TCNICAS HISTOLGICAS

La Histologa es una disciplina con ms de 100 aos de antigedad, en este tiempo los histlogos han

desarrollado gran cantidad de instrumentos, tcnicas y procesos para poder visualizar las clulas y los

tejidos. Describir todos estos instrumentos, tcnicas y procesos sera motivo de una coleccin de libros

completa.

El objetivo de este manual es introducir al estudiante en el conocimiento de las tcnicas e instrumentos

ms habituales en un laboratorio de Histologa, con el objetivo que el estudiante entienda cmo se han

obtenido las muestras que luego estudiar al microscopio y as mejorar su proceso de aprendizaje.

Por esto centraremos el guin principal de este tema en las tcnicas e instrumentos ms habitualmente

utilizados y en la parte final explicaremos otros tipos de instrumentos, tcnicas y protocolos, que aunque

se usan en Histologa lo hacen de forma espordica, para estudios determinados y especficos.

EL MICROSCOPIO

La Histologa se centra en el estudio de clulas y tejidos. Dado el pequeo tamao de estas estructuras, el

histlogo requiere de sistemas de aumento de la imagen, lo que conocemos como microscopios, ya que a

simple vista estas estructuras resultan tan pequeas que no pueden ser claramente discernidas.

En la actualidad hay mltiples tipos de microscopios, aunque el microscopio ptico de campo claro es la

herramienta bsica de estudio y como tal el estudiante debe conocerlo suficientemente.

Para empezar, hay una serie de hechos que el estudiante debe conocer:

A.- El ojo humano es capaz de distinguir cosas pequeas, pero como cualquier otro sistema ptico, tiene

un lmite; es decir, llega un momento que no es capaz de distinguir dos puntos como elementos separados

sino como un slo elemento. A esta separacin mnima que permite reconocer dos puntos como separados

se le conoce como "Lmite de resolucin". Esto ha hecho que el ser humano haya buscado sistemas para

ampliar la imagen.

B.- El desarrollo de las primeras lentes en el siglo XVII provoc la aparicin de los primeros y rudimentarios

microscopios. Desde entonces, los microscopios han evolucionado hasta los actuales. A pesar de este

desarrollo los microscopios pticos tienen un lmite de resolucin que limita los aumentos y que viene

determinado por la naturaleza propia de la luz.

C.- Hoy en da los mejores microscopios pticos no sobrepasan los 1000 - 1500 aumentos y tienen un lmite

de resolucin de 0,2 m (0,0002 mm).

D.- Se llaman microscopios simples a aquellos que tienen una, o un nico conjunto de lentes. Es lo que

coloquialmente se conoce como lupa.

E.- Se llaman microscopios compuestos a aquellos que tienen dos lentes o conjuntos de lentes, unas se

conocen como lentes objetivos y las otras como lentes oculares. Los microscopios de laboratorio actuales

son microscopios compuestos.

F.- En un microscopio compuesto es fundamental que la muestra a observar sea muy fina para que la luz

pueda atravesarla y llegar a la lente objetivo.

G.- La luz atraviesa los diferentes tejidos de un corte de forma similar por lo que resulta casi imposible

distinguir los diferentes componentes del corte. Es por eso que resulta necesario teir los cortes para poder

distinguir sus elementos componentes.

Adems hay una serie de conceptos y definiciones relacionados con la microscopa que el estudiante

tambin debe conocer para entender el microscopio y as manejarlo con ms eficiencia.

CONCEPTOS Y DEFINICIONES:

- Aumento: Es el nmero de veces que un sistema de microscopio puede incrementar el tamao de la

imagen de un objeto.

- Poder de resolucin: Es la capacidad de un sistema ptico de mostrar como elementos separados dos

puntos muy cercanos entre s.

- Lmite de resolucin: Es la distancia ms pequea a la que un microscopio puede mostrar dos puntos

prximos como elementos separados y no como un nico punto. Este parmetro depende de la longitud

de onda de la luz (energa utilizada) y la apertura numrica del objetivo utilizado. En trminos prcticos en

un microscopio ptico convencional con un objetivo de 100x (y ocular y lentes intermedias de 15x, es decir

a unos 1500 aumentos) es de 0,2 m. Se calcula mediante la frmula: LR=/2AN (donde representa la

longitud de onda y AN la apertura numrica).

- Apertura numrica: Es la capacidad del objetivo para dejar pasar la luz (mide el cono de luz que un objetivo

puede admitir). Es nica para cada objetivo.

- Profundidad de campo: Es la distancia entre las partes ms separadas de un objeto (siguiendo el eje ptico

del microscopio), que pueden verse sin necesidad de modificar el enfoque. Esta distancia es mayor en los

objetivos de pequeo aumento y menor en los de mayor aumento.

El Microscopio ptico es un instrumento de precisin formado por multitud de piezas y partes, de las que

es conveniente el estudiante conozca las ms importantes.

- Ocular: Es el conjunto de lentes que forma la imagen final ampliada que observamos.

- Revlver porta-objetivos: Los microscopios actuales suelen llevar varios objetivos que se disponen en una

rueda llamada revlver. Para colocar el objetivo deseado hay que mover el revlver hasta la posicin

apropiada. Podemos encontrar microscopios dotados con revlver de 3, 4 o 5 posiciones.

- Objetivo: Es el dispositivo que contiene el conjunto de lentes que captan la luz proveniente de la muestra

y generan la primera ampliacin, los hay de diferentes aumentos.

- Platina porta-muestras: Es la superficie donde se coloca la muestra a observar.

- Sistema Keller: Permiten centrar el haz de luz en el eje ptico del microscopio. (No todos los microscopios

disponen de estos sistemas).

- Condensador: Permite concentrar el haz de luz en una zona pequea de la muestra. (No visible en el

esquema).

- Diafragma: Permite regular el contraste de la imagen.

- Control de intensidad de luz: Muchos microscopios actuales disponen de este dispositivo de control de la

intensidad luminosa.

- Ruedas de desplazamiento: Son los mandos que permiten desplazar la muestra a lo largo y ancho de la

platina porta-muestras (ejes X e Y).

- Control de enfoque micromtrico: Permite el foco fino mediante ligeros desplazamientos (en el eje Z) de

la platina porta-muestras.

- Control de enfoque macromtrico: Permite la aproximacin al plano focal mediante mayores

desplazamientos de la platina porta-muestras a lo largo del eje Z (vertical).

- Estativo: Es la carcasa metlica que sirve de soporte a todo el resto del sistema. El estativo se acopla a la

base formando un bloque slido y estable.

Diferentes conjuntos de lentes y otros elementos pticos definen la trayectoria de la luz en el microscopio.

1.- La luz necesaria para el funcionamiento del microscopio es generada por una bombilla.

2.- El dimetro del haz se restringe mediante el uso de una apertura (una placa metlica con un agujero.

3.- Las lentes condensadoras condensan el haz sobre la muestra.

4.- El objetivo realiza una primera ampliacin de la imagen. La ampliacin depende del objetivo elegido.

5.- Un prisma cambia la direccin de la luz para realizar una observacin cmoda en un ngulo correcto.

6.- El ocular realiza la segunda y definitiva ampliacin de la imagen.

