UNIVERSIDADE DE BRASLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA
VETERINRIA - FAV
TERAPIA FOTODINMICA SOBRE CARCINOMA MAMRIO DE CADELA CULTIVADO
IN VITRO
MARTHA DE SOUZA TEIXEIRA DA ROCHA
DISSERTAO DE MESTRADO EM SADE ANIMAL
BRASLIA/DF MARO/2010
ii
UNIVERSIDADE DE BRASLIA
TERAPIA FOTODINMICA SOBRE CARCINOMA MAMRIO DE CADELA CULTIVADO
IN VITRO
MARTHA DE SOUZA TEIXEIRA DA ROCHA
ORIENTADOR: PAULA DINIZ GALERA
CO-ORIENTADOR: RICARDO BENTES DE AZEVEDO
DISSERTAO DE MESTRADO EM SADE ANIMAL
PUBLICAO: 020/2010
BRASLIA/DF MARO/2010
iii
iv
REFERNCIA BIBLIOGRFICA E CATALOGAO ROCHA, M.S.T.. Terapia
fotodinmica sobre carcinoma mamrio de cadela cultivado in vitro.
Braslia:Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinria, Universidade
de Braslia, 2010, 85 p. Dissertao de Mestrado.
FICHA CATALOGRFICA 020/2010
Documento formal, autorizando reproduo desta dissertao de
mestrado para emprstimo ou comercializao, exclusivamente para fins
acadmicos, foi passado pelo autor Universidade de Braslia e acha-se
arquivado na Secretaria do Programa. O autor reserva para si os
outros direitos autorais, de publicao. Nenhuma parte desta
dissertao de mestrado pode ser reproduzida sem a autorizao por
escrito do autor. Citaes so estimuladas, desde que citada a
fonte.
Rocha, Martha de Souza Teixeira da
Terapia fotodinmica sobre carcinoma mamrio de cadela cultivado
in vitro / Martha de Souza Teixeira da Rocha orientao de Paula
Diniz Galera, co-orientao de Ricardo Bentes de Azevedo Braslia,
2010. 85p.: il.
Dissertao de Mestrado (M) Universidade de Braslia/Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinria, 2010. 1.terapia fotodinmica,
2.carcinoma mamrio, 3.cadela, 4. alumino-cloro ftalocianina
lipossomal. I. Rocha, M.S.T.. II. Terapia fotodinmica sobre
carcinoma mamrio de cadela cultivado in vitro
CDD ou CDU Agris / FAO
v
DEDICATRIA
A Deus, meu rochedo, minha salvao e minha fortaleza (Salmo
61.3)
Aos meus amados pais Geraldo Rosalvo e Maria Virgnia e s minhas
irms Mariana
e Maria Izabel pelo amor, amizade, pacincia e confiana. Sem o
apoio incondicional
de vocs, certamente no chegaria at aqui.
Amo vocs
vi
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Aos Profs. Drs. Carolina Madeira Lucci e Ricardo Bentes de
Azevedo, agradeo pela
oportunidade dada, sem a qual nada disso seria possvel. Obrigada
por ajudar no
somente a mim como tambm, a todos que lhes procuram na busca
pelo
conhecimento. Obrigada por acreditarem em seus orientados,
co-orientados e
discentes, pelos valiosos ensinamentos e valores morais
adquiridos e pelo
companheirismo principalmente nas horas em que nem eu acreditava
mais em mim.
Minha admirao e respeito pelos mestres, profissionais, lderes e
seres humanos.
vii
AGRADECIMENTOS
minha orientadora, Prof Dra. Paula Diniz Galera, pela orientao
concedida, pela
confiana, pelos vrios anos de convivncia e oportunidades. Voc um
exemplo
para mim.
Ao Prof.Dr. Carlos Roberto Daleck e Prof Dra. Mnica Pereira
Garcia pelo aceite do
convite para compor a minha banca examinadora. Fico honrada com
a presena,
correes e consideraes dos docentes para a melhoria do presente
trabalho.
Ao Prof. Dr. Antnio Cludio Tedesco e equipe pela disponibilidade
de envio e
formulao do agente fotossensibilizador.
Ao Prof. Sebastio Willian da Silva pela generosidade de realizar
as avaliaes do
LED e pacincia em ensinar a uma mdica veterinria importantes
conceitos da
Fsica.
Aos Profs. Msc, Christine Souza Martins, Prof. Dr. Richard da
Rocha Filgueiras e
Prof. Dr. Daniel Gerardi pelos ensinamentos e ajuda nas horas
mais difceis. Mais
que grandes mestres, vocs foram grandes amigos. A admirao e o
respeito sero
eternos.
Ao Prof Dr Mrcio Botelho de Castro, pela ajuda sincera e
desinteressada nas
anlises adicionais ao meu projeto. Sei que posso contar a
qualquer hora seja com o
docente ou com o amigo. Conhecer essa pessoa to ntegra e de bom
corao foi
um dos grandes presentes que ganhei no mestrado.
Ao Prof. Ricardo Titze pela disponibilidade do laboratrio do
MMB.
A todos, sem exceo, funcionrios, mdicos veterinrios e residentes
do Hospital
Veterinrio da UnB, pelo apoio, pacincia, solidariedade, e
compreenso nos
momentos de ausncia. Obrigada especialmente a Equipe da Clnica
Cirrgica e aos
viii
funcionrios Alex, Cris, Hugo, Joacir, Monique, Nazar e Wilson
pela ajuda nos
horrios mais imprevisveis.
A equipe do laboratrio de Morfologia e Morfognese da UnB, em
especial a Zlia e
aos pesquisadores Camila, Carol, Cladio, Grazielli, Jaqueline,
Joo, J, Larissa,
Leandro, Luis, Mait, Natlia, Patricia, Victoria, por me
receberem de braos abertos
e pelas inmeras ajudas no decorrer de meu mestrado. A cada dia
admiro mais a
capacidade cientfica de cada um de vocs, contem sempre
comigo.
A Universidade de Braslia por ter me acolhido desde a graduao.
Minha histria
profissional sempre estar vinculada a est instituio to
querida.
Aos rgos de fomento: CNPq, CAPES, Finatec, pelo auxlio
financeiro.
A Ps Graduao Sade Animal - FAV, e especial ao coordenador Prof.
Dr Vtor
Salvador Pico e aos funcionrios Kelly Cristina e Deuzidete pelo
empenho de vocs
sempre quando me foi necessrio.
A toda equipe da Microbiologia Veterinria, Patologia Veterinria
e Patologia Clnica,
pela boa vontade em todos os momentos.
As mdicas-veterinrias: Anah, Cris, Karla, Marta, Mirna e
Vanessa. No h
palavras para agradecer tanto esforo, tanta amizade e
desprendimento. Nesta
trajetria muitas vezes rdua, vocs foram sensacionais.
Ao Laboratrio de Reproduo Animal e as mestrandas Luciana e
Renata, amigas
adquiridas no laboratrio para toda vida. Agradeo pelo
companheirismo, seja nas
horas de alegria quando as coisas davam certo ou nas horas de
tristezas
decorrentes dos obstculos enfrentados. Vocs foram fundamentais
para meu
equilbrio.
ix
As Mdicas veterinrias, Alexandra, Bruna, Catarina, Etiele e
Samara pela valiosa
ajuda nos atendimentos e ateno aos meus pacientes to especiais
da oncologia.
Sem a ajuda de vocs, jamais conseguiria tocar meus projetos.
Ao amigo e mdico veterinrio Mrio Falco, pelos anos de amizade. A
cada dia lhe
admiro mais como ser humano e profissional. Estarei sempre
presente quando
precisar.
A Maria Fernanda, filha, mdica veterinria e minha amiga, pelas
palavras corretas
nas horas mais incertas e pelas vrias ajudas no decorrer deste
trabalho. Obrigada
por me ouvir, e por sempre estar disposta a me ajudar.
A Ana Brbara, mdica veterinria pelo carinho, amizade, cooperao e
fora no
Hvetinho. Obrigada pelo ombro amigo.
A minha melhor amiga, minha irm Luiza Quinto pela presena
constante mesmo
estando fisicamente distante e pela amizade verdadeira. Obrigada
por sempre estar
ao meu lado nos momentos mais importantes, seja torcendo pelo
meu sucesso, pela
minha felicidade, seja me protegendo, me consolando ou me
aconselhando. Sua
amizade essencial em minha vida. Como sinto sua falta, mas agora
falta bem
pouquinho... Volta logo!!!
Aos meus filhos: Brisa, Cocada, Nina e Nikos, pelo amor
incondicional. Desculpem
pela falta de tempo principalmente nesta reta final.
Aos meus queridos pacientes e seus respectivos proprietrios.
Todo esforo,
dedicao, estudos por amor e dedicao a vocs. Obrigada pela
confiana em
meu trabalho e pela pacincia nos momentos em que no pude estar
presente.
Saudades eternas a Sacha, Layka, Pagu, Kay, Fufu e Brbara
Carolina.
Ao amigo e mdico veterinrio Levi Fiza, voc faz parte de tudo
isso... Saudade
eterna...
x
A vida valor absoluto. No existe vida menor ou maior, inferior
ou
superior. Engana-se quem mata ou subjuga um animal por
julg-lo
inferior. Diante da conscincia que abriga a essncia da vida, o
crime
o mesmo.
