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UEZO - CENTRO UNIVERSITRIO ESTADUAL DA ZONA OESTE

CENTRO SETORIAL DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE

CARACTERIZAO DA INTERAO DE Tr ichomonas

vaginal isCOM Bacteroides fragi l is

Pedro Souto Rodrigues

Rio de Janeiro

2013

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PEDRO SOUTO RODRIGUES

Aluno do Curso de Tecnologia em Biotecnologia

Matrcula 1021327669



Trabalho de Concluso de Curso, TCC,

apresentado ao Curso de Graduao em

Tecnologia em Biotecnologia, da UEZO

como parte dos requisitos para a obteno

do Grau de Tecnologia em Biotecnologia,

sob a orientao da Prof. Dr. Jessica

Manya Bittencourt Dias Vieira

Rio de Janeiro

2013

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Elaborado por Pedro Souto Rodrigues

Aluno do Curso Tecnologia em Biotecnologia da UEZO

Este trabalho de Graduao foi analisado e aprovado com

Grau: Dez (10)

Rio de Janeiro, 20 de dezembro de 2013.

Prof. Dr. Fabio da Silva de Azevedo Fortes

MSc. Thiago Alves Teixeira dos Santos

Prof. Dr. Jessica Manya Bittencourt Dias Vieira

Presidente

RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL

2013

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Aos meus pais, a quem espero orgulhar ao chegar ao finalde mais uma etapa da vida, dedico minha maior vitria.

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, que escrevendo certo por linhas tortas me guiou at

aqui.

A meus pais, Pedro e Aristia, pela confiana que sempre depositaram em

mim, e por sempre acreditarem no meu potencial e me impulsionarem nas

conquistas de todas as minhas vitrias.

Ao meu irmo, Daniel, pelas dicas no ingls e pela amizade.

A John (in memorian), meu grande amigo que se foi muito cedo. Com voc

aqui tenho certeza que toda essa jornada teria sido muito mais divertida.

Saudades eternas.

A minha namorada, Amanda, por todo amor, carinho, dedicao e

compreenso.

A Loyze, por sempre me ajudar com os experimentos e me apoiar nos

momentos difceis em que as coisas davam errado.

A todos os colegas do LTBM, que sempre faziam os dias serem divertidos

e prazerosos.

A professora Jessica, quem me orientou e me ajudou na construo deste

trabalho.

Ao professor Sergio Seabra, que sem o qual a realizao desse trabalho

no teria sido possvel e que sempre me ajudou em todos os aspectos.

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Que os vossos esforos desafiem asimpossibilidades, lembrai-vos de que as grandes

coisas do homem foram conquistadas do queparecia impossvel.

Charles Chaplin

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RESUMO

O gnero Bacteroides formado por bastonetes gram-negativos, anaerbios

estritos, resistentes a bile, mveis ou no e no formadores de esporos. Suas

espcies so frequentemente encontradas nas membranas mucosas, inclusive do

trato genital feminino, agindo como agentes em vrios stios de infeces. As

infeces anaerbias so frequentemente polimicrobianas e endgenas.

Trichomonas vaginalis, por sua vez, um parasita flagelado anaerbio facultativo

com distribuio cosmopolita e o agente etiolgico da tricomonase, a doena

sexualmente transmitida no-viral mais comum em humanos. Para persistnciada infecco, esse parasito possui um mecanimo de fagocitar outros

microrganismos, mas esse processo no totalmente elucidado. Nesse estudo,

fizemos uso de trofozotos de T. vaginalise a espcie Bacteroides fragilis, por B.

fragilisser considerada, clinicamente, a mais importante no gnero, uma vez que

a bactria mais comumente isolada de processos de infeco endogenas,

sendo frequentemente associada a infeces gastrointestinais, respiratrias e

infeces no trato genital feminino. Ns realizamos a interao parasito-bacterianas propores de 1:10, 1:50 e 1:100 em perodos entre 1 e 12 horas e testes de

viabilidade foram aplicados. Esses dados foram analizados para comparar o

crescimento do patgeno in vitro, na presena e na ausncia de B. fragilis. Os

resultados indicaram que na proporo de 1:100, alteraes na ultraestrutura

foram notadas a partir de 6 horas. Alm disso, foi observado que depois de 8

horas de interao, a viabilidade de T. vaginalis decai, e aps 12 horas de

interao, no se encontra mais trofozotos viveis. Esses dados sugerem que oparasito suporta B. fragilisem curtos perodos de interao e que nesse tempo,

no h qualquer variao na proliferao do parasito. No decorrer da interao,

os trofozotos colapsam, indicando que B. fragilis talvez produza metablitos

txicos contra a atividade de T. vaginalis.

