Técnico em Citopatologia - Caderno de referência 3: técnicas de

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©Ministério da SaúdeTodos os direitos reservados. É permitida a reprodução parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é da área técnica. Pode ser acessada na íntegra na Biblioteca Virtual em Saúde do Ministério da Saúde: http://www.saude.gov/bvs.

Tiragem: 1a Edição - 2012 - 5.000 exemplares

Elaboração, distribuição, informações:MINISTÉRIO DA SAÚDESecretaria de Gestão do Trabalho e da Educação na SaúdeDepartamento de Gestão da Educação na SaúdeEsplanada dos Ministérios, bloco G, sala 725CEP: 70058-900, Brasília - DFTelefones: (61) 3315 2858 / 3315 3848 - Fax: (061) 3315 2862E-mails: [email protected] / [email protected]: www.saude.gov.br/sgtes

Coordenação:Maria Auxiliadora Córdova ChristófaroMônica Sampaio de CarvalhoMozart Julio Tabosa Sales

Autor:Abel Dorigan Neto

Revisão técnica:Gyl Eanes Barros Silva

Coordenação editorial:Léa Simone Carvalho Mario Correia da Silva

Impresso no Brasil / Printed in Brazil

Projeto gráfico, diagramação, capa e arte final:Breno Santos Pessoa de LunaDino Vinícius Ferreira de Araujo

Apoio técnicoMaria Aparecida Timo BritoMaria Ivanildes Resende de Oliveira

Ilustração:Antonio Carlos Acioli da Silva Junior

Normalização e revisão editorial:Centro de Estudos e Pesquisa em Saúde Coletiva - CEPESCEndereço: Rua São Francisco Xavier, 524 – 7º andar – Bl. D Maracanã – Rio de Janeiro – [email protected]/ [email protected](21) 2569-1143/ 2234-7457

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)(Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Sandra Infurna, CRB nº 7 – 4607)

D697Dorigan Neto, Abel

Caderno de referência 3: técnicas de Histopatologia / Abel Dorigan Neto - Brasília: Ministério da Saúde; Rio de Janeiro: CEPESC, 2012.

94p. (Coleção Cadernos de Referência; 3)

ISBN 978-85-324-0035-2

1. Histopatologia. 2. Educação em Saúde. 3. Ensino Profissional. 4. Ensino Técnico. I. Título. II. Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio para a Saúde.

CDU 576.385:37 Títulos para indexação: Em inglês: Notebook Reference 3: Histopathology techniquesEm espanhol: Cuaderno de Referencia 3: técnicas de Histopatología

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Lista de abreviaturas e siglas

ABCAgNO3APTSBAARC-erb-2 Ck-7CD3DABDEGESEDTAETSUSGMSHEHRPHPV PAPAAFPAMSPASPBSpHProfapsRErpmSGTESSUSTBS

Avidina-biotina-complexoNitrato de PrataAminopropiltrietóxiBacilos Álcool-Ácido ResistentesOncogene localizado no cromossoma 17q21Citoceratina 7Complexo proteico que ativa linfócitos TDiamino BenzidinaDepartamento de Gestão da Educação na SaúdeÁcido Etilenodiamino Tetra-Acético Escola Técnica do SUSPrata Metenamina de GomoriHematoxilina e EosinaPeroxidase de Rábano (Horseradish)Papiloma Vírus Humano Pró-análisePunções Aspirativas por Agulha FinaÁcido Periódico Prata Metenamina de GomoriÁcido Periódico de SchiffSolução Tampão SalinaPotencial HidrogeniônicoPrograma de Formação de Profissionais de Nível Médio Para a SaúdeReceptor de EstrógenoRotações por minuto Secretaria de Gestão da Educação na SaúdeSistema Único de SaúdeSalina tamponada com tris

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SUMÁRIO

Apresentação..................................................................................................................................

1 Introdução...................................................................................................................................

2 Técnicas histológicas..................................................................................................................

3 Colorações histológicas para grânulos, depósitos e pigmentos..................................................

4 Coloração para tecido conjuntivo...............................................................................................

5 Coloração para agentes etiológicos............................................................................................

6 Coloração para sistema nervoso.................................................................................................

7 Imuno-histoquímica....................................................................................................................

8 Descalcificação...........................................................................................................................

9 Protocolos especiais....................................................................................................................

10 Técnicas citológicas..................................................................................................................

Referências....................................................................................................................................

Apêndice........................................................................................................................................

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Apresentação

A Secretaria de Gestão do Trabalho e da Educação na Saúde (SGTES) do Ministério da Saúde (MS), por meio da Coordenação-Geral de Ações Técnicas em Educação na Saúde do Departamento de Gestão da Educação na Saúde (DEGES), desenvolve políticas e programas com o propósito finalístico de ordenar recursos humanos para a saúde, como determina o Art. 200 da Constituição Federal, e, nesta perspectiva:

• Atender ao que dispõe a Lei Nº 8080/90, especificamente no seu Art. 6º; • Contribuir para a adequada formação, alocação, qualificação dos profissionais e valorização e democratização das relações do trabalho;• Ampliar as oportunidades de formação profissional e de qualificação técnica para trabalhadores do nível médio, tendo como propósito a qualidade das Redes de Atenção à Saúde do SUS;• Consolidar, nos planos político, pedagógico e administrativo, as Escolas Técnicas do SUS (ETSUS).

A efetividade, o atendimento oportuno e a qualidade dos serviços de saúde guardam intrínseca relação com a formação e a qualificação profissional. Portanto, é imprescindível que os acordos e respectivos contratos de colaboração entre os entes federativos, objetivando a organização da rede de atenção à saúde, assegurem recursos para o cumprimento e efetivação dos processos de formação e de qualificação técnica para o grupo de trabalhadores. Profissionais estes que formam o maior segmento da força de trabalho da área da saúde, os técnicos de nível médio. A efetivação dos objetivos do Programa de Formação de Profissionais de Nível Médio para a Saúde (PROFAPS) implica a definição de diretrizes e prioridades para a área de formação profissional e de qualificação técnica com foco nos trabalhadores de nível médio do SUS. Entre essas prioridades está a formação do Técnico em Citopatologia. Para tanto, foi definido plano de trabalho cuja execução resultou no estabelecimento das “Diretrizes e Orientações para a Formação”, fundamentadas nas diretrizes e princípios das políticas nacionais da educação e da saúde, publicadas em 2011. Nessa linha, a SGTES/DEGES investiu na aquisição e produção de recursos e material didático específico para os cursos de formação profissional técnica, prioritários no PROFAPS e que estão sendo desenvolvidos pelas ETSUS. Para o curso técnico em citopatologia, a Coordenação-Geral de Ações Técnicas em Educação na Saúde, junto com as ETSUS e especialistas da área, definiu e coordenou o processo de elaboração e produção de material didático específico, o que traduz a relevância da formação profissional técnica de nível médio na política nacional de saúde. Este atlas (impresso e digital) é um desses recursos. Organizado tendo como referência as diretrizes para a formação do técnico em citopatologia, seguramente, é base tanto para a elaboração e definição do projeto político-pedagógico como para o desenvolvimento do curso. A produção de material bibliográfico para o Curso Técnico em Citopatologia inclui:

• Atlas de Citopatologia Ginecológica (versão impressa e digital)• Caderno de Referência 1: Citopatologia Ginecológica• Caderno de Referência 2: Citopatologia Não Ginecológica• Caderno de Referência 3: Técnicas de Histopatologia

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Caderno de Referência 3• • • • • • • • • • • • • • • • • • •

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Apoiar o desenvolvimento do curso é o objetivo específico, contudo tem-se como propósito consolidar e ampliar a articulação das Escolas Técnicas com as Redes de Atenção à Saúde do SUS e, a partir dessa base, consolidar as Escolas como rede de excelência na formação profissional e na qualificação técnica do nível médio na área da saúde. Nessa perspectiva, fundamentada nos princípios das políticas de saúde, de educação e da regulação do trabalho, o SUS desenvolve a ordenação dos recursos humanos para a saúde.

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1 Introdução

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Desde o seu surgimento, as técnicas histocitopatológicas permitiram grande avanço às ciências biológicas e médicas. No entanto, nada foi tão impactante quanto o uso desses conhecimentos na diferenciação entre tumores benignos e malignos. De lá para cá, esse conhecimento tem se difundido com as mais diversas finalidades, para uma enormidade de áreas do conhecimento humano, tais como: medicina legal, genética, biologia molecular e em pesquisa básica com modelos experimentais e humanos. Dessas, a patologia cirúrgica é a mais significativa área. A interpretação histopatológica é crítica para estabelecer o diagnóstico de benignidade e malignidade e pode discriminar os diferentes tipos e graus de câncer, bem como determinar mecanismos e percursos moleculares específicos dos tumores. No câncer, essas informações são importantes para estimar o prognóstico e a melhor escolha do tratamento a ser ministrado. As técnicas citopatológicas também são usadas para o diagnóstico de outras patologias, como: doenças infecciosas, idiopáticas e autoimunes. Nos transplantes, a histologia continua sendo o método padrão-ouro para diagnóstico das rejeições, toxicidades e disfunções em geral. Outra importante aplicação histórica dos métodos citológicos é na prevenção do câncer, sobretudo ginecológico. A possibilidade de se revelar lesões precursoras do câncer de colo uterino, que representa a segunda causa de mortalidade por neoplasia entre mulheres brasileiras, promoveu um grande impacto na diminuição da morbimortalidade da população feminina. Diagnósticos preliminares, evitando procedimentos mais invasivos, podem ser obtidos nas punções da tireoide, da mama, dos linfonodos etc. No exame de congelação, o patologista pode fornecer informações imediatas para o cirurgião, com o paciente ainda aberto na sala de cirurgia, garantindo o melhor resultado possível para o paciente. A microscopia tradicional é agora suplementada por técnicas sofisticadas, como a imuno-histoquímica, a imunofluorescência e a hibridização in situ. Aqui, além de contribuir para o diagnóstico mais adequado, esses métodos também ajudam na identificação dos potenciais alvos terapêuticos (exemplo dos receptores hormonais nos tumores de mama e c-kit nos tumores do estroma gastrointestinal) e na tipagem de agentes etiológicos (por exemplo, separando os sorotipos mais carcinogênicos dos menos carcinogênicos do HPV). Para que todas essas funções sejam realizadas com sucesso, o material fornecido ao médico patologista deve ser de muito boa qualidade. Conhecer e observar os passos de todas as técnicas que aqui serão apresentadas é imprescindível para atingir esse objetivo, tornando o trabalho do técnico tão importante quanto o do patologista.

