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SUMÁRIO

1- Introdução

2- Descrição do Conjunto Processador TF- Test ®

3- Líquido Conservante

4- Coleta e Homogeneização da Amostra

5- Técnica de Enriquecimento Parasitário – Vantagens

6- Técnica de Enriquecimento Parasitário – Cuidados Técnicos

7- Exame da Amostra

8- Técnica de TF - Test ® Versus Outras Técnicas Convencionais e

Kits Comerciais

9- Vantagens da Técnica de TF - Test ®

10- Instruções para Utilização da Técnica de TF-Test ®

11- Recentes Avanços Tecnológicos no Exame Parasitológico de

Fezes

12- Referências Bibliográficas

2

1 INTRODUÇÃO

As parasitoses intestinais, ou enteroparasitoses, humanas são ainda altamente

prevalentes no mundo, sobretudo nas regiões tropicais, onde estão localizados países em

desenvolvimento 1,2,3

. Recentemente, a World Health Organization (WHO) e a Pan

American Health Organization (PAHO) divulgaram relatório mostrando que a mais de 4,5

bilhões de pessoas no mundo encontram-se infectadas por enteroparasitoses4. Destas,

aproximadamente 500 milhões apresentam-se doentes, sendo na sua grande maioria

crianças. Ainda, de acordo com o relatório da WHO/PAHO, as doenças infecciosas e

parasitárias são responsáveis por 2 a 3 milhões de óbitos por ano no mundo.

Entre algumas espécies de protozoários intestinais, estima-se que a amebíase atinja

cerca de 10% da população mundial, com mortalidade anual aproximada de 100.000

pessoas; que o parasito flagelado Giardia spp. deva perfazer uma incidência mundial da

ordem de 500.000 casos por ano; e que Cryptosporidium spp. acometa populações de mais

de noventa países e seis continentes 5. Por sua vez, entre os helmintos intestinais, estima-se

que a ascaridíase atinja mais de 300 milhões de pessoas no mundo, sendo responsável por

cerca de 80.000 óbitos anuais; que as infecções por ancilostomatídeos ocorrem em cerca de

151 milhões de pessoas no mundo; e que as esquistossomoses acometem mais de 200

milhões de habitantes, levando no mundo de 500.000 a 1 milhão de pessoas ao óbito

anualmente 1,2,3

.

Em países desenvolvidos, a transmissão de enteroparasitoses é baixa, contrastando

com a maioria dos países em desenvolvimento. Todavia, devido à alguns fatores, bem

como, marcante adaptação parasitária, turismo global, migrações crescentes, transmissões

zoonóticas, comprometimento da defesa imunológica e utilização em massa de drogas

imunossupressoras, muitos parasitos passaram a constituir problema de Saúde Pública

também em países desenvolvidos 5. O crescimento populacional sem melhoria nas

condições gerais da vida é o principal fator que contribui para a elevação da transmissão de

diferentes infecções parasitárias. Para revelar este problema, nesses países são realizados

exames parasitológicos de fezes para diagnósticos de helmintos e protozoários intestinais,

utilizando diferentes técnicas, que em muitas vezes deixam a desejar 6. Desta forma, a

nossa principal preocupação foi a de introduzir inovação tecnológica na área diagnóstica da

3

Parasitologia Clínica 6,7,8,21

. Assim, com a colaboração entre a empresa Immunoassay

Indústria e Comércio S/A e Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), foi

desenvolvido um projeto, financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

São Paulo (FAPESP), na Modalidade de Inovações Tecnológicas em pequenas Empresas

(PIPE - Proc.99/06228-4). Este projeto gerou o kit TF-Test ® (Three Fecal Test),

fundamentado em uma técnica capaz de identificar maior número de parasitos em material

fecal de pacientes, principalmente com moderadas e baixas intensidades de infecções, além

de ser de fácil execução e econômico. Os dados obtidos por muitos trabalhos de pesquisas,

de diversas instituições, apontam que a referida técnica possa substituir aquelas usadas em

exames parasitológicos, em rotina laboratorial. De acordo com o exposto, o Ministério da

Saúde do Brasil, através do Plano Nacional de Vigilância e Controle das Enteroparasitoses,

desde o ano de 2005, faz a recomendação da referida técnica para o diagnóstico laboratorial

das enteroparasitoses 9.

Em geral, as técnicas parasitológicas convencionais e/ou kits comerciais apresentam

boa sensibilidade diagnóstica quando a intensidade de infecção apresentada pelo paciente é

alta. Todavia, não se prestam para moderadas e baixas intensidades de infecções, por serem

pouco abrangentes e sensíveis 6. O principal mérito da técnica de TF-Test

®, em relação às

técnicas convencionais e kits comerciais, é o de apresentar alta sensibilidade diagnóstica,

mesmo em pacientes mostrando moderadas e baixas intensidades de infecções, por

proporcionar alta concentração parasitária, com abrangência a diferentes espécies, ao

processar juntas 3 amostras fecais, coletadas em dias diferentes, de uma só vez. O seu

sistema de dupla filtragem por centrífugo-sedimentação elimina de forma rápida o excesso

de material fecal, com o auxílio de líquido solvente, separando os parasitos e tornando

assim o sedimento rico com os mesmos, que são facilmente identificados pela microscopia.

