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SILVA
Tese apresentada ao Curso de
graduação em Medicina na
concentração em
Universidade do Rio Grande do
Sul, para obtenção do grau de Doutor.
Orientadores:
Prof. Dr. João Carlos Prolla
Prof. Dr. Peter H. Bartels
Porto Alegre
1999
S586c
Tese defendida em 9 de de 1999. Conceito: A
Vinicius Duval da
de lesões e núcleos celulares por método de assinatura digital I Vinicius Duval da Silva; orient. João Carlos ProBa; co-orient Peter H. Bartels. Porto Alegre
1999. 138 fls. : il. color.
Tese (Doutorado)- Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Faculdade de Medicina. Curso de Pós-graduação em Medicina : Pneumologia.
Carcinoma da 2. Carcinoma com invasão precoce. 3. Lesões pré-neoplásicas. 4. Análise quantitativa :Patologia. L Prolla, João Carlos. II Bartels, Peter H. UI. Título.
NLM: QZ24l
Catalogação: Biblioteca F AMED I HCP A
II
Para meus pais, Paulo Marcos e Eliana
e meu avô, Reverendo e Professor
Nataniel Duval da Silva (in memoriam)
Agradecimentos
Aos orientadores
compartilharem seus conhecimentos e
influências decisivas em formação.
Ao Prof. Rodolfo Montironi, MD,
Patologia Universidade
Bartels e
também pelo torne1cm1en histológico e
estudo.
À
pela camaradagem e suporte em
Aos colegas Prof. David Alberts, Vice-Diretor
e John MD pelas sugestões sobre esse projeto.
Aos Profs. Stein e
Aos Drs.
do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e Maria Isabel A.
meu período de residência médica no HCP A.
e
em
pelo
Aos colegas de residência médica Drs. Luíse Meurer e Rogério M. Chultz.
e
no
Ao Sr. Marco Aurélio da Silva, Secretário do Curso de Pós-graduação em
Medicina: Pneumologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).
E a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para a realização deste
projeto.
IH
Agradeço
Fundação Coordenação
(CAPES), Brasília, pelo apoio
National Health,
de uso de equipamentos e programas computador.
Universidade do Arizona em
em especial:
Sciences
Departamento
graduação em Medicina-Pneumologia e
IV
EUA e seus
do Sul,
Clínicas
e
INTRODUÇÃO, 1.
1.1
l A
nuclear como base
nuclear nas neoplasias
1.3 Quantificação em
Conceitos e história
1.5 Análise
1 Novas
1.7
2.1
E
3.1 Delineamento do estudo,
3.2 População estudada, 4 7.
3.3 Preparação do material, 47.
3.4 Classificação diagnóstica, 48.
a
8.
e
3.5 Sistema de captura de imagens (vídeo fotômetro), 50.
L
3.6 Metodologia de extração de características de textura nuclear, 52.
3.7 Definição dos conjuntos de núcleos estudados, 54.
3.8 Programas de computador, 58.
v
'U.J '-'' u • 71.
DISCUSSÃO, 86.
CONCLUSÕES,
1
e
VI
Tabela I.
Tabela
e subconjuntos
textura
VII
1.
3.
5.
Figura
Figura 11.
Figura
Figura 14.
Figura
um
rato
e e
em
e
a padronização em a
68.
Assinaturas de padrão histológico, 70.
Assinaturas nucleares de individuais da população celular normal e
de lesões, 72
VIII
e
a e
18. Assinaturas
na
com
com
em casos
casos
e
80.
casos e
81.
Figura Assinaturas padrão histológico dos casos
neoplásicas e áreas de 82.
Figura Assinaturas de locais a distâncias
microinvasão, 84.
Figura 26. Glândula com área de microinvasão, 85.
Figura Al. Matriz de co-ocorrência, 1 O 1.
Figura A2. Matriz de comprimento de sequência, 102.
IX
NIP-AG: neoplasia
RMS: root mean C'/H,,rr .. ,u.
RNP:
X
ou
estatísitca
celulares
o
características
padrão e
é um
e
(assinaturas digitais) e
quantificação do grau de
interesse em relação à população
para
áreas de tecido
de células e
(distância padronizada
e
ser
de
Tal método, que pode ser utilizado sem restrições em qualquer material
colhido e preparado por técnicas convencionais para estudo citológico ou histológico
demonstrou sensibilidade para detectar alterações subvisuais na textura da cromatina de
células aparentemente normais, próximas de lesões pré-neoplásicas e neoplasías malignas.
Tais potencialidades podem aumentar a sensibilidade diagnóstica dos métodos de
investigação baseados nesse tipo de material.
XI
is a ... ~."~'"''
microscopy. It is
to
to
to
a set
a
texture
manner
means
at
texture
were
to ali
sampled by biopsy, exfoliative and aspirative techniques. The digital are
also capable detecting subtle changes chromatin pattern of normal appearing
at the vicinity of precursor lesíons and carcinomas. Such potential may have a
impact on the sensitivity of methods based on citologic and histologic studies.
XII
Alterações
fundamentais na
isolado para diagnóstico
Alterações em
cromatina e
núcleos
1.1A
estrutura
como
pesquisa sobre as propriedades
ou
e
a
do genoma tem avançado rapidamente nos últimos anos, como conseqüência dos progressos
da genética e biologia molecular(l ). Apesar de todos os avanços, a compreensão
arquitetura do núcleo celular e organização do genoma ainda é muito limitada.
pouco tempo os conceitos relacionados ao núcleo celular eram derivados dos estudos
microscopia óptica convencional realizados a partir do final do século XIX, responsáveis
por uma concepção reducionista dessa organela. De acordo com o modelo baseado na
microscopia óptica, o núcleo seria composto por três elementos: a cromatina, que na
verdade corresponderia apenas à heterocromatina visualizada pelas técnicas então
e o ou à
se tratasse um ou
a ser
a
entre a
o termo
é conecta as
e outros
8), composta
própria do núcleo. filamentos em
intermediários do citoesqueleto. figura 1 exibe o modelo atual do núcleo ....,...,,,._..,"'' com suas
organelas e a figura 2 mostra fotomicrografias microscopia eletrônica
utilizando coloração com
envelope nuclear
ribo.ssoma
poro nuclear
membrana nucle--ar
nudea.r interna
lâmina nuclear
nucléolo
matriz in situ
de
1. Modelo esquemático
envelope nuclear constituído por
encontrados na superfície da
polissomos.
hctcrocromatina
um
regiões compostas por cromatina condensada (heterocromatina) e
regiões não-cromatínicas do núcleo o
matriz nuclear in situ, formando uma difusa
é
poros nucleares. lâmina nuclear pode ser considerada um componente
matriz nuclear, sendo conectada a porções
desenho de Buchholtz
um
em
e a
4
Figura Fotomicrografia eletrônica de seção ultrafina, comparando cortes
de rato corados por acetato de e '-'H'6-'HJllJV e por coloração reg~re~;snra u'""'"'uucu em
que cora palidamente a cro~m::ltlrta mas mantém o contraste outras
especialmente as que contém ribonucleoproteínas. Podem ser
a cromatina condensada ou heterocromatina e a da
notável a similaridade na estrutura da matriz isolada e situ, que demonstra o elevado
de organização tridimensional do núcleo celular. 2A. Hepatócito com coloração padrão.
Hepatócito corado por Matriz nuclear isolada corada por coloração padrão.
Matriz nuclear isolada e corada por Modificado de et aL (2). 22.000 X.
É
estendendo-se até a
cromatina densa existem as chamadas regiões intercromatínicas,
e a matriz nuclear, o que sugere uma associação potencial entre a replicação e
cromatina e os componentes da matriz nuclear (1 0). Um crescente
demonstra que o metabolismo dos ácidos nucléicos está distribuído em
núcleo, os domínios estruturais (11-13), com seus processos catalíticos
elementos bioquímicos que os suportam (1), como pode ser visto nas
menos dois domínios estruturais são postulados na matriz nuclear
cromatina e os de ribonucleoproteínas (RNP). domínios de cromatina
pontos de ancoragem das duplas hélices de sendo
transcrição do DNA(ll, e os domínios
processamento e transporte de RNA. O após a sua
ou
periferia nuclear ( 1 17), o a atuação da
coordenação de rumo aos
seu
as
A nuclear é o elemento com composição
5
e os
e
ao
rumo à
diretamente relacionada ao fenótipo da célula. A composição protéica da matriz
depende do estado de diferenciação celular e varia entre diferentes tipos celulares (18-20),
bem como ao longo dos estágios de desenvolvimento celular na vida fetal (21 ). Essa
característica fornece evidências de que a matriz nuclear participa da regulação e
coordenação da expressão do fenótipo celular (1, 11) já que o padrão de expressão
fenotípica parece ser determinado principalmente durante a transcrição do DNA, embora
alguns outros mecanismos alternativos tenham sido descritos (22, 23).
6
Figura Organização espacial nuclear em hepatócitos de rato. um
núcleo in no tecido hepático, onde se pode observar o envelope uu•vlvcu
(N), cromatina perinucleolar condensada e
3B mostra uma mesmo
A fração U'-''""''"'""' observada no núcleo
intercromatínicas
intercromatínicos (gi) e material fibroso menos denso (f). A linha descontínua na
delimita um agrupamento de grânulos intercromatínicos. Modificado de
(24). 40.000
Figura figura 4A é uma fotomicrografia
componentes da estrutura interna da
torno NR e indicados
perinucleolar e periférica respectivamente. 21.000
protéico da matriz nuclear em maior aumento, em uma
a
em
ENR. As quatro flechas escuras apontam os vestígios de um poro nuclear da ENR. Algumas
regiões da estrutura da matriz (linha descontínua) são semelhantes a agrupamentos de
grânulos intercromatínicos como os observados na figura 3. Modificado de Berezney e
Coffey (24). 50.000 X.
8
1 nas
As alterações do e
acompanham a malignidade envolvem na
modificações estruturais, embora significado diagnóstico
compreendidas em profundidade. Nos últimos anos, "'"" ...... v bioquímicos tem
apt·est;ntam proteínas da ....... .,."'''u ausentes no
em mama
no tecido correspondente. E as restrições relacionadas à '"'""·v, .. v•v"'''"'"
maior parte dos trabalhos e
detalhados para que se
"'"''"''""' <Lcuurs•u•" ou são produtos
preserltes no tecido E a
correspondam a um processo de regressão da
diferenciação celular também deve ser considerada.
Foi a análise de imagem computadorizada que permitiu avanços no estudo da matriz nuclear
através da análise multidimensional dos domínios estruturais e, em conjunto com a biologia
molecular, está inaugurando uma nova área de investigação: a morfologia molecular do
genoma (2). Porém, encontrando justificativa teórica na organização nuclear a nível
ultraestrutural e mais próximos dos procedimentos rotineiros dos laboratórios de patologia
cirúrgica e citopatologia estão os métodos de quantificação por análise de imagem baseados
em e
neste trabalho.
