Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula ... · Helena Cramer, pelo companheirismo e espírito crítico. É uma amiga que ... Lúcia de Albuquerque e aos demais integrantes

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIROCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDEFACULDADE DE MEDICINAPrograma de Pós-Graduação em Medicina – Cardiologia

Transplante Autólogo de CélulasMononucleares da Medula Óssea para Pacientescom Cardiomiopatia Isquêmica Crônica:Correlação do Fenótipo Celular com a EvoluçãoClínica.

Suzana Alves da Silva

Orientadores:Prof. Dr. Aristarco G. Siqueira Filho

Prof. Dr. Radovan BorojevicProf. Dr. Hans Jürgen Fernando Dohmann

Rio de Janeiro, RJ2006

Transplante Autólogo de Células Mononucleares da MedulaÓssea para Pacientes com Cardiomiopatia Isquêmica Crônica:Correlação do Fenótipo Celular com a Evolução Clínica.

Suzana Alves da Silva

Orientadores:Prof. Dr. Aristarco G. Siqueira Filho

Prof. Dr. Radovan BorojevicProf. Dr. Hans Jürgen Fernando Dohmann

Dissertação de mestrado submetida ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação emMedicina, área de concentração em Cardiologia, da Universidade Federal do Rio deJaneiro como parte dos requisitos necessários à obtenção do Grau de Mestre emCardiologia.

Aprovada em ___ de __________de_____ .

Banca Examinadora:

__________________________________________________________________Prof. Sergio Salles Xavier

__________________________________________________________________Profa. Maria Isabel Doria Rossi

__________________________________________________________________Prof. Cantídio Drumond Neto

Rio de Janeiro, RJMarço, 2006

SILVA, Suzana A.

Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula Óssea para Pacientes com Cardiomiopatia Isquêmica Crônica: Correlação do Fenótipo Celular com as Variáveis ClínicasAnalisadas / Suzana Alves da Silva. Rio de Janeiro, UFRJ, Faculdade de Medicina, 2006.

xiii, 132 p., il.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina,2006.

1.Terapia Celular 2.Células-Tronco 3.Angiogênese Fisiológica 4.Insuficiência CardíacaCongestiva 5.Isquemia Miocárdica 6.Cardiologia – Tese. I. Dissertação (Mestrado) – Faculdade deMedicina. II. Título

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A aqueles que lutam pelaconstrução de uma sociedade mais

ética e justa para todos.

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Agradecimentos

Chegamos ao final de mais uma longa jornada. Uma luta que se iniciou lá nojardim de infância e que resultou numa graduação em um curso de medicina. Muitaspessoas foram importantes e decisivas nesta caminhada. O apoio da minha família, oexemplo de vida dos meus pais, o carinho dos meus avós, meus irmãos Marcelo eRosane, primos e tios me ajudaram a construir toda uma história. Ensinaram-me acompartilhar os mais belos sentimentos.

Também existe um espaço para você, aqui, meu Amor! Obrigada André, pelocarinho, compreensão e apoio!

Algumas outras pessoas também foram muito especiais. Para todas estas pessoaseu deixo aqui a minha gratidão. Dentre elas eu destaco o Prof. Rogério José dos SantosReis. Foi quem me ensinou os primeiros passos dentro do campo apaixonante dacardiologia. Seu espírito crítico, inovador, sua paixão pelo conhecimento e pelo bem aopróximo despertaram em mim a curiosidade pela pesquisa clínica. O desejo não só pelacardiologia, mas também pelo desenvolvimento do conhecimento científico, e poratravessar os limites da ciência surgiram ali. Foram nas discussões clínicas, nosatendimentos ambulatoriais e de enfermaria cuidadosamente supervisionados por ele,nas discussões clínicas pelos corredores do Hospital Gafrée-Guinle, que o surgimentode diferentes idéias, capazes de responder questionamentos clínicos até então semresposta, era instigado. Rogério foi e é muito mais que um mestre. Além de um grandemestre, um grande amigo.

A minha grande amiga Dra Adna do Nascimento Lima, companheira de vida.

Dr. Marcello Bittencourt, Dr. Luis Eduardo Drumond e Dr. Gustavo Gouveia,foram os principais responsáveis por minha decisão de fazer a residência em cardiologiana Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro. A invejável competência profissionaldeles foi fundamental naquela que eu considero uma das melhores escolhas da minhavida.

Ao longo desta jornada conheci outras pessoas maravilhosas, motivadoras.Dentre elas não poderia deixar de destacar o Prof. Dr. Cantídio Drumond Neto, porquem tenho enorme admiração. Chefe da Sexta enfermaria de Cardiologia da SantaCasa de Misericóridia do Rio de Janeiro, assessorado pela Dra Lílian Soares da Costa epelo Dr. Marcelo Montera, sempre exigiu de seus residentes nada mais, nada menos,que a excelência. Sempre ofereceu carinho, motivação, apoio e reconhecimento.Sentimentos de um Mestre, quase um Pai, compartilhados com todos os que estão a suavolta. A filosofia de sua enfermaria de cardiologia, de incentivo a pesquisa e raciocínioclínico perspicaz, sempre me motivou a buscar o que havia além da aparência dos fatos.

Ao Dr. Marcelo Montera e ao Dr. Fernando Oswaldo Dias Rangel,coordenadores da Residência em cardiologia da Sexta enfermaria da Santa Casa deMisericóridia do Rio de Janeiro / Hospital Pró-Cardíaco, cuja postura de Mestresexigentes, perfeccionistas, exigiu de todos que se formaram por esta residência, umraciocínio crítico fundamentado em conhecimento amplo e profundo.

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À Dra. Helena Cramer, pelo companheirismo e espírito crítico. É uma amiga queeu admiro muito.

À Dra. Andréa Dornelles e à Dra. Mônica Mathias, que foram minhas “R3”durante a residência em Cardiologia na Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro.Representam para mim o verdadeiro exemplo de motivação, garra e enorme capacidadede luta para modificar a realidade, muitas vezes cruel. São exemplos de amizade,generosidade, humanidade, perseverança e vontade de vencer.

Não poderia deixar de aproveitar esta oportunidade para destacar minha enormegratidão ao Dr. Hans Fernando Dohmann. Foi quem abriu espaço para a residência emcardiologia no Hospital Pró-Cardíaco; foi quem criou, idealizou e consagrou o ProjetoCélula Tronco. Foi quem, certo e belo dia, durante a residência em cardiologia noHospital Pró-Cardíaco, olhou para mim e me deu uma chance. Trouxe para mim aoportunidade de trabalhar com a pesquisa em todas as suas fases; trouxe para o Estadodo Rio de Janeiro a demonstração de que a parceria público-privada é possível e poderesultar em um ganho enorme, não somente para os profissionais de saúde, mas tambémpara toda a população. Ele simboliza uma mistura de sonho, fantasia, inovação, escolha,esperança, motivação, vontade, obstinação, convicção, teimosia, respeito, alegria,confiança, amizade, suporte, sensibilidade, inteligência, sabedoria e experiência,sentimentos e qualidades que me fizeram acreditar, lutar e vencer. Não tenho palavraspara expressar o quanto o admiro e o quanto me orgulho por fazer parte da sua equipe.Descrever o Dr. Hans Fernando Dohmann, a dimensão da sua pessoa, está além daminha capacidade. Minha eterna gratidão a você Hans, um ser humano admirável.

Minha gratidão também ao Dr. André Luis Silveira Sousa, pela amizade e pelosuporte em todas as etapas da pesquisa. Foi quem, junto com toda a equipe, fez esteprojeto “acontecer”. Ao Dr. Emerson Perin, Dr. James Willerson e ao Dr. GuilhermeSilva, pelo auxílio no desenvolvimento deste projeto.

À Dra. Andréa Haddad; Dr. Fabio Tuche e Dr. Rodrigo Carvalho. Obrigada porvocês serem o que são e por representarem o que representam para mim e para a equipe.

A toda a equipe do Projeto Célula-Tronco, especialmente à Ana Cristina Reis,que além de grande companheira e amiga, foi uma pedra angular na viabilização desteprojeto. Obrigada Aninha por seu entusiasmo, sua dedicação, sua competência e seuprofissionalismo. À Alcione Braga, que embora tenha sido admitida na equipeposteriormente ao início deste projeto, contagiou a todos com sua ética eprofissionalismo. À Rosalia (Gonzalez Martinez de Cerqueira Joaquim...), que tambémchegou depois, mas que rapidamente conquistou toda a equipe com sua ternura.Eficiência é o seu lema! À Rita Weiler e Alessandra Borges, pela organização inicialdeste projeto e agendamento dos pacientes.

À Christine Rutterford, sempre presente e companheira, responsável pela análisedos questionários de qualidade de vida de todos os pacientes.

À Dra. Cíntia Miguel Peixoto e Dr. Gustavo Michelstaedter Rodrigues, pelaanálise dos eletrocardiogramas de todos os pacientes.

Ao Dr. Ivan Maia e sua equipe, pela realização e análise dos exames de Holterde 24 horas e ECG-AR.

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À Dra. Maria Claudia, ao Dr. Roberto Magalhães, ao Dr. Ângelo Maiolino e Dr.Edmilson, pela coleta do material de medula óssea neste estudo.

À incansável equipe do Prof. Dr. Radovan Borojevic, responsável pelo preparodas células da medula óssea e avaliação de histopatologia: Profa. Dra. Maria IsabelRossi; Dr. Hamilton Junior; Dr. Hélio Dutra; Dra. Rosana Bizon e Profa. Dra. ChristinaTakyia.

Ao Prof. Dr. Ronir Raggio; Prof. Dr. Antonio Cláudio da Nobrega e ao Dr.Bernardo Tura, pelas orientações quanto à metodologia e análise estatítica destadissertação.

À Dra. Ellen Barroso, Dr. Mario Amar e Dr. Joaquim Coutinho, peloencaminhamento de vários pacientes em fila de transplante cardíaco no estado do Rio deJaneiro, entre os quais seis foram incluídos neste protocolo de pesquisa.

Minha gratidão a todos os setores, do Hospital Pró-Cardíaco, representados porseus chefes de serviço, secretárias, rotinas médicas e demais integrantes do corpoclínico, pelo comprometimento com este projeto de pesquisa, que por natureza émultidisciplinar. Destaco aqui os nomes do Dr. Luís Antonio Carvalho, Dr. NelsonMattos, Dr. André Feijó, Dr. Constantino Gonzáles, Dr. Carlos Henrique Eiras Falcão e,especialmente, ao Dr. André Sousa, Dr. Rodrigo Verney Castello Branco e Dr. JoãoAlexandre Assad, pela análise dos resultados e pelos procedimentos de intervenção(NOGA e angiografia); Dr. Roberto Esporcatte; Dr. Fernando Rangel; Dr. RicardoMourille; Dr. Luís Antonio de Almeida Campos; Dr. Renato Vieira Gomes; Dr. MarcoAurélio Fernandes; Dr. Pedro Nogueira; Dr. Alexandre Rouge Felippe; Dr. AntonioSabino; Dr. Daniel Filho e Dr. Ronaldo Veigni, pelo acompanhamento dos doentes nafase intra-hospitalar; Dr. Luciano Belém; Dr. Arnaldo Rabischoffiski; Dr. JulioTolentino; Dra. Fernanda Nogueira pela análise dos ecocardiogramas de todos ospacientes; Dr. Cláudio Tinoco Mesquita, Dr Adair, pelos exames de cintilografia; Dr.Evandro Tinoco Mesquita; Dr. André Volschan; Dra. Mônica Araújo, pelo atendimentodos pacientes no setor de emergência durante o seguimento do estudo; Dr. AmarinoJunior, pela realização dos exames de ressonância cardíaca; Dr. Ricardo Viváqua; Dr.Salvador Serra e Dra. Valeria Rubin pelos exames de ergometria de todos os pacientes;Ana, do laboratório lâmina, pela coleta dos exames laboratoriais e armazenamento deamostras; Dra. Ângela Carrano, pela coleta do BNP.

À Enf. Solange Teitelroite; pelo profissionalismo e comprometimento com esteprojeto. À Enf. Francimar Tinoco; ao Enf. Ângelo Dettogni de Oliveira; à Enf. AnaLúcia de Albuquerque e aos demais integrantes da equipe de enfermagem da unidadecoronariana; unidade de pós-operatório, unidade semi-intensiva, unidade de curtapermanência e emergência do Hospital Pró-Cardíaco, pelo brilhante desempenho,fundamental, no acompanhamento intra-hospitalar dos pacientes.

Aos acionistas e diretores do Hospital Pró-Cardíaco por terem acreditado nesteprojeto, no trabalho da equipe e viabilizado todas as condições necessárias ao sucessodo mesmo.

Aos meus orientadores Prof. Dr. Radovan Borojevic; Prof. Dr. AristarcoSiqueira e Prof. Dr. Hans Jürgen Dohmann.

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“It is a common sense to take a method and try it: if it fails, admit it frankly and tryanother. But above all try something.”

Franklin Roosevelt

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SUMÁRIOLISTA DE ABREVIAÇÕES...................................................................................................................... xRESUMO .................................................................................................................................................. xiABSTRACT ............................................................................................................................................. xiiINTRODUÇÃO E OBJETIVOS................................................................................................................ 11. FUNDAMENTOS............................................................................................................................... 2

1.1. Terapia Celular .......................................................................................................................... 41.2. Células-Tronco .......................................................................................................................... 51.3. Células-Tronco Adultas.............................................................................................................. 61.4. Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Cardiomiócitos ............................... 61.5. Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Células Endoteliais......................... 71.6. Fatores de Crescimento e Angiogênese....................................................................................... 81.7. Doença Arterial Coronariana Aguda........................................................................................... 91.8. Cardiomiopatia Isquêmica Grave.............................................................................................. 111.9. Fenótipos Celulares.................................................................................................................. 13

2. HIPÓTESES ..................................................................................................................................... 153. OBJETIVOS PRINCIPAIS E SECUNDÁRIOS.............................................................................. 164. METODOLOGIA............................................................................................................................. 17

4.1. Desenho do estudo ................................................................................................................... 174.2. Alocação/Avaliação/Acompanhamento dos pacientes ............................................................... 174.3. Critérios de Inclusão ................................................................................................................ 174.4. Critérios de Exclusão ............................................................................................................... 184.5. Eventos Adversos..................................................................................................................... 18

4.5.1. Eventos adversos maiores.................................................................................................... 184.5.2. Eventos adversos menores ................................................................................................... 194.5.3. Efeitos adversos maiores e menores relacionados aos outros procedimentos que compõemeste protocolo ..................................................................................................................................... 19

4.6. Fase de Seleção........................................................................................................................ 194.7. Fase de Tratamento .................................................................................................................. 20

4.7.1. Mielograma – Punção da Medula Óssea ............................................................................... 204.7.2. Preparo do Aspirado Medular Seletivo ................................................................................. 214.7.3. Efeitos adversos................................................................................................................... 214.7.4. Período do Implante ............................................................................................................ 21

4.8. Fase de seguimento .................................................................................................................. 224.9. Análise dos Dados.................................................................................................................... 234.10. Análise Estatística.................................................................................................................... 234.11. Cronograma do Estudo............................................................................................................. 24

5. EXPLICITAÇÃO DE COMO OS ASPECTOS ÉTICOS FORAM CONTEMPLADOS............... 256. RESULTADOS FINAIS ................................................................................................................... 267. DISCUSSÃO ..................................................................................................................................... 41

7.1. Segurança e Exeqüibilidade...................................................................................................... 417.2. Angiogênese ............................................................................................................................ 417.3. Cardiomiogênese...................................................................................................................... 427.4. Fenótipos celulares e correlação com as variáveis clínicas analisadas........................................ 447.5. O número de injeções, a concentração da solução contendo células da medula óssea e a áreade distribuição destas células no miocárdio isquêmico: estão adequados? ................................................ 477.6. Limitações ............................................................................................................................... 48

8. CONCLUSÕES ................................................................................................................................ 509. CONCLUSÃO FINAL...................................................................................................................... 51REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................................... 52ANEXOS .................................................................................................................................................. 64

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LISTA DE ABREVIAÇÕESAC – AnticorpoAC133+ – Células com expressão do antígeno CD133, reconhecido pelo AC133Ad5FGF5 – Vetor de adenovírus humano carreando o gen para expressão de FGF5BNP – do inglês, Brain Natriuretic Peptide.CCSC – do inglês, Canadian Cardiovascular Society Angina SeverityClassificationCD – do inglês, Cluster of DifferentiationCD34+ – Células com expressão do antígeno CD34CMMO – Células Mononucleares da Medula ÓsseaCPE – Célula Projenitora EndotelialCTMO – Células-Tronco da Medula Óssea%DPMR50 – Percentual de Defeito de Perfusão Miocárdica em Repouso comatividade de 50% (fibrose), pela cintilografia miocárdica de perfusãoECG-AR – Eletrocardiograma de Alta ResoluçãoELL – Encurtamento Linear Local (NOGA)FE – Fração de EjeçãoFGF – do inglês, Fibroblast Growth FactorHGF – do inglês, Hepatocyte Growth FactorHIF – do inglês, Hypoxia-Inducible FactorIAM – Infarto Agudo do MiocárdioLin-ckit+ – Células de linhagem hematopoiética negativa, com expressão do

receptor ckit para SCFNYHA – do inglês, New York Heart AssociationPCR-t – Proteína C Reativa, tituladaPET-FDG – do inglês, Positron Emission Tomography – 18Fluor-2Deoxy-D-GlucosephVEGF – Vetor de DNA plasmidial carreando VEGFSCF – do inglês, Stem Cell FactorSF-36 – do inglês, 36-Item Short-Form Health Survey QuestionnaireSPECT – do inglês, Single Photon Emission Computed TomographySUS – Sistema Único de SaúdeTACMMO – Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula ÓsseaTDPMR – Total de Defeito de Perfusão Miocárdia Reversível (isquemia), em

percentual, pela cintilografia miocárdica de perfusãoVDF – Volume Diastólico FinalVEGF – do inglês, Vascular Endothelial Growth FactorVEGFR – do inglês, Vascular Endothelial Growth Factor ReceptorVSF – Volume Sistólico Final

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RESUMO

Objetivo: Este estudo tem por objetivo avaliar a exeqüibilidade e a segurança doTransplante Autólogo, transendocárdico, de Células Mononucleares da Medula Óssea(TACMMO), para pacientes com cardiomiopatia isquêmica terminal e correlacionar osdiferentes fenótipos, do “pool” total de células monononucleares da medula óssea(CMMO) injetadas, com a melhora relativa das variáveis clínicas analisadas.

