TESE DE DOUTORADO - repositorio.ufrn.br · bioinseticidas, os quais são mais seguros que os agrotóxicos comuns e apresentam vantagens como menor toxicidade e alta especificidade

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TESE DE DOUTORADO

Contribuição para a Tecnologia de Produção de Corpos de Oclusão do

Baculovírus Spodoptera: Análise das Proteínas Virais e

Caracterização Matemática

Graciana Clécia Dantas

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Regina da S. Pedrini

Co-orientadoras: Profa. Dra. Andréa Farias de Almeida

Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo

Natal/RN

Maio/2015

ii

Graciana Clécia Dantas

CONTRIBUIÇÃO PARA A TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE CORPOS

DE OCLUSÃO DO BACULOVÍRUS SPODOPTERA: ANÁLISE DAS

PROTEÍNAS VIRAIS E CARACTERIZAÇÃO MATEMÁTICA

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Doutora em

Engenharia Química, sob a orientação da Profa. Dra.

Márcia Regina da Silva Pedrini e a coorientação das

Profas. Dras. Andréa Farias de Almeida e Gorete

Ribeiro de Macedo.

Natal/RN

MAIO/2015

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / CT / DEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.

Dantas, Graciana Clécia.

Contribuição para a tecnologia de produção de corpos de oclusão do baculovírus

spodoptera: análises das proteínas virais e caracterização matemática / Graciana Clécia

Dantas. - Natal, 2015.

93 f.: il.

Orientador: Márcia Regina da Silva Pedrini.

Coorientadores: Andréa Farias de Almeida.

Gorete Ribeiro de Macedo.

Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de

Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação em

Engenharia Química.

1. Baculoviridae - Tese. 2. Produtos químicos - Pragas agrícolas - Controle - Tese.

I. Pedrini, Márcia Regina da Silva. II. Almeida, Andréa Farias de. III. Macedo, Gorete

Ribeiro de. IV. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. V. Título.

RN/UF/BSEQ CDU 578.841(043.2)

DANTAS, Graciana Clécia – Contribuição para a Tecnologia de Produção de Corpos de

Oclusão do Baculovírus Spodoptera: Análise das Proteínas Virais e Caracterização

Matemática. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química. Área de concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Engenharia de

Processos, Natal/RN, Brasil.

Orientação: Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini

Co-orientação: Profa. Dra. Andréa Farias de Almeida

Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo

___________________________________________________________________________

RESUMO:

O uso de agrotóxicos em cultivo agrícola é cada vez maior. Os inseticidas químicos usados na

agroindústria causam grandes preocupações como a contaminação ambiental e a falta de

seletividade aos organismos não-praga. Uma alternativa para esse problema é a utilização de

bioinseticidas, os quais são mais seguros que os agrotóxicos comuns e apresentam vantagens

como menor toxicidade e alta especificidade. Ademais, podem ser utilizados em menor

quantidade, decompõem-se mais rápido e sua utilização associada com os inseticidas

sintéticos faz com que o uso de agrotóxicos seja menor, causando baixo impacto ambiental.

Em particular, bioinseticidas do tipo baculovírus têm sido apontados como uma opção de

substituição aos inseticidas químicos na agricultura. Neste trabalho, foi realizada a produção

in vitro do baculovírus Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus e o estudo do seu perfil

eletroforético com base nas proteínas virais presentes nos vírus extracelulares deste

baculovírus. As partículas de vírus extracelulares obtidas durante a passagem seriada do

baculovírus foram analisadas por eletroforese em gel desnaturante e, como esperado, a

poliedrina, proteína responsável pela formação do corpo de oclusão, com aproximadamente

30 kDa foi destaque em todas as passagens analisadas. Proteínas na região entre 14,4 e 97

kDa também foram detectadas. A análise do efeito da adição do hormônio β-ecdisona extraído

do Ginseng brasileiro e do hormônio ecdisona sintético na produção do baculovírus

Spodoptera foi realizada na terceira e quarta passagens em células Sf21, momento em que a

formação dos corpos de oclusão foi reduzida. Os resultados mostraram que o hormônio

ecdisona não influenciou na produção dos corpos de oclusão na terceira passagem. Porém, na

quarta passagem ao se adicionar o hormônio ecdisona, tanto o sintético como o extraído do

Ginseng brasileiro, houve um aumento aproximado de duas vezes na formação dos corpos de

oclusão quando comparados à produção sem adição de ecdisona. Utilizando este processo de

infecção, foi realizada uma caracterização matemática que representasse o mecanismo de

produção do bioinseticida.

Palavras-chave: SfMNPV, Bioinseticida, Baculovírus, Ecdisona, Ginseng brasileiro, SDS-

PAGE, Caracterização matemática.

ABSTRACT

The use of pesticides in agricultural crops is increasing. Chemical pesticides used in

agribusiness cause major concerns such as environmental contamination and the lack of

selectivity to the target pests. An alternative to this problem is the use of biopesticides. The

bioinsecticides are safer than ordinary pesticides and present others benefits, such as lower

toxicity and high specificity. Furthermore, they can be used in smaller quantities, decompose

faster and when use associated with synthetic insecticides decreases the use of pesticides,

causing low environmental impact. In particular, baculovirus insecticides have been suggested

as an option to these chemical insecticides. In this work, in vitro production of baculovirus

Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus was performed and the study of its

electrophoretic profile based on viral proteins present in the extracellular virus. The particles

of extracellular virus obtained during serial passage baculovirus were analyzed by

electrophoresis on denaturing gel and, as expected, the polyhedrin - protein responsible for the

occluded bodies’ formation - with approximately 30kDa was prominent in all analyzed

passages. Proteins in the region between 14.4 and 97 kDa were also detected. The effect of the

addition of the extracted β-ecdysone hormone from Brazilian ginseng and synthetic hormone

ecdysone on the production of baculoviruses Spodoptera was carried out in the third and

fourth passages using Sf21 cells, when the formation of occlusion bodies was reduced. The

results showed that the hormone ecdysone did not influence the production of occlusion

bodies in the third passage. However, in the fourth passage by adding the hormone ecdysone,

both synthetic as well extracted from Brazilian ginseng, there was an approximate two-fold

increase in the formation of occlusion bodies as compared to the results without addition of

ecdysone. Using this process of infection, caracterization mathematical to represent the

biopesticide production mechanism was carried out.

Key words: SfMNPV, Biopesticide, Baculovirus, Ecdisone, Brazilian Ginseng, SDS-PAGE,

Mathematical caracterization.

A meu pai João Justino (in memorian) e a minha mãe Graça

por todo amor e confiança em mim depositada e por serem

responsáveis pelo meu crescimento profissional e pessoal.

A toda a minha família, pelo carinho e incentivo

em todos os momentos desta jornada.

DEDICO.

AGRADECIMENTOS

À Deus por me apontar sempre o caminho correto a seguir e me dar forças para

continuar quando tudo parecia estar difícil demais.

À minha mãe pelo exemplo, dedicação e amor incondicional dispensados a mim em

todos os momentos da minha vida.

Aos meus irmãos Júnior, João Hélio, Getúlio e George pelo grande apoio, carinho e

paciência.

Às minhas orientadoras, professoras doutoras Márcia Pedrini, Andréa Almeida e

Gorete Ribeiro pela dedicada orientação, oportunidade, disponibilidade, confiança, carinho,

apoio, valiosos ensinamentos e ajuda de sempre.

Aos Professores Jackson Araújo e Paulo Marinho pela presença na banca de

qualificação, contribuindo grandemente com o trabalho.

Ao doutor Diego Tresinari da UNICAMP pela doação do extrato do hormônio

ecdisona.

À professora Adriana Uchôa por toda dedicação na análise do gel de eletroforese.

Aos queridos Iuri, Milena e Ricardo pela ajuda nos experimentos.

Ao Carlos Eduardo pelo total empenho na execução da caracterização matemática

desse trabalho. A você, toda a minha gratidão!

Aos colegas do Laboratório de Engenharia de Alimentos pelas grandes alegrias no

convívio diário de trabalho.

Aos funcionários do PPGEQ, Mazinha e Medeiros, que sempre me ajudaram de forma

amigável e prestativa nas mais diversas questões surgidas ao longo deste curso.

A todos os meus amigos pela torcida e pelos momentos de descontração, carinho,

demonstração de verdadeira amizade, e por estarem sempre presentes.

Aos anjinhos da minha vida João Neto, Jodoval Neto, Rainan e Ludmila pelo amor

verdadeiro e por me fazerem sorrir nos momentos de estresse.

A Capes, pela bolsa concedida.

E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho, os meus sinceros agradecimentos e reconhecimento.

SUMÁRIO

Lista de figuras .............................................................................................................................

Lista de tabelas .............................................................................................................................

Nomenclatura................................................................................................................................

Lista de variáveis ..........................................................................................................................

Capítulo 1.Introdução Geral ..................................................................................................... 17

Capítulo 2.Análise das proteínas virais presentes na passagem seriada do baculovírus fMNPV

em células Sf21 ......................................................................................................................... 23

2.1. Revisão bibliográfica ................................................................................ 23

2.1.1. Produção de baculovírus em sistema in vitro ......................................................... 23

2.1.1.1. Passagem Seriada ................................................................................................ 26

2.1.2. Características das proteínas virais ......................................................................... 28

2.1.3. Análise das proteínas virais .................................................................................... 33

2.2. Metodologia Experimental ....................................................................... 33

2.2.1. Linhagem de células e vírus ................................................................................... 33

2.2.2. Passagem seriada .................................................................................................... 35

2.2.3. Preparo das amostras para as análises de eletroforese em gel ................................ 36

2.2.4. Dosagem de proteínas ............................................................................................. 36

2.2.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ............................................. 37

2.3. Resultados e Discussão ............................................................................. 38

2.3.1. Dosagem de proteínas através do método de Bradford .......................................... 38

2.3.2. Análise das proteínas do vírus extracelular (BVs) através de eletroforese em gel de

poliacrilamida - SDS ........................................................................................................ 39

2.4. Conclusões ................................................................................................ 41

Capítulo 3.Adição de ecdisona na produção em batelada do baculovírus SfMNPV ............... 43


3.1.2. Otimização da produção in vitro de baculovírus .................................................... 43

3.1.2.1. Hormônio 20 – Hidroxiecdisona ......................................................................... 44


3.2.1. Determinação da concentração celular e quantificação dos corpos de oclusão (OB)

.......................................................................................................................................... 49

3.2.2. Adição de ecdisona extraído do Ginseng brasileiro e de ecdisona comercial ....... 50

3.3. Resultados e Discussão ............................................................................. 50

3.3.1. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 3ª passagem . 50

3.3.2. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 4ª passagem . 53

3.4. Conclusões ................................................................................................ 57

Capítulo 4.Modelagem matemática e simulação da produção de baculovírus SfMNPV ......... 59


4.2. Definição das equações matemáticas ........................................................................ 62

4.2.1. Concentração de células viáveis não infectadas ..................................................... 62

4.2.2. Concentração de células viáveis infectadas ............................................................ 63

4.2.3. Concentração de células não viáveis ...................................................................... 64

4.2.4. Concentração viral .................................................................................................. 64

4.2.5. Estimação de parâmetros do modelo ...................................................................... 65

4.2.6. Algoritmo de otimização por enxame de partículas ............................................... 66


4.3.1. Formulação do Modelo ........................................................................................... 67

4.3.1.1. Considerações do modelo .................................................................................... 67

4.4. Resultados e Discussões ........................................................................... 73

4.4.1. Parâmetros estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton ................................. 73

4.4.2. Análise da sensibilidade paramétrica ..................................................................... 78

4.4.3. Comportamento das respostas do modelo matemático .......................................... 81

4.5. Conclusões ................................................................................................ 85

Capítulo 5.Considerações finais ............................................................................................... 88

Referências Bibliográficas ........................................................................................................ 91

Lista de figuras

Figura 1.1. Esquema representativo dos capítulos abordados..................................................21

Figura 2.1. Estrutura e composição das partículas infectivas dos baculovírus: Vírus

extracelular (BV); vírus derivado de oclusão (ODV). .............................................................. 24

Figura 2.2. Produção de corpos de oclusão durante passagem seriada do baculovirus

Spodoptera em células de inseto Sf21. ..................................................................................... 27

Figura 2.3. Reconstrução filogenética das sequências proteicas VP1054 dos baculovírus.. .... 32

Figura 2.4. Aparato para gel de poliacrilamida (SDS-PAGE.. ................................................. 37

Figura 2.5. Dosagem de proteína total da passagem seriada de SfMNPV. .............................. 38

Figura 2.6. Análise de proteínas estruturais de Spodoptera frugiperda MNPV. Eletroforese em

gel de poliacrilamida – SDS 12%. ............................................................................................ 39

Figura 3.1. Estrutura química da beta-ecdisona. ...................................................................... 46

Figura 3.2. Aspecto geral de um espécime de Pfaffia glomerata. .............................. ..............47

Figura 3.3. Aspecto das raízes de Pfaffia glomerata................................................................48

Figura 3.4. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 3.....51

Figura 3.5. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 3ª passagem .................. 52

Figura 3.6. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 4..... 54

Figura 3.7. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 4ª passagem:a) produção

volumétrica; b) produção específica. ........................................................................................ 55

Figura 4.1 Classificação de modelos.........................................................................................60

Figura 4.2. Fases na trajetória de vírus e a produção de proteína de uma suspensão de células

infectadas com baculovírus recombinante. A fase latente, a fase de produção, e a fase de

decaimento................................................................................................................................68

Figura 4.3. Dados experimentais utilizados para a simulação. Concentração de células não

viáveis (Nnv), (A); concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB,

(C).............................................................................................................................................69

Figura 4.4. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio das células

controle. Dados experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto

paramétrico re-estimado (). A) Células viáveis; B) Células não-

viáveis.......................................................................................................................................74

