RITA DE CÁSSIA LIMA RIBEIRO - uel.br DE... · Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) R484l Ribeiro, Rita de Cássia Lima. Leucose esporádica em bovinos com

RITA DE CÁSSIA LIMA RIBEIRO

LEUCOSE ESPORÁDICA EM BOVINOS COM DOENÇAS

NEUROLÓGICAS NO ESTADO DO PARANÁ.

Londrina

2012




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência Animal (nível mestrado)

área de concentração: Sanidade Animal da

Universidade Estadual de Londrina como requisito

para a obtenção do título de Mestre em Ciência

Animal.

Orientação: Profa. Dra. Ana Paula Frederico

Rodrigues Loureiro Bracarense

Londrina

2012

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)

R484l Ribeiro, Rita de Cássia Lima.

Leucose esporádica em bovinos com doenças neurológicas no estado do

Paraná / Rita de Cássia Lima Ribeiro. – Londrina, 2012. 52f. : il.

Orientador: Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro Bracarense.

Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Universidade Estadual de

Londrina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em

Ciência Animal, 2011.

Inclui bibliografia.

1. Leucose – Teses. 2. Linfoma bovino – Teses. 3. Sistema nervoso

Central – Teses. I. Bracarense, Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro. II.

Universidade Estadual de Londrina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de

Pós-Graduação em Ciência Animal. III. Título.

CDU 619:616.15




Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciência Animal (nível mestrado)

área de concentração: Sanidade Animal da

Universidade Estadual de Londrina como requisito

para a obtenção do título de Mestre em Ciência

Animal.

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Ana Paula Frederico Rodrigues Loureiro

Bracarense

UEL – Londrina –PR

Prof. Dr. Antonio Carlos Faria dos Reis


Prof. Dr. Kleber Moreno


Londrina, 12 de janeiro de 2012.

À Joaninha.

AGRADECIMENTOS

Professores:

Ana Paula, Giovana, Antônio Carlos, Júlio, Kleber e Karina.

Amigos:

Claudia, Raquel, Gislaine, Aline, Alessandra, Rogério, Juliana, Reginaldo,

Elisangela, Letícia, Gustavo, Priscila, Amude, Patrícia, Rebeca, Karina, Luciana, Danilo,

Laura, Rose.

Família:

Clodoaldo, Mãe, Pai, Caca, Rafael, tia Rudiane, tio Hélcio, Regina,

Genilson, Vica, Clara, Patrícia, Daine e os pequenos Maria, João e Gabi.

Aos animais:

Mingau, Leon, Che, Frida, Raissa, Lenin, Leco, Bianca, Paquita e todos que

já passaram em minha vida e que contribuíram para que eu ame esta que é a minha profissão.

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Patologia Animal e

Setor de Grandes Animais do Hospital Veterinário nos Departamentos de Medicina

Veterinária Preventiva e Clínica Veterinária do Centro de Ciências Agrárias (CCA),

Universidade Estadual de Londrina (UEL), como parte do projeto de pesquisa Diagnóstico

Diferencial das Doenças Neurológicas dos Bovinos no Estado do Paraná CNPq/MAPA/DAS

(processo 578645/2008-4).

Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos

junto à agência e órgão de fomento à pesquisa abaixo relacionado:

1 CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico.

RIBEIRO, Rita de Cássia Lima. Leucose esporádica em bovinos com doenças neurológicas

no estado do Paraná. 2012. 52 f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Universidade

Estadual de Londrina, Londrina, 2012.

RESUMO

As enfermidades do sistema nervoso em bovinos formam um grupo importante de doenças

que podem levar a perdas econômicas e problemas de saúde pública. As doenças de origem

infecciosa e tóxica são as moléstias com maior prevalência no Brasil. Outras enfermidades

como as neoplasias também tem sido diagnosticadas, embora ainda com dados escassos sobre

a prevalência no rebanho. Entre os neoplasmas de bovinos, o complexo leucose bovina é uma

enfermidade frequente e de ocorrência mundial. A maioria dos casos diagnosticados como

leucose refere-se a forma enzoótica da doença que tem como agente um retrovírus. A outra

forma da doença, denominada leucose esporádica, manifesta-se como linfoma e não está

associada a nenhum agente etiológico. Esta forma acomete animais jovens de até dois anos de

idade e possui três padrões de apresentação: juvenil, tímica e cutânea. Os objetivos deste

estudo foram identificar e caracterizar morfologicamente e imunohistologicamente bovinos

com manifestações neurológicas de leucose esporádica. Setenta e oito bovinos foram

submetidos ao exame clínico, análise de hemograma e líquor. Fragmentos de encéfalo,

medula espinhal, fígado, baço e linfonodos foram submetidos à análise histopatológica. O

exame imunoistoquímico foi utilizado para determinação do tipo de linfócito (B ou T). Quatro

animais tiveram o diagnóstico de linfoma (leucose esporádica). A idade dos animais variou

entre 2 a 29 meses. Os sinais clínicos foram tetraplegia, paraplegia paresia de membros

pélvicos e convulsões. Todos os animais apresentaram envolvimento do sistema nervoso

central caracterizado por infiltração de linfócitos atípicos ou neoformação no canal medular.

No exame histopatológico dois animais apresentaram linfoma de alto grau e dois de baixo

grau, sendo todos caracterizados fenotipicamente como linfoma de células T.

Palavras-chaves: Leucose. Linfoma bovino. Sistema nervoso central.

RIBEIRO, Rita de Cássia Lima. Bovine sporadic leukosis associated with neurologic

diseases in Paraná state. 52 f. Dissertation (Master’s degree in Animal Science) –

Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2012.

ABSTRACT

The nervous system diseases in cattle are an important group of diseases that can lead to

economic losses and public health problems. Infectious diseases are the most frequent in

Brazil, but also other diseases have been diagnosed as cancer. However, data about prevalence

in Brazilian herds are scarce. Among the neoplasms of cattle, bovine leucosis complex is a

common disease and occurs worldwide. Most of the cases diagnosed as enzootic leucosis

concerns the form related to a retrovírus. The other form of the disease is a lymphoma with no

etiologic agent known as sporadic leukosis. This form affects young animals up to two years

old and has three different patterns of presentation: juvenile, thymic and cutaneous. The

objective of this study was to characterize gross, histological and immunohistochemical

findings in cattle with neurological manifestations in sporadic leukosis. Seventy-eight animals

were subjected to clinical examination, analysis of blood count, and cerebral spinal fluid.

Fragments of the brain, spinal cord, liver, spleen and lymph nodes were submitted to

histopathological analysis. Immunohistochemical examination was used to determine the type

of lymphocyte (B or T). Four animals were diagnosed with lymphoma (sporadic leukosis).

The age of the animals ranged from 2 to 29 months. Clinical signs were tetraplegia,

paraplegia, paresia of hind limbs, and convulsions. All animals showed involvement of the

central nervous system characterized by infiltration of atypical lymphocytes or neoformation

in the spinal cord canal. The histopathological analysis of two animals showed high-grade

lymphoma and two low-grade, all characterized phenotypically as T-cell lymphoma.

Key words: Leukosis. Lymphoma bovine. Central nervous system.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Captura de imagem histológica. Massa neoplásica em canal medular HE.

Objetiva de 20x. Londrina 2011 ........................................................................ 32

Figura 2 – Captura de imagem histológica. Presença de linfócitos atípicos infiltrando

o fígado. Linfócitos grandes, com citoplasma escasso, núcleos

hipercromáticos com nucléolos proeminentes e dispostos perifericamente

(círculo). HE. Objetiva de 40x. Londrina 2011 ................................................. 32

Figura 3 – Leucose esporádica bovina juvenil. Paraplegia dos membros pélvicos.

Londrina, 2011 .................................................................................................. 33

Figura 4 – Leucose esporádica bovina. Neoformação no canal medular (setas) com

superfície homogênea, esbranquiçada e com 7cm de comprimento.