A seguir, as qualidades técnico-científicas, bem como, vantagens da técnica de TF-

Test ®

, serão abordadas, salientando aspectos do manuseio, do desempenho diagnóstico, e

do custo-benefício. Visa-se assim o interesse dos laboratórios de análises clínicas de

qualquer porte do setor público ou privado, que buscam por melhoria da qualidade de seus

exames. Vale ressaltar que, a técnica de TF-Test ®

somente terá um bom aproveitamento no

4

momento que: ocorrer o perfeito entrosamento da equipe técnica de laboratório e pacientes;

a mudança de hábito for estabelecida; a colaboração eventual da empresa suceder até o

esclarecimento completo nas diferentes fases de implementação da técnica parasitológica

no laboratório.

2 DESCRIÇÃO DO CONJUNTO PROCESSADOR TF-Test ®

O kit TF-Test ®

é constituído de três tubos coletores-usuário, um tubo de

centrifugação e um conjunto de filtros contendo duas telas metálicas [Fig. 1],

denominados, quando unificados, de Conjunto Processador TF-Test ®

. Cada tubo coletor-

usuário contém acoplado a sua tampa uma colher, ou pá coletora, para acomodar cerca de

1,5 gramas de fezes. Externamente, o tubo coletor-usuário possui graduações que vão de 1

mL a 10 mL. Há ainda assinalado com destaque dois níveis: a) primeiro nível, 5 mL, indica

o volume correto do líquido conservante (solução neutra de formalina); e b) o segundo

nível, 6 mL, indica o limite de tolerância aproximada que pode ser atingido pelo líquido

conservante após coleta de fezes. O tubo de centrifugação é acoplado a uma peça,

denominada conjunto de filtros [Fig. 1: (E)], que apresenta três orifícios, aos quais são

introduzidos os tubos coletores-usuário para a centrifugação. O Conjunto Processador será

centrifugado a uma rotação de 1.500 rpm (500 g), por 2 minutos, utilizando caçapas

universais de 100 mL. Encaixadas internamente ao conjunto de filtros existem duas telas

metálicas para filtração, as quais apresentam orifícios com 400 e 200 micrometros [Fig. 1:

(F)].

Este conjunto foi projetado para proporcionar maior rendimento na sua rotina

diagnóstica. As dimensões, o formato, o grau de conicidade e os ângulos foram

minuciosamente estudados por uma equipe de engenheiros da área de Termo-injeção

Plástica. Da mesma forma foi estudado o sistema de acoplamento de peças plásticas do

Conjunto Processador, como exemplo, baioneta, clique e batoque, para fechamento e

vedação, que é muito superior ao conhecimento sistema de rosca que apresenta

microvazamento de líquidos e gases. Destaca-se ainda que, para o processamento da técnica

de TF-Test ®, o profissional de laboratório evita o trabalho ingrato de manusear o material

fecal como é usual nas técnicas convencionais. O laboratório não precisa investir em

5

vidrarias que se quebrem e nem em mão-de-obra para suas lavagens, pois a técnica de TF-

Test ®

é totalmente descartável. Por ser de material reciclável, não polui o meio ambiente.

O espaço físico do laboratório utilizado para a execução das técnicas convencionais, e

também aquele espaço usado para armazenamento de utensílios laboratoriais, tornam-se

disponíveis para outras atividades com o emprego da técnica parasitológica de TF-Test ®.

Por fim, para o processamento laboratorial, todas as peças do Conjunto Processador são

acopladas por uma estante de acrílico destinada a portar o manuseio na bancada.

Fig. 1: (A). Tubo coletor-usuário; (B). Tampa do tubo coletor-usuário; (C). Colher ou pá

coletora; (D). kit paciente; (E). Conjunto de filtros; (F). Telas metálicas filtrantes; e (G).

Tubo de centrifugação.

3 LÍQUIDO CONSERVANTE

Até o presente momento, a solução aquosa de formalina é ainda um dos melhores

conservantes de material biológico que se conhece 3,10

. Na técnica de TF-Test ®, a solução

neutra de formalina é fornecida em volume de 5 mL em cada tubo coletor-usuário. Este

volume é facialmente observado pela transparência do tubo e, como também, através da

graduação existente na parte externa do tubo. A solução neutra de formalina tem a

propriedade de fixar e manter íntegras em temperatura ambiente as estruturas parasitárias,

como ovos, larvas, cistos e oocistos, por longo tempo, não sendo aconselhável o seu uso em

A

B C

D

E F

G

6

período superior a um mês. Assim, o material coletado deverá ser homogeneizado nesta

solução, a fim de permitir a boa fixação e conservação dessas estruturas parasitárias. O

trabalho de homogeneização é realizado pelo paciente, que deve executá-lo logo após a

coleta, por meio de agitação vigorosa manual do frasco coletor-usuário.

A proporção entre o líquido conservante e o material coletado é também de

fundamental importância para preservação das estruturas parasitárias e para se realizar um

bom diagnóstico. Portanto, fica evidente que, no momento em que o coletor-usuário TF-

Test ®

for entregue ao paciente, a pessoa encarregada no laboratório deverá ter competência

para instruí-lo corretamente e, a seguir, confirmar se ele compreendeu bem, mesmo que

tenha recebido a bula explicativa estampada no kit paciente contendo tubos coletores-

usuário.