1 Introdução• • • • • • • • • •

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2 Técnicas histológicas

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2.1 Fixação Signifi ca o processo de interrupção dos fenômenos de putrefação pós-morte a fi m de manter a integridade do tecido obtido através de ato cirúrgico, mantendo sua arquitetura e constituição química, preservando suas proteínas e antígenos e inativando enzimas proteolíticas causadoras da autólise, ou seja, conservando o tecido a ser estudado para que se mantenha o mais próximo possível de quando estava no paciente. Para isso, são utilizadas soluções químicas, isoladas ou em forma de mistura, para o processo chamado fi xação. Imediatamente após a colheita do material através do ato cirúrgico, a amostra deve ser colocada em solução fi xadora. Os fi xadores penetram no tecido, tornando-o rígido e bloqueando os sistemas enzimáticos capazes de destruí-lo. Atualmente, além dos procedimentos de rotina Hematoxilina & Eosina (HE) e histoquímica, sabe-se que a solução de formol a 10% tamponado é o fi xador ideal para imuno-histoquímica e reações de biologia molecular. O volume de fi xador deve ser 20 vezes o volume do fragmento e o tempo de fi xação varia de acordo com o tamanho (espessura) do mesmo; fragmentos pequenos, como biópsias obtidas em endoscopia, colonoscopia, punção de agulha fi na tipo renal, hepática ou prostática, requerem em torno de quatro horas de fi xação. Fragmentos maiores e com espessura em torno de 4 mm necessitam de até 12 horas. Orienta-se a quem estiver fazendo o recorte dessas peças cirúrgicas que, quando a espessura for de tamanho maior (útero, mama, estômago, baço etc), que elas sejam fatiadas com o intuito de se tornarem fragmentos mais delgados, facilitando, assim, a penetração do fi xador.

2 Técnicas Histológicas• • • • • • • • • • • • • • • • • •

Figura 1 - Tecido em diferentes etapas de fi xação.a - Peça cirúrgica a fresco.b - Peça cirúrgica fi xada.c - Peça cirúrgica mal fi xada.

a b

c

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Tipos fixadores

Formol puro (37% - 40%) 100 mlÁgua destilada 900 mlFosfato de sódio monobásico 4 gFosfato de sódio dibásico 6,5 gNão necessita de tratamento pós-fixação

Formol 10% tamponado (mais usado)

Bicromato de potássio 2,5 gCloreto de mercúrio 5 gSulfato de sódio 1 gÁgua destilada 100 mlÁcido acético glacial 5 mlTempo de fixação 12 a 24 horas

Tratamento após fixação com solução ZenkerApós fixado, o material deverá ser lavado em água corrente por 12 a 24 horas para retirar o bicromato de potássio. Em seguida, deve ter início o processamento do material (desidratação, diafanização, inclusão, corte e pesca); após a obtenção dos cortes, retirar os cristais de cloreto de mercúrio do seguinte modo:

• Desparafinar e levar até água corrente.• Colocar em solução de lugol de 10 a 15 minutos.• Lavar em água corrente.• Colocar em solução de tiossulfato de sódio a 5% por três minutos.• Lavar em água corrente por dez minutos.• Corar pelo método desejado.

Solução de Zenker

Iodo metálico 1 gIodato de potássio 2 g Água destilada 100 ml

Solução de Lugol

Tiossulfato de sódio 5 gÁgua destilada 100 ml

Solução de Tiossulfato de Sódio 5%

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Bicromato de potássio a 3% 80 mlFormol puro 20 mlTempo de fixação 6 a 12 horas

Remover o bicromato antes do processamento lavando os fragmentos com água corrente por 12 horas.

Solução de Regaud

Álcool 90% 85 mlFormol puro 10 mlÁcido acético glacial 5 mlTempo de fixação 6 a 12 horas

Preparar o fixador no momento do uso.

Solução de Alfac

Solução alcoólica saturada de ácido pícrico 80 mlFormol puro 15 mlÁcido acético glacial 5 mlTempo de fixação 4 a 6 horas

Solução de Gendre (fixador empregado para demonstração de glicogênio)

Álcool absoluto 60 mlClorofórmio 30 mlÁcido acético glacial 10 mlTempo de fixação 3 a 6 horas

Não é necessário tratamento pós-fixação. O material segue para processamento histológico.

Solução de Carnoy

Bicromato de potássio 2,5 gCloreto de mercúrio 5 gFormol puro 5 mlÁgua destilada 100 mlTempo de fixação 12 a 24 horas

Remover o bicromato de potássio e os cristais de cloreto de mercúrio do mesmo modo utilizado no fixador de Zenker.

Solução de Helly

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Bicloreto de mercúrio 4,5 gCloreto de sódio 0,5 mlÁgua destilada 80 mlFormol puro 20 mlÁcido tricloroacético 4 gTempo de fixação 12 a 24 horas

Não necessita de tratamento pós-fixação.

2.2 Processamento histológico (desidratação, diafanização e impregnação) Uma vez fixado, o fragmento de tecido deve ser acondicionado em cassetes identificados, embrulhado quando pequeno e submetido ao chamado processamento histológico, que compreende três etapas: desidratação, diafanização e impregnação. A desidratação, em bateria com concentração crescente de alcoóis (80°, 90°, 100°), corresponde ao processo de retirada total de água do tecido, necessária para as etapas seguintes. Esse processo deforma o tecido, uma vez que os espaços de onde fora retirada a água se contraem (murcham). Conforme foi dito anteriormente, é necessário se manter a arquitetura tecidual, e isso é feito substituindo os espaços vazios deixados pela retirada da água por misturas de parafina e de polímeros plásticos fundidos a temperaturas em torno de 58° C e 60° C, chamados de Paraplast®. Esse processo é conhecido como impregnação. Sabendo da propriedade do álcool de não ser miscível com a parafina, utiliza-se o xilol como ponte entre álcool e parafina. O xilol também tem a propriedade de clarificar o tecido, fenômeno chamado de diafanização. O tempo de duração desse processamento histológico é proporcional ao tamanho do fragmento que se está processando.

Figura 2 - Cassetes.a - Cassete com fragmento de biópsia (pequeno e embrulhado). b - Cassete com fragmento tecidual de peça cirúrgica (grande e não embrulhado).

Solução de Susa

a b

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Material a ser processado Solução Tempo

Peça cirúrgica

Biópsias Pequenas

Álcool 80°Álcool 95°1º Álcool 100°2º Álcool 100°3º Álcool 100°4º Álcool 100°1º Xilol 2º Xilol1ª Parafina2ª Parafina3ª Parafina

Álcool 80°Álcool 95°1º Álcool 100°2º Álcool 100°3º Álcool 100°4º Álcool 100°1º Xilol 2º Xilol1ª Parafina2ª Parafina3ª Parafina

1h1h1h1h1h1h1h1h2h2h2h

30 min30 min30 min30 min30 min30 min30 min30 min

1h1h1h

Caso não se disponha de processador automático de tecidos, o mesmo pode ser substituído por frascos de vidro, onde o processamento ocorrerá manualmente.

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2.3 Inclusão Nesta etapa, a amostra de tecido, que posteriormente será submetida ao processo de corte, necessita de um suporte que permita efetuar o processo. Chama-se inclusão o ato de emblocar esse fragmento em um meio que deve ser obrigatoriamente o mesmo em que foi embebido, ou seja, a mistura de parafina conhecida por Paraplast®. Já pensando na etapa seguinte, de corte, os fragmentos a serem emblocados devem obedecer a alguns critérios técnicos no seu posicionamento e na sua ordenação durante o processo de inclusão, o que facilitará a obtenção de um corte de qualidade.

a b

Figura 3 - Processadores.a - Modelo atual, com capacidade para 200 cassetes. b - Modelo antigo, com capacidade para aproximadamente 50 cassetes.

Figura 4 - Central de inclusão ou autoinclusor.

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Após a inclusão, deve-se conferir o número de identifi cação e a quantidade de fragmentos de cada bloco, de acordo com o mapa estabelecido pelo serviço. Em seguida, os blocos são colocados em forma com gelo e enviados ao congelador por alguns minutos para endurecer. O bloco a ser cortado necessita estar gelado, e, de preferência, o ambiente do laboratório deve ser refrigerado, para permitir cortes de qualidade.

e

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ca b

Figura 5 - Fragmentos de tecido emblocados em parafi na.a; b; c; d - Fotos de blocos de parafi na contendo fragmentos de pele incluídos de forma correta. A epiderme (setas) orienta a in-clusão de forma paralela. e - Fragmento de tecido contendo lesão de aspecto cístico (seta) a ser examinada. f - Fragmento de tecido prostático com bordas (margens de se-gurança) pintadas em nanquim verde (seta).


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2.4 Microtomia (corte) Para procedimento de corte necessita-se de micrótomo, navalha, banho-maria histológico, pinça, pincel, lápis e lâminas.

Ao preparar a mesa de trabalho, deve-se observar se todos os botões do micrótomo estão bem apertados e se o suporte de navalhas está na angulação 10. O bloco retirado do gelo é fixado ao micrótomo e deve ser aparado até que todo o fragmento seja exposto e, a partir daí, submetido ao corte.

• Os cortes de rotina costumam variar entre 4 e 6 µ (micras).• Biópsias de linfonodo 3 µ (micras).• Biópsias de Medula óssea 2 μ (micras).• Cortes para reação de imuno-histoquímica 3 µ (micras).• Biópsias renais 2 µ (micras).• Por melhor que esteja a navalha, o corte sempre necessita ser mais bem esticado, e, algumas vezes, pregas se formam sobre o tecido. Utiliza-se neste momento o banho-maria histológico, que permite a obtenção de corte de qualidade que será pescado em lâmina de vidro.• A água do banho-maria deve estar em temperatura abaixo do ponto de fusão do meio de inclusão (mais ou menos 50° C).• Os cortes histológicos agora na lâmina devem ser colocados em estufa com temperatura superior ao ponto de fusão do meio de inclusão (máximo de 65° C), o que permite que a parafina que cir-cunda o corte escorra e o mesmo se fixe à lâmina de vidro.

Os blocos agora cortados são enviados ao arquivo e, sempre que necessário, podem ser requisita-dos, gelados e cortados novamente para realização de outros procedimentos, como colorações especiais, imuno-histoquímica e biologia molecular.

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a

Figura 6 - Mesa de microtomia.a - Micrótomo: corte. b - Banho-maria: estender.c. Banho-maria: pesca.

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2.5 Coloração de Rotina (HE)

As lâminas acondicionadas em rede são retiradas da estufa e colocadas no primeiro frasco de xilol (seta preta) da bateria de coloração, onde o meio de inclusão que ainda resta na lâmina é retirado. Seguem-se mais 3 cubas com xilol (xilol 2, 3, 4), 2 cubas com álcool absoluto 100º (que retiram o xilol), álcool 95°, álcool 80° e, finalmente, água corrente.