Palavras-chave: Trichomonas vaginalis, Bacteroides fragilis, Interao

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ABSTRACT

The Bacteroides genus is composed by gram-negative, bacillus, obligate

anaerobes, bile-resistant and non-spore forming bacterium. The genus species

are commonly found on the mucous membranes, including the female genital

tract, acting as agents of several site infections. The anaerobic infections are

usually polymicrobial and endogenous. Trichomonas vaginalis, for its part, is an

anaerobic facultative flagellate parasite with worldwide distribution which is

trichomoniasis etiologic agent, the most common non-viral sexually transmitted

disease in humans. As for the infection persistence, this parasite possesses as a

mechanism phagocyting other microorganisms, but this process is not completely

elucidated. In this study we make use of T. vaginalis trophozoites and the species

Bacteroides fragilis, for B. fragilis is considered, clinically, the most important in its

genus, once it is the most commonly bacteria isolated from endogenous infectious

processes, being usually associated to gastrointestinal, respiratory and female

genital tracts infections. We performed the parasite-bacteria interaction in 1:10,

1:50 and 1:100 proportions in periods between 1 and 12 hours and viability tests

have been applied. These data have been analyzed to rival the pathogen growth

in vitro in the presence and absence of B. fragilis. The results indicate that in the

1:100 proportion post-interaction analysis, ultrastructural alterations were

noticeable after 6 hours. Furthermore, it was observed that after 8 hours the T.

vaginalis viability decays, and that after 12 hours of interaction no viable

trophozoites are found. These data suggest that the parasite covers B. fragilis in

short interaction periods and that in this time there are no variations of the parasite

proliferation, but as time goes by the trophozoites collapse, indicating that B.

fragilismay produce toxic metabolites against the T. vaginalis activity.

Key words: Trichomonas vaginalis, Bacteroides fragilis, Interaction

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Composio da microbiota humana ...................................................... 2

Figura 2- Ciclo de vida de Trichomonas vaginalis................................................ 3

Figura 3- Ilustrao de T.vaginalisfeita por Donn em 1836 ............................... 6

Figura 4- MEV mostrando ensaio de interao entreB. fragilis eT. vaginalis.... 13

Figura 5- MEV mostrando ensaio de interao entre B. fragilise T. vaginalis.....14

Figura 6- MEV mostrando ensaio de interao entre B. fragilise T. vaginalis.... 15

Figura 7- MET mostrando ensaio de interao entre B. fragilise T. vaginalis.... 16

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1- Interao parasito-bactria na proporo de 1:10 ............................. 17

Grfico 2- Interao parasito-bactria na proporo de 1:50 ............................. 18Grfico 3- Interao parasito-bactria na proporo de 1:100 ........................... 19

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SUMRIO

Resumo .................................................................................................................. vi

Abstract ................................................................................................................. vii

Lista de Figuras .................................................................................................... viii

Lista de Grficos .....................................................Error! Bookmark not defined.

1. Introduo .........................................................................................................1

2. Reviso de Literatura ........................................................................................5

2.1. Bacteroides fragilis .................................................................................... 5

2.1.1. Aspectos taxonmicos deBacteroides fragilis................................. 5

2.1.2. Patogenicidade e virulncia de Bacteroides fragilis......................... 5

2.2. Trichomonas vaginalis............................................................................... 6

2.2.1. Aspectos taxonmicos de Trichomonas vaginalis........................... 62.2.2. Patogenicidade e virulncia de Trichomonas vaginalis................... 7

2.3. Fagocitose ................................................................................................. 8

3. Objetivos ...........................................................................................................9

3.1. Objetivos geral .......................................................................................... 9

3.2. Objetivos especficos ................................................................................ 9

4. Justificativa ..................................................................................................... 10

5. Metodologia .................................................................................................... 11

5.1. Cultivo de Bacteroides fragilis ................................................................. 11

5.2. Cultivo de Trichomonas vaginalis............................................................ 11

5.3. Interao parasito-bactria ...................................................................... 11

5.4. Microscopia Eletrnica de Varredura ...................................................... 11

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5.5. Microscopia Eletrnica de Transmisso .................................................. 12