1 em
e a
descortina novos
de e
é a base a
sobre tamanho e forma do núcleo, distribuição da cromatina, relação de
citoplasma, lUVvHê>lU(.tU'-' e ne>.nr<:l'A
centenas de outras """'C>"'r"'"'
para
5
e
Os objetivos principais da quantificação em patologia, seja
citopatologia são: acrescentar objetividade na avaliação de casos e utilizar métodos
9
somente
ou
de aumentar as capacidades diagnóstica, prognóstica e, possivelmente, terapêutica(35).
Mensurar é um procedimento científico básico e é tão antigo em microscopia que sua
primeira utilização remonta à invenção do microscópio. Antoni van
determinou o tamanho dos eritrócitos humanos em 1674 (36).
A Resolução espacial: 873 X 595 pixels Resolução espectral: 16 milhões de cores
C. Resolução espacial: 873 X 595 pixels Resolução espectral: 256 tons de cinza
5. Dois são para
D. Resolução espacial: 873 X 595 pixe!s Resolução espectral: 256 cores (8 bits)
de
espacial e resolução espectral. A resolução o número
(pixels) que compõem a imagem. Quanto mais elementos de por
espacial. As figuras 5A, se e 5D originalmente, resoluções espaciais de 873
o
por 595 pixels verticais. A imagem 5B possui 90 X 72 pixels. Cada quadrado com a mesma cor
representa um elemento de imagem. A resolução espectral diz respeito ao número de tonalidades ou
cores exibidas pela imagem. O número de bits que define o espectro de cores ou tonalidades de cada
elemento de imagem determina o número total de cores possíveis. Uma imagem com 256 tons de
cinza ou 256 cores tem uma resolução espectral 8
código binário, onde bit só pode ter valores a zero ou um, existem 256 combinações
possíveis utilizando-se 8 bits, pois 28 = 256). As imagens 5A e 5B tem resoluções espectrais de 24
bits, ou 16 milhões de cores (224 = 16.777 .216). As imagens se e 5D possuem 256 tons de cinza e
256 cores, respectivamente. Foto original: Montezuma National Monument, Arizona, EUA.
de
procedimentos.
em patologia são um extenso 'v.:li.UU.V !J.''-'"C'VU
de em 1
primeiros parâmetros estudos
tem a
em
aparência normal mas
através do uso de parâmetros
aparência normal baseia-se em cm·ac1ten
percepção visual 45).
a possibilidade de
análise de imagem, deslocando a busca eventos raros como e
neoplásicas, o que poderia tornar a taxa falsos negativos testes
estatísticos baseados em
como por exemplo as células intermediárias nos espécimes citopatológicos
no padrão de
também em lesões colônicas (46), tireoidianas (44) e prostáticas (40, 42). Na cérvice uterina
essas alterações foram encontradas na proximidade das lesões, a distâncias inferiores a um
milímetro. Já na tíreóide, tais alterações foram encontradas no tecido aparentemente normal
a distâncias variáveis da lesão. No cólon foram demonstradas alterações detectáveis a até
cinco centímetros da lesão.
amostras e como
outras.
o aumento na
1
a
sutis
através dessas "'"''"''U'""'"'
rigorosos testes hipótese, a
adequado de experimentos pode detectar mascaradas
como a variabilidade de um paciente para outro (55, 56).
3
e e
e à o
em esses outros
ser como a estruturas
e
a
obtenção
quantitativas sobre características geométricas com sistemas de testes de dimensão menor
que o objeto ou estrutura estudados. Por exemplo, um método baseado em VVJlU'-'"""''"'
grade bidimensional pode ser utilizado para avaliação de volume de estruturas
tridimensionais como vilosidades intestinais. Nesse conceito a estereologia
técnicas de extrapolação de dados a partir de uma ou duas dimensões (59-61).
ou no
estruturas.
é a
termo
para
fisiologia teciduais seus tais estudos
mensuração
áreas totais
áreas em seções histológicas, mas também a avaliação
superfície. Essas estimativas forneciam a informação necessária
4
entre
e
a
desenhos realizados através de técnicas manua1s. Tais desenhos eram transferidos para
moldes de metal que eram posteriormente recortados e medidos, com isso obtendo-se
estimativas de volume e massa. As reconstruções tridimensionais eram finalmente
realizadas em modelos de madeira (59). Toda essa metodologia, além de lenta e cara era
muito tediosa, sendo substituída gradualmente pelos métodos estereológicos. Hoje, as
avaliações tridimensionais de preparados histológicos derivam quase exclusivamente da
5
e a é em e
nos
e
HU.LvVU 0
tamanho uvJLH"'"''-'
a
um ramo
uso em o
estudo da estrutura metais, quando o .. L-. ..... L,,V
a superfície de um meteorito (68). O foi o
pesquisador a realizar análise microscópica quantitativa, provando que, em seções
transversais de agregados minerais a ocupada por cada
Em 1943 o fisiologista Chalkley (70) avançou o potencial da metodologia para aplicações
nas ciências biológicas, permitindo a observação simultânea e contagem de múltiplos
objetos de interesse, tais como células e vasos sangüíneos. Essa técnica é usada hoje com a
6
o a a
é
a
na
na
esse
com o
a a
e 6
Microfotornetria
A microfotometria se desenvolveu de maneua menos ordenada do que a
morfometria e suas aplicações na microscopia. A luz que passa através de um espécime
histológico ou citológico é absorvida de forma seletiva por um corante (ou cromóforo) em
um comprimento de onda luminosa correspondente à cor complementar desse corante. Por
a cor 1) é
entre a
da
corante entre a
à
I
o lo a
de como:
=E. c. L
Onde A é o valor de absorbância, E é a constante que expressa o
de densidade óptica por mili-mol do corante utilizado, C é a concentração de corante
expressa em mili-mols por centímetro cúbico e L é a "'"'''"'""'' do corte em
centímetros(72). Baseada nessas equações a extinção, termo hoje substituído densidade
óptica, foi definida e relacionada à concentração e espessura do material absorvente por
Bunsen e Roscoe em 1862 (73). As descobertas desses pesquisadores encontraram
8
em como a
e tornaram-se e1eme:ntcls na a
uma
ser como
nas
trouxeram a
com esse aumentar a
ao a a
absorção de nessa usou a
mesma
celulares do tecido muscular.
a técnica no estudo de células tumorais (79). Ele concebeu também a idéia
avaliação da cromatina através de um microfotômetro (80). Provavelmente esse foi o
primeiro pesquisador a utilizar a microfotometria em material citológico.
Em 1932, Caspersson (81-83) criou as bases a
quantitativa estudando as propriedades absortivas dos colóides e géis como modelos de
constituintes celulares. Esses trabalhos permitiram aplicar técnicas de fotometria a pequenas
regiões de imagens celulares. Em sua tese de doutorado, Caspersson demonstrou as
era
aumento do
constante.
ultravioleta e u"''""'u.•v
o
em
o
a
Os instrumentos
9
o
o
é
mensuração de corrente a
apresentar custos razoáveis no final da década de 40. Isso permitiu a Pollister (88) criar o
primeiro microfotômetro em 1948: um microscópio óptico convencional com abertura
ocular adequada para mensurações em áreas definidas, acoplado a um e um
galvanômetro para leitura da corrente elétrica gerada. Ris (89) foi possivelmente o primeiro
pesquisador a estimar o conteúdo total de DNA celular baseado na reação de Feulgen,
também em 1948. Em 1950 Swift (90) demonstrou claramente a duplicação do conteúdo de
antes uma
o
distribuído remotamente
homogênea, o traz limitações às
vem a ser a
uso
o
e em 1 extensos
oncologia, especialmente do carcinoma de colo
Até 1966 os microfotômetros geravam apenas smms analógicos.
capacidade de converter sma1s analógicos para o formato digital tornou
representação de imagens ópticas como
trouxe a mudança fundamental na
imagem digitais.
de valores de densidade o
o começo da videomicroscopia e da análise
as
a
a
1 Análise
consiste no uso de
informação relacionada a características da
perímetros, áreas, densidades ópticas e outras (96). processo
ser dividido em vários estágios:
aquisição e transcrição
processamento
segmentação;
extração características
análise de características;
classificação.
e
21
como
análise
e
aquisição de imagens
(Charge Coupled Devices),
microscopia e outros rnews corno scanners
conversores
espaço em
na figura 5. Os conversores
conversor
várias origens para o digital, corno sons nos (Compact
nos sistemas de telefonia contemporâneos e
Processamento de imagem
ou
e outros
no
nos
Urna imagem digital pode necessitar de processamento, que pode corrigir ou
rnm1rn1zar problemas relacionados à iluminação e óptica do microscópio. Esta etapa
permite a extração de informação com ou sem redução de dados. A literatura dedicada a
procedimentos de processamento de imagem é ampla (97-99) e inclui:
correção de imagem: permite reduzir ou eliminar defeitos de iluminação da
Imagem que possam ter sido originados por imperfeições no dispositivo detector
manipulação
seja: delinear
segmentação pode ser
a.
tedioso;
ser
o objeto ou
de
b. pode ser feita de forma
o ser extremamente
computador faça a seleção preliminar dos objetos com base em
como forma ou tonalidade e permitindo a seleção e correções finais
observador;
ou
e
o
c. de forma inteiramente automática pelo computador, através de
critérios morfológicos ou através de métodos de automação de inteligência,
que permitem à máquina incorporar e utilizar os critérios de seleção de um
observador e podem ainda oferecer ao sistema a capacidade de aprendizado
para desenvolver novas soluções de segmentação. Dois métodos tem sido
esses os
de
o restante
operação é vezes nos
e
é
geométricas, como áreas e e relacionadas à textura
Apêndice). programas começam a ficar comuns e podem ser
em versões gratuitas na Internet (1 00) Tais versões usualmente extraem
características morfométricas.
e as
na
ou
ii···
e
em
compatíveis com a
Redmond,
outros
baseados em testes 01, 102).
em
diferentes um como a
densidade óptica total do núcleo, desvio padrão dos valores ou a
freqüência relativa de valores de densidade óptica em faixas. características
não são percebidas pela visão humana, que não é sensível a variações sutis de densidade
óptica. Além de estatística descritiva, as imagens digitais oferecem informações que podem
ser consideravelmente específicas na caracterização de um núcleo celular.
A análise de imagem digital deslocou o foco de pesquisa da citoquímíca
quantitativa para a extração de informação diagnóstica de forma quase acidental. As
questões que envolvem o uso da morfometria e fotometria estão relacionadas a dimensões
físicas, composição química, citoquímica e histoquímica. Mas a análise de imagem digital
r>· ,,IY,,
estruturas e
tem
esforços no
foram definidas. E novos
informação
procedimentos
somente
e análise
multi dimensionais características tornaram-se comuns.