(Olympia Salete)
xi
SUMRIO Pgina LISTA DE TABELAS Xii
LISTA DE FIGURAS xiii
LISTA DE SMBOLOS E ABREVIAES xv
RESUMO xvi
ABSTRACT xvii
CAPTULO I 01
Introduo 01
Referencial Terico 03
Objetivos 15
Referncias 16
CAPTULO II 27
Introduo 27
Material e Mtodos 29
Resultados 44
Discusso 54
Concluses 59
Referncias 60
CAPTULO III 67
Consideraes Finais 67
ANEXO 68
xii
LISTA DE QUADROS
Pgina
QUADRO 1
Classificao Histolgica dos Neoplasmas Mamrios em Cadelas segundo
a Organizao Mundial de Sade (MISDORP et al., 1999).
04
QUADRO 2
Descrio da constituio de cada grupo experimental. As demarcaes
em X referem-se aplicao do item em questo
48
xiii
LISTA DE FIGURAS
Pgina FIGURA 1 Ilustrao grfica dos mecanismos fotoqumicos
presentes na TFD.
Observa-se transferncia de energia e a produo de radicais livres
em diferentes tipos de reaes, aps a excitao do frmaco FS devido
irradiao com LED
11
FIGURA 2 Imagem fotogrfica do aparelho LED prottipo utilizado
nesta dissertao, em funcionamento durante TFD. Note a amostra
protegida da luz ambiente
33
FIGURA 3 Imagem computadorizada da faixa obtida atravs da
cromatografia de camada delgada (CCD) para identificao da faixa de
comprimento de onda do LED. Observa-se em 580nm percepo do espectro
(luz), em 660nm obtm-se seu maior valor e em 700nm termina seu
espectro
33
FIGURA 4 Representao esquemtica elucidando as etapas envolvidas
da colheita da amostra at o estabelecimento das culturas primrias.
A) cadeia mamria unilateral removida cirurgicamente do paciente
contendo massas tumorais em glndula mamria abdominal cranial e
inguinal; B) exciso do fragmento tumoral para colheita da amostra;
C) direse do material; D e E) imediatos ciclos de lavagens da
amostra e envio para o laboratrio atravs do meio de transporte; F)
fracionamento da amostra coletada e G) cultivo produzido a partir
dos fragmentos do tumor.
36
FIGURA 5 Representao do preparo das placas de 24 poos para
realizao do experimento com TFD. A) garrafa de cultivo contendo
clulas aderidas na superfcie e confluentes; B) aps adio da soluo de
tripsina-EDTA e consequente destacamento das clulas aderidas ao
fundo do frasco de cultura; C) e D) ressuspeso do meio contendo
clulas soltas e envio para centruga a 750xg durante 05 minutos para
formao do pellet. E) descarte do sobrenadante e ressuspenso do
pellete em 1mL de meio e F) transferncia de 1x105 clulas em cada
poo para aps 24 horas de estufa realizao do experimento.
38
FIGURA 6 Representao esquemtica dos grupos experimentais e
anlises realizadas.
40
FIGURA 7 Viabilidade mdia ( DP) das clulas aps 24 horas do
experimento, avaliadas pelo ensaio com corante Azul Tripan. (ab)
Barras com diferentes letras indicam diferena significativa entre
os tratamentos (P
xiv
alaranjado de acridina e brometo de etdeo, mostrando clulas
viveis (A), em apoptose tardia (B), apoptose (C), e necrose
(D).
48
FIGURA 10 Porcentagem mdia ( DP) de clulas vivas, com apoptose e
necrose aps 24 horas do experimento atravs do mtodo de colorao com
alaranjado de acridina e brometo de etdio. (a,b) Barras com
diferentes letras indicam diferena significativa entre os
tratamentos (P
xv
LISTA DE SMBOLOS E ABREVIAES
ALA cido Alfa-Linolico AlClFt Alumnio-Cloro-Ftalocianina AlPCS4
Alumnio-Ftalocianina Tetrasulfonada ANOVA Anlise de Varincia B16F10
Murine Melanoma Cells CCD Cromatografia de Cmara Delgada CHO-KI
Growth in Chinese Hamster Ovary Cells.
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMSO Dimetilsulfxido DNA cido Desoxiribonuclico
DP Desvio Padro Mdio EDTA cido Etilenodiaminotetractico EROS
Espcie Reativa de Oxignio. FAV Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinria FS Fotossensibilizador HEp - 2 Human Epidermoid Cancer
Cells IB Instituto de Cincias Biolgicas INCA Instituto Nacional do
Cncer LED Laser Emissor de Diodo MCF-7c3 Human Breast Cancer Cell
Line MTT (brometo de 3(4,5
dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazlio) NHIK Human Cervix
Carcinoma
OMS Organizao Mundial da Sade OSCC Oral Squamous Cells Carcinoma
PBS Soluo de Tampo Fosfato PVPI Polivinilpirrolidona TFD Terapia
Fotodinmica TNM Tumor/NduloLinfonodo/Metstase UnB Universidade de
Braslia ZnPc Zinco-ftalocianina
xvi
RESUMO
O cncer de mama representa o neoplasma maligno mais comum
nas
cadelas e o tratamento atualmente consiste na sua exciso,
associado ou no
quimioterapia adjuvante que pode ser eficaz ou no.
Conseqentemente crescente
a busca por alternativas teraputicas que cessem ou retardem o
crescimento
tumoral. Uma terapia promissora, difundida para o tratamento de
alguns tipos de a
terapia fotodinmica que se baseia na combinao de um frmaco
fotossensibilizante que quando ativado provoca morte celular. O
objetivo do trabalho
foi avaliar a aplicao e citotoxicidade da Terapia Fotofinmica
mediada pelo
Alumnio-Cloro-Ftalocianina em formulao liposomal (TFD-AlClFt) em
um sistema
de tratamento experimental in vitro de amostras tumorais
extradas de carcinoma
mamrio de cadela submetida ao tratamento cirrgico tradicional.
Para isso foram
formados 04 grupos experimentais: grupo controle, LED, frmaco
fotossensibilizador
AlClFt 2,5M e TFD. O grupo O controle (1) foi aquele em que as
clulas no foram
submetidas a nenhum tratamento; O grupo LED (2) recebeu iluminao
com a fonte
de luz LED na intensidade 10 J/cm2 e comprimento de onda 660nm.
O grupo AlClFt
(3) apenas administrao do frmaco AlClFt e grupo TFD (4), que
consistiu na
terapia fotodinmica. Foram analisados viabilidade celular,
citotoxicidade, via de
morte celular e possveis alteraes morfolgicas atravs dos ensaios
ciitotxicos;
azul tripan, dupla colorao de alaranjado de acridina e brometo
de etdio, MTT e
avaliaes morfolgicas que evidenciaram efetividade da TFD nas
condies
experimentais deste trabalho.
.
1.terapia fotodinmica, 2.carcinoma mamrio, 3.cadela, 4.
alumino-cloro
ftalocianina lipossomal
xvii
ABSTRACT
Breast cancer is the most common malignant neoplasm in dogs and
treatment
currently consists of surgical excision, with or without
adjuvant chemotherapy.
However, the search for alternative therapies to stop completely
or to slow down
tumor growth is increasing. Photodynamic therapy (PDT) is based
on the
combination of a photosensitizing agent that once activated
causes cell death. The
objective of this study was to evaluate PDT mediated by
Aluminum-Chlorine-
Phtalocyanine (AlClPc) in an experimental in vitro treatment
system of tumor
samples taken from mammary carcinoma of dogs subjected to
surgical excision . The
primary cell culture was divided into four experimental groups:
control, LED,
photosensitizer AlClPc 2.5 M and PDT. The control group (1)
represented the cells
which had not undergone any treatment, the LED group (2) was
exposed to a LED
light source of 10 J/cm2 intensity and wavelength of 660nm. The
AlClPc group (3)
was treated with only the photosensitizer agent and the PDT
group (4), was the one
that undergone the photodynamic therapy. Cell viability,
cytotoxicity and cell death
pathways were evaluated through the cytotoxicity assays: trypan
blue, double
staining of acridine orange and ethidium bromide and MTT.
Cultures were also
subjected to morphological evaluation by optic microscopy. It
can be observed from
the results that the amount of cell death was significantly
higher (P
1
CAPTULO I
INTRODUO
O cncer hoje um dos principais problemas de sade pblica
mundial.
Dados epidemiolgicos apontam as neoplasias malignas como
terceira maior causa
de morte do mundo, sendo a segunda entre as doenas. Estes dados
promoveram
uma espcie de corrida mundial para a cura do cncer. Grande parte
dos atuais
conhecimentos em biologia celular foi desenvolvida a partir de
projetos com
interesse em teraputica para os tumores malignos (INCA,
2008).
O cncer uma terminologia mundialmente conhecida para uma srie
de
doenas que possuem em comum a hiperproliferao de populaes
celulares
especficas, com potencial de invaso de tecidos prximos e/ou
distantes. Em
termos patolgicos, o cncer classificado como uma neoplasia
maligna, ou seja,
o desenvolvimento de novos clones celulares com atividade
proliferativa superior s
das clulas vizinhas e com carter de invaso e destruio tecidual
adjacente
acentuada (KNOWLES & SELBY, 2005).