• Numa pia, cora-se hematoxilina (núcleos) por três minutos. Lava-se em água corrente.• Diferencia-se rapidamente com álcool-ácido 1%. Lava-se em água corrente.• Azula-se com água amoniacal por 30 segundos. Lava-se em água corrente.• Retorna-se à bateria de coloração (álcool 95°, duas cubas, seta vermelha).• Mergulha-se em eosina (citoplasma) por um minuto.• Inicia-se a desidratação através de duas cubas de álcool 95°, cinco cubas de álcool 100° (absoluto, seta verde) e três cubas de xilol; nessa fase, as lâminas estão prontas para serem montadas.


HematoxilinaSulfato de alumínio e potássioÁlcool 95Óxido vermelho de mercúrio • Dissolver às vésperas do preparo a hematoxilina no álcool e o sulfato de alumínio e potássio na água, que deve ser aquecido em torno de 80° C.• No dia do preparo, levar a solução de sulfato de alumínio e potássio ao fogo e retirar após a fervura.• Acrescentar de maneira cuidadosa e lenta, com constante agitação, a solução de hematoxilina em álcool e voltar à fonte de calor.• Ferver por várias vezes, retirando e voltando ao fogo, por mais ou menos dez minutos.• Acrescentar lenta e cuidadosamente o óxido vermelho de mercúrio, agitar e retornar à fonte de calor. • Ferver por mais ou menos dez minutos, colocando e retirando da fonte de calor várias vezes.• Resfriar imediatamente em água corrente, acondicionar em frasco escuro e filtrar quando usar.

5 g100 g50 ml2,5 g

Figura 7 - Esquema de bateria de coloração de rotina.

Hematoxilina de Harris

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2.6 Montagem Os cortes histológicos, agora corados, necessitam ser recobertos por preservação e melhor refração no momento da microscopia. Para isso se utiliza um meio de montagem (Entellan®, Erv Mounth®, verniz etc.) que possibilite a fixação da lamínula de vidro sobre o corte histológico.

Figura 8 - Procedimento de montagem de lâmina. a - Lâmina retirada da cuba de xilol.b - Lâmina sendo montada.c - Utilização da lamínula.d - Meio de montagem.

Solução-mãeSolução aquosa de eosina a 1% Solução aquosa de floxina a 1% Solução uso (misturar em proveta ou cálice):Álcool comercial (95%)Solução de eosina aquosa a 1%Solução de floxina aquosa a 1%Ácido acético glacial PA puro

a

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d

400 ml50 ml

5 ml2 ml

Solução de Eosinafloxina

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Figura 9 - Lâminas prontas para leitura e diagnóstico. Os blocos dos quais foram confeccionados os cortes histológicos são acondicionados em gavetas de arquivo de madeira e, posteriormente, colocados em caixas de papelão apropriadas, quando são enviados ao arquivo definitivo do serviço.

Durante a leitura da lâmina o profissional médico pode necessitar de outras colorações, chamadas de especiais, para ajudar no diagnóstico. Neste caso, os blocos escolhidos são retirados do arquivo nova-mente gelados e submetidos à microtomia – estufa – xilol – álcool 100° – álcool 95° – 80° e água. Então procedem-se as colorações solicitadas conforme o capítulo a seguir.

Figura 10 - Arquivo.a - Arquivo de bloco tipo armário com gavetas, provisório, localizado no labo-ratório. b - Caixa arquivo de papelão, definitiva, armazenado no arquivo geral do ser-viço.

ba


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3 Colorações histológicas para grânulos, depósitos

e pigmentos

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Colorações especiais A solicitação de coloração especial, ou específica, é um procedimento feito pelo patologista ou pesquisador sempre que a lâmina corada por Hematoxilina & Eosina (HE) não for suficiente para diagnóstico ou mostrar estruturas que necessitam ser melhor esclarecidas. Elas se prestam para corar pigmentos, bactérias, fungos, substâncias amorfas, estruturas teciduais e para classificar as fibras que compõem o tecido examinado. Neste capítulo, cada coloração especial, ou específica, será tratada obedecendo a seguinte ordem: seu nome, a técnica de coloração seguida do preparo das drogas e corantes utilizados, seu resultado esperado e foto ilustrativa do procedimento. Com o intuito de ser mais didático, o capítulo está dividido em grupos específicos.

3.1 Substância amiloide

Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas.• Colocar as lâminas de 40 minutos a uma hora em tubete com solução de vermelho-congo.• Lavar em água corrente.• Diferenciar as lâminas rapidamente em solução de álcool a 50% e hidróxido de sódio a 1%.• Lavar em água corrente por cinco minutos.• Corar pela Hematoxilina de Van Gienson (Weigert) por 15 a 30 segundos.• Lavar em água corrente por dez minutos.• Desidratar e montar as lâminas.

Resultados Substância amiloide: corada em tom alaranjado.Núcleo: corado em tom azul.

Preparo de soluções

Solução de vermelho-congoSolução de vermelho-congoÁgua destilada

1 g100 ml

Hidróxido de sódio 1 %Hidróxido de sódio 1%Água destilada

1 g / 0,5g100 ml / 50ml

3 Colorações Histológicas Para Grânulos, Depósitos e Pigmentos• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Solução de álcool + hidróxido de sódio 1 %Hidróxido de sódio 1%Álcool 50%

1 g / 0,5g100 ml / 50 ml

Esta solução deve ser preparada na hora do uso.

Vermelho-congo

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Hematoxilina férrica de Weigert - Solução A*HematoxilinaÁlcool 95 º

1 g / 0,5 g100 ml / 50 ml

Solução de cloreto de Ferro 29 % - Solução B*Cloreto de ferro III ou férrico a 1,17 % Ácido clorídrico PA

99 ml1 ml

*Na hora do uso, misturam-se quantidades iguais de solução A e solução B e coloca-se a solu-ção sobre a lâmina.

Figura 11 - Material amiloide de aspecto alaranjado presente em vasos sanguíneos.a - Vermelho-congo, 100x.b - Vermelho-congo, 200x.

ba

Solução de cloreto de Ferro 1,17% Cloreto de ferro III ou férricoÁgua destilada

1,17 g100 ml

Desprezar 1,0 ml desta solução.

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3.2 Glicogênio

Procedimento• Colocar ácido periódico, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 20 minutos.• Lavar em água destilada.• Deixar escorrer bem a água.• Colocar o reativo de Schiff, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 40 minutos.• Lavar em água sulfurosa, três banhos de cinco minutos cada.• Lavar em água corrente.• Corar com Hematoxilina de Harris de 30 segundos a um minuto, dependendo da qualidade do corante.• Lavar em água corrente.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem – Entelan.

ResultadosNúcleos: azul-arroxeado.Fungos: vermelho. Fundo: verde-claro.Glicogênio, mucina, fibrina ou trombo, gotas de coloide, depósitos hialinos, membranas basais etc. Reação Positiva: vermelho-púrpura.


Ácido periódico 0,5 %Ácido periódico

Água destilada

0,5 g / 2,5 g

100 ml / 500 ml

Metabissulfito de sódio 10%Metabissulfito de sódioÁgua destilada

10 g / 5 g100 ml / 50 ml

Ácido clorídrico 1 NÁcido clorídrico densidade 1,19 e concentração de 36,7 %

Água destilada

41,25 ml

458,75 ml


Água sulfurosaMetabissulfito de sódio 10%Ácido clorídrico 1 NÁgua destilada

10 ml / 5 ml10 ml

180 ml / 90 ml

Este reativo deve ser preparado na hora do uso.

PAS sem digestão

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Procedimento• Salivar (cuspir) bem sobre a lâmina e deixar em câmara úmida por 20 minutos. Lavar as lâminas em água corrente para retirar a saliva.• Colocar ácido periódico, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 20 minutos.• Deixar escorrer bem a água.• Lavar em água destilada.• Colocar o reativo de Schiff, que fica na geladeira, sobre as lâminas por 40 minutos.• Lavar em água sulfurosa, três banhos de cinco minutos cada.• Lavar em água corrente.• Corar com Hematoxilina de Harris de 30 segundos a um minuto, dependendo da qualidade do corante.• Lavar em água corrente.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosNúcleos: azul-arroxeado.Fungos: vermelho. Fundo: verde-claro.Mucina, fibrina ou trombo, gotas de coloide, depósitos hialinos, membranas basais etc. Reação Positiva: vermelho-púrpura.

Obs.: Nesse PAS o glicogênio é digerido, portanto não cora na cor púrpura.


Ácido periódico 0,5 % Ácido periódico

Água destilada

0,5 g / 2,5 g

100 ml / 500 ml

a b

Figura 12 - Reação PAS positiva de cor fúcsia em mucosa intestinal.a - PAS, 100x.b - PAS, 200x.

PAS com digestão

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Água sulfurosaMetabissulfito de sódio 10%Ácido clorídrico 1 NÁgua destilada

10 ml / 5 ml10 ml

180 ml / 90 ml

Ácido clorídrico 1 NÁcido clorídrico densidade 1,19 e concentração de 36,7 %

Água destilada

41,25 ml

458,75 ml

Metabissulfito de sódio 10%Metabissulfito de sódioÁgua destilada

10 g / 5 g100 ml / 50 ml

3.3 Lipídeos


Água sulfurosaSudan III ou IV Álcool 70ºAcetona

1 g50 ml50 ml

Filtrar esta solução antes do uso. A solução não se conserva por muito tempo. Pode-se usar Scarlet C no lugar de Sudan IV.


Procedimento• Mergulhar rapidamente as lâminas em tubete com álcool 70%. • Colocar as lâminas em tubete com solução de Sudan III ou IV, previamente filtrada, por dois a cinco minutos. Voltar o reativo para o frasco após o uso.• Lavar as lâminas rapidamente em álcool 70%. • Lavar em água corrente.• Corar os núcleos com Hematoxilina de Harris por um a dois minutos.• Lavar cuidadosamente em água corrente.• Montar as lâminas com solução de gelatina de glicerina, previamente aquecida em micro -ondas. Não deixar formar bolhas.

ResultadosLípideos Neutros: corados em tom vermelho-vivo.Ésteres de colesterol: corados em tom alaranjado.

Sudan

Este reativo deve ser preparado na hora do uso.

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3.4 Muco

Procedimento• Corar as lâminas em hematoxilina de Harris por três a cinco minutos, dependendo da qualidade do corante. Diferenciar em álcool-ácido. • Enquanto as lâminas estão na hematoxilina, filtrar a solução de mucicarmim que será utilizada.• Lavar as lâminas em água corrente. • Azular na solução de amônia por 40 segundos.• Lavar as lâminas em água corrente.• Corar em solução de mucicarmim diluída com a mesma quantidade de água destilada, por 30 minutos.• Lavar as lâminas em água corrente rapidamente.• Lavar em água corrente.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosMuco: vermelho (carmim).Núcleos: negros.Cápsulas de criptococos: vermelho (carmim).Outros elementos do tecido: amarelos.