Condições a utilização e
A descrição das etapas da análise de imagem na maior parte da
ressalta um dos grandes problemas envolvidos no processo: a coneta identificação de
objetos em estudo. Procedimentos baseados em tonalidades e áreas muitas vezes não são
suficientes para diferenciar uma célula neoplásica de um linfócito maduro. problema é
multidisciplinar e outros exemplos podem ser utilizados. Automóveis e aviões já conseguem
realizar procedimentos de navegação e aterrissagem totalmente automatizados através de
sistemas de visão computacional e inteligência artificial em virtualmente qualquer situação,
incluindo respostas autônomas a imprevistos e capacidade de aprendizado(lll). É
tais
e classificação objetos como
identificação de uual>','vu•
estruturas histológicas de
representadas tem
ser
torna-se
como no caso
o número componentes básicos a serem
citoplasma e núcleo. Por esse motivo, a
teciduaís apresenta enormes uu!vu,lu,<u""·
histológicos tem as informações
é
parte dos
programas segmentação de imagem interativa e automatizada
de características teciduais viáveL
o
tornou a
ao
as
mas
cortes
em cortes
informações prévias torna-se essencial. informação tem origem em outras fontes,
como bancos de imagens e soluções previamente utilizadas e não na imagem que está sendo
estudada. A segmentação de imagem pode ser guiada por sistemas especialistas (112).
Sistemas especialistas são programas de computador desenhados para substituir ou
reproduzir os métodos de raciocínio de um especialista humano(ll3). A figura 6 mostra um
computador cada
modelos histológicos corretamente ""'''"""'·~'"''"""'""'
e resolução da imagem estudada, vários
programa de computador. O sistema
exemplo da figura 6 foi desenvolvido no
Arizona em Tucson(114).
procedimentos mais adequados para
é uma
dados citométricos e histométricos como distribuição e cuu.u.utuv
extraídos. Os sistemas que possuem esse
conhecidos como sistemas de
a
detecção de linfócitos binucleados (11
processador para
o
ser
na
os
antes
(11
definido um produto intermediário (em azul), definido
como paredes glandulares compartilhadas.
B. Após o segundo procedimento de segmentação, são
obtidos três objetos. Em verde e amarelo estão dois
C O terceiro procedimento de segmentação determina
os limites para os novos segmentos individuais de
glândulas, em azul e laranja.
Figura 6. Exemplo de segmentação guiada por conhecimento, método que pode ser
aplicado a diferentes tecidos como, nesse exemplo, uma biópsia de cólon. Todo o
procedimento é realizado pelo sistema especialista sem intervenção do observador, que ao
final do procedimento poderá aceitar ou descartar os produtos e retroalimentar o sistema
para aprimorar futuras operações. Hematoxilina e eosina, X 20. Imagem em 256 tonalidades
de cinza. Segmentação em 256 cores. Modificado de Hamilton et al. (117)
Nesse mesmo período, outra
Cytoanalyser da Universidade da Pennsylvania, foi convertido o sistema
( 18), produzindo imagens de alta resolução de leucócitos. Nas primeiras publicações desse
foi demonstrada a possibilidade de os sistemas digitais poderiam ao
desenvolvimento de sistemas com capacidades de reconhecimento potencialmente
superiores à humana (119, 120).
Em 1968, o projeto TICAS (Taxonomic intra-cellular analytic system) (1
passos
Imagens de culturas de tecido pulmonar embrionário e carcinomas
sem o uso de colorações foram capturadas por um microscópio UMSPl.
mostraram uma taxa elevada de caracterização correta do material baseada nos nqnrr'"'"
distribuição espacial da cromatina. Estudos adicionais passaram a recomendar o uso
imagens digitais para estudos objetivos da cromatina (122) e demonstraram
pronunciadas entre células de tipos histológicos diferentes.
A quantificação e a capacidade de comparar e avaliar estruturas de dados
trouxe novos desafios, como o questionamento sobre a verdade em diagnósticos
anatomopatológicos, já que todos os métodos de treinamento de sistemas computacionais
foram baseados em diagnósticos visuais. A literatura apresenta vários algoritmos para
abordagem desta questão, a maioria deles oriunda da área de reconhecimento de padrões
(123-130).
As operações de aprendizado automatizado alcançaram elevado nível de
complexidade. No sistema TICAS, um programa de treinamento automatizado era capaz de
31
"'""'""v~· um esquema de classií1cação 25 categorias de e
de 15000 imagens de citopatologia cervical nas coleções de treinamento (131, 132).
também demonstrado que uma relação estequiométrica entre a quantidade de corante e o
substrato por ele corado não era necessária(l33). Métodos de coloração capazes de
resultados constantes e reproduzíveis permitiriam a utilização de mensurações de textura
nuclear. Porém artefatos de fixação e coloração, ausência de procedimentos controle de
qualidade e até mesmo a caracterização precisa da composição
obstáculos no caminho da da metodologia. Já a captura
apresentado avanços 1936, os de
eram baseados em fotografias, onde mensurações pequenas regiões eram
manualmente, com procedimentos de calibração extremamente tediosos e lentos.
etapa, horas adicionais eram necessárias para os cálculos, empregando-se réguas
e tabelas de logaritmos. 1964 a empresa ofereceu o primeiro sistema
UMSPl (134).
permitia a velocidade de captura de 15 elementos de imagem por segundo.
imagens é apenas a primeira etapa do processo e a tecnologia de
essa
cálculo
sistema
captura de
permite a captura de vários milhões de pixels por segundo a preços cada vez mms
competitivos. A tendência atual é a integração dos elementos de captura, conhecidos como
CCDs (Charge Coupled Devices), ao dispositivo conversor de sinais analógicos em digitais
(conversor A/D) em um mesmo componente, denominado câmara digitaL Novas
tecnologias na fabricação de circuitos integrados permitirão a redução ainda mais acentuada
de custos. Sistemas automatizados dependem basicamente da capacidade de processamento
de dados, que deve ser elevada o suficiente para permitir a implementação desses sistemas
de maneira realmente efetiva e economicamente viável em laboratórios de patologia. Os
avanços no processamento de dados nas últimas décadas tem sido impressionantes. Quando
os primeiros computadores laboratoriais
microscópio UMSPl da
limitada a 100 elementos 1magem
como o
a velocidade
As estações de
permitem processar 1012 a 1013 elementos de HHU!5'~HL ou
mais importante, computadores pessoais de arquitetura compatível com o
8 ao
(lnternational Business Machines Corp. -Personal Computer), equipados com placas de
captura de imagem são capazes
custos inferiores a dois
tarefas processamento e análise
de 4 cm2 em uma lâmina e resoluções
processar 109 elementos
poder de prclce!~swmento
4 elementos Imagem por
áreas muito menores podem necessitar grandes capacidades de processamento,
correção e segmentação de centenas ou milhares de arquivos de uuur;,•.nu.
Para tais aplicações, sistemas com
1
em
a
de
imagens guiada por conhecimento (knowledge-guided systems) se tornam essenciais. em
tais sistemas, as capacidades elevadas de processamento são muito vantajosas. Um protótipo
existente na Universidade do Arizona requer um bilhão de instruções por arquivo de
imagem para segmentar corretamente um corte histológico de tecido prostático, sob a
orientação de um sistema especialista (expert system). O desempenho desse sistema é
bastante elevado. Em imagens de lesões bem diferenciadas com uma média de 35000
núcleos, diferenças significativas entre a segmentação realizada manualmente e pelo sistema
especialista não ocorreraJm em mais de 3 % dos núcleos (135). Isso demonstra que a
segmentação de imagens pode ser realizada com grande eficiência por sistemas
especialistas, derivação
na avaliação exaustiva de conjuntos
futuro, atingir desempenho superiores à avaliação visual
(136).
Como já foi discutido, o problema
áreas de interesse avaliação """''~vuuHJ''"'"' nas 1magens.
tanto com relação a métodos como a
patologia, esse
A questão envolvendo o uso de computadores
tem sido muito provocativa e determinado fortes reações
praticantes da chamada arte da patologia. O VV""'"~'"''""'"'u"v
ser
território onde a observação é
informações visuais. final da
33
no
um
em
em
e
um
a as
possibilidades da aplicação de computadores na automação da citopatologia da cérvice
uterina para o rastreamento do câncer de colo uterino.
1.6 Novas
ciência da a e
procedimentos e decisões baseados em dados, que podem ser ucu"'"''
existir em forma lingüística, sendo
características tornam essa nova
diagnóstico em
atualizados em
podem ser
processamento de dados podem ser reproduzidos, o
sistemas capazes de decisões diagnósticas.
adequada na
permite o
pode ser 'vV.UC:HUv.lW.,U uma
Assim como energia é definida OP1eraciCma1mem:e como a capacidade de
informação pode ser definida como a capacidade de organizar um
ou
à
conceito é uma tentativa de abordar fenômenos estudados por múltiplas áreas da
como por exemplo a estrutura subatômica, o DNA, oncologia, astrofísica, a mente humana e
seus produtos como a linguagem, dentre muitos outros. Todos esses fenômenos mostram
ordem em maior ou menor grau, sem excluir a existência de sistemas complexos e sistemas
caóticos.
Qual é a necessidade de uma teoria, ou como alguns já postulam, uma ciência
da informação? Até os anos 50, não havia a necessidade de um conceito de informação. Mas
o advento dos sistemas de telefonia em escala mundial e, depois, das redes de computadores
tornaram
tornaram
1953, quando e
em outras
uma
começaram a
exemplos mais impressionantes de uma estrutura
maciças de informação. O é uma demonstração da
como a
Hoje, laboratórios em vários o maLpe,amem:o
bases do genoma humano, uma que se torna
distribuição da
densidade óptica refletem, em sua
específica, que encontra suporte no
densidade óptica com outras
estrutura de dependência dos dados a
1
uma estrutura
da cromatina e
denominada textura e o estado funcional da célula. Exemplos mais simples
dependência podem ser encontrados na linguagem e música escritas. Cada linguagem
3
e a
é caracterizada por ocorrências concomitantes, denominadas co-ocorrências específicas
símbolos, como o "nha" e "lha" em português, o "th" em inglês e o trigrama em
espanhol. A figura 7 mostra um exemplo simples e dramático de modificação estrutura
de dependência.
36
A
B
Figura A informação contida na figura 8A codifica a abertura célebre Quinta UHUV'H""
em Dó menor de Beethoven. tem exatamente a mesma
informação que mas com a notas o
modificação
e Bem
uma mesma categoria, já que a quantidade de informação é idêntica nas duas
Uma imagem digital com seus valores de densidade óptica é um
bidímensional da linguagem escrita, onde tais valores podem ser considerados símbolos
diferentes. Núcleos em estados funcionais diversos são caracterizados por estruturas de
dependência de densidade óptica diferentes.