Como se puede observar en el esquema los elementos pticos presentes en un microscopio son numerosos

y variados y los podemos dividir en dos categoras: aquellos destinados a generar, modular, concentrar y

condensar la luz (como diafragmas, condensadores, aperturas, etc...) y aquellos otros destinados a ampliar

la imagen (objetivos y oculares).

Sin duda los ms importantes son objetivos y oculares.

- Objetivos: El microscopio suele disponer de tantos objetivos diferentes como posiciones tiene el revlver,

los ms habituales son los revlveres de 4 posiciones. La variedad de objetivos en el mercado es grande,

aunque los 4 objetivos ms habituales en los microscopios de laboratorio suelen ser 4x, 10x, 40x y 100x,

siendo este ltimo de inmersin.

- Oculares: Todo microscopio de laboratorio convencional dispone de 1 (si es monocular) o de dos oculares

iguales (si es binocular). Los oculares ms habituales con de 10 aumentos (10x) aunque algunos fabricantes

ofertan, para trabajos especiales, otros oculares (5x o 15x, por ejemplo).

Teniendo en cuenta que los aumentos totales de un microscopio es el resultado de la multiplicacin de los

aumentos parciales de objetivo y ocular podemos deducir que el rango de aumentos de un microscopio

ptico convencional va de 40x a 1.000x.

En los microscopios binoculares un o los dos oculares pueden graduarse, lo que permite una correcta visin

binocular incluso si se usa gafas, cuya correccin ptica puede compensarse graduando los oculares. En un

microscopio monocular no es necesario ni esto.

EN LA MAYORA DE CASOS NO ES NECESARIO USAR LAS GAFAS CON EL MCIROSCOPIO.

El estudiante debe aprender a operar el microscopio correctamente. El primer paso es comprobar que el

microscopio est correctamente conectado y la luz funciona con la intensidad adecuada.

En primer lugar, recordar al estudiante que use gafas que debe ajustar los oculares.

Aunque parezca obvio hay que colocar la preparacin correctamente, es decir con el cubreobjetos hacia

arriba.

El estudio de cualquier preparacin debe empezar con el objetivo ms pequeo (en muchos microscopios

el objetivo 4 X). Lo ms habitual es estudiar toda la superficie de la muestra para localizar las diferentes

estructuras.

Una vez localizada la estructura que se desea estudiar cambiar al siguiente objetivo (10x) y realizar la misma

operacin, hasta llegar, si es preciso, al objetivo de mayor aumento (100x).

Sin duda el estudiante conocer el concepto de "Difraccin de la luz", el cual se puede resumir diciendo

que la luz cambia ligeramente de direccin cuando pasa de un medio a otro (por ejemplo del vidrio al aire).

El cambio de direccin se da segn un ngulo que depende de cada uno de los medios y que puede

expresarse por un valor nico para cada medio que se conoce como "ndice de refraccin".

Usando objetivos de poco aumento este fenmeno apenas afecta a la observacin, pero s que se convierte

un inconveniente cuando usamos un objetivo de 100x, fundamentalmente debido a que a estos aumentos

la preparacin debe estar muy cerca del objetivo y el cambio de direccin de la luz desde el vidrio

(portaobjetos) al aire y otra vez al vidrio (lente) provoca que no pueda enfocarse correctamente la muestra.

Para evitar esto se debe colocar, entre la lente del objetivo y la parte superior de la muestra una pequea

gota de un aceite especial (aceite de inmersin), el cual tiene un ndice de refraccin similar al del vidrio,

por lo que la luz no cambia de direccin en esta interface y consecuentemente se puede enfocar sin

problemas.

Si despus de estudiar la muestra con el objetivo 100x fuera necesario volver a estudiarla con el objetivo

40x es necesario recordar que la muestra an tiene una gota de aceite de inmersin que ensuciar este

objetivo, por lo que ser necesario limpiarla con un pauelo o trozo de papel suave empapado en solucin

limpiadora.

Una vez acabada la observacin se debe retirar la preparacin limpiarla, como se acaba de describir, al igual

que el objetivo de 100x.

Al terminar el perodo de observacin se debe comprobar que tanto el microscopio (platina, objetivos), as

como las preparaciones estn totalmente limpios.

Tambin comprobaremos que el microscopio est correctamente desconectado y nos aseguraremos de

dejar colocado el objetivo ms pequeo, para facilitar el siguiente uso del microscopio.

PREPARACIN DE MUESTRAS

Ahora que conocemos que el microscopio ptico obtiene una imagen ampliada al atravesar la luz una

muestra y un conjunto de lentes, resulta evidente que no podemos estudiar un rgano o un trozo de un

rgano al microscopio, ya que la luz no la podra atravesar. Se hace necesario obtener muestras finas que

la luz pueda atravesar y se puedan estudiar al microscopio.

Cmo hacer para obtener muestras finas?

La respuesta es obvia, hay que realizar cortes finos del rgano a estudiar, lo cual no resulta fcil, esto lo

podr comprobar el estudiante si intenta cortar con un cuchillo muy afilado un trozo de carne fresca,

comprobar que no puede obtener lminas finas. Esto es debido a que la carne fresca no tiene ni la

consistencia ni la dureza necesaria para poder obtener cortes lo suficientemente finos, mientras que si

congelamos la carne o la dejamos secar, si que resulta posible cortar la carne, ya que esta, en ambos

procesos, ha aumentado su dureza y consistencia

Como los rganos a estudiar tienen una consistencia similar al trozo de carne fresca del ejemplo se hace

necesario incrementar la dureza y consistencia de forma artificial, para ello existen diferentes mtodos,

siendo el mtodo ms empleado la inclusin en parafina. No es un proceso simple y consta de numerosos

pasos.

1.- FIJACIN

El material biolgico, a partir del momento de la muerte, sufre un proceso de degradacin, conocido como

putrefaccin, debido tanto a causas endgenas (autolisis) o exgenas (ataques bacterianos). Resulta

evidente que esta degradacin dificulta progresivamente (a ms tiempo ms degradacin) el estudio de las

estructuras biolgicas al microscopio.

Para evitar esta degradacin se hace necesario estabilizar las estructuras y hacerlas inasequibles a tal

degradacin, para ello se utilizan sustancias qumicas conocidas como "fijadores". La naturaleza qumica de

los fijadores es variada aunque suelen ser molculas con varios grupos activos que se unen a diferentes

molculas de la clula generando una red molecular interconectada que hace los ataques bacterianos y

enzimticos sean infructuosos, manteniendo de esta manera la estructura celular.

Para las tcnicas de microscopa ptica convencional se suelen utilizar fijadores basados en el

formaldehido, bien sea en soluciones tamponadas o mezclado con otras especies qumicas (como con el

cido pcrico en el caso del fijador de Bouin).

La forma de administrar el fijador a la muestra depende mucho de las circunstancias de obtencin.

- As, en muestras humanas (y animales) obtenidas post-mortem (necropsias) u obtenidas por extraccin

directa (biopsias), el mtodo de fijacin es sencillo: se sumerge la muestra en un recipiente lleno de la

sustancia fijadora. El fijador debe difundir por los tejidos para realizar su accin. A veces, y dependiendo

de la naturaleza de los tejidos esta penetracin no es completa y se observa un gradiente de fijacin,

estando mejor fijadas las zonas perifricas y con peor fijacin, las zonas centrales.