5.6. Avaliao da proliferao de T. vaginalis................................................ 12

6. Resultados e Discusso .................................................................................13

6.1. Resultados .............................................................................................. 13

6.1.1. Avaliao da ultraestrutura de T. vaginalis em interao com B.

fragilisatravs de microscopia eletrnica de varredura ........................... 13

6.1.2. Anlise de T. vaginalis aps ensaios de interao atravs de

microscopia eletrnica de transmisso .................................................... 16

6.1.3. Avaliao da proliferao do protozorio in vitro, na ausncia e napresena de B. fragilis ............................................................................. 17

6.2. Discusso ............................................................................................... 19

7. Consideraes Finais .....................................................................................22

8. Perspectivas Futuras ......................................................................................23

9. Referncias Bibliogrficas .............................................................................. 24

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1. INTRODUO

A famlia Bacteroidaceae composta por bactrias anaerbias que

colonizam a orofaringe e os tratos gastrointestinal e genital feminino de humanos. composta por bacilos gram-negativos no formadores de esporos (CATO &

JOHNSON, 1976), incluindo o gnero Bacteroides. As espcies de Bacteroides

so anaerbias estritas e bile resistentes (SONG et al., 2004).

Bacteroides fragilis considerada, clinicamente, a mais importante dentro

do gnero, j que a mais comumente isolada de processos infecciosos

endgenos, estando geralmente associada a infeces nos tratos gastrintestinal,

respiratrio e genital feminino, e dos tecidos moles (GIAMARELLOU, 2000).

A mucosa intacta representa importante barreira que impede a proliferao

de microrganismos anaerbios de se espalharem para outros stios. Portanto, as

infeces anaerbias ocorrem normalmente na presena de fatores que so

predisponentes (BROOK, 1987). As bactrias anaerbias tm assumido grande

importncia clnica nos ltimos anos, em decorrncia de avanos nas tcnicas de

deteco e identificao deste grupo microbiano, sendo ratificado o envolvimento

desses microrganismos em diversos processos infecciosos dos tratos respiratrio,

gastrointestinal e genital feminino. No processo infeccioso as bactrias atuam

tanto como patgenos nicos quanto em associaes com microrganismos

facultativos (FERREIRA et al., 2003), o que caracteriza as infeces anaerbias

como polimicrobianas (ONDERDONK et al., 1977). Nesse contexto, as espcies

do gnero Bacteroides tm merecido ateno especial pela alta incidncia de

isolamento em casos clnicos (KOETH et al., 2004).

O interesse na microbiota bacteriana do trato genital feminino aumentou

em funo da relao existente com as infeces ginecolgicas, uma vez que

cerca de 50% das bactrias encontradas nas secrees vaginais e cervicais so

anaerbias (ENGELKIRK et al., 1992). Gorbach et al. (1973), demostraram a

predominncia de Lactobacillus e Bacteroides spp. na flora cervical, sendo o

gnero Bacteroides composto por espcies frequentemente associadas com

infeces no trato genital feminino, mostrando, deste modo, a relevncia dos

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estudos envolvendo estes microrganismos (FINEGOLD, 1977; FINEGOLD &

LANCE, 1989; SZKE et al., 1996).

Figura 1: Principais filos de bactrias que compe a microbiota humana.

Fonte: Adaptado de http://scienceblogs.com.br

Trichomonas vaginalis parasito causador da tricomonase, doena

sexualmente transmissvel no viral mais comum em humanos. Alm disso,

cosmopolita e infecta de 250 a 350 milhes de pessoas no mundo (COSTA et al.,

2005). O parasito se divide por fisso binria, tem um ciclo de vida simples e

habita o lmen e a mucosa do trato urogenital humano (HUPPERT, 2009).

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Figura 2. Ciclo de vida de T. vaginalis.

Fonte: http://fcfrp.usp.br

Trichomonas vaginalis possui a capacidade de realizar a fagocitose,

mecanismo de internalizao de partculas por vesculas fagocticas ou

fagossomos, processo realizado mais frequentemente por clulas fagocticas

como macrfagos (MELLMAN, 1996; CONNER & SCHMID, 2003). Este

fenmeno foi demonstrado por Pereira-Neves & Benchimol (2007) em ensaios em

que foi evidenciado a capacidade de T. vaginalisde ingerir partculas inertes e

clulas de maneira eficiente por mecanismo similar ao observado em outras

clulas fagocticas, porm tal mecanismo ainda no est completamente

elucidado. Alm disso, j foi descrito que T. vaginalisconsegue fagocitar diversos

outros tipos de bactrias, assim como microrganismos eucariticos, tais como

Saccharomyces cerevisiae.