Figura 4.5. Análise de sensibilidade paramétrica do modelo matemático proposto para os

ensaios de infecção de SfMNPV em células de inseto Sf21 sem adição de hormônio ecdisona

(A), com adição de hormônio ecdisona sintético (B) e com hormônio ecdisona extraído do

Ginseng brasileiro(C)...............................................................................................................80

Figura 4.6. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio sem hormônio

ecdisona. Dados experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com o

conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv), (A);

concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB, (C)..........................................82

Figura 4.7. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio

ecdisona sintético. Dados experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com

o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv), (A);

concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB, (C)...........................................83

Figura 4.8. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio

ecdisona extraído do Ginseng brasileiro. Dados experimentais (); Dados simulados pelo

modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células

não viáveis (Nnv), (A); concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB,

(C).............................................................................................................................................84

Lista de tabelas

Tabela 2.1. Principais proteínas codificadas por ORFs localizadas nas extremidades dos

clones de SfMNPV-19..............................................................................................................30

Tabela 4.1. Condições iniciais dos ensaios de infecção do baculovírus SfMNPV em células de

inseto Sf21.. .............................................................................................................................. 70

Tabela 4.2. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio

de infecção sem adição do hormônio ecdisona. ....................................................................... 75


de infecção com adição do hormônio ecdisona sintético ......................................................... 76


de infecção com adição de hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro ...................... 77

Nomenclatura

20-HE 20-Hidroxiecdisona

AcMNPV Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus

AgMNPV Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus

AgMNPV-2D Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone 2D

Bac-HÁ Baculovírus recombinante do vírus da gripe do subtipo H6

BmNPV Bombix mori nucleopolyhedrovirus

BV-RVG/RVG Baculovírus recombinante do vírus da raiva

BVs Budded virus – vírus extracelular

CNPMS Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo

d.p.i Dia pós infecção

DIPs Partículas interferentes defectivas

FP mutantes poucos poliedros

GP64 Glicoproteína 64

h.p.i Hora pós infecção

HaSNPV Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus

IEF Isoeletrofocalização

IGRs reguladores do crescimento de insetos

IPLB-Sf21 Linhagem de célula Sf21 de Spodoptera frugiperda

MIP Programa Integrado de Manejo de Pragas

MOI Multiplicidade de infecção

MP muitos poliedros

NS1 proteína não estrutural do vírus da dengue

OBs Corpos de oclusão

ODV vírus derivado do OB

ORFs fase de leitura aberta

PBM modelos de balanço populacional

PIBs Poliedros

PSO Otimização por enxame de partículas

rpm Rotação por minuto

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

Sf21 Linhagem de célula da Spodoptera frugiperda clone 21

Sf9 Linhagem de célula da Spodoptera frugiperda clone 9

SFM meio sem soro

SfMNPV Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus

T.ni Células Trichoplusia ni

TEMED Tetrametiletilenodiamina

vAgEGT∆-LacZ Baculovírus recombinante de Anticarsia gemmatalis multiple

nucleopolyhedrovirus

VHSV Vírus da septicemia hemorrágica viral

Lista de variáveis

µmax Velocidade específica de crescimento

C Concentração de células

c1 Parâmetro cognitivo

c2 Parâmetro social

COB Concentração de OB

D Fator de diluição

D Dimensão de busca

FO Função objetivo

I Índice de observações de uma saída do modelo

K Número da iteração

K Índice do vetor de parâmetros do modelo

ka Coeficiente de ataque viral às células viáveis não infectadas

kd1 Taxa de morte celular específica em células viáveis não infectadas

kd2 Taxa de morte celular específica em células viáveis infectadas

kdv Velocidade de decomposição

KDa Quilodalton

M Marcador de peso molecular

MOB Média da contagem de OB

N Total de observações de uma resposta do modelo

Ncélulas Número de células contadas

Ni Balanço material da população de células viáveis infectadas

Nnv Variação da população de células não viáveis

Nu Balanço material de células viáveis não infectadas

P Partícula

P1 Passagem seriada 1



r1 e r2 Números randômicos da distribuição uniforme

snd,ik Informação adimensional da sensibilidade paramétrica individual

V Velocidade da partícula

Vt Concentração viral (OB/mL)

W Parâmetro peso inicial

X Posição atual da partícula

xglob

Melhor posição obtida pelo enxame

xind

Melhor posição da partícula

Α Taxa de produção viral específica

α Velocidade específica de formação de OB

τearly Tempo que delimita a etapa inicial

τexp Tempo que delimita a fase exponencial de crescimento celular

τest Tempo que delimita a fase estacionária

τvlate Tempo que delimita a fase muito tardia

Capítulo 1

Introdução Geral

Capítulo 1. Introdução Geral 17

Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN

Capítulo 1.

Introdução Geral

O Brasil, por ser um país com atividade agrícola bastante expressiva, tem enorme

interesse quando se trata do combate de pragas agrícolas. Tendo em vista a alta produção

nacional e o custo com agrotóxicos, é relevante investir no controle de pragas.

Dentre as pragas que causam danos à atividade agrícola brasileira, destaca-se a lagarta-

do-cartucho do milho, Spodoptera frugiperda J.E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae), também

conhecida por lagarta do milharal ou lagarta militar, considerada como a principal praga da

cultura do milho no Brasil. A preferência de S. frugiperda pelo cartucho do milho, não exclui

o ataque às folhas e aos grãos das espigas, o que explica o tamanho do prejuízo causado às

plantações (Cruz & Monteiro, 2004).

O controle de pragas principalmente em sistemas de produção agrícola tem sido

realizado mediante aplicações frequentes de inseticidas químicos, como método predominante

para redução de danos econômicos em lavouras. Embora o controle químico seja importante

para este fim, o uso de produtos de alta toxicidade pode resultar em efeitos adversos ao

homem e ao meio ambiente (Moscardi & Souza, 2002). Além disso, pode causar resistência às

populações de pragas (Carpio et al., 2013) e destruir predadores naturais que ajudam no

biocontrole de pragas (Kalha et al., 2014).

O controle de pragas por métodos biológicos aplicados é um avanço na agricultura

mundial. Organismos que normalmente têm preferências específicas a determinadas pragas,

inócuos a outros animais benéficos e a pessoas, são preferenciais para o controle de pragas.

Em particular, os vírus do tipo baculovírus, são considerados importantes agentes de controle

biológico devido à especificidade oferecida aos seus organismos-alvo (hospedeiros) e a sua

forma de disseminação (Federici, 2002).

A propagação de baculovírus é feita através dos próprios hospedeiros (cultivo in vivo)

ou utilizando as células embrionárias ou epiteliais isoladas destes hospedeiros (cultivo in



vitro). Atualmente, a produção de baculovírus ainda é realizada em sistema de cultivo in vivo,

onde sua propagação é na própria lavoura. Esse processo torna-se ineficiente, pois necessita

da presença da lagarta durante o cultivo, entretanto, o plantio de milho não é constante

durante o ano, o que impossibilita uma produção regular deste vírus na lavoura (Moscardi,

1999).

Uma importante vantagem dos bioinseticidas sobre os inseticidas químicos é o fato de

apresentarem menor custo e, além disso, sua utilização continuada não provoca resistência da

praga. Os bioinseticidas, ainda, são mais específicos e menos poluentes. Porém, como

desvantagens, requerem estudos mais elucidados no isolamento de novos patógenos, nos

testes de seleção, produção e formulação (Nohatto et al., 2010).

O Brasil tem-se destacado na produção de baculovírus desde a década de 80, no

controle à lagarta da soja Anticarsia gemmatalis (Hubner, 1818) (Lepidóptera: Noctuidae),

um inseto de importância econômica e que demanda cerca de 60% das aplicações de

inseticidas realizadas na produção de soja no país (Moscardi & Souza, 2002), representando

assim, o maior programa da utilização deste vírus para o controle de pragas. Além da

utilização do baculovírus Anticarsia, de maneira experimental, também foi utilizado o

baculovírus Spodoptera para o controle da lagarta do milho, S. frugiperda (Valicente 1989,

Valicente & Cruz 1991).

O sistema in vitro é uma alternativa para melhoria da tecnologia de produção de

baculovírus, no entanto, ainda é realizado em cultura de células em monocamadas

dificultando assim a obtenção de baculovírus em escala industrial. Já a cultura de células em

suspensão facilitaria a produção de baculovírus in vitro em grande escala, devido à adaptação

destas células em cultivo submerso (Weiss et al., 1994; Chakraborty et al., 1999).

A produção in vitro de baculovírus apesar de ser desejável tem encontrado dificuldades

principalmente na ampliação de escala (scale up) devido à instabilidade genética do vírus.

Diversos estudos vêm sendo realizados com a finalidade de melhorar esta produção. Dentre

estes estudos, surge a adição de β-ecdisona, hormônio encontrado em diversas variedades de

samambaias, presente nas gimnospermas e angiospermas, também encontrado em insetos, e

que possui aplicações na agricultura como inseticida e na medicina como agentes antitumorais

(Dinan, 2001; Vigo, 2004).



A utilização de estratégias bem estabelecidas em engenharia de bioprocessos é uma

forma de enfrentar os desafios tecnológicos e econômicos para a produção in vitro de

baculovírus. Deste modo, adaptar sistemas de produção que são utilizados há muito tempo

com sucesso em processos com células microbianas (bactérias, fungos ou leveduras) para

sistema de cultivo com células de inseto é uma estratégia interessante, principalmente quando

se deseja o aumento e a otimização da produção de baculovírus. O conhecimento das

equações cinéticas através da modelagem matemática descritas por esses sistemas de

produção in vitro de bioinseticidas virais e vetores de expressão de proteínas também tem sua

importância na ampliação da produção viral (Almeida, 2010).

Os baculovírus produzem dois tipos de fenótipos: o vírus extracelular “budded virus”

(BVs) e os vírus derivados de oclusão “occluded virus” (OBs ou PIBs). Os BVs são

responsáveis pela infecção célula a célula, sendo esta forma viral essencial para o processo de

infecção in vitro, pois alta concentração destas partículas virais indica a possibilidade do

sincronismo do processo de infecção, garantindo que todas as células sejam infectadas no

mesmo momento. Já os OBs difundem o vírus de inseto para inseto, apresentando-se oclusos

em uma matriz protéica, cuja principal constituinte é a poliedrina com aproximadamente 30

KDa (Rohrmann, 1986). A poliedrina proporciona a preservação do vírus no ambiente por um

tempo mais prolongado (Castro et al., 2004), portanto, essa oclusão permite que os OBs sejam

utilizados como os próprios bioinseticidas.

Além do conhecimento do sistema de produção dos baculovirus, deve-se ter ideia de

como é o modo de atuação desses vírus em seus hospedeiros. Nos últimos anos, a análise

proteômica tem sido usada para o entendimento do modo de ação das proteínas como forma

de aumentar o controle biológico de insetos-praga (Murad et al., 2008;. Yao et al., 2009;

Zhang et al., 2011). Em se tratando dos bioinseticidas virais, também é essencial o

conhecimento das proteínas virais que estão envolvidas direta ou indiretamente no processo

de infecção. Deste modo, a análise das proteínas virais é importante para o desenvolvimento

de estratégias na produção in vitro dos bioinseticidas virais, do ponto de vista de processo e

também biológico.

Sendo assim, o presente trabalho apresenta dados relativos à otimização da produção de

bioinseticida viral obtido a partir de infecções com Spodoptera frugiperda multiple

nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) em células de S. frugiperda, linhagem Sf21, adaptadas ao



cultivo em suspensão. Análises do efeito do hormônio β-ecdisona, extraído do Ginseng

brasileiro, e do hormônio ecdisona sintético, produzido comercialmente, foram realizadas,

bem como a avaliação cinética da produção deste bioinseticida viral e sua caracterização

matemática no processo de infecção. Realizou-se, também, por meio de eletroforese em gel de

poliacrilamida, o estudo dos perfis das proteínas virais obtidas na produção in vitro do

baculovírus selvagem SfMNPV.

Em resumo, a presente tese está dividida em cinco capítulos. O primeiro capítulo exibe

uma introdução geral sobre os temas estudados. Os demais capítulos estão subdivididos em

revisão bibliográfica, relativa aos assuntos abordados na pesquisa, e no desenvolvimento

prático do trabalho (métodos utilizados, discussão dos resultados obtidos e conclusão parcial).

O segundo capítulo trata da análise das proteínas virais do vírus extracelular (BV) do

baculovírus SfMNPV onde a quantificação de proteínas foi realizada pelo método de

Bradford e a análise do vírus extracelular (BVs) em SDS-PAGE. O Capítulo 3 apresenta o

estudo da adição de ecdisona na produção em batelada do baculovírus SfMNPV, como

também, os dados experimentais das infecções na terceira e na quarta passagem do

baculovírus sem adição do hormônio ecdisona e com adição do hormônio β-ecdisona extraído

do Ginseng brasileiro e do hormônio ecdisona sintético produzido comercialmente. O

Capítulo 4 aborda as cinéticas de crescimento celular e de produção de corpos de oclusão,

obtidas das infecções dos três sistemas experimentais estudados no capítulo anterior, bem

como, a modelagem matemática e a simulação dos processos de produção já citados. Por fim,

o Capítulo 5 encerra a tese, apresentando as considerações finais, obtidas pela análise

minuciosa dos dados experimentais. O esquema representativo geral mostrando os capítulos

referentes a cada etapa deste trabalho é apresentado na Figura 1.1.



Capítulo 1:

Introdução Geral

Capítulo 2: Análise das Proteínas

Virais Presentes na Passagem

Seriada de SfMNPV em Células

Sf21

Quantificação

de proteínas

SDS - PAGE

Capítulo 3: Adição de Ecdisona na

Produção do Baculovírus SfMNPV

Capítulo 4: Modelagem

Matemática e Simulação da

Produção de Baculovírus

SfMNPV

Capítulo 5:

Considerações finais

Curvas de

crescimento celular Produção dos corpos

de oclusão

Sem ecdisona

Com ecdisona

comercial

Com extrato de

ecdisona

Aplicação aos modelos

matemáticos:

Power (1993)

Roldão et al. (2007)

Figura 1.1. Esquema representativo dos capítulos abordados.

