, estas defensinas foram consideradas como um novo subgrupo

das tioninas, sendo então chamadas γ-tioninas (Terras et al., 1995) por

apresentarem a mesma massa molecular, mas sua conformação estrutural disposta

em três folhas β antiparalelas e uma α-hélice estabilizada por quatro pontes

dissulfeto, as diferenciavam das tioninas estruturalmente (Broekaert et al., 1997;

Fant et al., 1998; Almeida et al., 2002); Thevissen et al., 2003a; Thevissen et al.,

2004.

Alguns anos depois, devido a sua similaridade estrutural com defensinas de

insetos e mamíferos, γ-tinionas foram renomeadas como defensinas de plantas

(Terras et al., 1995).

1.3.1. Aspectos estruturais

Estudos da estrutura tridimensional de defensinas encontradas em diferentes

espécies de plantas revelaram que estas moléculas são bastante semelhantes entre

si (Almeida et al., 2002). De um modo geral, a estrutura das defensinas de plantas é

composta por três folhas β e uma α-hélice, sendo estes elementos da estrutura

secundária, conectados através de três alças. A estrutura das defensinas de plantas

é estabilizada por quatro pontes dissulfeto (Fant et al., 1998; Almeida et al., 2002;

Carvalho e Gomes, 2009) (Figura 1A). Duas dessas pontes são formadas entre as

Cys21 da α-hélice e Cys45 da última folha β e entre a Cys25 da α-hélice e Cys47 da

última folha β formando um arranjo estrutural denominado de domínio αβ

estabilizado por cisteínas, característico de peptídeos com atividade antimicrobiana

(Cornet et al., 1995; Fant et al., 1998; Thomma et al., 2002).

Embora exista uma grande similaridade entre as estruturas das defensinas de

plantas, recentemente foram descritas algumas defensinas que possuem estruturas

diferenciadas. A defensina 1 de feijão (Vigna radiata),VrD1 (Liu et al., 2006),

apresenta em sua estrutura uma hélice extra denominada hélice 310 (Figura 1B).

Além desta, as defensinas isoladas de flores de Petunia hybrida, PhD1 e PhD2,

apresentam em sua estrutura 5 pontes dissulfeto (Janssen et al., 2003; Lay et al.,

2003a; Lay et al., 2003b) (Figura 1C). Mesmo com estas diferenças estruturais,

estas defensinas continuam apresentando o domínio αβ estabilizado por Cys. A

Figura 1 mostra os três tipos de estrutura descritos para as defensinas de plantas.

Figura 1. Comparação entre estruturas elucidadas de diferentes defensinas de plantas. A -

Estrutura da defensina PsD1 de ervilha (Pisum sativum) (Almeida et al., 2002); B - Estrutura

da defensina VrD1 de feijão (Vigna radiata) (Liu et al., 2006); C - Estrutura da defensina

PhD1 de Petunia hybrida (Janssen et al., 2003). (N) Região N-terminal; (C) região C-

terminal; (α1) α-hélice; (β1) folha β 1; (β2) folha β 2; (β3) folha β 3; (310) α-hélice 310.

1.3.2. Atividades descritas in vitro para as defensinas de planta

As defensinas de planta apresentam diversas funções biológicas que incluem

atividade antifúngica (Broekaert et al., 1997; García-Olmedo et al., 1998; Carvalho et

al., 2001; Thomma et al., 2002; Thevissen et al., 2003b; Games et al., 2008), inibição

de amilases do intestino de insetos (Bloch e Richardson, 1991; Liu et al., 2006;

Pelegrini et al., 2008;) e tripsina bovina (Wijaya et al., 2000), inibição de síntese de

proteínas (Colilla et al., 1990; Chen et al., 2002; Wong et al., 2006), atividade

antibacteriana (Moreno et al., 1994; Osborn et al., 1995;) e bloqueio de canais de

sódio (Kushmerick et al., 1998; Spelbrink et al., 2004).

C

A

β1

β2

β3

α1

B

Na literatura, foi visto que defensinas encontradas em plantas desempenham

um papel importante na proteção dos tecidos de plantas jovens durante os primeiros

estágios de emergência (Terras et al., 1995). A expressão das defensinas nos vários

tecidos das diferentes espécies de plantas, como nabo (Brassica campestris) (Park

et al., 2002), ervilha (P. sativum) (Almeida et al., 2002), fumo de jardim (Nicotiana

alata) (Lay et al., 2003a), rabanete (Raphanus sativus) (Terras et al., 1995), tomate

(Lycopersicon esculentum) (Brandstadter et al., 1996) e Arabidopsis thaliana

(Penninckx et al., 1996; Thomma et al., 2002) tem sido estudada e, observa-se que

não estão presentes somente nas sementes mas também nas camadas celulares

periféricas das frutas e dos órgãos florais. Esta localização periférica está

relacionada com a função de proteção dos órgãos contra os ataques microbianos

(Thevissen et al., 2003a).

Estudos de imunomarcação revelaram que defensinas estavam localizadas

na parede celular, nos espaços extracelulares do cotilédone e no tegumento deste

órgão. Essa localização seria adequada a um componente do sistema de defesa que

estaria presente nas regiões onde ocorrem os primeiros contatos entre fungos e a

semente e com a velocidade necessária para que esta proteína fosse exsudada. Isto

sugere que estes peptídeos possam contribuir para o controle de doenças fúngicas

do solo (Terras et al., 1995). Algumas defensinas são sistemicamente induzidas sob

infecção fúngica ou ferimentos de tecidos vegetativos em diferentes espécies de

plantas, como por exemplo, ervilha (P. sativum), batata (Solanum tuberosum),

rabanete (R. sativum), Arabidopsis thaliana entre outras (Thevissen et al., 2003a).

Confirmando definitivamente a participação das defensinas na defesa de

plantas, Terras et al. (1995) introduziram o gene que codifica a defensina de R.

sativum, Rs-AFP2, em plantas de tabaco (Nicotiana tabacum). Por comparação do

número e da área das lesões causadas pelo fungo Alternaria longipes, verificou-se

que nas plantas transformadas, as áreas de lesão foram de sete a oito vezes

menores que nas plantas controles. Este estudo, além de confirmar a participação

das defensinas na defesa de plantas, forneceu indícios do possível potencial

biotecnológico destas moléculas.

1.3.3. Atividade antimicrobiana das defensinas de planta

A atividade antimicrobiana das defensinas de planta é principalmente

observada contra fungos. Diversas espécies de fungos têm o crescimento inibido e

entre eles estão vários patógenos de plantas (Tabela 1) (Terras et al., 1992; Terras

et al., 1993; Osborn et al., 1995). A concentração inibitória varia muito e é

dependente do fungo testado; por exemplo, Fusarium culmorum é inibido pela

defensina de castanheiro-da-Índia (Aesculus hippocastanum), Ah-AMP1, com 12

µg.mL-1 (IC50) e por RS AFP2 com 1,5 µg.mL-1 (IC50) (Tabela 1). A atividade inibitória

contra bactérias é bem menos pronunciada e é observada de um modo geral apenas

contra bactérias Gram-positivas (Carvalho e Gomes, 2009). No entanto, alguns

autores têm demonstrado a atividade das defensinas de plantas sobre bactérias

Gram- negativas, sendo descrito por Terras et al. (1993). Mais recentemente, Franco

et al. (2006) isolaram a partir de sementes de feijão (V. unguiculata) a Cp-tionina II,

uma defensina (γ-tionina) que possui atividade contra bactérias Gram-positivas e

negativas.