Métodos: Vinte e um pacientes foram incluídos neste estudo prospectivo (os 14primeiros pacientes, grupo tratado; os 7 últimos pacientes, grupo controle). Inicialmentetodos os indivíduos foram submetidos à avaliação clínica e laboratorial, questionário dequalidade de vida (SF-36 e Minnessota), teste ergométrico, ecocardiograma,cintilografia miocárdica, ECG-AR e Holter de 24 horas. As CMMO foram isoladas,lavadas e diluídas em salina 0,9%, contendo albumina humana, para injeçãotransendocárdica, por meio do cateter MyoStar® NOGA, no grupo tratado.Imediatamente antes do procedimento, os pacientes do grupo tratado foram submetidosa uma angiografia inicial seguida de mapeamento eletromecânico, para identificação daárea de miocárdio viável a ser tratada (voltagem unipolar � 6,9 mV e encurtamentolinear local � 12%). Os exames não invasivos foram repetidos em todos os pacientes aofinal de 2; 6 e 12 meses de acompanhamento. Os pacientes do grupo tratado foramsubmetidos à nova angiografia e mapeamento eletromecânico ao final de 4 meses deseguimento. A melhora relativa destas variáveis clínicas foi correlacionada com opercentual, número total e densidade das CMMO injetadas e seus fenótipos, através doteste rho de Spearman (p � 0,05).

Resultados: Os fatores de risco e demais características clínicas não diferiramsignificativamente entre os grupos na avaliação inicial. Não foram observados eventosadversos maiores relacionados ao TACMMO. Ao final de 1 ano de seguimento houveredução significativa da área isquêmica na imagem de perfusão nuclear (p = 0,01).Também foi observado melhora significativa dos sintomas de angina (p = 0,002) e deinsuficiência cardíaca (p = 0,01), assim como, da capacidade funcional, pelo testeergométrico (p = 0,03). O total de células viáveis e os fenótipos CD45lo, HLADR-,ckit+CD45-, CD14+, CD19+, CD34+, CFU-F e CFU-GM se correlacionarampositivamente com a melhora de algumas variáveis clínicas analisadas, enquanto que ascélulas CD56+ se correlacionaram negativamente. As células CD4+, CD8+ e CD19- secorrelacionaram de forma ambígua com tais variáveis.

Conclusão: Este estudo demonstra a exeqüibilidade e a segurança da realização deinjeções transendocárdicas de CMMO em pacientes com cardiopatia isquêmicaassociada a grave disfunção ventricular. Os efeitos observados em curto prazo forammantidos até 12 meses de seguimento. Houve correlação significativa dos fenótiposcelulares com as variáveis clínicas analisadas. É possível que haja um efeito parácrino,em longo prazo, das células injetadas, mas as funções específicas de tais células, noprocesso de reparo tissular, ainda precisam ser elucidadas.

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ABSTRACT

Objective: This study aims to assess the safety and feasibility of Autologous,transendocardial, Bone Marrow Mononuclear Cells Transplantation (ABMMCT) inpatients with end-stage ischemic cardiomyopathy and correlate the different cellsphenotypes of the total pool of bone marrow mononuclear cells (BMMC) injected withthe relative improvement of analyzed clinical variables.

Methods: Twenty-one patients were enrolled in this prospective study (first 14 patientsforming the treated group and the last 7 patients forming the control group). Initially allpatients underwent clinical and laboratorial assessment, quality of life questionnaire(SF-36 e Minnessota), ramp treadmill test, echocardiogram, myocardial scintigraphy,SA-ECG e 24 hour Holter. BMMC were isolated, washed and diluted in saline withalbumin for injection, using MyoStar® NOGA catheter, in treated group. Just beforeprocedure, treated patients underwent to initial angiography followed byelectromechanical mapping in order to identify areas of viable myocardium (unipolarvoltage � 6.9 mV e linear local shortening � 12%) for cells treatment. Non invasivetests were reassessed after 2; 6 and 12 months of follow up in all patients. Angiographyand electromechanical mapping were repeated only in treated group at 4 months. Therelative improvement of these clinical variables was correlated to percentage, totalnumber and density of BMMC injected and their different phenotypes, throughSpearman’s rho test (p � 0.05).

Results: Demographic data and other clinical characteristics did not differ betweengroups in the initial evaluation. No major adverse events related to ABMMCT wereobserved. At the end of 12 month follow up, a reduction in the ischemic area wasobserved on nuclear perfusion imaging (p = 0.01). It was also observed a significantimprovement on symptoms of angina (p = 0,002) and congestive heart failure (p =0.01), as well as, functional capacity, by ramp protocol (p = 0.03). The viable cells andthe cells fenotype CD45lo, HLADR-, ckit+CD45-, CD14+, CD19+, CD34+, CFU-F andCFU-GM were positively correlated to the clinical improvement of some analyzedclinical variables, while the cells CD56+ were negatively correlated to it. The CD4+,CD8+ and CD19- cells were ambiguously correlated to those variables.

Conclusion: This study showed that transendocardial injections of BMMC are safe andfeasible in patients with ischemic heart disease associated to severe ventriculardysfunction. The effects observed in the short term were maintained up to twelve monthfollow up. There was significant correlation between cells phenotype and analyzedclinical variables. It is possible that these cells maintain a long term paracrine effect onmyocardium, however, the specific functions of these cells on tissue repair process stillneed to be elucidated.

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Universidade Federal do Rio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Medicina – Cardiologia

INTRODUÇÃO E OBJETIVOSVários estudos recentes vêm demonstrando, de forma cada vez mais consistente,

que células originadas na medula óssea participam intensamente da regeneração devárias estruturas do sistema cardiovascular. Apesar dos diversos estudos experimentaise clínicos publicados até o momento, do implante de diferentes tipos de célulasoriginadas da medula óssea no miocárdio isquêmico, através de múltiplas técnicas deinjeção, ainda se desconhecem os mecanismos de regeneração tecidual observado comos métodos desenvolvidos.

Este estudo tem por objetivo, portanto, avaliar a correlação do fenótipo celulardo “pool” total de células mononucleares da medula óssea que foram injetadas por viapercutânea, transendocárdica, utilizando o cateter de injeção NOGA MyoStar Cordis,em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica grave terminal, com as variáveisclínicas analisadas. Esta informação pode ter um potencial único de sugerir o papel dealgumas células neste processo de reparo tecidual no sentido de otimizá-lo ou retardá-lo.

Esta correlação é baseada nos resultados do “Estudo prospectivo, randomizado,para avaliar a segurança e a exeqüibilidade do Transplante Autólogo, transendocárdico,de Células Mononucleares da Medula Óssea (TACMMO) em pacientes com cardiopatiaisquêmica grave terminal, com a perspectiva de reduzir a área de fibrose e melhorar aperfusão miocárdica em relação ao grupo controle”, que foram previamente publicados1-

3 e encontram-se nos anexos II, III e IV, desta dissertação. Sumariamente, foramincluídos 21 pacientes distribuídos em 2 grupos: grupo tratado = 14 e grupo controle =7. O acompanhamento clínico foi realizado durante o período de 12 meses comaplicação de dois questionários de qualidade de vida (Minnessota e SF-36) e realizaçãode ECG, ecocardiograma, teste ergométrico, Holter 24 horas, ECG-AR(Eletrocardiograma de alta resolução), cintilografia miocárdica com estressefarmacológico com dipiridamol, avaliação laboratorial incluindo dosagens de PCRt(Proteína C Reativa titulada) e BNP (do inglês Brain Natriuretic Peptide), ao final de 2;6 e 12 meses de acompanhamento e coronariografia com ventriculografia esquerda emapeamento eletromecânico (NOGA) ao final de 4 meses de seguimento.

As seguintes variáveis foram selecionadas para a correlação celular: os escoresde pontos dos questionários de qualidade de vida (Minnessota e SF-36); fração deejeção (FE – Simpsom); volume sistólico final (VSF – Simpsom); volume diastólicofinal (VDF – Simpsom); pico de VO2 (teste ergométrico pelo protocolo de rampa);percentual de extra-sístoles ventriculares (ESV – Holter de 24 horas); duração do QRS(dQRS – ECG-AR); total de defeito de perfusão miocárdica reversível (TDPMR) epercentual de defeito de perfusão miocárdica em repouso, com atividade de 50%(%DPMR50 – cintilografia miocárdica de perfusão) e BNP, ao final de 2; 6 e 12 mesesde acompanhamento; FE (angiografia esquerda); encurtamento linear local (ELL) evoltagem unipolar (mapeamento eletromecânico – NOGA) ao final de 4 meses deseguimento.

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1. FUNDAMENTOSA insuficiência cardíaca, que tem entre suas causas mais freqüentes a

cardiomiopatia isquêmica, é um mal epidêmico neste início de século. Estadoença afeta de 2 a 4 milhões de pessoas nos Estados Unidos (EUA) e cerca de15 milhões de pessoas ao redor do planeta.4 No Brasil, segundo dados doDATASUS, a insuficiência cardíaca gera mais de 300.000 internações/ano,sendo a quarta maior causa de internação hospitalar (2,77% de todas asinternações feitas em 2005).5 Este total representa cerca de 26% de todas asinternações por doenças circulatórias, com uma mortalidade hospitalar de6,39%.5

Da mesma forma que no Brasil, a insuficiência cardíaca nos EUA é aprincipal causa de internação entre os pacientes com mais de 65 anos.4 Apósuma internação hospitalar, a sobrevida gira em torno de 1,47 anos para oshomens e 1,39 anos para as mulheres.6 Os casos mais graves correspondem a10% do total da população com insuficiência cardíaca.6 Além da altamortalidade (18% em 30 dias 42% em 1 ano e 75% em 5 anos),4 esses casosconsomem uma grande quantidade dos recursos do sistema de saúde. Mais deR$ 6 bilhões foram gastos em 2005 pelo Sistema Único de Saúde (SUS) cominternações hospitalares, sendo que cerca de R$ 230 milhões (3,4% do total)foram destinados às internações por insuficiência cardíaca.5

Face ao aumento da expectativa de vida no mundo ocidental nas últimasdécadas, a incidência de insuficiência cardíaca vem aumentando. Além disso,devido à evolução do tratamento do Infarto Agudo do Miocárdio (IAM), a taxade mortalidade relacionada a essa doença vem diminuindo e, comoconseqüência, ocorre um aumento da população de pacientes que têm comoseqüela a insuficiência cardíaca.4

O aprimoramento das diversas técnicas de revascularização miocárdica,sejam percutâneas ou cirúrgicas, permitiu resultados cada vez mais efetivosquanto à qualidade de vida, morbidade e mortalidade de coronariopatas, agudosou crônicos. Contudo, apesar do impacto positivo destes procedimentos, hápacientes que, por limitações individuais, não podem se beneficiar de recursosterapêuticos com este nível de efetividade.7 Entender as características clínicasdesta população é fundamental para que se possa identificar e desenvolveralternativas capazes de suprir suas necessidades específicas.

Do aspecto clínico, em termos gerais, estes pacientes são caracterizadospela presença de doença coronariana de longa duração, geralmente com históriaclínica de múltiplas revascularizações, precordialgia grave e incapacitante, edisfunção sistólica do ventrículo esquerdo.7

Cerca de 90% destes indivíduos já foram submetidos a, no mínimo, umprocedimento cirúrgico de revascularização, sendo que aproximadamente ametade deles já realizou mais do que 3 procedimentos percutâneos. Após estarealização sucessiva de técnicas de revascularização, o paciente geralmentealcança um estágio avançado de doença. Este estágio é caracterizado por:artérias de pequeno calibre, muitas vezes mantidas por extensa rede de colateraisinsuficientes para gerar perfusão miocárdica adequada; anatomias complexas,


muitas vezes envolvendo enxertos arteriais e/ou venosos, com dificuldade deacesso percutâneo; presença de doença arterial periférica concomitanteinviabilizando o uso de enxertos arteriais para revascularização ou o acesso doscateteres de angioplastia; presença de doença aterosclerótica coronariana graveno leito distal, que atenuam os potenciais benefícios dos procedimentos derevascularização.7

Estes pacientes são, na maior parte dos casos, do sexo masculino eencontram-se entre a sexta e a sétima décadas da vida. Noventa e um por centodeles já sofreram IAM. A mesma proporção apresenta angina classe III ou IVda classificação da Sociedade Canadense de Cardiologia (CCSC, do inglêsCanadian Cardiology Society Anginal Severity Classification) e, da mesmaforma, cerca de 95% destes pacientes encontra-se em classe funcional III ou IVda classificação da Associação do Coração de Nova Iorque (NYHA, do inglêsNew York Heart Association). A FE média destes pacientes é de 49,5 ± 16,4%.Nesses pacientes com estágio avançado de doença os custos chegam a ser de 8 a30 vezes maiores que nos pacientes com classe funcional II.8

O intenso consumo de medicamentos é também uma realidade na vidadesses pacientes. Quase todos tomam nitratos e 60 a 80% usam beta-bloqueadores associados a inibidores da enzima de conversão doangiotensinogênio a angiotensina, além de diuréticos. Cerca de um terçoutilizam digital regularmente e mais de 70% usam bloqueadores dos canais decálcio. Os sintomas freqüentes, somados ao uso expressivo de medicamentos,geram além de uma piora na qualidade de vida dos pacientes, um elevadoconsumo dos recursos do sistema de saúde.8

Há enorme preocupação com este subgrupo de coronariopatas graves,uma vez que seu número cresce progressivamente como produto dos melhoresresultados obtidos com os procedimentos de revascularização e com os novosmedicamentos utilizados para prevenção secundária.

Neste sentido, vários fármacos foram aprovados para o uso clínico comoos inibidores da enzima conversora do angiotensinogênio a angiotensina e osinibidores dos receptores do tipo I de angiotensina II. Da mesma forma, velhosfármacos tiveram suas indicações expandidas, tais como os beta-bloqueadores;outros tiveram sua indicação ratificada tais como os diuréticos antagonistas daação da aldosterona.8-10 Além disso, outras técnicas foram desenvolvidas e comoexemplo podemos citar a cardiomioplastia, a cirurgia de Randas Batista, otransplante cardíaco e o implante do coração artificial. Todas representamalternativas em uso clínico para minorar os sintomas da insuficiência cardíaca.11

Várias estratégias terapêuticas vêm sendo testadas, da mesma forma,para o tratamento da angina refratária crônica, tais como o uso intermitente ouem longo prazo de uroquinase; neuroestimulação;7, 12-14 revascularizaçãotransmiocárdica por laser, radiofreqüência ou mecânica;15 e neoangiogêneseatravés do implante de fatores de crescimento endoteliais.16, 17 Nenhuma destastécnicas, no entanto, a despeito de alguns anos de desenvolvimento, demonstrouefetividade no sentido de alterar o mau prognóstico destes pacientes, de forma ajustificar seu emprego clínico.7, 12-14, 18


Já no final do século passado, pesquisadores dedicados à área deoncologia começaram a focar suas atenções em um processo biológico até entãopouco estudado: o processo de angiogênese.

Não demorou para que pesquisadores que lidam com doenças isquêmicascomeçassem a aplicar o aprendizado deste processo no sentido de desenvolvertécnicas terapêuticas voltadas para estas doenças. Neste período, predominamdois nomes: Jeffrey Isner et al19, 20 e Asahara et al.21, 22 Estes pesquisadoresiniciaram a era biológica da terapêutica da doença isquêmica. Para tal,desenvolveram a terapia gênica, no sentido de aumentar a expressão de gensprodutores de fatores de crescimento envolvidos no processo angiogênico.21, 23-25

Mais recentemente, alternativas relacionadas à terapia celular começarama se desenvolver. Nos últimos dois anos alguns estudos, in vitro e in vivo, têmsido publicados sugerindo o potencial do uso de células-tronco com estafinalidade. O transplante autólogo de células satélites do músculo esqueléticosurgiu como uma opção para o tratamento destes pacientes. Da mesma forma, oTACMMO tem demonstrado in vitro e in vivo, potencial terapêutico.26

Portanto, um segundo capítulo começou a ser escrito já neste início deséculo XXI, o da terapia celular voltada para o estímulo ao processoangiogênico.

1.1. Terapia Celular

O implante de células para o tratamento de doenças cardiovascularesencontra-se sob investigação em vários centros no mundo. Várias linhagenscelulares têm sido investigadas em modelos experimentais27-31 e as primeirasséries de casos em humanos já foram descritas na literatura.32-36 Atualmente amaioria dos estudos em humanos se concentra em células de origem adulta eautóloga, em oposição ao uso de células de origem embrionária. Duas fontes decélulas foram utilizadas em humanos até o momento: a musculatura esquelética(origem dos mioblastos)34 e a medula óssea (fonte de células-tronco nosadultos).36, 37

O uso de células-tronco para o tratamento de doenças cardiovascularestem enorme potencial.