- En el caso de animales de experimentacin y para evitar el efecto de gradiente de fijacin se suele utilizar

el mtodo de la perfusin. La idea es sencilla: se trata de inyectar el lquido fijador en el sistema

cardiovascular para que este lo distribuya por todo el organismo y as la fijacin sea homognea en todos

los tejidos. Normalmente se suele inyectar el lquido fijador a la altura del ventrculo cardaco o arteria

aorta y se debe drenar la sangre a la altura de la aurcula para evitar una sobrepresin del sistema que

produzca rotura de capilares sanguneos.

Sea en un caso o en el otro se deja la pieza un tiempo para que el lquido fijador concluya su efecto. En este

punto la pieza se introduce en un casete porta-muestras (una pequea caja de plstico agujereada). Este

porta-muestras permite el fcil cambio de las muestras de unos recipientes a otros manteniendo la

integridad de la pieza. Pasado el tiempo de fijacin la pieza debe limpiarse con frecuentes baos de agua,

primero agua corriente y posteriormente agua destilada, para eliminar los restos de fijador que pudieran

reaccionar con las sustancias qumicas que debern ser usadas posteriormente.

2.- INCLUSIN

La inclusin es el proceso por el cual se incrementar la dureza y consistencia de la pieza para permitir su

corte. Esto se consigue incluyendo la pieza en una sustancia que tenga la dureza y consistencia adecuada.

La sustancia habitualmente utilizada en este proceso es la parafina. El reto consiste en sustituir el agua que

hay en el interior y exterior de las clulas por parafina.

La parafina es una sustancia que por encima de los 600C es lquida y solidifica por debajo de esta

temperatura, esto facilita de difusin de la parafina por los tejidos cuando est lquida, no obstante otro

problema que hay que salvar es el hecho que la parafina es altamente hidrfoba, es decir no se puede

mezclar con el agua o sustancias en medio acuoso. Por ello el siguiente paso que debe sufrir las muestras

es la eliminacin del agua de la muestra: la deshidratacin.

La deshidratacin de las muestras se consigue mediante una sustitucin progresiva del agua por etanol.

Para conseguirlo se somete a las piezas a sucesivos baos de etanol de gradacin creciente, empezando

por etanol 500 700 y concluyendo con diferentes baos de etanol absoluto (1000), pasando por baos

de etanol 960.

La pieza, ya deshidratada, an no puede ser pasada a parafina ya que el etanol no es miscible con la

parafina. Se usa un agente intermediario, es decir una sustancia que sea miscible tanto con el etanol como

con la parafina. El intermediario habitualmente usado es el Xileno, en el que la pieza sufre varios baos

para sustituir totalmente al etanol.

Con la pieza en Xileno, se suele pasar por un bao de una mezcla de Xileno-Parafina al 50% para favorecer

la penetracin de la parafina. Posterior a este bao se suceden varios baos en parafina pura hasta

conseguir que la parafina haya penetrado completamente en toda la pieza. Todos estos baos que

incorporan parafina se realizan en estufa 600C para mantener la parafina lquida. En algunos laboratorios

todo este proceso se realiza de forma automatizada usando un dispositivo (robot), que va cambiando las

muestras de un lquido a otro mediante un programa preestablecido.

Una vez pasado el tiempo necesario para que la parafina penetre en los tejidos, la cuestin es realizar un

bloque con todo ello, que pueda ser usado en el micrtomo para obtener cortes.

La forma ms sencilla es usar un molde en el que se vierte la parafina y en el que se introduce la muestra

procesada y se deja enfriar para que el conjunto se solidifique. En muchos laboratorios se utiliza una

estacin a tal efecto. Estas estaciones disponen de depsito de parafina lquida (600C), desde el que se

puede dispensar parafina sobre el molde mediante un grifo; dispone tambin de una cmara donde se

guardan los diferentes moldes a 600C y una placa caliente (600C) y otra fra (40C). La dinmica es sencilla,

se coloca el molde debajo del grifo dispensador de parafina y se llena con parafina lquida, se coloca la pieza

y se orienta, colocando, por ltimo la base del casete de inclusin. Se desplaza con cuidado el conjunto

encima de la placa fra para conseguir una solidificacin rpida que no forme cristales y una vez solidificado

se extrae el molde obteniendo un bloque listo para cortar, tal y como se ve en el esquema interactivo.

3.- CORTE (EL MICRTOMO)

El micrtomo (del griego, micros "pequeo" y tomos "seccin/parte") es el instrumento adecuado para

obtener cortes finos de material biolgico incluido en parafina.

En esencia, el micrtomo consta de una cuchilla fija y de un brazo mvil, el cual adelanta y sube y baja la

muestra, para que esta incida sobre la cuchilla y as obtener los cortes. A este tipo de micrtomos se ls

denomina "micrtomo rotatrio o de Minot".

El brazo es capaz de adelantar la muestra distancias muy pequeas (habitualmente de 5 a 10 m) gracias

a un sistema mecnico de precisin basado en un tornillo sin fin de paso de rosca muy fino.

En el extremo del brazo hay unja pinza en la que encajan las bases de casete utilizadas para formar el

bloque. El brazo avanza con el bloque en posicin elevada, cuando ha avanzado la cantidad de micras

deseada el brazo baja el bloque incide sobre el filo de la cuchilla y el corte se deposita sobre ella, cuando

el brazo llega a su posicin inferior, vuelve a subir e inicia un nuevo ciclo de corte. El proceso se controla

mediante una manivela circular, que al ser accionada concluye un ciclo de corte por cada vuelta.

Las cuchillas de microtoma estn muy afiladas para conseguir cortes finos y homogneos, en la mayora

de laboratorios se suelen utilizar cuchillas intercambiables, que son sustituidas cuando pierden filo.

Al incidir el bloque en el filo de la cuchilla, por el rozamiento, se incrementa la temperatura lo suficiente

para que el borde del nuevo corte su funda ligeramente y se una con el corte previo, as, al realizar varios

cortes, estos forman una tira sobre la superficie de la cuchilla.

4.- MONTAJE DE CORTES

Para poder observar los cortes al microscopio es necesario montarlos sobre una fina lmina de vidrio

(portaobjetos).

Para ello, en primer lugar se separan los cortes uno a uno o en pequeas tiras que puedan ser montadas

sobre el portaobjetos.

Los cortes salen arrugados del micrtomo debido a la friccin entre la cuchilla y el bloque, por lo que se

hace necesario estirar los cortes para su correcta observacin.

Para conseguirlo los cortes se hacen flotar en un bao de agua templada (sobre los 35-360C). Por efecto

del calor, la parafina se dilata estirando el corte hasta dejarlo completamente liso. Cuando los cortes ests

estirados, sencillamente se pescan con el portaobjetos. Previamente sobre la superficie del portaobjetos

se extiende una fina capa de una sustancia adherente que fija el corte al portaobjetos y evita que el corte

se desprenda en los procesos posteriores. En muchos laboratorios se usa la Poli-L-Lisina como sustancia

adherente.

Cuando tenemos los cortes situados sobre el portaobjetos se dejan secar (habitualmente en una estufa a

35-360C).

5.- TINCIN

El material biolgico cortado fino es, bsicamente, transparente, por lo que no se puede distinguir nada al

observarlos al microscopio.

Es por esto que se hace necesario teir las muestras para poder distinguir las clulas y los tejidos.

