UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIS ESCOLA DE VETERINRIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA ANIMAL Disciplina: SEMINRIOS APLICADOS

ISOLAMENTO E CULTIVO DE CLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Reviso de literatura

Benito Juarez Nunes Alves de Oliveira Orientador: Prof. Dr. Luiz Antnio Franco da Silva

GOINIA 2009

BENITO JUAREZ NUNES ALVES DE OLIVEIRA

ISOLAMENTO E CULTIVO DE CLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS

Reviso de literaturaSeminrio apresentado junto Disciplina Seminrios Aplicados do Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal da Escola de Veterinria Da Universidade Federal de Gois. Nvel: Doutorado rea de concentrao: Patologia, Clnica e Cirurgia Animal Linha de Pesquisa: Cirurgia Experimental

Orientador: Prof. Dr. Luiz Antnio Franco da Silva EV/UFG Comit de orientao: Prof. Dr. Duvaldo Eurides FAMEV/UFU Prof. Dr. Marcelo Emlio Beletti FAMEV/UFU

GOINIA 2009

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SUMRIO1 2 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2 A 2.3.2 B 2.3.3 2.3.4 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.2 A 2.4.2 B 2.4.3 2.4.3 A 2.4.3 B 2.4.3 C 2.4.3 D 2.4.4 2.4.5 3 4 INTRODUO REVISO DE LITERATURA Clulas-tronco mesenquimais Colheita de medula ssea Isolamento celular Gradiente de densidade Determinao do rendimento e viabilidade celular Mtodo de excluso pelo azul de Trypan Contador eletrnico de clulas cell counter Protocolos de isolamento celular Performance inadequada no isolamento celular Cultivo celular Histrico Tipos de culturas celulares Explante primrio versus desagregao Subculturas Ambiente de cultivo Substratos Fase gasosa Propriedades fsico-qumicas Condies fisiolgicas Mtodo de tripsinizao Protocolos de cultivo celular CONSIDERAES FINAIS REFERNCIAS 1 3 3 6 9 9 12 13 15 16 17 18 18 20 20 22 23 24 25 25 26 27 28 30 31

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LISTA DE FIGURASFIGURA 1 Diagrama esquemtico da hierarquia proliferativa das clulas progenitoras mesenquimais, demonstrando as duas principais divises contendo clulas-tronco mesenquimais multipotentes indiferenciadas ou progenitores mesenquimais diferenciados com decrescentes origens, sendo indicado pelo tringulo. Os progenitores mesenquimais so denominados de Unidades Formadoras de Colnias (CFU), e se diferenciam em S, estroma de suporte hematopoitico; O, osteoblastos; C, condrcitos; T, tencitos; A, adipcitos; skM, esqueltico; smM, liso; cM, clulas musculares cardacas; As, astrcitos; OI, oligodendrcitos; e N, neurais. A terceira diviso representa apenas os fentipos mesenquimais maturos (Fonte: MINGUELL et. al., 2000).

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FIGURA 2

Origem e tipos celulares derivadas das clulas-tronco mesenquimais (Fonte: Adaptado de POUNTOS &

GIANNOUDIS, 2005). FIGURA 3 Agulhas de bipsia dos tipos Jamshidi (A) e Rosenthal (B), para coleta de medula ssea (Fonte:

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www.cardinalhealth.com).

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FIGURA 4

Colheita da MO em coelhos utilizando seringa de 20 mL contendo 0,1 mL de soluo heparinizada (1:1000), Em A, puno da crista ilaca e, em B do tubrculo umeral (Fonte: OLIVEIRA et al., 2006).

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FIGURA 5

Amostra de aspirado de medula ssea aps separao por gradiente de densidade. Observar o anel celular (seta azul) situado entre o plasma (A) e o gradiente ficoll (B). Sedimento de eritrcitos e granulcitos (C) (Fonte: OLIVEIRA, 2009).

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FIGURA 6

Cmara hemocitomtrica de Neubauer. A lamnula colocada sob a superfcie da cmara e a suspenso celular depositada na cmara de contagem. Os quatro quadrantes dos extremos (1, 2, 4 e 5) e o quadrante central (3) so utilizados para a contagem das clulas (Fonte: Adaptado de PHELAN, 2006).

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FIGURA 7

Imagem da cmara hemocitomtrica em microscopia de luz. As clulas viveis esto representadas pelas setas verdes, j as clulas inviveis apresentam o citoplasma corado com azul de Trypan (seta amarela) (aumento 100x). (Fonte: OLIVEIRA, 2009).

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FIGURA 8

esquerda, a cultura explante em frasco demonstra a migrao e crescimento das clulas em sentido radial a partir do explante, visto no diagrama abaixo. direita, na desagregao tecidual enzimtica, as clulas em suspenso esto dispostas em uma monocamada, como observado no diagrama (Fonte: FRESHNEY, 2005).

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FIGURA 9

Clulas mesenquimais da medula ssea, subcultivadas em meio modificado de Eagle suplementado com soro fetal bovino a 10%. As clulas apresentam formato alongado semelhante a fibroblastos (A). Aos primeiros dias da subcultura, as clulas apresentam formato arredondado e so refringentes, o que corresponde fase de diviso (seta branca) (B).

(Fonte: BOURIN et al., 2008). FIGURA 10

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Recipientes de cultivo celular. Placas de Petri (A), microplacas (B) e frascos de Roux (C). (Fonte: www.bdbioscience.com ).

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LISTA DE QUADROSQUADRO 1 Protocolos de isolamento celular adotados de acordo com a espcie e a fonte de obteno das CTMs. QUADRO 2

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Principais complicaes, causas e solues para alteraes no desempenho dos procedimentos de isolamento celular por gradiente de densidade ficoll. (fonte: AMERSHAM

BIONSCIENCES, 2002). QUADRO 3 Principais meios disponveis no mercado para cultivo de clulas-tronco mesenquimais (Fonte: REYNA, 2003). QUADRO 4 Protocolos de cultura de clulas-tronco mesenquimais nas diferentes espcies.