Londrina, 2011 .................................................................................................. 34

Figura 5 – Captura de imagem histológica da neoformação em canal medular,

composta por linfócitos atípicos. HE. Objetiva de 20x. Londrina, 2011 .......... 35

Figura 6 – Captura de imagem histológica da massa em canal medular.Observar a

marcação de linfócitos para o anticorpo policlonal anti-CD3. Linfoma de

células T. Objetiva de 40x. Londrina, 2011....................................................... 35

Figura 7 – Leucose bovina esporádica em bezerro. Flacidez de língua. Londrina,

2011 ................................................................................................................... 37

Figura 8 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de

linfócitos atípicos no espaço perivascular. HE. Objetiva de 20x. Londrina,

2011 ................................................................................................................... 38

Figura 9 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de

linfócitos atípicos (círculos) e figuras de mitose (setas) no espaço

perivascular no córtex frontal. HE. Objetiva de 40x. Londrina, 2011 .............. 39

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Classificação de linfomas pelo sistema Working Formulation (adaptado) ....... 17

Tabela 2 – Classificação e graduação dos linfomas de acordo com o sistema Kiel

Modificado ........................................................................................................ 18

Tabela 3 – Doenças do Sistema Nervoso Central diagnosticado em 78 casos entre

março de 2009 e abril de 2011, que fazem parte do projeto pesquisa

Diagnóstico Diferencial das Doenças Neurológicas dos Bovinos no Estado

do Paraná. Londrina, 2011 ................................................................................. 27

Tabela 4 – Resultados dos exames de hemograma e líquor de bovinos com leucose

esporádica .......................................................................................................... 40

Tabela 5 – Achados clínicos e anátomo-patológicos em bovinos com leucose

esporádica com envolvimento do sistema nervoso central. Londrina 2011 ...... 41

SUMÁRIO

1 REVISÃO DA LITERATURA: LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA .....................11

1.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA ...................................................................................... 13

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 20

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 25

2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 25

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 25

3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL........................................................................ 26

4 MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO ....................................................................... 28

4.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA COM ENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO

CENTRAL: RELATO DE CASOS ......................................................................................... 28

4.1.1 Introdução ................................................................................................................... 29

4.1.2 Material e Métodos ..................................................................................................... 29

4.1.3 Relato de Casos .......................................................................................................... 31

4.1.3.1 Caso 1 ...................................................................................................................... 31

4.1.3.2 Caso 2 ...................................................................................................................... 33

4.1.3.3 Caso 3 ...................................................................................................................... 36

4.1.3.4 Caso 4 ...................................................................................................................... 37

4.1.4 Discussão .................................................................................................................... 41

5 CONCLUSÕES ............................................................................................................... 44

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 45

ANEXOS ............................................................................................................................ 48

ANEXO A – Lista de Reagentes e Produtos ........................................................................ 49

ANEXO B – Soluções e Tampões ........................................................................................ 50

ANEXO C – Protocolo de Técnicas ..................................................................................... 51

11

1 REVISÃO DA LITERATURA: LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA

RESUMO

As enfermidades do sistema nervoso em bovinos acarretam importantes perdas econômicas e

podem representar também um problema de saúde pública. As doenças de origem infecciosa e

tóxica são as moléstias com maior prevalência no Brasil. No entanto, as neoplasias em

bovinos também contribuem com os prejuízos na cadeia produtiva. Entre os neoplasmas de

bovinos, a leucose bovina, originária do tecido linfoide, é a mais frequente, acometendo

principalmente bovinos leiteiros. A leucose bovina é classificada em enzoótica ou esporádica

de acordo com aspectos etiológicos e epidemiológicos. A maioria dos casos refere-se a forma

enzoótica que é associada à infecção por um retrovírus, afeta animais entre três a sete anos de

idade e tem apresentação multicêntrica. A transmissão do vírus é principalmente horizontal,

por meio de linfócitos infectados, sendo que 1 a 5% dos animais infectados desenvolverá a

forma clínica. A leucose bovina esporádica não está associada a nenhum agente etiológico e

não é transmissível. A ocorrência desta forma no rebanho é baixa e afeta animais jovens de até

dois anos de idade. Três apresentações anatômicas são descritas: juvenil, tímica e cutânea. A

forma juvenil acomete bezerros com menos de seis meses de idade, tem apresentação

multicêntrica e envolvimento da medula espinhal. A forma tímica ocorre em animais de até

dois anos de idade e acomete o timo. A forma cutânea afeta bovinos com menos de três anos

de idade e apresenta-se como placas ou lesões crostosas cutâneas. Histologicamente a leucose

bovina caracteriza-se pela proliferação de linfócitos atípicos. A imunofenotipagem classifica a

leucose como de linfócitos T ou B. Há poucos relatos de leucose esporádica bovina, sendo

necessários estudos adicionais em relação a aspectos epidemiológicos e ao envolvimento do

sistema nervoso central.

Palavras-chave: Leucose esporádica. Linfoma. Sistema nervoso central.

12

ABSTRACT

Cattle nervous system diseases lead to important economic losses and can represent public

health problems. Diseases of infectious and toxicological origin are the most prevalent in

Brazil, however, neoplasias of cattle also affect the productive chain. Among the cattle

neoplasms, the bovine leukosis from lymphoid tissue origin is the most frequent affecting

dairy cattle. The enzootic bovine leukosis is classified as enzootic or sporadic according to

etiological and epidemiological aspects. Most cases refers to the enzootic form associated

with a retrovirus infection, that affects animals between three to seven years old with a

multicentric presentation. Virus transmission is primarily horizontal through infected

lymphocytes, and 1-5% of infected animals will develop the clinical form. The sporadic

bovine leukosis is not linked to any etiolological agent and is not transmissible. The

occurrence of this form in the herd is low and affects young animals up to two years of age.

Three anatomical presentations are described: juvenile, thymic and cutaneous. The juvenile

form affects calves less than six months old, showing a multicentric presentation and

involvement of the spinal cord. Thymic form occurs in animals up to two years of age and

affects the thymus. Cutaneous form affects cattle under three years old and presents as

plaques or crusted skin lesions. Enzootic bovine leukosis is characterized histologically by

atypical lymphocytes proliferation. Immunophenotyping classifies leukosis from T or B

lymphocytes. There are few reports of sporadic bovine leukosis, additional studies are needed

in relation to epidemiological aspects and the involvement of central nervous system.

Key words: Sporadic leukosis. Lymphoma. Central nervous system.

13

1.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA

Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos compreendem

um grande grupo de doenças que causam perdas econômicas e impactos na saúde pública

(LEMOS et al., 2001; SANCHES et al., 2000; GALIZA et al., 2010). Vários estudos vêm

sendo realizados para determinar a prevalência destas doenças no rebanho brasileiro, sendo

que as doenças de origem infecciosas e toxicológicas são consideradas as de maior

prevalência. No entanto, outras enfermidades como as neoplasias também podem contribuir

com as perdas econômicas na cadeia produtiva bovina (LEMOS et al., 2001; BARROS, 2007;

GALIZA et al., 2010; RISSI et al., 2010).

Quase não há dados sobre a epidemiologia das neoplasias que acometem o

sistema nervoso central em bovinos e os neoplasmas primários deste sistema, são raramente

encontrados (SANCHES et al., 2000). De modo geral os estudos sobre a prevalência de

tumores em animais de produção são escassos, no entanto, considera-se que o linfoma é a

neoplasia mais frequente em bovinos adultos (VERNAU; JACOBS; VALLI, 1997; RAMOS

et al., 2008; MCCONNEL et al., 2009; WALDNER et al., 2009).

Em um estudo retrospectivo em bovinos acometidos por neoplasias, 26,5%

dos animais apresentavam tumores do sistema hematopoiético que foram diagnosticados

como linfoma (RAMOS et al., 2008). Há duas formas clínicas de leucose em bovinos, a

Leucose Enzoótica Bovina (LEB) e a Leucose Esporádica (LE). A LEB está associada ao

vírus da leucose bovina (VLB) e apresenta duas formas clínicas: a neoplasia de linfócitos

(linfoma) e a linfocitose persistente (LP) (BUEHRING; KRAMER; SCHULTZ, 1994;

DOMÉNECH et al., 2000), sendo que alguns autores consideram a LP uma reação pré-

neoplásica em bovinos naturalmente infectados (REYES; COCKERELL, 1996). Já a leucose

esporádica não está associada a nenhum agente causal específico e apresenta frequência

menor do que a LEB (MILLER; MAATEN, 1992).