Vários estudos in vitro e in vivo demonstraram que as célulasmononucleares da medula óssea (CMMO) podem se diferenciar emcardiomiócitos e vasos.22, 38-45 O implante de células-tronco originadas namedula óssea (CTMO) foi capaz de melhorar a contração e a perfusãomiocárdica em modelos animais de infarto miocárdico e isquemia crônica.28, 42,

46, 47

Em humanos, a segurança do implante de CMMO durante a cirurgiacardíaca foi descrita no Japão,48 na Alemanha49, 50 e na Argentina.51

O uso de CMMO, por infusão intracoronariana, pós-IAM foi relatado emalgumas séries de casos52 e alguns estudos controlados.35, 36, 53-55 Também foirelatado em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica secundária a um IAM


antigo.52, 56 Os resultados de tais estudos, fase I/II, sugerem redução da área denecrose após IAM, nos pacientes submetidos à terapia celular, e reduçãosignificativa do volume sistótico final do ventrículo esquerdo com conseqüentemelhora da FE do ventrículo esquerdo nestes pacientes.32, 35, 52-57

A segurança do transplante autólogo, transendocárdico, de CMMOtambém foi demonstrada em pacientes com cardiopatia isquêmica grave.28, 58, 59

1.2. Células-Tronco

As células-tronco se caracterizam por serem células indiferenciadas,capazes de se auto-regenerarem, e de se diferenciarem em diversas linhagenscelulares. Estas células podem ter origem embrionária ou adulta.

De acordo com a sua capacidade de auto-renovação e diferenciação ascélulas-tronco podem ser classificadas como totipotentes, pluripotentes oumultipotentes: 60-62

Ø Células totipotentes têm a capacidade de gerarem sozinhas um novoembrião, incluindo as células do sincício trofoblasto que vão dar origem àplacenta. O embrião, o zigoto e as células descendentes imediatas,resultantes das duas primeiras divisões celulares após a formação do zigoto,são as únicas células consideradas totipotentes.

Ø Células pluripotentes podem proliferar-se indefinidamente in vitro sem sediferenciar, mas também podem diferenciar-se em diferentes linhagenscelulares se as condições de cultivo das células forem modificadas. Elas sãocapazes de dar origem a qualquer uma das células oriundas de uma das trêscamadas germinativas do embrião, com exceção da placenta e suasestruturas de sustentação. As células oriundas da camada interna doblastocisto 5 dias após a fertilização, tipicamente as células-troncoembrionárias, são pluripotentes. Recentemente várias evidências indicamque algumas células-tronco adultas também possuem esta propriedade.

Ø Células multipotentes têm menor capacidade de diferenciação e são,portanto, capazes de dar origem a uma pequena quantidade de linhagenscelulares específicas de acordo com o sítio tecidual em que se encontram.Entretanto, uma vez removidas de sua localização usual, tais células podemse transdiferenciar em outras linhagens celulares compatíveis com o novoambiente em que as mesmas se encontram.

Vários trabalhos na década de 90 utilizaram um outro tipo celular paraaplicação cardíaca: as células satélites do músculo esquelético em transplantescelulares para corações submetidos às lesões criogênicas ou isquêmicas.Embora, ao contrário do que se observou com mioblastos cardíacos fetais ecélulas-tronco medulares, não foi descrito o estabelecimento de junçõescomunicantes entre as células satélites transplantadas e o miocárdio.Naturalmente, o fato das células transplantadas não estabelecerem comunicaçãoelétrica com os cardiomiócitos é preocupante pois pode resultar nodesenvolvimento de focos arrítmicos.


O implante de mioblastos nas áreas de fibrose, durante a cirurgia derevascularização do miocárdio, foi a primeira descrição de terapia celular emhumanos para tratamento de doenças cardíacas.34 O comportamentoeletrofisiológico destas ilhas de músculo esquelético em meio a fibrose e oacoplamento destas novas células com os cardiomiócitos nativos é fonte depesquisas e, provavelmente, está relacionado ao desenvolvimento das arritmiasventriculares malignas que foram descritas por alguns centros europeus.63 Omesmo não foi observado com as células-tronco da medula óssea.

1.3. Células-Tronco Adultas

Na década de 60 foi descoberto que organismos adultos têm a capacidadede auto-regenerarem determinados tecidos como a pele, o epitélio intestinal eprincipalmente o sangue, que tem suas células constantemente destruídas erenovadas, num complexo e finamente regulado processo de proliferação ediferenciação celular. Durante muitas décadas estudou-se o processo dehematopoiese (processo de produção das células sanguíneas) a partir de células-tronco multipotentes, localizadas no interior dos ossos, que são capazes de darorigem a células progressivamente mais diferenciadas e com menor capacidadeproliferativa. As células-tronco da medula óssea, células-tronco multipotentes,geram as linhagens progenitoras mielóide e linfóide, que terminam por darorigem a todos os nove tipos celulares presentes no sangue, de hemácias alinfócitos. O processo de renovação celular é tão intenso que diariamente 213

novas células sanguíneas entram na circulação.64 É verdadeiramente assombrosoque o organismo consiga manter um processo proliferativo tão exuberante sobcontrole, impedindo, em circunstancias normais, que o número de célulasproduzidas exceda o necessário e que as células liberadas na circulação estejamno estágio correto de diferenciação.

A noção de que vários tecidos e órgãos do corpo humano, como o fígado,músculo esquelético, pâncreas, e sistema nervoso, tem um estoque de células-tronco, com uma capacidade limitada de regeneração tecidual após injúria, érazoavelmente recente. Ainda mais recente é a idéia de que as células-troncopresentes nestes vários órgãos são não apenas multipotentes, no sentido de quepodem gerar as células constitutivas daquele órgão específico, mas tambémpluripotentes, no sentido de que também podem gerar células de outros órgãos etecidos. Obviamente, a possibilidade de utilizar as próprias células de indivíduosadultos resolveria simultaneamente os dois principais problemas enfrentadospela bioengenharia: a rejeição imunológica relacionada aos transplantesheterólogos e as objeções ético-religiosas relacionadas ao uso de material fetal.O primeiro relato incontestável, desta propriedade das células-tronco adultas, foifeito, em 1998, por um grupo de cientistas italianos que estudaram a regeneraçãodo músculo esquelético por células derivadas da medula óssea.65

1.4. Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em Cardiomiócitos

Estudos in vitro demonstraram que as células mononucleares da medulaóssea podem se diferenciar em cardiomiócitos, através da detecção de atividade


elétrica espontânea e de receptores funcionais adrenérgicos e muscarínicos.Embora os trabalhos de Makino et al45 e Tomita et al66 tenham utilizadocondições de cultivo dos aspirados de medula óssea que favorecem a seleção decélulas do estroma, em nenhum dos dois trabalhos os autores se preocuparamcom uma caracterização fenotípica mais exata do(s) tipo(s) celular(es) queera(m) capaz(es) de se diferenciar em cardiomiócitos em cultura.

Estudos in vivo foram conduzidos em modelos experimentais com ratos,cães e porcos e em modelos de corações normais, pós-IAM e crioinjúria. Orlicet al demonstraram, através de estudos em camundongos, que células da medulaóssea injetadas na borda de áreas do miocárdio infartadas se transformavam emcardiomiócitos.41 Jackson et al demonstraram que após o IAM células marcadasda medula óssea em ratos povoavam a área das bordas do Infarto.38 Toma et aldemonstraram que células mesenquimais da medula óssea de humanos,transplantadas em corações normais de ratos, transformavam-se emcardiomiócitos.43 Estes resultados foram reproduzidos em modelos suínos deIAM onde cardiomiócitos juntamente com novos vasos, originados de células damedula óssea, foram identificados.42 Numa série de casos de análisehistopatológica de autópsias de coração de mulheres submetidas a transplante demedula óssea de doadores homens, Deb et al observaram a presença decardiomiócitos com cromossomas XY, ou seja, cardiomiócitos com origem namedula óssea.67 Outros estudos já haviam descrito a origem extra-cardíaca denovos cardiomiócitos,65, 68-70 mas este foi o primeiro a identificar a medula ósseacomo fonte de novos cardiomiócitos, revolucionando assim o conceito até entãovigente de que não há regeneração da musculatura cardíaca.

1.5. Transdiferenciação de Células-Tronco da Medula Óssea em CélulasEndoteliais

Alternativas têm sido desenvolvidas baseadas na noção conceitual de queas células endoteliais e as células-tronco hematopoiéticas derivam de umprecursor comum: o hemangioblasto.21, 71 Portanto, o paradigma de que ascélulas endoteliais eram geradas por replicação de células endoteliais madurasfoi revolucionado. Asahara et al observaram que grande parte das célulasenvolvidas no processo de angiogênese tinha origem na medula óssea.21 Maisainda, possibilitaram a descoberta de que há vasculogênese na vida adulta, ouseja, que ocorre surgimento de novos vasos na vida adulta e não somente areplicação de capilares a partir de vasos já existentes, conceito que responde porangiogênese. Após esta publicação, muitas outras se seguiram confirmandoestes resultados.71-80

As células progenitoras endoteliais (CPE), originadas na medula óssea,poderiam ser identificadas como CD34+ (CD, do inglês cluster of differentiation)e VEGFR2+ (VEGFR, do inglês Vascular Endothelial Growth Factor Receptor),embora outros marcadores como o AC133+ e CD31+ tenham sido descritos.Durante a isquemia tecidual, com a queda dos níveis de oxigênio, ocorreaumento da produção de HIF-1 (do inglês Hypoxia Growth Factor-1), que porsua vez desencadeia o aumento de vários fatores de crescimento, maisnotadamente o VEGF (do inglês Vascular Endothelial Growth Factor). Oaumento de VEGF é o principal estímulo para a mobilização das células da


medula óssea, assim como o principal sinal para o “homing” destas células nostecidos isquêmicos e sua posterior diferenciação em células endoteliais emestruturas tubulares.81 A aplicação de VEGF para a neovascularizaçãoterapêutica mobiliza as CPE.82

Shintani et al estudaram pacientes com IAM submetidos à angioplastiaprimária com sucesso e observaram significativa elevação das CPE originadasda medula óssea, que apresentaram pico sérico no sétimo dia pós-IAM. Osníveis de CPE tiveram relação com os níveis séricos de VEGF (r=0,35;p=0,01).83 Kocher et al sugeriram que a neovascularização que ocorrenaturalmente após o IAM seria insuficiente para suprir os miócitos ainda vivos,sob risco, resultando em perda progressiva de tecido viável, extensão do infartoe substituição da musculatura por fibrose. Uma maior oferta de CPE poderiapotencializar a formação de novos vasos na área infartada (vasculogênese) ou aproliferação de vasos a partir da vasculatura preexistente (angiogênese). Aneoangiogênese resultaria em diminuição da apoptose dos miócitoshipertrofiados na região perinfarto e, conseqüentemente, diminuição dadeposição de colágeno e remodelamento cardíaco, o que resultaria em melhorasustentada da função cardíaca.47

A utilização de células originadas da medula óssea em experimentos deneovascularização já conta com literatura consistente. Já foram utilizadosmodelos de isquemia miocárdica aguda e crônica em diferentes animais,utilizando a via intracoronariana, via transendocárdica e a via transepicárdica.22,

28, 46, 47, 84-91

Em todos estes estudos, o implante de CTMO foi capaz de melhorar acontração e a perfusão miocárdica.28, 42, 46, 47, 92 Modelos de membro isquêmicoem animais também foram bem sucedidos na neovascularização utilizandocélulas da medula óssea.85, 88

1.6. Fatores de Crescimento e Angiogênese

As implicações terapêuticas dos fatores de crescimento angiogênicosforam identificadas pelos estudos pioneiros de Folkman et al há 2 décadas.93

Investigações posteriores estabeleceram a possibilidade da utilização deformulações de fatores de crescimento angiogênico recombinantes com oobjetivo de desenvolver ou aumentar a rede de colaterais em modelos animais deisquemia crônica miocárdica ou de membro. Esta nova estratégia foidenominada angiogênese.94 Diversos estudos experimentais utilizando proteínarecombinante ou transferência gênica de VEGF, FGF-2 (FGF, do inglêsFibroblast Growth Factor) e HGF (do inglês Hepatocyte Growth Factor) foramrealizados.95

Transfecção gênica em seres humanos utilizando DNA carreando VEGF(phVEGF) foi inicialmente realizada para o tratamento de pacientes comisquemia grave de membros, com sucesso.96, 97 Três pacientes com dor emrepouso e tratados com 1000 µg de phVEGF evoluíram com melhorasintomática e do fluxo arterial para o membro tratado após 1 ano de seguimento.Com o aumento da dose para 2000 µg houve evidência angiográfica e


histológica de neoformação vascular.96, 97 Posteriormente, injeção diretaintramiocárdica de phVEGF-A165 foi realizada com sucesso em 5 pacientesportadores de doença coronariana sem possibilidade de revascularização(Losordo et al, 1999).98 N. Sarkar et al encontraram resultados semelhantes em7 pacientes portadores de angina refratária crônica e submetidos a injeçõestransepicárdicas de CMMO através de minitoracotomia, indicadaexclusivamente para este objetivo em um estudo de fase 1 publicado em 2001.99

Com base nos resultados do estudo de N. Sarkar et al,99 foi iniciado oestudo multicêntrico EUROINJECT ONE 100 com desenho duplo cego,randomizado e controlado por placebo. Outros 3 estudos controlados por placeboforam publicados nos Estados Unidos. O primeiro em 2001, realizado por PeterVale et al, em 6 pacientes com angina refratária, submetidos à injeçãotransendocárdica por cateter, guiada por NOGA, de phVEGF-2 em 3 pacientesdo grupo tratado e de placebo em 3 pacientes do grupo controle, com crossoverdo grupo controle para o grupo tratado 3 meses após a randomização inicial.101

Em 2002 foi publicado o segundo estudo de terapia gênica em humanos(AGENT), randomizado, duplo cego e controlado por placebo, em pacientescom angina estável classe canadense II e III. A infusão do gen do fator decrescimento de fibroblasto (FGF, do inglês Fibroblast Growth Factor) foi feitapor via intracoronariana, utilizando adenovírus como vetor (Ad5-FGF5) em 79pacientes (19 receberam placebo), com melhora dos sintomas e da contratilidadedo ventrículo esquerdo no grupo tratado.102 Posteriormente, no mesmo ano, foipublicado o terceiro estudo randomizado, duplo cego, controlado por placebo,com dose escalonada de phVEGF em 18 pacientes e de placebo em 9 pacientes,que foram submetidos a injeções transendocárdicas, também por meio de cateterNOGA de injeção.103

Estes estudos experimentais em animais e estes ensaios clínicos têm duasimplicações: primeiro, sugerem que o mecanismo fundamental pelo qual aneovascularização aumenta o desenvolvimento da rede de colaterais é através dofornecimento de citoquina suplementar a indivíduos que devido à idadeavançada, diabetes, hipercolesterolemia e outras circunstâncias ainda nãodefinidas, são incapazes de aumentar a expressão de citoquinas em resposta aisquemia tecidual; segundo, a administração de citoquina claramente representasomente um aspecto da intervenção terapêutica.

Independentemente de quanto de citoquina é administrado, a populaçãode células endoteliais residentes têm uma capacidade máxima de resposta a umdeterminado nível de fator de crescimento vascular, que pode constituir um fatorlimitante potencial para estratégias de neovascularização de tecidos isquêmicos.

1.7. Doença Arterial Coronariana Aguda

O primeiro relato de caso do uso de CMMO foi realizado na Alemanhapelo Dr Bodo Strauer em agosto de 2001, que realizou a injeção de CMMO porvia intracoronariana em um paciente após IAM com segurança.32 Na primeirasérie de casos de transplante de células por via intra-coronariana, pós-IAM,Strauer et al selecionaram 10 pacientes com IAM tratados por angioplastia


primária tardia (12 horas). Entre os critérios de inclusão não constaram avaliaçãoviabilidade miocárdica na área infartada ou FE do ventrículo esquerdo.