O histograma de valores de densidade óptica é uma representação estatística
dita de primeira ordem: ela apenas expressa o número de elementos de imagem na mesma
faixa de densidade óptica e considera essas ocorrências como independentes. Matrizes de
co-ocorrência são representações estatísticas de segunda ordem, que consideram a
freqüência relativa da co-ocorrência de valores de densidade óptica de diferentes faixas, que
podem ser considerados diferentes símbolos ou letras. É importante observar que as
de co-ocorrência avaliar de dependência em
direções de uma imagem digital. Se a análise a
determinada substância em um tecido, a análise de imagem
e distribuição de determinadas no núcleo
A avaliação microscópica cortes histológicos e esfregaços celulares é
baseada na experiência diagnóstica do patologista. O sucesso do método
integração de imagens disponíveis na
histológicos e de etiopatogenia,
visual do observador,
dados
complementares e possíveis efeitos de intervenções
Baseada nesse método, a patologia alcançou elevado de
exames
outros
e
diagnósticos adequados na maioria das situações. das limitações da patologia é
conhecimento se desenvolve e existe em indivíduos, sendo de difícil
e
o
outros especialistas. envolvidos na
avaliação diagnóstica é difícil e parte do conhecimento diagnóstico envolvido muitas vezes
tem descrição complexa e pouco compreensível. Além disso,
dedutivo podem não possuir explicação lógica (140), sendo baseados na experiência
pessoal. Todas essas características evidenciam a natureza subjetiva do processo de "'"''"~'"'<'"
diagnóstica.
A patologia é uma dentre várias especialidades cuja complexidade desafia a
ciência da informação, uma área que está em seus estágios iniciais de desenvolvimento,
assim como os sistemas de processamento de informação com capacidade de
"compreensão". Compreender em patologia é um processo que vai muito além da
informação oferecida por cortes histológicos e imagens microscópicas. É necessário integrar
a informação que possa ser ue<Jl<"-"<<uu no processo "'v''"""~
e ainda a informação necessária para
imagem microscópica.
realizado
38
seres
A necessidade de integrar grandes coleções de dados a uma
diagnóstica específica e desenvolver um procedimento inferencial capaz de tomar decisões é
um grande desafio. Isso requer uma definição completa de todas as ... "' 1'"''""''"'""'"'' .... " ""-"""'"'"'
entre os elementos da informação disponível. O
o em
Praticamente todo o conhecimento tradicional em patologia na
conceitos, sejam imagéticos, termos descritivos ou
numérico.
descrito acima, alguns conceitos podem ser traduzidos em tal formato. Mas, para que a
é
que outras informações não disponíveis fonnato numérico devem ser utilizadas. Sistemas
diagnósticos devem processar e utilizar essas informações na tomada de decisões.
Em engenharia de automação, diz-se que: "todos procedimentos que podem
ser realizados por uma máquina podem ser realizados de forma ainda mais eficiente por
outra máquina". Em patologia, surgem importantes questões diretamente relacionadas a
procedimentos realizáveis por uma máquina, tais como:
espécime?
em sua
nunca antes
o ser uma
Os processos vvJlHU'""'"
totalmente compreendidos?
Serão a forma
Será a ciência da informação
no
a aumentar a
percepção fenômenos?
Quantificar em patologia envolve
associado a dados numéricos. fato, em grande
conceitos histopatológicos COlTespondem
expressas em números. área de um
quadrados. Tais
3
um
novos
e
o é
situações, e
e
a
uma população de referência e classificados como normais ou compatíveis com
macronucleose, por exemplo. Outros conceitos em patologia, como células indiferenciadas,
também podem ser expressos em formato numérico, dependendo da avaliação de diferentes
como aleatoriedade da disposição
em um tecido, área nuclear e padrão de disposição de cromatina. Um dos grandes desafios
da patologia quantitativa é a definição de tais "transformações numéricas" interpretativas
(112), onde dados numéricos são traduzidos em conceitos diagnósticos descritivos por
algoritmos precisamente definidos.
podem adicionar
dados ( 14 Essa estrutura
com características inesperadas.
mudanças, pois as características de
encontrados em células ... ~ .. o···-~
a evolução da teoria
em termos
focal ou marcado. Os """""u'""
em algumas situações baseadas em
distância entre termos descritivos, ou
Uma variação dos sistemas
dos dados
a
numéricos ou
dados V0•>V.,CVUUU!VH
são as chamadas redes
fornecendo o resultado como a probabilidade diferentes alternativas
149, 150). Ainda, a maior das relacionadas a
numérica multivariada pode ser solucionada da utilização métodos
a
36,
baseado em casos (151). No método de raciocínio baseado em casos, a quantificação é
utilizada na avaliação prognóstica específica do paciente, baseada em medidas
similaridade e distâncias de casos precedentes.
Existem amplas evidências de que a quantificação pode extrair informação
diagnóstica e prognóstica adicional. O sucesso da avaliação visual na maioria das situações
provoca resistência em aceitar que tal método não produz níveis elevados de
reprodutibilidade em todas as situações. Uma das justificativas para o estudo das aplicações
41
da quantificação em patologia é aumentar a
prognóstica, o é reforçado pelo número considerável de trabalhos na literatura que
avaliam a dificuldade em se obter consenso diagnóstico mesmo entre
experimentados para uma grande variedade de situações na patologia (58). Rosai (1
publicou um trabalho mostrando um baixo de consenso diagnóstico em
benignas de mama. Os métodos quantitativos serão mais valiosos em tais
caracterizadas pela correção diagnóstica de difícil estabelecimento.
aplicação de métodos baseados na informação em formatos não a-.nuv•
para o manejo da incerteza em sistemas diagnósticos tem sido desenvolvidos
metodologia empregada nos sistemas especialistas tem sido adaptada para o uso
classificações descritivas. Sistemas baseados no teorema de Bayes (154) tem sido
a
em de maneira a estrutura de
dependência condicional permaneça intacta, o que permite a utilização de computadores
(150).
Claramente a pesquisa na área de patologia quantitativa está iniciando uma
fase onde o conhecimento histopatológico está sendo integrado ao processo de tomada de
decisões. A aplicação dessas novas tecnologias torna mais evidentes os problemas de
comunicação entre diferentes áreas. Os métodos disponíveis para análise de imagens
microscópicas tem suas origens em áreas como a estatística, desenho experimental,
morfologia matemática, álgebra, sistemas especialistas, gerenciamento de dados, manejo da
incerteza, teoria de conjuntos difusos (juzzy set theory) e muitos outros. Cada uma dessas
áreas desenvolveu seus próprios termos técnicos. Para a patologia tais métodos são
ferramentas, e as utilizadas nessas áreas são, em sua
completamente desconhecidas para o patologista. possibilidades
podem ser corretamente exploradas através de uma abordagem HH-HU''"'
de informações entre diferentes especialistas. Representações adequadas do
histopatológico são necessárias. A complexidade de sistemas como
tecidos, órgãos ou pacientes é muito grande e sempre crescente.
fenômenos em biologia e patologia começa a
áreas como a Física, como os complexos.
1.7 Sistemas complexos
Um novo ramo multidisciplinar procura demonstrar o
com troca
celulares,
a
é
do que o somatório de seus constituintes. em um cosmos
caótico foi dado o nome de ciência da complexidade, que começa a ser integrada com a
ciência da informação. Sistemas complexos tem duas características fundamentais: a
irreversibilidade e a ausência de linearidade. A irreversibilidade implíca na existência de um
meio onde os eventos acontecem em apenas uma direção. Esse meio é o tempo. A
irreversibilidade é observada com facilidade a nível macroscópico, onde a passagem do
tempo pode ser percebida sem dificuldades em eventos como o envelhecimento da pele.
Mas as leis do movimento utilizadas para descrever o comportamento da matéria a nível
microscópico não distinguem uma direção do tempo da outra. Embora a irreversibilidade
pareça um fenômeno óbvio, só em 1998 foi demonstrada pela primeira vez a
irreversibilidade do tempo a nível microscópico (155, 156).
lineares tem sido o ciência
regras simples de adição. Uma torneira com de água constante do
volume no dobro do tempo. Basta comparar esse com os
fenômenos não-lineares que regulam a quantidade de água no corpo humano. não-
linearidade causa alterações mínimas em um
imensas modificações no mesmo e em outros
do sistema que podem
fenômeno
resultados complexos e inesperados. e
fenômenos em as
Biologia foi antecipada pesquisadores outras
Schrodinger em 1943(157). Mas foi o advento computador nas
últimas décadas que permitiram tornar questões
complexos. Problemas como a determinação das variações
seqüência de descargas a ser
com sucesso a partir dos conceitos de complexidade e com o desenvolvimento modelos
computacionais. O genoma humano, com seus bilhões de pares bases é outro
exemplo de sistema complexo, e a compreensão do funcionamento de tal repositório
informação incluirá métodos de análise desenhados para tais sistemas. A oncologia
molecular é a explicação unificadora para o câncer(l58), mas também deve ser
compreendida como o estudo de um sistema não-linear, caracterizado por múltiplos
mecanismos de retroalimentação.
Sistemas complexos não podem ser caracterizados por conceitos precisos,
conforme a descrição de Zadeh (159): "à medida em que a complexidade aumenta,
conceitos precisos perdem significado e conceitos significativos perdem precisão". Esse é o
embasamento
sistemas
Exemplos típicos
pronunciado, moderado, severo, focal,
de termos vagos não impede
Obviamente termos como
qualquer situação de maneira
vagos resulta
anatomopatológicas.
Este trabalho
a o
significado os termos como:
o uso
não são prec1sos o para
seu uso em conjunto com outros termos
altamente
a patologia com a e a
para '"'""''"'""u""' e
curvas de progressão de processos patológicos.
2.1
através
Aplicar esse
progressão maligna, áreas
a
etapas de invasão precoce (microinvasão ).
com
O tecido
tecidual que permitem o
tecidos, preparados histológicos e
inclui todos os métodos
e
sem modificações
patológica e
pulmonar disponíveis.
desenvolvimento de
disso, a patologia o
estudos
Estados Unidos
1998 0 método vV111v\'V
esôfago.
3.1 Delineamento do Estudo
os
e
F oi realizado um estudo transversal no qual foram estudadas as
características de textura nuclear de núcleos celulares em diferentes áreas de diferentes
espécimes cirúrgicos. O padrão
convencional.
anatomopatológico por microscopia óptica
do
selecionados
prostatectomias ou cistoprostatectomias e todo o
excluir outros processos patológicos.
anos ou o com
onze casos
outros sete
casos com glândulas e
Fixação e documentação: foram a identificação,
margens de excisão com tinta da Índia, descrição macroscópica, fotografia, secção
dos espécimes e fixação com formalina tamponada a 1 O %, por 24 a 30 horas.