Conforme tambm observado na medicina, a oncologia hoje uma
das
especialidades que mais evolui dentro da medicina veterinria de
animais de
companhia (WHITROW, 2006). Dentro da oncologia, os tumores
mamrios so, sem
dvida, os mais estudados (BRODEY, et al., 1983), pois
representam os tumores
malignos mais comuns em cadelas e correspondem a 25-50% dentre
todas as
neoplasias (JONES et al., 2000). Nos ces observa-se uma
incidncia
2
aproximadamente trs vezes maior que a do cncer de mama nas
mulheres
(RUTTERMAN et al., 2001). O diagnstico precoce favorece o
tratamento, que
atualmente baseia-se na sua exciso, associado ou no
quimioterapia adjuvante
(MOULTON 1990; CEBALLOS et al, 1993; SILVA, 2000, OGILVIE &
MOORE, 2001).
Uma alternativa para tratamento de diferentes tipos de cncer a
Terapia
Fotodinmica (TFD), que pode ser substituta ou adjunta para a
cirurgia, radioterapia
e/ou quimioterapia. A grande vantagem da utilizao da TFD a sua
alta
seletividade na eliminao dos tecidos neoplsicos (DANIELL &
HILL, 1991;
RUSLANDER et al., 1997; MERKEL & BIEL, 2001), tornando-se
opo mais recente
e promissora de tratamento clnico contra o cncer (DANIELL &
HILL, 1991;
RUSLANDER et al., 1997; MERKEL & BIEL, 2001). O presente
estudo pretende
avanar na avaliao do uso da TFD em um sistema de tratamento
experimental in
vitro de amostras tumorais extradas de carcinoma mamrio de
cadela submetida ao
tratamento cirrgico tradicional.
3
REFERENCIAL TERICO
1. Cncer de Mama
A evoluo da Medicina Veterinria tem contribudo para a maior
longevidade
dos animais. Nutrio balanceada, preveno a doenas, diagnsticos
precisos e
tratamentos adequados permitem uma sobrevivncia maior e uma
melhor qualidade
de vida. Conseqentemente, doenas que geralmente acometem animais
idosos
tornam-se mais freqentes. o caso, por exemplo, dos neoplasmas
(OGILVIE &
MOORE, 2001; LANA et al., 2007; MONDIANO & BREEN, 2007).
O aprofundamento dos estudos tem demonstrado que dentre as
neoplasias
que acometem as cadelas, as neoplasias da glndula mamria merecem
destaque,
sobretudo por sua alta incidncia e pela semelhana, em diversos
aspectos, aos
tumores de mama em mulheres constituindo assim, modelos
apropriados e vlidos
ao estudo da biologia tumoral, carcinognese (MOTTOLLESE et al.,
1994; ZUCCARI
et al., 2001),
relevante citar que dada a apresentao histopatolgica e
comportamento
biolgico similar ao da espcie humana, o cncer de mama em cadelas
torna-se um
molde experimental para avaliao de agentes teraputicos
(GILBERTSON et al.,
1983; NERURKAR, 1989; PELETEIRO, 1994; CAVALCANTI & CASSALI,
2006;
TERZIAN et al, 2007).
Os neoplasmas de mama representam 25 a 50% das neoplasias
que
acometem as cadelas, e quando se leva em considerao os ces em
geral, as
neoplasias mamrias so menos freqentes apenas que os tumores de
pele
(RUTTEMAN, 1995, JONES et al., 2000; LANA et al., 2007). As raas
apontadas
como de maior ocorrncia de tumor mamrio so Cocker Spaniel,
Poodle, Labrador
e Dachshund, apesar de estudos relatarem o fato de no haver
predisposio racial
(LANA et al., 2007).
As neoplasias mamrias so de grande interesse de patologistas,
devido a
sua complexidade, dificuldade de classificao como, tambm, o
exame
histopatolgico ser o mtodo eletivo para identificar as
caractersticas
4
correlacionadas ao tratamento e ao prognstico clnico do paciente
(LIMA &
MARTINS, 1992; MOTA & OLIVEIRA, 1999; MISDORP, 2002).
Somando-se a outros
fatores, o tratamento cirrgico o de eleio, pois, em princpio,
todos os tumores
devero ser submetidos a exames histolgicos. Mesmo ndulos
pequenos, com
aparncia de benignidade, podem revelar focos de clulas malignas,
e as bipsias
excisionais so essenciais para o diagnstico (MISDORP, 2002). A
classificao dos
neoplasmas mamrios em cadelas segundo a Organizao Mundial da
Sade (OMS
- Misdorp et al., 1999), est disposta no Quadro 1.
Quadro 01 Classificao Histolgica dos Neoplasmas Mamrios em
Cadelas
segundo a Organizao Mundial de Sade (MISDORP et al., 1999).
I - Neoplasmas Malignos
II - Neoplasmas Benignos Carcinoma no-infiltrativo (in situ)
Adenoma Carcinoma Complexo Adenoma Simples Carcinoma Simples
Adenoma Complexo Carcinoma tbulo-paplifero Adenoma Basalide
Carcinoma slido Fibroadenoma Carcinoma anaplsico Baixa celularidade
Tipos especficos de carcinoma Alta celularidade Carcinoma de clulas
fusiformes Tumor misto benigno Carcinoma de clulas escamosas
Papiloma Ductal Carcinoma mucinoso Carcinoma rico em lipdeos
Carcinossarcomas Sarcomas Fibrossarcoma Osteossarcoma Outros tipos
de sarcomas Carcinoma em tumores benignos/ Sarcoma em tumores
benignos
Fonte: Adaptado de Rutterman & Withrow, 2007.
A transformao neoplsica multifatorial (MORRIS & DOBSON,
2001). O
desenvolvimento de neoplasia mamria na cadela dependente, em
grande parte,
de hormnios, como o estrgeno, a progesterona e o hormnio do
crescimento que
influenciam a carcinognese (MORRISON, 1998; FONSECA et al.,
2000; ZUCCARI
et al., 2001). MacEWEN et al. (1982) e Sartin (1992)
identificaram receptores de
estrgenos em 40 a 60% dos casos de cncer de mama em ces. O
estrgeno
estimula o aumento da atividade mittica do epitlio mamrio, o que
eleva o risco de
5
aparecimento do tumor. Porm, por si s ele no desencadeia o
surgimento do
mesmo, mas associado a outros fatores e em fases distintas da
formao do tumor,
pode ter papel determinante, seja na multiplicao ou na
transformao genmica
das clulas (MOULTON, 1990; PELETEIRO, 1994).
A incidncia de tumor de mama de 0,5% com a castrao antes do
primeiro
cio, 8% aps o primeiro ciclo estral e 26% aps dois ou mais
ciclos, at os dois
primeiros anos (OKEEFE. 1997; MORRISSON, 1998). No entanto,
cadelas
submetidas ovariossalpingohisterectomia aps os dois anos e meio
de idade ou
concomitante mastectomia, no so beneficiadas pelos efeitos
profilticos deste
procedimento (PELETEIRO, 1994; YAMAGAMI et al., 1996; MORRISON,
1998;
FONSECA & DALECK, 2000; RUTTEMAN et al., 2001; GALERA et
al., 2002).
importante salientar as caractersticas clnicas e o comportamento
biolgico
de cada neoplasia, pois elas estaro associadas com o prognstico
desfavorvel.
Caractersticas como modo e taxa de crescimento, volume total do
tumor e
envolvimento dos linfonodos regionais e distantes so
fundamentais para determinar
prognstico e possvel tratamento. Conseqentemente, a abordagem
clnica primria
essencial para o correto estadiamento da enfermidade, que no
caso de
neoplasmas mamrios em cadelas deve ser voltado para avaliar a
fase de evoluo
tumoral, bem como as possibilidades de progresso do tumor.
O modo de crescimento de uma neoplasia freqentemente o indicador
da
sua invasividade relativa. Leses expansivas, bem circunscritas
so mais facilmente
excisadas; tumores infiltrativos com ou sem ulcerao ou de
tecidos abaixo da
glndula mamria so mais agressivos, apresentando elevada taxa de
recidiva no
ps-operatrio (LERZIAN, et al., 2007; NELSON & COUTO, 2006).
fundamental,
tambm, anlise dos linfonodos regionais j que tumores com alto
potencial
metasttico possuem prognstico desfavorvel (DALECK et al., 1998;
GALERA et
al., 2002; MORRIS & DOBSON, 2001; QUEIROGA & LOPES,
2002; ZUCARRI et
al., 2005).
Clinicamente os tumores mamrios podem ser nicos ou mltiplos.
Cerca de
65 a 70% deles acomete as glndulas inguinais e as abdominais
caudais,
provavelmente em decorrncia do maior volume de tecido mamrio
(RUTTEMAN et
al., 2001).
6
Distintos procedimentos cirrgicos so empregados na conduta
teraputica. A
mastectomia regional baseia-se na drenagem venosa e linftica do
tecido mamrio.