Los protocolos de tincin se realizan mediantes baos secuenciales de distintos colorantes y reactivos. Hay

diferentes formas de hacer esto:

- Se pueden poner los portaobjetos sobre una rejilla dispuesta en una bandeja y mediante una pipeta se

van colocando los diferentes colorantes y reactivos.

- Se pueden teir varios portaobjetos colocados en cestillas especiales de vidrio las cuales se van pasando

de una cubeta a otra, conteniendo cada cubeta el colorante o reactivo pertinente.

- Este mismo proceso de tincin en cestillos se puede realizar de forma automatizada mediante un robot

que va cambiando automticamente el cestillo de cubeta mediante un programa de tiempos

predeterminado.

Sea cual sea el mtodo empleado, el protocolo (secuencia de pasos) de tincin a emplear depender de

aquello que se quiera mostrar de los tejidos procesados.

De protocolos (tcnicas) de tincin se han escrito numerosos libros ya que son muy numerosos y variados.

Al final de este tema haremos una resea de las tcnicas ms habituales utilizadas en Histologa.

Entre todas las tcnicas de tincin hay una que destaca sobre las dems ya que es con mucha diferencia,

la ms utilizada en todo el mundo, se trata de la tcnica de la Hematoxilina-Eosina.

La hematoxilina es una mezcla colorante (existen diferentes variantes) que tiene un carcter bsico por lo

que se une a sustancias cidas. En las clulas, la zona ms cida es el ncleo ya que est repleto de cidos

nucleicos (ADN), por lo que el ncleo se teir con la hematoxilina de un color azul-violceo.

La eosina es un colorante de tonalidad rosa-rojo que se disuelve en etanol y tiene un carcter cido, por lo

que se une a las estructuras bsicas (pH alto) de los tejidos. Las estructuras con mayor pH de los tejidos son

las protenas, debido a los puentes de Azufre y Nitrgeno que tienen. Es por eso que en muestras

procesadas con esta tcnica, se tien de color rosa, preferentemente, el citoplasma y la matriz extracelular,

ambas estructuras ricas en protenas.

Todo proceso de tincin se puede dividir en tres fases:

- La primera fase consiste en el desparafinado e hidratacin de los cortes. Para desparafinar se baan los

cortes con Xileno, el cual disuelve la parafina y la hidratacin se realiza con una secuencia de pasos inversa

a la de la deshidratacin.

- Con la muestra en un medio acuoso se procede con el protocolo de tincin elegido. El protocolo suele

constar de una secuencia de baos con los colorantes, limpiadores y reactivos, que es propio de cada

tcnica.

- La tercera fase tiene como objeto el montaje permanente de las muestras para su observacin al

microscopio. Para montar y proteger los cortes se coloca encima de ellos un medio de montaje: una

sustancia lquida que con el aire cristaliza (polimeriza) y una lmina muy fina de vidrio (cubreobjetos), que

forman un conjunto estable y duradero. El medio de montaje suele ser una sustancia hidrfoba, por lo que

los cortes antes de ser montados han de ser deshidratados, siguiendo un protocolo similar al utilizado

durante la inclusin.

La preparacin montada se deja secar unas horas y se guarda en oscuridad para evitar que la luz degrade

los colores.

ESTUDIO DE LAS MUESTRAS AL MICROSCOPIO

Con todo lo explicado hasta ahora el estudiante se puede hacer una clara idea del proceso que se realiza

hasta obtener las preparaciones que estudiar al microscopio.

Ahora, sera conveniente que el estudiante tuviese en cuenta algunos conceptos necesarios para el estudio

de las muestras al microscopio.

- En primer lugar, el estudiante ha de entender que las estructuras biolgicas son estructuras

tridimensionales, y habitualmente complejas, de las cuales, al microscopio, solamente se pueden ver

secciones planas (en dos dimensiones). As, por ejemplo, los tbulos renales son tubos cilndricos, con lo

que cabra esperar que al microscopio estos tbulos se vieran como anillos (la seccin de un cilindro). La

cuestin es que estos tubos no son rectilneos y presentan muchos giros (como otros tubos del organismo,

p.ej. el intestino), as que en un mismo corte y de un mismo tbulo se pueden ver numerosas secciones tal

y como muestra el esquema. Es decir el estudiante deber tener en cuenta que una misma estructura

cortada en diferente orientacin puede mostrar secciones diferentes.

- Abundando en este mismo tema de la tridimensionalidad, otro hecho que hay que tener en cuenta es la

profundidad del corte. Este problema se ilustra perfectamente en el esquema adjunto donde se toma como

ejemplo un huevo (que en esencia es una clula). Este huevo an cortado en el mismo plano puede mostrar

secciones diferentes dependiendo de la profundidad a la que se haya hecho el corte.

Es importante que el estudiante entienda ambos conceptos para poder interpretar correctamente las

estructuras que observar al microscopio.

Por otra parte el estudiante debe adoptar una dinmica correcta de observacin de muestras para el

mximo aprovechamiento de cada sesin de estudio.

Nuestro consejo es:

- Empezar por observar la preparacin a simple vista colocndola sobre una superficie blanca. En muchos

casos el estudiante podr localizar los elementos anatmicos ms destacados del rgano a estudiar.

- En segundo lugar, colocar la preparacin en la platina y observarla con el objetivo ms pequeo (4x) y

navegar por toda la preparacin localizando las reas de inters y elementos singulares.

- Por ltimo, y con las reas de inters localizadas, ir utilizando progresivamente los objetivos de mayor

aumento, en cada una de estas reas, hasta distinguir los elementos estructurales, tejidos y tipos celulares

propios de la muestra estudiada.

Hasta ahora hemos descrito los procedimientos, instrumentos y procesos de tincin ms usuales en el

estudio convencional de la anatoma, ahora daremos un breve repaso a otros tipos de instrumentos,

procesos de inclusin y protocolos de tincin, que tambin se suelen utilizar en Histologa.

OTROS TIPOS DE MICROSCOPIO

Aparte del microscopio ptico de campo claro, que es el ms utilizado en cualquier laboratorio de

Histologa, existen otros tipos de microscopios cuyos resultados (imgenes) el estudiante probablemente

usar durante su aprendizaje, aunque es poco probable que los use directamente ya que suelen ser

escasos, complejos de uso y caros.

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET)

El microscopio electrnico de transmisin es un instrumento de estudio que utiliza la misma estructura

conceptual que un microscopio ptico convencional, pero que usa un haz de electrones en lugar de un haz

de fotones (haz de luz).

La longitud de onda del electrn es menor de 1nm, es decir aproximadamente unas 500 veces ms pequea

que la longitud de onda de la luz (aprox. 400-600 nm), por lo que con un microscopio electrnico de

transmisin se pueden conseguir aproximadamente 500.000 de aumentos.

El hecho de utilizar electrones en un microscopio comporta una serie de problemas:

- Primero, hay que tener en cuenta que los electrones estn cargados elctricamente por lo que si estos

electrones, en su trayectoria, se encuentran con tomos, por electrosttica, las nubes de electrones de

esos tomos desviarn a los electrones del haz, haciendo imposible la obtencin de una imagen coherente.

Por esto en el interior de los microscopios electrnicos debe hacerse el ms completo vaco.