A LEB acomete mais frequentemente o gado leiteiro (MIGAKI, 1969;

BRAGA; LAAN, 2006), sendo que em rebanhos infectados pelo VLB a prevalência da

infecção pode alcançar taxas entre 60 a 90% (JOHNSON; KANEENE, 1992). Levantamentos

epidemiológicos nos Estados Unidos e Canadá demonstraram que a prevalência nos soros

testados foi de aproximadamente 24% em rebanhos leiteiros (SARGEANT et al., 1997),

enquanto que na Argentina a prevalência foi de 68,5% (GHEZZI et al., 1997).

Não há uma uniformidade dos dados apresentados no Brasil, porém sabe-se

que a região sudeste possui percentuais de prevalência da doença entre 46,4 a 49,8%. No

14

entanto, a região nordeste apresenta índices menores (Acre 7 %, Alagoas 9,6% e Paraíba

8,3%) (BARROS, 2007). Já nos estados da região sul, a prevalência variou entre 9,2% (Rio

Grande do Sul) e 40,8% (Paraná) (MORAIS et al., 1996). A prevalência nos bovinos de corte

situa-se entre 7 a 20%, sendo que taxas maiores são observadas em rebanhos submetidos à

premunição para babesiose (CARVALHO et al., 1996; BRAGA; LAAN, 2006).

A leucose enzoótica bovina geralmente manifesta-se em bovinos entre três a

sete anos de idade e está associada à infecção pelo VLB (BARROS, 2007). Os vírus

pertencentes à subfamília Oncoviridiae, como o VLB, são os principais agentes causadores de

leucemia e linfoma em muitas espécies de animais, como felinos, aves, símios e humanos

(LOWER, 1999). A principal forma de transmissão do vírus é a horizontal, por meio de

linfócitos infectados (LEUZZI; ALFIERI; ALFIERI, 2001). Nos bovinos jovens, embora com

uma menor frequência, o vírus pode ser transmitido verticalmente, por via uterina –

geralmente após o primeiro trimestre gestacional, ou pela ingestão do colostro e\ou leite

contendo linfócitos infectados pelo VLB.

Os animais portadores de altas concentrações do vírus, mas com baixos

títulos de anticorpos podem transmitir a infecção para o feto. Porém, as fêmeas com altos

títulos de anticorpos e baixa carga viral, proporcionam transferência passiva de imunidade,

que se perpetua por alguns meses (JACOBSEN, 1983; LIESSE et al., 1991).

Em relação a leucose esporádica os dados sobre prevalência são escassos

(DOIGE, 1987; HENDRICK, 2002; PEIXOTO et al., 2011), mas, sabe-se que, dificilmente há

mais de um caso no mesmo rebanho. Estima-se que aproximadamente 1 bovino em 100.000

animais desenvolve a leucose do tipo esporádica (ESPINOSA, 1994; BARROS, 2007). Esta

forma é mais comum em bovinos com menos de dois anos de idade (REED, 1981; JACOBS;

MESSICK; VALLI, 2002).

A LE apresenta variações na sua manifestação clínica, sendo classificada de

acordo com a idade e localização do tumor. A LE pode ter as seguintes apresentações clínicas:

cutânea, tímica e multicêntrica (ou juvenil). Em outras espécies a classificação anatômica do

linfoma é semelhante, sendo classificada em eqüinos nas formas multicêntrica, cutânea,

alimentar e esplênica (GREEN; DONOVAN, 1977) e em caninos também na forma

mediastínica e/ou tímica e extranodal. A forma extra-nodal é a menos frequente e pode ocorrer

nos olhos, sistema nervoso central, coração ou rins (MILNER et al., 1996; MELLANBY;

HERRTAGE; DOBSON, 2003).

Nos bovinos a forma multicêntrica é encontrada em animais de até seis

meses (DUNGWORTH; THEILEN; LENGYEL, 1964; JONES; HUNT; KING, 2000); a

15

forma tímica manifesta-se em bezerros de seis a dezoito meses (JACOBS; MESSICK;

VALLI, 2002) e a cutânea, geralmente ocorre em bovinos com menos de três anos

(ZWAHLEHA; TONTIS; SCHNEIDER, 1987).

A leucose juvenil é um linfoma multicêntrico em que ocorre aumento

generalizado dos linfonodos, frequentemente, com envolvimento do fígado e baço (HAMIR;

PERKINS; JONES, 1989). Ocasionalmente ocorre o envolvimento do sistema nervoso central

como parte da apresentação multicêntrica ou ainda manifestar-se como lesão primária

(SMITH; ANDERSON, 1977; SWEENEY et al., 1986). Nestes casos, as neoplasias podem

desenvolver-se no encéfalo, medula espinhal ou na região epidural levando a sinais clínicos

relacionados à localização da neoformação como, por exemplo, paralisia dos membros

posteriores e síndrome da cauda equina decorrente da compressão medular (DOIGE, 1987;

KOESTNER et al., 1999). A leucose juvenil pode envolver articulações, costelas, mandíbula,

coração e útero destacando assim a diversidade das manifestações da LE nesta apresentação

(HAMIR; PERKINS; JONES, 1989; ESPINOSA, 1994; JACOBS et al., 1992; HENDRICK,

2002; HARBO et al., 2004).

Os sinais clínicos mais freqüentes são a perda gradual de peso, depressão,

fraqueza e linfonodomegalia, sendo que febre, edema e insuficiência cardíaca congestiva são

alterações menos comuns (REBHUN, 1984; DIVERS et al., 1995). A doença pode ter um

curso rápido para a morte. Estima-se que após o aparecimento das primeiras manifestações

clínicas, o óbito pode ocorrer entre duas a oito semanas (ESPINOSA , 1994).

Outros sinais menos específicos podem ser notados como edema,

insuficiência cardíaca congestiva, que são observados conforme a região afetada (REBHUN,

1984; DIVERS et al., 1995).

Na apresentação tímica da leucose esporádica, o linfoma manifesta-se no

timo e regiões adjacentes (JONES; HUNT; KING, 2000). Os sinais clínicos mais comuns são

produzidos, principalmente, pela pressão que a neoplasia faz quando se infiltra na cavidade

torácica, com efeitos no sistema cardiovascular, como ingurgitamento da veia jugular e

acentuado edema na região subcutânea torácica que pode se estender até região

submandibular. Há possibilidade de ocorrer timpanismo discreto ou moderado, secundário à

compressão da neoplasia que impede a eructação. O animal pode ainda apresentar, depressão,

perda de peso, anorexia, podendo ter ou não o acometimento em linfonodos (DUNGWORTH;

THEILEN; LENGYEL, 1964). A leucose esporádica tímica tem etiologia desconhecida, no

entanto, a ocorrência desta forma em vários bezerros oriundos do mesmo touro, sugeriu uma

possível associação hereditária (PARODI et al., 1989).

16

A forma cutânea apresenta-se como múltiplos nódulos na pele do pescoço,

escápula, períneo e membros pélvicos. Os nódulos medem entre 2 e 3 cm de diâmetro, são

salientes, firmes e frequentemente alopécicos e ulcerados. As lesões podem evoluir para

escaras de coloração acinzentada com formação de crostas (OKADA et al., 1989). Outros

sinais clínicos podem ser observados, como aumento de linfonodos superficiais e edema de

subcutâneo (BARROS, 2007). As recidivas não são infrequentes e podem ocorrer entre um e

dois anos, com reaparecimento das lesões de pele e envolvimento de linfonodos e outros

órgãos como o que ocorre na apresentação multicêntrica (JACOBS et al., 1992; SMITH,

2006). Microscopicamente a neoplasia caracteriza-se como um linfoma epiteliotrópico de

células T semelhante a mycosis fungoides humana (NASU et al., 1985; ZWAHLENA;

TONTIS; SCHNEIDER, 1987).