Meio de montagem - geleia de glicerinaGelatinaÁgua destiladaGlicerinaFenol (cristais)

5 g / 10 g / 2,5 g30 ml / 60 ml / 15 ml

35 ml / 70 ml / 17,5 ml

0,125 g / 0,25 g / 0,0625 g

a b

Figura 13 - Marcação alaranjada em glândula sebácea.a - Sudan, 40x. b - Sudan, 400x.

Mucicarmim

Dissolver a gelatina na água em um béquer em banho-maria (água esquentada no micro -ondas), adicionar a glicerina e o fenol. Conservar o meio de montagem em frasco vedado na geladeira. Quando for necessário usar, aquecê-lo no micro-ondas.

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Amarelo de metanilo - estoqueAmarelo de metaniloÁgua destilada

0,25 g100 ml


Figura 14 - Mucosa intestinal mostrando criptas com positividade carmim para mucinas. a - Mucicarmim, 100x.b - Mucicarmim, 200x.

ba

Solução matriz de mucicarmimCarmimCloreto de alumínioÁgua destilada

1 g1 g

100 ml

Colocar os três reagentes em um balão volumétrico de 500 ml e agitar bem. Acrescentar pequenas quantidades (cerca de 0,5 g) de cloreto de alumínio aos poucos, agitando bem. Levar o balão para o micro-ondas e colocar em potência média/máxima. Assim que come-çar a levantar fervura, desligar o micro-ondas. Repetir o processo por três vezes. Retirar do micro-ondas, deixar esfriar e guardar na geladeira.

Amarelo de metanilo usoAmarelo de metanilo estoqueÁgua destilada

10 ml40 ml

Na hora do uso, retirar o volume que será utilizado sobre as lâminas e pingar de uma a duas gotas de ácido acético glacial para acidificar a solução.

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Solução de nitrato de prata 10%

Solução de cloreto de ouro uso

Nitrato de prata

Solução-matriz de cloreto de ouro 1%

Água destilada

Água destilada

10 g / 5 g / 2,5 g

10 ml

100 ml / 50 ml / 25 ml

40 ml

3.5 Células cromafins

Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas até a água.• Preparar a prata de Fontana-Masson.• Colocar as lâminas em tubete com a solução de prata de Fontana e levar à estufa a 37º C por uma hora, até que os cortes apresentem uma coloração marrom-clara. Após 45 minutos de estufa, verificar constantemente a cor das lâminas, já que a temperatura da estufa pode variar. Se após esse tempo as lâminas ainda estiverem claras, retirar da estufa e deixar esfriar por cinco minutos à temperatura ambiente. • Enxaguar em água destilada três vezes.• Matizar em solução de cloreto de ouro por dez minutos.• Enxaguar em água destilada.• Colocar em tubete com solução de tiossulfato de sódio 2% por cinco minutos.• Enxaguar em água destilada.• Corar fundo com solução de vermelho-neutro nuclear sobre as lâminas por cinco minutos.• Enxaguar bem com água destilada.• Desidratar, clarificar e montar.

ResultadosGrânulos argentafins: corados em negro.Melanina: corada em negro.Núcleos e citoplasma: corados em rosa-claro.

Solução de nitrato de frata de Fontana

Procedimento• Separar pequeno volume da prata 10% preparada de 3 a 5 ml.• Pingar hidróxido de amônia concentrado gota a gota na solução de maior volume. Logo nas primeiras gotas a solução irá turvar, ficar pardacenta.• Adicionar amônia gota a gota até clarear esta solução novamente. Quando clarear, pingar gota a gota o restante do nitrato de prata, até que a solução turve novamente. Esta solução turva é que será utilizada na coloração. Filtrar antes de usar.

Fontana Masson

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Solução de tiossulfato de sódio 2%Tiossulfato de sódioÁgua destilada

2 g100 ml

Solução de vermelho-neutro nuclearVermelho-neutro nuclearÁgua destilada

1 g / 0,5 g100 ml / 50 ml

Figura 15 - Melanócitos da epiderme mostrando positividade granular e escurecida.a - Fontana Massom, 100x.b - Fontana Massom, 200x.

a b

3.6 Pigmento biliar

Preparo de soluçõesSolução reagente de Fouchet

Solução aquosa de cloreto de ferro 10%Solução aquosa de ácido tricloroacético 25%

1 ml / 5 ml / 10 ml10 ml / 50 ml /100 ml

Solução de picro fucsina de Van Gienson – solução-mãeSolução aquosa fucsina ácida 1%Solução aquosa de ácido pícrico

2,5 ml97,5 ml


Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas.• Lavar em água destilada.• Corar pelo reagente de Fouchet por cinco minutos.• Lavar em água corrente por dois a três minutos.• Corar pela solução de Van Gienson durante cinco minutos.• Desidratar, clarificar e montar.

ResultadosPigmento biliar: corado em verde-oliva.Colágeno: corado em vermelho.Outras estruturas: coradas em amarelo.

Fouchet

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Solução de picro fucsina de Van Gienson - solução usoSolução-mãeÁgua destilada

10 ml40 ml

Solução de vermelho-neutro nuclear 1%Vermelho-neutro nuclearÁgua destilada

1 g / 0,5 g100 ml / 50 ml

Solução de nitrato de prata 1%Nitrato de prataÁgua destilada

1,0 g / 0,5 g / 0,25 g100 ml / 50 ml / 25 ml

3.7 Cálcio

Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas.• Colocar as lâminas em tubete com solução de prata a 1% por uma hora exposto ao sol ou bem próximo a uma lâmpada.• Lavar em água destilada.• Corar os núcleos com vermelho-neutro nuclear ou safranina o pingado sobre a lâmina por 30 segundos.• Lavar em água corrente.• Desidratar, diafanizar e montar as lâminas.

ResultadosCálcio: corado em negro-opaco.


Van Kossa

Figura 16 - Calcificações de tonalidade escura em túbulos renais (Van Kossa, 400x).

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3.8 Ferro

Procedimento• Dependendo da quantidade de lâminas a ser corada, preparar uma solução com partes iguais de ferrocianeto de potássio e ácido clorídrico. • Deixar as lâminas em tubete com esta solução por 30 minutos.• Lavar as lâminas rapidamente em água destilada.• Contracorar com solução de eosina 1% (preparar na hora diluição 1:9) por 30 segundos.• Lavar rapidamente em água corrente.• Retirar as lâminas do tubete.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosPigmentos de ferro: azul.Núcleos: vermelhos.Citoplasma: róseo.

Solução de ferrocianeto de potássio a 10%

Solução de nitrato de prata 1%

Eosina 1%

Ferrocianeto de potássio

Ácido clorídrico PA

Eosina

Água destilada

Água destilada

Água destilada

10 g / 5 g

20 ml / 10 ml / 5 ml

1,0 ml / 0,5 ml / 0,25 ml

100 ml / 50 ml

100 ml / 50 ml / 25 ml

100 ml / 50 ml / 25 ml


Figura 17 - Depósitos hepáticos de hemossiderina. Positividade azulada e granular em depó-sitos hepáticos de hemossiderina. a - Perl’s, 200x.b - Perls, 400x.

a b


Perl´s

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41

4 Coloração para tecido conjuntivo

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4.1 Fibras colágenas

Procedimento• Desparafinar e hidratar as duas lâminas que serão utilizadas na coloração em água corrente. • Colocar a hematoxilina de Weigert (soluções A e B) sobre as lâminas por dez minutos.• Lavar as lâminas em água corrente por dez minutos.• Colocar a solução de Van Gienson - Picrofucsina sobre as lâminas por cinco minutos.• Passar direto para o álcool 95º.• Retirar as lâminas do tubete.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosFibras colágenas - vermelhasNúcleos - negrosCitoplasma - amarelo.

Hematoxilina férrica de Weigert - solução A

Solução estoque de picrofucsina de Van Gienson

Solução de cloreto de ferro 1,17%

Solução uso de picrofucsina de Van Gienson

Solução de cloreto de ferro 29% - solução B

Hematoxilina

Solução aquosa de fucsina ácida 1%

Cloreto de ferro III ou férrico

Solução estoque de picrofucsina

Cloreto de ferro III ou férrico a 1,17%

Álcool 95º

Solução aquosa de ácido pícrico

Água destilada

Água destilada

Ácido clorídrico PA

1 g / 0,5 g

2,5 ml

1,17 g

10 ml

99 ml

100 ml / 50 ml

97,5 ml

100 ml

40 ml

1 ml


4 Coloração Para Tecido Conjuntivo• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Van Gienson

Desprezar 1 ml desta solução.

Na hora do uso, mistura-se quantidades iguais de solução A e solução B e coloca-se a solu-ção sobre a lâmina.

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4.2 Fibras elásticas

Procedimento• Colocar hematoxilina de Verhoeff sobre as lâminas por 15 minutos, até que fiquem negras. • Diferenciar na solução aquosa de cloreto de ferro (férrico) a 2%. Coloca-se o cloreto de ferro em um tubete e a água em outro tubete. Mergulha-se a lâmina no cloreto e depois na água.• Controla-se a diferenciação pelo microscópio até que o tecido conjuntivo tome a cor da solução de lugol.• Durante a diferenciação, deve-se agitar a lâmina dentro do tubete. Se a diferenciação for excessiva, recorar pela hematoxilina de Verhoeff.• Lavar em água corrente por cinco minutos.• Corar pela solução de Van Gienson (picrofucsina uso) por cinco minutos.• Passar as lâminas pelo álcool 95º.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosFibras elásticas: negras.Núcleos: azuis ou negros.Colágeno: vermelho.Outros elementos do tecido: amarelos.

Hematoxilina de Verhoeff - solução A

Hematoxilina de Verhoeff - solução B

Hematoxilina de Verhoeff - solução C

Hematoxilina (cristais)

Cloreto de ferro (férrico)

Iodo metálico

Álcool absoluto

Água destilada

Iodeto de potássioÁgua destilada

2,5 g / 0,5 g / 5 g

10 g / 5 g

2 g / 1 g

50 ml / 10 ml / 100 ml

100 ml / 50 ml

4 g / 2 g100 ml / 50 ml


Na hora de usar, misturar as soluções na seguinte ordem e quantidade:Solução uso

Solução ASolução BSolução C

2,5 ml / 1,25 ml1 ml / 0,5 ml1 ml / 0,5 ml

Misturar em quantidade adequada à necessidade da rotina. Colocar esta solução sobre as lâminas. Preparar a solução na hora do uso.

