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PREPARO DE LMINAS HISTOLGICAS

Ana Lcia Tosta Ribeiro, Anderson Carrijo da Costa,

Cntia Ruiz Denadai, rika Maria Antonino Fonseca,

Fabiana Peghim, Janayne Aparecida Pentino,

Luiz Alves Rodrigues, Priscila Maria Antonini,

Teresinha de Jesus Borin de Carvalho,

Vanessa Cristina Mazzi

Centro Universitrio da Fundao Educacional de Barretos

INTRODUO

O mtodo mais comum usado em histologia vegetal permite a obteno

de preparados histolgicos permanentes (lminas) para estudo ao microscpio

ptico. Nesse instrumento os objetos so examinados por transparncia e

como rgos muito delgados so raros, a maioria precisa ser reduzida a cortes

finos, suficientemente transparentes para serem examinados ao microscpio.

Estes cortes so feitos com um micrtomo, mas antes de serem cortados os

tecidos devem passar por uma srie de tratamentos.

Obviamente, o que se deseja levar ao microscpio um preparo no qual

os tecidos estejam perfeitamente preservados, apresentando a mesma

estrutura e composio qumica que possuam quando vivos. Mas apesar dos

cuidados tomados, esse ideal no alcanado plenamente, observando-se em

todos os cortes histolgicos certos artefatos decorrentes do processamento que

sofreram.

A fim de evitar a destruio das clulas por suas prprias enzimas, ou

por bactrias, os tecidos removidos devem ser adequadamente tratados

imediatamente aps a sua retirada. Esse tratamento denominado fixao. A

principal funo dos fixadores insolubilizar as protenas dos tecidos.

Para obteno dos cortes, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos

por substncia de consistncia firme. As substncias mais usadas para essa

finalidade (meios de incluso) so a parafina e as resinas plsticas.

Os tecidos devem sofrer uma srie de tratamentos antes da

impregnao. Na primeira etapa do processo, denominada desidratao, a

gua extrada dos tecidos pela passagem dos mesmos em banhos de

concentraes crescentes de etanol, geralmente de 70%, at etanol puro

(100%).

Em seguida, o etanol substitudo por um lquido miscvel e geralmente

usa-se xilol ou benzol. Os tecidos embebidos nessas substncias tornam-se

translcidos, razo por que essa etapa denominada clareamento.

Mergulham-se, ento, os tecidos em parafina fundida numa estufa a 60C.

Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam, e os espaos anteriormente

ocupados pela parafina ficam livres. Coloca-se o tecido num recipiente

contendo um pouco de parafina fundida e deixa-se solidificar, formando-se um

bloco de parafina com o tecido no seu interior (incluso).

Os blocos de parafina, contendo os tecidos includos, so seccionados pela

navalha de ao do micrtomo, obtendo-se geralmente cortes de 6 a 8 m de

espessura.

A maioria dos tecidos incolor, o que torna difcil sua observao ao

microscpio ptico. Devido a isso, foram introduzidos mtodos para a

colorao dos tecidos, de modo a tornar seus componentes visveis e

destacados uns dos outros.

A maioria dos corantes usados em histologia comporta-se como cidos

ou bases e tendem a formar ligaes salinas com radicais ionizveis presentes

nos tecidos.

A hematoxilina comporta-se como um corante bsico, ligando-se s

estruturas basfilas dos tecidos. A hematoxilina cora em azul os ncleos

celulares e outras estruturas de natureza cida, como regies do citoplasma

ricas em RNA e espessamentos celulares de celulose.

Ao estudar um corte histolgico no microscpio, preciso ter em mente

que a estrutura das clulas e tecidos est alterada pela tcnica histolgica. As

etapas da tcnica histolgica, subseqentes fixao (desidratao,

clareamento, impregnao e colorao), tambm introduzem algumas

modificaes nos tecidos, que no devem dificultar a caracterizao das

estruturas estudadas.

Alm disso, a delgada espessura dos cortes cria um obstculo ao estudo

tridimensional dos tecidos e rgos. Para se chegar a compreender a

arquitetura tridimensional de um rgo ou tecido, torna-se necessrio o estudo

de cortes realizados em diferentes direes.

MATERIAIS E MTODOS

Para a realizao dos cortes histolgicos, foram cortados e retirados

segmentos no 1/3 proximal da regio laminar, retirando cerca de 1 cm2 cada

pea nas folhas de Hibiscus rosacinencis L. com auxlio de uma rgua e

tesoura. Estes pedaos de folhas foram submetidos s seguintes metodologias:

Metodologia I:

Utilizou-se a mesma tcnica para os cortes histolgicos de tecido animal,

procedendo desidratao, clareamento, impregnao, incluso e a colorao

com o auxilio de cassete (Lupe), pinas, bqueres, cronmetro, proveta,

estufa, geladeira, micrtomo, lminas, lamnulas, resina Permount (Fisher

Scientific) e o microscpio para visualizao dos cortes preparados.