Os pacientes foram submetidos ao transplante de células entre o 5º e 9ºdia após o IAM. As células foram injetadas pelo lúmen de um balão deangioplastia, o qual foi insuflado no local da lesão responsável pelo IAM, e onúmero médio de células foi de 28+22 x 106, fracionadas em 6 a 7 injeções. Osprocedimentos foram realizados com segurança em todos os pacientes. Ao finalde 3 meses os pacientes apresentaram melhora da contratilidade miocárdica naárea infartada, assim como redução do VSF do ventrículo esquerdo (redução de18%), sugerindo um efeito benéfico no remodelamento cardíaco. Na análise daperfusão em repouso com tálio houve redução da área com defeito de perfusãomiocárdica em 26%.36

No estudo TOPCARE, também realizado na Alemanha, o uso de CMMO(n=9) e células-tronco selecionadas do sangue periférico (n=11), por infusãointracoronariana 4 dias após o IAM, em pacientes tratados por angioplastiaprimária, sugeriu redução da área de necrose miocárdica ao final de 4 meses.Neste estudo aberto, não randomizado, houve aumento de 15% de captação comFlúor-18 (F-fluoro-deoxi-D-glicose) na área de miocárdio infartado, pelatomografia com emissão de pósitrons (PET-FDG). Paralelamente, houvesignificativa redução de 25% no volume sistótico final do ventrículo esquerdo,associado à melhora da FE. Houve melhora da contratilidade regional, mesmonos pacientes que não tiveram critérios de viabilidade miocárdica aoecocardiograma com dobutamina.35

Em outubro de 2004 Schachinger et al publicaram os resultados finais doacompanhamento de 1 ano do estudo TOPCARE-AMI. Cinqüenta e novepacientes com IAM foram randomizados para tratamento com células-troncoselecionadas do sangue periférico (n = 30) ou CMMO (n = 29), transplantadas,por infusão intracoronariana, 4.9±1.5 dias pós-IAM. Houve aumentosignificativo da FE e diminuição do volume sistóico final do ventrículo esquerdoem ambos os grupos tratados, além de redução da área de infarto e ausência dehipertrofia reativa nas imagens de ressonância magnética cardíaca ao final de 1ano. Este estudo demonstrou a segurança do tratamento intracoronariano comambos os tipos celulares.57

Wollert et al publicaram o primeiro estudo clínico randomizado,controlado, simples cego, do implante intracoronariano de CMMO para 60pacientes (30 no grupo tratado com CMMO) 4,8 ± 1,3 dias pós-IAM com suprade ST. A FE do ventrículo esquerdo aumentou de 51.3% para 52% no grupocontrole e de 50.0% para 56.7% no grupo tratado (p = 0.0026). Esta melhora dafunção sistólica do ventrículo esquerdo foi devida principalmente à melhora dacontratilidade nos segmentos do miocárdio adjacentes a área infartada.53

Em julho de 2004 Chenn et al publicaram os resultados do primeiroestudo controlado, randomizado, com desenho duplo-cego, do implanteintracoronariano de células mesenquimais derivadas da medula óssea autóloga,em 69 pacientes pós-IAM tratados por angioplastia primária. Os pacientes foramrandomizados para o grupo tratado por injeção intracoronariana de célulasmesenquimais (n = 34) e para o grupo controle submetido à injeçãointracoronariana de solução salina (n = 35). No seguimento de 3 meses houve


diminuição significativa do defeito de perfusão miocárdica, medido pelacintilografia (SPECT), de 32 ± 11% para 13 ± 5% no grupo tratado comparadoao grupo controle (P < 0.05), e melhora da contratilidade global e segmentarpelo ecocardiograma com doppler tecidual no grupo tratado em relação ao grupocontrole (P < 0.05). Chenn et al também utilizaram mapeamento eletromecâniconos pacientes do grupo tratado. Houve melhora do ELL e da voltagemunipolar.55

Ruan et al repetiram o mesmo tipo de procedimento em 20 pacientes comIAM anterior submetidos a angioplastia primária com sucesso, em um estudoduplo-cego. Neste caso foi injetado o pool total de células mononucleares damedula óssea autóloga, por via intracoronariana, em 9 pacientes randomizadospara o grupo tratado. Houve melhora da FE e dos volumes cavitários ao final de6 meses de seguimento.54

Mais recentemente, Janssens et al publicaram os resultados do terceiroestudo controlado, randomizado, duplo-cego, do tranplante autólogo,intracoronariano, de CMMO 1 dia após IAM com supra de ST tratado porangioplastia primária com sucesso.104 Neste estudo não houve melhorasignificativa da contratilidade global do ventrículo esquerdo no grupo tratado emrelação ao grupo controle, mas houve melhora significativa do metabolismocelular e da contratilidade segmentar nas áreas de miocárdio tratadas comcélulas-tronco da medula óssea.

O estudo ASTAMI,105 ainda não publicado, não demonstrou benefício doTACMMO por via intracoronariana quanto aos desfechos clínicos e de funçãosistólica do ventrículo esquerdo no seguimento de 6 meses. Neste estudo aberto,100 pacientes foram randomizados ou para o grupo controle (n=50) ou para ogrupo tratado com CMMO, 4-8 dias após IAM com supra de ST tratado porangioplastia primária com sucesso. Os resultados deste estudo diferem de todosos outros apresentados até o momento.

Bartunek et al publicaram em 2005 os resultados do estudo randomizado,aberto, do transplante intracoronariano de 12,6±2.2 milhões de células CD133+,cerca de 12 dias após o diagnóstico de IAM.106 Este estudo demonstrou que esteprocedimento é exeqüível e pode estar relacionado à melhora da contratilidadeventricular e da perfusão miocárdica no grupo tratado. Entretanto, houve elevadaincidência de reestenose coronariana no grupo submetido à injeção de células emrelação ao grupo controle.

1.8. Cardiomiopatia Isquêmica Grave

Estudos iniciais foram realizados em pacientes portadores de cardiopatiaisquêmica grave com indicação de cirurgia de revascularização miocárdicaincompleta. Hamano et al foram o primeiro grupo de pesquisadores a relatar osresultados do transplante intra-miocárdico de CMMO durante a cirurgia derevascularização do miocárdio numa série de cinco pacientes, no Japão. Três dos5 pacientes tratados obtiveram melhora da perfusão miocárdica nos territóriosinjetados,48 confirmando os resultados de estudos experimentais prévios, emmodelos caninos, de que não houve nenhuma alteração prejudicial nos corações


submetidos a injeção de células-tronco. Estes resultados foram confirmados porum segundo estudo em humanos, conduzido por Stamm et al, na Universidadede Rostock, Alemanha.49 Neste estudo 6 pacientes foram submetidos aotratamento per-operatório com injeções transepicárdicas de células-tronco damedula óssea, em áreas de fibrose miocárdica, também evidenciando asegurança do procedimento e a melhora da perfusão miocárdica em 5 dos 6pacientes, no seguimento de 3-9 meses.

Em 2004 este mesmo grupo da universidade de Rostock publicou osresultados deste mesmo tipo de procedimento em 12 pacientes com diagnósticode IAM há mais de 10 dias. As injeções de células AC133+ foram novamenterealizadas nas bordas da área de miocárdio acinético, durante o procedimento derevascularização miocárdica. Houve melhora dos volumes cavitários e da FE doventrículo esquerdo.50

Gowdak et al realizaram procedimento semelhante em 10 pacientes,portadores de cardiopatia isquêmica grave, submetidos a revascularização domiocárdio incompleta. Cerca de 130 milhões de CMMO foram injetadas nasáreas isquêmicas do miocárdio não passíveis de revascularização. Esteprocedimento se mostrou seguro no seguimento de 1 mês.107

Patel et al também demonstraram a segurança desta técnica em 20pacientes, com grave disfunção ventricular, que foram submetidos à cirurgia derevascularização miocárdica incompleta, sem circulação extracorpórea. Dezpacientes foram submetidos à injeção transepicárdica de células CD34+ nas áreasnão revascularizáveis do miocárdio e 10 pacientes foram seguidos comocontroles. Houve melhora da função sistólica do ventrículo esquerdo noseguimento de 6 meses.51

Poucos centros de pesquisa realizaram TACMMO em pacientesportadores de cardiopatia isquêmica terminal, sem possibilidade derevascularização miocárdica, seja percutânea ou cirúrgica. Tse et al representamo primeiro grupo de pesquisadores a realizar TACMMO por via percutânea,utilizando cateteres NOGA de injeção, em pacientes portadores de cardiopatiaisquêmica terminal. Estes autores observaram redução da área de isquemia àressonância magnética de perfusão (de 8,8% para 5,0%; p=0,004) após 3 meses,bem como melhora da contratilidade regional nas áreas de miocárdio submetidasàs injeções de CMMO.58

Fucks et al representam o segundo grupo de pesquisadores queinvestigaram a segurança e a exeqüibilidade do TACMMO por viatransendocárdica em pacientes portadores de cardiopatia isquêmica grave, sempossibilidade de revascularização.108 Mais recentemente Beeres et al repetirameste procedimento numa série de 22 pacientes com angina grave (CCSC III ouIV) apesar do tratamento para doença coronariana obstrutiva na dose máximatolerada. Foram injetados cerca de 100 milhões de CMMO, distribuídas em11±2 injeções transendocárdicas, na área de miocárdio hibernante. Noseguimento de 3 meses houve redução da área de isquemia pela cintilografiamiocárdica com estresse farmacológico com dipiridamol, assim como melhorados sintomas de angina.59


A via intracoronariana tem sido testada como uma alternativa às vias deinjeção transepicárdica e transendocárdica nesta população de pacientes comdoença coronariana grave, em sua maioria, multivascular. Strauer et alsubmeteram 18 pacientes portadores de cardiopatia isquêmica secundária ainfarto do miocárdio antigo, variando de 5 meses a 8 anos, ao transplanteintracoronário de CMMO (IACT-Study). Este estudo demonstrou além dasegurança do procedimento, regeneração do metabolismo celular na áreainfartada. Este achado foi corroborado pela melhora da contratilidade global eseguimentar do ventrículo esquerdo nos pacientes tratados em relação ao grupocontrole.56

O estudo mais recente foi realizado por Blatt et al, utilizando injeçãointracoronariana de CMMO em pacientes portadores de cardiopatia isquêmicagrave sem opção de terapia de revascularização miocárdica. Foram estudados 6pacientes com classe funcional da New York Heart Association III ou IV, apesardo tratamento clínico pleno, e que apresentavam FE < 35% pelo ecocardiogramade estresse com dobutamina. No seguimento de 4 meses houve melhora clínica efuncional. A FE aumentou significativamente de 25% ± 7% para 28% ± 8% (p= .055).52

Além dos estudos citados acima, um grupo da universidade de Tel Avivem parceria com pesquisadores do Hospital Chao Phya, Bangkok, Tailândia,realizaram o implante intracoronariano de 25 milhões de CPE cultivadas por 24horas a partir de uma amostra de sangue periférico, em uma série de 17pacientes portadores de angina crônica refratária ao tratamento clínico na dosemáxima tolerada. No seguimento de 3 meses houve melhora dos sintomas e dacapacidade de exercício.109

1.9. Fenótipos Celulares

O fenótipo dos diferentes tipos celulares é definido pela presença deproteínas específicas na superfície da membrana da célula. Tais proteínas sãoidentificadas através de anticorpos monoclonais que se ligam a estas proteínas,ditas antígenos de superfície, identificando-as. Uma nomenclatura internacional,com o objetivo de classificar os diversos anticorpos monoclonais utilizados emtodo mundo, para identificação de leucócitos, foi proposta em 1982 no “1stInternational Workshop and Conference on Human Leukocyte DifferentiationAntigens (HLDA)”, em Paris. Esta nomenclatura foi denominada “Clustter ofDiffetentiation (CD)” e é a nomenclatura universalmente utilizada paracaracterização de diversos tipos celulares.110 Desde 1982 mais de 250 CD foramidentificados e a leitura destes antígenos de superfície é feita por citometria defluxo. Os sinais “+”e “-” são utilizados para indicar a presença ou ausência dedeterminada molécula CD nas frações celulares analisadas. CélulasCD34+CD19-, por exemplo, expressam na sua superfície a molécula CD34 masnão a CD19.110

As CMMO, bem como as CTMO, podem ser caracterizadas, portanto, deacordo com os seus marcadores de superfície, suas funções e proteínas queexpressam.26


A maioria dos estudos experimentais e clínicos, até o momento, temutilizado ou o “pool” total de CMMO ou fenótipos específicos destas célulasmononucleares, tais como a sub população de células aderentes (célulasmesenquimais);111 CPE;112 Lin-Ckit+; 41, 113 CD133+49, 106 ou CD34+.58, 108, 114-116

Nenhum destes estudos, entretanto, foi capaz de determinar qual ou quais destesfenótipos celulares são essenciais para esse processo de regeneração, e de queforma estas células interagem entre si e com o micro-ambiente lesado.

Uma vez que ainda se desconhecem os mecanismos de regeneraçãotecidual observado com esta técnica, esta informação pode ter um potencialúnico de sugerir o papel singular ou sinérgico destas células durante o reparotissular, no sentido de otimizá-lo ou retardá-lo.


2. HIPÓTESES

2.1. O transplante autólogo de células mononucleares da medula óssea, paraárea de miocárdio hibernante, através da liberação percutânea intra-miocárdica, é um procedimento exeqüível e seguro, em pacientes cominsuficiência cardíaca isquêmica terminal.

2.2. Os diferentes fenótipos celulares se correlacionam com o comportamentodas variáveis clínicas analisadas.


3. OBJETIVOS PRINCIPAIS ESECUNDÁRIOS

3.1. Objetivos Principais:

3.1.1. Identificar e quantificar a ocorrência de eventos adversos graves durante o procedimento de implante do material medular do “pool” total de Células Mononucleares da Medula Óssea (CMMO) para área de isquemia miocárdica crônica, bem como durante os 360 dias subseqüentes, em relação ao grupo controle.

3.1.2. Correlacionar os diferentes fenótipos celulares com a melhora relativadas seguintes variáveis clínicas: escores de pontos dos questionários dequalidade de vida (Minnessota e SF-36); FE e volumes sistólico ediastólico finais (ecocardiograma pelo método de Simpson), pico de VO2

(teste ergométrico pelo protocolo de rampa); percentual de extra-sístolesventriculares (Holter de 24 horas); duração do QRS (ECG-AR);reversibilidade total e %DPMR50; BNP, ao final de 2; 6 e 12 meses deacompanhamento e FE (coronariografia com ventriculografia esquerda);ELL e voltagem unipolar (mapeamento eletromecânico – NOGA) aofinal de 4 meses de seguimento.

3.2. Objetivos Secundários:

3.2.1. Avaliação da capacidade funcional pela medida do pico de VO2, por meio do teste ergométrico convencional (protocolo de rampa), antes e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o TACMMO em relação ao grupo controle.

3.2.2. Comparação da área de viabilidade miocárdica baseada na avaliação da perfusão através da cintilografia miocárdica antes e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o TACMMO em relação ao grupo controle.

3.2.3. Avaliação da função sistólica global do ventrículo esquerdo pelo ecocardiograma e pela quantificação sérica dos níveis de BNP circulante antes e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o implante do “pool”total e CMMO, em relação ao grupo controle.

3.2.4. Avaliação da melhora clinica através da quantificação dos sintomas relacionados à isquemia miocárdica e insuficiência ventricular esquerda, por meio da CCSC e NYHA de 2; 6 e 12 meses após o implante do “pool” total de CMMO, em relação ao grupo controle.

3.2.5. Avaliação dos índices de melhora da qualidade de vida através da aplicação dos Questionários de Qualidade de Vida SF-36117 e Minnessota,118, 119 antes e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o implante do “pool” total de CMMO, em relação ao grupo controle.


4. METODOLOGIA

A metodologia deste estudo foi previamente relatada2 e encontra-se no Anexo IIdesta dissertação. Segue abaixo, um breve sumário dos métodos utilizados nesteestudo.

4.1. Desenho do estudo

Estudo prospectivo, controlado, não randomizado e aberto.

4.2. Alocação/Avaliação/Acompanhamento dos pacientes

Vinte e um pacientes oriundos de serviços terciários de cardiologia, da rede deassistência pública e privada, foram incluídos neste estudo prospectivo (os 14primeiros pacientes, grupo tratado; os 7 últimos pacientes, grupo controle).Inicialmente todos os indivíduos foram submetidos à avaliação clínica e laboratorial,teste ergométrico, ecocardiograma, cintilografia miocárdica e Holter de 24 horas. AsCMMO foram isoladas, lavadas e diluídas em salina 0,9% para injeçãotransendocárdica em áreas de miocárdio viável no grupo tratado, (15 injeções de 0,2ml). Todos os pacientes foram reavaliados ao final de 2; 6 e 12 meses deacompanhamento.

4.3. Critérios de Inclusão

4.3.1. Doença arterial coronariana crônica com defeito de perfusãoreversível detectado pela cintilografia miocárdica (SPECT);

4.3.2. FE do ventrículo esquerdo < 40%;

4.3.3. Inelegibilidade para revascularização miocárdica percutânea oucirúrgica, avaliada pela coronariografia;

4.3.4. Termo de consentimento livre e esclarecido assinado.

A inelegibilidade para os procedimentos de revascularização miocárdicacirúrgica ou percutânea foi determinada por 2 comitês: um comitê cirúrgico compostopor 2 cirurgiões cardiovasculares e um cardiologista clínico, e um comitêintervencionista formado por 2 cardiologistas intervencionistas e um cardiologistaclínico.


4.4. Critérios de Exclusão

4.4.1. Dificuldade em obter acesso vascular para procedimentospercutâneos;

4.4.2. História de neoplasia ou outra co-morbidade prévia ouconcomitante que pudesse ter impacto na sobrevida em curtoprazo deste paciente;

4.4.3. Arritmias ventriculares malignas;

4.4.4. Aneurisma do ventrículo esquerdo;

4.4.5. Anormalidades laboratoriais inexplicadas;

4.4.6. Tecido ósseo com aspecto radiológico anormal;

4.4.7. Doença hematológica primária;

4.4.8. IAM nos 3 meses prévios a inclusão no protocolo;

4.4.9. Presença de trombo intraventricular;

4.4.10. Instabilidade hemodinâmica no momento do procedimento;

4.4.11. Fibrilação atrial;

4.4.12. Qualquer condição que, no julgamento do investigador, pudessecolocar o paciente em risco.

4.5. Eventos Adversos

Foram monitorados os eventos adversos maiores relacionados ao ato doimplante do material transplantado bem como à ação no organismo deste mesmomaterial. Para tal finalidade os pacientes foram submetidos aos seguintes examescomplementares seriados: ecocardiograma, eletrocardiograma e avaliaçãolaboratorial, além de Holter de 24 horas. Todos estes exames foram realizados na faseintra-hospitalar, pós-procedimento de injeção e nos seguimentos de 2; 4; 6 e 12 meses.

4.5.1. Eventos adversos maiores

Efeitos adversos maiores relacionados ao implante do material transplantado eà ação deste material no organismo

_ Morte.

_ Ruptura miocárdica com necessidade de drenagem.

_ Formação de pseudo-aneurisma indicando ruptura miocárdica.

_ Arritmias ventriculares graves (taquicardia ventricular sustentada, fibrilação ventricular).


_ Síndrome de resposta inflamatória sistêmica Tipo 4, de acordo com aclassificação de Gell e Coombs.120

_ Morbidade secundária ao desenvolvimento de tecidos não cardíacos.

_ Infarto Agudo do Miocárdio.