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LISTA DE ABREVIATURAS

MO medula ssea CTMs clulas-tronco mesenquimais CFU-F unidade formadora de colnias fibroblsticas CTHs clulas-tronco hematopoiticas CT clulas-tronco PBS soluo salina tamponada SFB soro fetal bovino DMEM meio de cultivo modificado de Dulbecco

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1 INTRODUO

Considera-se como clula-tronco um tipo especial de clula que apresenta capacidade de se renovar e originar diferentes tipos celulares especializados, no possuindo nenhuma funo especfica at que essa receba um sinal do ambiente, direcionando-a a diferenciao em uma clula especializada (KIRSCHSTEIN, 2001). Esses sinais incluem danos aos tecidos como: trauma, fraturas, inflamao, necrose e tumores (PALERMO et. al., 2005). Dentre as clulastronco, as mesenquimais so alvo de muito interesse em pesquisas por no apresentarem barreiras ticas, pela facilidade de obteno e ainda por serem utlizazadas em transplantes autlogos, sendo a medula ssea a maior fonte para utilizao (HUANG et al., 2004). As pesquisas atuais relacionadas frao de clulas mononucleares contendo clulas-tronco tm apontado inmeras possibilidades para a reparao tecidual e melhoria na qualidade dos processos regenerativos quando essas so transplantadas em nmero igual ou superior a 2 x 106 (SUTER et al., 2004). Apesar de o nmero limitado dessas clulas na cavidade medular ssea, a proliferao e expanso das mesmas, sob condies adequadas, so facilmente obtidas in vitro (KRAUS & KIRKER-HEAD, 2006). Aps a demonstrao de que clulas derivadas da medula ssea apresentam um nmero de linhagens celulares diferentes, incluindo algumas clulas responsveis pela

osteocartilognese, diversos tipos de culturas e manuteno de tais elementos foram descritos (PEREIRA et al., 2008). Esse novo avano no cultivo de clulas permitiu a formulao de uma variedade de meios de cultura, acrescidos de substncias responsveis pelo melhor desenvolvimento celular in vitro,

possibilitando assim o cultivo de clulas originrias da maioria dos tecidos e rgos (ASSIS et. al., 2002). Apesar dos avanos obtidos no emprego de clulas-tronco como auxiliares no tratamento de inmeras enfermidades, muitos questionamentos ainda no foram esclarecidos. Assim, possvel argumentar que a grande preocupao acerca dos fatores de sucesso e insucesso dos procedimentos de cultura celular tem relao com o nmero de clulas obtidas nas colheitas, sua diferenciao e viabilidade nos meios utilizados (PEREIRA et al., 2008), principalmente, quando

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se trata das clulas com potencial reparador, as chamadas clulas-tronco mesenquimais (PROCKOP et al., 2003). Portanto, diante desse vasto campo para aplicao das clulas-tronco e considerando os resultados descritos pelas pesquisas cientficas sobre esse assunto, em nosso meio, considera-se que o nmero de trabalhos publicados ainda pequeno diante do leque de possibilidades de aplicao que se abre a cada estudo concludo, em especial como auxiliar de protocolos teraputicos mais modernos. Na tentativa de ampliar conhecimentos e averiguar as informaes mais recentes sobre o assunto, este trabalho tem como objetivo fazer uma reviso bibliogrfica sobre os principais protocolos de obteno, isolamento e cultura de clulas-tronco mesenquimais, fornecendo assim subsdios tcnicos relevantes para a confeco e realizao de protocolos de isolamento e expanso in vitro, para posterior aplicabilidade in vivo.

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2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Clulas-tronco mesenquimais

A existncia de clulas-tronco no-hematopoiticas na medula ssea (MO) foi inicialmente sugerida por Cohnheim, h mais de 130 anos. No entanto, foi com os achados de FRIEDENSTEIN et al., (1966) que essa teoria foi comprovada com a descoberta das clulas-tronco mesenquimais (CTMs) (BITTENCOURT et al., 2006). Os autores encontraram em uma cultura de clulas da medula ssea uma populao celular aderida ao plstico, em formato de fuso e semelhante a fibroblastos. Observaram tambm que essas clulas estavam dispostas em colnias derivadas de uma nica clula precursora, conhecidas como Unidade Formadora de Colnia Fibroblsticas (CFU-F) (FRIEDENSTEIN et. al., 1966; PROCKOP, 1997). A medula ssea composta por duas linhagens celulares distintas e dependentes, a hematopoitica e o estroma associado, que formam um sistema cooperativo. As clulas do estroma medular, tambm conhecidas como clulastronco mesenquimais, esto relacionadas manuteno de um microambiente de preservao das clulas-tronco hematopoiticas (CTHs), sendo que a prognie j diferenciada recebe os sinais necessrios para a maturao celular (SCHWINDT et. al., 2005). As CTMs da MO apresentam algumas caractersticas que as distinguem das hematopoiticas, mas ambos os tipos celulares so de fcil separao in vitro. Quando a medula ssea dissociada e o material colhido em um gradiente de densidade, as CTMs apresentam a propriedade de se aderir a tubos e frascos de cultura, enquanto que as CTHs no possuem essa capacidade de adeso (KIRSCHSTEIN, 2001). O cultivo de CTMs feito selecionando-se as clulas com propriedade de adeso ao plstico, sendo que as clulas que permanecem em suspenso so facilmente removidas. Os outros tipos celulares contaminantes como os macrfagos, so eliminados aps um determinado nmero de passagens em cultura (JAVAZON et. al., 2004). Laboratorialmente, as clulas mesenquimais isoladas e posteriormente expandidas podem ser conduzidas a diferenciao em mltiplas linhagens fenotpicas, quando cultivadas em meios especficos contendo

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fatores

de

crescimento

ou

outras

substncias

como

a

dexametasona,

indometacina, hidrocortisona e fatores de crescimento de transformao (TGF- ) (JONES et. al., 2002). As CTMs exibem ampla capacidade de diferenciao em diversas linhagens celulares, bem como a aptido de dar origem e regenerar diversos tecidos, incluindo ossos, cartilagem, tecido adiposo, tendes e msculos (Figura 1) (POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005). J as CTH so utilizadas clinicamente no restabelecimento dos componentes do sangue e do sistema imunolgico (KIRSCHSTEIN, 2001).

FIGURA 1 Diagrama esquemtico da hierarquia proliferativa das clulas progenitoras mesenquimais, demonstrando as duas principais divises contendo clulas-tronco mesenquimais multipotentes indiferenciadas ou progenitores mesenquimais diferenciados com decrescentes origens, sendo indicado pelo tringulo. Os progenitores mesenquimais so denominados de Unidades Formadoras de Colnias (CFU), e se diferenciam em S, estroma de suporte hematopoitico; O, osteoblastos; C, condrcitos; T, tencitos; A, adipcitos; skM, esqueltico; smM, liso; cM, clulas musculares cardacas; As, astrcitos; OI, oligodendrcitos; e N, neurais. A terceira diviso representa apenas os fentipos mesenquimais maturos (Fonte: MINGUELL et. al., 2000).

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Inicialmente

as

CTMs

da

MO

foram

isoladas

do

bao

e

timo.

Subsequentemente, aspirados da medula ssea foram considerados por serem mais acessveis e apresentar fontes ricas em CTMs. Atualmente, essas vm sendo isoladas de vrios locais do organismo humano e animal, incluindo cartilagem, peristeo, sinvia, lquido sinovial, msculos e tendes

(FRIEDENSTEIN et. al., 1966). Tecidos fetais, placenta, vasos sangneos e sangue do cordo umbilical so citadas como fontes de CTMs (HU et. al., 2003) (Figura 2). Todavia, apresentam pouca quantidade desse tipo celular comparado com a MO, alm de ainda no estarem bem estabelecidas s condies ideais de cultivo (WEXLER et. al., 2003).