Capítulo 2

Análise das proteínas virais presentes na

passagem seriada do SfMNPV em

células Sf21

Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada do SfMNPV em Células Sf21 23


Capítulo 2.

Análise das proteínas virais presentes na passagem

seriada do baculovírus SfMNPV em células Sf21

Neste capítulo, serão apresentados uma breve revisão sobre a produção de baculovírus,

enfatizando estudos relacionados à análise das proteínas virais, mais especificamente a análise

das proteínas relacionadas com a produção em passagem seriada do vírus extracelular de

SfMNPV. A quantificação das proteínas identificadas e a análise do vírus extracelular (BVs)

em SDS-PAGE. A passagem seriada do vírus SfMNPV em linhagem de células de inseto

Sf21, cultivadas em meio SF900II, realizada por Dantas (2010), foi utilizada como base para

análise das proteínas virais deste sistema.

2.1. Revisão bibliográfica

2.1.1. Produção de baculovírus em sistema in vitro

A produção de baculovírus utilizados como bioinseticidas pode ser realizada por dois

diferentes sistemas. Tradicionalmente, a produção de baculovírus dá-se de forma in vivo, onde

os corpos de oclusão multiplicam-se na própria lagarta, mantida por dieta artificial, infectada

com o baculovírus de interesse. Enquanto que no sistema in vitro o vírus é preparado de tal

maneira que permita sua replicação em células adaptadas ao cultivo e susceptíveis à ação

viral.

Apesar do processo de produção in vivo ser considerado a maior fonte dos baculovírus

disponíveis no mercado, problemas na sua produção, no controle de qualidade e na ampliação

Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 24


de escala torna-o ainda um processo inviável, além de resultar num custo final elevado

(Moscardi & Souza, 2002).

A produção in vitro de baculovírus em cultivo de células é relativamente mais fácil,

quando comparada à produção in vivo, por estabelecer cultivos contínuos de células. Este

processo de produção pode ser realizado através de duas formas virais: o vírus extracelular

(BV) e o vírus derivado de oclusão (ODV) (Figura 2.1). No entanto, é normalmente realizado

com o vírus extracelular (BV) da hemolinfa de insetos infectados ou do sobrenadante das

células previamente infectadas, ou ainda, através da liberação das partículas virais dos OB

produzidos (King & Possee, 1992).

Figura 2.1. Estrutura e composição das partículas infectivas dos baculovírus: Vírus

extracelular (BV); vírus derivado de oclusão (ODV). (Fonte: Adaptada de:

http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculo.html).

Segundo Kikhno et al (2002), estas formas virais (BV e ODV) possuem funções

diferentes, estrutura de seus nucleocapsídeos similares, genótipos idênticos, atingem

diferentes células-alvo apresentando proteínas específicas e diferindo na composição de seus

http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculo



envelopes. Essas funções distintas conferem diferentes atribuições funcionais às partículas

ODV e BV (Blissard, 1996).

Os BVs são caracterizados por um nucleocapsídeo simples, cuja principal proteína é a

VP39, envelopado por uma derivação da membrana plasmática que contém em sua superfície

estruturas chamadas peplômeros (Volkman, 1986). Os peplômeros são compostos por

proteínas, principalmente pela glicoproteína GP64 ou por outras proteínas dependendo da

classe de baculovírus (Almeida, 2008). Os ODVs são constituídos por um ou múltiplos

nucleocapsídeos envolvidos por um envelope originado do núcleo da célula composto por

diversas outras proteínas virais diferentes dos BVs (Braunagel et al., 2003). A proteína P74 é

uma das proteínas presentes no ODV, a qual, durante o processo de infecção, concentra-se

dentro de “microvesículas” no interior do anel intranuclear, região onde se origina o ODV

(Faulkner et al., 1997; Slack et al., 2001).

As pesquisas com baculovírus têm avançado muito nos últimos anos, como por

exemplo, análises com regulação gênica, preparação de vetores virais, estudo de terapia

gênica, construção de vetores de vacina, entre outros (Hu, 2005). Xu et al. (2011) construíram

o baculovírus recombinante BacSC-E, o qual é considerado uma interessante vacina contra o

vírus da encefalite japonesa. Encinas et al. (2011), estudaram a expressão da glicoproteína G

na criação de anticorpos para o vírus da septicemia hemorrágica viral (VHSV). Wu et al.

(2014), desenvolveram nova estratégia para gerar uma vacina contra o vírus da raiva com o

baculovírus recombinante BV-RVG/RVG. Liao et al. (2014), estudaram a eficácia de uma

vacina contra o vírus da gripe do subtipo H6 a partir do baculovírus recombinante Bac-HA.

Iwanaga et al. (2014) avaliaram a expressão de proteínas recombinantes em células de BmVF

usando o nucleopolyhedrovirus B. mori (BmNPV) e os resultados mostraram a

susceptibilidade das células BmVF a BmNPV.

Observando-se esse histórico de pesquisas, torna-se claro a importância do

conhecimento das proteínas atuantes no processo de infecção por baculovírus, sejam elas

essenciais ou não à replicação viral.

Vários fatores contribuem para a replicação in vitro de baculovírus em cultivo de

células, tais como cinética de infecção do vírus, tempo de infecção, consumo de nutrientes, o

tipo de sistema célula-vírus estudado e o efeito de passagem. Apesar do processo de infecção

in vitro necessitar de uma linhagem de célula de inseto altamente produtiva, de um meio de



cultura de baixo custo e de uma estabilidade genética do vírus estoque (Black et al., 1997;

Jem et al., 1997), esse processo de infecção é um dos desenvolvimentos mais interessantes

com relação à produção de bioinseticida em larga escala.

A possibilidade de aumento da produção viral pode ser alcançada, porém, o maior

desafio é manter a estabilidade genética dos vírus produzidos no decorrer de diversas

passagens celulares devido ao “efeito passagem” que pode ocorrer durante o processo de

infecção (O'Reilly et al., 1994). Para tanto, a identificação das proteínas virais sintetizadas e

envolvidas no processo de infecção é essencial para a elucidação do efeito passagem.

2.1.1.1. Passagem Seriada

A passagem seriada baseia-se numa sequência de infecções virais em células

hospedeiras onde para cada infecção anterior é utilizada como inóculo para infecção seguinte.

Nesse processo, pode-se utilizar como inóculo os BVs ou ODVs produzidos por baculovírus

(Almeida, 2010). No entanto, sucessivas passagens destas partículas virais podem causar

alterações genéticas ou perdas de partículas virais no baculovírus, o conhecido “efeito

passagem”.

Na Figura 2.2, tem-se a passagem seriada obtida através das infecções com o

baculovírus SfMNPV realizada por Dantas (2010). No sistema estudado, apresentou-se uma

redução na produção dos corpos de oclusão (OBs) a partir da terceira passagem, durante a

passagem seriada do baculovírus Spodoptera em células de inseto Sf21, o que indica a

ocorrência do efeito passagem. Portanto, tal efeito constitui um fator limitante para a

ampliação de escala devido à instabilidade genética do vírus.

O efeito passagem é caracterizado pela formação de FP (few polyhedra) no decorrer de

sucessivas passagens dos vírus em células. A formação de FP causa redução da produção de

corpos de oclusão (Figura 2.2) e aumento da produção de vírus extracelulares, obtendo uma

vantagem seletiva durante o processo in vitro (Pedrini et al., 2004; Pedrini et al., 2005;

Pedrini et al., 2006a). Porém, o efeito passagem é considerado um dos bloqueios da produção

em larga escala de baculovírus em sistema in vitro, devido ao acúmulo de alterações em seu



genoma, através de ciclos de replicação em culturas de células ou em biorreatores (Krell,

1996).

1 2 3 4 5

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

OB

/ C

élu

la

Número de Passagens

Produção específica de poliedros

Figura 2.2. Produção de corpos de oclusão durante passagem seriada do baculovírus Spodoptera em

células de inseto Sf21 (Fonte: Dantas, 2010).

A baixa quantidade de OB no núcleo da célula infectada é considerado um atributo da

formação dos mutantes FP (poucos poliedros) (Chakraborty & Reid, 1999; Pedrini et al.,

2004). Além da redução de OB, o que também é considerado características destes mutantes

tipo FP são as oclusões que não contêm virions ou com virions de morfologia modificada,

envelopamento intranuclear dos ODV (occlusion derived viruses) também anormal ou

reduzido, aumento da liberação de vírus extracelulares (BV) e diminuição da porcentagem de

células que produzem OB (Harrison & Summers, 1995).



Outra alteração genética associada ao efeito passagem é a produção de partículas

interferentes defectivas (DIPs). Estas partículas apresentam apenas parte do genoma viral com

replicação mais rápida que o vírus padrão. A maioria das partículas defectivas está presente

em altas passagens seriadas do vírus (Souza et al., 2003).

Na produção in vitro de baculovírus SfMNPV, Pedrini et al. (2004), observaram a

rápida geração de fenótipo FP após somente duas passagens do isolado SfMNPV em cultura

de células Sf9. Almeida (2005), utilizando também um isolado de SfMNPV cultivado em

células Sf9, obteve uma maior estabilidade deste isolado, visto que a formação de mutantes do

tipo FP foi identificada após a quarta passagem em células. Dantas et al. (2013), fazendo uso

de um isolado de SfMNPV em cultivo de células Sf21 identificou uma redução na produção

de OB também após a quarta passagem. Também foi identificado por Pedrini (2003) a

diminuição de OB de HaSNPV-Ac53 a partir da segunda passagem em células HzUQ.

Todas as alterações observadas nesses vírus foram baseadas pelas mudanças

morfológicas provocadas pelo efeito passagem, portanto, a análise das proteínas virais durante

a passagem seriada é uma informação importante para que se possa elucidar a ocorrência do

efeito de passagem observado em diversos isolados de baculovírus.

2.1.2. Características das proteínas virais

Vírus é um fragmento, sobretudo protéico que pode infectar organismos vivos. As

formas virais, ODV e BV, apresentam proteínas específicas e diferentes. As primeiras

proteínas expressas no sistema baculovírus foram a β-interferon (Smith et al., 1983) e a

interleucina 2 (Smith et al., 1985), ambas produzidas em AcMNPV.

A maior parte das proteínas é codificada pelo próprio vírus. A especificidade das

proteínas de cada fenótipo viral vem sendo confirmada por meio de técnicas bioquímicas

(Volkman, 1983). É importante destacar, que as proteínas podem estar envolvidas

individualmente ou em cooperação no processo de entrada do vírion na célula do intestino

médio do inseto (Slack et al., 2001; Rashidan et al., 2003), pois já se sabe que fatores

presentes no envelope ODV são essenciais para a infectividade per os dos baculovírus.



Dentre as proteínas virais presentes nas formas virais dos baculovírus, pode-se citar a

proteína de 74 kDa, localizada no envelope ODV, codificada pelo gene de virulência p74. A

p74 é umas das proteínas presentes no processo de replicação dos baculovírus. É do tipo very

late, ou seja, o fenótipo ODV é formado em estágio mais avançado da infecção (Kuzio et al.,

1989). A proteína 25KFP considerada essencial para a montagem correta dos dois fenótipos

virais, ODV e BV (Beniya et al., 1998; Acosta et al., 2001). A poliedrina exibe papel

fundamental na formação dos corpos de oclusão (Maruniak, 1986). A glicoproteína

GP64/PROTEÍNA F tem sua importância na infectividade do vírus de célula para célula

(Monsma et al., 1996).

As proteínas virais estão classificadas em proteínas não estruturais e proteínas

estruturais. As proteínas não estruturais são essenciais no metabolismo de nucleotídeos, na

replicação do DNA viral, na regulação da expressão gênica, nos inibidores de apoptose e nos

genes auxiliares (Ijkel et al., 1999). As proteínas estruturais têm como funções a ligação do

vírion na superfície celular, penetração, descapsidação e aquisição do envelope viral (Ijkel et

al., 1999; Rohrmann, 1986). Na Tabela 2.1, são apresentadas algumas das proteínas não

estruturais e estruturais do baculovírus SfMNPV-19 e suas funções.

Cerca de nove proteínas, codificadas como estruturais, foram identificadas no genoma

do SfMNPV-19 (Tabela 2.1). Os genes da poliedrina, glicoproteína 41kD, ODV-E66 e P74,

codificam proteínas exclusivas dos vírus oclusos. O gene ODV-E66 codifica uma proteína

envolvida na formação do envelope dos vírus oclusos (OBs). A proteína P74, que se liga a um

receptor específico da célula hospedeira, tem como função unir o envelope viral com a

membrana plasmática. As proteínas P87capsid, VP39 e VP1054 exercem função na formação

do nucleocapsídeo e estão presentes tanto nos vírus oclusos quanto nos vírus extracelulares

(Oliveira, 2006).

O baculovírus mais estudado é o AcMNPV e dentre as proteínas já identificadas neste

baculovírus, destaca-se: ODV-E25, uma proteína do envelope com 25 kDa (Russell &

Rohrmann, 1993); a proteína O-glicosilada, identificada como a principal glicoproteína de

ODV, GP41 ou P40 (Whitford & Faulkner, 1992; Ma et al., 1993); além das proteínas ODV-

E66 (Hong et al., 1994), ODV-E56 (Braunagel et al., 1996a), ODV-E18, ODV-E35 e ODV-

EC27 (Braunagel et al., 1996b); GP64, VP39, e P69 (Wang et al., 2010); ac93 e ODV-e25

(Yuan et al., 2011).