Estudos também foram realizados mostrando a atividade antimicrobiana de

uma defensina isolada de fumo de jardim (N. alata), denominada NaD1, sobre o

crescimento de fungos filamentosos como Fusarium oxysporum, Thielaviopsis

basicola, Verticillium dahliae, Leptosphaeria maculans e Aspergillus nidulans. Na

concentração de 1 µM de NaD1, foi observada a inibição de 50% do crescimento

dos fungos F. oxysporum e L. maculans e 65% dos fungos V. dahliae, T. basicola e

A. nidulans. Já na concentração de 5 µM de NaD1, o crescimento de todos os

fungos filamentosos testados, apresentou mais do que 90% de inibição (Van der

Weerden et al., 2008). Foi demonstrado também que defensina isolada de sementes

de alfafa (Medicago sativa), denominada alfAFP, possui uma forte atividade contra o

patógeno fúngico de grande importância agronômica V. dahliae. Esta defensina,

alfAFP, foi capaz de inibir o crescimento de esporos pré-germinados em 50% numa

concentração de 5 µg.mL-1 e 100% para 15 µg.mL-1. Além deste fungo, esta também

foi capaz de inibir outros patógenos fúngicos como Alternaria solani e F. culmorum

(Gao et al., 2000).

Em 2001, Carvalho et al. relataram a presença de uma defensina em

sementes de feijão-de-corda que, atuando em sinergismo com uma LTP, inibia o

crescimento de fitopatógenos fúngicos de importância econômica.

Mais recentemente, nosso grupo de pesquisa mostrou que uma defensina

isolada de sementes de Phaseolus vulgaris, inibiu fortemente o crescimento das

leveduras C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, Pichia membranifaciens,

Kluyveromyces marxiannus e Saccharomyces cerevisiae. PvD1 também apresentou

uma atividade inibitória contra o crescimento de fungos fitopatogênicos como

Fusarium solani, F. laterithium e F. oxysporum.

Tabela 1. Atividade antifúngica de defensinas contra fungos, leveduras, oomicetos e

bactérias. Os valores são mostrados em concentrações expressas em µg.mL-1 necessárias

para se obter 50% da inibição do crescimento do fungo (IC50). (-), atividade não determinada;

sa, atividade inibitória acima de 500 µg.mL-1; >*1, atividade acima de 100 µg.mL-1; >*2,

atividade acima de 200 µg.mL-1; Ah, Aesculus hippocastanum; At, Arabidopsis thaliana; Bn,

Brassica napus; Br, Brassica rapa; Ct, Clitorea ternatea; Dm, Dahlia merckii; Hs, Heuchera

sanguinea; Rs, Raphanus sativus; +, dados obtidos de Terras et al. (1992); #, de Terras et al.

(1993); *, de Osborn et al. (1995). Fonte: Adaptado de Carvalho, 2005.

DEFENSINAS µg.mL-1 (IC50)

Fungos Ah1 Ct1 Dm1 Dm2 Hs1 Rs1 Rs2 Br1 Br2 At1 Bn1 Bn2 Botrytis cinerea 25* 20* 12* 10* 6* 8# 10* 1,5# >*1# 3,9# 2# 2# Cladosporium sphaerospermum 0,5* 6* 3* 3* 1* - 3* - - - - - Fusarium culmorum 12* 10* 5* 3* 1* 5# 1,5* 1,2# 38# 3# 2,8# 2,1# Leptosphaeria maculans 0,5* 6* 1,5* 1* 25* - 12* - - - - - Penicillium digitatum 6

* 20* 2* 2* 1* - 1,5* - - - - - Trichoderma viride >*1 >*1* >*1* >*1* 15* - 30* - - - - - Septoria tritici 0,5

* 2

* 1

* 1

* 0,5

* - 1,5

* - - - - -

Verticilium albo-atrum 6* 2* 4* 2* 12* - 12* - - - - -

Alternaria brassicola - - - - - 15# 2# 3# 75# 10# 0,6# 1,2#

Fusarium oxysporum lycorpesici - - - - - 30# 2# 1,8# 42# 3# 1,3# 1,5#

Pericularia oryzae - - - - - 0,3# 0,4# 0,25# 3# 0,25# 0,35# 0,25#

Verticilium dahlae - - - - - 5# 1,5# 0,8# 15# 1,5# 1,2# 1# Phythophtora infestans - - - - - 3+ 25+ - - - - - Saccharomyces cerevisiae - - - - - sa# sa# sa# sa# sa# sa# sa#

Bactérias Gram + Bacilus megaterium - - - - - sa# - sa # 52# sa# Sarcina lutea - - - - - sa# - sa# sa# sa# Bacillus subtilis 100* 15* 150* - >*2# - >*2# - - - - Staphylococcus aureus sa# sa# sa# - >*2# - >*2# - - - - Microcous luteus sa# sa# sa# - >*2# - >*2# - - - - Streptococcus faaecalis sa

# sa# sa# - >*2# - >*2# - - - Bactérias Gram -

Agrobacterium tumefaciens - - - - - sa# - sa # sa# sa# Alcalignes eutrophus - - - - - sa

# - sa# sa

# sa

#

Azospirillum brasilenses - - - - - sa # - sa# sa# sa# Escherichia coli sa# sa# sa# - >*2# sa# - sa

# sa

# sa

#

Erwinia carotovora - - - - - sa# - sa# sa# sa# Pseudomonas solanacearum - - - - - - sa

# sa# sa# Proteus vulgaris sa# sa# sa# - sa# - sa# - - -

MICRORGANISMOS

1.3.4. Mecanismos de ação das defensinas de plantas

Diferentes estudos têm sido feitos no sentido de se desvendar o mecanismo de

ação das defensinas de plantas, porém este ainda não foi totalmente elucidado. Em

relação ao seu modo de ação, foi mostrado que a defensina 1 de D. merckii, Dm-

AMP1, e Rs-AFP2 induzem uma variedade de rápidas respostas na membrana fúngica

como alterações na permeabilização da membrana plasmática resultando na entrada

de Ca+2 e no efluxo de K+ e mudanças no potencial de membrana. Estes resultados

sugerem a interação das defensinas de plantas com a membrana fúngica (Thevissen

et al., 1996; Thevissen et al., 1999; Thevissen et al., 2003b). A membrana plasmática

dos fungos apresenta fosfoglicerolipídeos principalmente no seu lado interno e esteróis

e esfingolipídeos no lado externo. Tem sido mostrado que os esfingolipídeos e os

esteróis são enriquecidos em domínios específicos, os chamados “rafts lipídicos”. A

interação de Dm-AMP1 com estes “rafts” resultam na ação dessa defensina, ligada a

estes componentes de membrana (Schneiter et al., 1999).