FIGURA 2 Origem e tipos celulares derivadas das clulas-tronco mesenquimais (Fonte: Adaptado de POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005).

As clulas-tronco (CT) podem ser definidas segundo trs propriedades: I) auto-renovao, ou seja, capacidade de originar outra clula com caractersticas

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idnticas; II) habilidade de se diferenciar em mais de uma linhagem celular; e III) capacidade de originar clulas funcionais nos tecidos derivados da mesma linhagem (VERFAILLIE, 2002). Assim, as CT so clulas indiferenciadas capazes de se diferenciar originando progenitores maduros e clulas efetoras

completamente diferenciadas (SCHWINDT et. al., 2005). As CTMs so a fonte de tecido que envolve a medula ssea e, portanto, espera-se que elas se diferenciem em clulas das linhagens osteognica, adipognica e condrognica in vitro. Com freqncia ocorre mineralizao da matriz extracelular e expresso de marcadores fenotpicos, que indicam a presena de clulas dessas trs linhagens na cultura. No entanto, o comportamento de linhagens clonais aps transplante, e no o fentipo observado in vitro, que define o grau de potencialidade das CTMs (BIANCO et. al., 2001). Mas nem todas as CFU-F da medula ssea apresentam de fato caracterstica multipotencial. Analisando-se as colnias individualmente, nota-se a heterogeneidade da populao em cultura relacionada taxa de proliferao e morfologia. Assim, sugere-se que a medula ssea seja composta pela mistura de clulas progenitoras diferenciadas e indiferenciadas. importante distinguir as CT dos muitos tipos de clulas progenitoras, de forma que as primeiras se autorenovam por toda a vida de um organismo, enquanto as progenitoras possuem auto-renovao e potencialidade limitadas. O isolamento e conseqente caracterizao das variedades celulares presentes dificultado pela ausncia de marcadores antignicos especficos bem estabelecidos (SCHWINDT et. al., 2005).

2.2 Colheita de medula ssea

A utilizao de clulas in natura da medula ssea tem sido reportada com sucesso no tratamento de fraturas com no unio e/ou unio retardada (OLIVEIRA et al.; 2006). Porm, a quantidade de CT encontradas na MO, segundo STRAUER & KORNOWSKI (2003), de aproximadamente 0,05%. Para tanto, so necessrias alternativas para aumentar o nmero de clulas para transplante (COTTLER-FOX et al., 2003; LEE et al., 2004). As CT esto distribudas de maneira esparsa na medula (TIEDEMAN et al., 1991), sendo que

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estudos de cicatrizao ssea, foi constatado que a adoo de tcnicas de concentrao das clulas osteoprogenitoras favorece a osteognese, j que a formao ssea est relacionada ao nmero de CT (CONNOLLY et al., 1989). A MO pode ser obtida em diversos locais, sendo a crista ilaca a principal fonte. A colheita realizada por meio de puno com agulha de bipsia (Figura 3 A e B) (DEL CARLO et al., 2004) ou por agulha hipodrmica (OLIVEIRA et al., 2006), no necessitando de inciso de pele, portanto ocasionando reduo da perda sangunea, ausncia de dor e formao de escaras (DEL CARLO et al., 2004).

FIGURA 3 Agulhas de bipsia dos tipos Jamshidi (A) e Rosenthal (B), para coleta de medula ssea (Fonte: www.cardinalhealth.com)

A obteno das clulas se d por meio de aspiraes sucessivas, sendo os pontos de puno espaados de 1 a 2 cm, que tem por finalidade obter pequenas quantidades em cada aspirao, prevenindo a diluio dos elementos da medula com o sangue colhido (CONNOLLY, 1995). Recomenda-se entre as aspiraes que a seringa e a agulha sejam lavadas com 4 mL de soluo salina heparinizada, com o propsito de evitar a formao de cogulos (TIEDEMAN et

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al., 1991). Em um estudo cientifico, a medula foi aspirada da crista ilaca (Figura 4A) de coelhos adultos anestesiados, empregando agulha hipodrmica que foi rotacionada cuidadosamente, acoplada a uma seringa de 20 mL umedecida com 0,1 mL de soluo de heparina (1:1000). Foram colhidos 2,0 a 3,0 mL por stio, at um total de 7,0 a 10 mL por animal (CONNOLLY et al., 1989). J OLIVEIRA, (2009) citou o tubrculo umeral como local de fcil aspirao (Figura 4B), devido a disposio anatmica da articulao escpulo-umeral. O autor conclui que, a partir de amostras de menores volumes de MO, pode-se atingir um alto rendimento e viabilidade celular.

A

B

FIGURA 4 Colheita da MO em coelhos utilizando seringa de 20 mL contendo 0,1 mL de soluo heparinizada (1:1000), Em A, puno da crista ilaca e, em B do tubrculo umeral (Fonte: OLIVEIRA et al., 2006).

A utilizao de heparina no recomendada como anticoagulante, pois pode causar alteraes nas propriedades tintoriais das clulas, sendo sugestivas de dano celular. Mais contrariando essa afirmao, diversos estudos tm demonstrado que a heparina no afeta a viabilidade das clulas isoladas da medula ssea (SALAMA & WEISSMAN, 1978). OLIVEIRA, (2009) e SOUZA,

(2009) aps colheita de 2 mL de MO do tubrculo umeral diludos em 0,1 mL de soluo salina heparinizada (5000 U/mL), constataram que os valores de viabilidade celular foram superiores 90%. Acrescente-se que a epfise proximal da tbia tambm tem sido utilizada como fonte de medula ssea. IM et al., (2001)

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e NISHIMORI et al., (2006), em estudos de reparos osteocondrais com CTMs em coelhos, realizaram a colheita da medula por inciso de aproximadamente 1 cm na face medial da tbia proximal, seguida pela criao de um orifcio sseo de 2 mm e aspirao de 2 mL de MO com seringa contendo 0,1 mL de heparina (3000 UI/mL). Em estudos experimentais empregando ratos e camundongos, a MO dos fmures e tbias pode ser coletada mediante eutansia dos animais, limpeza dos tecidos moles adjacentes e lavagens da cavidade ssea com soluo fisiolgica estril (TOGNOLI et al., 2007) ou com meio de cultivo modificado de Dulbecco (DMEM) (BITTENCOURT et al., 2006). Porm, independente da forma de obteno, uma das estratgias utilizadas para terapia celular baseada no princpio que uma quantidade numerosa de CT esteja presente nos aspirados de MO, para que o concentrado provoque efeitos teraputicos benficos, sem necessitar de cultura celular (KRAUS & KIRKER-HEAD, 2006). Contudo, pela importncia atribuda s CT e sua quantidade relativamente pequena em relao as clulas mononucleares da medula (1:1000), as pesquisas tm sido direcionadas para seu isolamento, purificao e concentrao (CONNOLLY, 1995).