Em estudos mais recentes com o baculovírus AcMNPV, Marek et al.(2013) detectaram

a proteína FLAG-VP1054 com uma banda de 43kDa na fração do nucleocapsideo e a proteína

VP39 que é considerada o componente mais abundante dos nucleocapsideos.

Tabela 2.1 - Principais proteínas codificadas por ORFs localizadas nas extremidades

dos clones de SfMNPV-19.

Função Proteína

Proteínas

Estruturais

Ligação do virion na

superfície celular, penetração,

aquisição do envelope viral

Polh, envelope protein, ODV-E66,

p87, glycoprotein 41 kD, vp1054,

vp39, p74, orf1629

Proteínas não

estruturais

Metabolismo de nucleotídeos

Replicação

Expressão viral

Auxiliares

Ribonucleotide reductase large

subunit-1

Dnapol, alcaline exonuclease,

helicase

lef-4, lef-8, p47, lef-6, 39k e ie-0

Catepsina e EGT

(Fonte: Oliveira, 2006).

A proteína VP1054 pode ser encontrada nos dois fenótipos, BV e ODV e é essencial

para a montagem do nucleocapsídeo (Marek et al., 2013). Neste estudo, os autores também

demonstraram que todos os homólogos de VP1054 foram reconhecidos em vírus da família

Baculoviridae e todos os baculovírus sequenciados possuem um gene vp1054. Na Figura 2.3,

estão mostradas todas as principais linhagens de baculovírus, indicando que um gene vp1054



estava presente em um antepassado dos baculovírus atuais como também exibe a subdivisão

dos NPVs específicos de lepidópteras de acordo com os estudos filogenéticos de baculovírus

utilizando o gene da poliedrina e posteriormente outros genes conservados (Zanotto et al.,

1993). Desta forma, cada grupo apresenta proteína de envelope responsável pela fusão do

vírus com a célula hospedeira específica: no grupo I, a glicoproteína GP64 e no grupo II, a

proteína F (Herniou et al., 2003; Monsma et al., 1996; Pearson et al., 2000).

Gerk et al.(1997) através de eletroforese em géis de poliacrilamida-SDS com partículas

virais de AgMNPV e SfMNPV detectaram uma banda majoritária presente nas partículas de

AgMNPV com peso molecular de 33 KDa e uma banda mais fraca, um pouco inferior, com

31 KDa. Análogo ao AgMNPV, os poliedros de SfMNPV, revelou-se uma nítida banda de 32

KDa.

A poliedrina de diversos baculovírus varia entre 28 KDa e 33 KDa (Summers & Smith

1978), portanto, a proteína de 33 KDa, do AgMNPV, e a proteína de 32KDa, do SfMNPV são

poliedrinas, por se encontrarem em maiores concentrações e possuírem peso molecular

característico desse grupo de proteínas (Gerk et al., 1997). Ainda mostraram-se presentes

neste estudo, proteínas na região de 15,5 KDa a 24 KDa em poliedros de AgMNPV e

proteínas de peso molecular variando entre 14,5 KDa e 28 KDa para poliedros de SfMNPV.



Figura 2.3. Reconstrução filogenética das sequências proteicas VP1054 dos baculovírus.

Todas as sequências homólogas de VP1054 reconhecível foram alinhadas. Números entre

parênteses são os números de acesso do GenBank. Quadrados de cor em cada uma das

estirpes de baculovírus indicam a classificação dos baculovirus. (Fonte: Marek et al., 2013).



2.1.3. Análise das proteínas virais

O avanço tecnológico nos estudos de proteínas no decorrer dos anos de 1980 a 1990

permitiu elevada ampliação das técnicas de estudo das proteínas (Chung, 2007). Como por

exemplo, no âmbito vegetal, estudos de análise de proteínas têm trazido relevantes

contribuições, principalmente no que diz respeito a plantas de interesse econômico como o

milho, trigo, batata e arroz (Rossignol et al., 2006).

Quando se trata de processo de infecção viral, os estudos são caracterizados por diversas

proteínas virais a depender do tipo de baculovírus utilizado, as partículas virais, ODV e BV,

envolvidas no processo de infecção e apresentam fenótipos distintos (Wang et al., 2010),

possuindo, então, conjuntos protéicos diferentes. Embora BVs e ODVs tenham a estrutura dos

nucleocapsídeos comum e transportarem informações genéticas idênticas, eles diferem na

composição protéica de seus envelopes (Yuan et al., 2011).

Na análise bioquímica, proteínas estruturais do vírus são usualmente determinadas e

identificadas por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) que separa

as proteínas em um campo elétrico, de acordo com o tamanho das moléculas (Laemmli,

1970).

2.2. Metodologia Experimental

2.2.1. Linhagem de células e vírus

As células utilizadas neste trabalho foram da linhagem de células de inseto IPLB-SF21

(American Type Culture Collection, MD) cedidas pela Embrapa – Recursos Genéticos e

Biotecnologia (Cenargen), adaptadas ao meio de cultura em suspensão SF900II® SFM

(Serum Free Medium) (GIBCO). As células foram cultivadas em frascos Erlenmeyers de 125

mL (Schott), com volume de suspensão de 50 mL em cada frasco, em incubadora rotativa

refrigerada (Tecnal – TE421), com agitação controlada de 120 rpm e 28ºC e sua manutenção

realizada a cada três ou quatro dias de cultivo. A concentração celular foi estimada utilizando

um microscópio fase-contraste (Olympus, Japão) e um hemocitômetro, modelo Neubauer



(Bright-Line Hemacytometer Sigma), dada conforme a Equação (1) em cada amostra. A

contagem foi realizada em triplicata, com erro em torno de 15% e média de 200 células

contadas em ambos os lados do hemocitômetro (Nielsen et al., 1991).

(1)

Onde:

C – concentração de células

célulasN – número de células contadas

D – fator de diluição

18x10-4

– Volume de dois lados do hemocitômetro.

Através da técnica de exclusão pela coloração com azul de tripan (Sigma-Aldrich), a

uma concentração final de 0,1% (v/v), foram determinadas a concentração de células viáveis e

viabilidade celular. As células que se tornaram azuladas devido à entrada do corante foram

consideradas não viáveis, enquanto que as células transparentes foram consideradas viáveis. A

concentração celular é expressa em células por mL (células/mL).

O baculovírus SfMNPV isolado-18, foi cedido pela Embrapa Milho e Sorgo (CNPMS),

Sete Lagoas, MG. O inóculo viral de SfMNPV, na forma de ODV (occluded derived virus),

foi obtido segundo o método de Lynn (1994). O ODV foi utilizado como inóculo para infectar

20 mL de suspensão de células Sf21 com viabilidade média de 95% e concentração de

5,3x105

células viáveis/mL. Para os demais experimentos de infecção da passagem seriada,

foram utilizados como inóculo o vírus extracelular (BV) obtido a partir da centrifugação a

1000 rpm/10 minutos de metade do volume de suspensão coletado após ter sido atingido o

estabelecimento da infecção.

As infecções foram realizadas em incubadora rotativa refrigerada (120 rpm e 28°C)

utilizando frascos Erlenmeyers de 125 mL (Schott). As concentrações de células não

infectadas e infectadas foram acompanhadas diariamente até atingir viabilidade em torno de



50%, e a concentração dos corpos de oclusão acompanhada até o final do processo de

infecção.

A contagem de OBs produzidos pelas células infectadas foi determinada utilizando

hemocitômetro e um microscópio ótico (Olympus CX40) com aumento de 400 vezes. As

células infectadas com o vírus SfMNPV foram lisadas com uma solução de 1% (p/v) de

dodecil sulfato de sódio (SDS) por 2 horas para total dissolução da membrana celular e

liberação dos corpos de oclusão. A suspensão contendo os OBs foi diluída com água

purificada (18,3 MΩ-cm) com a finalidade de permitir a contagem de 100 a 150 OBs no

quadrante central de cada lado do hemocitômetro. A contagem dos OBs também foi feita em

triplicata e a sua concentração pela Equação (2):

(2)

Onde:

COB – Concentração de OB, OB/mL.

D – Fator de diluição

MOB – Média da contagem de OB

1x10-4

– Volume de um quadrante do hemocitômetro.

O rendimento específico de OBs (OB/célula) foi calculado dividindo a concentração de

OB pela maior concentração de células totais da cultura infectada.

2.2.2. Passagem seriada

A passagem seriada do vírus SfMNPV em linhagem de células Sf21 cultivadas em meio

SF900II foi realizada por Dantas (2010). Um total de cinco passagens foram feitas em

Erlenmeyer de 125 mL (schott) com volume de suspensão 50 mL operados em incubadora



rotativa refrigerada (Tecnal – TE421) a 120 rpm e temperatura controlada a 28 ºC, seguindo

os métodos utilizados por Dantas (2010).

Na passagem 1, as células Sf21 foram inoculadas com 10% (v/v) do BV do SfMNPV

obtido da infecção com o ODV. Após o estabelecimento da infecção, metade da suspensão

infectada foi coletada, centrifugada a 1000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante (vírus

extracelular) foi usado para inocular a passagem 2. As demais passagens seguiram o mesmo

procedimento e cada sobrenadante serviu de inóculo para a passagem subsequente.

2.2.3. Preparo das amostras para as análises de eletroforese em gel

Partindo do resultado da passagem seriada do baculovírus SfMNPV descrita no item

anterior, três passagens foram selecionadas para análise de eletroforese em gel: as passagens

P1, P3 e P5. Para cada uma delas, 30 mL de acetona gelada foram adicionadas a 10 mL da

suspensão viral e sedimentada em freezer (-20 ºC) por 2 horas. Em seguida foram

centrifugadas a 16.000 g / 4 ºC em centrífuga (BECKMAN COULTER AVANTI-JE), rotor

JLA 16.250, por 1 hora. Após centrifugação o sobrenadante foi recolhido e o pellet mantido

em capela por aproximadamente 4 horas para total evaporação da acetona. Extraído toda a

acetona, o pellet foi diluído em água milliQ e armazenado em freezer (-20 ºC).

As amostras P1, P3 e P5 foram normalizadas para proteínas (30µg) e para volume

(50µL).

2.2.4. Dosagem de proteínas

As amostras P1, P3 e P5 foram diluídas nas proporções: 1:5, 1:10 e 1:20. A dosagem

colorimétrica foi realizada em placa de 96 poços. Como proteína padrão foi utilizada a

albumina e sua curva variou de 0,05 mg/mL a 0,5 mg/mL. Uma alíquota de 200 µL do

reagente Bradford foi adicionado em cada poço.

A leitura foi feita em espectrofotômetro com comprimento de onda λ= 595 nm,

utilizando a água como o branco.



2.2.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

O gel de poliacrilamida é formado por duas partes: o gel de empilhamento e o gel de

separação. O gel de empilhamento, com menor concentração de poliacrilamida e poros

grandes que permitem a migração igualitária das proteínas, independente das massas

moleculares, levando-as a empilharem-se em uma faixa estreita. Após o empilhamento, as

proteínas entram no gel de separação, cujos poros são menores, e a velocidade de migração

passa a ser dependente das massas moleculares.

Inicialmente foi realizado o gel de separação a 12% contendo: solução de acrilamida

30%, solução Tris-HCl 1,5 M e pH 8.8, TEMED, persulfato de amônio e água. O gel de

separação foi adicionado entre as placas do aparato e, para retirar bolhas, 100 μL de água

destilada foram adicionados sobre o gel. Após a polimerização, a água foi retirada e a

superfície do gel de separação foi seca.

O gel de empilhamento com menor concentração de poliacrilamida, o qual diferenciou

do gel de separação apenas o pH da solução Tris-HCl que foi 6.8, foi adicionado sobre o gel

de polimerização e, em seguida, o pente para criar os poços de aplicação foi colocado. Após a

polimerização, o pente foi retirado e o aparato contendo o gel foi submergido em tampão para

corrida dentro de uma cuba para eletroforese de proteínas (cuba SE 260 ligada ao

Electroforesis Power Supply EPS 601) (Figura 2.4).

Figura 2.4. Aparato para gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)



2.3. Resultados e Discussão

2.3.1. Dosagem de proteínas através do método de Bradford

A Figura 2.5 mostra que em neste estudo de quantificação de proteínas realizada pelo

método de Bradford houve redução nas proteínas após as passagens (P1, P3 e P5) de

SfMNPV. Foi possível observar uma alteração no padrão quantitativo com redução gradual da

proteína total.

P1 P3 P5

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

mg

/ m

L

Passagem seriada

Figura 2.5. Dosagem de proteína total da passagem seriada de SfMNPV.

Observando a dosagem de proteínas através do método de Bradford, foi verificado que

houve redução de proteína viral no decorrer da passagem seriada do baculovírus SfMNPV. As

passagens P3 e P5 tiveram perda proteica de 18% e 51%, respectivamente, em relação à

passagem inicial P1.

0,82

0,68

0,40



2.3.2. Análise das proteínas do vírus extracelular (BVs) através de

eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS

O perfil eletroforético das proteínas do vírus extracelular (BV) do baculovírus SfMNPV

é apresentado na Figura 2.6.

Figura 2.6. Análise de proteínas estruturais de SfMNPV. Eletroforese em gel de

poliacrilamida – SDS 12%; M – marcador de peso molecular; P1 – Passagem seriada 1; P3 –

Passagem seriada 3; P5 – Passagem seriada 5: (normalizada para 30µg de proteína); P1’ –

Passagem seriada 1; P3’ – Passagem seriada 3; P5’ – Passagem seriada 5 (normalizado para

volume de 50µL).