Thevissen et al. (2004) estudando mais especificamente os sítios de ligação

das defensinas de plantas Dm-AMP1 e Rs-AFP2 na membrana de fungos,

identificaram e caracterizaram certos grupos de esfingolipídeos. Eles descobriram

que a sensibilidade antifúngica a Dm-AMP1 está relacionada ao nível de

manosildiinositolfosforilceramida na membrana da levedura, mostrando o papel do

complexo de esfingolipídeos/defensina na atividade antifúngica de Dm-AMP1

(Thevissen et al., 2004). Assim, sugere-se que as defensinas de plantas têm, além

de um receptor, um sítio específico de interação com a membrana.

Estudos semelhantes também foram realizados utilizando a defensina Rs-

AFP2. Em 2003a, Thevissen et al. mostraram que Rs-AFP2 interage com

glicosilceramidas presentes na membrana fúngica e que esta defensina não é capaz

de se ligar às glicosilceramidas presentes nas células de humanos e soja. Segundo

estes autores, isto acontece devido ao fato da ceramida encontrada nestas células

serem estruturalmente diferentes. Os dados acima relatados nos dão indícios de que

as defensinas de plantas podem atuar sobre microrganismos também de uma

maneira específica. Além da estrutura dos lipídeos que constituem a membrana, a

composição lipídica da mesma parece determinar a susceptibilidade e/ou resistência

às defensinas de plantas. Ferket et al. (2003) demonstraram que mutantes do fungo

Neurospora crassa com maiores quantidades de esteril-glicosil (ergosterol-β-D-

glicopiranosideo) em sua membrana eram resistente às defensinas Rs-AFP2, Dm-

AMP1 e Hs-AFP1 (defensina de H. sanguinea). Adicionalmente, Thevissen et al.

(2007) mostraram que as defensinas Hs-AFP1 e Rs-AFP2 eram capazes de inibir o

crescimento de Candida albicans e C. krusei, mas não de C. glabrata e atribuem

estes dados ao fato de que C. glabrata não sintetiza glicosilceramidas (possível

receptor para Rs-AFP2). Da mesma forma, Medeiros et al. (2009) mostraram que

cepas de C. albicans mutantes (∆GCS1), que também eram incapazes de sintetizar

glicosilceramidas, eram mais resistentes à Psd1.

Recentemente, Aerts et al. (2007) demonstraram que Rs-AFP2 induz a

produção endógena de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C.

albicans e que tanto esta produção de ROS quanto a atividade antifúngica

desaparece na presença do antioxidante ácido ascórbico, o que sugere uma ligação

causal entre a atividade antifúngica de Rs-AFP2 e a produção de ROS por ela

mediada. Estes autores sugerem ainda que, a permeabilização da membrana é

consequência de uma sinalização intracelular gerada pela ligação de Rs-AFP2 com

as glicosilceramidas da membrana e não simplesmente a ação direta deste peptídeo

na membrana através de sua interação com este esfingolipídeo.

Até agora, não está claro se as defensinas de plantas acima citadas são

internalizadas pelas células fúngicas através de sua interação com os

esfingolipídeos de membrana, ou se elas se mantêm do lado de fora da célula e

modulam processos que levam a morte celular, como por exemplo, produção de

ROS e apoptose, via interação com os esfingolipídeos de membrana. Porém

recentes estudos têm investigado um novo mecanismo de ação intracelular das

defensinas, usando Psd1. Um sistema duplo híbrido foi usado para identificar

interações proteína-proteína entre Psd1 e as proteínas fúngicas. Proteínas alvo

foram analisadas dentro do cDNA do fungo N. crassa. Um clone apresentou

sequência similar à da ciclina F, que é uma proteína que está envolvida no ciclo

celular. Análises por microscopia de fluorescência de Psd1 conjugado com

Isotiocianato fluoresceína (FITC) e do coramento do fungo com 4,6 diamidino 2

fenilindol (DAPI) mostraram a colocalização, in vivo, do peptídeo de planta Psd1 no

núcleo. Estes resultados sugerem que o mecanismo de ação da defensina de planta

Psd1, pode envolver também alvos nucleares (Lobo et al., 2007).

1.4. Leveduras

As leveduras são fungos que se diferenciam por apresentarem

predominantemente sob a forma unicelular, se reproduzem comumente por

brotamento e não possuem hifas ascogênicas e ascocarpos. Algumas podem ser

encontradas no solo, água, esgoto e até no trato digestivo de mamíferos

(Alexopoulos et al., 1996). Sua parede é composta predominantemente por

polissacarídeos, mas especificamente mananos, β-1,3 e β-1,6-glucanos e

quantidades menores de quitina, sendo esta encontrada principalmente nas

cicatrizes do broto (Baladrón et al., 2002). Dentre os eucariotos, as leveduras foram

os primeiros organismos a terem seu mapa genético completamente seqüenciado

(Goffeau et al., 1996).

Diversas espécies de leveduras, como por exemplo, as pertencentes ao

gênero Candida, podem causar severas infecções sistêmicas em pacientes

imunocomprometidos, incluindo aqueles que são submetidos à quimioterapia no

tratamento de câncer, em pessoas diabéticas e em crianças prematuras (Isola et al.,

2009). Além disso, podem também provocar infecções localizadas ou disseminadas

como candidíase, meningite, infecções no sangue, entre outras (Alexopoulos et al.,

1996). Algumas leveduras são consideradas patógenos facultativos como, por

exemplo, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata (Kwon-Chung e Bennett, 1992).

Quanto à forma destas leveduras podemos destacar as várias espécies

patogênicas dimórficas existentes. Estas possuem uma capacidade reversível de

transição entre as formas leveduriforme e filamentosa, uma importante característica

que está diretamente relacionada à virulência destas leveduras durante o processo

de invasão do hospedeiro (Gow et al., 2002).

1.5. Fungos filamentosos

Os fungos filamentosos são organismos eucarióticos, heterotróficos

possuindo uma parede celular predominantemente constituída de quitina e glucanos,

os quais encontram-se embebidos numa matriz de polissacarídeos e glicoproteínas.

São organismos multinucleares possuindo como elemento constituinte básico a hifa,

que pode ser septada ou não septada e é a partir da hifa que serão formados os

esporos, para que haja a propagação das espécies (Alexopoulos et al., 1996).

Alguns fungos filamentosos podem ser saprofíticos obtendo sua nutrição por

absorção de nutrientes de organismos mortos, atuando como importantes

decompositores, além do grupo dos fitopatogênicos que são redutores de enzimas

que atacam polímeros das paredes de plantas (Agrios, 2005).