H conexo entre as glndulas torcicas craniais e caudais, e entre
as abdominais
caudais e as inguinais. As glndulas torcicas craniais e caudais
e a abdominal
cranial, e eventualmente a abdominal caudal, drenam para o
linfonodo axilar. O
linfonodo inguinal superficial drena as glndulas abdominais
craniais e caudais e as
inguinais (ALLEN et al., 1986; MISDORP, 2002; CARVALHO, 2006).
Considerando-
se as caractersticas anatmicas, recomendada a extrao destas
glndulas em
bloco, incluindo o linfonodo adjacente (RUTTEMAN et al., 2001;
MISDORP, 2002;).
A exciso cirrgica completa do tumor, com margem de segurana,
o
tratamento de eleio, conferindo maior sobrevida s cadelas com
cncer de mama
(BIRCHARD, 1995 apud DE NARDI, 2007), exceo dos tumores
inoperveis, a
exemplo dos carcinomas inflamatrios e as metstases para rgos
distantes
(MISDORP, 2002). A escolha da tcnica cirrgica mais adequada
determinada
pelo tamanho, localizao e consistncia tumorais, grau de
infiltrao e nmero de
tumores, achados radiogrficos de trax, e comprometimento ou no
dos linfonodos
regionais (MISDORP, 2002). A localizao do tumor, considerando-se
a drenagem
linftica das glndulas mamrias, determina a opo da tcnica
cirrgica a ser
adotada (McCAW,1996; MARTINS & FERREIRA, 2003).
Outros tratamentos podem ser associados ao procedimento
operatrio tais
como quimioterapia e radioterapia. A aplicao dos tratamentos
varia de acordo com
o estgio de desenvolvimento e localizao do tumor (McCAW, 1996;
QUEIROGA &
LOPES, 2002; FOSSUM et al., 2005).
A radioterapia um tratamento no-invasivo indicado principalmente
para
pacientes submetidas cirurgia visando evitar a recorrncia do
tumor. Tal terapia
utiliza raios X ou gama com alta energia que direcionada para o
local do
tumor/cirurgia. A energia empregada deve ser suficiente para
causar danos que
garantam a eliminao de todas as clulas tumorais. No entanto,
essa radiao
tambm incide em clulas normais (BUCCI et al., 2005). Os
principais efeitos
colaterais so ressecamento da mucosa oral, hiperemia na rea
tratada e fadiga
aps o tratamento (NIH, 2005). Esta tcnica no difundida na
medicina veterinria
e seus benefcios ainda no foram definidos, de forma que implica
em maiores
7
estudos a cerca de sua eficcia (LANA et al., 2007), sendo
portanto, alvo
experimental at dado momento (ZUCCARI et al, 2001; WHITROW,
2007)
A utilizao de protocolos de quimioterapia adjuvante tem
aumentado nos
ltimos anos, proporcionando aumento na qualidade de vida dos
animais, porm, os
carcinomas so tumores com baixo grau de quimiosensibilidade
(MORRIS &
DOBSON, 2001; RUTTEMAN et al., 2001). A quimioterapia consiste
no uso de
frmacos citotxicos aplicados atravs das vias endovenosa, oral ou
intratumoral e
que atingem preferencialmente clulas com elevadas taxas de
mitose, ou seja, as
clulas cancergenas. No entanto, outras clulas normais do
organismo com
elevadas taxas de mitose tambm podem ser afetadas (FONSECA &
DALECK,
2000; ZUCCARI et al., 2001; WEINBERG, 2006). Os efeitos
colaterais desse
tratamento variam de acordo com o tipo de frmaco utilizado.
Estes efeitos
compreendem a morte de clulas sangneas, alopecia, alteraes
gastrintestinais
(nuseas, vmito e diarria) e perda de apetite (FONSECA &
DALECK, 2000; NIH,
2005). Os frmacos mais empregados no tratamento para cncer de
mama em
cadelas so a doxorrubicina, a ciclofosfamida e o 5-Fluorouracil
(FRIMBERGER &
COTTER, 1995; DALECK et al.,1998; DAGLI, 2002; NOVOSSAD, 2003;
LANORE &
DELPRAT, 2004). As falhas nos protocolos quimioterpicos so
devidas a
resistncia celular aos frmacos, provocada pela presena da
protena
transmembrana glicoprotena-P, produzida pelo gene MDR1
(RODRIGUEZ et al.,
1997; DE NARDI et al., 2007).
2. Terapia Fotodinnima
A terapia fotodinmica (TFD) consiste na administrao por via
tpica ou
sistmica de frmacos fotossensibilizantes (FS), que se
acumulam
preferencialmente nos tecidos neoplsicos e atravs da incorporao
celular da
substncia fotossensibilizadora que ativada por determinada fonte
de luz,
adequado comprimento de onda e oxignio molecular, acarretando
citotoxicidade e
morte celular (DANIELL & HILL, 1991; RUSLANDER et al., 1997;
MACHADO,
2000b; MERKEL & BIEL, 2001; SIMPLISIO, 2002).
Ensaios clnicos consideram que a TFD pode se tornar uma opo
de
tratamento para o cncer (TEDESCO et al., 2003; TEDESCO et al.,
2004, CHEUNG
8
et al., 2005; PARISSE & BUZAID, 2006; LONGO et al., 2009). A
grande vantagem
da utilizao da TFD a sua alta seletividade na eliminao dos
tecidos neoplsicos
(DANIELL & HILL, 1991; RUSLANDER et al., 1997; MERKEL &
BIEL, 2001),
podendo ser associada a terapias tradicionais com produo mnima
de mutilao e
complicaes, se comparada ao tratamento cirrgico tradicional
(DANIELL & HILL,
1991). Tais caractersticas resultam da seletividade da destruio
tecidual da terapia
em decorrncia do controle do local tratado, e sem dano extenso s
estruturas
normais circunjacentes (DANIELL & HILL, 1991).
Os primeiros passos da avaliao do efeito da aplicao da TFD na
medicina
veterinria foram realizados na dcada de 80 para o carcinoma de
clulas
escamosas com as porfirinas, derivados da hematoporfirina,
frmaco
fotossensibilizador de primeira gerao (MERKEL & BIEL, 2001).
Os principais
efeitos colaterais observados era fotossensibilizao tardia e
eritema local.
Em seguida, Peaston et al.,1993, utilizaram a TFD em 18 gatos
com
carcinoma de clulas escamosas, com fotossensibilizador,
tetrasulfonato
fitalocianina de alumnio. Neste estudo, houve xito do tratamento
em mais de 80%
dos pacientes, e os efeitos colaterais restringiram-se formao de
edema e
eritema local. Os mesmos achados foram descritos por LEACH &
PEASTON (1994),
aps utilizao da TFD com mesmo fotossensibilizador, em estudo com
45 gatos
que apresentavam carcinoma de clulas escamosas.
Nos ltimos anos, outros agentes seletivos de ao fotodinmica com
efeitos
colaterais reduzidos foram desenvolvidos, tais como o cido
alfa-linolico (ALA) para
tratamento de carcinoma de clulas escamosas em gatos (STELL et
al, 2001;
LUCROY et al, 2003), os agentes lipossomais e as nanopartculas
(ANIOLA et al,
2003; OLIVEIRA et al, 2006; BARBOSA, 2008).
Tapajs et al (2008) demonstraram que o fotossensibilizador
Alumnio-Cloro-
Ftalocianina apresentou excelentes resultados na aplicao da TFD
em modelos de
cultura de clulas derivadas de Carcinoma Epidermoide Bucal
Humano.
Posteriormente, semelhante protocolo de aplicao da TFD foi
avaliado em
diferentes modelos experimentais para o cncer de boca em
camundongos (LONGO
et al., 2009). Neste estudo, no foram observados efeitos
adversos aos animais
tratados de forma sistmica com o frmaco fotossensibilizador
(LONGO et al., 2009).
9
2.1. Mecanismos da fotossensibilizao
O mecanismo de ao da TFD uma reao fotoqumica promovida pela
irradiao dos FS com fontes de luz em comprimentos de onda
adequados, ou seja,
especficos (RUSLANDER et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2006). A
absoro de ftons
pelo frmaco promove a sua transformao em uma molcula
extremamente
instvel que reagir com o oxignio presente no meio tecidual
formando uma
cascata de espcies reativas de oxignio e conseqentemente gerao
dos efeitos
citotxicos da terapia sobre as clulas alvo (LUKSIENE, 2003;
PERUSSI, 2007).
Durante a terapia fotodinmica, na presena de oxignio encontrado
nas
clulas o fotossensibilizador que se encontra ligado ao tumor
ativado pela luz e
passa do estado fundamental ao estado excitado, denominado
estado singlete. As
molculas excitadas podem retornar ao seu estado fundamental
emitindo energia na
forma de calor ou fluorescncia, por meio da liberao de ftons, ou
progredir na
cadeia de reaes qumicas, passar a outro estado de excitao menos
instvel
denominado de estado triplete. Neste estado, eles podem
interagir diretamente com
substratos biolgicos ou molculas na sua vizinhana por
transferncia de eltrons
ou hidrognio, levando formao de ons perxidos, superxidos e
radicais
hidroxilas, gerando uma cascata de espcies reativas de oxignio
(EROs),
denominada reao do tipo I (DANIELL & HILL, 1991; HENDERSON
&
DOUGHERTY, 1992; LUKISIENE, 2003, PERUSSI, 2007)..