2.3 Isolamento celular

2.3.1 Gradiente de densidade Em testes de histocompatibilidade, imunoensaios celulares in vitro, protocolos de cultivo celular e outros procedimentos em geral, tm sido utilizados diversos gradientes de densidade de alto peso molecular. Dentre eles esto o Ficoll-Hypaque, Histopaque, Isolymph e Nycomed, os quais apresentam a funo de isolar linfcitos e clulas mononucleares do sangue perifrico e da medula ssea (ISLAM, 1994). BOYM (1968) foi o primeiro pesquisador a descrever a tcnica de isolamento de clulas mononucleares utilizando o ficoll como gradiente de densidade. Nesse estudo, o autor demonstrou que a baixa viscosidade do gradiente, comparado com outros agentes de agregao de

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eritrcitos, foi eficaz no isolamento in vitro de linfcitos do sangue perifrico humano, a partir de centrifugaes rpidas e de baixa velocidade. O gradiente de densidade ficoll tem merecido destaque, por ser de fcil aplicabilidade, rpido e favorecer a concentrao de clulas mononucleares da MO, atingindo altos nveis de rendimento celular (KAPLAN et al., 1982; OLIVEIRA, 2009). O Ficoll-Paque 400 uma soluo aquosa com densidade de 1,077 0,001 g/mL contendo 5,7g de Ficoll, 9g de diatrizoato de sdio e 0,0231g de cido etilenodiaminotetractico para cada 100mL. Essa composio responsvel pela formao de uma soluo de baixa viscosidade e alta densidade (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). O princpio da tcnica de separao baseia-se na densidade do gradiente em relao aos linfcitos, moncitos e plaquetas, os quais no conseguem penetrar pelo gradiente. Esses se depositam na interface entre o ficoll e o plasma, formando o chamado anel celular. A migrao celular durante o processo de centrifugao com o ficoll resulta na formao de camadas contendo diferentes tipos celulares (Figura 5). A frao celular constituda de eritrcitos e granulcitos atravessam o gradiente e sedimentam no fundo dos tubos, podendo ocorrer o aprisionamento de alguns linfcitos durante a agregao eritrocitria da MO a fresco. Contudo, esse processo pode ser evitado diluindo-se inicialmente o sangue, aumentando assim o rendimento celular e reduzindo a agregao das clulas vermelhas (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). As principais solues para a diluio da MO so a soluo salina tamponada (PBS) (OLIVEIRA, 2009) e meios de cultivo modificados (CURY, 2005), podendo este ltimo ser suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 10% (BITTENCOURT et al., 2006). A amostra de medula ssea diluda , em seguida, depositada lentamente sobre o gradiente de densidade de separao de clulas (CURY, 2005; OLIVEIRA, 2009). Outro fator a ser considerado a temperatura de centrifugao. A agregao eritrocitria favorecida em altas temperaturas (37C), enquanto que em baixas (4C), a taxa de agregao reduzida, porm, o tempo de separao aumentado, o qual tambm reduz o rendimento celular. Uma temperatura de 18-20C geralmente fornece bons resultados no processo de isolamento (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002).

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FIGURA 5 - Amostra de aspirado de medula ssea aps separao por gradiente de densidade. Observar o anel celular (seta azul) situado entre o plasma (A) e o gradiente ficoll (B). Sedimento de eritrcitos e granulcitos (C) (Fonte: OLIVEIRA, 2009).

Aps o processo de centrifugao, o plasma sobrenadante desprezado utilizando-se pipeta de Pasteur e o anel celular removido e transferido para outro tubo. Lavagens subseqentes so recomendadas com solues salinas balanceadas, com a finalidade de remover o remanescente de plasma, plaquetas e a soluo de ficoll (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). Os procedimentos de lavagem pelos mtodos padres de isolamento geralmente so eficientes na remoo das plaquetas do boto celular. Caso as plaquetas estejam presentes, pode-se realizar a centrifugao com gradiente de sucrose a 4-20% (PERPER et al., 1968), bem como com adenosina-5-difosfato (ADP) aps a separao dos linfcitos (VIVES et al., 1971), os quais auxiliam na remoo do remanescente. O rendimento e a diminuio da pureza dos linfcitos dependem consideravelmente da eficcia na remoo das clulas vermelhas. Diversos

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produtos comerciais esto disponveis como a soluo de lise FACS (NAKAGE et al., 2009) e/ou preparadas em laboratrio, como o cloreto de amnio 0,16 M em soluo de Tris 0,17 M, pH 7,6, recomendando-se diluir 1mL ao boto celular isolado e manter em repouso durante cinco minutos. O tampo de lise, segundo estudos, favorece a contagem das clulas na cmara hemocitomtrica de Neubauer, reduzindo as falhas na determinao do rendimento celular (OLIVEIRA, 2009).

2.3.2 Determinao do rendimento e viabilidade celular

No momento que a integridade da membrana celular foi rompida, em um processo de morte celular como exemplo, a viabilidade de tais clulas estaria, por conseqncia, comprometida (BACS et al., 2000). Existem atualmente vrios testes para a determinao da integridade celular. Um deles o mtodo do azul de Trypan, um corante que tem a capacidade de penetrar no interior da clula, cuja membrana esteja rompida. Tal teste largamente empregado devido a sua praticidade, porm possui o inconveniente de produzir artefatos na penetrao do corante, comprometendo a sua determinao (MASCOTTI et al., 2002). H protocolos alternativos ao azul de Trypan, como aqueles baseados na citometria de fluxo, os quais utilizam uma combinao de marcadores, como a Anexina, uma protena que possui afinidade pelos fosfolipdios expostos pela membrana celular, e o corante 7-AAD, o qual penetra no interior da clula, fornecendo informaes acerca da formao de poros da membrana celular (HPPNER et al., 2002). Esses mtodos de determinao do rendimento e viabilidade celular precisam ser o mais confivel possvel, a fim de refletirem o estado de integridade da membrana, uma vez que o sucesso de um transplante celular depende dessa integridade, a fim de que as clulas possam colonizar a rea afetada em uma determinada leso, interagindo com as demais clulas do hospedeiro e recuperando o tecido lesado (CURY, 2005).

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A ) MTODO DE EXCLUSO PELO AZUL DE TRYPAN (PHELAN, 2006) Materiais Etanol (v/v) a 70%; Suspenso celular; Azul de Trypan a 0,4%; Cmara hemocitomtrica de Neubauer com lamnula; Contador manual; Pipeta de Pasteur; Microscpio. Preparao da Cmara 1. Limpe a superfcie da lmina da cmara e da lamnula com lcool a 70%; 2. Limpe os cantos da lamnula com gua destilada e coloque-a sobre a cmara, recobrindo a rea de contagem prateada. Procedimento 3. Realize a diluio 1:1 da suspenso celular com azul de trypan a 0,4%. Pode ser diludo posteriormente com PBS caso necessrio; 4. Suspender as clulas cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur; 5. Cubra a cmara hemocitomtrica com uma lamnula, e deposite a suspenso celular da pipeta pela extremidade em forma de V entre a cmara e a lamnula. Repita a operao do outro lado. importante no preencher excessivamente a cmara, apenas a quantidade necesria para que o soluto possa fluir pela superfcie, pela ao de capilaridade; 6. Coloque a cmara no microscpio; 7. Inicialmente, focalize as linhas da cmara em menor aumento; 8. A hemocitmetro consiste de nove quadrantes de 1mm, as quais so divididas em 25 quadrantes menores. Com uma objetiva x 10 e contador manual, deve-se quantificar as clulas presentes nos quadrantes 1 a 5 (Figura 6).