De uma forma geral os sinais clínicos da LE podem levar a diminuição na

produção de leite, baixa fertilidade e redução no ganho de peso do animal acometido pelo

linfoma (BURTON et al., 2010).

A classificação histológica do linfoma na espécie humana e canina é de

extrema importância para estabelecer o tratamento e prognóstico (MORENO;

BRACARENSE, 2006). Existem várias classificações histológicas, sendo as mais utilizadas a

Kiel modificado e a Working Formulation (National Cancer Institute). Microscopicamente o

linfoma caracteriza-se como uma proliferação de linfócitos atípicos que de acordo com a

Working Formulation pode ser classificado em difuso ou folicular. Em relação ao aspecto

morfológico das células é graduado em baixo, intermediário e alto grau, sendo compostos por

células com diferentes aspectos (Tabela 1).

17

Tabela 1 – Classificação de linfomas pelo sistema Working Formulation (adaptado).

Baixo Grau Grau Intermediário

A- Difuso, pequenos linfócitos com leucemia linfocítica

crônica

Difuso, pequenos linfócitos-plasmocitóide

Difuso, pequenos linfócitos-intermediário

D-Folicular, predomínio de células

grandes

B- Folicular, predomínio de pequenas células clivadas E- Difuso, células pequenas e

clivadas

C-Folicular, misto, pequenas células clivadas e grandes

células não clivadas

F- Difuso, mista, células grandes e

pequenas

G- Difuso, células grandes e

clivadas e não clivadas

Alto Grau Miscelânea

H- Imunoblastico.

Plasmocitóide.

Células claras.

Células polimórficas

L- Composição

Mycosis fungoides

Histiocitoma

Plasmocitoma extra-medular

I- Imunoblastico.

Células enoveladas.

Células não enoveladas

J- Células pequenas e não clivadas

Não Burkitt

Burkitt

Fonte: Vernau et. al. (1992).

O Kiel modificado avalia a morfologia celular em centroblástico,

centrocítico e imunoblástico e a classificação imunofenotípica em linfócitos T e B, sendo a

graduação de malignidade determinada em dois padrões: alto e baixo grau (VALLI;

GENTRY, 2007) (Tabela 2).

18

Tabela 2 – Classificação e graduação dos linfomas de acordo com o esquema Kiel

modificado.

Células B

Baixo Grau

Células B

Alto Grau

Células T

Baixo Grau

Células T

Alto Grau

Linfocítico Centroblástico Linfocítico Células médias e

grandes, pleomórficas

Linfoplasmocitoide Imunoblástico Mycosis fungoides Imunoblástico

Centrocítico Linfoblástico Linfoma de zona T Linfoblástico

Burkitt

Pequenas células

pleomórficas

Grandes células

anaplásicas

Grandes células

anaplásicas

Fonte: Stansfeld et al. (1988).

Em bovinos, um estudo com 1198 animais utilizou a classificação Working

Formulation constatando que 89% dos linfomas eram de alto grau, com predomínio (65%) do

tipo difuso de células grandes e clivadas. Os autores observaram que a ocorrência dos tipos de

células diferiu significativamente entre os linfomas das formas enzoótica e esporádica. A

forma clivada difusa de células grandes ocorreu em 38% dos casos de leucose enzoótica,

enquanto que na leucose esporádica a ocorrência foi de 14%. Os índices mitóticos foram

maiores nos linfomas enzoóticos do que nos esporádicos (VERNAU et al., 1992).

Não foram encontrados na literatura outros relatos que classifiquem a

leucose esporádica bovina segundo as classificações acima citadas, porém alguns relatos

descrevem histologicamente a neoplasia.

Existem algumas características morfológicas celulares que são comuns em

alguns casos como predomínio de linfócitos neoplásicos grandes (DUNGWORTH;

THEILEN; LENGYEL, 1964; BUNDZA et al., 1980; ZWAHLENA; TONTIS;

SCHNEIDER, 1987; OKADA et al., 1989; DUBREUIL et al., 1998). Alguns trabalhos

descrevem predomínio de núcleos clivados (DUNGWORTH; THEILEN; LENGYEL, 1964;

DUBREUIL et al., 1998; NASIR, 2005). Não há um padrão quanto ao índice mitótico.

A caracterização fenotípica dos linfócitos neoplásicos é de linfócitos T e B

(ISHII; OKI, 1994; VERNAU; JACOBS; VALLI, 1997. Estudos demonstraram que os

linfócitos B e T neoplásicos expressam uma mutação na proteína c-myc que está associada à

regulação celular (ASAHINA et al., 1996; SHINAGAWA et al., 1997).

Pouco se sabe sobre o conjunto de manifestações que podem preceder ou

acompanhar a LEB ou LE (JACOBS; MESSICK; VALLI, 2002). Dentre as alterações

19

descritas, relata-se o aumento na captação e a utilização da glicose, resultando em excesso de

produção de lactato (ELFENBEIN et al., 2008). Além do aumento da glicólise nas células

neoplásicas, a disfunção hepática tem sido uma das causas da hiperlactemia, pois o principal

local de metabolismo do lactato é no fígado, mas pode ocorrer em outros tecidos como

músculo esquelético e rim. O lactato é convertido em piruvato para entrar no ciclo de Krebs,

no fígado onde será transformado em glicose e utilizado em tecidos periféricos. A

hipoglicemia e a hiperlactemia se estabelecem desta forma como uma síndrome

paraneoplásica como a que ocorre em humanos (ELFENBEIN et al., 2008).

Existem poucos estudos sobre a leucose esporádica bovina, sendo que a

literatura refere-se em quase a sua totalidade a relatos de casos. Estudos enfocando aspectos

epidemiológicos, clínicos e patológicos são necessários para o melhor entendimento desta

neoplasia.

20

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25

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Identificar os casos de leucose esporádica em bovinos com sinais de doença

neurológica.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterizar anátomo-patologicamente as formas da leucose esporádica

bovina.

Caracterizar histologicamente as formas da leucose esporádica bovina.

Caracterizar imuno-histoquimicamente as formas da leucose esporádica

bovina.

26

3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

O trabalho foi desenvolvido no Departamento de Medicina Veterinária

Preventiva e Departamento de Clínicas Veterinárias da Universidade Estadual de Londrina,

Paraná como parte do projeto de pesquisa Diagnóstico Diferencial das Doenças Neurológicas

dos Bovinos no Estado do Paraná CNPq/MAPA/DAS (processo 578645/2008-4).

Foram encaminhados ao projeto 78 casos de bovinos acometidos por

doenças neurológicas no período entre março de 2009 a abril de 2011. Os animais foram

submetidos ao exame clínico, exames complementares e nos casos que vieram a óbito ou

foram eutanasiados foi realizada a necropsia e exame histopatológico.

Nos casos em que havia suspeita de intoxicação, fragmentos de fígado

foram submetidos a exame toxicológico para a detecção de organofosforados, organoclorados,

carbamatos e dicumarínicos.

Na tabela 3 estão dispostos os diagnósticos estabelecidos para o total de

animais atendidos no projeto com sinais clínicos e distúrbios nervosos.

27

Tabela 3 – Doenças do Sistema Nervoso Central diagnosticadas em 78 bovinos atendidos

entre março de 2009 e abril de 2011 como parte do projeto de pesquisa

Diagnóstico Diferencial das Doenças Neurológicas dos Bovinos no Estado do

Paraná. Londrina, 2011.

Alterações Inflamatórias Virais N %

Raiva 7 8,9

BHV-5 8 10,2

Alterações Inflamatórias Bacterianas

Abscesso cerebral e paravertebral 2 2,5

Enterotoxemia 2 2,5

Meningomielite 2 2,5

Alterações Degenerativas

Osteomielite com compressão de

medula

1 1,2

Polioencefalomalácea 1 1,2

Alterações Tóxicas

Tétano 2 2,5

Botulismo 3 3,8

Plantas Tóxicas 17 21,7

Carbamato 2 2,5

Nitrato/nitrito 5 6,4

Uréia 1 1,2

Micotoxinas 7 8,9

Metabólicas 1 1,2

Acetonemia Nervosa 1 1,2

Alterações Circulatórias

Babesiose 2 2,5

Trauma 3 3,8

Neoplasias

LEB 1 1,2

LE 4 5,1

Casos sem causas determinadas 6 7,6

Total 78 100%

Fonte: Ribeiro e Lisboa (2011).