4 COLETA E HOMOGENEIZAÇÃO DA AMOSTRA

É sabido que apenas uma coleta de fezes, sobretudo em condições de baixa ou

média intensidade de parasitismo, não é suficiente para detectar os parasitos 6,11,12,13,14,15

.

Destaca-se ainda a irregularidade da eliminação das estruturas parasitárias durante o ciclo

biológico do parasito 3. Nessas situações são recomendadas três coletas num período

máximo de 10 dias, com intervalos no mínimo de um dia entre as coletas. Obedecida esta

conduta, aumenta-se a probabilidade diagnóstica em cerca de 20% 6. Uma das inovações da

técnica de TF-Test ®

é de processar, de uma só vez, as três amostras coletadas. Os

pacientes não terão dificuldades em coletar três amostras fecais, pois, a linguagem e os

desenhos usados na bula explicativa, localizada no kit paciente [Fig.1: (D)], auxiliam na

compreensão, facilitando a execução da tarefa solicitada. Ademais, o profissional de

laboratório responsável pela destinação do frasco coletor-usuário será treinado e preparado

por uma equipe de assessoria científica da empresa Immunoassay Indústria e Comércio

S/A, a fim de transmitir aos pacientes todas as informações necessárias sobre o

procedimento de coleta, mesmo que tenham recebido a bula explicativa da técnica de TF-

Test ®

.

É necessário que o contato com os pacientes deva ser feito de forma eficiente, pois,

se a quantidade do material coletado for excessiva, poderá ocorrer homogeneização e

7

conservação inadequadas de parasitos, bem como trazer dificuldades no processamento

laboratorial desse material, inutilizando todo o trabalho do paciente. O excesso é facilmente

notado quando o volume final ultrapassar a faixa de tolerância demarcada no frasco coleto-

usuário. No entanto, se o paciente coletar o material fecal com um certo excesso no tubo

coletor-usuário, pode-se ainda admitir uma tolerância, desde que esse excesso de material

não tenha interferido na conservação de parasitos, como também no processo de filtragem

subsequente do TF-Test ®.

Outrossim, o excesso de material fecal coletado poderá ser facilmente identificado

através da observação do grau de turvação do material coletado. O material fecal assim

coletado não apresentará problema no laboratório, pois a probabilidade de encontrar

parasitos mal conservados é baixa e, com algumas agitações, o material já semidesfeito se

homogeneizará rapidamente. O laboratorista estará instruindo de como proceder nessa

circunstância, se descarta ou aproveita esse tipo de material que foi entregue para o exame.

Recomenda-se, para casos de fezes com consistência normal, uma simples agitação

vigorosa para que o material fecal coletado se destaque da colher ou pá coletora e

facilmente se torne uma mistura homogênea no líquido conservante.

Em casos da amostra ter sido coletada em recipiente convencional (latinha), cuja

evacuação tenha sido feita há menos de 24 horas e refrigerada, o laboratorista bastará

coletar a quantidade recomendada do material fecal desse recipiente, utilizando para isto a

colher coletora TF-Test ®, transferindo-a ao tubo coletor-usuário TF-Test

® contendo

líquido conservante.

5 TÉCNICA DE ENRIQUECIMENTO PARASITÁRIO - VANTAGENS

A técnica de TF-Test ®

foi cuidadosamente estudada com o objetivo de

proporcionar resultados sensíveis e confiáveis, usando procedimentos fáceis no preparo de

amostra fecal destinado a exame parasitológico. O processo de enriquecimento de

estruturas parasitárias, usando o TF-Test ®, é mais prático e mais rápido que as técnicas

convencionais. O trabalho do profissional de laboratório consiste de manuseios simples e

sequenciais como: acrescentar líquido solvente de gordura na amostra fecal contida no tudo

coletor-usuário; agitar bem para que aja a deslipidação do material e facilitar a separação de

parasitos de impurezas fecais; realizar uma centrifugação de apenas 2 minutos para efetuar

8

dupla filtragem, visando à remoção de impurezas fecais, deixando passar os parasitos, que

se sedimentam no fundo do tubo de centrifugação; descartar o sobrenadante e transferir o

sedimento sobre a lâmina de microscopia; e efetuar a leitura em microscopia.

Na microscopia óptica convencional, sobretudo quando a intensidade da infecção

parasitária é baixa, a procura dessas estruturas, tais como ovos, larvas, cistos e oocistos, em

meio a impurezas fecais, tornam-se exaustiva, demorada e cansativa. A grande vantagem de

TF-Test ®

é a de ser uma técnica de enriquecimento de estruturas parasitárias, por processar

as 3 amostras de fezes coletadas em uma só etapa, onde o excesso de material fecal é

removido mediante dupla filtragem por centrífugo-sedimentação, com o uso de líquido

solvente, possibilitando desta maneira o aumento na probabilidade do encontro de

parasitos, mesmo em se tratando de intensidades de infecções baixas.