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lamnula

grade

Depositar a suspenso celular 1mm

1mm

FIGURA 6 Cmara hemocitomtrica de Neubauer. A lamnula colocada sob a superfcie da cmara e a suspenso celular depositada na cmara de contagem. Os quatro quadrantes dos extremos (1, 2, 4 e 5) e o quadrante central (3) so utilizados para a contagem das clulas (Fonte: Adaptado de PHELAN, 2006).

Clculo do rendimento celular

9. Determina as clulas/mL pelo seguinte clculo: clulas/mL = mdia contada por quadrante x fator de diluio x 104 total de clulas = clulas/mL x volume total da suspenso celular da amostra; O nmero 104 o fator de correo do volume do hemocitmetro: cada quadrante 1/1mm e a profundidade 0,1mm.

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Clculo da viabilidade celular

10. Contar o nmero de clulas totais da amostra e o nmero de clulas viveis (no coradas) (Figura 7). Calcular a porcentagem de viabilidade pela seguinte frmula:

% viabilidade celular =

n clulas viveis n clulas totais

x 100

FIGURA 7 Imagem da cmara hemocitomtrica em microscopia de luz. As clulas viveis esto representadas pelas setas verdes, j as clulas inviveis apresentam o citoplasma corado com azul de Trypan (seta amarela) (aumento 100x). (Fonte: OLIVEIRA, 2009).

B) CONTADOR ELETRNICO DE CLULAS - CELL COUNTER

um dispositivo capaz de contar e medir partculas em suspenso. Esse sistema formado por dois eletrodos e um amplificador, os quais registram e transmitem as oscilaes na resistncia a passagem das clulas pelo orifcio, armazenando e analisando os dados em seguida (REYNA, 2003).

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2.3.3 Protocolos de isolamento celular

No quadro 1 esto especificados diferentes protocolos de isolamento recomendados pela literatura, variando quanto a espcie e fonte de obteno das CTMs, bem como seus resultados de rendimento e viabilidade celular.QUADRO 1 Protocolos de isolamento celular adotados de acordo com a espcie e a fonte de obteno das CTMs.

AUTORES

ESPCIE

FONTE

PROTOCOLOS- Colheita de 2mL de MO diludo em 0,1mL de soluo fisiolgica heparinizada (5000UI), diludo em PBS (1:1). - Centrifugao em gradiente Ficoll 1,077g/mL (diluio 2:1) a 495g, durante 30 min a 15C. - Lavagens com PBS e DMEM baixa glucose suplementado com soro fetal bovino 10%, 493g durante 10 minutos a 4C. 6 - Rendimento: 6,25 x 10 clulas/mL - Viabilidade: 93,56% - Colheita de 10ml/kg MO em bolsas de coleta contendo 0,1mL de heparina (10000UI). - Centrifugao a 440g, na diluio 1:1 com gradiente Histopaque 1,077g/mL, temperatura entre 18-26C. - Lavagens celulares com soluo salina 0,9%, DMEM e soro sanguneo autlogo estril, a 440g durante 5 minutos. 6 - Rendimento: 2,57 x 10 clulas/mL - Viabilidade: 96, 72% - Gordura subcutnea fragmentada e lavada com PBS 2%. - Digesto enzimtica com colagenase (2mg/mL), DMEM, BSA (20mg/mL) penicilina e estreptomicina, durante 50 minutos a 37C. - Bloqueio enzimtico com SFB - Pellet diludo em DMEM e SFB a 10% - Lavagem para colheita da MO com 10mL de meio Knockout DMEM e DMEM-alta concentrao de glucose. - Centrifugao a 1200rpm por 10 minutos. 6 - Rendimento: 6 x 10 clulas/mL - Viabilidade: >95%

OLIVEIRA, 2009

Coelhos

MO*

OLSSON et al., 2009

Canina

MO

PEREIRA et al., 2008

Coelhos

TA**

BITTENCOURT et al., 2006

Ratos

MO

* MO Medula ssea

** TA Tecido adiposo

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2.3.4 Performance inadequada no isolamento celular Segundo OLSSON et al., (2009), o maior desafio da manipulao celular a preservao das caractersticas funcionais e a manuteno da viabilidade das clulas. Muitos problemas podem estar relacionados ao processo de isolamento celular, reduzindo assim as taxas de rendimento, bem como a viabilidade das clulas mononucleares. As principais complicaes relacionadas ao processo de isolamento por gradiente de densidade esto listadas no quadro 2.QUADRO 2 Principais complicaes, causas e solues para alteraes no desempenho dos procedimentos de isolamento celular por gradiente de densidade ficoll.

ALTERAES NO DESEMPENHO

PRINCIPAL CAUSA DO PROBLEMA A. Temperatura muito baixa

COMENTRIOS A densidade do ficoll grande em baixas temperaturas e as clulas vermelhas so menos agregadas. Contudo, granulcitos e eritrcitos so impedidos de atravessar a camada de ficoll. Mantenha a temperatura entre 1820C. Adequado tempo e fora g devem ser utilizados para promover completa sedimentao das clulas no linfides. O gradiente ficoll menos denso em altas temperaturas, e alguns linfcitos podem penetrar no gradiente. A viabilidade celular pode tambm ser afetada. Uma alta densidade celular resulta em um grande nmero de linfcitos aprisionados pelos agregados de clulas vermelhas. Deve-se diluir a amostra previamente. Vibraes podem causar um alargamento da banda de linfcitos, misturando-se a outras clulas. Verifique se o rotor est corretamente balanceado Pode ser encontradas em amostras patolgicas, amostras de sangue no humanas ou de outras fontes que no o sangue perifrico. Nesses casos, podese utilizar o gradiente Percoll para separao de clulas

Clulas vermelhas aumentadas e contaminao dos linfcitos B. Baixa velocidade de centrifugao e/ou tempo de centrifugao muito curto. Baixo rendimento e viabilidade de linfcitos

Temperatura muito alta

Baixo rendimento de linfcitos com viabilidade normal Baixo rendimento com aumento da contaminao de granulcitos Baixo rendimento e viabilidade de linfcitos com contaminao por outros tipos celulares

Sangue no diludo 1:1 com soluo salina balanceada; incomum alto hematcrito Vibrao do rotor da centrfuga, misturando o gradiente