A coloração com azul de “Coomassie” revelou um padrão diferencial de expressão

protéica entre as três passagens, sendo a P3 a que apresentou maior diferença quanto ao perfil

protéico. Pode-se observar uma banda majoritária com massa molecular aproximadamente a

60 KDa na passagem 3, sendo a mesma também detectada nas demais passagens, embora se



mostrasse pouco nítida. Esta proteína apresenta característica molecular semelhante à

glicoproteína GP64 (64 KDa), essencial na infectividade do vírus de célula para célula

(Monsma et al., 1996) nos baculovírus do grupo I, como por exemplo, o AcMNPV e o

AgMNPV. Porém, já se sabe que o baculovírus SfMNPV pertence aos NPVs do grupo II , os

quais não possuem GP64. No entanto, há um análogo funcional para as proteínas do envelope

que estão envolvidas no processo de ligação e ativação dos baculovírus do grupo I. O

conjunto destas proteínas foi denominado de proteínas F (Lung et al., 2002; Westenberg et

al., 2004).

A poliedrina com aproximadamente 30 KDa foi destacada em todas as passagens

analisadas. Fato esperado devido à produção de poliedrina ser imprescindível na formação do

corpo de oclusão, característica do baculovírus estudado. A mesma corresponde cerca de 95%

do conteúdo protéico do poliedro (Maruniak, 1986).

Bandas com pesos moleculares de 14,4 KDa ainda foram detectadas nas três passagens

com melhor nitidez nas passagens P1 e P5 e outra com aproximadamente 97 KDa visualizada

na passagem P5. Ainda na passagem P5 foi visto uma banda com peso molecular próximo a

45 kDa similar a proteína identificada como Flag-VP1054 com 43 KDa, importante no

processo de infecção, detectada por Marek et al. (2013) no nucleocapsídeo do baculovírus

AcMNPV.

Em comparação com a literatura, observa-se que diversos autores identificaram

proteínas em sistemas células / vírus. Chung (2007) identificou na infecção das células vero

com o vírus da dengue sorotipo 2, as proteínas diferenciais, GP96 e enolase, proteínas

exclusivas da infecção. Wang et al (2010) observou através da espectrometria de massa e

cromatografia líquida três proteínas mais abundantes do BV de AcMNPV: GP64, VP39, e

P69. Porém, um total de 34 proteínas virais foi identificado pelos métodos associados.

Também, Yuan et al (2011) identificaram em suas pesquisas com AcMNPV as proteínas ac93

e ODV-e25 e demonstraram que a proteína ac93 afeta a produção de BV. Braconi (2014),

estudando a proteômica do baculovírus AgMNPV-2D, identificou 33 proteínas estruturais em

seu BV. Destas, sete novas proteínas foram associadas a este fenótipo, previamente

desconhecidas nos dois proteomas disponíveis da família Baculoviridae.



2.4 Conclusões

Através da eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS foram detectadas algumas

proteínas presentes no vírus extracelular (BVs). A poliedrina foi destaque em todas as

passagens analisadas. Fato já esperado, uma vez que esta proteína é essencial na formação do

corpo de oclusão do baculovírus em estudo. Proteínas F e outras proteínas na região entre 14,4

e 97 KDa também foram encontradas neste estudo.

Capítulo 3

Adição de ecdisona na produção do

baculovírus SfMNPV

Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 43


Capítulo 3.

Adição de ecdisona na produção em batelada do

baculovírus SfMNPV

Este capítulo descreve a influência da adição do hormônio ecdisona na produção de

corpos de oclusão (OB) do baculovírus SfMNPV isolado-18, como processo alternativo para

o aumento da produtividade do bioinseticida viral, em escala industrial. A produção in vitro

do baculovírus SfMNPV foi avaliada após a adição ao meio de cultura, separadamente, de

dois tipos de hormônios ecdisona: um extraído do Ginseng brasileiro denominado de

ecdisona natural e o outro o ecdisona comercial 20-Hidroxiecdisona.


3.1.2. Otimização da produção in vitro de baculovírus

Diferentes tipos de sistemas podem ser utilizados para a produção de baculovírus em

células de inseto, desde cultivo em monocamadas (estático) como cultivos em suspensão

utilizando frascos Erlenmeyers, spinners ou biorreatores. Isso se deve aos avanços na área de

cultivo celular. A temperatura de 28 ºC é ótima tanto para o crescimento celular quanto para a

infecção das células Sf9 e Sf21, embora, a maioria das células de inseto poder ser cultivada

numa faixa de 25 a 30 ºC (King & Possee, 1992).

A escolha do processo de produção, bem como, o modo de operação dos sistemas de

produção é de grande importância para obtenção de altos rendimentos com custo efetivo e

visando uma possível ampliação de escala (Almeida et al., 2010).



O desenvolvimento de um processo de produção, seja de proteínas recombinantes ou de

baculovírus, utilizando células animais, exige conhecimento detalhado das suas necessidades

nutricionais e de seu comportamento metabólico, bem como a seleção de uma estratégia de

cultivo específico: como batelada, batelada-alimentada ou de perfusão (Gioria et al., 2006).

Alguns autores têm estudado diferentes estratégias para aumentar a produção in vitro de

baculovírus. Almeida (2010) estudou a produção in vitro de baculovírus através do cultivo em

suspensão de corpos de oclusão de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus e de

seu recombinante denominado vAgEGT∆-LacZ, analisando o aumento da produção em dois

sistemas de cultivo: batelada e batelada-alimentada. Como resultado, a autora verificou

aumento de produção de quatro vezes nos sistemas em batelada-alimentada com adição de

nutrientes, quando comparados ao sistema de produção em batelada simples.

Ainda considerando o aumento da produtividade, Dantas (2010) atingiu uma produção

de 1,9 x 108 OB/mL utilizando o sistema em suspensão do Spodoptera frugiperda MNPV, em

células Sf21 com adição de adjuvantes. Em ambos os estudos, a utilização de diferentes

estratégias de cultivo, seja pela adição de nutrientes e/ou substâncias ou o modo de operação

do sistema, resulta em aumento de produção, demonstrando ser uma alternativa interessante

para a otimização da produção de cultivos em suspensão de bioinseticidas virais.

3.1.2.1. Hormônio 20 – Hidroxiecdisona

Alternativas vêm sendo propostas com a intenção de minimizar as barreiras que ainda

deixam a produção in vitro de baculovírus não competitiva em relação à sua produção em

escala industrial. A perda de virulência ao longo das passagens sucessivas em cultivos

celulares configura o principal impedimento para a produção de baculovírus em larga escala.

A inserção de algumas substâncias que favoreçam o cultivo e o modo de conduzir o processo

in vitro é importante para o sucesso na produção. O hormônio 20-HE é uma destas

substâncias que vem sendo estudadas com a finalidade de se obter sucesso na produção de

baculovírus (Dantas, 2010).

A ecdisona está relacionada ao crescimento, ao desenvolvimento e à apólise (separação

da cutícula antiga da epiderme subjacente). Este hormônio ocorre em todos os grupos de



insetos estudados, crustáceos e aracnídeos, e provavelmente é o hormônio de muda de todos

os artrópodes. Também desempenha um papel na diferenciação dos ovaríolos e das glândulas

reprodutoras acessórias nas fêmeas e em várias etapas do processo de produção de ovos

(oogênese). A ecdisona também é produzida nos ovários dos insetos em um par de glândulas

do protórax (Triplehorn & Johnson, 2013).

O hormônio ecdisona é chamado de reguladores do crescimento de insetos (IGRs) e

compromete apenas o desenvolvimento e o crescimento dos insetos, sem causar danos a

organismos vertebrados (Graf, 1993; Mulla, 1995). A adição deste hormônio bloqueia o

processo de muda, ou seja, o inseto continua no estágio larval. As formas sintéticas da

ecdisona apresentam eficiência como agentes de controle de algumas populações de insetos,

induzindo a inibição da alimentação e mortalidade larvar (Dhadialla et al., 1998). Estes

compostos se mostraram eficazes contra lepidópteras (Hu et al., 2001).

O processo de muda dos insetos é regulado pela variação das concentrações de 20-HE

(Dhadialla et al., 1998). O crescimento e o desenvolvimento adequado dos insetos dependem

da concentração de 20-HE em vários estágios de diferenciação (Chapman, 1998). A adição

deste hormônio permite aumento considerável da produção de proteínas recombinantes e de

corpos de oclusão utilizando o processo em batelada (Chan et al., 2002; Dantas, 2010).

O 20-HE é a forma fisiologicamente ativa da ecdisona na maioria das espécies (Hubber

& Hoppe, 1965). Além de ser considerado o principal agente indutor da metamorfose nos

insetos (Dinan, 2001), é também o ecdisteroide encontrado em maior concentração, tanto em

plantas como em insetos (Savchenko et al., 1998; Dinan, 2001). Este

hormônio ativo resulta da ecdisona (Figura 3.1) que é um pró-hormônio polihidroxilado

(Chapman, 1998), inicialmente isolado a partir da pupa da mariposa. É considerado agente da

regulação dos processos de modulação da expressão dos genes relacionados ao ciclo da muda

(Shecther et al., 2007).



Figura 3.1. Estrutura química da beta-ecdisona (Fonte: Debien et al., 2014).

Nas plantas, o hormônio 20-HE pode ser isolado a partir de raízes glomerata. A Pfaffia

glomerata (Figura 3.2) é uma planta medicinal conhecida no Brasil como Ginseng brasileiro

(Debien et al., 2014), assim chamada devido ao formato de suas raízes serem parecidas com

as do Ginseng Coreano (Panax ginseng C.A. Meyer) (Calgaroto, 2009).

A Pfaffia glomerata pertence ao gênero Pfaffia sendo a espécie de maior destaque

medicinal e comercial deste gênero (Vigo et al., 2003; Figueiredo et al., 2004; Zimmer et al.,

2006). A atuação adaptógena da Pfaffia associa-se, sobretudo, à presença do ecdisteróide β-

ecdisona (Vigo et al., 2003).



Figura 3.2. Aspecto geral de Pfaffia glomerata (Marques, 1998).

Há vários anos o Ginseng brasileiro é utilizado em países asiáticos como medicamento

de cura e tônico. São em suas raízes tuberosas (Figura 3.3) que se encontram as saponinas, as

quais exercem inúmeros efeitos sobre o sistema imunológico e estresse (Leal et al., 2010). A

principal saponina presente nestas raízes de P. glomerata é a β-ecdisona (CAS n° 8047-15-2)

(Shiobara et al., 1993). Freitas et al. (2004) também confirmaram a presença significativa de

β-ecdisona nas raízes de P. glomerata.



Figura 3.3. Aspecto das raízes de Pfaffia glomerata (Fonte: http://www.nativas.com.br).

Estudos farmacológicos e medicinais têm demonstrado que as raízes de Ginseng

brasileiro apresentam propriedades analgésicas, anti-inflamatórias e antireumáticas (Neto et

al., 2005), anti-glicêmico ( Sanches et al., 2001), anti-microbianas (Neto et al., 2004), dentre

outros. Portanto, considerando os atributos de promoção a saúde humana, este hormônio β-

ecdisona extraído da raiz do Ginseng brasileiro, tem um grande potencial como aditivo

alimentar na produção de alimentos nutracêuticos (Debien et al., 2014). Porém, um aspecto

negativo destas saponinas é que a ingestão em grandes quantidades demonstrou, por vezes,

causar perturbações gástricas, incluindo náuseas e dores de estômago (Shyobara et al., 1993).

Quando se trata do composto 20-HE encontrado nos insetos, o mesmo não é produzido

por linhagens de células de inseto desenvolvidas a partir do tecido ovariano, como por

exemplo, as linhagens Sf21, Sf9 e T.ni (Lynn et al., 1987).

Sarvari et al. (1990) demonstraram a eficácia da adição de 20-HE no aumento da

produção de proteínas recombinantes utilizando baculovírus como vetor. A adição de 2g de

20-HE/mL de meio de cultivo obteve um aumento na concentração da proteína, enquanto que

a adição de 10g de 20-HE/mL foi inibitória. Isto quer dizer que a concentração do hormônio

é um fator importante na otimização do processo.

http://www.nativas.com.br/



Chan et al. (1998), otimizaram o processo para produção da proteína recombinante β-

galactosidase através da adição de nutrientes (aminoácidos, lipídios, glicose e extratos de

levedura) em culturas de células Sf9 em meio de cultivo SF900II (Invitrogen, USA).

Posteriormente, Chan et al. (2002) testando o processo de batelada alimentada para produzir a

glicoproteína recombinante do vírus da dengue NS1 também conseguiram otimizar o processo

obtendo um aumento de 5 vezes quando adicionado 4 µg/mL de 20HE ao meio de cultivo.

Dantas (2010), estudando o efeito da adição de ecdisona na produção in vitro do

baculovírus Spodoptera, no sistema em batelada, obteve aumento de duas vezes na produção

volumétrica de OB em relação ao processo de infecção sem adição de hormônio.

Diante disto, propõe-se adicionar o hormônio ecdisona ao processo de infecção como

estratégia para melhorar a produção dos corpos de oclusão do baculovírus SfMNPV em

cultura de células Sf21.


3.2.1. Determinação da concentração celular e quantificação dos corpos de

oclusão (OB)

Assim como no capítulo anterior, a linhagem de células de inseto IPLB-SF21 (American

Type Culture Collection, MD) cedidas pela Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia

(Cenargen), adaptadas ao meio de cultura em suspensão SF900II® SFM (Serum Free

Medium) (GIBCO) foi utilizada nestes experimentos como também o baculovírus SfMNPV

isolado-18, foi cedido pela Embrapa Milho e Sorgo (CNPMS), Sete Lagoas, MG.

Todos os experimentos foram realizados em triplicata e apresentaram um erro médio de

5% na contagem das células e 18% na quantificação dos corpos de oclusão (OBs). A

concentração celular e a quantificação dos corpos de oclusão (OB) foram estimadas conforme

descritos no item 2.2.1 da referida tese.



3.2.2. Adição de ecdisona extraído do Ginseng brasileiro e de ecdisona

comercial

O hormônio ecdisona foi adicionado na passagem 3 e passagem 4 do processo de

produção de baculovírus SfMNPV. A adição ocorreu 24 h.p.i (horas pós infecção).