Os fungos filamentosos são importantes agentes fitopatogênicos, podendo ser

os principais causadores de doenças de plantas, agindo como parasitas obrigatórios

ou facultativos (Gurgel et al., 2005)

Na tentativa de colonizar as plantas, os fungos desenvolveram diferentes

mecanismos para invadir o tecido, aperfeiçoar o crescimento e se propagar. Alguns

microrganismos oportunistas precisam de alguma abertura natural ou ferimento para

que ocorra o processo de infecção e colonização de plantas, no entanto os fungos

patogênicos possuem mecanismos e estruturas capazes de romper as células da

planta e assim penetram as suas estruturas externas como, por exemplo, a cutícula

(Agrios, 2005).

1.6. Feijão Comum (Phaseolus vulgaris)

O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) foi originalmente cultivado no Novo

Mundo, mas é agora cultivado extensivamente em todas as maiores áreas

continentais (Graham et al., 1997). É um componente principal na dieta, e

consequentemente, a fonte de proteína de mais de 300 milhões de pessoas na

América Latina e África Ocidental e do Sul (Kaschuk et al., 2005).

O feijão comum é membro da família Leguminosae, tribo Phaseoleae,

subfamília Papilionoideae (Debouck et al., 1991; Graham et al., 1997). Existem cerca

de 55 espécies conhecidas do gênero Phaseolus, porém as quatro espécies mais

cultivadas são: P. vulgaris L., P. coccineus L., P. lunatus L. e P. polyanthus. O feijão

comum (P. vulgaris L.) é o mais importante, por ser a espécie cultivada mais antiga e

mais utilizada nos cinco continentes (Aidar et al., 2003).

Este é um dos principais componentes da dieta alimentar brasileira,

constituindo uma das mais importantes fontes de proteína. Além do seu conteúdo

protéico, o elevado teor de ferro e fibra alimentar, com seus reconhecidos efeitos

hipocolesterolêmico e hipoglicêmico, aliado às vitaminas, especialmente do

complexo B, e aos carboidratos, tornam o seu consumo altamente vantajoso como

alimento funcional (Aidar et al., 2003). É também rico em vitaminas, carboidratos e

minerais. O consumo das sementes secas tem reduzido o risco de diabetes,

obesidade (Geil et al., 1994), doenças do coração e câncer de cólon (Anderson et

al., 1984).

O feijoeiro comum é hospedeiro de inúmeras doenças causadas por vírus,

bactérias, fungos e nematóides. Entre as principais doenças fúngicas, encontram-se

a antracnose, a mancha-angular, a ferrugem, o oídio e a mancha-de-alternária, além

de outra recentemente identificada nessa cultura e denominada de sarna. Todas são

determinadas como doenças da parte aérea do feijoeiro comum (Sartorato et al.,

2006). Já entre as doenças do solo, encontram-se o mofo-branco, a mela, a

podridão-radicular-de-rizoctonia, podridão-radicular-seca, a murcha-de-fusário e a

podridão-cinzenta-do-caule (Graham, 1997; Sartorato et al., 2006). De um modo

geral, essas doenças podem ser disseminadas à longa distância pelas sementes

infectadas e por correntes aéreas. À curta distância, essas doenças são

disseminadas pelas sementes infectadas, vento, chuvas, insetos, animais, partículas

de solo aderidas aos implementos agrícolas, água de irrigação e pelo movimento do

homem (Sartorato et al., 2006).

Ainda não se conhecem os mecanismos de resistência de plantas a várias

doenças fúngicas. O esclarecimento desses mecanismos é uma etapa fundamental

para o desenvolvimento de métodos de controle adequados, bem como para a

compreensão da interação entre patógeno e hospedeiro

2. OBJETIVOS

2.1 – Objetivo geral

Este trabalho teve como objetivo geral estudar o mecanismo de ação e a

atividade antifúngica da defensina PvD1 isolada a partir de sementes de feijão

comum (Phaseolus vulgaris – cultivar Pérola).

2.2 – Objetivos específicos

1- Isolar em grande quantidade a defensina PvD1 de sementes de feijão

comum;

2- Estabelecer uma metodologia para a produção de anticorpos policlonais

contra a defensina isolada;

3- Estudar o efeito da defensina isolada PvD1 sobre a inibição do crescimento de

fungos filamentosos em meio líquido;

4- Analisar o efeito da defensina PvD1 isolada de sementes de feijão comum sobre

a permeabilização de membranas de fungos filamentosos e leveduras;

5- Analisar o efeito da defensina PvD1 sobre a inibição da acidificação do meio

estimulado por glicose, em células de leveduras;

6- Analisar o efeito da defensina isolada PvD1 sobre a indução da produção

endógena de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C.

albicans.

3. MATERIAIS

3.1 - Material biológico

3.1.1 - Sementes

Sementes de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) cultivar Pérola foram cedidas

pela Profa. Rosana Rodrigues do Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal,

do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, da Universidade Estadual do

Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.

3.1.2 - Microrganismos

As espécies de leveduras Candida parapsilosis (CE002), Pichia

membranifaciens (CE015), Candida tropicalis (CE017), Candida albicans (CE022),

Kluyveromyces marxiannus (CE025) e Saccharomyces cerevisiae (1038) foram

cedidas pela Profª. Vânia Maria Maciel de Melo do Laboratório de Microbiologia da

Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, Ceará, Brasil e os fungos filamentosos

Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium laterithium foram cultivados e

conservados juntamente com as cepas de leveduras no Laboratório de Fisiologia e

Bioquímica de Microrganismos, do Centro de Biociências e Biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, Campos dos

Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil.

3.1.3 – Coelho

Coelhos da linhagem Nova Zelândia foram adquiridos comercialmente e

mantidos em biotério na UENF.

3.2 – Reagentes e outros materiais

- Reagentes para extração de proteínas de sementes

NaH2PO4, Na2HPO4, KCl, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e (NH4)2SO4

foram obtidos da Merck S/A e Sigma Co, St Louis, U.S.A.

- Proteínas

Albumina sérica bovina (BSA) foi obtida da Sigma Co, St Louis, U.S.A.

- Materiais e reagentes para cromatografias

A resina de DEAE-Sepharose e a coluna C2C18 foram adquiridas da GE

Healthcare e Shimadzu Co., respectivamente.

O Tris-hidroximetil-aminometano (Tris) e o NaCl utilizados foram obtidos da

Sigma Co, St Louis, U.S.A. e para C2/18 foram utilizados ácido trifluoroacético

(TFA) obtidos da Sigma Co, St Louis, U. S. A. e acetonitrila (ACN) obtida da Merck

S/A.

- Material para diálise

Membranas de celulose que retém moléculas de massa molecular acima de

1.000 Da foram adquiridas da Sigma Co, St Louis, U.S.A.

- Materiais para eletroforese

Acrilamida, N,N’ metileno bisacrilamida (bisacrilamida), dodecil sulfato de sódio

(SDS), β-mercaptoetanol, azul de bromofenol, persulfato de amônio, Tris-base, N,

N, N’ ,N’ -tetrametiletilenodiamina (TEMED), tricina, glicerol e marcadores de peso

molecular foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A. Foram utilizados os

seguintes marcadores de massa molecular: mioglobina (16.950 Da), mioglobina I +

II (14.400 Da), mioglobina I + III (10.600 Da), mioglobina I (8.160 Da), mioglobina II

(6.200 Da), glucagon (3.400 Da) e mioglobina III (2.500 Da).