Amostra contm clulas com densidade diferentes

Fonte: AMERSHAM BIONSCIENCES, 2002

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2.4 Cultivo celular

2.4.1 Histrico

O cultivo de tecidos se desenvolveu a partir dos ltimos anos do sculo XIX, como uma continuao das tcnicas de embriologia. Wilhem Roux, em 1885, manteve clulas do embrio de aves em soluo salina durante alguns dias. Porm, o zologo Ross Harrison considerado o pioneiro no cultivo de tecidos animais. Harrison, em 1907, empregou tcnicas in vitro para o estudo de fenmenos in vivo, realizando cultivos de medula espinhal embrionria de anfbios. Pde observar o crescimento dos axnios dos neuroblastos e estabeleceu que o axnio se formava por expanso, a partir do corpo neuronal e no pela fuso de uma cadeia de clulas (REYNA, 2003). Inicialmente, a primeira limitao para o estabelecimento de cultivos era desenvolver um meio nutritivo adequado. Burrows, em 1910, utilizou plasma de aves para nutrir explantes de tecidos embrionrios e provou ser um mtodo eficaz o qual lhe permitiu observar o crescimento de tecido nervoso, corao e pele. Neste mesmo ano, Burrows e Carrel realizaram os primeiros intentos de estabelecer cultivos de clulas de mamferos e conseguiram manter explantes obtidos a partir de ces, gatos e coelhos, assim como no crescimento de tumores slidos. Demonstraram que se pode prolongar a vida do cultivo mediante subculturas. Os meios empregados foram plasma suplementado com extratos de embrio. Em 1916, Rous e Jones utilizaram, pela primeira vez, extratos enriquecidos em tripsina para dissociar clulas embrionrias, estabelecendo o primeiro cultivo celular. Um dos maiores problemas constatados no cultivo foi o aparecimento de mltiplas contaminaes e se desenvolveram numerosos mtodos de manipulao em condies asspticas, que ainda so utilizadas at hoje (FRESHNEY, 2005). Em 1913, Carrel demonstrou a possibilidade de manter em cultivo clulas extradas de embrio de aves, por um perodo de tempo superior vida deste. Manteve em cultivo clulas de aves durante 34 anos, o que s foi possvel pela utilizao do frasco de Carrel (SONDAHL & SHARP, 1977). Entre os anos de 1920 e 1940, foram desenvolvidas diferentes estratgias de obteno de cultivo e

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a manuteno das condies estreis, mas sem grandes avanos. A partir dos anos 40, com o surgimento dos primeiros antibiticos, se desenvolveram numerosas aplicaes dentre as quais se podem destacar: (REYNA, 2003). EARLE et al., (1948) isolaram clulas da linha celular L e mostraram que eram capazes de formar clones no cultivo de tecidos, mediante a alimentao com nutrientes corretos; GEY et al., (1952) estabeleceram a primeira linha celular contnua, atualmente conhecidas como clulas HeLa. O meio empregado era extremamente complexo e pouco definido: plasma de aves, extrato de embrio bovino e soro do cordo umbilical de humanos; COHEN et al., (1954) constataram que o fator de crescimento nervoso estimula o crescimento de axnios em cultivo de tecidos; EAGLE (1955) realiza a investigao sistemtica sobre os requerimentos nutritivos das clulas em cultivo. Cita que as solues corporais completas podem ser satisfatrias ao cultivo, como o soro eqino a 1% em um meio com aminocidos e acares; HAYFLICK & MOORHEAD (1961) foram os pioneiros na utilizao de antibiticos para prevenir a contaminao de cultivos de fibroblastos. HAM (1965) introduziu o primeiro meio livre de soro capaz de manter algumas clulas de mamferos em cultivo; AUGUSTI-TOCCO & SATO (1969) obtiveram a primeira linhagem celular estvel a partir de neuroblastomas, e observaram que esses eram eletricamente excitveis; KOHLER & MILSTEIN (1975) detectaram a primeira linhagem celular produtora de anticorpos monoclonais; HAYASHI & SATO, (1976) publicaram trabalhos que demonstram que as diferentes linhagens celulares requerem misturas distintas de hormnios e fatores de crescimento, para se desenvolverem em meios livres de soro.

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2.4.2 Tipos de Culturas Celulares

A) EXPLANTE PRIMRIO VERSUS DESAGREGAO

Quando as clulas so isoladas do tecido do doador, elas podem ser mantidas sob diversas formas. Um pequeno fragmento de tecido que se adere superfcie de crescimento, seja espontneo ou por auxlio mecnico, como os cogulos ou uma matriz extracelular constituinte (colgenos), geralmente do suporte ao crescimento celular. Esse tipo de cultura conhecido com um explante primrio e as clulas que migram do tecido so clulas em crescimento (Figura 8). Essas so selecionadas, no primeiro instante, pela sua habilidade em migrar do explante e subseqentemente, se subcultivadas, pela habilidade de proliferao. Quando uma amostra de tecido desagregada, seja mecnica ou enzimaticamente, forma-se uma suspenso de clulas e pequenos agregados capazes de se ligarem a um substrato slido, formando uma monocamada (Figura 8). As clulas da monocamada com capacidade de se proliferar so ento selecionadas da primeira subcultura e, como as do explante primrio, possivelmente originam uma linhagem celular. A desagregao tecidual capaz de produzir largas culturas com mais rapidez que a cultura explante, porm esta ltima pode ser preferida quando so obtidos pequenos fragmentos de tecidos ou quando a fragilidade das clulas impede sua sobrevivncia aps a desagregao (FRESHNEY, 2006). A vantagem dessas culturas que, quando so recentemente removidas da sua situao in vitro, espera-se que as suas caractersticas funcionais se assemelhem a das clulas in vivo. Como desvantagens, so citadas as reaes das culturas as mudanas do ambiente nos primeiros dias ou semanas in vitro, os danos e sua recuperao durante a remoo das clulas do animal e por fim, as alteraes na composio da cultura ocasionadas por clulas de culturas mistas que morrem e outras que proliferam e/ou diferenciam (MATHER & ROBERTS, 1998).

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FIGURA 8 esquerda, a cultura explante em frasco demonstra a migrao e crescimento das clulas em sentido radial a partir do explante, visto no diagrama abaixo. direita, na desagregao tecidual enzimtica, as clulas em suspenso esto dispostas em uma monocamada, como observado no diagrama (Fonte: FRESHNEY, 2005).

Na desagregao, o tecido passa pelos estgios de lavagem, dissecao, e ainda desagregao mecnica ou digesto enzimtica em tripsina e/ou colagenase. Este geralmente requerido no para se ter uma suspenso celular simples, pois muitas clulas primrias sobrevivem melhor em pequenos agregados (FRESHNEY, 2006). A desagregao tecidual contm uma variedade de diferentes tipos celulares, sendo necessria a utilizao de tcnicas de isolamento como por gradiente de densidade de separao (PRETLOW & PRETLOW, 1989), ou imunotipagem em vidrarias magnetizadas, utilizando frascos com magneto positivo para se selecionar as clulas de interesse (CARR et. al., 1999) ou negativos para eliminar as clulas indesejadas (SAALBACH et. al., 1997). A populao celular deve ser enriquecida posteriormente por meios de

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cultivos adequados, dos quais esto disponveis comercialmente (FRESHNEY, 2006).