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Street et al. (1984) relataram a interao de Trichomonas com outros

microrganismos patognicos do trato genital e observaram que as espcies

bacterianas de Neisseria gonorrhoeae e Mycoplasma hominis so rapidamente

inativadas e fagocitadas, sugerindo um mecanismo de persistncia da infeco do

parasito. Tal descoberta mostra a relevncia do estudo deste mecanismo

fagoctico de T. vaginaliscom outros agentes causadores de infeces, como B.

fragilis.

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2.REVISO DE LITERATURA

2.1. Bacteroides fragi l is

2.1.1. Aspectos taxonmicos de Bacteroides fragi l is

A famlia Bacteriodaceae compreende 13 gneros, sendo Bacteroides,

Fusobacterium, Prevotella e Porphyromonasos os mais importantes devido

frequncia com a qual causam infeces no organismo hospedeiro. As espcies

do gnero Bacteroidesso bacilos ou cocobacilos gram-negativos (SONG et al.,

2004).

Bacteroides fragilis foi descrita pela primeira vez por Veillon e Zubber em1898 como Bacillus fragilis,sendo includa no gnero Bacteroidespor Castellani e

Chalmers em 1919. Em 1923, o gnero Bacteroidesfoi descrito como sendo este

composto por bacilos anaerbios obrigatrios, gram-positivos e negativos e no

formadores de esporos, e posteriormente, em 1937, Weiss e Rettger excluram os

organismos gram-positivos do gnero Bacteroides.

At o final do sculo XX, devido aos avanos em tcnicas de biologia

molecular, houveram diversas mudanas no gnero Bacteroides, e em 2007,

Wexler relatou que as espcies que fazem parte deste gnero soB. acidifaciens,

B. caccae, B. coprocola, B. coprosuis, B. eggerthi, B. finegoldi, B. fragilis, B.

helcogenes, B. intestinalis, B. massiliensis, B. nordii, B. ovatus, B.

thetaiotaomicron, B. vulgatus, B. plebeius, B. uniformis, B. salyersai, B. pyogenes,

B. finegoldii, B. goldsteinii, B. doreiee B. johnsonii.

2.1.2. Patogenicidade e virulncia de Bacteroides fragi l is

O potencial patognico determinado pelos mecanismos que as bactrias

utilizam para o estabelecimento da enfermidade, como a capacidade de adeso

s clulas epiteliais do organismo hospedeiro, invaso tecidual, resistncia s

defesas do hospedeiro, produo de metablitos e danos teciduais (DUERDEN,

1994; SHARP, 1999).

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A colonizao bacteriana inicia-se com o processo de adeso que contribui

para a sua permanncia no organismo hospedeiro.Bacteroides fragilis se liga s

clulas epiteliais por estruturas como as fmbrias. Desta forma, aps a aderncia

bacteriana s clulas epiteliais do hospedeiro, observam-se mudanas estruturais

e bioqumicas nas mesmas (SHARP, 1999).

Bacteroides fragilis pode ainda produzir enzimas extracelulares que so

capazes de promover a hidrlise nos tecidos do hospedeiros, alterando a sua

estrutura celular (DUERDEN, 1994; SHARP, 1999).

2.2. Trichomonas vaginal is

2.2.1.Aspectos taxonmicos de Trichomonas vaginal is

De acordo com Maciel et al. (2004) em 1836, Donn descreveu pela

primeira vez o parasito Trichomonas vaginalis. No entanto, a pesquisa sobre esse

microrganismo s se iniciou no sculo XX.

Figura 3. Ilustrao de T. vaginalisfeita por Donn em 1836.

Fonte: http://jmb.sagepub.com

A classificao taxonmica indica que o gnero Trichomonaspertence ao

filo Zoomastigina, a classe Parabasalia, ordem Trichomonadida e famlia
http://jmb.sagepub.com/content/17/2/81/F4.fullhttp://jmb.sagepub.com/content/17/2/81/F4.full

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Trichomonadidae (SCHWEBKE & BURGESS, 2004). Tricomonaddeos so

protistas anaerbios facultativos e as trs espcies encontradas no homem so:

T. tenax, T. hominis e T. vaginalis, no entanto, T. tenax e T. hominis so

considerados no patognicos (SCHWEBKE & BURGESS, 2004; TASCA & DE

CARLI, 2007).