Processamento do material: o material preparado através das técnicas
convencionais de inclusão em parafina e cortes homogêneos de 5 micrômetros de espessura
em micrótomo.
(167) e UHUJl!VUl.;nV\.1 com
34betaE12) (168).
patologistas
foram "'"'"'""H"'""'~'" corno:
casos apresentando com
adenocarcinornas prostáticos com
adenocarcinornas da próstata.
e
consenso entre
na casos
e e
Todos os casos foram estudados através de coloração de hematoxilina e
eosina e anticorpo rnonoclonal anti-queratina 34betaE12 (Dako, Carpinteria, CA, EUA),
direcionado para queratinas de alto peso molecular. Este anticorpo é utilizado para
delineamento da camada de células basais da próstata (170-172). O epitélio prostático
normal invariavelmente reage com este anticorpo e a circunferência da camada de células
basais fica delineada continuamente. Rupturas, caracterizadas pela descontinuidade na
coloração pelo 34betaE12 ao longo da camada de células basais são observadas em 56% dos
casos de NIP de alto grau e comumente em com lesões de a
com adenocarcinoma de em
descontinuidade da camada de células basais aumenta em relação
com perda de mais um terço da camada basal em 52% dos focos de
ácino através do estroma em áreas de descontinuidade da camada de células (166,
174). No entanto, a integridade da lâmina
precoce(166). A figura 8
com foco invasão
tarmdade células basa1s
a
é preservada mesmo na de
de morfológicas do
Figura 8. Sequência morfológica proposta para carcinogênese na próstata humana. De
acordo com o conceito de progressão, NIP de grau 1 corresponde a displasia muito leve e
leve. NIP grau 2 corresponde a displasia moderada e NIP grau 3 a displasia acentuada I
carcinoma in situ. O estágio precursor do carcinoma de próstata é encerrado quando ocorre
microínvasão, o que caracteriza o adenocarcinoma com invasão precoce. Modificado de
Bostwick e Brawer (166).
Sistema de imagens
Sistemas de captura de imagens são compostos o
componente óptico (microscópio), videocâmara, placa captura e microcomputador(175).
Imagem é o termo que define a representação espacial de um objeto em duas
ou três dimensões. Uma imagem pode ser real ou virtual, como a imagem
imagem obtida através de uma videocâmara ou charge coupled device) é
sinais eletrônicos
catódicos, como um
sua reprodução
Imagem digital é o
um
da
matriz finita de duas dimensões, composta elementos de imagem ou pixels.
é criado através de placa digitalizadora conectada ao elemento gerador de '""""~".''""'
A placa define o valor da tonalidade de cada elemento de imagem (pixel).
Componente ótico: foram utilizados dois microscópios
convencionais marca Zeiss (Oberkochen, Alemanha) e Leica (Wetzlar, Alemanha),
de sistemas de iluminação Koehler, com fontes estabilizadas e reguláveis de
incandescente e condensadores Abbé com aberturas numéricas de 0,9. O microscópio Leica
foi equipado com plataforma de controle automático computadorizado (LANG,
Würtemberg, Alemanha) e lentes objetivas plano-apocromáticas de 20 aumentos e abertura
numérica (A.N.) de 0.75 (NIKON, Melville, NY, EUA). O microscópio Zeiss foi equipado
com objetivas plano-apocromáticas de imersão em óleo de 63 aumentos (Zeiss, Oberkochen,
Alemanha) e abertura numérica de 1.40. Os dois microscópios contavam com fototubos,
ótica plana com ampliação de lx e lentes de projeção com 1 O aumentos, determinando
resoluções finais de 200 e 630 aumentos.
1
Dispositivo CCD: foi acoplada uma 3 760
(Sony, Park Ridge, NJ, EUA) ao fototubo do microscópio Leica para captura de imagens
com magnificação de 200x. Para captura de imagens de alta resolução utilizada uma
videocâmara monocromática Vidicon(l76) (COHU, San EUA) ao
microscópio Zeiss. As imagens foram monitoradas durante as sessões de captura através
monitores de vídeo Sony (Park Ridge,
polegadas.
Placas digitalizadoras
1954Q com
(Analogic Co., Peabody, MA, EUA) de captura estática, gerando quadros
elementos de imagem, cores de 24 bits (câmara Sony) ou 256 tons de
COHU), sendo estas imagens gravadas em disco rígido com cópias segurança em
ROM no
19
480
na
Universidade de Chicago como parte do projeto
qualquer outro formato convencional, como
(Joint Photographic Experts Group).
21 ), podendo ser convertido em
(Tagged Image File e
Microcomputadores: As placas de captura de imagem foram conectadas a dois
computadores Sun Sparcstation Ultra 2 (Sun Microsystems, Palo Alto, CA, EUA), cada um
com 2 processadores RISC de 200 MHz, memória RAM de 1024 MB, discos rígidos de 9
GB e dois monitores de 20 polegadas. O sistema operacional utilizado foi o Sun Solaris
versão 2.6. Foi utilizado também um microcomputador padrão IBM-PC com processador
Intel Pentium II de 450 MHz (Intel, Santa Clara, CA, EUA), 128 MB de memória RAM,
disco rígido de 14 GB e monitor de 17 polegadas. O sistema operacional utilizado nesse
computador foi o Microsoft Windows 98 (Microsoft,
computadores operaram conectados através de rede.
3.6 Metodologia de extração de características de textura
As imagens de média resolução (200x)
de interesse foram demarcadas.
captura dirigida e aleatória
procedimento
impressas em
uma redução no
interpretadas através de dispositivo de visão computacional baseado em
(177) (knowledge-based machine vision system) desenvolvido pelo Centro
Ópticas do Arizona (114). A figura 9 mostra a seqüência de segmentação
glândula prostática adjacente a um '-"'···~"'J'"''-'·~"'~"v'" .....
As imagens de alta resolução (630x) foram obtidas
relacionadas a camadas basais intactas de
os
e as
e
uma
com NIP de baixo e alto grau, adenocarcinomas com invasão precoce e adenocarcinomas
prostáticos, totalizado 5.045 núcleos celulares. As imagens foram então revisadas e
arquivadas para extração de características de textura nuclear. Um filtro de interferência em
610 nm (vermelho) foi utilizado para aumentar o contraste dos cortes corados por
hematoxilina e eosina. A resolução digital foi de seis elementos de imagem por micrômetro
nas imagens de alta resolução.
Figura 9. Sistema de visão computacional do Ópticas
do Arizona. A figura 1 OA mostra uma glândula contígua a um adenocarcinoma de próstata
(abaixo à direita). A área em verde delimita uma parte da imagem segmentada pelo sistema
automático. lOB. Identificação do lúmen (azul). lOC. A área que contém células
glandulares secretoras (em verde). 1 OD. Regiões com células basais positivas para
34betaE12 (amarelo). lOE. Porções citoplasmáticas das células secretoras (roxo). lOF.
Estroma (marrom). lOG. Composição da área delimitada na figura lOA com todos os
elementos identificados pelo sistema. O tempo total de segmentação e interpretação dessa
imagem é de 0,04 segundos utilizando-se um computador Sun Sparcstation Ultra 2 com as
especificações e configuração descritas no item 3.5.
Definição untos de
estudo e
entre parênteses. Os cinco
F oram determinados
recebeu urna denominação abreviada,
conjuntos são compostos por núcleos de normal (normal/normal) e de
(NIP-BG), NIP de alto grau (NIP-AG), adenocarcinorna com
(Microinv) e adenocarcinorna (Ca). Os
de glândulas histológica
(Norrnal/NIP-BG) e alto graus (Normal I
(Norrnal/Ca).
Grupo normal (normal/normal)
conjuntos são compostos
'"'u''""'v'"' de casos com
Foram capturadas imagens de 1443 núcleos de células normais áreas de tecido
um
de baixo
portanto relacionadas a camadas basais íntegras, provenientes de sete indivíduos. Todos os
espécimes foram obtidos através de cistoprostatectomias e não apresentavam NIP ou
carcinoma prostático. Tais núcleos foram obtidos em glândulas selecionadas aleatoriamente,
dentro de perímetros de 1 O milímetros.
Neoplasia intraepitelial de baixo grau (NIP-BG)
Quinhentos e cinqüenta e três núcleos de glândulas com NIP de baixo grau
foram obtidos de onze espécimes.
Neoplasia
Setecentos e
do material de sete pacientes.
Adenocarcinoma de próstata com
Quinhentos e
mostradas
cada um dos quatro casos
selecionada. cada área de
subconjunto foi denominado
e
e quatro núcleos de de
em
com
capturadas cerca
núcleos relacionados à camada basal e imagens
de cada uma das seguintes áreas de cada uma das quatro glândulas:
55
mínima de (os códigos entre parênteses correspondem à denominação de cada subconjunto):
L cinco núcleos do ponto zero (PROX);
II. 1 O e 15 núcleos do ponto zero (MED 1 );
III. e 35 núcleos do ponto zero (MED2);
IV. 40 e 45 núcleos do ponto zero (MED3);
V. células a mais de 45 núcleos do ponto zero (DIST).
Tabela I. Conjuntos e subconjuntos de núcleos
o número de núcleos relacionados a camadas de células basais
34Ebetal2. Os adenocarcinomas com invasão (microinvasão) e ""'''"V'"''-'-'-
não apresentaram células com tais características. A mostra uma glândula com
de alto grau com área de micro invasão com os subconjuntos identificados. INV: área de
microinvasão. PROX: área entre um e 5 núcleos do ponto de microinvasão. 1:
entre 10 e 15 núcleos do ponto de microinvasão. MED2: área entre e 35
ponto de microinvasão. MED3: área entre 40 e núcleos do ponto microinvasão e
DIST: área a mais de núcleos do ponto de microinvasão.
Conjunto total de à de núcleos camada intacta núcleos
de basais
>_> _____ ,_
Normal/normal 1.443 1.443 NIP-BG 553 161 NIP-AG 744 150
INV PROX 47
Micro in v 414 MEDl 48 MED2 48 MED3 48 DIST 48
C a 150 Normal/NlP-BG 783 Normal/NIP-AG 457 457 Normal!Ca 501 501 Total 5.045
Ponto zero (microinvasão) DIST MED3 MED2 MEDI PROX INV
Adenocarcinoma
Cento e cinqüenta núcleos vv<l.<HU
classificados corno 5 (2+ 3) pelo método de
três
histológica de
capturados. seleção de casos com essas características se deveu à
78)
um
de corte arbitrado entre os escores 6 e 7 Gleason com relação ao estadiarnento.
do escore 7 a probabilidade de em é (1 1
Núcleos em casos
(normal/NIP-BG)
Dos onze casos de NIP baixo grau obtido um
celulares em grupos de 30 a 50 por glândula de
glândulas caso
NIP de baixo grau.