28

4 MANUSCRITO PARA PUBLICAÇÃO

4.1 LEUCOSE ESPORÁDICA BOVINA COM ENVOLVIMENTO DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL:

RELATO DE CASOS

RESUMO

A leucose esporádica bovina é considerada uma neoplasia de rara ocorrência caracterizada

pela proliferação de linfócitos atípicos. O objetivo deste trabalho foi relatar quatro casos desta

afecção em bovinos com sinais de doença neurológica. A idade dos animais variou entre 2 a

29 meses. Os bovinos foram submetidos a exame clínico, hematológico, de líquor e

imunodifusão em ágar-gel para determinação de anticorpos contra o vírus da leucose

enzoótica. Fragmentos de encéfalo, medula espinhal, fígado, baço e linfonodos foram

submetidos à análise histopatológica. O exame imuno-histoquímico foi utilizado para

determinação do tipo de linfócito (B ou T). Os sinais clínicos foram tetraplegia, paraplegia

paresia de membros pélvicos e convulsões. Todos os animais apresentaram envolvimento do

sistema nervoso central caracterizado por infiltração de linfócitos atípicos ou neoformação no

canal medular. No exame histopatológico dois animais apresentaram linfoma de alto grau e

dois de baixo grau, sendo todos caracterizados fenotipicamente como linfoma de células T. Os

resultados histológicos e imuno-histoquímicos associados ao resultado negativo para a

imunodifusão permitiram o diagnóstico de leucose esporádica nos quatro bovinos.

Palavras Chaves: Leucose esporádica. Linfoma. Sistema nervoso central.

ABSTRACT

The sporadic bovine leukosis is considered a rare occurrence of neoplasia, characterized by

proliferation of atypical lymphocytes. The objective of this study was to report four cases of

this disease in cattle with signs of neurological disease. The age of the animals ranged from 2-

29 months. The animals were subjected to clinical examination, haematological and spinal

fluid analysis and immunodiffusion in agar gel for determination of antibodies against the

virus of enzootic leukosis. Fragments of brain, spinal cord, liver, spleen, lymph nodes were

submitted to histopathological analysis. The immunohistochemical examination was used to

determine the type of lymphocyte (T or B). Clinical signs were tetraplegia, paraplegia,

paresia of hind limbs, and convulsions. All animals showed involvement of the central

nervous system characterized by infiltration of atypical lymphocytes or neoformation in the

spinal cord canal. The histopathological analysis of two animals showed high-grade

lymphoma and two low-grade, all characterized phenotypically as T-cell lymphoma. The

histological and immunohistochemical findings associated with negative result for

immunodiffusion allowed for the diagnosis of enzootic bovine sporadic in the four animals.

Key words: Sporadic leukosis, lymphoma, central nervous system

29

4.1.1 Introdução

Os distúrbios do sistema nervoso central (SNC) em bovinos compreendem

um grande grupo de doenças que causam perdas econômicas e afetam a saúde pública em

todo o país (SANCHES et al., 2000; LEMOS et. al., 2001; GALIZA et al., 2010). As

principais doenças neurológicas em bovinos são de origem infecciosa e tóxica, porém outras

enfermidades como as neoplasias também são relatadas (RISSI et al., 2010). Os dados sobre

os neoplasmas primários do SNC em bovinos são escassos, sendo estes considerados raros

(SANCHES et al., 2000).

Dentre as neoplasias que acometem os bovinos, o linfoma é uma das mais

frequentes. Em um estudo retrospectivo com 98 bovinos acometidos por tumores, 26 % dos

animais tiveram o diagnóstico de linfoma (RAMOS et al., 2008). O linfoma é um grupo

heterogêneo de neoplasmas originários de células linfoides frequentemente diagnosticado em

animais domésticos (SEARCY, 1998). A leucose bovina é classificada em enzoótica ou

esporádica. A leucose enzoótica é uma doença infecciosa transmissível associada à infecção

por um oncovírus, enquanto que a leucose esporádica não tem etiologia definida e não é

transmissível (BARROS, 2007).

A forma esporádica tem três apresentações anatômicas: a juvenil que é

encontrada em animais de até seis meses de idade (DUNGWORTH; THEILEN; ENGYEL,

1964; JONES; HUNT; KING, 2000); a tímica que se manifesta em bezerros de seis a dezoito

meses (JACOBS; MESSICK; VALLI, 2002) e a cutânea que geralmente ocorre em bovinos

com mais de três anos (ZWAHLENA; TONTIS; SCHNEIDER, 1987). As três formas

esporádicas são de raras apresentações no rebanho, estimando-se um caso em cada 100.000

animais (ESPINOSA, 1994).

O objetivo deste trabalho foi relatar quatro casos de leucose esporádica em

bovinos com envolvimento do sistema nervoso central e seus aspectos clínicos, anátomo-

patológicos e imunofenotípicos.

4.1.2 Material e Métodos

Foram encaminhados ao Hospital Veterinário (HV) da Universidade

Estadual de Londrina, quatro bovinos que foram submetidos a anamnese, exame clínico e

30

exames complementares. Um dos animais já estava morto quando foi encaminhado ao HV. Os

exames complementares consistiram em avaliar os parâmetros hematológicos e líquor.

As amostras do líquido cefalorraquidiano foram colhidas por punção em

cisterna magna no espaço atlanto-occipital e acondicionadas em tubos de ensaio e foram

mantidas refrigeradas até o momento do exame

As amostras de sangue foram colhidas por venopunção e acondicionadas em

tubos de ensaio contendo EDTA a 10%. Estas amostras foram mantidas refrigeradas até o

momento da realização do exame para determinação do eritrograma e leucograma. Para

avaliação sorológica da presença dos anticorpos anti-vírus da leucose enzoótica bovina, foi

utilizada imunodifusão em gel de Agar-IDGA (MILLER; MATTEN,1992).

Nos casos em que a evolução do quadro não cursou com a melhora geral do

animal, realizou-se eutanásia dos animais com solução de cloreto de potássio a 20% após

anestesia com cloridrato de xilazina (0,2 mg/Kg) e tiopental sódico (10 mg/Kg).

Os animais foram necropsiados e fragmentos de órgão colhidos para exame

histopatológico. Fragmentos de pulmão, fígado, baço, linfonodos, rim e encéfalo foram

fixados em solução tamponada de formalina a 10%, sendo então submetidos ao

processamento de rotina. Os cortes com 4µm de espessura foram corados pelo método de

hematoxilina e eosina (HE) para exame histológico conforme procedimento padrão.

Com o objetivo de caracterizar o fenótipo das células neoplásicas nos casos

de linfoma utilizou-se o exame imuno-histoquímico. Para tanto, os cortes histológicos dos

animais foram distendidos sobre lâminas histológicas previamente silanizadas. Após a

desparafinização, as lâminas foram submetidas à recuperação antigênica em tampão citrato

(pH 6,0) em forno microondas durante 15 minutos e bloqueio da peroxidase endógena em

solução de água oxigenada e metanol (1:1). Posteriormente foram incubadas com anticorpo

monoclonal anti-CD79 (1:50, clone JCB117, Dako), policlonal anti-CD3 (1:50, Dako) e

policlonal anti-lisozima (1:200, Invitrogen) por 18 horas em câmara úmida a 4C. As lâminas

foram então tratadas pelo método do polímero (Envision, Dako) durante 30 minutos à

temperatura ambiente, sendo a reação revelada em solução de 3,3 diaminobenzidina. Os

cortes foram submetidos à contra-coloração com hematoxilina de Harris, desidratação e

montagem com lamínula e resina sintética. Todas as reações foram acompanhadas com

controle negativo e positivo para a reação de acordo com o fabricante.