Verchoeff

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Ou

Solução de Van Gienson (picrofucsina) - solução-mãe (Stock)

Solução de Van Gienson (picrofucsina) - solução uso

Solução diferenciadora de cloreto férrico a 2%

Solução aquosa de fucsina ácida 1%

Solução-mãe

Cloreto de ferro (férrico)

Solução aquosa de ácido pícrico

Água destilada

Água destilada

2,5 ml

10 ml

2 g / 1 g

97,5 ml

40 ml

100 ml / 50 ml

Solução diferenciadora de cloreto férrico a 2%Solução aquosa de cloreto de ferro 10%Água destilada

20 ml80 ml

4.3 Fibras reticulares


Procedimento• Enquanto as lâminas estão no xilol, filtra-se o permanganato de potássio em cone de papel.• Oxidar pingando permanganato de potássio 0,5% já filtrado sobre as lâminas por um minuto.• Lavar rapidamente as lâminas em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem.• Diferenciar pingando solução de ácido oxálico 3% sobre a lâmina por um minuto. • Lavar em água corrente, rapidamente, dando dois mergulhos na cuba de lavagem.• Sensibilizar pingando a solução de sulfato férrico amoniacal a 2% (ou alúmen de ferro 2%) sobre a lâmina por um minuto.• Lavar rapidamente em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem.• Lavar rapidamente em água corrente dando dois mergulhos na cuba de lavagem. • Reduzir na solução de formol 10%, colocando as lâminas em tubete, por três minutos.• Lavar rapidamente em água corrente.• Matizar em cloreto de ouro 0,2%, em tubete, por cinco minutos.• Colocar de volta o reativo no frasco.• Lavar as lâminas em água corrente rapidamente.• Fixar a prata com tiossulfato de sódio 2%, em tubete, por um minuto.• Lavar rapidamente em água corrente.• Contracorar na solução de verde-luz por um a três minutos, dependendo da validade do corante. • Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosFibras reticulares: negras.Coloração de fundo: esverdeada.

Retículo

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Solução de permanganato de potássio 0,5%Permanganato de potássioÁgua destilada

0,5 g / 0,25 g100 ml / 50 ml

Solução de ácido oxálico 3%Ácido oxálicoÁgua destilada

15 g / 9 g / 3 g500 ml / 300 ml / 100 ml

Solução de hidróxido de potássio a 10%Hidróxido de potássioÁgua destilada

10 g / 5 g / 2,5 g100 ml / 50 ml / 25 ml

A solução de prata amoniacal deve ser preparada na hora do uso. Os reagentes utilizados em seu preparo já ficam prontos, com exceção do nitrato de prata a 10%, que deve ser pre-parado na hora.

Solução de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro) a 2%Sulfato férrico amoniacal, ou alúmen de ferroÁgua destilada

8 g / 2 g / 1 g400 ml / 100 ml / 50 ml


Solução de nitrato de prata a 10%Nitrato de prataÁgua destilada

0,5 g / 0,25 g5 ml / 2,5 ml

Pesar a quantidade de droga necessária de acordo com a quantidade de lâminas a serem coradas. Geralmente, em nossa rotina, usamos a receita inteira, ou seja, 5,0 ml.

Solução de formol a 10%Formol PAÁgua destilada

10 ml / 5 ml100 ml / 50 ml

Esta solução deve ser preparada na hora do uso.

Solução de prata amoniacalSolução aquosa de nitrato de prata 10%Solução aquosa de hidróxido de potássio

Hidróxido de amônia concentrado

5 g / 2,5 g50 ml / 25 ml

1,5 ml (20 a 24 gotas) / 0,75 ml (10 a 12 gotas)

Pipetar o hidróxido de potássio no béquer do nitrato de prata e misturar levemente. Colocar a amônia gota a gota até que o precipitado formado desapareça e a solução fique bem clara, transparente como água. Em seguida, filtrar e dobrar o volume da solução com água destilada. Este reativo deve ser desprezado após o uso.

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Solução-mãe de cloreto de ouro a 1 %Ampola de 1 g de cloreto de ouroÁgua destilada

uma ampola100 ml

Figura 18 - Trama reticular enegrecida em fígado cirrótico (Retículo, 200x).



2 g / 4 g / 6 g / 8 g100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml

Em geral, preparamos quatro receitas, o que nos dá um volume final de 400 ml.

Solução de cloreto de ouro 0,2%Solução de cloreto de ouro 1%Água destilada

10 ml 40 ml

Preparar sempre entre duas receitas, o que dá 100 ml de solução de cloreto de ouro. Usa-se este reativo em média por dois meses, ou até que fique em tom de amarelo muito claro.

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Dissolver a hematoxilina no calor. Depois de fria, acrescentar o ácido fosfotúngstico. O ama-durecimento é longo, de três a quatro semanas. Para amadurecimento rápido, acrescentar 0,02 g de permanganato de potássio.

4.4 Fibrina

Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas em água corrente. • Colocar as lâminas em tubete com solução de Zenker por 90 minutos na estufa 56º C.• Retirar as lâminas da estufa e deixar na mesma solução de Zenker, agora em temperatura ambiente por 15 minutos.• Colocar solução de Lugol sobre as lâminas por 15 minutos.• Lavar em água corrente. • Colocar as lâminas em solução de tiossulfato de sódio 2% por três minutos.• Lavar em água corrente.• Colocar as lâminas em tubete com hematoxilina fosfotúngstica de Mallory por 90 minutos na estufa 56º C.• Retirar as lâminas da estufa e deixar na mesma hematoxilina, agora em temperatura ambiente, por 15 minutos. • Lavar rapidamente em água corrente.• Desidratar e montar as lâminas.

ResultadosConectivo: vermelho/amarelo. Estrias musculares: azuis.Fibroglia e microglia: azuis-escuros.

Solução de hematoxilina fosfotúngstica

Iodine

Solução de sulfato férrico amoniacal (alúmen de ferro) a 2%

Hematoxilina

Iodine (iodo metálico)

Sulfato férrico amoniacal, ou alúmen de ferro

Ácido fosfotúngstico

Iodeto de potássio

Água destilada

Água destilada

Água destilada

0,1 g

1 g

8 g / 2 g / 1 g

2 g

2 g

100 ml

300 ml

400 ml / 100 ml / 50 ml


Hematoxilina ácida fosfotúngstica de Mallory (PTAH)

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Solução de Zenker

Solução de tiossulfato de dódio 2%

Dicromato de potássio

Tiossulfato de sódio

Cloreto de mercúrio

Água destilada

Sulfato de sódio

Água destiladaÁcido acético glacial

2,5 g / 1,25 g

2 g / 4 g / 6 g / 8 g

5 g / 2,5 g

100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml

1 g / 0,5 g

100 ml / 50 ml5 ml / 2,5 ml


4.5 Colágeno

Procedimento• Desparafinar, hidratar.• Corar pela mematoxilina de Groat por dez minutos.• Lavar em água corrente por cinco minutos.• Lavar em água acética a 1% por 30 segundos.• Corar em Rouge Mallory por dez minutos.• Lavar para retirar o excesso do corante com água acética a 1%.• Imergir as lâminas em solução de ácido fosfomolibdico a 10% por 10 minutos.• Lavar para retirar o excesso do ácido com água acética a 1%.• Corar com Vert-Lumiere ou Azul de Anilina por dez minutos.• Lavar em água acética a 1% para retirar o excesso do corante.• Desidratar, diafanizar e montar.

ResultadosNúcleos: marrons.Citoplasma, queratina e fibras musculares: vermelhos.Fundo: verde-claro.Colágeno: azul ou verde.

Preparo de Soluções

Tricrômico de Masson (tempo rápido)

Água acética 1%Ácido acéticoÁgua destilada

5 ml50 ml

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Rouge MalloryFucsina ácidaOrange GÁcido acético

Água destilada

1 g0,4 g3 ml

300 ml

Ácido fosfomolibdico 10%Ácido fosfomolibdicoÁgua destilada

10 g100 ml

Vert-Lumiere – light-greenLight-greenÁgua destiladaÁcido acético

1 g100 ml

1 ml

Azul de anilina 1%Azul de AnilinaÁgua destiladaÁcido acético

1 g100 ml

1 ml

50

Hematoxilina de Groat - Solução AÁlcool 95°Hematoxilina

50 ml0,5 g

Hematoxilina de Groat - Solução BÁgua destiladaÁcido sulfúrico concentrado

50 ml0,8 ml

Sulfato férrico amoniacal 1 g

Misturar Solução A + Solução B em partes iguais e dobrar o volume com água destilada.

Figura 19 – Feixes de tecido conjuntivo de tonalidade azulada ao redor de fibras musculares (50x).

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51

5 Coloração para agentes etiológicos

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Iodine de GramIodine (iodo metálico)Iodeto de potássioÁgua destilada

1 g / 0,5 g2 g / 1 g

300 ml / 150 ml


5.1 Bactérias

Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas em água corrente. • Pingar solução de cristal violeta filtrado sobre a lâmina e deixar por dois minutos.• Lavar em água corrente para retirar o excesso do corante.• Cobrir a lâmina com solução de Lugol por cinco minutos.• Lavar em água corrente.• Escorrer o excesso de água e colocar em acetona pura, diferenciando a lâmina com aproximadamente três a quatro mergulhos (verificar a olho nu a diferenciação).• Lavar em água corrente.• Lavar em água corrente para remover o excesso de ccetona.• Colocar solução de carbolfucsina sobre a lâmina de 1 minuto a 1 minuto e 30 segundos. • Lavar em água corrente.• Colocar em tubete com solução de Gallego por cinco minutos.• Lavar em água corrente, deixando escorrer o excesso, e passar imediatamente para tubete com acetona pura, aproximadamente por três mergulhos.• Passar as lâminas em tubete com ácido pícrico e acetona aproximadamente por três mergulhos.• Passar as lâminas em tubete com acetona aproximadamente por três mergulhos.• Passar as lâminas por três mergulhos no xilol.• Montar a lâmina.

ResultadosBactérias gram-positivas: roxas.Bactérias gram-negativas: rosas.

5 Coloração Para Agentes Etiológicos• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Gram

Solução de hematoxilina fosfotúngsticaHematoxilinaÁcido fosfotúngsticoÁgua destilada

0,1 g2 g

100 mlFiltrar antes de usar.

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Carbol fucsina

Solução de Gallego

Ácido pícrico acetona

Fucsina básica

Formol concentrado

Ácido pícrico

Fenol (ácido fênico)

Ácido acético glacial

Acetona

Álcool absoluto

Água destilada

Água destilada

1 g / 0,5 g / 0,25 g

1 g / 0,5 g

1 g / 0,5 g

5 g / 2,5 g / 1,25 g

0,5 ml / 0,25 ml

100 ml / 50 ml

10 ml / 5 ml / 2,5 ml

50 ml / 25 ml

100 ml / 50 ml / 25 ml

Figura 20- Agrupamento de bactérias com positividade azulada (Gram, 400x).