- Materiais para eletrotransferência e Western Blotting

Anticorpos anti-IgG de coelho conjugado com peroxidade, diaminobenzidina

(DAB) foram adquiridos da Sigma Co, St Louis, U.S.A e membranas de

nitrocelulose foram adquiridas da MFS (Micro Filtration System).

- Reagentes para a purificação de IgG

Acetato de sódio, ácido caprílico e (NH4)2SO4 foram obtidos da Merck S/A e

Sigma Co, St Louis, U.S.A.

- Reagentes para quantificação de proteínas

O “Comassie brilliant blue G” foi obtido da Sigma Co, St Louis, U.S.A. O ácido

orto-fosfórico e o etanol foram obtidos da Merck S/A indústrias químicas. O ácido

bicinconínico foi adquirido da Sigma Co, St Louis, U.S.A.

- Meios de cultura

Caldo Sabouraud e Agar Sabouraud foram adquiridos da Merck S/A Indústrias

Químicas.

- Reagentes usados para ensaios antifúngicos e acidificação

Glicose, NaH2PO4 e NaCl foram adquiridos da Sigma Co, St. Louis, U. S. A. e da

Merck S/A indústrias químicas.

- Corante usado para ensaios de permeabilização de membranas de fungos

filamentosos e leveduras

SYTOX Green foi adquirido da Molecular Probes Invitrogen

- Corante usado para ensaio de produção de ROS em células de levedura

2’ 7’- Diclorofluoresceína Diacetato foi adquirido da Calbiochem

- Outros reagentes

Todos os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e adquiridos

comercialmente.

3.3 - INSTRUMENTAL

EQUIPAMENTOS MARCA MODELO

Autoclave

Balança

Balança

Banho Maria

Bomba Peristáltica

Coletor de Frações

Capela de Fluxo laminar vertical com

lâmpada germicida

Célula de transferência

Centrífuga

Environ Shaker

Estufa

Espectrofotômetro

HPLC

Leitor de ELISA

Liofilizador

Microcentrífuga não refrigerada

Microscópio óptico

Microscópio óptico

pHmetro

Placa agitadora/aquecedora

Sistema para eletroforese

Fabre Primar

Sartorius

Sartorius

FANEM

Pharmacia

Pharmacia

VECO

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103.02

2100

110S

102

P1

RediFrac

VLFS 12

Trans-blot SD, Semi-dry

Blotting System

Himac CR 21

3527

Q316.14

UV VIS 1230

Prominence

MR 500

Freeze dry system/freezon 4.5

5415C

JENAMED2

Axioplan

400-A

PC 220

150A - gel Eletrophoresis cell

4. MÉTODOS

4.1 - Extração e purificação da defensina PvD1 de Phaseolus vulgaris

4.1.1 - Extração protéica das sementes

As sementes de feijão comum foram descascadas e trituradas com um

processador de alimentos até a formação de uma farinha bem fina. A farinha obtida

foi extraída em tampão fosfato (Na2HPO4 10 mM, NaH2PO4 15 mM, KCl 100 mM,

EDTA 1,5%) pH 5,4 na proporção de 1:5 (farinha:tampão de extração) sob agitação

constante por 2 h a 4 ºC, segundo a metodologia desenvolvida por Games et al.

(2008) (Esquema 1). Após homogeneização, o extrato bruto foi submetido à

centrifugação a 15.000 x g por 20 min a 4 ºC e o sobrenadante resultante foi

submetido à precipitação com sulfato de amônio a 70% de saturação e deixado a 4

ºC por 16 h. O precipitado resultante, obtido após nova centrifugação a 15.000 x g

por 20 min a 4 ºC, foi ressuspenso em 10 mL de água destilada e aquecido a 80 ºC

por 15 min e em seguida centrifugado a 10.000 x g por 8 min a 4 ºC. O precipitado

resultante desta última centrifugação foi descartado e o sobrenadante dialisado

durante três dias, contra água destilada e em seguida liofilizado para posterior

purificação dos peptídeos. Esta amostra, chamada ao final do processo de fração 0-

70 (F/0-70), foi armazenada a -20 ºC e usada posteriormente para a purificação dos

peptídeos.

Homogeneizado

- 2 h a 4 °C sob agitação em tampão fosfato pH 5,4

- centrifugação 15.000 x g – 20 min

resíduo sobrenadante

- adicionado sulfato de amônio

a 70% de saturação

- 16 h a 4 ºC

- centrifugação (15.000 x g – 20 min)

precipitado sobrenadante

(ressuspendido em água destilada)

aquecimento a 80 ºC por 15 min

- centrifugação (10.000 x g – 8 min)

precipitado sobrenadante

diálise e liofilização

(F/0-70)

Esquema 1 – Fracionamento com sulfato de amônio do homogeneizado obtido a partir da

extração da farinha das sementes de feijão comum (Games et al., 2008).

4.1.2- Cromatografia de troca iônica (DEAE–Sepharose)

Para a purificação da PvD1 foi inicialmente usada uma coluna de troca iônica,

DEAE-Sepharose, com 100 mL de resina. Esta foi montada sob a ação da gravidade

e depois da resina estar devidamente empacotada e foi lavada com 350 mL de

água. Em seguida passado aproximadamente 250 mL de hidróxido de sódio 0,1 M,

novamente foi passado 350 mL água e depois 250 mL de ácido clorídrico 0,1 M.

Posteriormente com a resina devidamente ativada foi passado o tampão de

equilíbrio, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, deixando a coluna preparada para o uso. A

amostra aplicada na coluna foi preparada da seguinte forma: 50 mg da F/0-70 foram

pesados e dissolvidos em 5 mL de tampão de equilíbrio e depois centrifugado a

16.000 x g por 3 min à temperatura ambiente e o sobrenadante aplicado sobre a

resina. A amostra foi eluída primeiramente no tampão de equilíbrio e em seguida em

um tampão Tris-HCl adicionado de NaCl na concentração de 1 M. Foram coletados

frações de 3 mL em 50 tubos em um fluxo de 60 mL.h-1. As absorbâncias das

frações foram lidas em um espectrofotômetro a 280 nm. O pico D1 obtido nesta

cromatografia foi submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C2/C18 em

HPLC (Games et al., 2008).