2.2.2.Patogenicidade e virulncia de Trichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis tem se destacado como um dos principais

patgenos do homem e da mulher e est associado a srias complicaes de

sade (LEHKER & ALDERETE, 2000). Estudos recentes demonstraram que T.

vaginalis promove a transmisso do vrus da imunodeficincia humana (HIV)(FLEMING & WASSERHEIT, 1999); causa de baixo peso em bebs, bem como

de nascimentos prematuros; predispe mulheres a doena inflamatria plvica

atpica, cncer cervical e infertilidade (MACIEL et al., 2004).

A ao citopatognica de T. vaginalis pode ser dividida em 4 fases:

adeso, citlise, fagocitose e digesto intracelular (MIDLEYJ & BENCHIMOL,

2009).

O estabelecimento de T. vaginalisna vagina se inicia com o aumento do

pH, j que o pH normal neste stio cido (3,8 4,5) e o microrganismo cresce

em pH maior que 5. A elevao do pH vaginal na tricomonase evidente, com

reduo concomitante de Lactobacillus acidophilus e aumento na proporo de

bactrias anaerbias (PETRIN et al., 1998).

Os estudos de Lpez et al. (2000)demonstraram que a interao entre T.

vaginalise o seu hospedeiro um processo complexo, no qual esto envolvidos

componentes associados superfcie celular do parasito, clulas epiteliais do

hospedeiro e tambm componentes solveis encontrados nas secrees vaginal

e uretral. A aderncia e a citotoxicidade exercidas pelos parasitos sobre as

clulas do hospedeiro podem ser ditadas por diversos fatores de virulncia.

Alguns autores indicaram que a atividade fagoctica de T. vaginalis talvez

constitua em um mecanismo patognico (MALDONATO et al.,1998).

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2.3. Fagocitose

De acordo com Alberts et al.(2002), a endocitose um processo pelo qual

uma clula capta macromolculas, substncias particuladas e, em casosespecializados outras clulas. Nesse processo, o material a ser ingerido

progressivamente circundado por uma pequena poro da membrana plasmtica,

a qual invagina-se e ento projeta-se para formar uma vescula endoctica. Um

destes processos especializados de endocitose a fagocitose, no qual alguns

protozorios realizam a sua alimentao. A fagocitose,portanto, consiste no

englobamento de partculas slidas pela membrana celular atravs da formao

de pseudpodes. Aps a adeso da partcula superfcie ocorre a ingesto damesma e a formao do vacolo fagoctico. A fuso deste vacolo aos lisossomos

faz com que as enzimas ali presentes degradem a partcula que se encontra

internalizada (DE SOUZA, 1994).

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3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo geral

Analisar os efeitos da interao entre Bacteroides fragilise Trichomonas vaginalis,

realizando ensaios em diferentes tempos e propores.

3.2. Objetivos especficos

Observar a ultraestrutura de superfcie de T. vaginalis em interao com B.

fragilisatravs de microscopia eletrnica de varredura;

Analisar T. vaginalis aps ensaios de interao atravs de microscopiaeletrnica de transmisso;

Avaliar a proliferao do protozorio in vitro, na ausncia e na presena de

B. fragilis.

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4. JUSTIFICATIVA

Bacteroides fragilis apresenta interesse clnico, bem como T. vaginalis.

Desta forma, levando em considerao que geralmente as infeces poranaerbios so polimicrobianas e que a tricomonase, a doena sexualmente

transmissvel no viral mais comum em humanos, o estudo da interao de B.

fragilis com T. vaginalis se mostra relevante para o entendimento do processo

infeccioso parasitrio bem como bacteriano, mimetizando o stio real do

estabelecimento da infeco.

Street et al. (1984) relataram a interao de Trichomonas com outros

microrganismos patognicos do trato genital e observou que as espciesbacterianas de Neisseria gonorrhoeae e Mycoplasma hominis so rapidamente

inativadas e fagocitadas pelo parasito, sugerindo um mecanismo de persistncia

da infeco. Assim sendo, tal descoberta mostra ainda a relevncia do estudo

deste mecanismo fagoctico de T. vaginalis com outros agentes causadores de

infeces.