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5.2 Tuberculose

Procedimento• Colocar as lâminas em suporte próprio (bandeja) para colocar os reativos utilizados sobre a lâmina. • Colocar a solução de Ziehl-Neelsen filtrada sobre as lâminas e deixar de 40 minutos a uma hora aproximadamente.• Lavar as lâminas em água corrente para retirar o excesso do corante.• Colocar álcool-ácido em um tubete.• Diferenciar as lâminas, uma a uma, mergulhando-as em álcool ácido e lavando em cuba com água corrente até que se obtenha um tom de rosa-pálido nos cortes. Observar a diferenciação atentamente para que não se descore demais.• Colocar as lâminas em uma rede e lavá-las em uma cuba com água corrente (embaixo da torneira) por aproximadamente dez minutos.• Mergulhar as lâminas, uma a uma, no tubete com solução uso de azul de metileno, rapidamente, cerca de dois ou três mergulhos intercalados com lavagens em cuba com água corrente.• Colocar as lâminas na rede e deixar secar bem para que não desbotem na montagem.• Levar para a bateria para desidratar e diafanizar rapidamente. • Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosBacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): vermelhos brilhantes.Outros elementos do tecido: azuis-claros.

Fucsina fenol de ZiehlFenolÁlcool absolutoFucsina básicaÁgua destilada

20 g / 25 g / 2,5 g / 5 g40 ml / 50 ml / 5 ml / 10 ml

4 g / 5 g / 0,5 g / 1 g400 ml / 500 ml / 50 ml / 100 ml


Álcool-ácido 1%

Solução estoque de azul de metileno (solução-mãe)

Álcool 70%

Azul de metileno

Ácido clorídrico

Álcool comercial (95º)

500 ml

1,4 g

5 ml

100 ml


Ziehl-Neelsen

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5.3 Lepra

Solução uso de azul de metilenoAzul de metileno estoqueÁgua destilada

10 ml90 ml

Figura 21 - Bacilos avermelhados, intracelulares, presentes em tecido pulmonar. a - Ziehl-Neelsen, 200x.b - Ziehl-Neelsen, 400x.

Procedimento• Nesta coloração, as lâminas não são desparafinizadas no xilol, e sim na terebentina. O tempo de exposição é o mesmo utilizado para o xilol. • Lavar as lâminas em água corrente para retirada do excesso de terebentina. Secar as lâminas em papel de filtro.• Colocar a solução de Ziehl-Neelsen filtrada sobre as lâminas e deixar de 40 minutos a uma hora aproximadamente.• Lavar as lâminas em água corrente para retirar o excesso do corante.• Colocar álcool-ácido em um tubete.• Diferenciar as lâminas, uma u uma, mergulhando-as em álcool-ácido e lavando em cuba com água corrente, até que se obtenha um tom de rosa-pálido nos cortes. Observar a diferenciação atentamente para que não se descore demais.• Colocar as lâminas em uma rede e lavá-las em água corrente em uma cuba (embaixo da torneira) por aproximadamente dez minutos. • Mergulhar as lâminas, uma a uma, no tubete com solução uso de azul de metileno, rapidamente, cerca de dois ou três mergulhos intercalados, dependendo da validade do corante, com lavagens em cuba com água corrente.• Colocar as lâminas na rede e deixar secar bem para que não desbotem na montagem.• Levar para a bateria para desidratar e diafanizar rapidamente.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosBacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR): vermelhos. Filamentos de nocárdia: vermelhos.Bacilos de lepra: vermelhos.Fundo: azul-pálido.

Fite-faraco

a b

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Álcool-ácido 1%Álcool 70%Ácido clorídrico

500 ml5 ml

Solução estoque de azul de metileno (solução-mãe)Azul de metilenoÁlcool comercial (95º)

1,4 g100 ml

Solução uso de Azul de metilenoAzul de metileno estoqueÁgua destilada

10 ml90 ml


Fucsina fenol de ZiehlFenolÁlcool absolutoFucsina básicaÁgua destilada

20 g / 25 g / 2,5 g / 5 g40 ml / 50 ml / 5 ml / 10 ml

4 g / 5 g / 0,5 g / 1 g400 ml / 500 ml / 50 ml / 100 ml

Esta solução deve ser filtrada antes do uso.

Figura 22 - Aglomerados de bacilos de Hansen de tonalidade avermelhada em derme. a - Fite-Faraco, 200x.b - Fite-Faraco, 1000x.

a b

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5.4 Fungos

Procedimento• Colocar as lâminas para oxidar em tubete ou cálice de vidro com solução aquosa de ácido crômico a 5% por 40 minutos. Caso necessário, o tempo pode ser maior. • Voltar o reativo para o frasco.• Lavar as lâminas em água corrente.• Mergulhar as lâminas na solução de bissulfito de sódio a 1% por um minuto para remover o ácido crômico.• Lavar as lâminas em água corrente duas vezes.• Lavar as lâminas em água destilada duas vezes.• Deixar água destilada em quantidade suficiente para cobrir as lâminas no tubete.• Mergulhar na solução de nitrato de prata metanamina. • Levar o tubete e o recipiente onde foi preparada a solução de prata metanamina para o micro -ondas.• Iniciar o aquecimento da prata para que esta alcance cerca de 56º C de temperatura, colocando -se o micro-ondas em potência máxima por 50 segundos.• Descartar a água destilada do tubete e substituí-la pela solução de nitrato de prata metanamina.• Ligar o micro-ondas em potência média por dez segundos. Abrir e verificar a impregnação da prata. Ir repetindo este procedimento, intercalando com um tempo, na potência mínima, de seis segundos, para não aquecer muito a prata, até se verificar que os cortes atingiram uma cor amarelo-pardacenta, indicando que a impregnação está correta.• Retirar o tubete do micro-ondas e lavar várias vezes em água corrente.• Colocar solução de cloreto de ouro a 0,2% no tubete por cinco minutos.• Lavar em água corrente.• Remover a prata não reduzida passando pela solução de tiossulfato de sódio a 2% por cinco minutos.• Lavar em água corrente cuidadosamente.• Preparar a solução de amarelo de metanilo a 0,25% em quantidade suficiente para cobrir as lâminas na bandeja.• Acidificar o amarelo de metanilo, pingando uma gota de ácido glacial acético.• Colocar as lâminas na bandeja de coloração e pingar sobre os cortes o amarelo já acidificado.• Lavar as lâminas cuidadosamente em água corrente.• Colocar as lâminas na rede, deixar secar e levar para a bateria para desidratar e diafanizar.• Montar a lâmina com lamínula e meio de montagem.

ResultadosFungos: negros.Mucina: preto-acinzentada.Partes centrais do micélio e hifas: rosa-avermelhadas.Coloração de fundo: amarela.

Prata metenamina de Gomori (GMS)

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Preparo de soluçõesSolução de ácido crômico 5%

Ácido crômicoÁgua destilada

5 g / 10 g /20 g100 ml / 200 ml / 400 ml

Bissulfito de sódioBissulfito de SódioÁgua destilada

1 g / 2 g100 ml / 200 ml

Solução de BóraxBórax, ou ácido bóricoÁgua destilada

5 g / 10 g100 ml / 200 ml


5 g / 10 g100 ml / 200 ml

Solução-mãe de cloreto de ouro 1%Ampola de 1 g de cloreto de ouroÁgua destilada

uma ampola100 ml

Solução de metanamina 3%Hexamethylenotetramine ou metanamina ou urotropinaÁgua destilada

3 g / 6 g / 9 g

100 ml / 200 ml / 300 ml

Solução de cloreto de ouro 0,2%Solução de cloreto de ouro 1%Água destilada

10 ml 40 ml

Preparamos sempre entre duas receitas, o que nos dá 80 ml de solução de cloreto de ouro. Usa-se este reativo em média por dois meses ou até que fique em tom de amarelo muito claro.


Solução de prata metanaminaSolução metanamina 3%Solução de bórax 5%Nitrato de prata 5%Água destilada

25 ml / 50 ml2 ml / 4 ml

1,25 ml / 2,5 ml25 ml / 50 ml

Preparar esta solução com os reativos sempre nesta ordem. A quantidade de reagente pre-parado depende da quantidade de lâminas que estão sendo coradas.Este reagente deve ser sempre preparado na hora do uso.

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Amarelo de metanilo - estoqueAmarelo de metaniloÁgua destilada

0,25 g100 ml

Figura 23 - Positividade escurecida em parede de fungos (paracoccidioidomicose), GMS, 200x.

Amarelo de metanilo usoAmarelo de metanilo stockÁgua destilada

10 ml40 ml

Acidificar com uma a duas gotas de ácido acético glacial na hora do uso.


2 g / 4 g / 6 g / 8 g100 ml / 200 ml / 300 ml / 400 ml

Em geral, preparamos quatro receitas, o que dá um volume final de 400 ml.

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5.5 Espiroquetas


Solução A da água tamponada de pH 3,6 (fica na geladeira)Acetato de sódioÁgua destilada

1,64 g / 8,2 g100 ml / 500 ml

Solução B da água tamponada de pH 3,6 (preparar na hora do uso )Ácido acético glacialÁgua destilada

0,59 ml / 1,18 ml / 5,9 ml50 ml / 960 ml / 480 ml


Procedimento• Nesta reação, utilizar sempre água tamponada para lavagem das lâminas e preparo das soluções. • Deve-se preparar os reativos antes do início da reação, de preferência enquanto as lâminas estão desparafinando. Todos eles devem ficar na estufa 56º C durante toda a reação, inclusive o que sobrar de água tamponada. Cada um deve ser acondicionado em um béquer diferente, e o da prata deve ter capacidade para 60 ml de solução, já que a solução reveladora será preparada nele.• Desparafinar e hidratar as lâminas até a água tamponada de pH 3,6, que estará em um tubete.• Impregnar os cortes na solução de nitrato de prata 1%, sempre dissolvida em água tamponada, colocando as lâminas no tubete que já está na estufa 56º C junto com a prata, por uma hora.• Após este período iremos descartar a Solução de Prata 1% em um béquer vazio. Os cortes ainda estarão brancos, e não de cor acastanhada, o que só ocorrerá após a revelação.• Preparar a solução reveladora juntando os reativos que estão na estufa na seguinte ordem: solução de Prata 2%, gelatina e hidroquinona. Agitar levemente.• Colocar a solução reveladora no tubete onde estão as lâminas e observar atentamente, já que o processo de revelação é bem rápido. Agora sim as lâminas ficarão de cor amarelo-pardacenta, acastanhada.• Após a revelação, descartar a solução reveladora e lavar as lâminas com o restante da água tamponada que também estava na estufa. • Desidratar, clarificar e montar.• Depois de montadas, manter as lâminas em local escuro (dentro de uma gaveta ou entre bandejas), ao abrigo da luz.

ResultadosEspiroquetas: negras.Fundo: amarelo-canela.

Warthin Starry

Solução de água tamponada de pH 3,6Solução ASolução BÁgua destilada

3 ml / 1,5 ml37 ml / 18,5 ml

960 ml / 480 mlPara um tubete, até três lâminas, preparar 500 ml desta solução.

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Nitrato de prata 1 e 2% Pesar 0,68 g de nitrato de prata. Acrescentar 34 ml de água tamponada. Retirar 9 ml dessa solução e reservar. Esta será a prata 2% que será utilizada. O restante da prata que ficou no béquer (2%) terá seu volume dobrado com 25 ml de água tamponada e passará a ser a prata 1% utilizada na reação.