4.1.3 - Cromatografia de fase reversa em coluna C2C18 em HLPC

Uma coluna de fase reversa C2C18 equilibrada com 0,1% de ácido

trifluoroacético (TFA) foi empregada sequencialmente no processo de isolamento da

defensina de sementes de feijão comum. O pico D1 não retido, oriundo da

cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Sepharose, foi solubilizado em

TFA 0,1% e 500 µL desta mistura foram injetados na coluna de fase reversa. A

cromatografia foi desenvolvida utilizando-se um fluxo de 0,5 mL.min-1, a temperatura

de 32 oC em sistema de HPLC. Para a eluição das proteínas da coluna foi utilizado

um gradiente de acetonitrila (ACN) de 0 a 80%. Inicialmente (10 primeiros minutos) a

coluna foi lavada com TFA 0,1% em água ultrapura (solvente A), e em seguida um

gradiente foi sendo formado através da mistura do solvente A e 80% de acetonitrila

em TFA 0,1 % (solvente B) por cerca de 48 min. Após esse período a coluna foi

lavada com 100% do solvente B totalizando 60 min. A eluição da coluna foi

acompanhada por um detector de arranjo de diodo (DAD), sendo as absorbâncias

lidas a 220 nm (Games et al., 2008).

4.2 - Quantificação de proteínas

As determinações quantitativas de proteínas foram feitas pelo método de

Bradford (1976) sendo a BSA utilizada como padrão.

4.3 - Eletroforese em gel de Tricina na presença de SDS

A eletroforese em gel de tricina foi feita segundo metodologia de Schägger e

Von Jagow (1987). Foram usadas placas de vidro de 7 x 10 cm e 8 x 10 cm e

espaçadores de 0,5 mm. O gel de separação foi preparado numa concentração de

16,4% de acrilamida/bis-acrilamida e o gel de concentração numa concentração de

3,9%.

A F/0-70 e as frações protéicas obtidas na cromatografia de troca iônica,

DEAE-Sepharose, foram concentradas por liofilização e, em seguida, pesadas e

ressuspensas em tampão de amostra (Tris 0,125 M, SDS 2,5%, azul de bromofenol

0,25%, β-mercaptoetanol 5% e sacarose 15%). Estas foram aquecidas por 5 min a

100 ºC e centrifugadas a 16.000 x g por 2 min. Após este tratamento 20 µL das

amostras foram aplicadas no gel de concentração. A corrida foi feita a uma voltagem

constante de 20 V por um período de aproximadamente 16 h.

4.3.1 - Coramento e descoramento do gel

Após o término da corrida, o gel foi cuidadosamente retirado das placas e

colocado na solução corante (Comassie Blue R 0,05%, ácido acético 70% e metanol

40%) por duas horas e após esse período, o gel foi transferido para uma solução

descorante (metanol 40% e ácido acético 7%) e mantido até a visualização das

bandas de proteína.

4.4 - Produção de anticorpo e Western blotting

4.4.1 – Obtenção do soro pré-imune e imunização

Primeiramente, foi obtido soro pré-imune a partir da sangria do coelho antes

da inoculação do peptídeo de interesse. Esta sangria consiste de um corte na

extremidade da orelha do animal com o auxílio de uma lâmina. Foram, então

coletados 4 mL de sangue em um béquer, deixados por 30 min em temperatura

ambiente, e posteriormente, por aproximadamente 16 h a 4 ºC para coagular. Após

formação do coágulo, o soro foi recolhido e submetido à centrifugação a 255 x g por

15 min a 4 ºC. Este procedimento permitiu a clarificação do soro deixando-o livre de

hemácias e este foi, então, armazenado a -20 ºC até o uso.

À defensina isolada PvD1 foi adicionado o adjuvante de Freud para

emulsificação na proporção de 2:1 e, posteriormente, aplicado no coelho. A primeira

imunização foi intramuscular e subcutânea (1 mL em cada local de inoculação) e

após um período de 30 dias foi feita a segunda imunização apenas subcutânea (500

µL em diferentes locais no dorso do coelho). Após sete dias foi feita uma nova

inoculação repetida no dorso. Quatro dias depois, foi feita a primeira sangria e, em

seguida, foi feita mais uma imunização subcutânea. E assim, o processo foi feito por

mais duas semanas com mais duas sangrias e duas aplicações subcutâneas.

A obtenção e estocagem do soro contendo o anticorpo de interesse foram

feitas nas mesmas condições que para o soro pré-imune (Steinbuch e Audran et al.,

1969).

4.4.2 - Purificação de IgG do soro

O soro obtido como descrito no item acima foi centrifugado a 790 x g por 10

min. O sobrenadante do soro foi então diluído 1:3 em tampão acetato de sódio 60

mM, pH 4,0, sob baixa agitação, em temperatura ambiente. Após esta diluição, foi

adicionado ácido caprílico 100% numa proporção de 0,4 mL para cada 10 mL de

volume original de soro. O ácido caprílico foi adicionado gota a gota à mistura, sob

agitação e permanecendo assim por mais 30 min. Em seguida, essa mistura foi

centrifugada a 5.000 x g por 10 min, em temperatura ambiente. O sobrenadante

obtido foi colhido e o pH ajustado para pH 7,2, com adição de Tris 3 M. Neste

momento, a etapa de centrifugação foi repetida, o sobrenadante resultante foi

concentrado com adição de sal de sulfato de amônio até 45% de saturação

(peso/volume), sob agitação, a temperatura ambiente, permanecendo em agitação

por mais 2 h. O material foi centrifugado a 5.000 x g, durante 15 min, em

temperatura entre 4 e 8 ºC. O precipitado foi ressuspendido em salina (NaCl 0,9%) e

dialisado contra salina, com duas trocas por dia, durante 3 dias. A concentração da

IgG purificada foi determinada, através de uma curva utilizando ácido bicinconínico,

de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante do reagente (Steinbuch e

Audran et al., 1969).

4.4.3 - Eletrotransferência de proteínas para Western Blotting

Após o término da eletroforese, o gel foi retirado das placas e imerso em

tampão de transferência (glicina 182 mM, Tris 25 mM e metanol 20%) por 20 min.

Uma membrana de nitrocelulose (Hybond ECL, Amersham Biosciences), cortada

nas mesmas dimensões do gel, foi também imersa no tampão de transferência por

20 min. Após esse período foi montado, sobre uma célula de transferência, um

“sanduíche” com quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, previamente

embebidas em tampão de transferência. Sobre essa camada de papel foi colocada a

membrana e acima da membrana o gel, sendo então o “sanduíche” finalizado com

mais uma camada de quatro folhas de papel de filtro Whatman 3 MM, já embebidas

no tampão de transferência. Durante a montagem desse “sanduíche” as bolhas de ar

foram evitadas e/ou removidas entre as camadas, para não interferirem com a

transferência das proteínas. Após esse procedimento, a célula de transferência foi

fechada e foi aplicada uma corrente constante de 1mA/cm2 por 2 h no sentido gel-

membrana. Após a transferência o “sanduíche” foi cuidadosamente desfeito e a

membrana submetida à coloração com Ponceau S (0,1%) (Amersham Biosciences)

para determinação do sucesso da transferência (Towbin et al., 1979).