O mesmo não pode se dizer aos métodos convencionais de Lutz (Hoffman), Faust,

Rugai e Kato-Katz, além dos kits comerciais Coprotest ® (NL Com. Ext. Ltda.), Parasep ®

(DiaSys Europe Ltd.) e StillQuick ®

(Labo-Moderne), que apesar de apresentarem boa

sensibilidade em intensidades de infecções altas, não são eficazes nas infecções moderadas

e baixas, onde ocorre o problema de pequena abrangência diagnóstica para diferentes

espécies parasitarias 6,11

. Desta forma, o laboratório passa a utilizar mais de uma técnica

para a detecção de diferentes espécies de parasitos, afetando de maneira negativa o fator

custo-benefício. A nossa opinião é a de que, para exames de rotina laboratorial, ao invés da

tentativa de melhorar a qualidade dos resultados recorrendo a duas, ou mais técnicas, é

preferível ao laboratório usar uma técnica de enriquecimento parasitário, como a de TF-

Test ®, examinando se necessário mais de uma lâmina, ou então examinando todo o

sedimento fecal, a fim de não onerar o exame.

Estudos comparativos realizados por importantes órgãos de pesquisas, considerados

de referência do Estado de São Paulo, como, Hospital de Clínicas, da Faculdade de

Ciências Médicas, da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) / Campinas;

Hospital de Clínicas, da Faculdade de Medicina, da Universidade de São Paulo (USP) / São

Paulo; Laboratório de Parasitologia, do Hospital de Clínicas, da Universidade Estadual de

São Paulo (UNESP) / Botucatu; e Laboratório de Parasitologia, do Departamento de

9

Biologia, da Universidade de Taubaté (UNITAU) / Taubaté, mostraram as vantagens da

técnica de TF-Test ®

em relação às demais técnicas parasitológicas utilizadas em rotina

diagnostica laboratorial 6 [Tab.: 1].

6 TÉCNICA DE ENRIQUECIMENTO PARASITÁRIO - CUIDADOS TÉCNICOS

É recomendado o uso de uma gota de detergente por tubo coletor-usuário, e não

mais, por que isso poderia afetar a eficiência da ação do líquido solvente (acetato de etila)

utilizado no processo de deslipidação e separação de impurezas fecais, ocasionando no seu

final a formação de sedimento com falta de pureza, dificultando a observação na

microscopia dos parasitos. O volume de acetato de etila a ser usado não é muito rigoroso,

porém, não é recomendado utilizar volumes inferiores ou superiores aos preconizado na

técnica, 3 ml, pois isto poderia causar a diminuição da sensibilidade da técnica de TF-Test

®. No Brasil, alguns laboratórios de análises clínicas demonstram resistência em implantar

acetato de etila em rotina, apesar de este reagente ser comprovadamente eficaz para a

eliminação de impurezas e gorduras de amostras fecais 3,10

, principalmente em substituição

ao éter etílico, usado universalmente na técnica parasitológica de Ritchie 18

. Quando

trabalhado de acordo com as normas de Controle de Qualidade e Biossegurança, o uso de

acetato de etila é recomendado pela literatura científica nacional e internacional, sem

qualquer risco à saúde humana, com comprovada eficiência à detecção de organismos

parasitários 3,10,19, 20

.

7 EXAME DA AMOSTRA

A inovação tecnológica de TF-Test ®, desenvolvida no projeto FAPESP-PIPE,

com sua tríplice coleta, constituindo em processo de enriquecimento parasitário, reflete no

aumento considerável de positividade no exame parasitológico das fezes, significando

melhora de sensibilidade diagnóstica, especialmente em parasitoses de moderada e baixa

intensidade de infecção 1,6,21

. Convém ressaltar que, resultados considerados confiáveis são

obtidos somente quando se examina a lâmina toda ao microscópio.

10

8 TÉCNICA DE TF-Test ® VERSUS OUTRAS TÉCNICAS CONVENCIONAIS

E KITS COMERCIAIS

Estudos comparativos de avaliações da técnica de TF-Test ® mostraram que, em

parasitoses com alta intensidade de infecção, as técnicas utilizadas no exame parasitológico

de fezes, em geral, apresentam bom desempenho diagnóstico. Nesta condição, a

sensibilidade diagnóstica de TF-Test ® foi de 96%, diferindo pouco daqueles disponíveis

no comércio como Coprotest ® (91%), StillQuick ®

(92%) e Parasep ® (87%), ou então da

técnica convencional de Lutz/Hoffman (82%) 11

. Todavia, foi observado que havia

diferença estatística na sensibilidade diagnóstica dessas técnicas quando as infecções

parasitárias eram moderadas ou baixas. Por exemplo, a técnica de Kato-Katz demonstrou

que, se a carga parasitária era alta (mais de 1.000 ovos por grama de fezes), a sensibilidade

desta técnica era de 100%, semelhante a de TF-Test ®

. Entretanto, quando a carga

parasitária era baixa (menos de 100 ovos por grama de fezes), a sua sensibilidade se tornava

significativamente mais baixa, de 80%, enquanto que a de TF-Test ® continuava no mesmo

nível (100%) 11

. Luiz Rey, na publicação de seu último livro, Parasitologia – 4a edição

2,

também relata a baixa sensibilidade da técnica de Kato-Katz, sobretudo quando empregada

em baixas cargas parasitárias. Mesmo assim, a técnica de Kato-Katz é mais eficiente que

alguns kits comerciais, como exemplo, Coprokit ® (Campinas Medical). Segundo achados

de Ávila et al. 22

, a técnica de Kato-Katz apresentou superioridade de 34% de sensibilidade

diagnóstica em relação ao Coprokit ®, em um estudo comparativo realizado à detecção de

ovos de Schistosoma mansoni. Este dado vem a confirmar que diversos kits são lançados no

comércio por empresas visando obter preços baixos de venda, no entanto, deixando a

desejar no diagnóstico laboratorial, por apresentarem baixas sensibilidades diagnósticas. Da

mesma maneira procede o kit comercial Paratest ® (Diagnostek Ind. Com. Prod. Cient.),

que, apesar de mostrar baixo custo, revela baixa eficiência diagnóstica 1,16,17

.