GelatinaGelatinaÁgua tamponada

2,5 ml45 ml

HidroquinonaHidroquinonaÁgua destilada

0,3 g3 ml

Figura 24 - Corte de pulmão. Estruturas espiraladas, alongadas e negras (espiroquetas). Warthin Starry, 1000x.

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6 Coloração para sistema nervoso

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6.1 Fibras nervosas

Procedimento• Desparafinar e hidratar as lâminas até a água. • Pesar 5 g de AgNO3 e diluir em 25 ml de água destilada. Esta será nossa solução de prata 20% - solução A.• Separar 13 ml desta solução, aquecer no micro-ondas na potência mínima (20%) por aproximadamente 48 segundos. Colocar o termômetro e verificar se a prata atingiu a temperatura desejada de 56º C. Esta solução tem que ser preparada na hora do uso.• Caso a temperatura esteja adequada, colocar a lâmina em tubete pequeno com esta solução de prata em estufa 56º C, coberta por papel alumínio, por aproximadamente 5 minutos.• Retirar o tubete da estufa 56º C e passar para a estufa 37º C por dez minutos, sem retirar o papel alumínio. Enquanto isso, ir preparando a solução B.• Lavar em água destilada morna (aquecida em tubete por 15 segundos em potência máxima no micro-ondas).• Os 12 ml de AgNO3 que restaram irão receber gotas de hidróxido de amônia. Logo na primeira gota, a solução irá ficar pardacenta. A partir da segunda gota, iremos pingando amônia para clarear a solução novamente (para este volume de prata, serão aproximadamente de 50 a 60 gotas). Essa prata deverá ser aquecida da mesma forma que a anterior antes de ser utilizada. Esta será nossa solução B.• Com a temperatura adequada (56º C), colocar a lâmina em tubete pequeno com esta solução de prata em estufa 56º C, coberta por papel alumínio, por aproximadamente cinco minutos.Retirar o tubete da estufa 56º C e passar para a estufa 37º C por dez minutos, sem retirar o papel alumínio. Enquanto isso, ir preparando a solução reveladora, que será nossa solução C. • Preparar a solução reveladora de trabalho e a solução uso adicionando-se oito gotas de amônia concentrada e oito gotas da solução C a 50 ml de água destilada. Esta solução também deve ser preparada na hora do uso.• Retirar as lâminas da estufa, lavá-las em água destilada morna e colocá-las na solução reveladora uso até que as fibras nervosas (axônios) fiquem de cor negra, quando observados sobre um fundo amarelo. O tempo esperado para esta mudança pode estar entre um e cinco minutos, dependendo da região a ser corada (geralmente o tempo é de um a dois minutos).• Checar a lâmina ao microscópio para verificar se a impregnação está correta.• Lavar a lâmina em água amoniacal fresca (oito gotas de amônia para 50 ml de água Destilada).• Lavar as lâminas em água destilada por um minuto.• Desidratar, clarificar e montar.

ResultadosAxônios: negros.Background: amarelo-acastanhado.Placas neuríticas e tangles: negros.Placas e amiloide vascular: castanhas/castanho-escuras.

6 Coloração Para Sistema Nervoso• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Bielschowsky

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Solução reveladora - estoque - solução CÁcido cítricoFormaldeído PAÁcido nítricoÁgua destilada

0,5 g / 0,25 g / 1 g20 ml / 10 ml / 40 ml

2 gotas / 1 gota / 4 gotas100 ml / 50 ml / 200 ml

Figura 25 - Trama fibrilar de aspecto escurecido em processos axionais do encéfalo (Bielschowsky, 400x).

Solução reveladora - uso - solução CSolução C – estoqueAmôniaÁgua destilada

8 gotas8 gotas

50 ml

Esta quantidade de solução uso é suficiente para se corar de cinco a dez lâminas.

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7 Imuno-histoquímica

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7.1 Conceitos Básicos O termo surgiu das palavras imunologia, histologia e química. • Imunologia: estuda o sistema imunológico. • Histologia: estuda tecidos e órgãos com auxílio do microscópio. • Química: estuda os elementos da natureza e a maneira pela qual se ligam e reagem entre si. O processo de identificar antígenos nos tecidos com anticorpos através de cortes histológicos co-rados é chamado imuno-histoquímica. A coleta e os passos seguintes do material a ser estudado obedecem os mesmos passos do material colhido para diagnóstico de rotina Hematoxilina & Eosina (HE), ou seja, coleta, fixação, macroscopia, processamento histológico (desidratação, diafanização e inclusão), microtomia e pesca, sendo que, após esta fase, as lâminas com os cortes devem secar preferencialmente ao ar livre, ser escorridas em estufa, desparafinizadas e assim serem submetidas à técnica imuno-histoquímica, conforme protocolo básico abaixo.

7.2 Protocolo para reação de imuno-histoquímica

1. Cortes de 2 µm e 3 µm em lâminas silanizadas.2. Secar bem as lâminas e escorrer a 60º C na estufa.3. Desparafinizar em xilol.4. RE hidratar em álcoois decrescentes5. Lavar em água corrente e água destilada.6. Proceder à recuperação antigênica conforme a orientação da bula. • Micro-ondas • Panela de pressão • Steamer – Panela a vapor – 96º C • Banho sorológico – 96º C a 98º C

Tampões de recuperação antigênica • Citrato pH 6,0 • EDTA pH 8,0 • Tris EDTA pH 9,0

Independentemente do procedimento utilizado na recuperação antigênica, deve-se deixar esfriar por 20 minutos em temperatura ambiente ou em água corrente.

7. Lavar as lâminas em tampão de lavagem (PBS ou TBS).8. Bloquear a peroxidase endógena por meio do peróxido de hidrogênio/metanol a 0,5 /v/v durante dez minutos.9. Lavar em lâminas em TBS por três minutos.10. Incubar em soro bloqueador (bloqueio da proteína) durante dez minutos.11. Incubar no anticorpo primário.

7 Imuno-histoquímica • • • • • • • • • • • • • • • • •

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Preparação das lâminas para imuno-histoquímica

• O APTS (silano) é tóxico e causa queimaduras na pele, portanto o mesmo deverá ser manipulado com cuidado, utilizando luva. • Colocar as lâminas em berço de alumínio.• Preparar três cubas de vidro na capela de exaustão. - Cuba 1: solução de APTS a 6% em acetona. - Cuba 2: água destilada. - Cuba 3: água destilada.• Colocar a rede metálica com as lâminas na solução de APTS a 6% (cuba 1) por três minutos. Escorrer o excesso.• Colocar em água destilada (cuba 2) por três minutos. Escorrer o excesso.• Colocar em água destilada (cuba 3), imergir quatro vezes, escorrer o excesso e acondicionar as redes com as lâminas em bandeja forrada com papel filtro ou compressa cirúrgica, sendo que as lâminas devem ficar com a extremidade fosca voltada para cima.• Secar em estufa a 60° C por uma hora ou por toda a noite protegidas de poeira.• Guardar em caixas.

Silano (silanização)

• Colocar as lâminas em solução de Poly-L-lysina (1:10). Utilizar recipientes plásticos.• Secar em estufa a 60° C por uma hora ou por toda a noite.• Guardar as lâminas em caixas para evitar contaminação e poeira.

Poly-L-Lysina

12. Lavar em TBS durante três minutos.13. Incubar as lâminas no anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos.14. Lavar em tampão TBS durante três minutos.15. Incubar as lâminas em ABC – HRP por 30 minutos.16. Lavar em TBS por três minutos.17. Incubar as lâminas em DAB por cinco minutos.18. Lavar as lâminas em TBS por três minutos.19. Lavar em água destilada.20. Corar na hematoxilina.21. Lavar em água corrente.22. Azular em água amoniacal.23. Desidratar, diafanizar e montar em meio de montagem.

A técnica de imuno-histoquímica é um processo sensível de detecção molecular (antígenos), sendo de grande valor nos diagnóstico anatomopatológicos. O mecanismo básico é o reconhecimento do antíge-no por um anticorpo primário associado a diversos tipos de visualização

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a

b

dc

Figura 26 - Positividade marrom em células malignas da mama, em pâncreas e linfonodo.a - Positividade em membrana (C-erb, 100x).b - Positividade nuclear (RE, 100x).c - Positividade citoplasmática. (CK-7, 100x).d - Positividade em membrana de linfócitos (CD3, 100x).

7 Imuno-histoquímica • • • • • • • • • • • • • • • • •

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8 Descalcificação

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Tecidos ósseos ou qualquer outro tecido contendo sais de cálcio requerem a remoção destes sais para posteriormente serem submetidos à técnica histológica. Esses fragmentos, após recorte com serra, são colocados em contato com as soluções descalcificadoras para a retirada dos sais de cálcio. Durante muito tempo, o ácido nítrico a 7,5% em solução aquosa foi considerado como uma boa solução descalcificadora. Esta solução tem o inconveniente de demorar a retirar o cálcio do material (dois, três, quatro ou mais dias), o que acaba destruindo o tecido mole adjacente. Hoje utiliza-se solução descalcificadora à base de EDTA, que permite maior rapidez, além de preservar o tecido adjacente. Para descalcificar biópsia de medula óssea, que contém espículas ósseas, ainda utiliza-se o ácido nítrico, porém a 2%. As biópsias já fixadas são colocadas na solução descalcificadora, onde permanecem durante o período das 7 horas até 16 horas, quando são retiradas da solução, lavadas por cinco minutos em água corrente e, então, são submetidas a processamento histológico.

8 Descalcificação• • • • • • • • • • • • •

Solução descalcificadora com EDTA

EDTA, tetrassódio Tartarato de sódio e potássio Tartarato de sódioÁcido clorídrico PAÁgua destilada

0,7 g8,0 g

0,14 g120 ml900 ml

2 ml98 ml

Ácido nítrico PA Água destilada

Solução ácido nítrico 2% (medula óssea)

Ácido nítrico PA Água destilada

7,5 ml92,5 ml

Solução ácido nítrico 7,5% (tecido ósseo)

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9 Protocolos especiais

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A amostra recebida deve ser medida, embrulhada e acondicionada em cassete plástico para seguir processamento histológico:

O fragmento deve ser incluído e cortado, sendo que devem ser obtidas dez lâminas sequenciais com dois cortes de 2 micras em cada lâmina.

• As lâminas de números 1 e 10 são coradas por HE.• As lâminas de números 2,5 e 9 são coradas pelo tricrômico de Masson. • As lâminas de números 3, 6 e 8 são coradas pela técnica de prata metenamina – PAMS. Ver téc-nica a seguir.• As lâminas de números 4 e 7 são coradas pela técnica de PAS.• Nos casos de transplante renal, deve-se cortar mais duas lâminas para imuno-histoquímica.