B) SUBCULTURAS

As subculturas podem ser requeridas periodicamente, com a inteno de promover nova fonte de nutrientes e espao para o crescimento contnuo das linhagens celulares. A freqncia de subcultura, a proporo de semeadura e a densidade de clulas plaqueadas dependem das caractersticas de cada linhagem celular. Caso as clulas sejam rompidas com freqncia ou so plaqueadas a uma baixa densidade, essas podem no se desenvolver sob cultivo. Com isso, diferentes tipos celulares podem ser selecionados ao crescimento, quando se trata de culturas mistas (MATHER & ROBERTS, 1998). Nas subculturas, deve-se realizar a remoo do meio de crescimento, lavagem da placa, dissociao das clulas aderentes pela tripsina e diluio da suspenso celular em meio fresco, mtodo este conhecido como passagem. As trocas do meio devem ser feitas quando as clulas atingirem aproximadamente 70% de confluncia com o substrato, ou seja, aderidas as placas ou frascos de cultura (PEREIRA et al., 2008). As passagens celulares para novos recipientes de cultura podem ser realizadas inmeras vezes, com o objetivo de se obter um rendimento expressivo de clulas (FRESHNEY, 2006). Caso a subcultura seja feita em soro e a proporo de semeadura seja alta, no se faz necessria a remoo da tripsina residual. Entretanto, em culturas mantidas em meios livres de soro, deve-se neutralizar a enzima utilizando um inibidor de protease, como o inibidor de tripsina soybean (MATHER & ROBERTS, 1998). Espera-se que, nos primeiros dias de subcultura, as CTMs da MO apresentem um formato arredondado e refringncia, e que, com o passar do tempo, elas adquiram uma aparncia fibroblstica (Figura 9, A e B) (BOURIN et al., 2008).

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500m

FIGURA 9 Clulas mesenquimais da medula ssea, subcultivadas em meio modificado de Eagle suplementado com soro fetal bovino a 10%. As clulas apresentam formato alongado semelhante a fibroblastos (A). Aos primeiros dias da subcultura, as clulas apresentam formato arredondado e so refringentes, o que corresponde a fase de diviso (seta branca) (B). (Fonte: BOURIN et al., 2008).

2.4.3 Ambiente de cultivo

Para o cultivo celular so utilizados meios artificiais, preparados mediante a mescla de componentes purificados ou de solues orgnicas completas, instrumentos que mantm as condies fsico-qumicas adequadas e recipientes que isolam as clulas do meio externo. Por este fato, considera-se que o meio de cultivo formado por quatro elementos: (1) a natureza do substrato onde as clulas crescem; (2) a natureza e composio da fase gasosa; (3) as condies fsico-qumicas e fisiolgicas do meio e (4) as condies de incubao, como a temperatura e a umidade (REYNA, 2003).

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A) SUBSTRATOS

Os principais materiais empregados como substratos so: a. Vidros tem como vantagem o custo baixo, ser de fcil limpeza e esterilizao e de boa qualidade ptica, facilitando a observao ao microscpio. b. Plstico descartvel O plstico mais utilizado o de poliestireno, que possui boa qualidade ptica. Por ser de caracterstica hidrofbica, requer tratamento por irradiao gama, qumica ou por descargas eltricas. Esto disponveis em diversos tipos de recipientes: Placas de Petri: disponveis em tamanhos de 3,5, 6 e 10 cm de dimetro. Por serem ventiladas, no recomendada para a manuteno das linhagens celulares (Figura 10A). Multiplacas: placas que contm de 6 a 96 poos (Figura 10B). Frascos de Roux: podem ser ventilados ou no, disponveis em diversos tamanhos. So muito utilizados para o crescimento e manuteno de linhagens celulares (Figura 10C).

FIGURA 10 Recipientes de cultivo celular. Placas de Petri (A), microplacas (B) e frascos de Roux (C). (Fonte: www.bdbioscience.com )

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B) FASE GASOSA

Os componentes mais significativos da fase gasosa so o oxignio e o dixido de carbono. As necessidades de oxignio para a maioria dos cultivos celulares gerada pela tenso atmosfrica, porm, h outros que necessitam de uma tenso de oxignio superior (95%), possivelmente pela dificuldade de difuso do gs em seu interior (REYNA, 2003). O dixido de carbono tem um importante papel na regulao do pH e na quantidade de ons HCO3 -. Um incremento nas concentraes de on bicarbonato associada a uma adequada tenso de oxignio, promovem a estabilizao do pH em 7,4 (FRESHNEY, 2006). Os cultivos com baixa densidade e em um recipiente aberto precisam de uma atmosfera de CO2, cuja concentrao esteja em equilbrio com o bicarbonato de sdio do meio. Em concentraes celulares muito reduzidas, necessrio acrescentar dixido de carbono quando os frascos so fechados. Todavia, quando a densidade celular mais elevada, possivelmente no seja necessrio acrscimo de CO2 em frascos fechados, mas deve ser acrescido em frascos abertos (REYNA, 2003).

C) PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS

pH e capacidade de tamponamento: o pH timo de crescimento para a maioria dos tipos celulares de 7,4, ainda que existam pequenas variaes. Algumas linhagens normais de fibroblastos crescem melhor entre pH 7,4 e 7,7, e j as clulas diferenciadas na margem de pH 7,0 a 7,4. O meio de cultivo deve ser tamponado, a fim de evitar alteraes bruscas de pH. A soluo tampo mais utilizada o bicarbonato, pelo seu baixo custo e toxicidade, alm de trazer benefcios nutricionais para o cultivo (EAGLE, 1973).

Osmolaridade: as clulas geralmente tem uma ampla tolerncia a osmolaridade do meio, crescendo bem entre 260 e 320 mOsm/kg, podendo ocorrer variaes de acordo com a espcie. recomendado empregar meios

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ligeiramente hipotnicos para compensar a evaporao durante o perodo de incubao, principalmente em estufas sem controle da umidade ambiente (FRESHNEY, 2006). Temperatura: tem grande influncia na taxa de crescimento das clulas, e deve ser controlada durante o perodo de incubao. Recomenda-se ajustar o pH do meio 0,2 unidades abaixo do timo, a temperatura ambiente (37C). Tambm se pode preparar o meio completo acrescido de soro, deixar equilibrar na estufa e depois ajustar o pH, antes de acrescent-las ao cultivo (FRESHNEY, 2006). Viscosidade: tem pouca influncia no crescimento das clulas, porm, importante na reduo dos danos celulares pela agitao do cultivo (quanto maior a viscosidade, menor os danos) e na tripsinizao. Pode-se aumentar a viscosidade, especialmente em meios livres de soro, acrescentando carboxi-metilcelulose ou polivinilpirrolidona (BIRCH & PIRCH, 1971). Tenso superficial: a tenso deve ser mantida baixa. Em geral, observa-se alterada quando h a formao de espumas nos cultivos pelo borbulhamento de CO2, levando a uma desnaturao de protenas e incrementando os riscos de contaminao. Recomenda-se utilizar um agente anti-espumante de silicone (REYNA, 2003).