- En segundo lugar, hemos de tener en cuenta que para que un microscopio se comporte como tal, es

necesario disponer de unas lentes, que modifiquen la trayectoria del haz. El problema es que las lentes

pticas no sirven para este propsito, as que hay que dotar al microscopio electrnico de otro tipo de

lentes. La forma de modificar un haz de electrones es mediante el uso de un campo magntico, es por esto

que las lentes de un microscopio electrnico son bobinas electromagnticas que generan esos campos

magnticos.

- En tercer lugar est el grosor del corte. Si utilizamos un corte de los utilizados para microscopia ptica (de

5 a 10 m de grosor), la cantidad de material biolgico comprendida en este grosor es tal que la imagen

sera incomprensible. Es por esto que el grosor de los cortes para este tipo de microscopa ha de ser mucho

ms finos, oscilan entre los 40 y 50 nm. (0.04-0.05 m). Adems tampoco se pueden utilizar portaobjetos

de vidrio (por muy finos que sean) ya que el haz de electrones no lo atravesara, es por esto que se suele

utilizar como portaobjetos una fina rejilla metlica (cobre), el corte reposa sobre los filamentos de la rejilla

quedando suspendido en los espacios entre filamentos.

- Luego debemos resolver el problema del contraste (tincin). Las muestras biolgicas presentan un

contraste frente a los electrones muy similar entre si y en general muy bajo, por lo que se hace necesario

incrementarlo. En microscopia electrnica no sirven los colorantes usados en microscopia ptica (apenas

ofrecen contraste frente a los electrones), por lo que es necesario usar otro tipo de sustancias

contrastadoras. Se usa bsicamente, Acetato de uranio, esta molcula se une qumicamente al material

biolgico y con la gran cantidad de electrones del tomo de Uranio, hace que all donde haya una

acumulacin de material biolgico (con acetato de uranio adherido qumicamente) los electrones no

atraviesan la muestra, al ser desviados por la nube electrnica, mientras que all donde haya una baja

concentracin de material biolgico, los electrones atravesarn la muestra ms fcilmente. Esto provoca

que la imagen final se componga mediante la presencia o ausencia de electrones. LAS IMGENES DE LOS

MICROSCOPIOS ELECTRNICOS SON SIEMPRE MONOCROMTICAS (BLANCO Y NEGRO).

- El ltimo problema que se ha de solucionar es la obtencin de la imagen. El ojo humano no es capaz de

ver electrones, por lo que es necesario idear un sistema para obtener una imagen visible. El sistema

utilizado es una placa de fsforo. El fsforo tiene la propiedad que al ser alcanzado por un electrn libera

un fotn, as se consigue la imagen. Aparte, los electrones tambin pueden impresionar una placa

fotogrfica convencional, e incluso con la ayuda de un captador digital de electrones, se puede obtener

una imagen en un monitor de ordenador.

Procesamiento de muestras para el MET

En esencia el procesamiento de las muestras para el MET es similar al usado en microscopa ptica

convencional, teniendo en cuenta las peculiares propias del MET.

- En primer lugar hay que tener en cuenta que al observar a ms aumentos se hace necesario que la

conservacin de las estructuras biolgicas sea mucho ms fiel y precisa que para la microscopa ptica. Es

por ello que se suelen usar fijadores mucho ms potentes, tales como el Glutardialdehido, e incluso se

suele hacer una postfijacin con Tetraxido de Osmio (OSO4), que tiene cuatro grupos activos, que forman

redes mucho ms tupidas del material biolgico de la muestra.

- Luego hay que tener en cuenta, que como hemos dicho el corte ha de ser mucho ms fino (40 - 50 nm =

0,04 - 0,05 m), se les denomina cortes ultrafinos. Para ello resulta obvio que necesitaremos un microtomo

de mayor precisin (ultramicrotomo). Adems las piezas debern incluirse en un material ms duro que la

parafina para obtener cortes de tal grosor. El material ms utilizado son las resinas sintticas poli-

componente, que requieren de un procesamiento similar al de la parafina, con la diferencia que estas

resinas son lquidas a temperatura ambiente y que polimerizan a ciertas temperaturas.

- El ultramicrotomo funciona en esencia como el microtomo rotatorio de Minot con la peculiaridad de que

su mecnica es mucho ms precisa, lo cual permite los desplazamientos tan pequeos que se requieren

para obtener cortes ultrafinos. Otra peculiaridad de este tipo de microtoma radica en la naturaleza de las

cuchillas, las cuales han de ser de un material extremadamente duro para poder cortar los bloques de

resina. Habitualmente estas cuchillas son de un vidrio especialmente tratado que permite la obtencin de

una serie de 30 o 40 cortes, despus de los cuales la cuchilla ha de ser reemplazada ya que ha perdido el

filo. En ocasiones determinadas se pueden emplear cuchillas con filo de diamante, que como el estudiante

entender son poco habituales dado su elevado precio. Se adosa a la cuchilla una pieza de plstico al efecto,

la cual forma una cavidad la cual se llena de agua donde flotan los cortes, una vez realizados, y donde son

capturados con las rejillas porta-muestras.

- Las rejillas con los cortes adheridos se pasan por los reactivos necesarios para realizar el contraste (acetato

de uranio y otros), luego se dejan secar y ya se pueden observar al MET. A diferencia del procesamiento

con parafina, en esta tcnica no se elimina el medio de montaje (resina).

Con el ultramicrotomo tambin se pueden obtener cortes ms gruesos (1 - 2 mm) para su estudio en

microscopa ptica convencional (de campo claro), a estos cortes se les conoce como "semifinos".

MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB / SCANNING)

El microscopio electrnico de barrido (scanning), utiliza, tambin, un haz de electrones y utiliza bobinas

electro-magnticas como lentes, pero ah acaban las similitudes.

Este microscopio se utiliza para el estudio de superficies, no para el estudio de los componentes ntimos

de tejidos y clulas.

Para ello el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que unas bobinas deflectoras realizan un barrido

de la superficie de la muestra.

Procesamiento de muestras para el MEB

La muestra, para este tipo de microscopia, no es un corte fino sino que se trata de una muestra completa

(o casi completa), as con esta tcnica se pueden estudiar pequeos organismos enteros, como por

ejemplo, los insectos.

La preparacin de la muestra tambin es diferente a la que se realiza para el M.E.T. Para el M.E.B. no se

realizan cortes sino que la pieza, (una porcin de tejido, un insecto, etc...) Se deshidrata y se recubre con

una capa fina (mono-molecular) de un metal conductor (habitualmente oro).

Al bombardear la muestra con un haz de electrones (electrones primarios) la capa metlica reacciona

emitiendo un electrn por cada electrn que recibe. Estos electrones emitidos (que se llaman electrones

secundarios) tienen la caracterstica que se emiten en un ngulo que depende del ngulo de incidencia de

los electrones primarios con respecto a la superficie de la muestra.

Los electrones secundarios son recogidos por un captador de electrones dividido en una matriz de celdillas,

luego un sistema informtico se encarga de generar una imagen en un monitor, en la base de: un punto de

luz por cada electrn detectado.

Como los electrones secundarios indicen en la matriz en diferente nmero en cada celdilla, debido al ngulo

en el que son generados, la imagen muestra claros y oscuros, que reflejan la superficie tridimensional de

la muestra, dando una informacin adicional de los tejidos a aquellas que se puede obtener con un

Microscopio ptico convencional o incluso con un MET.