Consistindo-se na passagem dos cassete (Lupe) (onde contm a pea da

planta) nas seguintes substncias e nos tempos indicados:

DESIDRATAO:

lcool 70% 30 minutos





lcool absoluto I 30 minutos

lcool absoluto II 30 minutos

lcool absoluto / xilol 30 minutos

CLAREAMENTO:

Xilol I 20 minutos

Xilol II 20 minutos

Xilol III 20 minutos

IMPREGNAO:

Parafina I 30 minutos

Parafina II 30 minutos

Parafina III 30 minutos

Aps estes procedimentos, realizou-se a incluso da pea no molde de

parafina, onde ela inclusa no centro do molde at completa solidificao,

resfriada e levada a geladeira por no mnimo 40 minutos. A pea moldada de

acordo com o tamanho do micrtomo, sendo realizado os cortes de 7 m que

so levados ao banho-maria na temperatura entorno de 50C. Os cortes so

colocados na lmina e corados com a hematoxilina (HE), seguindo os tempos

necessrios:

Xilol I 7 minutos

Xilol II 7 minutos

lcool absoluto I passagem

lcool absoluto II passagem

lcool 90% passagem

lcool 70% passagem

gua 2 minutos

Hematoxilina 2 minutos

gua 2 minutos

lcool 70% passagem



Xilol I passagem

Xilol II passagem

Xilol III passagem

Feita a colorao, as lamnulas foram fixadas nas lminas com permount,

estando pronta para a visualizao no microscpio.

METODOLOGIA II:

Aplicou-se a tcnica anterior mudando somente o tempo de permanncia

do xilol no clareamento, de 20 minutos para 10 e 5 minutos. Na colorao, de

7 minutos para 3 e posteriormente para 1minuto, seguindo normalmente as

outras etapas at visualizao.

METODOLOGIA III:

Quando as peas das plantas foram removidas, elas ficaram por cerca de

12 horas no formol para que fosse realizada a fixao e prosseguiu-se

normalmente com a desidratao, clareamento, impregnao e colorao da

metodologia anterior.

METODOLOGIA IV:

As peas foram colocadas por 10 minutos na gua destilada, 20 minutos

no xilol, incluidas no molde de parafina e ento foram feitos os cortes no

micrtomo.

METODOLOGIA V:

As peas contidas no cassete (Lupe) passaram pelos seguintes

procedimentos:

gua destilada 10 minutos

Xilol 20 minutos

Descansou at que o xilol tenha escorrido.

Xilol 20 minutos

Depois foram colocadas em parafina e levadas para a estufa a 56C. Fez-

se a incluso nos moldes, esperou-se secarem e foram levadas para a

geladeira. As peas foram moldadas no micrtomo e feitos os cortes, tiradas

do banho-maria e passadas para as lminas, fazendo-se a colorao nas

seguintes substncias:

Hipoclorito 7 minutos

Hematoxilina 1 minuto

gua de torneira lavagem

Lugol 1 minuto

As lamnulas foram fixadas nas lminas com Permount (Fisher

Scientific) e visualizadas ao microscpio.

METODOLOGIA VI:

Utilizou-se o procedimento da desidratao, clareamento, impregnao e a

incluso da metodologia I, e cortes no tamanho de 20, 25 e 40 m.

Para a colorao foram usadas as seguintes substncias e tempos:

Xilol I 1 minuto

Xilol II 1 minuto



lcool 90% passagem

lcool 70% passagem


Hipoclorito 5 minutos


Lugol 1 minuto

Hematoxilina 38 segundos


lcool 70% passagem

lcool 90% passagem


Xilol I passagem

Xilol II passagem

Xilol III passagem

Aps a colorao as lamnulas foram colocadas nas lminas com Permount

(Fisher Scientific) e visualizadas ao microscpio.

METODOLOGIA VII:

Fez-se o mesmo procedimento da metodologia V, mudando as

substncias e tempos na colorao:

Xilol I 3 minutos

Xilol II 3 minutos



lcool 90% passagem

lcool 70% passagem


Lugol 5 minutos

Hematoxilina 38 segundos


lcool 70% passagem

lcool 90% passagem



Xilol I passagem

Xilol II passagem

Xilol III passagem

Foram colocadas as lamnulas e visualizadas ao microscpio.

RESULTADOS

Todas as Metodologias I a VI descritas e testadas, no produziram cortes

bons, montados em lminas para visualizao ao microscpio ptico adequadas,

tornando-se difcil a distino dos tecidos a serem estudados.

As figuras abaixo mostram os cortes obtidos com a Metodologia VII que

mostrou-se a mais indicada para o estudo de cortes da regio laminar de

folhas de vegetais.

Figura 1

Figura 2

Figura 3

Dependendo da finalidade a que se destina pode-se montar os cortes em

lminas para observao imediata ou em lminas ditas permanentes. Neste

estudo obtivemos os melhores cortes semi-permanentes com a Metodologia

VII.

Outra dificuldade encontrada no estudo da histologia decorreu do fato de

que, quando se cora um preparado histolgico, dependendo da tcnica

empregada, apenas alguns aspectos das estruturas teciduais so evidenciados.

difcil o preparo de uma lmina que mostre todos componentes celulares e

todos os detalhes dos tecidos.

Leia mais sobre a produo de lminas vegetais em:

a) Junqueira, L. C.; Carneiro, J.; Histologia Bsica, 8 edio, Editora

Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1995.

b) Esau, K., Anatomia das Plantas com Sementes; Editora Edgard Blucher,

S.P.,1974.

Figuras e legendas

Figura 1: corte de folha de Hibiscus rosacinencis L.,

corado com lugol no tamanho de 20 m.


corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.


corado com hematoxilina no tamanho de 20 m.

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