Um estudo realizado com mais de 1.100 pacientes, em quatro regiões do Estado de

São Paulo, mostrou que a técnica de TF-Test ® apresenta sensibilidade diagnóstica

estatisticamente maior que as demais técnicas convencionais usadas no exame

parasitológico de fezes, em se tratando de infecções moderadas ou baixas 6,21

[Tab. 1].

11

Parasite TF-Test Routine techniqueLutz/Hoffman, Faust and Rugai

Total positivity

species (Positive no.) (Positive no.) (no.)

Protozoan

Endolimax nana 13,5% (149) 9,6% (106) 15,7% (173)

Entamoeba coli 14,0% (154) 9,5% (104) 15,1% (166)

Blastocystis hominis 10,1% (111) 6,8% (75) 11,7% (129)

Giardia duodenalis 8,2% (90) 5,5% (61) 8,4% (93)

Iodamoeba butschlii 2.5% (28) 1.5% (17) 3.0% (33)

Entamoeba histolytica /

E.dispar

1.6% (18) 0.8% (9) 1.9% (21)

Entamoeba hartmanni 0.3% (3) 0.5% (5) 0.7% (8)

Chilomastix mesnili 0.1% (1) 0.2% (2) 0.2% (2)

Helminth

Ancylostomatidae 5.3% (58) 4.7% (52) 5.7% (63)

Trichuris trichiura 4.1% (45) 3.2% (35) 4.4% (48)

Strongyloides stercoralis 2.8% (31) 2.0% (23) 3.6% (40)

Schistosoma mansoni 1.1% (12) 1.1% (12) 1.6% (18)

Enterobius vermicularis 0.8% (9) 0.9% (10) 1.0% (11)

Hymenolepis nana 0.2% (2) 0.2% (2) 0.2% (2)

Total 64.5% (711) 46.6% (514) 73.3%( 807)

Tab. 1: Parasite species identified by the TF-Test and conventional techniques in the study of 1,102 subjects in four different laboratories in the State of São Paulo, Brazil.

Foi ainda observado que se os exames parasitológicos, com a combinação de

técnicas convencionais acima referidas [Tab. 1], fossem repetidos por 3 vezes em dias

diferentes, a sensibilidade dessas técnicas combinadas alcançava o mesmo nível de

sensibilidade da técnica de TF-Test ®

6 [Tab. 2]. Todavia, este procedimento vem a onerar

o diagnóstico laboratorial, inviabilizando o uso deste modo de atuar, sobretudo em

laboratórios públicos, que recebem baixos valores financeiros do Sistema Único de Saúde

(SUS), para a realização do exame parasitológico de fezes. Estes achados comprovam a

eficiência diagnóstica, aliada aos aspectos práticos e econômicos, da nova técnica

parasitológica de TF-Test ®.

12

Technique Sensitivity (repeat no)

One Two Three

Lutz/Hoffman 38.4 % (134) 65.6 % (229) 86.5 % (302)

Faust 25.5 % (89) 41.8 % (146) 60.7 % (212)

Rugai 12.0 % (42) 19.5 % (68) 30.4 % (106)

Lutz/Hoffman, Faust and

Rugai

48.1 % (168) 78.8 % (275) 89.4 % (312)

Centrífugo-sedimentação 35 % 65 % -----------

Tab. 2: Increased sensitivity of the Lutz/Hoffman, Faust and Rugai techniques and of their combination by repeating the ovum-and-parasite stool examination for a total of 256 patients with intestinal parasitic infections.

9 VANTAGENS DA TÉCNICA DE TF-Test ®

As peças do Conjunto Processador são confeccionadas em plástico reciclável e são

totalmente descartáveis, o que evita a utilização de utensílios na etapa de processamento

laboratorial, como exemplo, vidrarias;

Apresenta maior rendimento, aliado à praticidade e rapidez;

Permite economia de espaço físico ao laboratório;

O líquido conservante foi minuciosamente estudado e não agride a morfologia de

estruturas parasitárias, principalmente, preservando a amostra fecal em boas condições

por até 30 dias, em temperatura ambiente;

13

É uma técnica abrangente de tríplice coleta de amostra fecal, em dias alternados,

favorecendo o amplo encontro de estruturas parasitárias, como helmintos e protozoários

intestinais;

O pouco manuseio da técnica e o uso de líquido conservante eliminam riscos de

infecção tanto para o paciente como ao profissional de laboratório, se enquadrando nos

critérios de Biossegurança;

A ação do líquido conservante elimina o forte odor desagradável de material fecal

coletado no laboratório de análises clínicas;

Apresenta vantagem de custo-benefício;

Os estudos científicos demonstram que a sensibilidade da técnica é elevada em relação

às demais técnicas parasitológicas convencionais e kits comerciais;

Remove o excesso de impurezas fecais por dupla filtragem e centrifugação, com o uso

de líquido solvente, aumentando a probabilidade de detecção de estruturas parasitárias;

Nesta técnica, o material fecal coletado é aproveitado em 100% por procedimento de

enriquecimento parasitário (centrífugo-sedimentação), em contraste com outras técnicas

e/ou kits que utilizam somente uma parte do material coletado, reduzindo a

sensibilidade diagnóstica;

O descarte de material analisado em recipiente apropriado para líquidos protege a rede

de esgoto, evitando poluição e contaminação do meio ambiente, amparando-se desta

maneira nos critérios de Biossegurança e Controle de Qualidade;

É um produto constituído de Inovação Tecnológica, com concessão de patentes

nacional e internacional 7,8

, e que teve apoio integral da Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP-PIPE) e Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP).