OTROS MICROSCOPIOS PTICOS

En este apartado vamos a hacer una breve resea de otros microscopios pticos (que usan luz), que se

utilizan en el estudio histolgico, aunque en ciertas circunstancias.

Microscpio de contraste de fases: Este tipo de microscopio se basa en la propiedad ptica del

cambio de fase de un haz de luz al atravesar un objeto compuesto de materiales de diferente ndice

de refraccin. Mediante esta tcnica se pueden observar materiales sin teir y resulta

especialmente til para el estudio de material vivo (cultivos celulares, etc...).

Dispositivo de campo oscuro: Este dispositivo hace que la luz no incida perpendicularmente a la

muestra, sino tangencialmente, por lo que es refractada por la muestra hacia el objetivo, en las

zonas en las que no hay material se ve todo negro, de ah el nombre de campo oscuro.

Microscopio de fluorescencia: Este microscopio utiliza luz ultravioleta en lugar de luz blanca. Esta

luz provoca fluorescencia en ciertas sustancias (fluoro-cromos) que son las que se utilizan como

colorantes. En este tipo de microscopio el fondo queda negro y las estructuras marcadas con el

fluoro-cromo emiten su propia luz (que es la que se ve).

Microscopio confocal: El microscopio confocal es un microscopio ptico de caractersticas

especiales y reciente aparicin.

Las prestaciones de este microscopio son singulares, as por ejemplo, se pueden observar muestras

gruesas, de las que el microscopio obtiene imgenes no de todo el grosor de la muestra, sino de secciones

de pequeo grosor (al estilo de la tomografa axial computarizada) que luego, mediante programas

informticos, puede reconstruir en una estructura tridimensional que se muestra en una pantalla de

ordenador.

Tambin permite el estudio de muestras vivas (cultivos celulares) a lo largo del tiempo, lo cual lo hace

idneo para la comprensin de ciertos procesos biolgicos.

Es un microscopio de reciente aparicin, no por la complejidad ptica de sus construcciones, que ya estaba

en funcionamiento en los aos cincuenta, sino por la complejidad del hardware y software informtico

necesario.

El microscopio confocal dispone de varios emisores lser, que son las fuentes de luz utilizadas.

Cada uno de esos los lseres es de longitud de onda diferente e incide sobre la muestra donde excita a los

foto-cromos (que son los colorantes) que responden, cada uno a una longitud de onda determinada,

permitiendo la realizacin de marcajes mltiples en una misma muestra, revelando distintas estructuras

en diferentes colores.

OTRAS TCNICAS DE TINCIN

En el apartado "TINCIN" se ha comentado la tcnica de la Hematoxilina-Eosina, que es, sin duda, la tcnica

ms utilizada en Histologa, pero obviamente hay muchas ms tcnicas de tincin. En este apartado

haremos la resea de otras tcnicas, entre muchas, que tambin se utilizan en Histologa, aunque con

mucha menos frecuencia que la H-E y siempre para mostrar caractersticas especficas de tejidos y/o tipos

celulares.

TCNICAS QUMICAS GENERALISTAS (CONVENCIONALES)

Estas tcnicas tienen como objetivo mostrar las caractersticas generales, especialmente la topografa, de

tejidos y rganos. La base de estas tcnicas es una reaccin qumica (cido-base, oxidacin-reduccin)

entre los colorantes y los elementos estructurales de los tejidos.

Estas tcnicas son muchas y muy variadas, que pueden ser clasificadas atendiendo al nmero de colorantes,

en: monocrmicas, bicrmicas y tricrmicas.

En este apartado deberamos incluir la tcnica de la Hematoxilina-Eosina (bicrmica), explicada

anteriormente.

Tcnicas monocrmicas

Estas tcnicas utilizan un slo colorante que tie todos los tejidos de forma semejante y la diferenciacin

se consigue gracias a la diferente naturaleza de los tejidos, as un epitelio formado por una lmina continua

de clulas se tie ms intensamente que el tejido conectivo donde conviven fibras (que se tien menos)

con algunas clulas.

Entre estas tcnicas cabe mencionar:

- Azul de Anilina

- Azul de Toluidina

- Hematoxilina de Hedienhain

- Rojo neutro

Estas tcnicas se suelen realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Tcnicas tricrmicas

Como su nombre indica, estas tcnicas utilizan una combinacin de tres colorantes. Una caracterstica

propia de estas tcnicas es que suelen teir el tejido conectivo de forma diferencial, ya que uno de los

colorantes suele tener afinidad por las fibras (colgenas) de la matriz extracelular de este tejido.

Estas tcnicas se suelen utilizar, al igual que la hematoxilina-eosina, para el estudio topogrfico de rganos,

con el valor aadido de la facilidad de reconocimiento del tejido conectivo.

Las tcnicas tricrmicas ms usadas son:

- Tricrmico de Masson

- Tricrmico de Mallory

Estas tcnicas se suelen realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

TCNICAS QUMICAS ESPECFICAS

Se engloban en este apartado aquellas tcnicas que se basan en una reaccin qumica convencional entre

algn colorante y un elemento especfico propio de tipos celulares, fibras extracelulares, etc...

A continuacin se exponen unas pocas de estas tcnicas que suelen usarse en los laboratorios de

Histologa.

Tcnica de PAS-H

Esta tcnica se basa en el uso combinado del cido Perydico junto con el reactivo de Schiff.

Esta combinacin tie de forma selectiva mucopolisacridos. Estos componentes se encuentran en las

lminas basales de epitelios, secreciones mucosas o el glicoclix de microvellosidades, por lo que estos

elementos se tien selectivamente de color rosa-rojo.

Se suele combinar con la hematoxilina, la cual tie los ncleos de color azul-violeta y permite localizar mejor

los elementos teidos con el PAS.

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Tcnica de PAS - Azul Alcin

Esta tcnica combina la reaccin del PAS con el azul alcin. El azul alcin tie especficamente los

mucopolisacridos de carcter cido en contraposicin del PAS que tie mucopolisacridos de carcter

neutro.

Por esto esta tcnica se usa preferentemente en el estudio de las secreciones mucosas del tracto digestivo

diferenciando secreciones mucosas neutras (rosa-rojo) de las secreciones mucosas cidas (azul).

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Tcnica de la Orcena Picro-ndigo-Carmn

Esta tcnica est especialmente recomendada para el estudio del sistema cardiovascular, ya que tie de

color rojo-marrn las fibras elsticas (por ejemplo las de las arterias elsticas o las del endocardio auricular),

mientras que tie de azul-verdoso plido las fibras colgenas (por ejemplo las de la adventicia arterial o

venosa o las del epicardio cardaco).

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Tcnica de Gordon-Sweets

Est tcnica est basada en el uso de sales de plata, las que en combinacin con los otros reactivos usados

en esta tcnica, tie selectivamente de negro las fibras reticulares del tejido conectivo.

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes en parafina de entre 5 y 10 m.

Tcnica del Sudn IV

El Sudn IV es un colorante liposoluble, por lo que resulta muy adecuado para teir elementos grasos, tales

como los adipocitos.