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5. METODOLOGIA

5.1. Cultivo de Bacteroides fragi l is

Espcimes de B. fragilis (ATCC25285) foram reativadas em caldo BHI

(Brain Heart Infusion) PRAS (Pre-Reduced Anaerobically Sterilized) a partir de

estoque em BHI-gar inclinado e incubadas em estufa por 24 h a 37C. Critrios

de viabilidade e pureza foram utilizados aps semeadura em placas de gar

sangue suplementadas com vitamina K e hemina. Aps o perodo de incubao,

em ambiente de anaerobiose, as colnias foram repicadas para novo caldo BHI-

PRAS.

5.2. Cultivo de Trichomo nas vaginal is

Trofozotos de T. vaginalis foram cultivados em tubos de vidro de 8ml

contendo 7 mL de meio Trypticase-Yeast Extract-Maltose (TYM) como descrito

por Diamond (1957), acrescido de 10% de soro fetal bovino inativado. As culturas

foram mantidas em estufa a 37C por 24 horas e o meio foi trocado aps este

perodo, que corresponde fase logartmica de crescimento.

5.3. Interao parasito-bactria

Trichomonas vaginalisfoi cultivado em tubo de vidro de 8ml com meio TYM

suplementado com soro fetal bovino a 10% e a bactria foi inoculada ao meio. A

interao protozorio-bactria foi feita na proporo de 1:10, 1:50 e 1:100 em

perodos entre 1h e 12h e testes de viabilidade sero aplicados.

5.4. Microscopia Eletrnica de Varredura

A estrutura dos protozorios e das bactrias foi analisadas por microscopia

eletrnica de varredura. Aps diferentes perodos de interao, as amostras foram

fixadas em soluo contendo glutaraldedo 2.5% e 4% de paraformaldedo

nascente em tampo cacodilato de sdio 0.1 M, pH 7.4, desidratadas em

solues de acetona (de 30 a 100%), secas usando ponto crtico de CO2 e

montadas em suportes. As amostras foram cobertas com ouro (2030 nm) para

observao em Microscpio Eletrnico de Varredura Jeol JSM 6490LV.

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5.5. Microscopia Eletrnica de Transmisso

Experimentos para microscopia eletrnica de transmisso, com diferentes

tempos de interao foram preparados. As amostras foram fixadas em soluocontendo glutaraldedo 2.5% em tampo cacodilato de sdio 0.1 M, pH 7.4,

lavadas no mesmo tampo e ps-fixadas por 40 minutos no escuro em soluo de

tetrxido de smio 1% em tampo cacodilato de sdio 0.1 M, pH 7.4. As amostras

foram lavadas no mesmo tampo, desidratadas em acetona e embebidas em

resina epxi. Seces ultrafinas foram contrastadas com acetato de uranila e

citrato de chumbo e observadas ao Microscpio Eletrnico de Transmisso FEI

SPIRIT 120 Kvolts.

5.6. Avaliao da proliferao de T. vaginalis

Aps diferentes perodos de interao, as amostras foram coradas com

azul de tripan para anlise da viabilidade celular e as clulas vivas sero contadas

em cmara de Neubauer. B. fragilis foi quantificada pela escala de McFarland.

Com os resultados foi montada uma curva de crescimento do protozorio sozinho

e frente a interao com a bactria. Os resultados so representativos de trsexperimentos diferentes.

6. RESULTADOS E DISCUSSO

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6.1. Resultados

Os resultados foram descritos de acordo com os objetivos propostos.

6.1.1. Observao da ultraestrutura de superfcie de T. vaginalis em

interao com B. fragil isatravs de microscopia eletrnica de varredura

A interao do protozorio T. vaginalis com B. fragilis na proporo de

1:100, foi analisada aps 2, 6 e 12 horas, atravs de microscopia eletrnica de

varredura. Aps o perodo de 2 horas, no possvel observar modificaes na

ultraestrutura do parasito (B, C e D) em comparao com o controle sem bactria

(A). Alm disso, possvel observar bactrias aderidas na superfcie do parasito

(setas B, C e D ), e tambm, B. fragilisaparentemente sendo internalizada por T.

vaginalis(estrela D).

Figura 4: Microscopia eletrnica de varredura mostrando ensaios de interao de T. vaginaliscom

B. fragilisna proporo de 1:100, aps 2 horas de interao.

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Aps o perodo de incubao de 6 horas na proporo 1:100parasito-

bactria, no possvel observar modificaes na ultraestrutura do parasito (B, C

e D) em comparao com o controle sem bactria (A). Nota-se bactrias aderidas

na superfcie do parasito (setas em B e C) e bactrias sendo internalizadas

(estrelas em B e C). Alm disso observa-se bactrias aderidas superfcie do

protozorio (setas em D).