Núcleos de glândulas de aparência normal em casos de NIP de alto
AG)
Um total de 457 núcleos foram capturados de sete casos, seguindo o mesmo
método descrito para o conjunto norrnal/NIP-BG, em faixas de 0,5 a 7,5 mrn das lesões.
Núcleos de glândulas de aparência normal em casos de adenocarcinoma de
próstata (Normal/Ca)
e um
com a o
milímetros de distância das I <>rw·PcP·n'~"<> um
núcleos estudados.
3.8 Análise Estatística
variância e
estatísticos
sistema (121, 131) de '"'"·'"""" Óticas
casos
8
(Tucson, AZ, EUA). Cálculos adicionais realizados
computador Microsoft (Microsoft,
(Datamost, Salt
58
1 a 6
e Statmost
serão descritos os "'"'"'"''rt
assinaturas de lesões, e os conceitos
normal e distância
nesse
longo desta
matemáticas e das
Apêndice. características
TICAS em função de suas
diferentes órgãos e ao anos
padronizada
dos
ma1s
do
catalogou mais de 400 características moríométricas. E cada uma
um algarismo arábico. Como já
morfométricas e por isso a r>ntnP>'O:>r'<:\
densidade óptica total é a
nesse
dessas neste
1, a
59
ao
no
denominada
a
a
corresponde ao 3, RMS ao 4 e o histograma de densidade óptica até densidade 1,8 em
valores percentuais corresponde às características entre os números 8 e as
características de números 5, 6 e 7 dentre outras do sistema TICAS não foram utilizadas
neste trabalho.
de forma
nuclear, seguidos das freqüências relativas
nos intervalos do histograma
conjunto
características
ocorrência e matriz de
histograma de densidade óptica dos '-'1'-,ul~dl
assim 10 mostra o
textura
eventos
e os respectivos desvios
de dependência textura assinatura
graficamente conjuntos de características
observador reconhecer padrões e tendências de
co-
e
ao
Os histogramas agrupam conjuntos de características que representam desde
grandezas físicas como área até os resultados de funções e relações que representam
aspectos morfológicos de descrição verbal complexa ou mesmo impossível. Portanto o eixo
das ordenadas da figura 1 O expressa os valores em unidades arbitrárias.
Unidades arbitrárias
Características de textura nuclear
- óptica
1
Matriz de co-ocorrência
Matriz de comprimento de seqüência Length Matrix)
Características 303 a
20% abaixo da média, média da acima da média)
Número total de pixels no núcleo, de pixels e
Figura 10. Assinatura nuclear de uma célula representada no canto superior
a
características de descritivas da densidade óptica total, área, circularidade e RMS estão
representadas em preto e violeta . As de e comprimento de seqüência
respectivamente, as cores laranja e verde no histograma. As em
vermelho, cinza e amarelo descrevem a distribuição da densidade óptica e das matrizes de co-
ocorrência e comprimento de seqüência. As características são expressas em unidades arbitrárias
comparáveis entre sí apenas no mesmo grupo de características. As cores utilizadas na figura tem o
objetivo de facilitar a compreensão da estrutura das assinaturas nucleares.
15
O teste
nucleares mais
características selecionadas da
geração uma função
e"''""'"''"'''"''-
então
um
determinada o nas
celulares e categorias diagnósticas diferentes e
15
na
os casos
a casos e
se
a uma
estava em coJmD•an:lr uu."'''"'v
dentro da mesma u.;,.;J>UA< .. UJ.
digital, os quais, como descrito acima, representam vários elementos
como grandezas físicas, funções, matrizes, determinantes e outros.
com
no contexto
caJractei'lStlC<:ts ,,.,H.,....,H, a
valores extremamente
população
o ser um
caso as
mas, na vezes,
nesse as
os e
textura
2268 00,0001 1188, l 00,188 2280,8 00,281 2269 00,0001 772,92 00,073 1153,8 00,154 2270 00,0001 224,48 00,024 882,68 00,0827 2271 00,001 66,78 00,068 441,5 00,415 2272 00,001 22,67 00,027 2285 l ,O 00,016 00,016 2286 1,0 00,012 00,012 2287 lO O 00,0001 00,01 2288 1000,0 00,00001 00,01 2289 1000,0 00,00001 00,01
1
urna entre O e 1, o
registro 0,01 corno o em
o
em urna
valor extremamente
digitaL tais constante
para que escala pudesse ser mantida. estabelecer então um
arbitrário que permitisse a extração de informação visualmente significativa. Após a
verificação de todos os conjuntos de dados foi aplicada uma limitação de escala a duas
unidades arbitrárias. A figura 11 mostra as assinaturas baseadas em um
características de textura para núcleos de células glandulares de próstatas normais e de
alto grau com limitação de valores no eixo das ordenadas.
núcleos normais
características de textura nuclear
as textura
conjuntos dados e os
escalas
As assinaturas
' l_
a
Núcleos de NU' de alto gnm
caracteristicas de textura nuclear
ao
a zero
úteis ao caracterizarem urna diferença ou desvio em relação a urna
núcleo ou conjunto de núcleos considerando todas as características de textura , ""'-''<~,.,,
os
um
termo distância média padronizada da população normal significa a média de cada urna das
características nucleares rnensuradas. Tal diferença pôde ser definida através da
computação, para cada característica cariornétrica de um núcleo ou conjunto de núcleos, a
partir da diferença absoluta entre essa característica e o valor determinado para o conjunto
o
de
ser valores z,
as casos
e
a zero.
entre os z as
tem como o
e em suas com
i2
i O d m8 p 6 n 4
Núcleos de NIP de b~xo grau
caractensti cas de te:xturanutloor
dmpn 3,45
Cada barra
população cada uma das 93
histogramas corresponde à
AG.
12
10 d ma p 6 n 4
2
o
e
Niu~leos de NIP de ruto gnu
dmpn = 3
a
Distância média padronizada ponderada da população
A distância média padronizada ponderada da população normal é o
em
e
do valor da média aritmética entre os valores de distância média padronizada da população
normal e número total de núcleos incluídos em um grupo diagnóstico, sendo expressa em
unidades de desvio-padrão da média (figura 13).
2.5,
1 o
""
1 t" 1 ·~
t 1
1.5 J o j
m o
c j $ Ci " ~ .s .s g ~a ~a Ci
Figura 13. Distâncias médias padronizadas ponderadas da população normal, expressas em
unidades de desvio-padrão, comparando casos normais, NIP de baixo e de alto grau, com os
limites de confiança de 95%.
A figura 13 exibe os valores das distâncias médias padronizadas ponderadas
para todos os núcleos de três categorias diagnósticas: normal, NIP de baixo e alto graus. Os
núcleos das NIP apresentaram diferenças em relação à população normal de 1 ,5 a 2 desvios
padrões em todas as características. Tais núcleos foram claramente diferentes dos núcleos
da normal, e os das
apresentam maiores do as
grau. A curva da
população normal até as NIP de grau. A figura 13 também é um
métodos de classificação baseados nos procedimentos estatísticos
confiança das categorias de lesões
qualquer tentativa de classificação.
Assinaturas de padrão
As assinaturas padrão
e estão sobrepostos,
estendem por 4 unidades de desvio-padrão, sendo cada unidade desvio-padrão
em cinco intervalos. Quanto maior o número células anormais, maior a distância
individuais e categorias diagnósticas. A figura
padrão histológico das categorias diagnósticas de células normais e dos casos
adenocarcinoma .
se
F R o
o 1 2 3
Normal
ocorrência de células (FRO).
4
F R o
o 1
uma
histogramas foi aplicada limitação de escala 40% para as
intervalos.
2 3 4
em
4.
estatística da cromatina
arranjadas e processadas para
computadas
Os valores das assinaturas foram ae1cenm1J1actos em
população celular considerada normaL
Assinaturas
suas distâncias
assinaturas núcleos mostraram aumentos
relação à população celular normal. A figura 15
de diferentes categorias diagnósticas. O
apresentou uma distância média z = 0,3868,
NIP de baixo grau com valores z = 0,8633 e z = 1,5625. Os dois uu'''"''",
7
e
uma
lesões
grau apresentaram valores z 2,327 e z = 4,9231. Tais núcleos constituem exemplos
espectro de assinaturas encontradas nas lesões estudadas. Já os núcleos de tecido
aparentemente normal em próstatas com NIP de alto grau apresentaram perfis semelhantes
aos dessas lesões, o que pode ser visto na figura 16. Foram evidenciadas mudanças
significativas nas assinaturas nucleares de células aparentemente normais em NIP e
carcinomas. Nas figuras 15 e 16 um limite de escala de 25 foi determinado para as
ordenadas.
25 normal/nonnal, 0.3868
20
15
10
o !b .. l ~-
20
15
10
o
d 20 ,
m 15
10
p : ~ n
25 NIP-AG, 2.327
20
15
10
, ... Jitlll : 1,1,1.11 1.1 J ' li J,,h.III.L
Figura 15. Assinaturas nucleares de núcleos individuais, representados no canto superior
direito de cada histograma. Os valores das distâncias médias padronizadas da população
celular normal (dmpn) para cada núcleo (valores z) estão à esquerda das imagens dos
núcleos. A primeira assinatura conesponde a um núcleo da população normal. As duas
assinaturas seguintes conespondem a núcleos de NIP de baixo grau e as duas últimas a NIP
de alto grau.
d
m
p
n
25 normaVnormal? 2280
20
15
10
5
5
o
:: I : ~.J.u~
bl
Figura 16. Assinaturas nucleares de núcleos individuais, representados no canto superior
direito de cada histograma. Os valores das distâncias médias padronizadas da população
celular normal (dmpn) para cada núcleo (valores z) estão à esquerda das imagens dos
núcleos. A primeira assinatura corresponde a um núcleo normal. As duas assinaturas
seguintes correspondem a núcleos de morfologia normal, mas próximos a NIP de baixo grau
e alto grau, respectivamente. A última assinatura corresponde a um núcleo de aparência
normal, mas oriundo de um espécime com carcinoma.
lesões de
núcleos
intraepiteliais de baixo, alto 18.
perfis mostrados nas figuras 17 e 18 os casos
díagnóstica.
normal/normal
NJP de baixo grau
-..~. ... -NJP de alto grau
... .-...... .... -·---Carcinoma
o.o 4.0
Figura 17. Assinaturas de padrão histológico para as categorias normal, NIP de baixo e alto graus e
adenocarcinomas. O eixo das abcissas se estende por 4 desvios-padrão da média da população
celular normal. Tais histogramas demonstram visualmente o padrão de distribuição (eixo y) e o grau
de desvio dos núcleos celulares em relação à população celular normal (eixo x). Para melhor
visualização da distribuição dos histogramas a escala de frequência relativa de ocorrência (FRO),
apresentada no eixo das ordenadas foi limitada a 40%.
normaJlnormal
normallNIP-BG
normaJlCa
Figura 18. Assinaturas padrão histológico compostas por glândulas de morfologia na
proximidade de lesões de baixo grau (normal/NIP-BG), lesões de alto grau (NIP/AG) e
adenocarcinomas (normai/Ca). O histograma da categoria normal (normal/normal) foi mantido
facilitar comparações entre as diferentes categorias diagnósticas. Para melhor visualização
distribuição dos histogramas a escala de frequência relativa de ocorrência (FRO), apresentada no
eixo das ordenadas foi limitada a 40%.
da mesma
diagnóstica entre
apresenta cinco casos próstatas
principalmente quando comparados aos
grau da figura 20. 21 mostra de padrão
com histológica normal em casos
uma assinatura similar a e
... ...