_ Acidente Vascular Cerebral por Embolia.

_ Necessidade de revascularização.

_ Hospitalização por angina e/ou insuficiência cardíaca.

4.5.2. Eventos adversos menores

Eventos adversos menores provavelmente não relacionados ao implante domaterial transplantado ou à ação deste material no organismo foram relatados em 2 dos14 pacientes submetidos ao transplante de CMMO.2

Eventos adversos menores relacionados ao implante do material transplantadoe à ação deste material no organismo.

_ Derrame pericárdico que não necessite drenagem.

_ Arritmias ventriculares não consideradas graves (taquicardia ventricular nãosustentada, extrassístoles ventriculares).

_ Constatação de desenvolvimento de tecidos não cardíacos, porém semmorbidade aparente ao paciente.

_ Síndrome de resposta inflamatória Tipos 1, 2 ou 3, de acordo com aclassificação de Gell e Coombs.120

_ Agravamento dos sintomas de angina ou insuficiência cardíaca, semnecessidade de internação hospitalar.

4.5.3. Efeitos adversos maiores e menores relacionados aos outros procedimentos que compõem este protocolo

Todos os outros procedimentos realizados neste protocolo foram de uso clínicorotineiro, com seus efeitos adversos bem determinados e aceitos pela sociedade.

4.6. Fase de Seleção

Os pacientes que preencheram os critérios de inclusão/exclusão e que assinaramo termo de consentimento livre e esclarecido foram submetidos aos seguintes exames:

4.6.1. Avaliação laboratorial de seleção do paciente para o protocolo depesquisa: coagulograma; hepatograma; lipidograma e sorologias parahepatites B e C; HIV I e II e LUES (VDRL e FTAabs);


4.6.2. Avaliação laboratorial completa incluindo hemograma completo comcontagem de plaquetas; dosagens de uréia, creatinina, glicose, sódio,potássio, assim como Proteína C Reativa titulada (PCRt) e BNP (doinglês Brain natriuretic peptide);

4.6.3. Troponina I; CK-MB massa e PCRt dosados seriadamente, imediatamenteapós e 6; 12; 24 e 48 horas após o procedimento de injeção;

4.6.4. Holter de 24 horas;

4.6.5. Teste ergométrico, pelo protocolo de rampa, com medida do consumo deO2;

4.6.6. Cintilografia Miocárdica (SPECT) com estresse farmacológico comdipiridamol;

4.6.7. Ecocardiograma transtorácico;

4.6.8. Exame físico completo, incluindo exame neurológico detalhado, a fim deestabelecer a condição clínica e neurológica inicial;

4.6.9. Anamnese.

Todos os pacientes que foram incluídos no protocolo estavam há, pelo menos, 1mês com o tratamento medicamentoso na dose máxima tolerada, no momento dainclusão no protocolo.

4.7. Fase de Tratamento

Ao completar os testes da fase inicial, os 14 primeiros pacientes foram alocadosno grupo tratado e os 7 seguintes, no grupo controle.

O grupo controle não foi submetido ao aspirado de medula óssea bem como nãofoi submetido aos procedimentos da fase de transplante, descritos abaixo:

O TACMMO foi constituído pela punção da medula óssea para retirada domaterial medular, seguida do preparo do material para gerar o aspirado medular seletivoe posterior implante na área miocárdica a ser tratada.

4.7.1. Mielograma – Punção da Medula Óssea

Cerca de 4 horas antes da injeção, transendocárdica, de células mononucleares,50 ml de aspirado da medula óssea foram obtidos da crista ilíaca posterior, dospacientes alocados no grupo tratado, sob anestesia local associada à sedação/analgesia.


4.7.2. Preparo do Aspirado Medular Seletivo

As células mononucleares foram isoladas pelo gradiente de Ficoll-Paque Plus®(Amersham Biosciences®), exaustivamente lavadas com salina heparinizada contendoalbumina humana 5%, e posteriormente filtradas através de uma peneira de nylon de100 ìm para remover os agregados celulares. Uma pequena fração da suspensão decélulas foi utilizada para citometria e avaliação da viabilidade celular pelo método deexclusão, utilizando azul de trypan, com demonstração de viabilidade celular superior a90% (96,2±4,9%), garantindo a qualidade da suspensão. 121-125

A caracterização dos marcadores de diferenciação leucocitária, por citometria defluxo, e a avaliação funcional também foram realizadas em uma fração das célulasobtidas. A capacidade clonogênica dos progenitores hematopoiéticos foi avaliada pelasunidades formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos, conforme previamentedescrito. 121-125 Culturas de bactérias e fungos das preparações de células clinicamenteutilizadas foram realizadas.

4.7.3. Efeitos adversos

⇒ Reação ao anestésico empregado;

⇒ Fratura em ossos muito porosos ou com fibrose acentuada;

⇒ Osteomielite no local da punção;

⇒ Hemorragia local;

⇒ Penetração óssea com danos a estruturas subjacentes, particularmente emesterno, em virtude de dispormos de cerca de 1cm de espessura na alturado segundo interespaço desse osso no adulto.

4.7.4. Período do Implante

⇒ Grupo Tratado

Os pacientes alocados no grupo tratado foram transferidos para o laboratório deintervenção cardiovascular, cerca de 3 horas antes do início do procedimento, pararealização de coronariografia e ventriculografia esquerda seguida de mapeamentoeletromecânico, a fim de identificar áreas de miocárdio viável definidas como voltagemunipolar preservada (> 6,9 mV) e atividade mecânica diminuída (ELL < 12%). Asinjeções transendocárdicas, com o cateter NOGA MyoStar® Cordis, foram realizadasem pontos com estas características.

Cada ponto de injeção foi cuidadosamente avaliado antes das injeções,utilizando-se os seguintes critérios: 1) posição perpendicular do cateter na parede doventrículo esquerdo; 2) excelente estabilidade do cateter (“Loop Stability” < 4mm) e 3)presença de extra-sístole ventricular à exteriorização da agulha no miocárdio. Foramrealizadas 15 injeções de 0,2ml cada (1 milhão de CMMO/0,1ml).


⇒ Grupo Controle

Os pacientes do grupo controle foram submetidos à mesma avaliação da faseinicial, excetuando-se os procedimentos invasivos (coronariografia e mapeamentoeletromecânico, aspiração da medula óssea e injeção das células mononucleares nomiocárdio).

Para comparação, foram realizados os mesmos exames laboratoriais de controlepós-procedimento, descritos acima para o grupo tratado, além de um Holter de 24 horas.

4.8. Fase de seguimento

Após o procedimento, todos os pacientes foram submetidos à avaliaçãolaboratorial incluindo hemograma completo, dosagem sérica de uréia, creatinina ePCRt. Os pacientes receberam alta hospitalar 48 horas após o procedimento, na ausênciade eventos adversos.

No momento da alta hospitalar, os pacientes foram orientados quanto àpossibilidade de sinais ou sintomas de síndrome infecciosa. Eles deviam verificar atemperatura axilar diariamente, durante as duas primeiras semanas e reportar qualqueralteração ao investigador. O acompanhamento médico foi feito em 1, 2, 4, 6, e 8semanas após o procedimento, e em seguida mensalmente até o final de 6 meses. Umaúltima consulta clínica foi realizada ao final de 12 meses de seguimento. Durante asconsultas, foi realizado um exame neurológico detalhado a fim de avaliar possíveistromboembolismos cerebrais. Avaliação laboratorial completa, idêntica àquela realizadana fase inicial, incluindo dosagens de PCRt e BNP foi repetida em 2; 6 e 12 meses apósa realização do procedimento.

Os pacientes fizeram Holter de 24 horas antes do procedimento, nas 24 horaspós-procedimento de injeção e em 2; 6 e 12 meses após, a fim de detectar possívelarritmia ventricular ou distúrbio de condução.

ECG-AR também foi realizado antes do procedimento e nos seguimentossubseqüentes, de 2 e 6 meses após o procedimento de injeção.

A avaliação precoce da função do VE foi realizada imediatamente após oprocedimento, em 2, 4, 6 e 8 semanas, e em 4; 6 e 12 meses, através deecocardiograma, com o intuito de se detectar possíveis efeitos das células naintegridade miocárdica, assim como detectar derrame pericárdico/pericardite.Avaliação da função ventricular através das medidas da FE e dos volumes cavitáriosdo VE (método de Simpson) foi realizada antes do procedimento e nos seguimentosde 2; 6 e 12 meses após o procedimento de injeção.

O pico de VO2 foi determinado por teste ergométrico (protocolo de rampa)antes do procedimento de injeção e após 2; 6 e 12 meses.

A cintilografia miocárdica foi repetida em 2; 6 e 12 meses. Oacompanhamento invasivo, incluindo coronariografia; ventriculografia esquerda emapeamento eletromecânico (NOGA MyoStar Cordis), foi repetido 4 meses após oprocedimento.


A avaliação da qualidade de vida (QDV) foi feita através dos questionários SF-36 (36-Item Short-Form Health Survey Questionaire) e Minnesota (Minnesota LivingWith Heart Failure Questionnaire) em 2; 6 e 12 meses após o procedimento de injeção.

4.9. Análise dos Dados

Um comitê de segurança foi estabelecido para a revisão dos dados. Os examesde cintilografia miocárdica, ecocardiograma, Holter, teste ergométrico e coronariografiaforam analisados de forma independente por examinadores experientes.

4.10. Análise Estatística

As diferenças nas características demográficas, entre os grupos, foram avaliadasatravés do teste qui-quadrado. Teste exato de Fisher, teste T e teste de Mann-Whitneyforam utilizados para as variáveis discretas, contínuas com distribuição simétrica econtínuas com distribuição assimétrica, respectivamente. A comparação das mudançasocorridas entre a fase inicial e o seguimento de 2; 6 e 12 meses no grupo tratado e nogrupo controle foi feita através do teste ANOVA para medidas repetidas. A avaliaçãodas mudanças ocorridas ao longo do seguimento de 6 e de 12 meses do grupo tratadoem relação ao grupo controle foi feita através do modelo ANOVA para medidasrepetidas, incluindo a interação entre os dois grupos, com análise Pos hoc de Kruskal-Wallis para variáveis não paramétricas e para variáveis contínuas com distribuiçãoassimétrica. Análise Pos hoc com correção de Bonferroni foi realizada para variáveiscontínuas, com distribuição normal. Um valor de p<0.05 foi consideradoestatisticamente significativo.

A correlação dos fenótipos celulares com as variáveis contínuas comdistribuição assimétrica, obtidas a partir das variáveis clínicas analisadas, foi realizadaatravés da correlação para variáveis não paramétricas, rho de Spearman. Para estacorrelação foram utilizados os valores iniciais das variáveis selecionadas e o percentualde variação de tais variáveis com relação ao valor inicial. Portanto, utilizou-se aseguinte fórmula:

I Para variáveis cuja relação com melhora se faz por aumento progressivo dosseus valores utilizou-se: (Valor em 4 meses – Valor Inicial)*100 / Valor Inicial

ex.: FE; ELL; Voltagem Unipolar; Pico de VO2; escore de pontos SF-36

II Para variáveis cuja relação com melhora se faz pela diminuição progressivados seus valores utilizou-se: (Valor Inicial – Valor em 4 meses)*100 / ValorInicial

ex.: VDF; VSF; RT; %DPMR50; BNP; % ESV; dQRS; escore de pontosMinnessota


4.11. Cronograma do Estudo

Procedimentos InicialIntra-Hospitalar - Pós

ProcedimentoSeguimento

semanal Seguimento MensalTotal deProced

0h 6h 12h 24h 48h 1ª 2a 4a 1º 2º 3o 4o 5o 6o 12º

Avaliação Clínica X X X X X X X X X X X X X 13

Avaliação LaboratorialCompleta* X X X X X X 6

CK-massa; Troponina I X X X X X X 6

PCRt X X X X X X 6

Avaliação laboratorialde Seleção

X 1

ECG X X X X X X X X X X X X X X X X 16

ECG-AR X X X 3

Holter de 24 horas X X X X X 5

Ecocardiograma** X X X X X X X X X X X X X 13

SPECT*** X X X X 4

Teste Ergométrico X X X X 4

Coronariografia eVentriculografia

X X 2

MapeamentoEletromecânico

X X 2

Avaliação de Qualidadede Vida

X X X X 4

*Hemograma completo; glicose; ureia; creatinina; sódio; potássio. BNP (do inglês, Brain Natriuretic Peptide) foi dosadosomente antes do procedimento de injeção e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após o procedimento.

**O Ecocardiograma uni e bidimensional com Doppler foi realizado em todas as consultas de seguimento com o objetivode se detectar possíveis eventos tais como pericardite ou derrame pericárdico provocados ou pelo procedimento deinjeção ou pela ação do material medular transplantado. A quantificação da função ventricular através da medida da FE edos volumes cavitários pelo método de Simpson, para fins deste estudo, foi realizada apenas 2; 6 e 12 meses após oprocedimento de injeção.

***SPECT, do inglês Single Photon Emission Computed Tomography.


5. EXPLICITAÇÃO DE COMO OSASPECTOS ÉTICOS FORAMCONTEMPLADOS

5.1. Dos aspectos de bioética

Todas as ações deste protocolo foram norteadas pelas regulamentaçõesvigentes no território nacional, seguindo as normas da resolução 196/96 doConselho Nacional de Saúde / Ministério da Saúde, sob a coordenação daComissão Nacional de Ética em Pesquisa. Estes projetos foram amplamentediscutidos pela Comissão Científica e pelo Comitê de Ética em Pesquisa doHospital Pró-Cardíaco. Foram posteriormente aprovados pela ComissãoNacional de Ética em Pesquisa (CONEP) sob o registro 2613.

5.2. Consentimento pós-informação

Todos os pacientes foram completamente informados sobre o conteúdoda pesquisa conforme previsto na resolução 196/96 do Conselho Nacional deSaúde / Ministério da Saúde. Duas cópias do Termo de Consentimento Livre eEsclarecido foram, portanto, lidas e assinadas pelo paciente, o qual recebeu umadas vias do mesmo.

5.3. Comitês de Gerenciamento do Estudo

O estudo foi gerenciado por uma série de comitês que compuseram ocorpo executivo. Cada um destes comitês foi responsável por uma dimensão doestudo, interagindo entre si com a finalidade de garantir alto padrão de qualidadecientífica e acordo com os princípios de bioética vigentes. As funções,composição e especificação de cada um dos comitês encontram-se no Anexo Idesta dissertação.

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6. RESULTADOS FINAISOs resultados deste primeiro braço do projeto de pesquisa foram

publicados1, 2, 126, 127 e encontram-se disponíveis nos Anexos II, III e IV destadissertação.

De modo sucinto podemos ressaltar que não foi identificado nenhumefeito adverso grave relacionado ao procedimento proposto, objetivo primário doestudo. Não foram identificados quaisquer dados sugestivos de lesão muscularsignificativa secundária às injeções, bem como, não houve desenvolvimento denenhum tecido estranho aos tecidos que compõem a estrutura cardíaca. Nãoforam identificadas arritmias ventriculares graves importantes, nem reaçãoinflamatória secundária ao transplante.

Ao contrário, os pacientes do grupo tratado evoluíram com melhora dossintomas anginosos, bem como daqueles relacionados à insuficiência cardíaca.No teste ergométrico a melhora do desempenho dos pacientes foi significativa, oque não foi observado no grupo controle, que se manteve estável durante operíodo de seguimento. Quando submetidos a uma análise quantitativa,realizada pela cintilografia miocárdica, houve uma redução da carga isquêmicade 15% para cerca de 5% da área do ventrículo esquerdo. Esta melhora deperfusão resultou numa melhor atividade sistólica do ventrículo esquerdo commelhora da FE. Todas estas alterações não foram observadas no grupo controle.

Não houve diferenças quanto às características clínicas entre os grupos.Os pacientes foram tratados de acordo com a diretriz brasileira de cardiologiapara o tratamento de insuficiência cardíaca.128 Todos os pacientes utilizaraminibidores da enzima conversora de angiotensinogênio (IECA) ou inibidores doreceptor de angiotensina. Setenta e um por cento dos pacientes do grupo tratadoe 50% dos pacientes do grupo controle estavam em uso de betabloqueadores.Não houve diferença no uso de nitratos, IECA, beta bloqueadores ou diuréticosnos 6 meses de seguimento.1

As características da população celular estão descritas na tabela 1. Foraminjetadas 40.6 ± 12.51 x 106 CMMO / paciente. A viabilidade celular foi acimade 95% (96.2±4.97%), garantindo a qualidade da suspensão de células. Asculturas de fungos e bactérias foram negativas.

O tempo total do procedimento de injeção foi de 81 ± 19 minutos. Osmapas eletromecânicos contaram com 92 ± 16 pontos.

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Tabela 1 – Análise quantitativa dos diferentes fenótipos celulares, do "pool" total de célulasmononucleares da medula óssea injetadas.