14

10 INSTRUÇÕES PARA UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE TF-Test ®

10.1 COLETA - Indicação para o paciente

Para o diagnóstico correto, sugerimos que a coleta das fezes seja feita em 3 dias

alternados (dia sim, dia não). Após o término da coleta, os três tubos coletores-usuário

devem ser entregues ao laboratório num prazo máximo de 10 dias. Este processo é muito

simples, basta seguir corretamente as instruções abaixo.

a) O paciente deve ser orientado a coletar somente uma colher ou pazinha de fezes, segundo

a instrução que se encontra na embalagem (kit paciente) contendo os três tubos coletores-

usuário, em dias alternados, e em um período de tempo que não ultrapasse a 10 dias; e

b) de preferência, orientar o paciente a coletar as primeiras fezes do dia, livres da ação de

medicamentos e produtos químicos, como exemplo, antidiarréicos, antibióticos, antiácidos,

derivados de bismuto e do bário, vaselina e óleos minerais, os quais podem tornar

insatisfatório o diagnóstico de protozoários intestinais 3,10

.

10.2 CONCENTRAÇÃO - Indicação para o laboratório

Ao coletar as 3 amostras fecais nos tubos coletores-usuário TF-Test ®, o próprio

paciente já faz a homogeneização. Portanto, no processamento laboratorial da técnica, não é

preciso coar e nem transportar o material coletado de um frasco coletor para um tubo de

centrifugação. Tudo para reduzir o manuseio e o menor risco de exposição do profissional

de laboratório ao material fecal coletado. O emprego de acetato de etila p.a elimina as

gorduras e grande parte das impurezas fecais, fornecendo um sedimento limpo e altamente

enriquecido por estruturas parasitárias de diversas espécies. As orientações desta etapa de

trabalho seguem logo abaixo.

a) No laboratório, os tubos coletores-usuário, com amostras fecais coletas, necessitam

passar por uma nova agitação vigorosa, antes de serem processados;

15

b) em seguida, acomodar os tubos em uma estante apropriada TF-Test ®, com a

identificação de cada paciente, com as tampas semi-abertas. Em cada tubo, adicionar uma

gota de solvente orgânico (detergente neutro incolor) e 3 mL de acetato de etila p.a.;

c) os tubos deverão ser fechados com as suas respectivas tampas. Agitar vigorosamente

todos os tubos, a fim de obter uma suspensão homogênea de partículas fecais;

d) logo após, as tampas dos tubos são retiradas, descartando-as em um recipiente

apropriado para destacarte de material sólido contaminante, como por exemplo, a caixa

Clean-Box ® (Immunoassay Ind. Com. S/A.), seguindo as normas de Biossegurança;

e) depois, encaixar os três tubos coletores-usuário pertencentes a cada paciente em um

conjunto de filtros TF-Test ®, cuja peça contém o tubo de centrifugação acoplado em uma

de suas extremidades. A unificação de todas essas peças constitui o Conjunto Processar

TF-Test ®;

f) verificar se o Conjunto Processador está bem encaixado (acoplado) e não apresenta

nenhum vazamento, fazendo para isto a inversão do conjunto;

g) em seguida, centrifugar o Conjunto Processador por 2 minutos, a 500 g (1.500 rpm,

desde que o raio da cruzeta da centrífuga seja de 20cm), tendo os três tubos coletores-

usuário voltados para a parte superior da caçapa, ou para a tampa de abertura da centrífuga,

e o tubo de centrifugação voltado para a parte inferior da caçapa, ou motor (rotor) da

centrífuga. A caçapa utilizada é a de 100 mL universal, disponível em centrífugas de

diversas empresas, seja nacional ou internacional;

h) após a centrifugação, o tubo de centrifugação é desacoplado, cuidadosamente, do

restante do Conjunto Processador, colocando-o na estante apropriada TF-Test ®,

descartando o restante das peças do Conjunto Processador em um recipiente próprio para

material sólido contaminante (Clean-Box), seguindo os critérios de Biossegurança; e

i) em seguida, o líquido sobrenadante do tubo de centrifugação é decantado em recipiente

adequado para descarte de líquido contaminante, de acordo com normas de Biossegurança.