31

4.1.3 Relato de Casos

4.1.3.1 Caso 1

Um animal de espécie bovina, fêmea, 60 dias, raça Nelore, apresentou

apatia e quadro súbito e progressivo de paraparesia de membros pélvicos, progredindo para

decúbito esternal, posteriormente lateral e morte em 11 dias após o inicio dos sinais. Não

foram realizados os exames clínicos e colheita de amostras para exames complementares

porque o animal já estava morto quando o atendimento foi efetuado.

À necropsia observou-se acentuado edema pulmonar, fígado com discreto

aumento de tamanho com inúmeros nódulos brancos circulares de tamanho entre 0,2 e 0,3 cm

em seu diâmetro maior; linfonodos inguinais direito e esquerdo com discreto aumento. Na

inspeção do canal medular verificou-se na região epidural entre a quarta e sexta vértebras

lombares a presença de massa de coloração branca, consistência firme, medindo

aproximadamente 0,5 cm de comprimento.

Ao exame histopatológico da neoformação no canal medular observou-se

padrão difuso de grandes células linfóides que apresentavam citoplasma escasso,

discretamente eosinofílico, núcleo volumoso, com acentuada anisocariose e baixo número de

figuras de mitoses (1/10 campos) (Figura 1). Em algumas células o núcleo apresentava-se

com reentrâncias e nucléolos na periferia. A infiltração por linfócitos neoplásicos estendia-se

até as leptomeninges da região medular e ocasionalmente no espaço perivascular de córtex

frontal, parietal, temporal e occipital. Observou-se ainda pneumonia intersticial discreta e

edema alveolar difuso. O fígado apresentava esteatose difusa e infiltração de linfócitos

neoplásicos entre os hepatócitos. Nos linfonodos constatou-se proliferação difusa de

linfócitos, com perda do padrão folicular constituído por grandes células linfóides que

apresentavam citoplasma escasso e de coloração eosinofílica, núcleo volumoso, com

acentuada anisocariose e baixo número de figuras de mitoses (1/10 campos), caracterizando

um linfoma de alto grau. Ao exame imuno-histoquímico os linfócitos atípicos foram

predominantemente imunoreagentes ao anticorpo anti-CD3.

32

Figura 1 – Captura de imagem histológica. Massa neoplásica em canal medular HE. Objetiva

de 20x. Londrina 2011.

Foto: A autora (2011).

Figura 2– Captura de imagem histológica. Presença de linfócitos atípicos infiltrados no

fígado. Linfócitos grandes, com citoplasma escasso, núcleos hipercromáticos com

nucléolos proeminentes e dispostos perifericamente (círculo). HE. Objetiva de

40x. Londrina 2011.


33

4.1.3.2 Caso 2

Um bezerro da raça Girolanda, macho, 90 dias de idade foi encaminhado ao

HV/UEL apresentando paraplegia e decúbito esternal. Ao exame clínico o animal apresentou

temperatura de 38,9°C, discreta taquipnéia e bom estado nutricional. Não foram observadas

alterações em linfonodos.

Ao exame neurológico constatou-se que o animal estava alerta, com perda

de reflexos cutâneos a partir das primeiras vértebras sacrais, flacidez de cauda, ausência de

reflexo perineal, relaxamento do esfíncter anal, leve prolapso retal, incontinência urinária e

ausência de reflexo patelar e reflexo de flexão (Figura 3).

Foram colhidas amostras para realização de exames complementares. Os

resultados do hemograma e líquor encontram-se na tabela 4.

Figura 3 – Leucose esporádica bovina juvenil. Bezerro apresentando paraplegia. Londrina,

2011.

Foto: Julio Lisboa (2010).

O animal apresentou discreta atrofia muscular. Sem a melhora do estado

clínico geral do animal decidiu-se pela eutanásia. À necropsia verificou-se no canal medular

presença de massa de 7cm de comprimento, macia, branca comprimindo a medula entre o

sexto segmento lombar e o primeiro segmento sacral (Figura 4).

34

Figura 4 – Leucose esporádica bovina. Neoformação no canal medular (setas) com superfície

homogênea e esbranquiçada. Londrina, 2011.

Foto: Julio Lisboa (2010)

Ao exame microscópico observou-se discreta infiltração de células linfoides

atípicas em leptomeninges do córtex frontal e parietal. A massa no canal medular era

constituída por pequenas células linfocíticas, com distribuição difusa, citoplasma escasso,

núcleo central, cromatina reticular, nucléolos múltiplos, evidentes e discreto número de

figuras de mitoses (1 em 10 campos, objetiva de 40X), caracterizando um linfoma de baixo

grau (Figura 5). A medula na região da neoformação apresentava áreas de malácia e

infiltração por linfócitos neoplásicos na região de substância branca. Observou-se ainda

tumefação axonal na medula nos segmentos lombares e de cauda equina e formação de

trombo nessa região. Nos demais órgãos analisados não foram observados alterações

microscópicas. Ao exame imuno-histoquímico os linfócitos atípicos foram

predominantemente imunoreagentes ao anticorpo anti - CD3. (Figura 6)

35

Figura 5 – Captura de imagem histológica da massa em canal medular, composta por

linfócitos atípicos.HE .Objetiva de 20x. Londrina, 2011.

Foto: A autora (2011)

Figura 6 – Captura de imagem histológica da massa em canal medular. Observar a marcação

de linfócitos para o anticorpo policlonal anti-CD3. Linfoma de células T. Objetiva

de 40x. Londrina, 2011.


36

4.1.3.3 Caso 3

Uma novilha da raça Gir, fêmea de 29 meses de idade foi atendida no

HV/UEL com histórico de desconforto abdominal. Ao exame clínico constatou-se que o

animal estava alerta e com incoordenação de membros pélvicos. O animal foi internado e nos

três primeiros dias apresentou episódios convulsivos. Durante os 28 dias de internamento

observou-se a manutenção dos sinais clínicos, além de tremores musculares nos membros

pélvicos. O animal permanecia em decúbito esternal, porém quando estimulada levantava-se

sem auxílio. Constatou-se ainda reação dolorosa do membro torácico direito e membro

pélvico esquerdo. Os exames de hemograma e líquor encontram-se na tabela 4. Devido ao

agravamento do quadro clínico, o animal foi submetido à eutanásia e necropsia.

Ao exame macroscópico observou-se a presença de material fibrino-

purulento e necrótico em articulação tarso-metatársica esquerda e radio-cárpica direita. O

músculo serrátil ventral do tórax apresentava um abscesso com aproximadamente 15 cm de

diâmetro. As gorduras abdominal e perirrenal apresentavam focos de 2 a 3 cm de diâmetro de

coloração branca e aspecto arenoso. Observou-se aderência do omento e retículo ao peritônio

com presença de foco contendo material purulento. Os linfonodos mesentéricos apresentavam

discreto aumento de volume. No sistema nervoso central não foram observadas alterações

macroscópicas.

Ao exame histopatológico observou-se extensa necrose muscular

acompanhada de calcificação distrófica multifocal no músculo serrátil e nefrite intersticial

crônica. A gordura perirenal apresentava múltiplos granulomas micóticos com presença de

hifas na região central. No retículo observou-se também a formação de granulomas micóticos

na região mucosa e a presença de linfócitos atípicos no lúmen intravascular. No sistema

nervoso central constatou-se espongiose da camada cortical no córtex cerebral. Nas regiões do

colículo rostral, distal, ponte e medula oblonga observaram-se linfócitos atípicos no lúmen

vascular e degeneração walleriana em raízes nervosas da medula. Os linfonodos apresentaram

perda do padrão folicular e proliferação difusa de linfócitos com discreta atipia. As células

apresentavam padrão linfocítico com núcleo central, nucléolos proeminentes, sem presença de

figuras de mitoses, caracterizando um linfoma de baixo grau. Ao exame imuno-histoquímico

os linfócitos atípicos foram imunoreagentes ao anticorpo anti-CD3.

37

4.1.3.4 Caso 4

Um bezerro sem raça definida, macho, com 10 meses de idade,

apresentando decúbito lateral permanente foi atendido no HV/UEL. Ao exame clínico

observou-se aumento de volume no linfonodo pré-escapular esquerdo. Ao exame neurológico

constatou-se que o animal apresentava depressão, cegueira, nistagmo, sialorréia, trismo

mandibular, tremor de cabeça e muscular e ausência de reflexos cutâneos. Tetraplegia,

ausência de tônus da cauda e flacidez de língua (Figura 7) também foram observados.