O extrato de ecdisona obtido a partir do Ginseng brasileiro foi cedido pelo Dr. Diego

Tresinari dos Santos (UNICAMP).

A concentração de ecdisona extraído do Ginseng brasileiro e do hormônio 20-HE

adquirido comercialmente adicionada aos experimentos foi de 6 µg/mL tendo como base os

estudos de Chan et al. (2002) e Dantas (2010).

3.3. Resultados e Discussão

3.3.1. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 3ª

passagem

Na Figura 3.4 são apresentados todos os perfis de crescimento das células infectadas e

não infectadas na passagem 3 dos sistemas estudados neste capítulo. O primeiro perfil mostra

o crescimento das células não infectadas a qual exerceu função de controle para as células

infectadas. No segundo perfil observou-se o crescimento das células infectadas com o

baculovírus SfMNPV na 3ª passagem; o terceiro refere-se a curva de crescimento das células

infectadas com o baculovírus SfMNPV na 3ª passagem, quando adicionado 6µg/mL de

ecdisona adquirido comercialmente e, por fim, o perfil das células infectadas com adição de

ecdisona extraída do Ginseng brasileiro na mesma concentração do hormônio adquirido

comercialmente.



0 1 2 3 4

0

1

2

3

4

5

6

7

Cé

lula

s vi

áve

is x

106

/ m

L

Tempo (dia)

Células não infectadas

Células infectadas

Células infectadas e com ecdisona comercial

Células infectadas e com extrato de ecdisona

Figura 3.4. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 3.

Como pode observar na Figura 3.4, é notória a diferenciação quanto ao crescimento das

células não infectadas em relação às células infectadas no momento em que a infecção é

estabelecida. As células infectadas e as infectadas mais a adição de ecdisona comercial

tiveram o mesmo comportamento e o estabelecimento da infecção é visível já no primeiro dia.

No processo de infecção das células mais adição de ecdisona, extraída do Ginseng brasileiro,

a estabilidade infectiva é observada no segundo dia. A adição de ecdisona foi dada 24 hpi e, a

partir de então, já houve declínio na concentração das células viáveis na infecção com o

hormônio comercial. No entanto, na infecção com o extrato de ecdisona este declínio só foi

observado no dia seguinte. As células não infectadas cresceram até 6,2 x 106± 0,3 células

viáveis / mL. Em todos os sistemas de infecção estudados as células infectadas cresceram na

ordem de 105 células viáveis / mL.

As Figuras 3.5 (A) e 3.5 (B) mostram a produção de OBs produzidos na infecção com

SfMNPV na 3ª passagem nos três sistemas estudados nos últimos três dias de infecção.

Ecdisona



INFECTADA INFECTADA+ECDISONA COMERCIAL INFECTADA+EXTRATO DE ECDISONA

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

OB

x 1

08 /

mL

Experimentos

INFECTADA INFECTADA+ECDISONA COMERCIAL INFECTADA+EXTRATO DE ECDISONA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

OB

/ c

élu

la

Experimentos

Figura 3.5. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 3ª passagem:

A) Produção volumétrica; B) Produção específica.

(B)

(A)



Observou-se que a produção média (volumétrica e específica) de OB não teve diferença

significativa nos três processos. Ao final de 10 d.p.i. (dia pós infecção) a produção de OB sem

nenhum adjuvante foi 1,34 x 10 8± 0,24 OB / mL e 122,17 ± 22 OB / célula. Enquanto que

com relação à infecção com adição do hormônio ecdisona adquirido comercialmente produziu

em torno de 1,61 x 10 8± 0,28 OB / mL e 135,42 ± 24 OB / célula. Já o hormônio extraído do

Ginseng brasileiro obteve produção de 1,41 x 10 8 ± 0,25 OB / mL e 150,56 ± 27 OB / célula.

A partir destes resultados pode-se afirmar que a 3ª passagem da infecção com

baculovírus SfMNPV atinge produção máxima e, portanto, a adição do hormônio ecdisona

não favoreceu a infecção. Esta afirmação é confirmada com o estudo da passagem serial do

baculovírus S. frugiperda MNPV em cultivo de células de inseto realizado por Dantas (2010),

que demonstrou um declínio na produção de OB apenas a partir da quarta passagem. Diante

disto, objetivando reduzir o efeito passagem e promover o aumento da produção do

bioinseticida viral nos cultivos em suspensão, foi estudado a adição do hormônio ecdisona na

4ª passagem.

3.3.2. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 4ª

passagem

A Figura 3.6 mostra as curvas de crescimento das células não infectadas, infectadas e

com adição do hormônio ecdisona nas duas formas estudadas.

Observa-se agora o mesmo comportamento das células infectadas em todos os sistemas

aqui estudados. Pode-se perceber que a infecção foi estabelecida no primeiro dia e a

concentração de células viáveis foi praticamente a mesma em ambos os processos de

infecção, em torno de 6,0 x 105 ± 0,30 células viáveis / mL. Contudo, o comportamento

identificado em todos os processos infectivos deste trabalho, tanto na passagem 3 como na

passagem 4, foi na diferenciação das células não infectadas e infectadas independentes da

adição de ecdisona. Portanto, tal ação evidencia a capacidade infectiva do SfMNPV – isolado

18 na linhagem de células Sf21 (Barreto et al., 2005).



0 1 2 3 4

0

1

2

3

4

Cé

lula

s vi

áve

is x

106 /

mL

Tempo (dia)

Células não infectadas

Células infectadas

Células infectadas + ecdisona sintético

células infectadas + extrato de ecdisona

Figura 3.6. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 4.

A influência do hormônio ecdisona somente foi observada na produção de Obs (Figura

3,7). Porém, não houve diferença significativa entre o hormônio adquirido comercialmente e o

hormônio extraído do ginseng brasileiro. A produção de OB foi acompanhada diariamente até

10 d.p.i.

Pelas Figuras 3.7 (A) e (B) percebe-se que, exceto no sexto dia de infecção, a adição do

hormônio favoreceu a produção de OB.

Tal fato significa que o hormônio ecdisona tem influência positiva na produção de

corpos de oclusão (OB) já que sua adição a uma concentração de 6µg/mL aumentou em

aproximadamente duas vezes a produção volumétrica e específica de OB em relação ao

processo de infecção sem adição de hormônio, a qual passou de 7,01 x 107

OB/mL e 86,28

OB/célula para 1,33 x 10 8 e 168,65 OB/célula; e para 1,28 x 10

8 OB/mL e 171,29 OB/célula

(hormônio comercial e hormônio extraído do Ginseng brasileiro, respectivamente).

Ecdisona



2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

2,1

OB

x 1

08 / m

L

Tempo (dia)

INFECTADA

INFECTADA + ECDISONA COMERCIAL

INFECTADA + EXTRATO DE ECDISONA

2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

OB

/ c

élu

la

Tempo (dia)

INFECTADA

INFECTADA + ECDISONA COMERCIAL

INFECTADA + EXTRATO DE ECDISONA

Figura 3.7. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 4ª passagem:

A) produção volumétrica; B) produção específica.

(A)

(B)



Estes resultados confirmam os valores encontrados por Dantas (2010) mostrando que

com esse sistema estudado é possível diminuir o efeito do acúmulo de mutantes FP que tem

como principal característica o rápido declínio na produção de corpos de oclusão (OB).

Efeitos sobre o aumento na produtividade viral ou de proteínas recombinantes, usando o

baculovírus como vetor de expressão observado quando se adicionou adjuvantes ao meio de

cultivo há anos vêm sendo estudados.

Belloncik et al. (1997), constataram que o colesterol, quando adicionado ao meio de

cultivo, melhorou a morfologia da membrana dos corpos de oclusão de Galleria mellonella

(GmNPV). Chernomordik et al. (1995), investigando a infecção de células Sf21 com o

baculovírus AcNPV observaram que houve replicação deste baculovírus quando o meio de

cultivo foi suplementado com lipídios. Meghrous et al. (2010) afirma que soluções lipídicas

são importantes no aumento de produtividade de proteínas recombinantes utilizando

baculovírus como vetor (BEVS).

Ainda em relação ao aumento na produção de proteínas recombinantes utilizando

baculovirus como vetor de expressão, Sarvari et al. (1990) também obtiveram aumento da

produção quando adicionaram o hormônio 20-HE ao meio de cultivo. Chan et al. (2002) e

Chan et al. (1998) otimizaram o processo de batelada alimentada para produção da

glicoproteína recombinante do vírus da dengue NS1 e da proteína recombinante β-

galactosidase, respectivamente, através da adição de nutrientes. Do mesmo modo, Almeida

(2010), visando o aumento da produção de OBs do baculovírus recombinante vAgEGT∆-

LacZ também obteve sucesso quando adicionou nutrientes ao meio de cultivo no processo de

produção em batelada alimentada.

Desta forma, é possível afirmar que a presença de adjuvantes no processo de infecção

viral é apresentada como fator importante no que se refere ao aumento de produção como

também no estímulo ao crescimento celular (Goodwin, 1990; Wilkie et al., 1980) e na

formação dos poliedros.



3.4 Conclusões

O hormônio ecdisona não influenciou a produção do baculovírus SfMNPV na terceira

passagem por não provocar efeito na quantidade de partículas virais devido a formação de MP

(muitos poliedros). Tal fato mostra que é na passagem 3 onde ocorre a maior produção de

OBs sendo assim, inviável a adição de adjuvantes para aumento da produção viral de

baculovírus.

A adição, na quarta passagem, do hormônio ecdisona comercial como também o

hormônio extraído do Ginseng brasileiro elevou cerca de 2 vezes a produção dos corpos de

oclusão com relação a produção do baculovírus SfMNPV durante a passagem seriada sem

adição de adjuvantes.

Este resultado mostra a influência positiva do hormônio ecdisona na produção de MP,

reduzindo o efeito do acúmulo de mutantes FP. Esta influência pode estar relacionada à

suscetibilidade das células Sf21 a retenção do composto 20-HE permanecendo mais robustas

e viáveis por um tempo mais prolongado que as células infectadas isentas do hormônio. Fato

observado na morfologia das células durante o processo de infecção.

Capítulo 4

Modelagem matemática e simulação da

produção de baculovírus SfMNPV

Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 59


Capítulo 4.

Modelagem matemática e simulação da produção de

baculovírus SfMNPV

Neste capítulo, serão apresentados e discutidos os resultados da modelagem matemática

e simulação da produção de baculovírus SfMNPV em células de inseto Sf21 sob os efeitos de

ecdisona comercial e do extrato de ecdisona.


A cinética de um processo biotecnológico é representada pelo comportamento de

parâmetros que são relevantes para o cultivo, tais como crescimento celular, formação de

produtos, sejam primários ou secundários, consumo de substratos e suplementação de

nutrientes que associados descrevem um modelo característico.

Ao se adotar um modelo cinético para descrever o crescimento celular e a formação de

produtos, algumas simplificações estão embutidas. As estruturas celulares podem ser

consideradas como não estruturadas ou estruturadas. Caso as variáveis intrínsecas das células

sejam consideradas inalteradas ou em estado pseudo-estacionário, a própria célula pode ser

considerada como não estruturada e pode ser representada por uma única variável como

massa celular ou número de células. Sendo este modelo, pela dificuldade em obter parâmetros

cinéticos intrínsecos, o mais comumente utilizado na modelagem de processos fermentativos.

No entanto, quando as estruturas internas das células são descritas em detalhes, então os

modelos cinéticos são denominados modelos estruturados (Power et al., 1994).



Os modelos podem ainda ser denominados de segregados ou não segregados (Figura

4.1) que resume os principais tipos de modelos aplicados na descrição do metabolismo

celular, segundo a classificação proposta por Tsuchiya et al.(1966).

Figura 4.1 Classificação de modelos (Fonte: Augusto et al., 2008 baseado em

Tsuuchiya et al., 1966 e Bailey & Ollis, 1986)

No processo de modelagem matemática a etapa crucial é a formulação do modelo, visto

que a modelagem matemática busca desempenhar ampla rede de reações bioquímicas

múltiplas controladas por regimes complexos de regulação, que geram adaptações das células

às variações nas condições de cultivo. A complexidade desse metabolismo celular foi

abordada levando em consideração as limitações de recursos e as necessidades de

informações para a representação dos processos.

Desta forma, os modelos são ditos segregados e não estruturados quando consideram o

cultivo celular como uma população heterogênea, com as células individuais caracterizadas

por idade, massa ou tamanho. Essa variação de propriedades segue modelos estatísticos de

distribuição. Devido a isto, os modelos de balanço populacional (PBM – population balance

heterogêneas



models) é o meio mais pragmático de tratar a heterogeneidade da população. PBM são os

modelos que causam maior complexidade matemática, pois as equações que descrevem a

população precisam considerar que as propriedades variam na população e ao longo do tempo

de cultivo. Nesse caso, a descrição matemática utiliza equações diferenciais parciais.

Enquanto os modelos não segregados e estruturados são aqueles que consideram a população

celular como homogênea no que se refere à idade, tamanho e massa, porém, as estruturas

intracelulares são discriminadas, de forma que cada célula representa uma estrutura

heterogênea (Augusto et al., 2008).

Nos modelos segregados e estruturados são consideradas as populações de células

heterogêneas e células como estruturas heterogêneas, representando, assim, a diversidade de

estados fisiológicos e as várias estruturas e as vias metabólicas a elas relacionadas. A

complexidade envolvida na formulação matemática e na determinação de parâmetros faz com

que esses modelos sejam pouco utilizados, apesar de possibilitarem uma representação bem

realista dos cultivos. Já os modelos não segregados e não estruturados diferenciam dos

modelos segregados e estruturados por permitirem uma visão macro do comportamento

celular. A população celular é considerada homogênea, isto é, todas as células da cultura se

comportam da mesma forma (Augusto et al., 2008).