Figura 5. Microscopia eletrnica de varredura mostrando ensaios de interao de T. vaginaliscom


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Aps o perodo de interao de 12 horas na proporo de 1:100, nota-se

algumas modificaes na ultraestrutura do parasito, em comparao com o

controle sem bactria (A), principalmente a perda da forma elipside do

protozorio (B e C). Alm disso, observa-se modificaes na disposio das

bactrias, que sugerem a formao de biofilme (B, C e D), devido ao aparente

elevado grau de organizao de B. fragilis.

Figura 6. Microscopia eletrnica de varredura mostrando ensaios de interao de T. vaginaliscom


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6.1.2. Anlise de T. vaginalis aps ensaios de interao atravs de

microscopia eletrnica de transmisso

O protozorio T. vaginalis, aps 6 horas de interao com B. fragilis naproporo de 1:100, foi observado atravs de microscopia eletrnica de

transmisso com o objetivo de confirmar a ocorrncia de fagocitose. A imagem

abaixo mostra B. fragilis internalizada por T. vaginalis(seta).

Figura 7. Microscopia eletrnica de transmisso mostrando ensaios de interao de T. vaginalis

com B. fragilis na proporo de 1:100, aps 6 horas de interao. N Ncleo, H

Hidrogenossomo. Imagem controle cedida por BENCHIMOL, M.

N

H

H

H

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6.1.3. Avaliao da proliferao do protozorio in vit ro , na ausncia e na

presena de B. fragil is

A proliferao do parasito in vitro foi analisada atravs de contagem emcmara de neubauer, utilizando azul de tripan para analisar a viabilidade do

protozorio. O eixo Y mostra o nmero de clulas viveis de T. vaginalis e o eixo

X o tempo em horas. Depois de cada contagem, as amostras foram semeadas em

placas de gar sangue suplementado com vitamina K e hemina e posteriormente

incubadas em ambiente de anaerobiose durante 24 horas 37C para garantir a

de viabilidade de B. fragilis aps as 12 horas de experimento (dados no

mostrados).

Os resultados mostram que na proporo parasito-bactria de 1:10, a partir

de um perodo de 8 horas, a viabilidade de T. vaginalis comprometida em

relao ao controle.

Grfico 1. Viabilidade celular de T. vaginalisem perodos de 0 a 12 horas, em interao com B.

fragilisna proporo de 1:10 (vermelho), em comparao com o controle (azul).

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Em ensaios de interao na proporo de 1:50, observado uma queda

mais expressiva no nmero de parasitos viveis em comparao ao ensaio

performado na proporo de 1:10 a partir de 2 horas de interao.



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Em ensaios de interao na proporo de 1:100, observado uma queda

expressiva no nmero de parasitos viveis aps 6 horas de interao, em

comparao com ensaios de interao em outras propores menores. A partir de

10 horas de interao j no so mais observadas clulas viveis.



Os resultados demonstram que o nmero de clulas vaveis de T. vaginalis

est diretamente relacionado com a proporo deB. fragilis. Tais resultados so

condizentes com as imagens obtidas atravs de microscopia eletrnica de

varredura.

6.2. Discusso

Infeces geniturinrias so dividas em duas categorias principais:

infeces primrias, devido a microorganismos patognicos sexualmente

transmissveis, como parasitos (Trichomonas vaginalis), bactrias (Treponema

pallidum, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi) e

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vrus (Herpes simplex), e infeces devido aos membros da microbiota, como

Bacteroides fragilise membros da famlia Enterobacteriaceae (RONALD, A.R. &

ALFA, M.J., 1996). Com isso, o estudo dos microrganismos residentes no trato

genital feminino tem aumentado em funo dessa relao existente da microbiota

com as infeces ginecolgicas.

No processo infeccioso, as bactrias atuam tanto como patgenos nicos

quanto em associaes com microrganismos facultativos, e cerca de 50% das

bactrias encontradas nas secrees vaginais e cervicais so anaerbias. Por

estes fatores, tm-se observado a necessidade de estudos de microorganismos

anaerbios com outros microrganismos existente, de maneira facultativa ou no,

no trato genital feminino (GORBACH et al., 1973; ENGELKIRK et al., 1992;

FERREIRA et al., 2003).