D) CONDIES FISIOLGICAS

A principal dificuldade para o estabelecimento das linhagens celulares de se obter meios nutritivos adequados, que sejam capazes de reproduzir o meio natural como extratos embrionrios, hidrolizados de protenas e soros (FRESHNEY, 2006). Depois de anos de investigao sobre a composio dos meios, a seleo deste ainda permanece emprica (REYNA, 2003). Alguns meios de cultivo disponveis comercialmente esto listados no quadro 3.

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QUADRO 3 Principais meios disponveis no mercado para cultivo de clulas-tronco mesenquimais.

Nome comercialMeio Basal de Eagle (BME)

DescrioMeio contendo apenas aminocidos essenciais. Necessita ser suplementado com soro fetal bovino a 10%. Contm mais aminocidos e em maior concentrao que o BME. Requer suplementao com SFB. Contm quatro vezes a concentrao de aminocidos e vitaminas que o BME. Meio completo que inclui na formulao albumina bovina, transferrina, selnio, e outros. Requer suplementao com SFB. Meio que pode ser suplementado com protenas e hormnios. Contm metais como o ferro, cobre e zinco. Fornece suplementao protica as clulas. Pode ter seu uso combinado ao IMDM

Meio Mnimo Essencial de Eagle (MEM)

Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM)

Meio DMEM modificado por Iscove (IMDM)

Meio F-10 de Ham

Meio F-12 de Ham

Fonte: REYNA, 2003

2.4.4 Mtodo de tripsinizao

A maior parte das clulas que se mantm em cultivos de desagregao tecidual precisa estar aderida ao substrato (frascos e placas de cultivo) para o seu desenvolvimento e manuteno. Para se resuspender essas clulas, deve-se realizar a desagregao mecnica ou digesto enzimtica, empregando o mtodo de tripsinizao (FRESHNEY, 2006). REYNA (2003) descreveu que para a maioria das linhagens celulares, aps as trocas do meio de cultivo, deve-se utilizar tripsina 0,01 a 0,5% diluda em soluo salina tamponada (PBS), e mantidas em estufa a 37C durante 5 a 15 minutos.

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2.4.5 Protocolos de cultivo celular

No quadro 4 esto alguns protocolos de cultura de CTMs recomendados na literatura, de acordo com a espcie em questo.QUADRO 4 Protocolos de cultura de clulas-tronco mesenquimais nas diferentes espcies.

AUTORES

ESPCIE

FONTE

PROTOCOLOS- Coleta de 9mL MO diluda em 1mL soluo salina heparinizada (1000U/mL). - Adio de DMEM (2:1) suplementado com SFB 10%, penicilina G (100U/mL), estreptomicina (0,1mg/mL), anfotericina B (0,25g/mL). - Separao por gradiente percoll (1,073g/mL), 7 lavadas e plaqueadas 10 clulas/frasco. - Incubadas em estufa 5% CO2 a 37C - Troca do meio realizado no 4 dia do cultivo, e aps duas vezes por semana. Passagens realizadas no 9, 10 e 11 dias de cultivo, por 3 2 replaqueamento de 8 x 10 clulas/cm . 7 - Total de 3 x 10 clulas transplantadas. - Coleta 5 8mL MO diluda em heparina (100U). - Adio de DMEM suplementado com SFB 10%, produzindo a suspenso celular por centrifugao. - Resuspenso em 5mL de DMEM e SFB 10%. - Separao por gradiente percoll (70% de densidade inicial). - TA foi macerado e lavado duas vezes em PBS. - Digesto enzimtica com colagenase 0,075% e centrifugao para a obteno da suspenso celular. 6 - Plaqueadas 1 x 10 clulas/frasco. - Ambas cultivadas em monocamadas na estufa 5% CO2 a 37C, at atingir confluncia de 80%, - Remoo das clulas aderentes com tripsina 0,25% - Amostra de 2mL MO diluda em 0,1mL heparina (3000UI). - Separao por gradiente ficoll (0,7mL), 200g por 15 minutos. - Lavagens tripla em meio Ham F-12 200g por 5 minutos. - Cultivo em meio Ham F-12 suplementados com SFB 10%, penicilina G (100U/mL), estreptomicina (0,1mg/mL), anfotericina B (0,25g/mL), estufa 2 5% CO2 em frascos de cultura de 25 cm . - Meio trocado a partir do 3 dia, e aps todos os dias at o 20dia.

BRUDER et al., 1998

Canina

MO

MO

HUANG et al., 2005

Humanos

TA

IM et al., 2001

Coelhos

MO

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- Remoo das clulas aderentes com tripsina 0,25% e 0,001M EDTA, 3 lavagens em meio Ham F-12 e contagem das clulas em hemocitmetro. - O nmero mdio de clulas foi de 3,4 (1,5)x 6 6 10 antes e 2,3 (0,6)x10 aps a cultura.MO Medula ssea, TA Tecido adiposo, SFB Soro fetal bovino, PBS soluo salina tamponada

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3 CONSIDERAES FINAIS

O desenvolvimento tecnolgico e cientfico crescente das instituies de ensino e, principalmente das empresas voltadas a produo de materiais para cultivo de clulas, tm auxiliado os pesquisadores na obteno de protocolos de isolamento e de culturas mais eficazes. Esses materiais, como as estufas com controle de temperatura e umidade, frascos e meios de cultivo, buscam fornecer um ambiente in vitro adequado as clulas, assemelhando-se as condies in vivo, para que essas possam se proliferar e diferenciar em linhagens celulares especficas. Nesta reviso observou-se que as clulas-tronco mesenquimais com potencial reparador podem ser obtidas, isoladas e expandidas de diferentes formas e condies, devido a diversidade dos protocolos de isolamento e cultura existentes. Essa diversidade traz benefcios relacionados ao desenvolvimento de procedimentos que forneam alto rendimento e viabilidade das clulas mesenquimais, aumentando assim o nmero de clulas finais transplantadas. Atualmente, o foco chave para a elaborao de pesquisas cientficas tem sido acerca do mecanismo de diferenciao in vitro das clulas-tronco cultivadas em laboratrio. Para isso, tm-se utilizado em associao substncias exgenas como os fatores de crescimento, dentre os quais esto s protenas morfogenticas sseas (BMP), fatores de crescimento fibroblsticos (FGF), fatores de crescimento neurotrficos (NGF), e outros. Espera-se que, no futuro prximo, as vias de sinalizao para a diferenciao celular sejam melhor compreendidas, possibilitando o controle, direcionamento e diferenciao em clulas com capacidade de regenerar tecidos lesados.

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4 REFERNCIAS

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