16

10.3 LEITURA - Indicação para o laboratório

A leitura microscópica, especialmente em amostras originadas de baixa intensidade

de infecção, exige a procura e identificação de ovos, larvas, cistos e oocistos no meio de

estruturas sem interesse (impurezas fecais). Como o TF-Test ® trata-se de uma técnica que

enriquece a amostra com a utilização de 3 coletas, em dias alternados, e dupla filtragem por

centrífugo-sedimentação, com o uso de líquido solvente, tornam assim a técnica muito mais

provável e facilita o encontro de estruturas parasitárias em amostras fecais oriundas de

pacientes com moderada e baixa intensidade de infecção. Abaixo, seguem as orientações

desta etapa de trabalho laboratorial.

a) Adicionar cerca de 10 gotas de solução salina fisiológica (NaCl a 0,85%) sobre o

sedimento localizado no fundo do tubo de centrifugação, de modo a formar uma suspensão,

homogeneizando-a delicadamente com o auxílio de pipeta plástica descartável;

b) com o uso da mesma pipeta, transferir uma ou duas gotas (de preferência) da suspensão

sobre uma lâmina de microscopia;

c) adicionar sobre esta(s) gota (s), uma gota de solução de Lugol diluído a 2%, e mais uma

gota de solução salina fisiológica, dependendo do grau de limpidez da suspensão fecal; e

d) preparar um esfregaço de todo o material depositado em lâmina de microscopia, cobrir

com lamínula e examiná-lo em microscopia de luz convencional com aumentos de 100

vezes, e confirmando o encontro do parasito, sobretudo protozoário intestinal, com aumento

de 400 vezes.

11 RECENTES AVANÇOS TECNOLÓGICOS NO EXAME PARASITOLÓGICO

DE FEZES

Visando dar continuidade aos avanços tecnológicos na área diagnóstica da

Parasitologia Clínica, a Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), por meio de

uma equipe multidisciplinar de pesquisa, vem desenvolvendo novas tecnologias, as quais a

empresa Immunoassay Indústria e Comércio S/A. estará se aproveitando comercialmente,

especialmente pelo contrato de parceria de desenvolvimento de pesquisa existente entre

17

esta empresa e a mencionada universidade (FUNCAMP, 27 de outubro de 2008). Sendo

assim, no primeiro trimestre de 2010, a empresa pretende realizar o lançamento comercial

da técnica TF-Test Modified. Trata-se de um progresso técnico/científico adicionado à

técnica parasitológica de TF-Test ®, que proporcionará o diagnóstico com alta

sensibilidade, como ilustram as Figuras 2 e 3. Esta nova tecnologia consiste de um processo

técnico laboratorial que aumenta a sensibilidade diagnóstica das enteroparasitoses, além de

diminuir drasticamente as impurezas fecais indesejáveis em esfregaço fecal 23

, muito

frequentes em técnicas parasitológicas convencionais e kits comerciais, que podem falsear o

resultado.

(A) (B)

Fig. 2: (A). Lâmina obtida pela técnica de TF-Test Modified , com cerca de 100 ovos por

campo do parasito Hymenolepis diminuta, com aumento microscópico de 40 vezes; (B).

Lâmina obtida pela mesma técnica parasitológica, contendo por campo 15 larvas de

Strongyloides stercoralis, com mesmo aumento microscópico.

18

(A) (B)

Fig. 3: (A). Cisto de Giardia spp., em meio a impurezas fecais, obtido por técnica de Lutz

/ Hoffman, Pons e Janer, com aumento microscópico de 400 vezes; e (B). Cisto da mesma

espécie parasitária, porém, livre de impurezas fecais, obtido pela nova técnica de TF-Test

Modified.

Ademais, seguindo a proposta de inovação tecnológica na área diagnóstica da

parasitologia, a UNICAMP, desde o ano de 2004, vem desenvolvendo um projeto

intitulado “Análise de Imagens de Parasitos Intestinais do Homem” (FAPESP-

proc.03/14096-8). Este projeto encontra-se em pleno desenvolvimento, porém, em uma

outra etapa de trabalho, denominada de “Automatização do Diagnóstico de Parasitos

Intestinais do Homem por Análise de Imagens” (FAPESP- proc.08/57428-4). Este

prosseguimento de trabalho tem como objetivo abordar o estudo da análise automatizada de

parasitos intestinais, e é constituído por um sistema composto por técnica parasitológica,

equipamentos e técnicas computacionais. Este sistema, a médio prazo, resultará na

automatização do exame parasitológico das fezes, e deverá fornecer resultados altamente

sensíveis, jamais vistos na área da parasitologia 5,24

. Esta tecnologia, sem sombra de dúvida,

irá inovar a área da parasitologia clínica nacional e internacional, beneficiando os

laboratórios públicos e privados, os quais praticam um grande número de exames. O exame

automatizado das enteroparasitoses repercutirá favoravelmente aos programas

governamentais, com a obtenção de resultados confiáveis, através de imagens, em um curto

espaço de tempo.

10 µm

19

A G R A D E C I M E N T O S

Aos que nos ajudaram a manter o equilíbrio e o bom andamento do projeto

FAPESP-PIPE (Nº 99/06228-4), agradecemos e em especial a Professora Titular Sumie

Hoshino Shimizu, Coordenadora Geral do Projeto; o Professor Associado Luiz Cândido

de Souza Dias, Coordenador da Área Específica de Parasitologia; o Professor Livre

Docente Alexandre Xavier Falcão, Coordenador do Projeto de Melhoria da Técnica

Parasitológica de TF-Test ®; e o Pesquisador Doutor Jancarlo Ferreira Gomes,

Coordenador pela Empresa no Projeto, Pesquisador Científico e Gestor do Projeto na Inter-

Relação Universidade-Empresa, para o desenvolvimento do produto que consideramos

resultante de Inovação Tecnológica, TF-Test ®.