A avaliação de alguns tecidos requer uma rotina diferenciada, quer seja na fixação, processamen-to, espessura de corte e colorações específicas. Duas dessas situações são descritas abaixo: biópsia renal e de medula óssea.

9.1 Biópsia renal A amostra a ser examinada normalmente é obtida através de punção com agulha fina, resultando numa amostra de fragmento filiforme e delgado, que deve ser fixada em solução de Bouin alcoólico:

Álcool 80% Ácido pícrico Formol PA 40% Ácido acético

Solução de Bouin 300 ml

2 g120 ml

30 mlConservar a mistura em geladeira.

Solução15 min 15 min 15 min 15 min 15 min15 min30 min30 min

Álcool 100° Álcool 100° Álcool 100° Álcool 100°XilolXilolParafina 1 (56° C - 58° C) na estufa Parafina 2 (56° C - 58° C) na estufa

9 Protocolos Especiais• • • • • • • • • • • • • • • • • •

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80


Solução de ácido periódico 0,5%Ácido periódicoÁgua destilada

0,5 g 100 ml

Solução de ácido crômico 5%Ácido crômicoÁgua destilada

0,5 g 100 ml

Solução de bissulfito de sódio 1%Bissufito de sódioÁgua destilada

1 g100 ml

Procedimento• Antes de iniciar a coloração, preparar a solução impregnadora de prata metanamina. • Colocar esta solução na estufa a 56° C para que, na hora do uso, ela esteja quente.• Desparafinar e hidratar as lâminas até a água corrente.• Colocar o ácido periódico a 1% sobre a lâmina por 15 minutos.• Lavar rapidamente em água corrente.• Imergir as lâminas em ácido crômico 5% por cinco minutos.• Lavar rapidamente em água corrente.• Colocar bissulfito de sódio 1% sobre a lâmina por cinco minutos.• Lavar em água corrente por dez minutos. • Passar por 6 trocas de água destilada.• Impregnar na solução previamente preparada (item 1) por aproximadamente 30 minutos. Os cortes devem ficar impregnados com coloração acastanhada.• Lavar em água destilada.• Imergir em solução de cloreto de ouro 0,1% por três a cinco minutos.• Lavar em água destilada.• Imergir em solução de tiossulfato de sódio 2% por cinco minutos.• Lavar em água destilada.• Corar em hematoxilina de Harris por um minuto.• Lavar em água corrente.• Corar com eosina por um minuto.• Desidratar, diafanizar e montar.

Obs.: A coloração pela hematoxilina e eosina é opcional.

ResultadosMembranas de túbulos e glomérulos corados em negro.

Método do ácido periódico prata metenamina de Gomori (PAMS)

Solução de metanamina 3%Hexametyleno tetraminaÁgua destilada

3 g100 ml

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Solução de Bórax 5%Bórax ou ácido bóricoÁgua destilada

5 g 100 ml


5 g 100 ml

Solução de cloreto de ouro 0,1%Cloreto de ouroÁgua destilada

0,1 g 100 ml


2 g 100 ml

Figura 27 - Colorações básicas na rotina de pato-logia renal. a - Córtex renal corado pela HE (100x).b - Córtex renal corado pelo tricrômico de Mas-son (100x).c - Glomérulos e túbulos renais impregnados com prata (400x).d - Imuno-histoquímica positiva em capilares pe-ritubulares e glomérulos. (C4d,100x).

Solução de prata impregnadoraSolução de metanamina 3%Solução de nitrato de prata

50 ml2,5 ml

Misturar e jogar fora 2,5 ml desta solução. Acrescentar 6 ml de solução de bórax 5%.

a b

dc

9 Protocolos Especiais• • • • • • • • • • • • • • • • • •

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Medula óssea As biópsias de medula óssea obtidas por punção, após fixadas, sofrem processo de descalcificação utilizando acido nítrico a 2% por oito horas. Seguem para o processamento histológico como biópsia pe-quena. Após inclusão, obtêm-se cortes para HE com espessura de 2 micras e lâminas para colorações de Perl’s e retículo com espessura de 4 micras.

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10 Técnicas citológicas

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Este caderno prioriza as técnicas histológicas, porém não pode deixar de mencionar noções bási-cas de citologia, as quais estão descritas com detalhes nos Cadernos de Referência 1 e 2, específicos da citologia.

10.1 Processamento de Líquidos e Secreções O material a ser submetido a estudo citológico deve ser enviado ao laboratório imediatamente após a coleta, sem fixador ou conservante, devidamente identificado e acompanhado de uma requisição contendo a história clínica do paciente. Estas amostras a serem processadas podem ser: lavados vesicais, brônquicos, líquidos ascítico e pleural, escarro, urina e outros.

10.1.1 Escarro A parte mais representativa (área espessa, sanguinolenta etc.) é colocada sobre uma lâmina de vidro e em seguida coberta com outra lâmina, que, após compressão e desligamento, transforma-se em esfregaços, que devem ser imediatamente fixados em álcool comercial (95%). Caso a amostra seja abun-dante, deverá ser fixada, submetida a processamento histológico, o qual poderá ser utilizado para proce-dimentos especiais (colorações especiais, imunoperoxidase, biologia molecular). Esses esfregaços devem ser corados pelos métodos de HE e H. Shorr.

10.1.2 Líquidos (lavados brônquico, vesical, urina, líquor, líquidos ascíticos e da cavidade toráxica) Estes líquidos são submetidos à centrífuga convencional para que haja concentração de elementos celulares (dez minutos/1.500 rpm), em seguida despreza-se o sobrenadante, e o sedimento é utilizado para confecção de esfregaço, que após fixação imediata é submetido à coloração.

10.2 Processamento deesfregaços/punções aspirativas por agulha fina (PAAF) Estes materiais são resultantes de PAAF de mama, tireoide e outros órgãos sólidos. As amostras são recebidas fixadas ou a seco (sem fixador). Os fixadores mais usados são o álcool 95° e o spray. Obs.: Lâminas fixadas em álcool ou spray podem ser coradas por HE ou H. Shorr. Para a coloração de Giemsa, o esfregaço deve ser seco ao ar livre antes de ser submetido à coloração.

Fixação em citologia

• Fixadores de spray - Que fixam e formam película protetora, a exemplo do polietilenoglicol dissolvido em álcool.

• Fixadores líquidos - O álcool comercial (92% a 95%) é considerado fixador citológico uni-versal. Quanto mais curto for o período em segundos entre a confecção do esfregaço e a fixação, melhor será a qualidade deste.

10 Técnicas Citológicas• • • • • • • • • • • • • • • • • • •

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Técnica de coloração diferencial de Shorr As lâminas fixadas em spray devem ser mergulhadas por dez minutos em álcool 80° para a reti-rada do fixador. Agora estas lâminas, juntamente com as recebidas em álcool 95°, passam pelo seguinte processo de coloração:

Álcool 80° Álcool 70°Água correnteCorar pela hematoxilinaLavar em água corrente Álcool 95°Corante ShorrÁlcool 95°1º álcool 100°2º álcool 100°3º álcool 100°4º álcool 100°1º xilol2º xilolMontar

10 mergulhadas 10 mergulhadas 10 mergulhadas

1 min10 min

3 min6 min

Para retirar o excesso1 min1 min1 min1 min1 min

1 min - montar com resina e lamínula

Lâminas fixadas em álcool 95°Álcool 80° Álcool 70°Lavar em água correnteCorar pela hematoxilina de HarrisLavar em água corrente Álcool 95°EosinafloxinaÁlcool 95°1º álcool absoluto 2º álcool absoluto 3º álcool absoluto4º álcool absoluto1º xilol2º xilolMontar com resína e lamínula

1 min1 min

1 min10 min

1 min1 min1 min1 min1 min1 min1 min1 min1 min

Técnica

Coloração de H.E. (punções e líquidos)

+-+-+-

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Caso se prefira uma coloração mais intensa, aumenta-se a concentração dos corantes, conforme abaixo.

Giemsa Quando solicitado pelo patologista ou quando o laboratório recebe esfregaços secos sem fixação, o ideal é recorrer à coloração de Giemsa, que é específica para esfregaços secos, como segue abaixo:

• As lâminas recebidas a seco são fixadas em álcool metílico por três minutos.• Preparar solução uso: diluir a solução-mãe de Giemsa na proporção de 2 ml do corante para 30 ml de água destilada.• Cobrir os esfregaços com solução uso do corante Giemsa e deixar corando por 30 minutos.• Lavar em água corrente por dez minutos.• Secar as lâminas ao ar livre ou estufa 60 °C.• Após secas, passar as lâminas discretamente no xilol.• Montar com resina e lamínula.

Corante Shorr O corante Shorr é encontrado à venda pronto para uso, porém muitos serviços dão a opção de pre-parar seu corante, de acordo com a receita abaixo.

10 Técnicas Citológicas• • • • • • • • • • • • • • • • • • •

Solução tricrômico de Shorr0,3 g

0,075 g0,075 g0,025 g

0,25 g0,25 g

100 ml1 ml

Biebrich ScarlatAzul de anilinaOrange GFast Green FCFÁcido fosfotúngsticoÁcido fosfomolíbdicoÁlcool 50° CÁcido Acético Glacial

Solução1 g

0,25 g0,075 g

0,1 g0,5 g0,5 g

100 ml2 ml

Biebrich ScarlatOrange GFast Green FCCAzul de anilinaÁcido fosfotúngsticoÁcido fosfomolíbdicoÁlcool 50º CÁcido acético glacial

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Preparo do corante giemsa

5 g330 ml330 ml

Corante GiemsaGlicerina (não pode ser bidestilada)Álcool metílico (Metanol)

Solução estoque

• Deixar o corante Giemsa dissolver na glicerina em estufa a 60° C por 12 horas.• Esfriar em temperatura ambiente.• Deixar descansar por uma semana e mexer com bastão de vidro todos os dias.• Adicionar o álcool metílico após uma semana de descanso.• Filtrar (o processo de filtragem é demorado devido à viscosidade da glicerina).• Armazenar em frasco escuro.

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Referências

MICHALANY J. Técnica Histológica em Anatomia Patológica. 3. ed. São Paulo: Editora Michalany, 1998.

PROPHET, E. B.; Mills B. et al. Laboratory Methods In Histotechno-Armed Forces, Institute of Pathology. Washington, Estados Unidos: American Registry of Pathology, 1992.

BANCROFT J. D.; STEVENS A. Theory and Practice of Histological Techniques. 4. ed. Nova York, Estados Unidos: Churchill Livingstone, 1996.

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Apêndice

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Perfil dos autores

Abel Dorigan Neto Biólogo; diretor técnico da Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (HCFMRP); diretor técnico do Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (FMRP-USP).

Gyl Eanes Barros Silva Médico, doutor em patologia pela Universidade de São Paulo (USP-SP); professor doutor da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo-Ribeirão Preto (FMUSP-RP).

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Documents

Técnico em Citopatologia - Caderno de referência 3: técnicas de