As molculas em estado triplete podem, tambm, transferir sua
energia
diretamente para o oxignio celular e formar o oxignio singlete
altamente reativo e
responsvel pela morte celular, chamada de reao tipo II (DANIELL
& HILL, 1991;
HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; MACHADO, 2000b, LUKISIENE,
2003,
PERUSSI, 2007). Tais reaes so rapidamente descritas na figura
01.
Ambos os caminhos podem levar morte celular e destruio do
tecido
doente (SKIVKA et al., 2004; PERUSSI, 2007; BUCK, 2009). O
oxignio singlete
reage com quase todos os componentes celulares uma vez que os
compostos
orgnicos insaturados so, de forma geral, suscetveis ao do
oxignio reativo.
Como a primeira barreira para esta molcula a membrana celular
que contm
lipdeos insaturados, estes podem ser danificados e tornar a
clula invivel. Os
10
hidroperxidos resultantes podem levar formao de EROS atravs de
reaes
catalticas (CARRE et al., 1999; CASTANO et al., 2006). Uma vez
que a reatividade
das EROS com molculas orgnicas no especfica, qualquer
macromolcula
dentro da clula pode ser um alvo em potencial para terapia
fotodinmica
(DOLMANS et al., 2003). Assim, a multiplicidade de alvos
dificulta o
desenvolvimento de resistncia celular sendo essa, juntamente com
a citotoxicidade,
uma das vantagens da fotossensibilizao (DOLMANS et al., 2003;
FEROLLA, 2007;
PERUSSI, 2007; BUCK, 2009).
Figura 01 Ilustrao grfica dos mecanismos fotoqumicos presentes
na TFD. Observa-se transferncia de energia e a produo de radicais
livres em diferentes tipos de
reaes, aps a excitao do frmaco FS devido irradiao com LED. .
11
As EROs so radicais livres com alta energia que podem reagir com
vrias
biomolculas, acarretando modificaes qumicas que impedem seu
funcionamento
normal. A gerao de uma cascata de espcies reativas aps a aplicao
da TFD
um fator fundamental para a citotoxicidade causada pela terapia
devido a sua alta
capacidade de interaes com diferentes biomolculas (DOLMANS et
al., 2003;
CASTANO et al., 2005; LONGO et al., 2009).
2.2. Fatores envolvidos na fotossensibilizao
A maioria dos fotossensibilizadores retida tanto nos tecidos
normais como
nos neoplsicos (HENDERSON & DOUGHERTY, 1992; SKIVKA et al.,
2004). O
agente fotossensvel, segundo MACHADO (2000b), tende a se
concentrar no tecido
lesionado, mas o mecanismo no est totalmente esclarecido.
Sharman et al, 1999,
Dolmans et al, 2003, descrevem que apesar desta reteno no ser
claramente
elucidada, alguns fatores so incriminados como responsveis. A
permeabilidade da
membrana das clulas neoplsicas encontra-se alterada, as fibras
colgenas que
interagem no tumor so imaturas e semelhantes s observadas em
tecidos
embrionrios e em processo de cicatrizao recente. Essas fibras
imaturas
apresentam grande capacidade de ligao s porfirinas, agente
fotossensibilizador,
constituindo um local para reteno e acmulo do frmaco. Outros
fatores como a
rede linftica pouco desenvolvida, a presena de macrfagos e o
menor pH
intracelular tambm favorecem maior concentrao do frmaco nas
clulas tumorais
(MOAN & PENG, 2003; NOWIS et al, 2005).
Outro importante componente na TFD a fonte de luz (HENDERSON
&
DOUGHERTY, 1992). As fontes de radiao so, em geral, laser ou
laser emissor de
diodo, (MACHADO, 2000a; CARVALHO, 2008). As principais vantagens
do laser
como fonte de luz so a estabilidade, coerncia e previsibilidade
(PARIZE &
BUZAID, 2006); entretanto, este possui um custo elevado
(MACHADO, 2000a).
Conseqentemente, a disponibilidade do laser emissor de diodo
(LED) tornou o valor
das fontes de luz mais acessveis, visto ser um quarto do valor
econmico do laser
12
(DOUGHERTY, et al., 1998; MANG, 2004). O LED, apesar de
apresentar potncia
inferior ao laser, possui comprimento de onda e caractersticas
qumico-fsicas
necessrias para a adequada aplicabilidade da TFD (MACHADO et
al., 2000a;
MANG, 2004. CARVALHO, 2008).
Logo, a eficcia da TFD depende da natureza qumica do
fotossensibilizador,
da adequada concentrao nos tecidos e da localizao celular no
momento da
irradiao, seja atravs do laser ou LED, de radiao luminosa
compatvel com as
caractersticas bioqumicas do fotossensibilizador permitindo que
este seja excitado.
Outros fatores que interferem so o tempo entre a administrao do
FS, das
caractersticas anatmicas do neoplasma ou no caso experimental,
da linhagem
celular tumoral utilizada e da disponibilidade de oxignio
molecular da clula
tumoral durante todo o processo (WHRLE et al., 1998; MACHADO,
2000b;
PERUSSI, 2007)
2.3. Fotossensibilizadores
Conforme elucidado anteriormente, os FSs so os elementos
principais na
execuo da TFD. Estas estruturas realizam a transferncia de
energia luminosa
para gerar reaes que culminam com a formao de uma srie de
espcies
qumicas altamente reativas, que por sua vez promovem a destruio
das clulas-
alvo. Diversos FSs tm sido desenvolvidos e testados clinicamente
para serem
utilizados na TFD. Inicialmente, a literatura classificou os
grupos de FSs em
geraes de frmacos de acordo com o perodo cronolgico de
desenvolvimento
(DOUGHERTY, et al., 1998). Contrrios a classificao cronolgica,
Allison et al.,
(2004) classificaram os FSs de acordo com suas semelhanas
bioqumicas,
classificando-os em famlias de fotossensibilizadores.
A escolha de um FS para a utilizao na TFD envolve uma complexa
anlise
de caractersticas at que se possa determinar qual a melhor opo
para a
execuo da TFD. Dentre os pontos a serem analisados, h as
propriedades
especficas como as caractersticas fotofsicas, a estruturao
qumica, a toxicidade,
a ao mutagnica e a carcinogenicidade dos frmacos (HENDERSON
&
13
DOUGHERTY, 1992). Devem ser avaliadas ainda a seletividade do
frmaco pelas
clulas alvo; possveis afeitos adversos decorrentes de exposio
luz branca,
toxicidade no escuro, via de administrao, custos, solubilidade e
gua ou solvente
incuo, capacidade e tempo de eliminao dos frmacos, comprimento
de onda para
ativao e efetividade clnica (ALLISON et al., 2004; CASTANO et
al., 2005). A
anlise de todos estes fatores muitas vezes se torna complexa,
mas apropriado ter
um fator de efetividade calculado subjetivamente para justificar
a escolha de um FS
entre as vrias opes teraputicas (CASTANO et al., 2006).
MACHADO (2000b) citou que a primeira gerao de agentes
fotossensibilizadores baseia-se em mistura de derivados
porfirnicos. Os frmacos
da segunda gerao, como as ftalocianinas e as clorinas, podem ser
excitados com
radiao de comprimento de ondas maiores, quando o tecido biolgico
tem menor
absoro e a profundidade de penetrao da luz maior, e apresentam
um perodo
de eliminao mais curto. O fotossensibilizador pode ser aplicado
por via
intravenosa ou tpica (MERKEL & BIEL, 2001).
Os fotossensibilizadores mais utilizados so os de primeira
gerao, tal como
o Photofrin (MERKEL & BIEL, 2001). Este foi desenvolvido em
fins da dcada de 80,
sendo o primeiro agente fotossensibilizador a ser autorizado por
rgos
governamentais (MACHADO, 2000b). A medicao ativada com um
comprimento
de onda de 630nm (MERKEL & BIEL, 2001). Entre seus efeitos
colaterais est a
induo de prolongada fotossensibilidade drmica e ocular (MACHADO,
2000b).
Entre as famlias de FSs, as ftalocianinas tm despertado grande
interesse da
comunidade cientfica. Estudos clnicos e pr-clnicos envolvendo
ftalocianinas tm
apresentado resultados promissores para aplicao na TFD. Como
grandes
vantagens, as ftalocianinas so ativadas por luz em comprimentos
de onda elevados
(650-750 nm), o que confere maior poder de penetrao, alm de
apresentarem
baixa toxicidade quando empregada na TFD (ALLISON et al.,
2004).
Outra importante caracterstica desta classe de FS serem
hidrofbicos.