Amostras de sangue e líquor foram colhidas para análise. Os resultados

estão dispostos na tabela 4.

Figura 7 – Leucose bovina esporádica em bezerro. Flacidez de língua. Londrina, 2011.

Foto: Julio Lisboa (2010).

O animal apresentou agravamento do quadro clínico e veio a óbito. Foi

realizada a necropsia e foram observadas áreas de hepatização em lobo cranial no pulmão,

fígado com bordos arredondados, baço com hiperplasia de polpa branca e linfonodos pré-

escapulares aumentados. Verificou-se também necrose focal na musculatura do pescoço e

ligamento supra-espinhoso, necrose de cornetos e malácia focal no córtex frontal e temporal.

38

Ao exame histopatológico observou-se moderada broncopneumonia,

discreta esteatose hepática, discreta hiperplasia linfoide esplênica e de linfonodos. No córtex

cerebral frontal e parietal observou-se a presença de linfócitos neoplásicos grandes do tipo

imunoblástico e centroblástico no espaço perivascular e lúmen (Figura 8 e 9), com frequentes

figuras de mitoses (6/10 campos. Objetiva 40x), caracterizando um linfoma de alto grau.

Malácia focal da substância branca e nódulos gliais também foram observados. Ao exame

imuno-histoquímico os linfócitos atípicos foram imunoreagentes ao anticorpo anti-CD3.

Figura 8 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de linfócitos

atípicos no espaço perivascular. HE. Objetiva de 20x. Londrina, 2011.


39

Figura 9 – Captura de imagem histológica. Córtex cerebral de bezerro. Presença de linfócitos

atípicos (círculos) e figuras de mitose (setas) no espaço perivascular no córtex

frontal. HE. Objetiva de 40x. Londrina, 2011.


Para a determinação da presença de anticorpos para o vírus da leucose

bovina foi colhido soro e realizado o exame baseado no método de imunodifusão em gel de

ágar-IDGA. Os animais dois, três e quatro apresentaram resultados negativos para este exame.

No animal 1 o exame não foi realizado. Na tabela 5 são apresentados os principais achados

dos casos.

40

Tabela 4 – Resultados dos exames de hemograma e líquor de bovinos com leucose

esporádica.

Parâmetros laboratoriais

Valores

referenciais

Caso 2

Caso 3

Caso 4

Hemácias 8 – 15 mm3 8,0 mm3 15,6 mm3 7,46 mm3

Hemoglobina 5 – 10 g/dl 5 g/dl 6,31 g/dl 11,7 g/dl

VG 24 – 46 % 29,8 % 37,9% 37,3 %

VCM 40 – 60 F.L 60 F.L 60 F.L 50,1 F.L

CHCM 30-36 % 33,33 % 34,1% 31,5 %

Fibrinogênio 300 – 700 g/dl 600 g/dl 800 g/dl 1.000 g/dl

Proteínas Totais 7- 8,5 g/dl 7 g/ dl 7,4g/ dl 7,0 g/ dl

Total de leucócitos 4.000 – 12.000 7.900 10.500 10.020

Segmentado 15 – 45 % 15 % 66 % 54 %

Linfócito 45 – 75 % 85 % 32 % 42 %

Eosinófilos 2– 20 % - - 2 %

Monócitos 2 – 7 % - - 2 %

Exame do líquor

Coloração Incolor Incolor Incolor Incolor

Aspecto Límpido Límpido Límpido Límpido

Glicose 40 – 80 mg/dl 61,1mg/dl 37,5 mg/dl 37,5mg/dl

Densidade 1003 – 1006 1004 1006 1003

Número de leucócitos 1 - 3/mm3 6/mm3 - 486/mm3

Segmentados - 10 % - 30%

Linfócitos - 90 % - 70%

VG - volume globular, VCM - volume corpuscular médio, CHCM - concentração de hemoglobina

corpuscular média, F.L. - fentolitro

Fonte: A autora (2011)

41

Tabela 5 – Achados clínicos e anátomo-patológicos em bovinos com leucose esporádica com

envolvimento do sistema nervoso central. Londrina 2011.

Animal e

raça Sexo

Idade

Exame clínico-

neurológico

Aspectos

macroscópicos

Achados

histopatológicos Fenótipo

1 Nelore

Fêmea

2 meses

Apatia,

paraparesia dos

membros

pélvicos,

diminuição dos

reflexos

espinhais em

membros

pélvicos.

Neoformação no

canal medular (L4-

L6), linfonodos

aumentados e

nódulos

brancacentos no

parênquima

hepático.

Linfoma no canal

medular,

linfonodo e

fígado.

CD3 +

2 Girolanda

Macho

3 meses

Alerta,

paraplegia,

ausência de

reflexo na

cauda.

Neoformação no

canal medular (L6-

S1)

Linfoma no canal

medular. Malácia

focal em medula.

Linfócitos

atípicos em

leptomeninges do

córtex cerebral.

CD3 +

3 Gir

Fêmea

29 meses

Episódios de

convulsão.

Artrite fibrino-

purulentaem tarso-

metatarso esquerdo

e rádio-cárpo

direito

Linfócitos

atípicos no lúmen

e espaço

perivascular do

SNC. Linfoma

em linfonodo.

CD3 +

4 SRD

Macho

10 Meses

Depressão,

cegueira,

nistagmo,

convulsão,

tremores de

cabeça e

músculos.

Tetraplegia.

Malácia em córtex

frontal e temporal

Linfócitos

atípicos no lúmen

e espaço

perivascular do

córtex cerebral.

Malácia focal

cerebral.

CD3 +

Fonte: A autora (2011)

4.1.4 Discussão

Os aspectos macroscópicos observados neste estudo foram sugestivos de

leucose esporádica juvenil em dois casos (caso 1 e 2) em que foram visualizadas

neoformações no canal medular. Essa forma acomete bezerros de até seis meses de idade, mas

eventualmente pode ser congênita e caracteriza-se por linfodenopatia generalizada com

envolvimento de outros órgãos como o canal medular (VALLI, 2007). O caso 1 apresentava

os aspectos macroscópicos clássicos de um linfoma multicêntrico acompanhado de infiltração

42

hepática, no entanto, no caso 2, apenas a neoformação medular foi observada, sem

envolvimento de órgãos linfóides. Dentre as neoplasias que causam compressão medular, o

linfoma é o mais comum, ocorrendo frequentemente em região lombossacra e com menor

frequência no plexo braquial e áreas cervicais (BLOOD; RADOSTITS, 1983).

Leucemia acompanhada de anemia normocítica, normocrômica e

trombocitopenia (VALLI, 2007) ocorrem frequentemente na forma juvenil, no entanto neste

estudo alterações hematológicas ou no líquor não foram observadas. O exame do liquor tem

pouca sensibilidade para a detecção de linfócitos neoplásicos principalmente quando as lesões

se localizam em vértebras lombares e sacrais e a colheita é realizada entre as vértebras

atlanto-occipital (ESPINOSA, 1994; BURTON et. al., 2010).

Nos casos 3 e 4, os aspectos macroscópicos não foram indicativos de

nenhuma patologia do sistema linfóide, visto que nenhum órgão linfóide apresentava

alterações significativas. As lesões macroscópicas observadas no caso 3 estavam relacionadas

à artrite supurativa e a presença multifocal de granulomas micóticos e no caso 4 a malácia

focal cortical. A pleocitose observada no líquor do animal 4 pode estar relacionada à presença

de linfócitos atípicos infiltrando o sistema nervoso.