12 R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S

1 Neves DP. Parasitologia Dinâmica. Atheneu, São Paulo, 3ª Edição, p.592., 2009.

2 Rey L. Parasitologia. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 4o Edição, p.883, 2008.

3 Garcia LS. Diagnostic Medical Parasitology. ASM, Washington D.C., USA, 5th

Edition,

2007.

4 PAHO/WHO. French-Speaking Caribbean: Towards World Health Assembly Resolution

54.19. Kingston, Jamaica, 15-17 May, 2007.

5 Gomes JF. Processamento de amostras fecais e desenvolvimento da técnica de análise de

imagens por computador, para o diagnóstico das enteroparasitoses (Tese de doutorado).

Instituto de Biologia da UNICAMP, 2008.

6 Gomes JF, Hoshino-Shimizu S, Dias LCS, Araujo AJSA, Castilho VLP and Neves

FAMA. Evaluation of a novel kit (TF-Test) for the diagnosis of intestinal parasitic

infections. J.Clin.Lab.Anal.(USA), 18:132-138, 2004.

20

7 Hoshino-Shimizu S, Gomes J F, Dias LCS. Kit para múltiplas coletas de material fecal

para a análise laboratorial (concessão de patente - INPI/PI-0104372-2), 2001.

8 Hoshino-Shimizu S, Dias LCS, Gomes J F. Multiple Collection Kit for Stool Laboratory

Examination (concessão de patente - PCT: WO/2003/014705), 2003.

9 Ministério da Saúde. Plano nacional de vigilância e controle das enteroparasitoses. SVS

– Secretaria de Vigilância em Saúde, 42p., 2005.

10 De Carli GA. Parasitologia Clínica: Seleção de Métodos e Técnicas de Laboratório para

o Diagnóstico das Parasitoses Humanas. Atheneu, São Paulo, 2a Edição, 2007.

11 Hoshino-Shimizu S, Gomes JF, Dias LC. Parasitos Intestinais: Técnicas Tradicionais e

Conjuntos Comerciais. J. Br. Parasitol., 37: 44, 2001.

12 Hiatt RA, Markell EK. How many stool examinations are necessary detect pathogenic

intestinal protozoa. Am. J. Trop. Hyg, 53: 36-39, 1995.

13 Nazer H, Greer W, Sonelly K, Mohamed AE, Yaish H, Kagawalla PR. The need for

three stool specimes in routine laboratory examinations for intestinal parasites. Br. J. Clin.

Pract., 47: 76-78, 1993.

14 Cartwright CP. Utility of multiple-stool-specimen ova and parasite examinations in a

high prevalence setting. J. Clin. Microbiol., 37: 2408-2411, 1999.

15 Hanson KL, Cartwright CP. Use of an enzyme immunoassay does not eliminate the

need to analyse multiple stool specimes for sensitive detection og Giardia lamblia. J. Clin.

Microbiol., 39: 474-477, 2001.

16 Santos SFLN, Faro LB, Fonseca SF, Araújo FG, Ferreira MG, Hiltner AN. Comparação

entre os métodos de Hoffman, Pons e Janer e Paratest®

para a detecção das parasitoses

intestinais. J. Bras. Patol. Clin. Med. Lab., res.458, 2006.

21

17 Santos CJ, Oliveira RE, Sauro AC, Sarraipo LL, Coelho FAZ, Coelho MDG. Avaliação

do uso do kit comercial Paratest®

como ferramenta no diagnóstico coproparasitológico. C.

P. Parasitol., res. 97tecno, 2006.

18 Ritchie LS. An ether sedimentation technique for routine stool examination. Bull US

Army Med. Dept., 8:326, 1948.

19 Crede P. Microscopic examination of the fecal specimens: concentration by formalin-

ethyl acetate sedimentation. Clin. Microbiol. Proc. Handb., 2: 1-5, 2004.

20 Young KH, Bullock SL, Melvin DM et al. Ethyl acetate as substitute for diethyl ether in

the formalin-ether sedimentation procedure. J. Clin. Microbiol., 10:852-853, 1979.

21 Gomes JF, Hoshino-Shimizu S, Falcão AX. Recentes avanços tecnológicos no exame

parasitológico de amostras de fezes. Rev. Bio Farma, 10: 44-53, 2008.

22 Ávila LSL, Simões LF, Leal DAG, Yamashiro S, Branco N, Gomes LD, Zanotti-

Magalhães EM, Magalhães LA, Franco MB. Teste do coletor Coproseco®

e comparação

dos métodos Kato-Katz e Coprokit®

quanto a análise de ovos de Schistosoma mansoni.

Rev. Patol. Trop., 38, supl. 2 (jul-set), 2009.

23 Falcão AX, Gomes JF, Hoshino-Shimizu S, Suzuki CTN. Método de preparação de

amostra coproparasitológica fecal e composição clarificante (concessão de patente INPI -

N.Prot. 018090047245), 2009.

24 Gomes JF, Suzuki CTN, Papa JP, Falcão AX, Hoshino-Shimizu S, Dias LCS. Análise

de Imagens de Parasitos Intestinais do Homem: Uma Realidade.. J. Br. Patol. Clín. Med.

Lab., p.456, 2006.