Devido a esta caracterstica qumica, estes frmacos necessitam ser
incorporados a
sistemas de liberao de frmacos especficos para que possam
circular atravs do
plasma sanguneo. Um dos sistemas de liberao descritos para o
carreamento de
frmacos lipossolveis so os lipossomas. Essas estruturas so
pequenas vesculas
formadas por paredes fosfolipdicas contendo um compartimento
aquoso no seu
14
interior. Desta forma, esse sistema pode carrear tanto
estruturas lipoflicas (na
parede) quando hidroflicas (interior) (SIBATA et al., 2004).Alm
da capacidade de
fluir livremente pelo plasma sanguneo, a associao de
ftalocianinas com
lipossomas apresenta outras vantagens, como sua maior captao
pelas clulas
tumorais. A estrutura do lipossomo pode ser modificada pela adio
de algumas
substncias como colesterol. A presena deste lipdio na parede do
lipossoma tende
a aumentar a captao dos frmacos pelos tecidos tumorais. Esse
aumento se
refere ao fato de existir um aumento de receptores de membrana
com afinidade para
colesterol. Esta afinidade qumica permite que haja uma maior
captao de FS pelas
clulas neoplsicas (DOUGHERTY, et al., 1998; OLIVEIRA et al.,
2006; LONGO et
al., 2009). Estudos experimentais (TAPAJS et al., 2008)
demonstraram a alta
efetividade da Alumnio-Cloro-Ftalocianina na destruio de clulas
em cultura
derivadas de Carcinoma Epidermide Bucal Humano. Nesse mesmo
estudo, foi
descrita a baixa citotoxicidade do FS quando administrado s
clulas de cultivo na
ausncia da iluminao com laser. Corroborando com tais achados,
Longo et al.,
(2009) avaliaram a eficincia da TFD mediada por
Alumnio-Cloro-Ftalocianina. em
formulao lipossomal sobre a mesma linhagem celular, como em
modelos
experimentais in vivo, camundongos imunocompetentes (Swiss)
e
imunocomprometidos (nude-Balb/c).com o mesmo neoplasma.
2.4. Morte Celular A terapia fotodinmica pode produzir apoptose
ou necrose, ou uma
combinao dos dois mecanismos (OLEINICK et al., 2002). Apoptose
uma forma
regulada de morte celular que pode ocorrer em eventos
fisiolgicos ou patolgicos
que dependente da expresso intrnseca celular, no qual uma
cascata da
caspases induzida (WISING, et al., 2005). Morfologicamente, os
elementos
cruciais do processo so condensao da cromatina, encolhimento
celular e
produo de corpos apoptticos os quais so engolfados por clulas
circunvizinhas
e ento fagocitados (NOWIS, et al., 2005; OLEINICK et al.,
2002).A morte celular
caracterizada por necrose, em geral, est relacionada presena de
um agente
agressor de alta intensidade. Nessas situaes, os mecanismos
bsicos de defesa e
15
escape celulares da morte so ineficientes devido grande
intensidade do estmulo
agressor como o promovido pela formao de radicais livres aps a
aplicao da
TFD (OLEINICK et al., 2002; RICH et al., 2000). Uma das
caractersticas marcantes
da necrose so as alteraes funcionais em diferentes regies
subcelulares, com
especial ateno s membranas biolgicas que provocam a liberao dos
contedos
celulares e conseqente perda de viabilidade. Associada destruio
das
membranas celulares, ocorre a liberao de fosfolipdios de
membrana e,
conseqentemente, a gerao de intenso processo inflamatrio
decorrente dos
produtos gerados na via da lipooxigenase (RICH et al., 2000).
OBJETIVOS Objetivo Geral
Avaliar o efeito in vitro da Terapia Fotodinmica mediada pelo
Alumnio-
Cloro-Ftalocianina em formulao liposomal (TFD-AlClFt) sobre
culturas primrias
derivadas de carcinoma mamrio de cadelas.
Objetivos Especficos
Obter culturas primrias de carcinoma mamrio de cadela;
Verificar a citotoxicidade provocada AlClFt no escuro e LED, nas
condies
utilizadas no trabalho.
Analisar citotoxicidade, as vias de morte celular e as possveis
alteraes
morfolgicas causadas pelo tratamento com a TFD-AlClFt.
16
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27
CAPTULO II
AVALIAO DA APLICAO DA TERAPIA FOTODINMICA SOBRE CARCINOMA
MAMRIO DE CADELA CULTIVADA IN VITRO.
INTRODUO
Os tratamentos para o cncer atualmente disponveis, apesar de
apresentarem bons efeitos teraputicos, possuem inmeros efeitos
colaterais
adversos. O desenvolvimento de novas terapias que possam ser
utilizadas como
forma de tratamento principal ou como terapia adjuvante
fundamental para o
estabelecimento de protocolos teraputicos mais efetivos contra
as diferentes
modalidades de cncer.
A avaliao de eficincia de um protocolo teraputico para o
tratamento do
cncer extremamente complexa e envolve diversas etapas de avaliao
at que se
comprove a sua efetividade clnica. Ensaios clnicos demonstram
que a TFD um
tratamento interessante para o cncer. Suas principais
caractersticas so de
seletividade obtida pelo acmulo preferencial do
fotossensibilizador na clula
tumoral e a habilidade de reter a ativao deste frmaco atravs da
restrio de
iluminao quela regio especfica (MACHADO, 2000; MERKEL &
BIEL, 2001);.
28
Portanto, comparativamente aos mtodos atuais de tratamento, a
TFD possui a
vantagem de ser mais efetiva e seletiva na destruio das clulas
tumorais,
preservando a integridade das clulas adjacentes normais. Alm
disso, trata-se de
uma modalidade de tratamento minimamente invasiva, podendo ser
aplicada
repetidamente no mesmo local e usada no tratamento de vrios
tipos de cncer,
incluindo aqueles que so resistentes s outras terapias.
importante observar que
a utilizao da quimioterapia, radioterapia ou cirurgia no impedem
a aplicao da
TFD, podendo ser usadas antes ou aps o paciente ser submetido a
TFD
(FEROLLA, 2007; PASCHOAL, 2009).
Os primeiros passos da avaliao do efeito da aplicao da TFD
mediada
pela AlClFt-liposomal foram conduzidos com xito em sistemas de
cultura celular e
em modelos tumorais experimentais em camundongos (TAPAJS et al.,
2008;
LONGO et al., 2009). O presente estudo pretende avanar na
avaliao deste
protocolo teraputico em um sistema de tratamento experimental in
vitro de
amostras tumorais extradas de carcinoma mamrio de cadela
submetida ao
tratamento cirrgico tradicional.
29
MATERIAIS E MTODOS
Esse trabalho, sob o nmero de processo UNBDOC n 36972/2008,
foi
aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa no Uso Animal (CEUA) do
Instituto de
Cincias Biolgicas (IB) da Universidade de Braslia (UnB).
1. MATERIAIS
As solues estoque dos meios, corantes e reagentes foram
preparadas em
PBS, ph=7,4 e mantidas a temperatura ambiente, ou quando
necessrio refrigerado
a 4C e ao abrigo da luz. Todas as solues foram esterilizadas por
filtrao em
membrana de 0,22m imediatamente antes do uso e armazenadas em
frascos de
vidro autoclavados ou aliquotados em micro tubos do tipo
eppendorfs.
1.1. Procedncia das Amostras Neoplsicas
O estudo foi conduzido no Hospital Veterinrio de Pequenos
Animais, no
Laboratrio de Morfologia e Morfognese do Instituto de Cincias
Biolgicas (IB) e
no Laboratrio de Reproduo Animal da Faculdade de Medicina
Veterinria (FAV),
todos pertencente Universidade de Braslia (UnB), Distrito
Federal.
A amostra utilizada foi extrada de um paciente da espcie canina,
raa
pitbull, nove anos de idade, com ndulo de aproximadamente 2,5cm
de dimetro na
glndula mamria inguinal esquerda posteriomente diagnosticado com
carcinoma
complexo de mama moderadamente diferenciado invasor, atravs de
anlise
histopatolgica, proveniente do Servio de Clnica Cirrgica, setor
de oncologia, do
Hospital Veterinrio de Pequenos Animais da UnB. O atendimento, a
avaliao
clnica e pr-operatria do animal, assim como fornecimento de
informaes e
recomendaes necessrias ao proprietrio, foi realizads conforme
rotina hospitalar.
O procedimento cirrgico adotado foi mastectomia radical
unilateral esquerda, de
acordo com o estabelecido na literatura (RUTTEMAN et al., 2001;
MISDORP, 2002).
O proprietrio estava ciente, atravs de autorizao escrita, que
continha descritos
os mecanismos e procedimentos utilizados como tambm, os riscos
inerentes
envolvidos em quaisquer procedimentos cirrgicos e
anestsicos.
30
Vale ressaltar que o animal foi submetido ao procedimento
cirrgico usual e
para o cultivo celular foram utilizadas amostras do material
comumente excisado no
procedimento cirrgico tradicional. A bipsia que geralmente
enviada para anlise
histopatolgica foi fragmentada e encaminhada para o cultivo
celular. O animal foi
acompanhado diariamente at a retirada da sutura e depois
semanalmente para
acompanhamento do quadro clnico e evoluo quimioterpica conforme
conduta do
mdico veterinrio responsvel.