Figura 19. Assinaturas de padrão histológico de cinco casos de próstatas normais. Para
melhor visualização da distribuição dos histogramas a escala da frequência relativa de ocorrência,
apresentada nos eixo das ordenadas foi limitada a 30%.
..... ~_.__·~·
casos com
intraepi te li ais alto grau. a
escala frequência relativa de no
a 30% nas 20 e 21.
11111 ...... ----o.o 4.0
Figura 21. Três assinaturas de padrão histológico de áreas com aparência histológica
normal em casos de adenocarcinoma de próstata.
com
casos
criação de dois conjuntos de dados, um com os
microinvasão (INV) e o outro com os "'""''"'v
MED3 e DIST) relacionada com a área de
de textura
grupos, como pode ser observado na
Tabela
de alto grau) e da área de
características estão detalhadas no Apêndice.
Característica (n° no sistema
óptica total (1)
em seqüências longas (303)
Desuniformidade de comprimento de seqüência
Homogeneidade de densidade óptica **(313)
Matriz de comprimento de seqüência **(272)
Matriz de comprimento de seqüência **(279)
Matriz de comprimento de seqüência **(282)
Matriz de comprimento de seqüência **(283)
Matriz de comprimento de seqüência **(284)
* Os valores estão expressos em unidades arbitrárias.
de
e
1,942
0,2096
120,9
14,15
0,681
0,102
0,638
* * Ver no Apêndice os detalhes de definição de cada característica.
a
entre esses
1,630
O, 1
77,2
7,7
0,445
0,104
0,104
os nas
os a
menores.
figura mostra a
e
com
variação menores em p1co.
um
próximas a focos de invasão.
substituído por distribuições base nas e e
adenocarcinomas, onde as distribuições atingem com grande variabilidade
parâmetro, sugerindo possível correlação com o conteúdo DNA.
A figura 23 mostra as assinaturas nucleares dos núcleos de NIP de alto grau e das regiões de
microinvasão. O desvio da normalidade para os núcleos das áreas de microinvasão foi
claramente menor quando comparado aos núcleos das áreas de NIP de alto A
assinatura nuclear das neoplasias intraepiteliais de alto grau mostrou várias características
de textura nuclear com desvios substanciais em relação aos valores encontrados no epitélio
glandular normal.
Nonnal
NIP-AG
Adenocarcinoma
Micro invasão
o 12 24 36 48 60 Densidade óptica rota!
Figura 22. Distribuição da densidade óptica total dos núcleos celulares casos
normais, NIP de alto grau (NIP-AG), casos de adenocarcinoma e de
microinvasão. O eixo x se estende por 60 intervalos de valores de densidade óptica
total que vão do zero (transparência) ao do histograma (opacidade). O y
corresponde à freqüencia relativa de ocorrência de núcleos em cada intervalo de valor
de densidade óptica.
8
25 NIP-AG
20
15
d !O
:ll~- I1.1JlJlll m
p 25:
Microinvasão ?fJ
n 15
lO ,
5'
característica.-; carioroétricas
Assinaturas dos núcleos de todos os casos e
núcleos das quatro de
população normal). redução dos valores com
NIP-AG
o
Mlcroinvasão
0' ~~
o 4
Assinaturas de padrão e
a os casos
Para melhor visualização da
ocorrência (FRO) apresentada no a40%
A figura 24 apresenta as assinaturas de padrão histológico para todos os casos de NIP
alto grau e todas as áreas de microinvasão estudadas. Observa-se a
celulares a uma distância maior da população celular normal nas áreas de microinvasão
quando comparadas aos casos de NIP-AG.
A diminuição da DOT nos núcleos da área de microinvasão em conjunto com as alterações
de outras características descritivas da cromatina pode indicar a emergência de uma
subpopulação com u.,,,,,,.,._. ... ,_..," nas
padrão un.uu•ua.l nas áreas de a
um clone 83-186)
de infiltrar, sendo o responsável padrão observado em
hipótese, núcleos em diferentes áreas ao longo
alto grau foram estudados 1,
mostra a a
mostraram
uma \V»CUVUVL<A
micro invasão. os
de casos estudados. aumentar a
tendência
da matriz comprimento de 283 e
de seqüência 7-8 a 11-12 elementos de imagem, todos no
de 0,6 a 0,9. Foi obtida a média aritmética entre todos os casos para cada um dos
subconjuntos estudados e a figura 26 mostra este resultado. O valor correspondente ao
adenocarcinoma foi acrescentado ao gráfico para fins comparação. A textura de
cromatina apresentou modificações significativas ao longo da glândula, atingindo seu
mais baixo a 10-15 núcleos do ponto de micro invasão.
>45 náclOOH da área de A microlnvasllo
25
~l 20
~ :1~1M.l 111J
25-35 núcleos dll área de B mlcroinvasão
2:'5 1
20 i
«< :llü _ _J --*tal~ ~ c
t 1·5 núcloos da área de
25 mic:roinvasão
-'l 20
1 :;,11~ J i ~ s D a <li! Mlcro!nvasão
~ 25
201
15 i
~ lO!
~~li dtl
E Adenocarcinoma
25 20 15
~~ llhli~ 1111 mllm1ml'1 Características cariométrica;;
Figura 25. O histograma A exibe a assinatura para os núcleos de NIP-AG mais distantes da
interface entre a área de microinvasão e a neoplasia intraepitelial de alto grau. O histograma
B exibe as assinaturas para as áreas entre 25 e 35 núcleos da área de invasão (MED2). O
histograma C mostra a assinatura dos núcleos celulares próximos da área de invasão (entre 1
e cinco núcleos da área de invasão: PROX). O histograma D mostra a assinatura na área de
microinvasão (INV) e a assinatura dos adenocarcinomas é apresentada para comparação em
matrizes de comprimento de seqüência
invasão
Figura Glândula com
das características 282, 283 e 284,
85
os
da de comprimento
seqüência nos diferentes pontos mensurados dos quatro casos de adenocarcinoma com
microinvasão. As letras do gráfico indicam as assinaturas nucleares correspondentes na
figura 25. A figura mostrando uma lesão de alto grau com micro invasão
para ilustração, já que os valores apresentados representam a média entre todos os
casos. O ponto E (adenocarcinoma invasor) não está ilustrado na fotomicrografia.
A assinatura constitui um
interpretados como uma mensagem. As "'"''"·"''"'H""
uma seqüência ordenada de símbolos e possuem uma
Isso permite o uso características de textura nuclear
razões de prevalência para agrupamento em uma ae1:errnu1aaa
utilizadas em classificação. É
próstatas normais obtidas
na 20, onde casos
distâncias mais amplas. Pode ser questionada a
desses dois casos, a possibilidade
achados morfológicos subvisuais implicações
nos casos
ser
as
neoplásicas intraepiteliais de alto os resultados observados em outros
trabalhos ( 40, 41 ), onde tais características foram utilizadas para classificar núcleos em
diferentes categorias diagnósticas. Existiram, porém, diferenças relevantes de metodologia
entre tais trabalhos e o presente estudo. A derivação de índices de progressão e regras de
tem expressão regular nos núcleos
de todas as categorias diagnósticas estudadas. Para tais propósitos, características que
apresentem fortes tendências de limite central entre casos também devem ser escolhidas
para delineamento da curva de progressão. Logo, os critérios de seleção de características
em tais procedimentos favorecem todos os elementos que os casos e núcleos celulares
tenham em comum, em
utilização como
e
comportamentos
características de textura
grupos. São as diferenças
conter as uuvuuw,_,v,_
entre
núcleos e
Adenocarcinomas com
é
Redução da densidade óptica total
as
os
o
a
mas a os
e
à
A coloração por hematoxilina e eosina não é estequiométrica ou específica para DNA, o que
leva a coeficientes de variação maiores para a densidade óptica total do que os que seriam
obtidos utilizando a coloração de Feulgen. Mas a densimetria de hematoxilina apresenta
resultados reproduzíveis (133) quando empregada sob condições controladas, como neste
estudo. Mesmo a microfotometria do DNA utilizando-se a reação de Feulgen apresenta um
técnica( 187).
através
aplicados em
microfotometria
núcleos
a
a distribuição
cortes
essas limitações sustentam a u"""''"''.i""'-''"'
óptica total como uuAUHA'-'
vários parâmetros, o
Redução dos valores da matriz de comprimento de seqüência
A hipótese de maior sustentação na literatura para a alteração dos valores
e o
comprimento de seqüência, cuja tradução morfológica é a textura mais fina da cromatina,
pode ser o relaxamento estrutural da cromatina relacionado às alterações das histonas que
ocorrem nos processos de transformação neoplásica(28). Como foi apresentado na
introdução, a morfologia da célula é o produto de um sistema de interações complexas que
estrutura
19 E as
fosforilação e
1.
e
o e a
e
as
as
ser em menos
substituições, deleções ou inserções de alguns nucleotídeos. Essas alterações
detectáveis pela análise citogenética. desse tipo de alteração são as
no gene k-ras, que ocorrem em 80% dos carcinomas de pâncreas(l94).
Translocações cromossômicas: essas alterações podem ser detectadas
citogenética como fusões de diferentes cromosomos ou entre segmentos normalmente
contíguos do mesmo cromossomo. A nível molecular essas translocações podem ocasionar a
fusão entre dois gens diferentes, o que pode conferir propriedades tumorigênicas ao produto
de transcrição. Um exemplo de translocação é o cromossomo Philadelphia das leucemias
o cromossomo 9
cromossomo
3. cromossomos: o e a
cromossomos, sendo em os
sólidas '-'I>.'•H"I-HV é o cromossomo 7 no
a
(amplicon).
sendo r"'"''~"H"" das cromossomos, como as nas
ocorre em
Os
hipótese UVJLHH>U.H é que mutações desconhecidas
genética e que algumas das mutações subsequentes levariam à 1'"\l"t>fTl'P
201 ). No entanto, apesar das investigações que se estendem por mais de duas décadas, a
mutação inicial, capaz de determinar o processo de transformação tumoral ainda não
demonstrada(200-203).