No presente estudo, foi analizada a interao de Trichomonas vaginalise

Bacteroides fragilis em diferentes perodos de tempo e propores, com o objetivo

de analisar essa interao a nvel ultraestrutural, afim de verificar a presena de

modificaes morfolgicas indicativas de fagocitose atravs de microscopia

eletrnica de varredura. Os resultados mostraram bactrias aderidas ao parasito esendo aparentemente internalizadas. Benchimol (1995) realizou a interao de T.

vaginalis com bactrias da espcie Escherichia coli e obteve resultados

semelhantes. Em seu estudo, E. coli foi rapidamente fagocitada e inativada por T.

vaginalis.

Anlises realizadas por microscopia eletrnica de transmisso mostraram

que aps o perodo de 6h de interao, so encontradas no interior do parasito,

estruturas alongadas incomuns, semelhante a B. fragilis, indicando a

interiorarizao da bactria pelo parasito. E apesar de no estar totalmente

elucidado, possvel tambm deduzir que esta fagocitose do parasito possa ser

uma tentativa para o balano ecolgico do meio, como mecanismo de

persistncia da infeco pelo parasito, resultados estes que confirmam os obtidos

por Street et al. (1984).

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Diversos estudos j avaliaram a capacidade de endocitose de T. vaginalis.

Pereira-Neves & Benchimol (2007) demonstraram que T. vaginalispode realizar

dois tipos diferentes de fagocitose. Uma a fagocitose clssica, com a emisso

de pseudpodes. A segunda, fagocitose por afundamento, onde no h a

emisso de pseudpodes. Nesse estudo no foi observado a ocorrncia de

fagocitose clssica. Isso se deve, provavelmente, ao fato da cepa utilizada de T.

vaginalis ter sido mantida em cultura desde os anos 80. Existem diversos estudos

que indicam que cepas selvagens de T. vaginalisrealizam a fagocitose clssica

mais frequentemente do que cepas domesticadas.

Aps estas observaes, foi analisado a viabilidade do parasito na

interao com Bacteroides fragilis, os ensaios foram realizados utilizando

diferentes propores parasito-bactria, e foi constatado que ao decorrer do

tempo, com incio entre 2 e 8h de interao, o nmero de T. Vaginalis diminui em

comparao com o controle, estes dados sugeriram, portanto, que o parasito

fagocita a bactria numa tentativa de persistncia da infeco, porm este

mecanismo no o bastante, e Bacteroides fragilis consegue contornar esta

investida do parasito. Os estudos de Rudek e Haque (1976) demonstraram que B.

fragilispode produzir e liberar desoxiribonucleases, proteases e lipases no meio

extracelular. A produo destes metablitos uma possvel explicao para a

morte de T. vaginalisquando em interao com B. fragilisdurante longos perodos

de tempo. Essa explicao fortemente justificada pela reduo do nmero de

parasitos viveis de acordo com o aumento da proporo parasito-bactria.

Outra possvel explicao para a morte do protozorio o fato da interao

ocorrer em sistema fechado. Este modelo pode causar a competio de nutrientesentre ambos microrganismos e esta tambm uma possvel explicao para os

resultados obtidos.

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7. CONSIDERAES FINAIS

Trichomonas vaginalis foi capaz de fagocitar B. fragilis em todos

experimentos realizados, nas propores de 1:10, 1:50 e 1:100;

Durante os ensaios de interao, foi mostrado que a ultraestrutura de T.

vaginalis drasticamente modificada aps um perodo de 12 horas, mas

alteraes j podem ser notadas a partir de 6 horas, e isso provavelmente

ocorre devido a metablitos produzidos por B. fragilis;

A viabilidade celular de T. vaginalis decai de acordo com o tempo de

incubao e proporo de B. fragilis, no entanto, a viabilidade de B. fragilis

mantida mesmo depois de 12 horas de interao (dados no mostrados);

Foram encontradas evidncias que B. fragilis forma biofilme aps longos

perodos de incubao.

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8. PERSPECTIVAS FUTURAS

Estudos futuros so necessrios para averiguar outros aspectos

importantes do processo de fagocitose do parasito, como o provavel papelde receptores e outros mecanismos responsveis pela adeso de B. fragilis

no corpo celular de T. vaginalis;

Ser realizado o experimento, utilizando uma cepa selvagem de T.

vaginalis a fim de se obter um resultado comparativo;

Novos ensaios de interao sero performados utilizando uma cepa de

isolado de B. fragilis;

Ainda, afim de se obter mais resultados comparativos, sero realizados

experimentos utilizando outras espcies de Bacteroides.

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9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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