1.2. Fotossensibilizador 1.2.1. Formulao lipossomal de
Alumnio-Cloro-ftalocianina (AlClft)
Utilizou-se nos tratamentos deste estudo, amostra de
ftalocianinas
lipossomais, na concentrao de 5 M, estocada no escuro,
gentilmente cedidas
pelo Prof. Dr. Antnio Cludio Tedesco USP/ Ribeiro Preto. As
demais
concentraes de estudo, 2,5 M, foram retiradas desta mesma
amostra e diludas
de acordo com a concentrao almejada com Soluo Tampo Fosfato
Salina (PBS)
(LB Laborclin Ltda., Brasil) estril em capela com fluxo laminar
contnuo horizontal.
1.3. Fonte de Luz
Empregou-se prottipo Laser Emissor de Diodo (LED), (Figura
02),
comprimento de onda de 660 nm, com potncia de 75 - 78 mW a
distncia
determinada de quatro centmetros entre a lente do LED e o objeto
experimental.
Tais valores foram determinados atravs da avaliao fsica
gentilmente realizada
pelo Prof. Dr. Sebastio Willian da Silva Instituto de Fsica
/UnB. O comprimento
de onda foi calculado atravs da Cromatografia de Camada Delgada
(CCD - Figura
03) e espectofotometria para aferio do espectro. O LED utilizado
formado por
uma banda espectral inserida no espectro vermelho.
31
Figura 02 Imagem fotogrfica do aparelho prottipo LED em
funcionamento
durante TFD. Note a esquerda, amostra envolvida em papel alumnio
para ficar protegida da
luz ambiente.
Figura 03 Imagem computadorizada da faixa obtida atravs da
cromatografia de
camada delgada (CCD) para identificao da faixa de comprimento de
onda do LED.
Observa-se em 580nm percepo do espectro (luz), em 660nm obtm-se
seu maior valor e
em 700nm termina seu espectro.
32
Dose (J/cm2) = Potncia (watt) X Tempo (segundos) rea irradiada
(cm2)
A potncia do LED foi medida em um colimador ligado a uma fonte
de
quantificao de concentrao fotnica (intensidade medida em watts)
e fonte de
energia de 220 volts.
A dosidometria estipulada para o experimento foi obtida atravs
da frmula:
*Dose: energia necessria para excitao dos ftons dada por
J/cm2
*Potncia: intensidade da fonte de luz a uma determinada
distncia, medida
em watts.
*Tempo: perodo em segundos de exposio a fonte de luz necessrio
para a
excitao dos ftons.
*rea: espao da amostra a ser irradiada pela fonte de luz medida
pela rea
da circunferncia do fundo da placa.
1.4. Concentrao do fotossensibilizador e dosidometria
Inicialmente realizou-se um estudo preliminar da aplicao da TFD
in vitro
mediada pela AlClFt-liposomal em diferentes perodos de
tratamento para averiguar
o tempo mnimo necessrio de exposio ao LED como tambm, a
concentrao de
AlClFt.
Aps anlise destes resultados (dados no mostrados), a
concentrao
escolhida de AlClFt-liposomal foi de 2,5M e fonte de luz, LED,
com: comprimento
de onda 660nm.,potncia entre 75 -78 mW, densidade de energia de
10J/cm2.
2. METODOLOGIA
2.1. Obteno das Amostras
Uma vez removido cirurgicamente, os tumores foram
imediatamente
seccionados em fragmentos de aproximadamente dois centmetros de
dimetro com
33
auxlio de lmina de bisturi n 10, cabo de bisturi n 03 e pina
anatmica. Em
seguida, foi novamente excisado em duas partes iguais de um
centmetro cada. A
primeira amostra foi armazenada em frasco coletor de amostras
biolgicas de
capacidade 50mL contendo formol a 10% e encaminhada para
avaliao
histopatolgica juntamente com o restante da bipsia excisional do
paciente. No
outro fragmento foram realizados ciclos de lavagem, atravs da
imerso da amostra
em um tubo falcon 50mL com Polivinilpirrolidona Iodo (PVPI)
tpico - LM Farma,
Brasil, seguidos de quatro lavagens com soluo fisiolgica NaCl
0,9%, - Equiplex
Brasil, todos estreis para finalmente armazenagem em tubo falcon
contendo meio
de cultivo Dulbecos Modified Eagle Medium (DMEM) - GIBCOTM, EUA,
e antibitico
penicilina (100 g/mL) e estreptomicina (100 g/mL) - Sigma
Adrich, EUA, o qual
serviu de meio de transporte do material at o laboratrio.
A manipulao em todas as etapas deste procedimento foi feita de
forma
estril, e os materiais utilizados foram previamente
esterilizados.
2.2. Cultivo Celular
Fragmentos dos tecidos tumorais excisados durante o tratamento
cirrgico tradicional foram encaminhados para o estabelecimento de
culturas celulares
primrias. Aps o estabelecimento das culturas primrias derivadas
do neoplasma,
foi realizada a aplicao da TFD mediada pela AlClFt-liposomal in
vitro e demais
grupos experimentais.
Todos os procedimentos que sero posteriormente descritos foram
realizados
em capela de fluxo laminar horizontal - CFLH-12, VECO, Brasil,
com material
estril. Cabe ressaltar que, sempre antes da utilizao da cmara de
fluxo laminar,
era realizada limpeza mecnica com lcool a 70% e em seguida,
repouso de 30 a 40
minutos sob luz ultravioleta.
2.2.1. Estabelecimento de culturas primrias
34
As culturas de clulas de tecidos tumorais foram estabelecidas
conforme o seguinte protocolo: uma vez removido o tecido tumoral de
maneira assptica,
conforme descrito no item 2.1, a amostra foi transportada para o
laboratrio em 5mL
de meio de transporte. Em seguida, o material foi seccionado em
pequenos
fragmentos com aproximadamente 0,5mm de dimetro (separao mecnica
do
material biolgico), sob placa de Petri de vidro com auxlio de
pina anatmica e
lmina de bisturi nmero 20 acoplado em cabo de bisturi n 04. Em
seguida, o
material foi transferido para placa de 6 poos e garrafa pequena
de cultivo contendo
meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino - GIBCO,
Brasil,
penicilina (100g/mL) e estreptomicina (100g/mL). As placas e as
garrafas foram
colocadas em estufa TE 399Tecnal, Brasil, e mantidas a 37,5C, em
atmosfera
umidificada com 5% de CO2 em ar (Figura 04).
Figura 04 Representao esquemtica elucidando as etapas envolvidas
da
colheita da amostra at o estabelecimento das culturas primrias.
A) cadeia mamria
unilateral removida cirurgicamente do paciente contendo massas
tumorais em glndula
mamria abdominal cranial e inguinal; B) exciso do fragmento
tumoral para colheita da
amostra; C) direse do material; D e E) imediatos ciclos de
lavagens da amostra e envio
para o laboratrio atravs do meio de transporte; F) fracionamento
da amostra coletada e G)
cultivo produzido a partir dos fragmentos do tumor.
Para estabelecimento de subculturas, partindo-se inicialmente da
placa de
seis poos e uma garrafa de 25cm2 para cultura de clulas, aps
atingir 75% de
35
confluncia, as clulas foram soltas do fundo do frasco por
tratamento com soluo
de tripsina-EDTA - GIBCO - Canad, contendo 2,5 g/L de tripsina
(1:250) e 0,38 g/L
de EDTA, por trs minutos, a 37 C. Em seguida adicionou-se igual
volume de meio
de cultivo com soro fetal bovino para inativao da tripsina, e o
volume total
contendo a suspenso de clulas foi transferido para um tubo de
centrfuga,
centrifugado a 750 x g por 5 minutos, para formar um precipitado
de clulas (pellet).
O sobrenadante foi descartado e as clulas foram ressuspendidas
em novo meio de
cultivo. Este volume total foi distribudo em placas e garrafas
de cultura, as quais
eram acondicionadas na estufa conforme descrito
anteriormente.
2.2.3. Manuteno do Cultivo Celular
Os frascos de cultura foram avaliados a cada 48 horas em
microscpio
invertido com contraste de fase onde na ocasio era realizada a
troca de metade do
volume do meio das placas e das garrafas, ou caso atingissem
confluncia, a
repicao.
2.3. Delineamento Experimental
Em todos os experimentos aqui realizados, a aplicao do LED e do
frmaco AlClFt-liposomal, seja isolado ou na TFD, foram realizadas
em ambiente escuro,
sem luminosidade.
2.3.1. Preparao do Cultivo para os experimentos in vitro
Partindo-se inicialmente de uma garrafa para cultura de clulas
contendo uma
monocamada de clulas confluentes, outras garrafas foram
preparadas similar ao
proferido no estabelecimento de sub-culturas. No entanto, aps a
centrifugao e
descarte do sobrenadante, o pellet formado era ressuspendido em
01 mL de meio
de cultura suplementado. Aps, as clulas eram contadas em cmara
de Neubauer
36
e plaqueadas para placas de cultura de 24 poos. Todas as
passagens celulares
foram realizadas 24 horas antes dos procedimentos experimentais,
para que
houvesse a estabilizao e adeso celular ao fundo das placas de
cultura. Para as
placas de 24 poos foram transferidas 105 clulas por poo (Figura
05).
O mtodo de cultivo acima descrito foi igual para todos os
ensaios realizados.