A formulação de um modelo matemático deve possuir um comprometimento entre grau

de complexidade razoável e solução (esforço computacional) economicamente desejável. Por

sua vez, a simulação do processo corresponde a sua análise (por exemplo, sua otimização)

através da utilização do modelo matemático proposto (Bonomi & Schmidell, 2001).

Levando em consideração as informações acima referenciadas foi formulado um

modelo para o referido estudo da modelagem e simulação da estratégia de otimização para

produção in vitro de baculovírus SfMNPV proposto neste trabalho.



= velocidade específica de morte celular intrínseca, kd1

= crescimento da população por replicação.

4.2. Definição das equações matemáticas

4.2.1. Concentração de células viáveis não infectadas

O balanço material de células viáveis não infectadas, Nu (células/mL), é o resultado de

três contribuições (Equação 3). A primeira delas representa a velocidade de adsorção dos

vírus nas células de inseto em suspensão, ou seja, compreende a conversão das células não

infectadas em células infectadas (Roldão et al., 2007). O segundo termo trata-se da velocidade

específica de morte celular intrínseca, kd1, e o terceiro termo está ligado ao crescimento da

população por replicação.

1

1ua u t d u u

dNk N V k N N

dt MOI

(3)

Onde os termos:

Nu = balanço material de células viáveis não infectadas (células/mL)

ka = coeficiente de ataque viral

Vt= concentração viral

kd1 = velocidade específica de morte celular intrínseca

MOI = multiplicidade de infecção

µ = velocidade específica de crescimento

A velocidade específica de crescimento da população viável não infectada, μ (hpi-1

),

leva em conta, ainda que de maneira simplificada, a idade da célula e a concentração de

nutrientes. Desta forma, foram definidos valores diferentes de μ em dadas situações do

= velocidade de adsorção dos vírus nas células de inseto em suspensão



cultivo, sendo necessários dois parâmetros (τexp e τest) que se referem às etapas de crescimento

exponencial, estacionário e morte celular (Equação 4).

max exp

1 exp est

est

, para

, para

0, para

d

t

k t

t

(4)

4.2.2. Concentração de células viáveis infectadas

O balanço material da população de células viáveis infectadas, Ni (célula/mL), possui

dois termos. O acréscimo de células infectadas é dado pela velocidade de adsorção dos vírus

nas células viáveis não infectadas e o segundo termo trata-se da velocidade de morte celular

(Equação 5).

As células Sf21 infectadas, no que diz respeito à morte celular, podem exibir dois perfis

distintos. Em um primeiro instante a concentração de células decai por meio de eventuais

lesões na membrana plasmática, expresso pela velocidade de morte celular intrínseca. No

estágio de infecção tardia as células infectadas são rompidas para liberação dos OBs, sendo

caracterizado pelo aumento da velocidade de morte celular, dado pelo acréscimo da constante

kd2 (hpi-1

). Na fase muito tardia, quando a liberação de OBs foi cessada, a velocidade de morte

celular específica é associada apenas a constante kd1 (hpi-1

) (Equação 6).

1ia u t d i

dNk N V k N

dt MOI

(5)

1 early

1 2 early late

1 late

, para

, para

, para

d

d d d

d

k t

k k k t

k t

(6)



= acréscimo de células infectadas

Onde os termos:

Ni = balanço material da população de células viáveis infectadas (célula/mL)

4.2.3. Concentração de células não viáveis

A variação da população de células não viáveis, Nnv (célula/mL), está ligada às

contribuições de morte celular das células viáveis não infectadas e das células viáveis

infectadas (Equação 7).

1nv

d u d i

dNk N k N

dt (7)

Onde os termos:

Nnv= variação da população de células não viáveis(célula/mL)

4.2.4. Concentração viral

A concentração viral, V (OB/mL), durante o cultivo é o resultado de sua formação na

fase tardia e sua não formação na fase muito tardia. A produção de OBs foi considerada como

uma velocidade dependente da concentração de células viáveis infectadas (Power et al.,

1994). O termo α pode ser definido como a velocidade específica de formação de OB, cujo

= morte celular das células viáveis não infectadas

= células viáveis infectadas.

= velocidade de morte celular



valor varia de acordo com os estágios de infecção. No estágio tardio α tem valor fixo e

positivo, já nos dois outros estágios o termo assume valor nulo. A não formação dos OBs

também foi considerada no processo de infecção, mais especificamente no estágio muito

tardio, e é governada pela velocidade de decomposição de primeira ordem, kdV (hpi-1

).

i dV

dVN k

dt (8)

early

early late

late

0, para

', para

0, para

t

t

t

(9)

late

late

0, para

', para dV

dv

tk

k t

(10)

Onde os termos:

V = concentração viral (OB/mL)

4.2.5. Estimação de parâmetros do modelo

Os modelos matemáticos são compostos de conjunto de equações algébricas e/ou

diferenciais que estabelecem relações entre as variáveis independentes e as variáveis

dependentes. Algumas destas variáveis não podem ser medidas e elas são chamadas de

parâmetros do modelo. Em problemas não lineares, como é o caso dos modelos bioquímicos,

= formação de OB na fase tardia

= não formação de OB na fase muito tardia.

V



a estimação dos parâmetros pode ser realizada pela soma ponderada dos quadrados dos

desvios entre os valores experimentais e os valores preditos (Schwaab et al., 2008; Zhao et

al., 2013).

A estimação de parâmetros de um modelo pode ser realizada por duas abordagens:

determinística ou heurística. Os algoritmos de estimação determinística como Gauss-Newton,

Levenberg-Marquardt, e outros, se baseiam no cálculo de derivadas ou aproximações destas

para guiar a resposta para o mínimo. Apesar da rápida convergência, estes métodos sofrem

com problemas multimodais (problemas com mais de um ponto de máximo ou de mínimo).

Por outro lado, nos métodos metaheurísticos a estimação é feita de maneira “aleatória

orientada” com várias avaliações simultaneamente, o que aumenta o esforço computacional.

Eles exploram de modo multidimensional o espaço fornecido e não se prendem a máximos ou

mínimos locais, aproximando-se da otimalidade dentro de suas limitações (Schwaab et al.,

2008; Colaço et al., 2006).

4.2.6. Algoritmo de otimização por enxame de partículas

A otimização por enxame de partículas (PSO) é um algoritmo iterativo de busca

inspirado na movimentação agrupada de organismos. Nele, a busca no espaço

multidimensional é realizada pelo ajuste da trajetória de vetores individuais chamados

partículas que, assim como os seres vivos, trocam experiências entre si visando obter

vantagem evolutiva (Giordano et al., 2013; Dhanarajan et al., 2014). A atualização da posição

e da velocidade da partícula p na direção de busca d é feita conforme as Equações 11 e 12:

,

1, 1 1 , , 2 2 ,p d

globk k ind k kp d p d p d p ddv w v c r x x c r x x

(11)

1 1, , ,

k k kp d p d p dx x v (12)



Onde:

p representa uma partícula,

d =a dimensão de busca,

k = o número da iteração,

v = a velocidade da partícula,

x = a posição atual da partícula,

xind

= a melhor posição da partícula,

xglob

= a melhor posição obtida pelo enxame.

w, c1 e c2 são os parâmetros peso inicial, cognitivo e social, respectivamente.

Os termos r1e r2 tratam-se de dois números randômicos da distribuição uniforme na faixa de 0

a 1.


4.3.1. Formulação do Modelo

4.3.1.1. Considerações do modelo

Excesso de nutrientes: o meio de cultivo dispõe de nutrientes suficientes para

crescimento celular e produção viral;

Modelo segregado e não estruturado: a população das células de inseto foi dividida

em viável e não-viável e em infectada e não-infectada. Apesar disto, detalhes

metabólicos das células foram suprimidos;

Infecção sincronizada: valores intermediários da multiplicidade de infecção

possibilitam que algumas células de inseto não sejam infectadas e permaneçam com

seu metabolismo original;

Divisão de estágios de infecção: No modelo, a infecção foi retratada pela sequência de

etapas inicial, muito tardia e degradativa. Elas correspondem biologicamente à



adsorção de vírus em células e na reprogramação das células para replicação viral,

produção de OBs e decaimento viral (Figura 4.2).

Figura 4.2. Fases na trajetória de vírus e a produção de proteína de uma suspensão de células

infectadas com baculovírus recombinante. A fase latente, a fase de produção, e a fase de

decaimento (Fonte: Power, 1993).

Onde:

P1 = produção final (vírus ou proteína)

P0 = produção inicial (vírus ou proteína)

τINF = tempo inicial do processo de produção

τPC = tempo no qual ocorre a primeira detecção do produto no cultivo (virus ou proteína)

τPE = tempo da máxima produção detectada no cultivo (virus ou proteína)

τEND = tempo final do processo de produção



Para as simulações foram utilizados os experimentos de infecção das células de inseto Sf21 com o baculovirus SfMNPV sobre o efeito da

adição de ecdisona mostrados na Figura 4.3.

0 24 48 72 96

0

1

2

3

Cé

lula

s n

ão

viá

ve

is x

105

/ m

L

Tempo (hora)

Infectada sem ecdisona

Infectada + ecdisona sintético

Infectada + extrato de ecdisona

0 24 48 72 96

2

3

4

5

6

7

Cé

lula

s v

iáve

is x

105

/ m

L

Tempo (dia)




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

OB

x 1

08/

mL

Tempo (dia)




Figura 4.3. Dados experimentais utilizados para a simulação. Concentração de células não viáveis (Nnv), (A); concentração de células viáveis (Nv), (B) e

produção de OB, (C).

(B) (A) (C)

Tempo (hora) Tempo (hora) Tempo (dia)



A Tabela 4.1 mostra as condições iniciais para os três ensaios de infecção do

baculovírus SfMNPV nas células de inseto Sf21.

Tabela 4.1. Condições iniciais dos ensaios de infecção do baculovírus SfMNPV em células de

inseto Sf21.

Variáveis Sem ecdisona Ecdisona

comercial

Extrato de

ecdisona

Nu 4,13 x 105

3,50 x 105

2,99 x 105

Nnv 8,00 x 103

1,20 x 104 1,30 x 10

4

MOI (unidade

PFU/cell)

10,00 10,00 10,00

Vt 1,88 x 109

1,88 x 109

1,88 x 109

Onde:

Nu = células viáveis não infectadas (célula/mL)

Nnv = células não viáveis (célula/mL)

MOI = multiplicidade de infecção

Vt = concentração viral (OB/mL).

Para assegurar um conjunto de parâmetros ótimos foi usada uma abordagem híbrida

para estimação dos parâmetros do modelo. Esta abordagem consiste no uso da saída de uma

técnica de estimação randômica, no caso o algoritmo PSO, como chute inicial para um

método de estimação determinística, como o algoritmo Gauss-Newton. Desta forma, partiu-se

do algoritmo PSO para ajuste das respostas nos ensaios de infecção sem hormônio ecdisona,

com hormônio ecdisona sintético e hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro.



As simulações do modelo proposto foram realizadas usando a linguagem de

programação Fortran, no software Microsoft Visual Studio. A integração numérica das

Equações 3, 5, 7 e 8 foi executada pela rotina DASSL IMSL. No algoritmo PSO foram usadas

50 partículas e 50 iterações; o peso inercial e os termos cognitivo e social foram fixados em

0,7, 1,0 e 1,0, respectivamente. A função objetivo (FO) minimizada foi do tipo mínimos

quadrados ponderados (Equação 13), que estabelece a diferença entre os valores experimental

(expiy ) e calculado (

calciy ) associada a um peso ( iw ). Os intervalos de busca do PSO para os

parâmetros do modelo foram baseados em trabalhos com sistemas de infecção semelhantes,

sendo:

ka[10-9

; 10-7

] mL.cél-1

.h-1

, kd1[10-4

; 5x10-3

] h-1

e kd2[5x10-3

; 5x10-2

] h-1

(Roldão et al.,

2007);

α[0,1; 3,5] OB.cél-1

.h-1

e kdV[10-4

; 10-2

] h-1

(Power, 1993).

Os demais: μmax[7,5x10-2

; 2,5x10-1

] h-1

,τearly[24,0; 48,0] h, τvlate[48,0; 240,0] h,

τexp[24,0; 60,0] h, τest[75,0; 150,0] h foram delimitados com base nos dados

experimentais.

2

exp calc

21

N ii

i i

y yFO

(13)

Após a calibração dos parâmetros do modelo foi realizada uma investigação acerca dos

parâmetros que mais influenciaram as respostas de concentração de células viáveis, não

viáveis e viral. Desta forma foi usada a análise da sensibilidade paramétrica conforme a

metodologia mostrada em Brun et al. (2001) e Prunescu & Sin (2013), que o cálculo da

medida δmsqr

descrita na Equação (14):

,1

1 Nmsqr

nd iki

sN

(14)



Onde:

k é o índice do vetor de parâmetros do modelo k ,

i é o índice de observações de uma saída do modelo,

N é o total de observações de uma resposta do modelo e

snd,ik é a informação adimensional da sensibilidade paramétrica individual definida por:

,i k

nd ikk i

ys

SC

(15)

Aqui ; ;nv v iy N N N V é o vetor de respostas do modelo, i

k

y

representa a

variação da resposta do modelo pela perturbação no parâmetro k , e iSC é o fator de escala

com a mesma unidade da resposta observada. Este método foi executado para os conjuntos de

parâmetros estimados pelo algoritmo PSO nos ensaios sem hormônio ecdisona, com

hormônio ecdisona sintético e com hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro,

mantendo as mesmas condições iniciais usadas na estimação. Os valores de iSC foram

retirados dos erros de medição associada a cada resposta.