O aumento generalizado de linfonodos acompanhado ou não de espleno e

hepatomegalia é frequentemente observado tanto na leucose enzoótica como na esporádica. A

proliferação de linfócitos atípicos resultando no desaparecimento do padrão folicular dos

linfonodos ou baço é uma das características do linfoma (HENDRICK, 2002). Neste estudo o

envolvimento de linfonodos foi observado em dois casos (1 e 3), sendo que em ambos, apenas

um ou dois linfonodos foram afetados. As características morfológicas microscópicas

observadas tanto nos linfonodos como nas neoformações do canal medular estão de acordo

com o descrito na literatura (VERNAU et al., 1992). Em dois animais as lesões estavam

restritas à infiltração perivascular no sistema nervoso central, uma apresentação rara, mas já

evidenciada e pouco esclarecida na literatura (SMITH; ANDERSON, 1977; SWEENEY et al.,

1986). Considerando os aspectos macro e microscópicos, o caso 4 pode ser classificado como

uma forma atípica da leucose esporádica com envolvimento do sistema nervoso. Em outras

espécies, estas apresentações são classificadas como extra-nodais, manifestando-se em locais

como globo ocular, coração, medula e cérebro (COUTO, 1992; SLATTER, 1992; FIGHERA,

2000), sendo o aspecto descrito, associado ao linfoma primário do SNC (KOESTENER,

1978).

Outras alterações observadas no tecido nervoso medular, como malácia e

degeneração walleriana, foram associadas à compressão exercida pela neoplasia (caso 2).

43

Achados semelhantes foram descritos na literatura (REBHUN, 1984; SHERMAN, 1987;

DIVERS et al., 1995; BURTON et al., 2010). No caso 1, estas alterações não foram

observadas, provavelmente porque o tamanho da neoformação (0,5 cm) não foi suficiente

para induzir compressão.

A imunofenotipagem é um procedimento necessário para a classificação dos

linfomas pelo sistema Kiel. Os primeiros relatos em bovinos classificaram os linfomas como

de células T (ISHII; OKI, 1984), no entanto linfomas bovinos de células B também foram

descritos (VERNAU; JACOBS; VALLI, 1997). Neste estudo, todos os casos estavam

associados a linfócitos T. Em outras espécies, como os cães, à determinação do tipo celular

influencia no prognóstico e tratamento, tendo o linfoma de células T pior prognóstico

(GREENLEE, et al. 1990; TESKE, 1994). Em bovinos os relatos envolvendo

imunofenotipagem de linfomas são escassos, sendo necessários mais estudos para se verificar

se há diferenças no prognóstico entre linfomas de células T ou B.

Em conclusão, os achados anátomo-patológicos e imuno-istoquímicos

associados à ausência de reatividade no teste de imunodifusão em ágar-gel permitiram o

diagnóstico de leucose esporádica bovina nos quatro casos relatados.

44

REFERÊNCIAS

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47

CONCLUSÕES

A leucose esporádica bovina foi observada em quatro animais de um total

de 78 examinados.

Dois animais apresentaram a forma juvenil da leucose esporádica com

envolvimento do canal medular.

Dois animais apresentaram forma atípica da leucose esporádica associada

à infiltração de linfócitos neoplásicos no SNC.

As neoplasias foram classificadas fenotipicamente como linfomas T.

48

ANEXOS

49

ANEXO A

Lista de Reagentes e Produtos

1. 2-Mercaptoetanol (C2H6O5) P.M. 78,13 (Fluka®)

2. Acetona, P.A. (CH3COCH3) P.M. 58,08 (Dinâmica®)

3. Ácido acético glacial, P.A. (CH3COOH) P.M. 60,05 (Nuclear®)

4. Ácido bórico (H3BO3) P.M. 61,83

5. Ácido cítrico P.A. – Anidro (Reagen®)

6. Ácido clorídrico (HCl) P.M. 36,46 (Reagen®)

7. Ácido etilenodiaminotetraácido Sal di-sódico – EDTA, P.A. (C10H14N2O8Na22H2O) P.M. 372,24

(Reagen®)

8. Ácido fórmico P.A. / ACS (Reatec®)

9. Agarose (Gibco BRL®)

10. Álcool etílico absoluto (C2H2OH) P.M. 46,07 (Nuclear®)

11. Álcoolisoamílico ((CH3)2CHCH2CH2OH) P.M. 88,15 (Synth®)

12. Anticorpos (E-caderina e Ki-67) (Zymed®)

13. Azul de bromofenol (Sigma®)

14. Bicarbonato de sódio P.A.(NaHCO3) P.M. 84,01 (Biotec®)

15. Cloreto de potássio, P.A. (KCl) P.M. 74,56 (Reagen®)

16. Cloreto de sódio, P.A. (NaCl) P.M. 58,45 (Reagen®)

17. Clorofórmio, P.A. (CHCl3) P.M. 119,38 (Dinâmica®)

18. DAB (Invitrogen Life TechnologiesTM

)

19. EDTA

20. Eosina (Nuclear®)

21. Ethidiumbromide (C21H20N3Br) P.M. 394,3 (Sigma®)

22. Formaldeído P.A. (Vetec®)

23. Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4) P.M. 141,96 (Synth®)

24. Fosfato de sódio monobásico (NaH2PO4.2H2O) P.M. 155,99 (Reagen®)

25. Gelatina U.S.P. (Sinth®)

26. Hematoxilina (Nuclear®)

27. Hidróxido de Sódio, P.A. (NaOH) P.M. 40,00 (Dinâmica®)

28. Hidroximetil amino metano – TRIS 99% P.M. 121,14 (Inlab®)

29. Metanol, P.A. (CH3OH) P.M. 32,04 (Allkimia®)

30. Tris (Nuclear®)

31. Xileno P.A. (Nuclear®)

50

ANEXO B

Soluções e Tampões

PBS pH 7,2

Misturar 1,98 g de Na2HPO4.7H2O em 500 mL de água MilliQ®

Acrescentar 0,36 g NaH2PO4.H2O e 8.17 g de NaCl

Adicionar água MilliQ® q.s.p. 1.000 mL

Ajustar solução para pH 7,2

Tampão citratopH 6,0

2,1 g de acido cítrico H3C6H5O7.H2O

1000 mL de Água destilada

TampãoTris-EDTA Tween20 pH 9,0

1,211 g de TRIS

0,372 g de EDTA

1000 mL de Água destilada

0,2ml de Tween20

51

ANEXO C

Protocolo de Técnicas

Imuno-histoquímica (CD79, CD3 e lisozima)

- Xilol 1 – 20min (em estufa)

- Xilol 2 – 15min

- Álcool abs. 1 – 10min

- Álcool abs. 2 – 10min

- Álcool 90% 1 – 5 min

- Álcool 90% 2 – 5min





- Lavar em água corrente por 10min.

- Enxaguar duas vezes em água destilada.

- Recuperação Antigênica

- Para CD3, CD79 e lisozima: Colocar as lâminas em recipiente metálico com solução

tampão citrato

- pH 6,0 e por em banho–maria (placa aquecedora) por 35 minutos após iniciar

formação de bolhas. Ir controlando temperatura manualmente para não permitir

fervura. Deixar esfriar em temperatura ambiente, na solução tampão citrato pH 6,0 por

1 a 2 horas.



- Colocar as lâminas em solução de metanol (140ml) + água oxigenada 20volumes (10ml).

Deixar em câmara escura por 20 minutos.

- Lavar em água corrente por 10 minutos.


- Secar as lâminas individualmente com papel absorvente e colocar uma gota de anticorpo

primário (anti-CD79, CD3 e lisozima) cobrindo todo o corte.

- Incubar em câmara úmida, deixando em geladeira por 18 horas.

- Lavar as lâminas com solução PBS pH 7,2 por 5min (repetir duas vezes).

52

- Secar as lâminas individualmente e colocar uma gota do anticorpo secundário, cobrindo todo

o corte. Cobrir e deixar incubando em temperatura ambiente por 20min.

- Lavar as lâminas com solução de PBS pH 7,2 por 5 min (repetir duas vezes).

- Cobrir o corte com o DAB e observar revelação.

- Lavar as lâminas em água corrente por 10min.

- Enxaguar duas vezes com água destilada.

- Contra-corar com hematoxilina (20 segundos).


- Enxaguar em água destilada duas vezes.

- Álcool 70% - 5min.

- Álcool 80% - 5min



- Xilol - 15min.

- Montagem das lâminas.

Documents

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