População Celular e FenótipoPercentual de

Células Injetadas(%)

No de CélulasInjetadas (x 106)

Densidadede CélulasInjetadas*

No Cel x 103 /mm2

Células Mononucleares da Medula Óssea 100% 40,60 ± 12,51 29,57 ± 18,07Células Mononucleares da Medula Óssea Viáveis 96,4 ± 4,97 39,03 ± 11,92 27,99 ± 15,64Células Progenitoras Hematopoiéticas(CD45loCD34+) 2,59 ± 1,31 0,98 ± 0,580 0,77 ± 0,78Células Progenitoras Hematopoiéticas Precoces(CD45loCD34+HLA-DR-) 0,10 ± 0,05 0,040 ± 0,018 0,28 ± 0,02

Células Progenitoras Hematopoiéticas (ckit+CD45-) 0,26 ± 0,28 0,105 ± 0,131 0,12 ± 0,17Células Progenitoras Hematopoiéticas(CD45loCD34+CD19-) 1,93 ± 1,03 0,71 ± 0,413 0,45 ± 0,30

Células T CD4+ (CD45+CD3+CD4+) 28,4 ± 10,8 11,2 ± 6,510 7,32 ± 3,42

Células T CD8+ (CD45+CD3+CD8+) 14,9 ± 5,97 5,76 ± 2,860 4,11 ± 2,63

Células B (CD45+CD19+) 11,28 ± 4,88 4,29 ± 1,980 3,15 ± 2,27

Monócitos (CD45+CD14+) 9,97 ± 4,04 4,34 ± 1,760 3,02 ± 1,75

Células NK (CD45+CD56+) 1,15 ± 0,53 0,55 ± 0,290 0,36 ± 0,21Percentual de

colônias No. ColôniasNo. Colônias

InjetadasAvaliação Funcional

(%) (Unidades)Unidades /

mm2

UFC-F (Unidade Formadora de Colônia deFibroblastos) 0,016 ± 0,02 7,78 ± 10,09

0,0055 ±0,0071

UFC-GM (Unidade Formadora de Colônia deGranulócitos e Macrófagos) 2,2 ± 1,5 719,57 ± 385 0,57 ± 0,55

* Área de Injeção = 1778 ± 1144 mm2 e Número de Injeções = 14,86 ± 1,96

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Não houve complicações maiores relacionadas ao procedimento. Umpaciente apresentou um episódio transitório de congestão pulmonar que foitratado com diuréticos e dobutamina. Nenhuma arritmia sustentada foiobservada durante o procedimento. Não foi detectado caso algum de derramepericárdico nos exames seriados de ecocardiografia realizados nas 48 horas apóso procedimento. Todos os pacientes tiveram alta hospitalar 48 horas após oprocedimento de injeção conforme previsto no protocolo.

Um paciente do grupo controle morreu 2 semanas após a entrada noestudo, por morte súbita, e não foi incluído na análise. Um paciente do grupotratado morreu na 14a semana de seguimento, por morte súbita precedida porprecordialgia de forte intensidade. Os familiares recusaram a necrópsia. Porémum segundo paciente do grupo tratado faleceu 11 meses após o implante, devidoa um AVE hemorrágico, sendo este submetido à autópsia.127 Os resultados doestudo histopatológico, do coração deste paciente, foram publicados eencontram-se disponíveis no anexo V desta dissertação.

Os pacientes do grupo tratado apresentaram menos sintomas deinsuficiência cardíaca, pela classificação NYHA, e angina, pela CCSC, após 12meses de seguimento, quando comparados ao grupo controle (p = 0,01 e 0,002,respectivamente).

Não houve incidência de arritmias ventriculares graves na análise peloHolter de 24 horas realizado nas 24 horas imediatamente após o procedimento enos seguimentos de 2 e 6 meses. Houve uma tendência à redução no número deextra-sístoles ventriculares de 4.445±8.512/24h para 941±1.244/24h (p = 0,08)mantendo este padrão até o 6o mês de seguimento. O percentual de extra-sístoles ventriculares variou não significativamente de 3,8±6,8% para 0,9±1,14%em 2 meses e para 0,95±1,28% em 6 meses.

No acompanhamento de 12 meses, dentre todos os valores laboratoriais,somente os níveis séricos de creatinina variaram entre o grupo controle e o grupotratado. Os níveis séricos de creatinina aumentaram significativamente no grupocontrole, quando comparados ao grupo tratado (p = 0,04). Os níveis de PCRt naavaliação inicial e nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses não apresentaramdiferença significativa entre os 2 grupos (p = 0,4). Houve aumento dos níveisséricos de BNP no grupo controle em relação ao grupo tratado, no seguimentode 6 meses (p = 0,003)1, com uma tendência a manutenção deste resultado aofinal de 12 meses (p = 0,08).

Na avaliação inicial a geometria ventricular diferiu significativamenteentre os grupos. O grupo controle apresentou volumes sistólico e diastólicofinais menores (p < 0,001) assim como uma FE inicial maior (p = 0,054).2 Noentanto, no seguimento de 6 meses a FE diminuiu de forma significativa nogrupo controle (p = 0,05), o que não aconteceu no grupo tratado. Os volumescavitários se mantiveram inalterados em ambos os grupos.1 Esta diferençasignificativa entre os grupos não foi mais observada ao final de 12 meses deseguimento (Anexo III).

O pico de VO2 foi semelhante entre os 2 grupos na avaliação inicial eocorreu aumento significativo após 2 meses de seguimento, no grupo tratado (de

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17,96±8,78 para 23,40±8,30, p = 0,01), que se manteve aos 6 meses(24,20±7,50; p = 0,05) e aos 12 meses de seguimento (25,1±8,7; p = 0,03), emrelação ao grupo controle (Anexo III).

O tamanho do TDPMR (isquemia) e o %DPMR50 (cicatriz) foramsemelhantes entre os grupos na avaliação inicial. Não houve variação do%DPMR50 em 2; 6 ou 12 meses, em ambos os grupos. No grupo tratado houveredução absoluta, significativa, de 10% do TDPMR (p = 0,022) ao final de 2meses (redução relativa de 73%) diferindo de forma significativa em relação aogrupo controle. Ao final de 6 meses, esta redução absoluta da área isquêmicaperdeu 4% do seu impacto inical, porém, mantendo uma redução absoluta (emrelação à avaliação inicial) de 6%, bem como uma diferença significativa emrelação ao grupo controle (p = 0,05).1 Esta melhora da área isquêmica foimantida ao final de 1 ano de seguimento (p =0,01), apesar de uma pioraprogressiva, lenta, observada a partir do 6º mês de acompanhamento (Anexo III).

O conjunto de melhoras relatadas se refletiu na qualidade de vidarelacionada à saúde, de forma que tanto no questionário SF-36, quanto noQuestionário de Minnesota (específico para sintomas de insuficiência cardíaca),demonstrou-se melhora significativa nos respectivos índices, durante o períodode seguimento.

Foi possível, portanto, observar uma melhora expressiva da QDV,baseada no escore total de pontos do questionário de Minnessota, variando de46,5±18,7% para 29,7±17,4; 19,2±15,5 e 23,9±17%, no grupo tratado e de49,7±23 para 42,9±21; 64,6±19,7 e 51,6±28,5, no grupo controle, ao final de 2;6 e 12 meses de seguimento, respectivamente (p = 0,04). O mesmo padrãoevolutivo foi observado com o escore resumido de pontos do questionário dequalidade de vida SF-36, variando de 50,3±21 para 69,2±18,5; 75,7±19,3 e72,9±24,6 no grupo tratado e de 47,9±23,8 para 56,6±25; 35,2±18,4 e 50,2±24,4no grupo controle, ao final de 2; 6 e 12 meses de seguimento, respectivamente (p= 0,02). Estes dados estão representados graficamente nas figuras 1 e 2,respectivamente.

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A área de distribuição das CMMO se correlacionou negativamente com amelhora relativa do ELL, 4 meses após o procedimento de injeção. Os resultadosda correlação, do percentual total e da densidade de células mononuclearesinjetadas, com as variáveis clínicas selecionadas estão descritos nas tabelas de 2a 14.

O perfil do fenótipo celular entre os pacientes que mantiveram melhorasustentada da isquemia ao final de 1 ano e os pacientes que não apresentaram amesma evolução favorável, foi significativamente diferente e está representadona na figura 3 e tabela 15. Estes dois grupos foram clinicamente semelhantes(tabela 16).

A melhora sustentada da isquemia foi definida como diminuição da áreade isquemia em pelo menos 4 pontos percentuais ao final de 1 ano, em relaçãoao valor inicial.

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Figura 3 – Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível,Figura 3 – Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível,avaliada pela cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT) aoavaliada pela cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT) aolongo do seguimento de 1 ano, nos pacientes submetidos aolongo do seguimento de 1 ano, nos pacientes submetidos aoTACMMO**.TACMMO**.

Total de Defeito Miocárdico Reversível

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Inicial 2 meses 6 meses 1 ano

%

Paciente 1

Paciente 2

Paciente 3

Paciente 4

Paciente 5

Paciente 6

Paciente 7

Paciente 8

. . . .

Paciente 10

Paciente 11

Paciente 12

Paciente 13

Paciente 14

*As linhas em vermelho representam os pacientes que não apresentaram melhora sustentada da isquemiaao longo de 1 ano de seguimento após o TACMMO. As linhas em azul representam os pacientes quemantiveram melhora sustentada da isquemia ao longo de 1 ano de seguimento.

**TACMMO: Transplante Autólogo de Células Mononucleares da Medula Óssea.

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Tabela 2 – Correlação do percentual, total e densidade de células viáveis com o percentual de melhorarelativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de células viáveis Num de células viáveis Densidade de células viáveis% de melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)

% ESV 2 meses ns ns 0,66 (0,02)ELL 4 meses ns ns 0,54 (0,02)Volt U 4 meses 0,52 (0,03) ns nsIsquemia* 6 meses 0,6 (0,04) 0,7 (<0,01) nsFibrose** 6 meses 0,64 (0,03) ns nsBNP 6 meses 0,72 (0,01) ns ns

Pico de VO2 6 meses ns ns 0,60 (0,03)Fibrose 1 ano 0,75 (<0,01) ns ns

ESV: Extra-sístoles ventriculares; ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); BNP do inglêsBrain Natriuretic Peptide; ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).** Fibrose avaliada pelo Percentual de Defeito de Perfusão Miocárdica em Repouso, com atividade de 50%, na cintilografiamiocárdica de perfusão (SPECT).

Tabela 3 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células CD45lo com o percentualde melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de CD34+CD45lo Num de CD34+CD45lo Densidade de CD34+CD45lo

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)dQRS 6 meses 0,49 (0,06) 0,56 (0,04) ns

dQRS: duração do QRS

Tabela 4 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células HLADR- com opercentual de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de CD34+HLADR- Num CD34+HLADR- Densidade de CD34+HLADR-

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)dQRS 2 meses ns 0,64 (0,03) nsdQRS 6 meses 0,58 (0,04) ns nsIsquemia* 1 ano 0,62 (0,05) ns 0,54 (0,05)

dQRS: duração do QRS; ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).

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Tabela 5 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células ckit+CD45- com opercentual de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % ckit+CD45- Num de ckit+CD45- Densidade de ckit+CD45-

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)

Pico de VO2 2 meses 0,90 (0,04) 0,8 (0,05) 0,8 (0,05)Isquemia* 2 meses ns 0,98 (<0,01) NsVDF 1 ano 0,90 (0,04) 0,8 (0,05) NsVSF 1 ano ns 0,90 (0,04) 0,9 (0,04)

VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).

Tabela 6 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células TCD4+ com o percentualde melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de CTCD4+ Num de CTCD4+ Densidade de CTCD4+

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)VSF 2 meses ns ns (-0,56 (<0,04))VDF 2 meses ns ns (-0,45 (<0,05))ELL 4 meses ns ns 0,65 (0,02)Volt U 4 meses 0,48 (0,05) 0,75 (<0,01) nsIsquemia 6 meses ns (-0,78 (<0,01)) ns

Pico de VO2 6 meses ns ns 0,67 (0,01)Isquemia* 1 ano ns (-0,61 (<0,05)) nsFibrose** 1 ano 0,68 (0,02) 0,85 (<0,01) ns

VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ELL: Encurtamento Linear Local(NOGA); Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).** Fibrose avaliada pelo Percentual de Defeito de Perfusão Miocárdica em Repouso, com atividade de 50%, na cintilografiamiocárdica de perfusão (SPECT).

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Tabela 7 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células TCD8+ com o percentualde melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de CTCD8+ Num de CTCD8+ Densidade de CTCD8+% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)

VSF 2 meses (-0,6 (0,02)) (-0,6 (0,02) (-0,64 (0,01))VDF 2 meses (-0,54 (0,04) (-0,52 (0,05) (-0,51 (0,03))% ESV 2 meses ns ns 0,59 (0,04)dQRS 2 meses ns (-0,56 (0,05) (-0,48 (0,05))ELL 4 meses ns 0,56 (0,05) 0,78 (<0,01)VSF 6 meses ns (-0,66 (0,02) (-0,55 (0,04)

Pico de VO2 6 meses 0,6 (0,03) ns 0,84 (<0,01)

Pico de VO2 1 ano 0,54 (0,03) ns 0,62 (0,03)VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ESV: Extra-sístolesventriculares; dQRS: duração do QRS; ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)

Tabela 8 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de células CD19+ com o percentualde melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de CD19+ Num de CD19+ Densidade de CD19+

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)ELL 4 meses ns ns 0,53 (0,04)Isquemia 1 ano ns 0,69 (0,03) ns

ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).



% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)BNP 2 meses ns ns 0,63 (0,03)VDF 6 meses 0,58 (0,04) ns ns

BNP, do inglês Brain Natriuretic Peptide; VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)

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dQRS: duração do QRS; Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); ELL: Encurtamento Linear Local (NOGA); SF-36: questionário dequalidade de vida SF-36; ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).

ESV: Extra-sístoles ventriculares; BNP, do inglês Brain Natriuretic Peptide; FE: Fração de Ejeção (angiografia); Volt U: VoltagemUnipolar (NOGA); VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).



% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)dQRS 2 meses -0,57 (0,05) ns nsVolt U 4 meses ns 0,7 (0,04) nsELL 4 meses ns -0,58 (0,05) nsIsquemia* 6 meses -0,82 (0,02) -0,80 (0,02) nsMinnessota 6 meses -0,71 (0,05) -0,71 (0,05) nsSF-36 6 meses -0,64 (0,04) -0,64 (0,04) nsMinnessota 1 ano -0,76 (0,03) -0,76 (0,03) nsSF-36 1 ano -0,69 (0,06) -0,69 (0,06) ns

Tabela 11 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CD19- com o percentualde melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % de CD34+CD19- Num de CD34+CD19- Densidade de CD34+CD19-

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)%ESV 2 meses ns ns 0,71 (0,04)BNP 2 meses ns ns 0,9 (0,04)FE 4 meses ns ns -0,82 (0,02)Volt U 4 meses ns 0,86 (0,01) nsIsquemia 6 meses ns -0,74 (0,06) nsVSF 6 meses ns ns -0,75 (0,05)Isquemia* 1 ano ns -0,74 (0,06) nsPico de VO2 1 ano ns ns 0,75 (0,05)

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Tabela 12 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CFU-GM com opercentual de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % CFU-GM Num de CFU-GM Densidade de CFU-GM% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)

dQRS 2 meses ns 0,65 (0,02) nsdQRS 6 meses ns 0,56 (0,04) ns

dQRS: duração do QRS; ns: não significativo (p > 0,05)

Tabela 13 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CFU-F com opercentual de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % CFU-F Num de CFU-F Densidade de CFU-F% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)

VSF 2 meses ns 0,43 (0,06) nsVDF 2 meses ns 0,55 (0,03) nsMinnessota 2 meses ns 0,87 (<0,01) nsVDF 1 ano ns 0,66 (0,04) 0,59 (0,037)

VSF: Volume Sistólico Final (ecocardiograma); VDF: Volume Diastólico Final (ecocardiograma); ns: não significativo (p > 0,05)

Tabela 14 – Correlações significativas do percentual, total e densidade de Células CD34+ com opercentual de melhora relativa das variáveis clínicas analisadas

Variáveis Clínicas % CD34+ Num de CD34+ Densidade de CD34+

% melhora relativa rho de Spearman (p) rho de Spearman (p) rho de Spearman (p)Isquemia* 2 meses ns 0,75 (0,05) 0,75 (0,05)dQRS 2 meses 0,52 (0,08) 0,52 (0,08) nsFE 4 meses ns Ns 0,94 (0,005)Volt U 4 meses ns 0,77 (0,036) ns

dQRS: duração do QRS; FE: Fração de Ejeção (angiografia); Volt U: Voltagem Unipolar (NOGA); ns: não significativo (p > 0,05)* Isquemia avaliada pelo Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível, na cintilografia miocárdica de perfusão (SPECT).

