Universidade Estcio de S Cursos de FARMCIA, NUTRIO e ENFERMAGEM

BIOQUMICA

Roteiros de Aulas Prticas

Curso Prtico de Bioqumica

Aspectos Gerais:

Os alunos recebero instrues relacionadas s aulas prticas e

posteriormente, executaro os experimentos propriamente. Ambos os procedimentos acontecero nos laboratrios. O aluno deve aguardar orientaes para iniciar.

Ao final de cada prtica, o grupo dever entregar um relatrio referente a prtica executada, aps a aula, com os seguintes itens:

a) Objetivos b) Resumo dos Procedimentos c) Resultados d) DISCUSSO (fundamentao terica dos resultados)

Os relatrios sero avaliados, perfazendo 10% (dez por cento) do total do

bimestre referente.

PRTICAS E ATIVIDADES: 1) IDENTIFICAO DE PROTENAS E AMINOCIDOS; 2) PROPRIEDADES PROTECAS DESNATURAO E RENATURAO; 3) FATORES INTERFERENTES NA REAO ENZIMTICA; 4) IDENTIFICAO DE BIOMOLCULAS: CARBOIDRATOS E LIPDEOS 5) SEMINRIO DE VITAMINAS 6) PROCESSO DE FERMENTAO

AULA PRTICA N 01

IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS Objetivo: reconhecer, qualitativamente, a presena de aminocidos e protenas em solues, atravs da reao da ninhidrina e do biureto. 1. REAO DA NINHIDRINA Em 4 tubos de ensaio marcados ( 1A ), ( 2A ), ( 3A ) e ( 4A ), ADICIONAR: a) Nos quatro tubos - 1,0 ml da soluo de ninhidrina b) Em ( 1A ) - 1,0 ml da soluo de Alanina ou Glicina; Em ( 2A ) - 1,0 ml da soluo de Prolina; Em ( 3A ) - 1,0 ml da soluo de Protena; Em ( 4A ) - 1,0 ml da Salina Fisiolgica (NaCl - 0,9%) c) Colocar os tubos em banho 60C durante 5 minutos ou aqueer diretamente em

bico de bunsen, at atingir a colorao esperada. d) Comparar os tubos e anotar os resultados. 2. REAO DE BIURETO (CuSO4 a 5% alcalino) Em 4 tubos de ensaio marcados ( 1B ), ( 2B ), ( 3B ) e ( 4B ), adicionar: a) Nos quatro tubos - 1,0 ml do reagente de biureto b) Em ( 1B ) - 1,0 ml da soluo de Alanina; Em ( 2B ) - 1,0 ml da soluo de Prolina;

Em ( 3B ) - 1,0 ml da soluo de Protenas Em ( 4B ) - 1,0 ml de Salina Fisiolgica c) Agitar e comparar os tubos. d) Anotar os resultados

AULA PRTICA N 02

PROPRIEDADES DAS PROTENAS DESNATURAO E RENATURAO PROTECAS

Objetivos: observar o comportamento da estrutura protica frente a agentes desnaturantes e precipitantes, analisando fenmenos de desnaturao, renaturao e precipitao proticos.

1. DESNATURAO TRMICA Em tubo de centrfuga (1), colocar 2,0 ml da soluo de protenas. Aquecer at fervura (ou no mximo at 10 minutos). Observe se ocorreu alguma modificao. Centrifuge a 500 rpm por 3min. Separe o sobrenadante (se houver), retirando-o com pipeta pasteur ou vertendo o tubo e transferindo a um novo tubo limpo (S1). Adicione soro fisiolgico (2,0 ml) ao precipitado (se houver) e agite. Adicione 1,0mL de biureto no sobrenadante e agite. Anote o que observou.

2. DESNATURAO CIDA Em tubo de centrfuga (1), colocar 2,0 ml da soluo de protenas. Adicionar 1,0 ml de cido tricloroactico (TCA) a 10% (CUIDADO! cido corrosivo). Agite e observe o que ocorre. Centrifuge por 3min, separe o sobrenadante em novo tubo (S2). Faa a reao do biureto no sobrenadante (como no item 2), nesta frao. Ao precipitado, adicione soro fisiolgico (2,0 ml) e anote sua observaes.

3. PRECIPITAO PELO SULFATO DE AMNEO SATURADO (SALTING

OUT) Em tubo de ensaio (3), colocar 2,0 ml de soluo de protenas e 2,0 ml da soluo saturada de sulfato de amnio (SAS). Observe a precipitao. Separe o sobrenadante cuidadosamente, com pipeta pasteur. Ao precipitado, adicionar 2,0 ml de gua destilada e agitar. Caso no ocorra solubilizao, repita a operao, descartando o sobrenadante e adicionando novamente 2,0 ml de gua ao precipitado. Ao sobrenadante, faa o teste do biureto. Anote sua observaes. COMPARAR OS RESULTADOS ENTRE OS TRS PROCESSOS.