4.4.4 - Imunodetecção de Proteínas

Após coloração com Ponceau S 0,1%, para a marcação com os anticorpos,

inicialmente a membrana foi bloqueada com tampão bloqueador (tampão fosfato

salino (PBS) contendo 5% de leite em pó) e foi deixada por 16 h a 4 ºC. Em seguida,

a membrana foi incubada com o anticorpo primário contra a defensina isolada de

sementes de P. vulgaris (1:500), diluído em tampão (PBS contendo 5% de leite em

pó e 0,1% de Tween 20) por 1 h, sob agitação e em temperatura ambiente. Após

esta incubação com o anticorpo primário, foram feitas 5 lavagens de 5 min cada,

com tampão de lavagem (PBS contendo 0,1% de Tween 20). Ao término desta

lavagem a membrana foi incubada com o anticorpo secundário (1:2.000), conjugado

com peroxidase, diluído em PBS contendo 5% de leite em pó e 0,1% de Tween 20

por 1 h, sob agitação e em temperatura ambiente. Após esta incubação foram feitas

mais 5 lavagens de 5 min cada em tampão de lavagem. Ao término destas lavagens,

foi feita a revelação com diaminobenzidina (DAB) imergindo a membrana na solução

reveladora (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, DAB 1 mg.mL -1, imidazol 100 mM e peróxido

de hidrogênio 0,03%) até a visualização das bandas marcadas.

4.5 - Ensaio de inibição da germinação de esporos fúngicos em meio líquido

4.5.1 - Obtenção de esporos de fungos filamentosos

Os fungos F. oxysporum, F. solani, F. laterithium foram transferidos do

estoque e colocados para crescer em uma placa de Petri contendo ágar Sabouraud

por aproximadamente 15 dias a 30 ºC. Após esse período, 10 mL de caldo

Sabouraud foram vertidos sobre a placa contendo os fungos e os esporos foram

liberados com o auxílio de uma alça de Drigalsky. Essa suspensão foi devidamente

filtrada em gase para evitar a passagem de restos miceliais que pudessem estar em

solução juntamente com os esporos. Esses esporos foram então quantificados em

câmara de Newbauer, na presença de um microscópio óptico (Gomes et al., 1998).

4.5.2 - Análise da inibição do crescimento dos esporos fúngicos

Em placas de cultura de células (96 poços), contendo 200 µL de meio de

cultura caldo Sabouraud, foi adicionada PvD1 em concentrações de 25, 50 e 100

µg.mL-1 (D1 da DEAE) e 1 x 104 esporos.mL-1 dos fungos filamentosos F.

oxysporum, F. solani e F. laterithium. Para a observação da inibição do crescimento

dos fungos, foi determinada a densidade ótica calculada a partir de leituras em “um

leitor de ELISA” a 670 nm a cada 6 h, por um período de 60 h. Todo o ensaio foi feito

em triplicata e sob condições de assepsia em capela de fluxo laminar, segundo

metodologia adaptada de Broekaert et al. (1990).

4.6 - Avaliação do mecanismo de ação da PvD1 sobre fungos

4.6.1 - Efeitos da defensina isolada PvD1 sobre a permeabilização de membranas

de fungos filamentosos e leveduras

A permeabilização da membrana das células tratadas com PvD1 foi avaliada

através da utilização do corante fluorescente SYTOX Green, segundo metodologia

descrita por Thevissen et al. (1999) com algumas modificações. SYTOX Green é um

corante que possui alta afinidade para ácidos nucléicos e penetra em células apenas

quando sua membrana está comprometida. Imediatamente após 24 h de crescimento,

na ausência e presença de PvD1, uma alíquota das diferentes células de leveduras foi

incubada sob constante agitação por duas horas com o corante fluorescente SYTOX

Green a uma concentração final de 0,2 µM, de acordo com instruções fornecidas pelo

fabricante. Após este período, estas células foram transferidas para lâminas, cobertas

com lamínulas e analisadas por fluorescência em microscópio óptico (Zeiss; Axioplan).

As imagens foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado à câmera

“Cannon Power Shot A640”.

4.6.2 - Análise do efeito da defensina isolada PvD1 sobre a inibição da

acidificação do meio induzido por glicose por células de levedura

4.6.2.1 - Manutenção e preparo das células

Células das leveduras C. albicans e S. cerevisiae foram transferidas do ágar

inclinado (estoque) para placas de Petri contendo ágar Sabouraud, onde cresceram

por três dias a 30 °C. Após este período, 4 mL de meio de cultura líquido foram

vertidos sobre as colônias e as células ressuspensas e homogeneizadas com o

auxílio de uma pipeta. Posteriormente, 5 µL dessa suspensão celular foram

adicionados em 200 mL de meio de cultura (caldo Sabouraud) e mantidas sob

intensa agitação a 30 °C por aproximadamente 16 h. Após este período de

crescimento, o material foi centrifugado a 3.000 x g por 5 min a 4 °C. As células

precipitadas foram lavadas com água ultra pura e centrifugadas a 3.000 x g por 5

min a 4 °C, sendo este procedimento repetido três vezes, para que todo o meio de

cultura fosse retirado. Ao final das lavagens, as células precipitadas foram

ressuspensas em 3 mL de água ultra pura e utilizadas no ensaio de inibição da

acidificação do meio por células de leveduras (Gomes et al., 1998).

4.6.2.2 - Ensaio de acidificação

Células de C. albicans e S. cerevisiae (107 células.mL-1) foram pré-incubadas

em diferentes tempos (1, 2 e 4 h) em meio contendo tampão Tris-HCl 10 mM pH 6,0

na presença e na ausência da PvD1 em duas diferentes concentrações (100 e 200

µg.mL-1). Após os períodos de pré-incubação, foram adicionados 200 µL de glicose

0,5 M e em seguida foram feitas leituras do pH a cada minuto por um tempo de 30

min.

Este ensaio foi feito em triplicata e os cálculos de ∆pH foram feitos para

determinar a porcentagem de inibição obtida com o experimento. O volume final do

ensaio foi de 1 mL.

Todo o ensaio foi feito segundo metodologia adaptada de Gomes et al.

(1998).

4.6.3 - Efeitos da defensina isolada PvD1 sobre a indução da produção endógena

de espécies reativas de oxigênio (ROS) em células de C. albicans

A indução da produção endógena de ROS em células da levedura C. albicans,

tratadas com a defensina PvD1 após ensaio de inibição do crescimento, foi avaliada

através da utilização do corante fluorescente 2’,7’ diclorofluoresceína diacetato,

segundo metodologia descrita por Aerts et al. (2007) com algumas modificações.

Imediatamente após 24 h de crescimento, na ausência e presença da PvD1, uma

alíquota foi incubada sob constante agitação por 2 h com o corante fluorescente a uma

concentração final de 20 µM, de acordo com instruções fornecidas pelo fabricante.

Após este período, estas células foram transferidas para lâminas, cobertas com

lamínulas e analisadas por fluorescência em microscópio óptico (Zeiss; Axioplan). As

imagens foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado à câmera “Cannon

Power Shot A640”.