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Tabela 15 – Diferenças no fenótipo celular entre os pacientes que apresentaram, ou não,melhora sustentada da isquemia miocárdica, avaliada pelo TDPMR (cintilografia miocárdicade perfusão - SPECT) ao final de 1 ano de seguimento

Sem MelhoraSustentada daIsquemia ao Final de 1ano

Melhora Sustentadada Isquemia ao Finalde 1 ano

p

N = 7 N = 7

Média ± DP Média ± DP Mann-WhitneyÁrea de injeção 2345± 1374 1270 ± 440 0.073% de Células CD34+HLA-DR- 0,08 ± 0,05 0,12 ± 0,03 0.05Num de CT CD4+ 14,7 ± 7,36 7,77 ± 3,11 0.05Num de CT CD8+ 7,29 ± 3,05 4,23 ± 1,72 0.07Num de Células CD19+ 5,71 ± 1,24 3,07 ± 1,67 0.014Num de UFC-GM 487 ± 184 952 ± 402 0.03Densidade de CD34+HLA-DR- 0,01 ± 0,01 0,05 ± 0,02 0.002Densidade de UFC-GM 0,23 ± 0,06 0,91 ± 0,61 0.001

TDPMR: Percentual do Total de Defeito de Perfusão Miocárdica Reversível pela cintilografia miocárdica; DP: Desvio Padrão

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Tabela 16 - Características clínicas entre os pacientes que apresentaram, ou não, melhorasustentada da isquemia miocárdica, avaliada pelo TDPMR (cintilografia miocárdica deperfusão - SPECT) ao final de 1 ano de seguimento

Melhorasustentada da

isquemiaN Media DP P (Mann-

Whitney)

Idade Não 7 61,00 10,39Sim 7 52,86 7,84 0,125Não 6 18,33 9,83FE (ventriculografia esquerda)

Sim 7 21,43 9,08 0,474ELL (NOGA) Não 6 5,05 4,71

Sim 7 4,44 2,57 0,775Não 6 10,03 2,01Voltagem unipolar (NOGA)

Sim 7 10,36 3,71 0,886Não 6 11,33 15,03TDPMR (Cintilografia de perfusão)

Sim 7 18,86 14,70 0,562Não 6 40,00 10,02DPMR50% (Cintilografia de

perfusão) Sim 7 41,43 12,77 0,565Pico de VO2_Inicial Não 7 16,91 9,27

Sim 7 19,00 8,83 0,565FE (ecocardiograma) Não 7 28,00 4,69

Sim 7 32,00 5,97 0,249VSF (ecocardiograma) Não 7 145,14 37,84

Sim 7 148,43 68,96 0,749VDF (ecocardiograma) Não 7 201,14 46,56

Sim 7 221,57 101,98 0,949BNP Não 6 210,50 209,85

Sim 5 450,80 496,60 0,361% ESV Não 7 1,11 1,81

Sim 5 7,64 9,54 0,167Duração do QT Não 7 61,88 14,40

Sim 7 70,67 26,31 0,406Duração do QRS Não 7 139,29 25,00

Sim 6 136,17 18,87 0,836Não 6 47,63 22,27Escore de pontos resumido do

SF36 Sim 7 52,60 21,55 0,474Não 6 51,33 22,84Escore de pontos do questionário

de Minnessota Sim 7 42,29 14,83 0,283DP: desvio padrão; FE: fração de ejeção; ELL: encurtamento linear local; TDPMR: percentual total dedefeito de perfusão miocárdica reversível; DPMR50%: defeito de perfusão miocárdica em repouso comatividade de 50%; VSF: volume sistólico final; VDF: volume diastólico final; BNP: do inglês BrainNatriuretic Peptide; ESV: extra-sístole ventricular.

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7. DISCUSSÃO

7.1. Segurança e Exeqüibilidade

Os resultados deste estudo sugerem que o transplante autólogo de célulasmononucleares da medula óssea através de injeções transendocárdicas, empacientes com grave disfunção ventricular, é uma técnica segura e exeqüível,tanto em curto prazo2 quanto em sua evolução de 12 meses.3

Diversos estudos clínicos vêm demonstrando a segurança e aexeqüibilidade deste procedimento em pacientes com cardiopatia isquêmicagrave,28, 49-52, 56, 58 levantando, cada vez mais, a possibilidade de uma nova opçãode tratamento para esta população de pacientes, até o presente, considerada “forade possibilidade terapêutica”.

Apesar dos avanços obtidos na última década, na área de ciência básica,com relação a esta nova modalidade terapêutica, diversas questões permanecemsem resposta. Pouco se sabe sobre os mecanismos subjacentes a esta maquinariacelular, através dos quais a terapia com células da medula óssea pode resultar emmelhora cardíaca efetiva. Quatro questões merecem atenção imediata:

1. Qual é ou quais são os tipos ideais de células para que haja recuperaçãofuncional efetiva? Em havendo, esta recuperação funcional está relacionada àregeneração miocárdica ou de outros componentes do tecido cardíaco(interstício, sistema de condução, sistema vascular, etc)?

2. Qual é o número ideal de células que deve ser utilizado para este tipo deterapia?

3. Qual deve ser a concentração ideal de células por volume de solução que deveser aplicada em cada ponto de injeção transendocárdica?

4. Qual deve ser o número máximo de injeções por tratamento?

A resposta a tais perguntas é fonte de intensa investigação em todo omundo e talvez possa ser encontrada dentro dos capítulos de angiogênese;cardiomiogênese; entendimento do papel das células da medula óssea injetadas eseus diferentes fenótipos celulares e suas correlações com as variáveis clínicasestudadas.

7.2. Angiogênese

Estudos em modelos pré-clínicos embasam a possibilidade deneovascularização de tecidos isquêmicos com o transplante de CMMO.Observou-se em ratos que as células da medula óssea são capazes de gerar

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angiogênese, demonstrado por dados funcionais e histopatológicos.129 Outrosgrupos obtiveram resultados semelhantes, incluindo Fuchs et al 28 e Kawamotoet al90 que estudaram porcos com isquemia miocárdica crônica induzida porimplante de constritores na coronária, e que, a seguir, foram submetidos aotransplante de CMMO. Os animais foram submetidos à análise histopatológica1 mês após o procedimento. Os autores observaram melhora da perfusãomiocárdica relacionada ao desenvolvimento de novos vasos.28, 90

Os resultados deste estudo demonstram que houve melhora significativada perfusão e do ELL, pelo mapeamento eletromecânico, na área de miocárdiotratada, assim como melhora da FE e do VSF do ventrículo esquerdo, semmelhora do VDF.1-3 Tais achados sugerem um melhor desempenho contrátil dasáreas viáveis e não o surgimento de novas áreas viáveis. Uma vez que as célulasforam injetadas somente em áreas de miocárdio isquêmico, é razoável imaginarque aquele meio (micro) ambiente oferecesse forte sinalização angiogênica paraas células transplantadas, como, por exemplo, pela presença do Fator de HipóxiaTecidual (HIF-1, do inglês “hipoxia inducible factor”) gerando Fator deCrescimento Vascular Endotelial (VEGF, do inglês “vascular endothelialgrowth factor”).

Portanto, neste estudo, a melhora da perfusão miocárdica observada nasáreas de miocárdio tratadas com CMMO, pode ter como um de seus mecanismosa angiogênese.

7.3. Cardiomiogênese

A idéia de que o coração é um órgão sem capacidade de auto-regeneração tem sido posta em cheque por estudos recentes que demonstraramum grande número de cardiomiócitos em mitose em corações adultos.130-132

Autópsia de corações de pacientes falecidos por insuficiência cardíacademonstrou que a proporção de miócitos em mitose é baixa, 0,015% a 0,08%,mas deixou evidente que existe uma proliferação de cardiomiócitos em coraçõesadultos, embora, ineficiente para um mecanismo de reparo tecidual efetivo.130, 131

A origem destas células em processo de divisão, no miocárdio, também éincerta. Entretanto, a possibilidade de que estas células em divisão sejam deorigem extracardíaca é sugerida por estudos de pacientes submetidos atransplantes heterólogos de doadores do sexo oposto.

A biópsia de corações femininos em receptores do sexo masculinoevidenciou cardiomiócitos com cromossoma Y.69, 130, 133 Dado que tais célulaspodem se diferenciar em tecido cardíaco, duas origens potenciais têm sidosugeridas: na primeira, as células teriam origem na medula óssea, de onde elasseriam liberadas em baixas taxas num processo de regeneração contínua ou emresposta a uma lesão aguda; na segunda hipótese, estas células representariamuma população de células-tronco residentes cardíacas.

O isolamento de células lin-ckit+ e Sca1+ de tecido cardíaco,131, 134

fortaleceu a última hipótese, no entanto, de acordo com evidências maisrecentes, as duas hipóteses parecem ser verdadeiras. Oh et al também relatarama existência de células progenitoras residentes cardíacas.135 Diferente das células

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lin-ckit+Sca1+ de Beltrami et al,134 estas células são lin-ckit-Sca1+. Células-troncoresidentes cardíacas também foram isoladas de pacientes submetidos à cirurgiade troca de valva aórtica estenosada. Análise do material de miomectomia dotrato de saída do VE, demonstrou grupos de células lin-ckit+Sca1+, co-expressando marcadores de cardiomiócitos GATA-4 e MEF2 (do inglês,myocyte-specific enhancer factor 2), sugerindo a existência de células-troncoresidentes cardíacas em processo de transição para cardiomiócito.136 Estudosposteriores a partir de tecido cardíaco humano corroboram não só a existênciadessas células, mas também a capacidade das mesmas de adotarem o fenótipo decardiomiócito maduro in vivo137 e in vitro138, na ausência de fusão celular.

Embora as células residentes cardíacas não expressem marcadores desuperfície de linhagem endotelial ou hematopoiética, existe a possibilidade deque tais células possam ser derivadas da medula óssea.27, 65, 69, 134, 135

Células da medula óssea lin-, ou seja, que não expressam marcadores dediferenciação na superfície, mas ckit+, ou seja, que expressam SCF-1 (do inglês,stem cell factor), quando injetadas diretamente no músculo cardíaco, melhorama função sistólica do VE.41 Além disso, através de técnicas deimunofluorescência foi possível demonstrar que estas células primitivas,derivadas da medula óssea, durante o processo de diferenciação passam aexpressar marcadores de cardiomiócitos, sugerindo que tais células são capazesde regenerar a musculatura cardíaca. Tais achados foram confirmados porestudos subseqüentes.38, 134, 139

Entretanto, outras técnicas também demonstraram que existe umprocesso de fusão das células da medula óssea com as células locais e que estafusão poderia justificar a expressão dos marcadores de cardiomiócitos pelascélulas da medula óssea, trazendo a tona o fato de que o processo detransdiferenciação talvez possa ser mais limitado do que o demonstrado pelosestudos iniciais.135, 140-144 Dois outros estudos, publicados mais recentemente,26,

145 que utilizaram técnicas genéticas para marcação celular ao invés deimunofluorescência, corroboraram esta teoria e trouxeram uma outra linha deraciocínio relacionada a melhora da função cardíaca observada no estudo deOrlic et al,41, 139, 146 talvez justificada pela formação de novos vasos comconseqüente aumento do aporte sanguíneo, ao invés de transdiferenciação emcardiomiócitos.26, 145

Embora os resultados clínicos preliminares em pacientes com IAM,recente35, 36, 53, 54, 57, 104, 111 e crônico,56 sugiram uma redução na área de fibroseapós terapia com células mononucleares de medula óssea por viaintracoronariana, os dados de angiografia, cintilografia e mapeamentoeletromecânico deste estudo sugerem melhora da função contrátil do ventrículoesquerdo secundária a angiogênese e não cardiomiogênese.1-3 Além do fatodestes pacientes não terem apresentado melhora do defeito em repouso, nacintilografia, bem como da voltagem unipolar, pelo mapeamentoeletromecânico, o que sugeriria um possível efeito miogênico, houve melhorasignificativa da perfusão e do ELL, pelo mapeamento eletromecânico, na área demiocárdio tratada, assim como melhora da FE e do VSF do ventrículo esquerdo,sem melhora do VDF.1-3 Tais achados sugerem um melhor desempenho contrátildas áreas viáveis e não o surgimento de novas áreas viáveis.

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Além disso, o estudo histopatológico do nono paciente deste estudo, queevoluiu para o óbito 11 meses após o procedimento de injeção, demonstrou umaumento da densidade capilar na área de implante associada a uma hipertrofia daparede vascular com hiperplasia de pericitos, células murais e da adventícia.Algumas destas células adquiriram estruturas do citoesqueleto, doscardiomiócitos, e proteínas contráteis.49, 51, 111 É possível, portanto, que amelhora clínica observada nestes pacientes, já no segundo mês deacompanhamento, se deva a um processo de angiogênese mais do que decardiomiogênese. Tal suposição está em concordância com os resultados dosestudos pré-clínicos.147 É também possível que a interação das CMMO comcélulas-tronco residentes cardíacas, demontradas em estudos recentes,137, 138

possa ser responsável pelo surgimento tardio (11 meses após o procedimento deinjeção) de células miofibroblastoides, com características de cadiomiócitos.Cardiomiogênese, portanto, pode ser um evento tardio no processo de reparo dotecido miocárdico lesado. Sua demonstração neste estudo não foi possívelprovavelmente porque as CMMO foram primariamente injetadas em áreas demiocárdio hibernante. O estudo histopatológico do coração deste paciente,entretanto, demonstrou que existem células móveis na área de fibrose, e queestas células parecem “caminhar” no sentido da árvore de distribuição vascular,resultante de um processo angiogênico em meio à fibrose.

7.4. Fenótipos celulares e correlação com as variáveis clínicas analisadas

Pouco se sabe sobre como as células da medula óssea melhoram a funçãocardíaca ou quais são os fenótipos celulares envolvidos. As evidências sugeremque existe um processo de neoformação vascular, neoformação decardiomiócitos e um efeito parácrino. As evidências também sugerem que aquantidade de cardiomiócitos novos produzidos pelo processo de regeneração éincapaz de, por si só, explicar os efeitos clínicos observados.

A maioria dos estudos clínicos publicados até o momento, de fase I/II,tem utilizado o “pool” total de células mononucleares da medula óssea e algunspoucos estudos, populações específicas de células mesenquimais, CPE, CD34+

ou AC133+.41, 112, 139, 146 As células mononucleares da medula óssea contêm umavariedade de células progenitoras, incluindo as células-tronco hematopoiéticas;as células satélites ou pericitos e as células mesenquimais ou células do estromada medula óssea. As células-tronco hematopoiéticas expressam os antígenos desuperfície CD34+ ou CD133+ em seres humanos e compõem, normalmente,cerca de 1-2% do total de células mononucleares da medula óssea em adultosnormais.41, 139, 146 A população de pacientes deste estudo, que foi submetida aoaspirado de medula óssea, apresentou 3,8±2% de células CD34+ do total decélulas mononucleares. De forma bastante interessante tais células, quandoanalisadas em conjunto, não apresentaram qualquer correlação significativa comas variáveis clínicas analisadas, porém quando a mesma análise foi feita deforma individualizada as células CD34+CD45lo, célula progenitorashematopoiéticas, e as células CD34+HLADR-, ditas células progenitorashematopoiéticas precoces, apresentaram correlação significativa com a duraçãodo QRS medida ao final de 2 e 6 meses de seguimento, respectivamente. Alémdisso, as células progenitoras hematopoiéticas precoces (CD34+HLADR-)

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apresentaram correlação significativa com a melhora da isquemia miocárdica,avaliada pela cintilografia miocárdica, ao final de 1 ano de seguimento.

As células ckit+CD45-, que são as células lin- com expressão do receptordo SCF-1, se correlacionaram com a diminuição dos volumes cavitários doventrículo esquerdo ao final de 1 ano, corroborando com a teoria de que taiscélulas podem influenciar no remodelamento reverso do miocárdio.148 Alémdesse possível papel tardio, tais células também apresentaram uma correlaçãopositiva, significativa, com a melhora da capacidade funcional e da isquemiamiocárdica ao final de 2 meses de seguimento.

O receptor ckit é um membro da família tirosina cinase de receptores e éativado pelo SCF/kit ligante. A ativação deste receptor resulta em múltiplas viasde sinalização envolvendo mobilização celular, proliferação celular eantiapoptose.149-151 Células da medula óssea lin-ckit+ atuam sobre diversaspopulações celulares alvos, tais como células-tronco e progenitorashematopoiéticas, mastócitos e células Natural Killer. Ayach et al152 demonstrouque o transplante de células da medula óssea lin-ckit+ em camundongos resultouem melhora da função cardíaca, diminuição da apoptose, aumento daangiogênese, aumento da mobilização de células da medula óssea e aumento daatividade das células Natural Killer precocemente após IAM.152 Entretanto,neste estudo, as células Natural Killer (células CD56+), com atividadecitotóxica, apresentaram correlação negativa com a maioria das variáveisanalisadas (duração do QRS; ELL; Isquemia e escores de qualidade de vida).São necessários estudos posteriores para que se possa esclarecer o significadodeste achado.

Atividade parácrina “antiapoptótica” resultante da sinalização promovidapelos receptores cKit ativados, tem sido atribuída à regulação positiva da via desinalização AKT, citoprotetora, nas células-alvo.151, 153 A ativação de tal viapode explicar a maior sobrevida de células endoteliais e miócitos, observada noestudo de Ayach et al.152 Infiltração de células da medula óssea mobilizadas oucélulas residentes, cKit+, podem ter contribuído para esta atividade parácrina.Resultados semelhantes foram observados após injeção de células-troncomesenquimais em área de miocárdio infartado, com redução do tamanho doinfarto.154 Cerca de 70% das células CD34+, derivadas da medula óssea, sãocKit+ e este fato talvez justifique a relação destas células com o processo deneovascularização.47, 155, 156

Quando se observou o comportamento das células linfocíticas, CD4+ eCD8+, resultados controversos foram obtidos. Houve correlação negativa comalgumas variáveis analisadas (volumes cavitários ao final de 2 e 6 meses eisquemia ao final de 6 meses e 1 ano) e correlação positiva com outras (ELL eVoltagem Unipolar ao final de 4 meses, assim como melhora da área de cicatrizmiocárdica e capacidade de exercício ao final de 6 meses e 1 ano). É interessantenotar que as células T CD8+ são predominantemente citotóxicas, enquanto queas células T CD4+ podem ser subdividas em dois subgrupos celulares de célulasT helper, Th1 e Th2. As células CD4+ Th1 secretam interferon-ã e ativammacrófagos, dirigindo, portanto, uma resposta imunoinflamatória. São as célulasimplicadas em algumas doenças auto-imunes, incluindo-se a miocardite auto-imune. As células Th2 secretam predominantemente, e em grande quantidade,

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interleucina antiinflamatória (IL-10) e, em pequena quantidade, interleucinasinflamatórias (IL-2; IL-4; IL-5; e TGF-â) sendo, portanto, consideradas célulasimunomoduladoras. Alguns grupos consideram que tais células tambémestimulam as células endoteliais a secretarem VEGF, através de sinalizaçõesutilizando CD40, em reposta a isquemia.28, 49-52, 58

As células CD19-, ou seja, todas as células mononucleares da populaçãode células injetadas, com exceção das células B, também se correlacionaram deforma ambígua com tais variáveis clínicas, fortalecendo a hipótese de queexistem células que talvez participem desse processo de reparo retardando-o, ede que existem outras células, que talvez devam ter a concentração aumentada,que participam desse processo ampliando-o.