AULA PRATICA N 03

FATORES QUE INTERFEREM NUMA REAO ENZIMATICA (Reao com Glicose Oxidase)

Objetivo: analisar, qualitativamente, o papel exercido pelo pH, temperatura e concentrao do substrato numa reao enzimtica. OBS: todos os tubos devem ser agitados aps a colocao dos reagentes. Sempre anote a temperatura. MATERIAL 1. Reagente de Uso (E) : Enzima glicose oxidade e peroxidase em tampo fosfato

pH 7,4 (DO KIT COMERCIAL DE DOSAGEM DE GLICOSE); 2. Substrato (S): Soluo de glicose 50ug/mL; 3. Tampo A (TA): acetato/c. actico 0,5M pH 3,5; 4. Tampo B (TB): fosfato 0,5M pH 7,4 OU GUA DESTILADA 5. Tampo C (TC): borato/c. brico 0,5M pH 10,5 NOTA: A enzima (reagente de uso) deve sempre ser a ltima a ser adicionada em cada tubo. A) INFLUNCIA DO pH

REAGENTES 1 2 3

Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 Ml 1 mL

Tampo A 1 mL - -

Tampo B - 1 mL -

Tampo C - - 1 mL

Substrato (Glicose) 100 L (microlitros) 100 L 100 L

Agite levemente. Coloque em banho-maria 37C por 10 min. Marque o tempo a partir da adio da glicose. Aps 10 min, faa suas observaes e as anote para posterior discusso.

B) INFLUNCIA DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO

REAGENTES 4 5 6 7 8 9

Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Tampo B (fosfato) ou

gua destilada q.s.p.

480 L 450 L 400 L 300 L 200 L -

Substrato (Glicose) 20 L 50 L 100 L 200 L 300 L 500 L

Agite levemente. Coloque em banho-maria 37C por 10 min. Marque o tempo a partir da adio da glicose. Aps 10 min, faa suas observaes e as anote para posterior discusso.

C) INFLUNCIA DA TEMPERATURA

REAGENTES 10 11 12

Reagente de Uso (Enz.) 1 mL 1 mL 1 mL

COLOQUE OS TUBOS NAS SEGUINTES TEMPERATURAS

4C 37C 70C

Adicione apenas o reagente (enz.) nesses tubos (10, 11 e 12) e leve os tubos para os seus respectivos banho-marias. Aguarde 3 min para a enzima atingir a temperatura desejada. Depois disso, adicione 100 L do substrato (glicose) nos tubos.

Substrato (Glicose) 100 L 100 L 100 L

Marque o tempo a partir da adio da glicose. Aps 7 min, faa suas observaes e as anote para posterior discusso.

NOTA: Procure colocar em grficos as observaes colhidas.

AULA PRTICA N 04

IDENTIFICAO DE BIOMOLCULAS CARBOIDRATOS E LIPDEOS

Objetivo:

PROCEDIMENTOS: A) Identificao de Carboidratos

1. Teste de Benedict: Em tubos de ensaio limpos, secos e etiquetado com o nome do carboidrato, pipetar 1ml da soluo de cada carboidrato: 1) gua (controle), 2) amido, 3) glicose, 4) frutose e 5) suco de fruta. Adicionar:

1 ml reativo de Benedict; Ferver durante 1 minuto; Deixar esfriar espontaneamente; Observar/anotar os resultados.

2. Teste de Seliwanoff:

a) Rotular 6 tubos de ensaio com as respectivas amostras: 1) gua (controle), 2) amido, 3) glicose, 4) frutose, 5) suco de fruta. b) Pipetar 1,0 ml de cada uma das amostras no tubo correspondente c) Pipetar 2 ml de reativo de Seliwanoff em todos os tubos d) Ferver, em banho maria, estes tubos de ensaio por cerca de 10 minutos. Observe, minuto a minuto, durante este procedimento, a ocorrncia de possveis alteraes e tire suas concluses.

3. Teste do Iodo (Lugol) Em tubo de ensaio limpo, seco e etiquetado com o nome dos carboidratos do item anterior, colocar: 2,0 ml de soluo de carboidrato; Gotas de iodo (Lugol); Notar o aparecimento da cor azul; Neste caso, aquecer o tubo direto na chama; Resfriar o tubo em gua corrente; Observar/anotar os resultados.

B) Reao de caracterizao de esterides (lipdeos): Em tubo de ensaio limpo e seco, pipetar 0,5 ml de leo animal + 1,0 ml de cido

sulfrico concentrado (CUIDADO). Observar Em tubo de ensaio limpo e seco, pipetar 0,5 ml de leo vegetal + 1,0 ml de cido

sulfrico concentrado (CUIDADO). Observar Em tubo de ensaio limpo e seco, pipetar 0,5 ml de leo mineral + 1,0 ml de cido

sulfrico concentrado (CUIDADO). Observar

AULA PRTICA N: 05

PROCESSO DE FERMENTAO Objetivo: observar o processo de fermentao, diferenciando a fermentao alcolica da lctica. MATERIAL:

- clulas de Sacharomyces cerevisae (Fermento biolgico seco). Pesar 5g/ erlenmeyer

- soluo de sacarose 10% ou glicose 10%

- erlenmeyer de 250ml e bales de borracha

PROCEDIMENTO:

Preparar as amostras conforme tabela abaixo.

Erlenmeyers Sacarose

(ml) Levedura

5 g gua (ml)

Ferver 15min

Resultados obtidos

1 - 5 50 no 2 50 - - no 3 50 5 - no 4 50 5 - sim

Fechar os erlenmeyers com os bales de borracha vedando bem a boca do vidro e agitar

esporadicamente, at completar 30min. Observar e descrever o resultado.

QUESTES:

2. O que voc observou nos erlenmeyers incubados com leveduras?

3. Como voc acha que est a concentrao de glicose no incio e no final do

experimento? Faa um grfico para ilustrar a sua resposta.

4. Quais so os produtos formados pelas leveduras durante este processo de fermentao

que ocorreu nos erlenmeyers?

5. Explique resumidamente a via bioqumica da fermentao da glicose neste processo, evidenciando as principais enzimas envolvidas.