Com o conjunto de parâmetros já calibrado pelo algoritmo PSO e finalizada a

sensibilidade paramétrica, os cinco parâmetros mais relevantes foram re-estimados pelo

algoritmo Gauss-Newton. O pacote computacional Estima desenvolvido na COPPE-UFRJ foi

usado para esta finalidade, buscando minimizar a função objetivo (FO) descrita igualmente

pela Equação (13). Através dele também foi possível extrair a matriz de covariância, e por

conseqüência, os desvios padrões associados a cada parâmetro.



4.4. Resultados e Discussões

4.4.1. Parâmetros estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton

Para reduzir o esforço do algoritmo PSO na estimação dos parâmetros do modelo e

evitar a correlação dos parâmetros ka, µmax e kd1, a estimação dos dois últimos foi realizada

separadamente com base nos dados do ensaio das células controle. Como se trata de um

ensaio controle não há adição de inóculo viral, de modo que os primeiros termos das

Equações 3 e 7 são nulos, o que transforma o modelo de infecção a um simples caso de

crescimento celular. Nesta estimação foi usada uma rotina baseada no método de Levenberg-

Marquardt tendo como chute inicial os valores de µmax e kd1 obtidos em Roldão et al., (2007).

As Figuras 4.4 (A) e 4.4 (B) mostram a concentração das células Sf21 viáveis e não-

viáveis ao longo do cultivo, respectivamente. A curva simulada de células viáveis se ajusta

bem aos dados experimentais seguindo o seu comportamento exponencial; no entanto, com

relação ao comportamento de células não-viáveis, foi observado um certo afastamento entre o

simulado e o experimental.

(A)



Figura 4.4. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio das células

controle. Dados experimentais(); Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto

paramétrico re-estimado (). A) Células viáveis; B) Células não-viáveis.

Após a estimação dos parâmetros do modelo com base no ensaio controle, as respostas

nos ensaios de infecção foram ajustadas através do algoritmo PSO. As respostas observadas

foram concentração de células viáveis, não viáveis e concentração viral. Nas primeiras

colunas das Tabelas 4.2, 4.3 e 4.4 estão dispostos os conjuntos paramétricos estimados pelo

algoritmo PSO para os ensaios sem ecdisona, com ecdisona sintético e com extrato de

ecdisona, respectivamente.

(B)




de infecção sem adição do hormônio ecdisona.

Parâmetros

Valores estimados

Algoritmo PSO Algoritmo Gauss-Newton

1 1mL cél hak 4,57 x 10-9

4,61 x 10-9

± 6,09 x 10-8

11 hdk 0,001 0,001

12 hdk 0,014 0,013 x 10

-2 ± 0,032 x 10

-2

1max h 0,036 0,036

1 1OB cél h 1,695 1,734 ± 6,95 x 10-1

1hdVk 0,000 2,03 x 10-8

hearly 44,0 46 ± 5,61

hvlate 218,08 218,08

exp h 58,8 58,8

est h 94,3 94,3




de infecção com adição do hormônio ecdisona sintético.

Parâmetros

Valores estimados


1 1mL cél hak 3,69 x 10-9

5,47 x 10-9

± 2,22 x 10-8

11 hdk 0,001 0,001

12 hdk 0,009 0,0098

1max h 0,036 0,036

1 1OB cél h 3,077 3,16 ± 8,64

1hdVk 0,004 0,004

hearly 55,6 35 ± 0,035

hvlate 199,69 194 ± 48,8

exp h 69,5 69,5

est h 79,1 79,1




de infecção com adição de hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro.

Parâmetros

Valores estimados


1 1mL cél hak 3,64 x 10-9

3,67 x 10-9

± 4,095 x 10-8

11 hdk 0,001 0,001

12 hdk 0,02 0,016

± 0,018

1max h 0,036 0,036

1 1OB cél h 4,907 4,66 ± 3,969

1hdVk 0,002 0,002

hearly 63,0 67,3 ± 0,011,

hvlate 170,4 170,4

exp h 73,3 73,3

est h 92,4 92,4



A velocidade específica de crescimentos (µmax) foi de 0,036h-1

, ou seja, 0,864d

-1 para os

três sistemas estudados. Tal valor é equivalente aos comparados com a literatura. Almeida et

al. (2010) obteve velocidade específica de crescimento 0, 775d-1

de células Sf9 cultivadas em

meio HyClone suplementado com soro fetal bovino, valor próximo ao encontrado por Power

et al. (1994), que também utilizando as células Sf9, obtiveram µmax= 0,672 d-1

.

Analisando a velocidade de morte celular (Kd), observou-se que as células não

infectadas (Kd1) foram iguais nos três sistemas em estudo. Em relação à velocidade de morte

celular (Kd2), percebeu-se que os valores foram aproximados em todos os casos. No entanto, a

velocidade de morte celular intrínseca das células Sf21 em todos os sistemas, kd1 = 0,001 h-1

está de acordo com estudos anteriores em células Sf9 (Dalal & Bentley, 1999; Hu & Bentley,

2000).

Após a infecção viral, a velocidade de morte celular, aqui caracterizada pelo parâmetro

Kd2, exibe algumas variabilidades em função da carga viral. Apesar de se ter semelhantes

velocidades de morte celular (kd2) nos três sistemas estudados, as infecções onde houve

adição do hormônio ecdisona tiveram maior tempo de vida e, consequentemente, maior

produção viral devido à proteção das células dada pela presença do hormônio. Tal fato foi

observado através da morfologia das células infectadas. Roldão et al. (2007), sugeriram que o

aumento na velocidade de morte celular, kd2, superior em seus estudos com a co-infecção em

relação a infecção única se deu em consequência da MOI mais elevada, o que para Licari &

Bailey (1991), uma elevada MOI provoca um decréscimo mais rápido na viabilidade celular.

4.4.2. Análise da sensibilidade paramétrica

Finalizada a primeira calibração do conjunto de parâmetros do modelo, foi realizada

uma análise de sensibilidade paramétrica (Figura 4.5), tendo como medida o valor de δmsqr

. Os

resultados de sensibilidade paramétrica indicaram que o coeficiente de ataque viral às células

viáveis não infectadas (ka) foi quem mais afetou significativamente as saídas do modelo,

possuindo elevados valores de δmsqr

nas três condições de infecção. Outros parâmetros que

obtiveram valores moderados de δmsqr

foram a taxa de morte celular específica em células

viáveis infectadas (kd2) mais visível na infecção sem hormônio, a taxa de produção viral



específica (α) e o tempo que delimita a etapa inicial (τearly). Este último, por sinal, apresenta

este comportamento nos ensaios sem ecdisona e com ecdisona extraído do Ginseng brasileiro,

mas no ensaio com ecdisona sintético seu efeito foi pouco pronunciável. Os demais

parâmetros que incluem o tempo que delimita a etapa muito tardia (τvlate), o tempo da fase

exponencial de crescimento celular (τexp) e o tempo da fase estacionária (τest) pouco afetaram

as saídas do modelo e, consequentemente, obtiveram baixos valores de δmsqr

.



4.4.2. Análise da sensibilidade paramétrica

Finalizada a primeira calibração do conjunto de parâmetros do modelo, foi realizada uma análise de sensibilidade paramétrica, tendo como

medida o valor de msqr

.

Figura 4.5. Análise de sensibilidade paramétrica do modelo matemático proposto para os ensaios de infecção de SfMNPV em células de inseto Sf21 sem

adição de hormônio ecdisona (A), com adição de hormônio ecdisona sintético (B) e com hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro (C).



4.4.3. Comportamento das respostas do modelo matemático

De maneira a eliminar parâmetros não-identificáveis e reduzir o esforço computacional

na estimação pelo algoritmo Gauss-Newton, os quatro parâmetros com maiores valores de

sensibilidade (ka, kd2, τearly e α) foram levados à re-estimação nos sistemas de infecção sem

hormônio ecdisona e com ecdisona extraído do Ginseng brasileiro. Para o sistema de infecção

com adição do hormônio sintético foram re-estimados os parâmetros ka,. α, τearly e τvlate.

Enquanto isso, os parâmetros considerados não-relevantes foram fixados nesta etapa. Os

parâmetros re-estimados e seus respectivos desvios padrões são mostrados na segunda coluna

das Tabelas 4.2, 4.3 e 4.4.

Após a simulação dos dados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-

estimado, os mesmos foram analisados juntamente com os dados experimentais e seus

comportamentos estão mostrados nas Figuras 4.6, 4.7 e 4.8 para cada sistema de infecção

estudado.



(A) (B)

Figura 4.6. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio sem hormônio ecdisona. Dados experimentais (); Dados

simulados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv) (A);

concentração de células viáveis (Nv) (B) e produção de OB (C).

(C)



(B)

Figura 4.7. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio ecdisona sintético. Dados experimentais ();

Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv) (A);

concentração de células viáveis (Nv) (B) e produção de OB (C).

(A) (C)



(A) (B) (C)

Figura 4.8. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro. Dados

experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis

(Nnv) (A); concentração de células viáveis (Nv) (B) e produção de OB (C).


Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ - UFRN

As Figuras 4.6 (A), 4.7 (A) e 4.8 (A) mostram a variação de células não viáveis

previstas e observadas das culturas de células Sf21 infectadas com o baculovírus Spodoptera

para a infecção ausente de hormônio ecdisona, a infecção com adição do hormônio ecdisona

sintético e para a infecção com adição de hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro,

respectivamente. Os modelos preditos corresponderam adequadamente com as respostas dos

dados experimentais. Este fato também é observado nas Figuras 4.6 (B), 4.7 (B) e 4.8 (B) que

representam a concentração de células viáveis dos processos de infecção examinados.

O comportamento das respostas do modelo para a produção volumétrica (OB/mL) dos

corpos de oclusão é mostrado nas Figuras 4.6 (C), 4.7 (C) e 4.8.(C). Observou-se no processo

de infecção sem a presença do hormônio ecdisona que a produção de OBs é menor do que nos

sistemas no qual houve a adição do hormônio. A adequação do modelo mantém uma relação

razoável com os dados experimentais. O modelo previu um aumento na produção de OBs para

as produções virais na presença do hormônio ecdisona, fato já esperado, uma vez que o

objetivo de se adicionar hormônio ao processo infectivo é diminuir o efeito passagem.

A concentração de OB tem um comportamento mais complexo no tempo e incorre

maiores desvios por conta de sua determinação, o que prejudica o ajuste das curvas simuladas.

Para uma futura ampliação de escala dos sistemas baculovírus faz-se necessário um

modelo capaz de permitir o acúmulo de informações sobre os fatores que afetam a morte

celular. Wu et al. ( 1993, 1994) desenvolveram um modelo matemático que descreve a morte

celular em um cultivo em monocamada baseado nas fases lag, a qual a viabilidade permanece

constante, e rápida, período no qual ocorre uma queda acentuada na viabilidade celular

(Revisado por Padilha et al., 2013).

4.5. Conclusões

Neste trabalho, foi proposto um modelo matemático do sistema vírus / células de

inseto Sf21 para a produção de bioinseticida. Para todos os casos analisados os modelos

preditos corresponderam satisfatoriamente bem aos dados experimentais.

Houve um acréscimo da produção de OB mediante presença do hormônio ecdisona. A

simulação do modelo está em boa concordância com os dados experimentais.



A concentração celular viável e não-viável prevista e observada em cada sistema

mostraram aceitação adequada entre o modelo e os dados.

Capítulo 5


Capítulo 5. Considerações finais 88


Capítulo 5.


A expectativa da realização deste trabalho era essencialmente trazer informações

relevantes sobre a análise bioquímica dos vírus extracelulares dos baculovírus; o

melhoramento da produção dos corpos de oclusão a partir da adição do hormônio ecdisona,

como também, simular um modelo matemático para esta produção de OB.

As sucessivas passagens do baculovírus em cultivo de células de inseto usando o BV

como inóculo mostraram uma rápida diminuição de OB no decorrer do cultivo. Com isso,

observou-se ainda, por meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida – SDS,

uma redução da proteína total o que representa outro desafio para o aumento de escala da

produção deste bioinseticida viral.

A análise bioquímica destas partículas de BVs trouxe informações referentes às

proteínas presentes nesta forma viral analisada, revelando um padrão diferencial de expressão

proteica entre as três passagens. Foi detectada a presença da poliedrina com 30 kDa em ambas

as passagens, além de uma banda majoritária com massa molecular de aproximadamente 60

kDa observada com maior intensidade na passagem 3. Outras observações foram feitas com

bandas na faixa entre 14,4 kDa e 97 kDa.

Por ser altamente específico o baculovírus é um excelente agente de controle a ser

empregado no manejo integrado de pragas, priorizando a presença dos inimigos naturais não

alvos e a preservação do meio ambiente. Por isso o interesse em ampliar a produção do

baculovírus a ser utilizado como bioinseticida viral. Diante disto, a adição de hormônio

ecdisona proposto para ampliação da escala de produção apresentou resultados satisfatórios

quando adicionados na quarta passagem, a qual obteve aumento de 2 vezes. Porém, na

produção final do baculovírus na terceira passagem, o hormônio ecdisona não causou efeito

positivo na produção dos corpos de oclusão. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que o

Capítulo 5. Considerações finais 89


hormônio ecdisona, utilizado no sistema células/vírus aqui estudado estimule um mecanismo

de proteção celular, permitindo uma otimização da produção viral.

A formulação do modelo matemático e a simulação, fazendo uso da linguagem de

programação Fortran, para a produção de baculovírus SfMNPV foi considerada satisfatória

uma vez que os dados experimentais de todos os sistemas de infecção analisados tiveram

concordância com modelos preditos. O modelo formulado foi considerado útil para melhorar

a produção dos corpos de oclusão do baculovírus Spodoptera.

Essa ferramenta de modelagem pode permitir um ponto de partida para otimizar os

parâmetros de infecção, tais como a produção de OBs em processo em batelada. O modelo

proposto representa um bom ajuste entre complexidade e precisão. Um número relativamente

pequeno de parâmetros cinéticos está envolvido, os quais foram estimados com alta confiança

estatística.

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