A aplicação das assinaturas digitais a núcleos em localizações selecionadas como áreas de
microinvasão e suas vizinhanças foi realizada para explorar exatamente possíveis alterações
de expressão fenotípica. Os resultados sugerem um processo em que determinado fenótipo
antes
capacidade
com a
se tornarem
baseadas em um ou
estudo genético
A
com
Existe considerável
na
diferenciação celular durante os estágios
9
uma
1
de
NIP(l74, 0). tem
expressão aumentada na NIP e adenocarcinoma(211 14). As alterações na expressão
biomarcadores estão claramente associadas com a progressão alterações
nucleares ao longo das etapas da neoplasia intraepitelial prostática. Tal tendência não é
claramente observada no adenocarcinoma, que parece expressar biomarcadores de forma
aleatória(174). Nos adenocarcinomas o grau de anormalidade nuclear e a expressão protéica
e de marcadores de diferenciação parecem associar-se de forma randômica.
se a
em algumas
um
e dos
evento.
do
necessários,
tais como aumento
pr<)cç:arme:m:<)S ou aumento de
histológico ou citológico em
eventos a
como
ser a
neutra ou álcool sem
modiflcação de técnicas de processamento e coloração ou
a
ocorrer
nesse
em
As assinaturas nucleares baseadas em distâncias padronizadas da população normal
para avaliação visual de diferenças, similaridades e tendências. O próximo estágio de
desenvolvimento dessa metodologia será a utilização das assinaturas digitais para
identiflcação positiva de núcleos com relação à malignidade. Para tal procedimento será
fundamental a derivação de uma medida de certeza de que um núcleo de fato representa
e o o
as
alternativas possíveis os
e
em uma 'VHI-H.«<Uv HH..'U"ULU o
mesmo tempo, o ser e
repetidas
O índice
Tal índice também mudanças em curtos como
a ruptura da camada basal, estratificação de camadas ou o
vascularização nas cercanias de neoplasias intraepiteliais prostáticas podem meses
para refletir alterações regressivas, enquanto alterações de textura da cromatina podem ser
verificadas em intervalos muito menores tempo. Infelizmente até
poucos estudos de análise de imagem que avaliem material de ensaios de quimioprevenção.
Um estudo preliminar sobre a eficácia da vitamina A e DFMO (difluormetilornitina) em
lesões de ceratose actíníca está em fase de conclusão(l65). Esse estudo demonstrou que
existe uma curva de progressão a partir da pele normal até lesões severas. Foi também
a '-''-<1-'"""'"-"-'-'-''"'
mesma curva de
Usos r as
ou
a
apresentado no
aplicados na pesquisa em
a
somente
celulares
predominantemente
em a
à sua
em
o
em amostras escarro com
e alguns valores tetraplóides. os
metaplasias com atipia moderada apresentaram predomínio de núcleos com
alguns núcleos atingindo valores hipertetraplóides. Resultados semelhantes foram obtidos
em outros estudos(223). Tais observações sugerem alterações sequenciais do DNA em
lesões precursoras do carcinoma epidermóide do pulmão(224) documentáveis
imagem. A evolução dos sistemas de análise de imagem computadorizada tornou possível a
mensuração de centenas de características morfométricas e densimétricas dos núcleos
celulares em frações de segundo até mesmo em computadores do tipo IBM-PC
contemporâneos.
pulmonares
80% das biópsias
portadores
corantes com
a avaliação
padrão histológico
poderão .:>UJL<IJJ,Ul'vUl a
amostras
do
corretamente
e
possibilidades
textura
1 ).
escarro como
das assinaturas digitais em
reforçadas por estudos que propõem a detecção precoce
o uso
aumentar a
e
métodos de biologia molecular. Um recente trabalho aplicando quatro diferentes métodos
para detecção de mutações e instabilidade em microsatélites em amostras de lavado
broncoalveolar de 43 pacientes cujo tumor primário apresentasse pelo menos um marcador
molecular estudado atingiu 53% de sensibilidade total(227). É relevante que o mesmo
estudo sugira as possibilidades de uso da análise de imagem no aumento da taxa de detecção
de técnicas citológicas(228).
O recente aumento vezes
brônquicos.
a..,,.,,,..,.,_,, comas
a. A textura
desvio) em
assinaturas
As
em à
c. a e e
aw;;:m)C<:JtrclmCim<:ts avm1çctac1S ou em
textura cromatina em ''-'<"''-''V"
textura
contava com
características.
a
como
1: ou
o
mx == /1 * I[i][j]
(i, j )
==área
( i, j ) in N: todos os pixels dispostos em linhas e
nuclear.
Característica 2: área do núcleo em micrômetros quadrados. O primeiro número no
denominador é um fator de correção para o sistema óptico.
Área área (pixels) 65.935159 (pixels/f})
Roundness = I * 1t *
Estruturas a
mean
mx 2= L
I=O (i, j )
I [ i ] [ j ]2
Área
mx L
(i, j )
RMS=
I[i][j]
ExtSum *
A
Características 8 a Histograma de densidade óptica
percentuais
10(-i/100) 1.0 for i = O preto
0.016 for i= 180- cor de fundo
al.
A
densidade 1.8 em
a (i, j ) no (I [ i ] [ j ] I 1 +
o
coloração
a como tons o zero
a ser e
a tons
(bins: 1 11 21 a
coloração.
a os tons 7 5,
31
1
Características a de i, em6
X 6 faixas de densidade óptica mesma
densidade em linha horizontal, gerando uma como a 1:
É realizada uma varredura a um
valor para cada pixel em
elemento de imagem em uma linha horizontal com oito elementos. A o
número de ocorrências (co-ocorrências) de ~·~·""""
dentro da mesma faixa.
D.O 00-0.3 0.31-0.6 0.61-0.9 0.91 1.2 1.21·1.5 >>1.5 0-0.3 1 1 0.31-0.6 3 1 0.61-0.9 1 0.91-1.2 1.21-1.5 >1.5
a
Avalia o pixels a
mesma e um
os
elemento o
número de de elementos com mesma
D.O. 1-2 3-4 5-6 7··8 9-10 11 12 0-0.3 1 0.31-0.6 0.61-0.9 0.91-1.2 3 1.21-1.5 >1.5
Característica 267: Faixa de densidade óptica (DO) dividida em seis cada um
com amplitude de 0,3 unidades de DO. O número de pixels consecutivos na mesma faixa é
contado. A característica 267 corresponde ao comprimento de 1 a 2 pixels na faixa de DO de
O a 0,3.
o mesmo a mas
o mesmo a mas
o mesmo mas
pixels.
:o mesmo a mas
o mesmo a mas
as entre e a
o mesmo a mas
pixels e entre e 1
Característica 303: ênfase em seqüêncías curtas (Short Emphasis)
Característica 304 ênfase em seqüências longas (Long Run Emphasis)
Característica 305: desuniformidade de níveis de cinza (Grey Level Nonuniformity)
Característica 306 desuniformidade
Nonuniformity)
comprimento de
3
a
7 a 8
9 a
1
a 2
Length
( i ] [ j ] como um ( i, j) na
e
a 8, 1
6 6 1 = L L [i] [j]
1 J 1
6 6 TMP2= L L [i] [j] I
1 j = 1
6 6 3 L L [i] [j] I * [i] [j]
1 J 1
6 6
TMP4 L [ L rlh[i] [j] i= 1 j I
6 6
TMP5= L [ L rlh [i] [ j ] r J 1 i= l
2 * (número total de seqüências possíveis de comprimento 1)
Logo, as características 303 a 307 podem ser definidas como:
curtas
I
I
I 1
I 1
I
nucleares. As ênfases em seqüências curtas e longas são autoexplanatórias: o valores de
SRE e RLE refletem a distribuição dessas seqüências no núcleo celular. desuniformídade
de níveis cinza funciona da maneira: Quando as seqüências estão
uniformemente entre as faixas de o valor de GLN tende a ser pequeno.
desuniformidade de comprimento de seqüência (RLN) mede se as seqüências estão
uniformemente distribuídas através dos comprimentos ou não. Se as seqüências forem muito
grandes, porém, o valor de RLN também será elevado. O percentual de seqüências (RP) é a
a
em
Característica densidade óptica 20 % acima do do valor médio em valores
(av20a).
Característica
Ng Nt
Nt
no
heterogeneidade:
Ng número pixels em diferentes tons de
Nt como definido acima.
1
hl
correspondendo ao valor médio.
8 em uma ser a
-nw I
no 8
I=
a o cl
tm
onde:
tm número total de conjuntos encontrados no núcleo.
Logo:
Característica 314: clumpness
cl = cll nb + nw
Como o na ao
mesmo
* os
I nt
o
L L I[i][j]/ (i, j) N
Logo:
Característica 316: densidade óptica 20
(av20b):
av20b = 0,8 * 1-L
110
em
avext = ll
%
= 1.2 * ll
os
1 o
é como
é
cinza assumindo um 5%.
Ambas são """.u'"'""" rernnora sem a
espacial de cromatina condensada. Mapas de pixels a descrição
espacial de cromatina. Valores individuais não podem descrever tais características
adequadamente.
compactação ( clumpness) reflete a distribuição de grânulos em
de 1 micrômetro. Grânulos pequenos determinam valores pequenos de compactação.
A condensação reflete a fração correspondente aos grânulos largos. Os valores para
condensação se aproximam dos valores de compactação quando todos os pixels são pretos
o
menor o
*
thl = av20b
th2 av20a
a
Let nb ng nw = O
For all x (i, j) in N
{
1
o
no
(l[i][ ]< ) +1
(I [i ][j ] > =
}
I[i][j]<=
12
+ 1
da
produto de
em um
estruturas
é um
dados e
os componentes. A estrutura
seguinte UH.-UH.,au
3
como o
ou novas
dados
como
dados, como único e não passível de Observando um a
célula é um elemento atômico. magnifícações intermediárias, a polaridade em
tecidos epiteliais pode ser avaliada pelas relações entre núcleo e citoplasma celulares, que
podem então ser considerados elementos atômicos. Em grande aumento, todas as organelas
atômicos.
Gratícula: retículo constituído por um conjunto de linhas gravadas em um vidro
transparente e que pode ser aplicado sobre as lentes oculares de um microscópio.
o objetivo
sobreposições.
a
1)
todo o
a
VLUVLVUU\.,!Ui) à a
nome de citometria como tem o nome
glicosilação,
tradução.
e
ocorrem a
em
um
uso em
ou
Raciocínio baseado em casos (case based reasoning): é o método em que casos
e
são utilizados para solucionar uma nova situação características semelhantes(232).
Redes inferenciais (iriference engine): parte do sistema especialista capaz de
inferências a partir de bancos de dados(l77).
tem
se
o
novas
Sistemas especialistas: são sistemas que oferecem diagnósticos e/ou recomendações
baseadas na representação do conhecimento de experiências reais(l77).
num é
e
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