Para poder realizar esta tcnica, durante el procesamiento de los tejidos no se debe usar ningn disolvente

orgnico, ya que disolvera los elementos grasos que se pretende teir; esto imposibilita el incluir las

muestras en parafina, as que las muestras se suelen cortar por congelacin, en un grosor de

aproximadamente 30 m realizados con el criostato.

TCNICAS HISTOQUMICAS E INMUNOHISTOQUMICAS

Estos tipos de tincin no se basan en reacciones qumicas bsicas sino en reacciones ms especficas tales

como la actividad enzimtica o inmunolgica.

El tipo de reacciones que se aprovechan en estas tcnicas son variadas.

As podemos encontrar reacciones de alta especificidad entre molculas como en el caso de la tcnica de

la lectina de tomate.

Tcnica de la Lectina de tomate

Las lectinas son protenas que se unen selectivamente a ciertos azcares, as la lectina de tomate se

combina con la N-acetilglucosamina, que en el hgado, por ejemplo, se encuentra en los macrfagos

(clulas de Kupffer) y en las paredes endoteliales de los vasos (sinusoides).

En Histologa se usa la lectina de tomate combinada con una molcula marcadora, (como la biotina). La

biotina luego puede ser puesta de manifiesto en un proceso de revelado. El proceso es sencillo: se coloca

la lectina marcada sobre el corte, se espera un tiempo suficiente para que la lectina se una al azcar y luego

se revela para que se vea al microscopio.

Esta tcnica se puede realizar, tanto sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por congelacin en el

criostato, tanto en cortes de 5 a 10 m en parafina.

Las tcnicas Histoqumicas (Histoenzimticas) se basan en reacciones enzimticas de molculas (enzimas)

presentes en los tejidos de la muestra.

La mecnica general se basa en colocar un sustrato adecuado al enzima a estudiar, sobre el corte

histolgico, para que se produzca la reaccin enzimtica y posteriormente detectar alguno de los productos

de esa reaccin.

Un ejemplo de este tipo de tcnicas es la tcnicas de la NDPasa.

Tcnica de la NDPasa

La NDPasa es un enzima que se encuentra, entre otras en las clulas de microgla del Sistema Nervioso

Central y en la pared de los vasos sanguneos.

Para poner de manifiesto las estructuras que contienen este enzima en cortes histolgicos, lo que se hace

es colocar sobre el corte un producto que este enzima degrada, en este caso Inositol-fosfato. Se deja

tiempo para que se produzca la reaccin enzimtica cuyo resultado es la formacin de precipitado en el

lugar donde la reaccin se produce. Posteriormente se amplifica el marcaje mediante un tratamiento del

precipitado con sulfuro y sales de plata, lo cual le proporciona un color pardo muy oscuro. Se hace un

contraste con azul de toluidina para localizar las clulas no marcadas.

Las clulas marcadas (microgla) aparecen al microscopio de un color marrn oscuro, al igual que los vasos

sanguneos, mientras que el resto de tipos celulares quedan teidos de azul claro.

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por congelacin en el

criostato.

Las tcnicas Inmuno-histoqumicas se basan en el fenmeno natural del reconocimiento especfico de una

molcula (antgeno) por parte de otra (anticuerpo), esto se conoce como reaccin inmunitaria. Si usamos

un anticuerpo marcado el resultado es que la marca se ver all donde se encuentre el antgeno (dada la

especificidad de la reaccin antgeno-anticuerpo).

En la actualidad la bioindustria ofrece gran cantidad de anticuerpos marcados especficos contra una amplia

variedad de antgenos.

Tcnica de la GFAP

La GFAP es una protena que se encuentra exclusivamente en los astrocitos y clulas de su mismo linaje.

En esta tcnica inmuno-histoqumica lo que se hace es colocar sobre el corte una solucin del anticuerpo

marcado para que el anticuerpo localice y se una selectivamente a la GFAP. Posteriormente se revela, con

lo que se consigue que solamente aparezcan coloreadas las clulas que contienen esa protena, es este

caso los astrocitos.

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de alrededor de 30 m, realizados por congelacin en el

criostato.

TCNICAS ESPECFICAS PARA EL ESTUDIO DEL SISTEMA NERVIOSO

Las neuronas (junto con las clulas gliales), son las clulas propias del sistema nervioso, y como el

estudiante conoce, tienen un cuerpo o soma celular del que parten, tanto dendritas como axn. Esta

peculiaridad hace que el tejido nervioso presente una estructura especial en la que se entremezclan

dendritas y axones (parnquima nervioso / neuropilo) y en el que se localizan los somas neuronales.

Esta caracterstica peculiar junto con el inters que despierta el estudio del Sistema Nervioso ha provocado

el desarrollo de numerosas tcnicas de tincin propias de este tejido. En este apartado comentaremos

algunas de las tcnicas ms utilizadas.

Tcnica de Nissl

Esta tcnica se utiliza habitualmente en el estudio del tejido nervioso en lugar de la Hematoxilina-Eosina.

Es decir es una tcnica topogrfica, que nos muestra la distribucin de los somas neuronales en el

neuropilo.

El colorante utilizado en esta tcnica es el Azul de toluidina, que se aplica despus de un tratamiento previo

en Dicromato potsico. En algunas variantes se utiliza como colorante el Violeta de Cresilo.

Los somas neuronales aparecen teidos de azul oscuro mientras que el parnquima aparece casi blanco.

Las clulas gliales (sus cuerpos celulares) se tien tambin de azul oscuro y se pueden llegar a distinguir los

diferentes tipos por su forma y localizacin. En cortes los suficientemente finos (de hasta 5 7 m de

grosor), a grandes aumentos (400 - 1.000 x) se ven en el citoplasma del cuerpo neuronal (soma) unos

acmulos que se conocen como cuerpos de Nissl, los cuales corresponden a apilamientos de cisternas de

retculo endoplasmtico rugoso.

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de entre 5 y 10 m, realizados en parafina.

Tcnica de Klver-Barrera

La tcnica de Klver-Barrera se utiliza apara el estudio topogrfico del Sistema Nervioso de, tanto los somas

neuronales, como de los paquetes de fibras (axones) mielnicos.

En esta tcnica, adems del Azul de Toluidina (para la tincin de los somas neuronales), se usa el Luxol fast

blue, que tie selectivamente la mielina que rodea a ciertos axones (axones mielnicos).

Esta tcnica se suele realizar sobre cortes de entre 5 y 10 m, realizados en parafina.

Tcnica de la Plata reducida de Cajal

Esta tcnica se utiliza, fundamentalmente para el estudio de paquetes de axones amielnicos (no

mielinizados).

Esta tcnica se basa en una impregnacin argntica del tejido nervioso y una posterior reduccin qumica.

Este proceso tie de marrn oscuro neurofilamentos y neurotbulos, por lo que pone de manifiesto axones

amielnicos (en los mielnicos el Nitrato de Plata no puede atravesar la vaina de mielina), dendritas y el

cuerpo celular, no el ncleo (que no se tie).

Esta tincin se realiza en bloque, es decir se tie el cerebro completo (o una porcin), y una vez teido, el

tejido se incluye en parafina, se corta (en un grosor de 10 m) y se monta en el portaobjetos.

Tcnica de Golgi

La tcnica de Golgi es, quizs, la ms paradigmtica de las tcnicas de tincin empleadas en el estudio del

Sistema Nervioso.