5. RESULTADOS

5.1 - Purificação da defensina

A cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sepharose da F/0-70 obtida

por extração protéica das sementes de P. vulgaris, apresentou dois diferentes picos

denominados D1, que foi eluído com o tampão de equilíbrio da coluna, e D2, que foi

eluído com o tampão de equilíbrio da coluna acrescido com 1 M de NaCl (Figura 2).

No pico D1, encontra-se presente a defensina PvD1 previamente isolada de

sementes de feijão comum como descrita por Games et al. (2008). Este pico foi

então dialisado, liofilizado e utilizado para eletroforese, ensaios de inibição de

crescimento de fungos filamentosos e ensaios de acidificação induzido por glicose

por células de leveduras.

Figura 2 – Cromatograma da F/0-70 de sementes de feijão comum obtido após

cromatografia em coluna DEAE–Sepharose. A coluna foi previamente equilibrada com

tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,0. D1 foi eluído da coluna com tampão de equilíbrio, D2 foi

eluído com tampão Tris-HCl 20 mM contendo 1 M de NaCl. O fluxo foi de 60 mL.h-1 e foram

coletadas frações de 3 mL em cada tubo, em um total de 50 tubos.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Tubos

Absorbância, 280nm

D1

NaCl 1 M

D2

Para confirmar se realmente o pico D1 continha apenas a defensina PvD1, o

pico D1 obtido na cromatografia de DEAE-Sepharose, foi submetido a uma

cromatografia de fase reversa em coluna C2C18. Esta mostrou a presença de

apenas um único pico majoritário denominado H1 (Figura 3). Este pico foi então

dialisado, liofilizado e utilizado para a produção de anticorpos policlonais contra a

defensina isolada.

Figura 3 – Cromatograma obtido após cromatografia de fase reversa em coluna C2C18 em

HPLC do pico D1 obtido após cromatografia em DEAE-Sepharose. A coluna foi equilibrada

com uma solução de TFA 0,1% e a amostra foi eluída utilizando-se um gradiente de

acetonitrila 80%-TFA 0,1% de 0 a 100%, a um fluxo de 0,5 mL.min-1. O padrão de eluição

dos peptídeos foi monitorado a 220 nm.

Gradiente de acetonitrila

100%

0%

H1

Tempo, min

5.2 - Eletroforese em gel de tricina na presença de SDS

As proteínas presentes na F/0-70 e também nos picos obtidos após

cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose e cromatografia em coluna de fase

reversa C2/C18 foram inicialmente analisados em gel de tricina, como pode ser

observado na figura 4. A F/0-70, representada na raia 2 apresenta diversas bandas

de peptídeos com diferentes massas moleculares, na raia 3 foi observada a

presença de apenas um único peptídeo (defensina PvD1 previamente isolada por

Games et al., 2008), na raia 4 foi observada a predominância de proteínas de alto

peso molecular e na raia 5 está o perfil eletroforético da defensina isolada após

cromatografia em coluna C2/C18. Foi observada a presença única da defensina de

aproximadamente 6 kDa. As amostras foram tratadas com β-mercaptoetanol.

Figura 4 – Visualização eletroforética em gel de tricina na presença de SDS da F/0-70 e dos

picos obtidos após cromatografia de troca iônica DEAE-Sepharose e cromatografia em

coluna de fase reversa C2C18. Todas as amostras foram tratadas com β-mercaptoetanol. M

- marcador de massa molecular (kDa); F – fração 0-70 obtida de sementes de feijão comum;

D1 – pico não retido obtido em DEAE-Sepharose; D2 – pico retido em DEAE-Sepharose,;

H1 – pico obtido após cromatografia em coluna C2C18 em HPLC.

kDa M F D1 D2 PvD1

16.9 14.4

10.6 8.1

6.2

M F D1 D2 H1 B

5.3 - Western Blotting

Várias estratégias e metodologias com uso de diferentes animais

(camundongo, porco-da-índia e galinha) foram utilizadas para se obter um anticorpo

que reconhecesse a PvD1. Através da metodologia descrita por Steinbuch e Audran,

1969, utilizando coelhos, foi possível obter um anticorpo que reconhecesse a PvD1.

O pico H1 obtido na cromatografia de fase reversa em coluna de HPLC foi utilizado

na imunização de coelho para a produção de anticorpos contra a defensina PvD1

isolada de sementes de P. vulgaris. Através da técnica de Western Blotting, foi

observado na figura 5, o reconhecimento da defensina isolada PvD1 pelo anticorpo

produzido, tanto no soro imune quanto na IgG purificada, enquanto que no soro pré-

imune e no soro controle não houve qualquer reação imunológica.

Figura 5 – Western Blotting do anticorpo produzido em coelhos contra a defensina PvD1

isolada de sementes de P. vulgaris. 1 – Soro imune; 2 – Soro pré-imune; 3 – IgG purificada

e 4 – Soro controle. Foi utilizada uma concentração de 1:500 com todos os soros testados.

2 1 4 3

5.4 - Análise da inibição do crescimento de esporos fúngicos em meio líquido

Na figura 6 (A-C), foi observada o efeito da defensina PvD1 isolada de

sementes de P. vulgaris sobre o crescimento dos fungos F. oxysporum, F. solani e F.

laterithium. Notou-se que a PvD1 apresentou um efeito inibitório sobre o crescimento

de todos os fungos filamentosos testados F. oxysporum, F. solani e F. laterithium

especialmente nas duas concentrações maiores utilizadas (50 e 100 µg.mL-1), sendo

que a inibição foi mais acentuada na presença de 100 µg.mL-1 da defensina PvD1

para os fungos F. oxysporum e F. solani quando comparada com as outras

concentrações utilizadas. Pode-se notar também que, utilizando concentrações

maiores que 100 µg.mL-1 da defensina PvD1 é que iremos atingir seu IC50 (tabela 2).

Figura 6 – Curva de crescimento mostrando a alteração do crescimento dos fungos

filamentosos (A) F. oxysporum, (B) F. solani e (C) F. laterithium na ausência (controle) e na

presença da defensina isolada PvD1, obtida após cromatografia em coluna de DEAE-

Sepharose. O crescimento foi observado até 60 h. (-♦-) Controle; (-■-) 25 µg.mL-1, (-▲-) 50

µg.mL-1 e (-x-) 100 µg.mL-1. Os experimentos foram realizados em triplicata.

0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

T empo (h)

B

0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

Tempo (h)

A

C

0

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60

T empo (h)

Tabela 2. Atividade antifúngica da defensina PvD1

Fungos filamentosos Valores de IC50 (µµµµg.mL-1)*

Fusarium oxysporum > 100

F. solani > 100

F. laterithium > 100

* Concentração de proteína mínima necessária para se obter 50 % de inibição do crescimento

após 60 h a 30 ºC.

Em recente trabalho publicado por Games et al. (2008), foi visto que a

defensina PvD1 inibiu significativamente o crescimento das leveduras C.

parapsilosis, P. membranifaciens, C. tropicalis, C. albicans e K. marxiannus nas

concentrações de 25, 50 e 100 µg.mL-1, enquanto que para as células da levedura S.

cerevisiae, observou-se uma acentuada redução no cres