No entanto, para as placas de 24 poos disponibilizadas para as
anlises de
morfologia na microscopia de luz, foi adicionada uma lamnula de
vidro circular,
estril, no fundo de cada poo das placas anterior ao plaqueamento
de clulas,
possibilitando o crescimento celular em sua superfcie.
Figura 05 Representao do preparo das placas de 24 poos para
realizao do
experimento com TFD. A) garrafa de cultivo contendo clulas
aderidas na superfcie e
confluentes; B) aps adio da soluo de tripsina-EDTA e consequente
destacamento das
clulas aderidas ao fundo do frasco de cultura; C) e D)
ressuspeso do meio contendo
clulas soltas e envio para centruga a 750xg durante 05 minutos
para formao do pellet.
E) descarte do sobrenadante e ressuspenso do pellete em 1mL de
meio e F) transferncia
de 1x105 clulas em cada poo para aps 24 horas de estufa realizao
do experimento.
37
2.3.2. Grupos Experimentais
Foram delineados quatro grupos experimentais: (1) controle; (2)
LED; (3)
AlClFt-liposomal 2,5M; (4) TFD (Quadro 03)
O controle (1) foi aquele em que as clulas no foram submetidas a
nenhum
tratamento e permaneceram em estufa de cultivo com soluo de PBS
estril
durante todo o procedimento.
O grupo tratado somente com LED (2) permaneceu somente com
soluo
PBS estril semelhante ao grupo controle, porm recebeu iluminao
com LED na
mesma intensidade e comprimento de onda que o grupo da TFD.
Objetivo deste
grupo foi avaliar se a fonte de luz apresentava toxicidade
celular se utilizada
isoladamente. O grupo tratado com AlClFt (3) possuiu metodologia
semelhante ao
grupo tratado com TFD (4), porm sem iluminao com LED, apenas
administrao
do frmaco durante 30 minutos e em seguida descarte e manuteno
com o PBS. A
finalidade deste grupo foi avaliar a citotoxicidade do frmaco
sem fotoativao.
Enfim, o objetivo almejado na criao destes dois grupos foi
certificar inocuidade dos
fatores FS e fonte de luz, aumento assim confiabilidade da
TFD.
E finalmente, grupo TFD (4), que consistiu no tratamento das
culturas
celulares com soluo liposomal de AlClFt em uma concentrao de 2,5
M. Aps
30 minutos de exposio em estufa de cultivo celular, a soluo
fotossensibilizadora
foi descartada e uma soluo de PBS estril foi aplicada nos poos
para que fosse
procedida a aplicao de LED com energia total de 10 J/cm2
Quadro 02 Descrio da constituio de cada grupo experimental.
As
demarcaes em X referem-se aplicao do item em questo.
AlClFt
LED
GRUPOS 2,5M
10J/cm2
1 (Controle) - -
2 (LED) - X
3 (AlClFt) X -
4 (TFD) X X
38
Aps 24 horas da execuo destes procedimentos, as placas de
cultura foram
processadas para as diferentes anlises. Todas as anlises foram
conduzidas em
quadruplicatas, ou seja, realizao de quatro poos de tratamento
para cada grupo
experimental em cada anlise proposta.
Figura 06 Representao esquemtica dos grupos experimentais e
anlises
realizadas.
39
2.4. Ensaios Citotxicos
2.4.1. Anlise da Viabilidade Celular pelo mtodo de Excluso por
Azul Tripan Esse teste de viabilidade tem como princpio a avaliao
do grau de
comprometimento estrutural da membrana plasmtica atravs da
deteco de
clulas com perda de integridade de membrana citoplasmtica sendo,
assim,
consideradas inviveis. Tal fato pode ser evidenciado em razo do
corante ser uma
macromolcula, no absorvido pela membrana plasmtica de clulas
viveis
(STROBER, 2003). Contudo, quando a membrana plasmtica sofre
alteraes
estruturais e se torna permevel ao corante, as clulas so coradas
em azul.
Para tal, decorridas 24 horas do protocolo experimental
(tratamentos), foi
retirado o meio DMEM suplementado de cada poo e adicionados 300l
de tripsina-
EDTA e mantido em estufa de cultivo durante dois minutos. Aps a
incubao, foi
adicionado igual volume de DMEM com 10% de soro fetal bovino e o
volume total foi
ressuspendido e transferido para tubos de microcentrifugao do
tipo eppendorfs,
devidamente numerados e identificados com o nome do grupo
experimental. Em
seguida o material foi centrifugado a 750xg durante cinco
minutos e o sobrenadante
formado, descartado. Do pellet obtido fez-se ressuspenso com um
mililitro de meio
de cultivo DMEM e de cada uma das amostras, retirou-se 100L da
suspenso de
clulas de cada poo, aos quais foram adicionados 100 L do corante
azul tripan
(0,4%) - Sigma - Aldrich , EUA. Aps homogeneizao da mistura, dez
L foram
transferidos ao hematocitmetro - C.A.Hausser & Son, EUA e o
nmero de clulas
viveis (no coradas) e no viveis (coradas em azul) foi
determinado. A contagem
celular realizada com auxlio do microscpio ptico modelo MO BX
41- Olympus,
EUA, foi feita no perodo mximo de cinco minutos para evitar a
evaporao do
lquido e a morte celular por exposio prolongada ao corante. Para
a determinao
do nmero de clulas na cmara de Neubauer foi utilizada a frmula a
seguir.
N de clulas por mL = n de clulas nos 4 quadrantes x fator de
diluio x 104
4
40
Um nmero absoluto de clulas por mililitros foi obtido neste
ensaio. A mdia
da contagem de 4 poos em cada grupo 24 horas aps os diferentes
tratamentos
levou ao resultado obtido desta etapa do experimento.
2.4.2. Viabilidade Celular pelo mtodo de MTT
Esse ensaio de citotoxidade consiste em um teste colorimtrico
que quantifica
a reduo do sal tetrazolium MTT (brometo de 3(4,5
dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-
tetrazlio) em um composto conhecido como formazan
(1-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-
3,5- diphenylformazan), pela ao de desidrogenases mitocondriais
e mediada pela
enzima intracelular succinato-desidrogenase. O resultado do
teste dependente,
portanto, da populao celular vivel, capaz de metabolizar o
formazan (DENIZOT et
al 1986 apud MACHADO et al., 2008). Ou seja, a presena de
desidrogenases
mitocondriais ativas um indicativo de viabilidade celular. Os
cristais do corante roxo
de formazan formados pela reduo do MTT so quantificados por
tcnicas de
espectofotometria.
Para a realizao dessa anlise, decorridas 24 horas aps o perodo
de
incubao, o meio de cultivo foi substitudo por outro adicionado
de soluo estoque
de MTT (5 mg/mL) na proporo 50 L / 450 L de meio de cultura. Tal
soluo foi
armazenada protegida da luz e em temperatura de 4C. Em seguida,
incubaram-se
as placas na estufa de cultivo de maneira rotineira, mas ao
abrigo da luz. Aps trs
horas de incubao com o meio de cultura adicionado com o corante
MTT, esse
meio foi removido e adicionados 300 L de soluo dimetilsulfxido
(DMSO) - Sigma
- Aldrich; EUA, em cada poo para a dissoluo dos cristais de
formazan. Aps 10
minutos de repouso, os cristais de formazan foram dissolvidos e
a leitura e
quantificao das quadruplicatas foram feitas com o aparelho
espectrofotmetro
digital (Bio-Rad Model 3550 UV microplate reader) em comprimento
de onda 595
nm. O grfico foi plotado no Programa Origin verso 6.0 e a
interpretao dos
resultados foi obtida atravs da anlise das absorvncias.
Absorvncia menor que a
lida no grupo controle no tratado indicativo de morte
celular.
41
2.4.3. Viabilidade celular e distino entre as vias de morte
celular por meio do ensaio de colorao com Alaranjado de Acridina e
Brometo de Etdio
Este ensaio consiste em um teste de viabilidade celular que
utiliza uma dupla
colorao fluorescente. Os corantes ento utilizados tm a
capacidade de se
intercalarem com cidos nuclicos, sendo que o brometo de etdio
exposto a
radiao ultravioleta emite fluorescncia em vermelho ou
vermelho-alaranjado
quando se intercala ao DNA (SILVA et al., 2001) e o alaranjado
de acridina emite
fluorescncia em verde quando se intercala a esse cido nuclico
(LIU et al., 2008).
Esses dois corantes tambm possuem a capacidade de penetrar a
membrana
plasmtica de forma diferenciada. Enquanto o alaranjado de
acridina consegue
penetrar as clulas com membrana ntegra, o brometo de etdio s
penetra as
clulas com perda de integridade de membrana. Ou seja, quando a
clula encontra-
se vivel, ser corada de verde uniformemente, com citoplasma de
tamanho normal
e ncleo preservado se destacando com verde mais claro. No caso
de apoptose
inicial, mas com preservao de sua membrana plasmtica, haver
entrada somente
do corante alaranjado de acridina e as clulas sero coradas em
verde, no entanto,
o ncleo estar com formatos irregulares e possveis condensaes e
fragmentao
da cromatina. Na apoptose tardia, como as clulas j perderam
parcialmente a
inte