Esta tcnica tiene como objetivo el poder estudiar neuronas completas, incluyendo soma, dendritas y axn.

Como el estudiante conoce, las neuronas son clulas con prolongaciones (dendritas y axn) arborizadas

que ocupan un gran volumen de tejido, un poliedro que incluya una neurona "tipo" puede tener 100-200

m x 100-200 m x 100-1000 m de aristas.

Esto implica varias circunstancias a tener en cuenta:

- En primer lugar resulta obvio que no se podrn observar neuronas completas en un corte de 5, 10 o 30

m de grosor, y ser necesario realizar cortes ms gruesos (100 - 150 m).

- En segundo lugar, solamente se deben teir una pequea proporcin de neuronas, ya que si tieran todas,

al teir todos sus elementos, no se podran distinguir unas neuronas de otras.

Ambas circunstancias se dan en la tcnica de Golgi, en la que se impregna en bloque el tejido nervioso con

una solucin de Nitrato de Plata, despus de una induracin, con Dicromato potsico. Este proceso

consigue impregnar una muy pequea proporcin de total de neuronas (aproximadamente el 0,03%). Hoy

en da, an es motivo de discusin el mecanismo por el cual unas neuronas se tien y otras no.

La tcnica de Golgi se realiza en bloque, es decir con el cerebro completo (o una porcin de este). Los cortes

han de ser gruesos (100 - 150 m), por lo que la pieza no se incluye en parafina ni se corta con un micrtomo

rotatorio. La pieza impregnada con la tcnica de Golgi se puede incluir en celoidina (un colodin purificado),

o sencillamente encastrar en gelatina o incluso en parafina. Para cortar se suelen utilizar otros dispositivos

menos sofisticados, tales como un vibrtomo, un microtomo de deslizamiento o incluso una sencilla

cuchilla de barbero sobre un microtomo manual.

Como resultado de esta tcnica, al microscopio so observan neuronas completas de las que se puede seguir

el sinuoso recorrido de sus dendritas, usando el control del desplazamiento de la platina y el mando de

enfoque. Como el Nitrato de Plata no puede atravesar la vaina de mielina, solamente se vern los axones

no mielinizados.

Tambin se pueden ver clulas gliales y vasos sanguneos.

OTROS INSTRUMENTOS, PROTOCOLOS Y PROCEDIMIENTOS

Como se ha apuntado en los apartados anteriores, en Histologa, adems de los explicados, se usan otros

instrumentos, protocolos y procedimientos, atendiendo a los resultados que se pretende obtener.

As por ejemplo se usa una variedad de aparatos para cortar:

OTROS MICROTOMOS

Adems del microtomo rotatorio o de Minot para el corte en parafina, que ya se ha explicado, en la prctica

habitual en Histologa para el desarrollo de tcnicas especficas.

- Ultramicrotomo: En esencia este instrumento sigue el modelo mecnico del microtomo rotatorio,

pero con una considerablemente mayor precisin, para obtener cortes mucho ms finos (40 - 50

nm) para ser usados en microscopa electrnica de transmisin.

En este microtomo se utilizan otro tipo de cuchillas de mayor dureza, hechas tanto de vidrio

especialmente tratado como, incluso, con el filo de diamante.

- Criostato: El criostato es, en esencia, un microtomo rotatorio en el interior de un arcn refrigerado.

Obviamente se usa para cortar muestras a bajas temperaturas, para tcnicas que requieren el

mantenimiento de la actividad biolgica en las muestras, por ejemplo, las tcnicas histoenzimticas

y las inmunohistoqumicas. Las muestras congelan, previo tratamiento con un crioprotector, y se

cortan, montando los cortes sobre portaobjetos, sobre los que se suele hacer el tratamiento

histoqumico o inmunohistoqumico.

- Vibrtomo: El vibrtomo, como su nombre indica, se basa en un brazo vibrtil que realiza cortes no

demasiado finos (entre 25 y 500 m). Se suele utilizar para tcnicas histoenzimticas e

inmunohistoqumicas ya que no es necesario incluir en parafina las piezas, aunque en la actualidad

se usa ms el criostato para estas tcnicas. Ocasionalmente se ha utilizado el vibrtomo para

realizar cortes con la tcnica de Golgi.

- Microtomo de mano: Es el ms sencillo de los micrtomos y simplemente es un tornillo sin fin que

levanta la muestra sobre una superficie plana, sobre la que se desliza una afilada cuchilla de barbero

para obtener los cortes. SU rango de corte oscila entre los 20 a los 150 m y es muy utilizado en

Histologa vegetal. En histologa animal se suele utilizar para obtener cortes gruesos en la tcnica

de Golgi.

ARTEFACTOS DE TINCIN

Como el estudiante ha podido comprobar la tcnica es compleja y comprende muchos pasos, por lo

que puede suceder que en alguno de estos pasos se produzca alguna distorsin o pequeo fallo, que

luego se detecta durante el estudio de la muestra al microscopio, es lo que se conoce como artefactos

de tincin.

En s mismos los artefactos no tienen ningn valor histolgico, pero al encontrrselos durante el estudio

de las preparaciones el estudiante puede llegar a confundirlos con elementos propios del tejido lo que

hace conveniente que el estudiante tenga conciencia de su existencia.

La mayora de los artefactos producen alteraciones microscpicas que son totalmente invisibles a

simple vista por lo que resulta muy difcil que el histlogo pueda evitarlos.

En las pginas siguientes el estudiante encontrar diferentes ejemplos de los artefactos ms habituales

que pueden encontrarse en el estudio de preparaciones histolgicas.

- BANDEADO

El aspecto bandeado que muestran algunas preparaciones se suele producir por un ngulo de

incidencia de la cuchilla incorrecto.

En algunas otras ocasiones se produce un bandeado al intentar cortar demasiado fino un tejido que no

tiene la dureza y/o consistencia suficiente.

- BURBUJAS

Algunas preparaciones muestran pequeas burbujas de aire atrapadas en el medio de montaje.

Este artefacto se suele dar cuando el medio de montaje es muy denso y solidifica de forma rpida.

INCLUSIONES Y MANCHAS DE COLOR

A veces, durante el proceso de preparacin de muestras, preferentemente durante el montaje final, se

cuelan sobre el corte motas de polvo, pequeos pelos y otros elementos del ambiente que se fijan

en la preparacin al utilizar el medio de montaje.

Tambin estas inclusiones pueden ser precipitadas de color debido a pequeos cristales colorante.

- MELLAS

Las mellas se producen por pequeas imperfecciones del filo de la cuchilla a la hora de cortar en el

micrtomo.

Estas mellas provocan un arrastre y destruccin de una banda recta de tejido cuyo ancho coincide con

la anchura de la imperfeccin del filo de la cuchilla y que ocupan todo el tejido en la direccin del corte.

- PLIEGUES

Los pliegues se suelen producir durante el montaje del corte sobre el portaobjetos.

A veces se trata de una simple ondulacin del tejido, a veces se trata de un gran pliegue que se dobla

sobre s mismo.

Tenemos el convencimiento que la lectura de este tema ayudar al estudiante a comprender el

procesamiento histolgico necesario para obtener los cortes que estudiar al microscopio y ello

redundar en una mejor comprensin de las clulas tejidos y estructuras que observar durante el

estudio.