Os linfócitos B (células CD19+) se correlacionaram positivamente com oELL ao final de 4 meses e com a melhora da isquemia ao final de 1 ano deseguimento, sugerindo um efeito parácrino de tais células sobre o processo deregeneração do miocárdio, precoce e tardio.

Os monócitos (células CD14+), de forma interessante, correlacionaram-sepositivamente com a melhora dos níveis séricos de BNP ao final de 2 meses ecom a diminuição do VDF do VE ao final de 6 meses, também corroborando ahipótese de que talvez haja uma possível interação parácrina destas células como processo de reparo tissular. Os monócitos (células CD14+) são importantesmediadores da resposta inflamatória durante a arteriogênese e são célulassecretoras de uma larga variedade de citoquinas tais como VEGF, MCP-1, FGF-1 e FGF-2, além de também secretarem óxido nítrico. São, portanto, célulasimportantes no processo de angiogênese e reparo tissular.59

As unidades formadoras de colônia de fibroblastos (CFU-F), quegrosseiramente representam as células mesenquimais, se correlacionarampositivamente com a melhora dos volumes cavitários e dos sintomas deinsuficiência cardíaca ao final de 2 meses de seguimento. Uma correlaçãopositiva entre a densidade dessas células e o VDF, ao final de 1 ano deseguimento também foi observado. Estes resultados são corroborados pordiversos estudos, clínicos e pré-clínicos, que têm utilizado célulasmesenquimais, expandidas em cultura, para regeneração miocárdica,demonstrando melhora da função contrátil do VE.157 Da mesma forma, asunidades formadoras de granulócitos (CFU-GM), também se correlacionarampositivamente com diversas variáveis clínicas analisadas, sugerindo que taiscélulas talvez possam participar desse processo de regeneração tissular poratividade parácrina. As CFU-GM são precursoras das células CD34+ e, portanto,esta correlação positiva e significativa pode ter sido o resultado de umacorrelação indireta com estas células progenitoras.

De forma bastante interessante não houve correlação de nenhum dosfenótipos avaliados com aumento do número de extra-sístoles ventriculares atéum ano de seguimento, mais uma vez corroborando os dados clínicos publicadosaté o momento de que não houve indução de arritmia maligna em nenhum dospacientes estudados.158

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7.5. O número de injeções, a concentração da solução contendo células da medulaóssea e a área de distribuição destas células no miocárdio isquêmico: estãoadequados?

Em resposta as perguntas 2; 3 e 4, o número de injeções ventriculares secorrelacionou de forma negativa com as variáveis que medem funçãoventricular, sugerindo que apesar do pequeno calibre da agulha de injeçãotransendocárdica e do pequeno volume de solução injetada (0,2 ml) por ponto, onúmero excessivo de injeções ventriculares pode promover mais agressãomiocárdica do que reparo. Tal afirmativa é corroborada pelo fato de que em umsubgrupo de 5 pacientes, com características semelhantes a estes, onde foiinjetado 5,9 ± 1,6 ml de solução, contendo 120,4 ± 24 milhões de CMMO,distribuída em 29 ± 7,8 pontos de injeção, não houve melhora do ELL ou davoltagem unipolar no seguimento de 4 meses, assim como das outras variáveisrelacionadas à função ventricular (dados não publicados).

Beers et al recentemente apresentaram, no congresso “American HeartAssociation” de 2005, os resutados do transplante transendocárdico de 100milhões de CMMO distribuídas na área de miocárdio isquêmico, através de 11 ±2 injeções, em uma série de 22 pacientes, com cardiopatia isquêmica terminal eangina refratária.159 Estes autores demonstraram além de melhora dos sintomasde angina, aumento significativo da FE e redução do VSF do ventrículoesquerdo, com manutenção do VDF, ao final de 3 meses de seguimento. Estesresultados são semelhantes ao que foi demonstrado no seguimento de 2 mesesdeste estudo.

Nesta série de 5 pacientes, relatada acima, que foi submetida aotratamento com um número de CMMO, semelhante ao do estudo de Beers et al,distribuídas não em 11 ± 2, (ou 14,8 ± 2 injeções como neste estudo), mas em 29± 7,8 pontos de injeção, em uma área de miocárdio de 4.317 ± 1.433 mm2 (2,43vezes maior que a área de distribuição das células, neste estudo), tal efeitosignificativo não foi observado (dados não publicados). Nestes 5 pacientes, opercentual de defeito reversível na cintilografia variou de 23,8% ± 39% para22,6% ± 29% e o percentual de defeito de captação em repouso variou de 36,4%± 13% para 34,8% ± 14% no seguimento de 2 meses. A FE variou de 35,5% ±15% para 35,5% ± 13%; o ELL variou de 6,7% ± 3,2% para 7,7% ± 1,8% e avoltagem unipolar variou de 7,7 mV ± 1,3 mV para 7,5 mV ± 1,7 mV noseguimento de 4 meses. Tais dados levantam a suposição de que talvez aconcentração da solução de 1 milhão de células para cada 0,1 ml de soluçãosalina, utilizada pela maioria dos trials clínicos, deva ser aumentada e o númerode injeções limitado a no máximo 20, por procedimento de transplante. Nesteestudo a densidade das células CD34+ apresentou forte correlação com amelhora da função sistólica do ventrículo esquerdo, fortalecendo a hipótese deque a concentração de células na solução para injeção deve ser aumentada.

O tamanho da área de injeção também se correlacionou negativamentecom algumas variáveis clínicas. É interessante observar que quando secomparam os pacientes que apresentaram melhora sustentada da isquemia aofinal de 1 ano de seguimento, com aqueles, dentro do grupo de 14 pacientes, quenão tiveram a mesma evolução favorável, algumas diferenças foram observadas.Embora o número total de células injetadas nos dois grupos tenha sido

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semelhante, assim como a área de isquemia pela cintilografia, no grupo que nãoapresentou melhora sustentada da isquemia observou-se uma maior área (mm2)de distribuição das injeções (2.345 ± 1.374 x 1.270 ± 440; p = 0,07). No grupoque manteve melhora sustentada da isquemia ao final de 1 ano de seguimento,observou-se uma população de células mononucleares significativamente, ecoincidentemente, mais enriquecida com células CD34+HLADR- (p=0,05) emenos enriquecida com céluas CD4+; CD8+ e CD19+ (p < 0,05).

É incontestável o fato de que diversas células da medula óssea exercemseus efeitos através de mecanismos parácrinos e de que existe um complexomecanismo de interação, contato e liberação de sinais entre as células do estromada medula óssea e as outras populações celulares, incluindo-se a das célulasprogenitoras hematopoiéticas. Angiogênese e arteriogênese são processoscomplexos que envolvem a participação de múltiplas células e múltiplascitoquinas. Estas citoquinas agem de forma coordenada pelo tempo, pelaconcentração e pela presença de outras citoquinas, através ou de sinergismo oude efeito inibitório. Terapia celular utilizando células precursoras em número econcentrações apropriadas, que secretem tais citoquinas ou sinalizadores deforma fisiológica, é um objetivo a ser atingido no futuro próximo. Açãoparácrina é o principal mecanismo de ação considerado atualmente. Além disso,a possibilidade de ativação das células-tronco locais deve ser considerada.

7.6. Limitações

Embora o pequeno número de pacientes e o desenho aberto do estudopossam justificar diferenças estatísticas observadas na comparação de algumasvariáveis (efeito “Hawthorne”), os dados apresentados sugerem que osresultados demonstrados podem ser secundários à melhora da perfusãomiocárdica.

Numa população de poucos pacientes com múltiplas variáveis emanálise, há uma probabilidade aumentada de erro tipo á e tipo â nos testes decorrelação linear. Além disso, apesar de termos observado correlaçõessignificativas, positivas e negativas, com algumas variáveis clínicas analisadas,coincidentemente, seguindo um padrão coerente com os mecanismos conhecidosde funcionamento dessas células, não é possível inferir qualquer relação causa-efeito entre os diferentes fenótipos celulares estudados e as variações clínicasobservadas, o que fortaleceria a hipótese de efeitos parácrinos como principalmecanismo de ação dessas células.

O pequeno número de pacientes também impediu uma análise estatísticamais acurada, incluindo análise multivariada, que pudesse identificar os perfiscelulares que se correlacionassem de forma independente com as variáveisclínicas estudadas.

Portanto, não é possível inferir qualquer mecanismo de atuação celularcom base nos dados expostos, uma vez que uma correlação linear significativanão implica em relação “causa-efeito”. Entretanto, seguindo um raciocíniocoerente com a lógica da biologia de tais células, é possível levantar a hipótesede que talvez a injeção de células mononucleares negativamente selecionadas,

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para as células CD56+; CD19+; CD4+ e CD8+ e enriquecidas com a população decélulas aderentes e células CD34+, possam promover um resultado clínico aindamais favorável tanto em curto quanto em longo prazo.

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8. CONCLUSÕES

8.1. Neste estudo inicial prospectivo, não randomizado, em pacientes com doençaarterial coronária, com grave disfunção ventricular e sem outra opção detratamento, não foram observados efeitos adversos graves relacionados aoprocedimento, seja na fase de internação, seja no seguimento de 12 meses.Neste período de acompanhamento não foi observado deterioração dosparâmetros mecânicos e de perfusão nas áreas injetadas, assim como não foiobservado qualquer sinal de disfunção do sistema de condução. Um paciente dogrupo tratado faleceu por morte súbita, 14 semanas após o procedimento deinjeção e um segundo paciente, do grupo tratado, faleceu por AVC hemorrágico,11 meses após o procedimento. Os dois óbitos foram considerados nãorelacionados ao procedimento de injeção ou a ação do material medular noorganismo. Houve 1 óbito, por morte súbita, no grupo controle.

8.2. As células viáveis e os fenótipos CD45lo, HLADR-, ckit+CD45-, CD14+,CD19+, CD34+, CFU-F e CFU-GM se correlacionaram positivamente com amelhora de algumas variáveis clínicas analisadas, enquanto que as célulasCD56+ se correlacionaram negativamente. As células CD4+, CD8+ e CD19- secorrelacionaram de forma ambígua com tais variáveis.

8.3. Houve aumento significativo da medida do pico de VO2 no grupo tratado emrelação ao grupo controle, 2 meses após o TACMMO. Este resultado foimantido até 1 ano de acompanhamento.

8.4. Observou-se melhora da isquemia miocárdica no grupo tratado em relação aogrupo controle, 2 meses após o TACMMO. Esta melhora significativa foimantida até 1 ano de acompanhamento, apesar de uma lenta e progressiva piorada isquemia, observada a partir do 6º mês de seguimento.

8.5. Observou-se melhora significativa da FE do ventrículo esquerdo no grupotratado em relação ao grupo controle, no 2º e 6º mês de acompanhamento. Estamelhora significativa não se sustentou até 1 ano de seguimento. Houve, damesma forma, elevação significativa dos níveis séricos de BNP no grupocontrole em relação ao tratado no 2º e 6º mês de acompanhamento. Entretanto,esta diferença entre os grupos não foi mais observada ao final de 12 meses deseguimento.

8.6. Os pacientes do grupo submetido ao TACMMO evoluíram com melhorasustentada dos sintomas de angina e insuficiência cardíaca ao longo dos 12meses de seguimento, em relação ao grupo controle.

8.7. Observou-se melhora sustentada dos índices dos Questionários de Qualidade deVida SF-36 e Minnessota, nos seguimentos de 2; 6 e 12 meses após oprocedimento de implante do “pool” total de CMMO, no grupo tratado emrelação ao grupo controle.

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9. CONCLUSÃO FINAL

Este estudo demonstra a exeqüibilidade e a segurança da realização deinjeções transendocárdicas de CMMO em pacientes com cardiopatia isquêmicaassociada a grave disfunção ventricular. Os efeitos observados em curto prazoforam mantidos até 12 meses de seguimento.

Houve correlação significativa dos fenótipos celulares com as variáveisclínicas analisadas, sendo que as células viáveis e os fenótipos CD45lo, HLADR-

, ckit+CD45-, CD14+, CD19+, CD34+, CFU-F e CFU-GM se correlacionarampositivamente com tais variáveis, enquanto que as células CD56+ secorrelacionaram negativamente. As células CD4+, CD8+ e CD19- secorrelacionaram de forma ambígua com as variáveis clínicas analisadas. Épossível que haja um efeito parácrino, em longo prazo, das células injetadas, masas funções específicas de tais células, no processo de reparo tissular, aindaprecisam ser elucidadas.

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149. Ashman LK. The biology of stem cell factor and its receptor C-kit. Int JBiochem Cell Biol. Oct 1999;31(10):1037-1051.

150. Jiang X, Gurel O, Mendiaz EA, et al. Structure of the active core of human stemcell factor and analysis of binding to its receptor kit. Embo J. Jul 3 2000;19(13):3192-3203.

151. Ronnstrand L. Signal transduction via the stem cell factor receptor/c-Kit. CellMol Life Sci. Oct 2004;61(19-20):2535-2548.

152. Ayach BB, Yoshimitsu M, Dawood F, et al. Stem cell factor receptor inducesprogenitor and natural killer cell-mediated cardiac survival and repair after myocardialinfarction. Proc Natl Acad Sci U S A. Feb 14 2006;103(7):2304-2309.

153. Smith MA, Court EL, Smith JG. Stem cell factor: laboratory and clinicalaspects. Blood Rev. Dec 2001;15(4):191-197.

154. Mangi AA, Noiseux N, Kong D, et al. Mesenchymal stem cells modified withAkt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med. Sep2003;9(9):1195-1201.

155. Lanza R, Moore MA, Wakayama T, et al. Regeneration of the infarcted heartwith stem cells derived by nuclear transplantation. Circ Res. Apr 2 2004;94(6):820-827.

- 63 -


156. De Waele M, Renmans W, Asosingh K, et al. Growth factor receptor profile ofCD34 cells in normal bone marrow, cord blood and mobilized peripheral blood. Eur JHaematol. Mar 2004;72(3):193-202.

157. Pittenger MF, Martin BJ. Mesenchymal stem cells and their potential as cardiactherapeutics. Circ Res. Jul 9 2004;95(1):9-20.

158. Kinnaird T, Stabile E, Burnett MS, et al. Bone-marrow-derived cells forenhancing collateral development: mechanisms, animal data, and initial clinicalexperiences. Circ Res. Aug 20 2004;95(4):354-363.

159. Wickstrom G, Bendix T. The "Hawthorne effect"--what did the originalHawthorne studies actually show? Scand J Work Environ Health. Aug 2000;26(4):363-367.

- 64 –Anexos


ANEXOS

Anexo I - Gerenciamento e Financiamento do Estudo

Anexo II – Trabalho publicado na Revista Circulation Abril 2003

Anexo III – Trabalho publicado na Revista Circulation Setembro 2004

Anexo IV – Trabalho publicado na Revista Arquivos Brasileiros de Cardiologia Maio2005

Anexo V – Trabalho publicado na Revista Circulation Julho 2005

- 65 –Anexos


ANEXO I - Gerenciamento e Financiamento do Estudo

O estudo foi gerenciado por uma série de comitês que compuseram o corpoexecutivo. Cada um destes comitês foi responsável por uma dimensão do estudo,interagindo entre si, com a finalidade de garantir alto padrão de qualidade científica eacordo com os princípios de bioética vigentes. As funções, composições eespecificações, de cada um dos comitês, estão descritas abaixo.

A 1.1 - COMITÊ COORDENADOR

INTEGRANTES: Dr. Hans Fernando Rocha Dohmann, Dr. Radovan Borojevic, Dr.Antônio Carlos Carvalho, Dra. Suzana Alves Silva, Dr. Hans Jurgen F Dohmann.

Responsável pela coordenação das ações previstas no protocolo de pesquisa.Supervisionou os diversos comitês e garantiu a interação entre eles para a execuçãoadequada de suas atribuições. Também foi responsável pela análise dos dadosfornecidos pelo Comitê de Assessoria em Exames Complementares que gerou osresultados deste estudo.

A 1.2 - COMITÊ ADMINISTRATIVO

INTEGRANTES: Dr. Francisco Eduardo Guimarães Ferreira, Dr. Evandro Ruas, Dr.Paulo Alves.

Responsável pelo gerenciamento das ações administrativas que garantiram aexecução do protocolo. Garantiu a contratação de serviços quando necessário, adisponibilização de dados administrativos, bem como qualquer relação jurídica que sefizesse necessária por relação com este protocolo.

A 1.3 - COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA

INTEGRANTES: Dra. Lúcia Pimenta, Dr. Alfredo Potsch, Enf. Ana Lúcia Cascardo.

Responsável pelo cumprimento das ações previstas neste protocolo sob o pontode vista da qualidade da metodologia de pesquisa, bem como dos princípios de bioética.Relacionou-se com a Comissão Nacional de Ética em Pesquisa garantindo a execuçãoda regulamentação nacional vigente. Recebeu os dados clínicos do Comitê deGerenciamento dos Casos a fim de filtrar qualquer informação, ou falta de, quepudessem ter algum comprometimento ético aos pacientes.

A 1.4 - COMITÊ DE SEGURANÇA

- 66 –Anexos


INTEGRANTES: Dr. Roberto Esporcatte, Dr. Ricardo Mourille, Dr. Evandro TinocoMesquita, Dr. Luis Antônio Campos, Dr. Antonio Cláudio Nóbrega.

Este Comitê foi responsável por participar da elaboração do protocolo depesquisa, pontuar, discutir e considerar todos os aspectos de segurança dos pacientesrelacionados ao protocolo de pesquisa; também foi responsável por monitorar os dadosdo estudo e decidir, com autonomia, a continuidade ou não do mesmo; receberam osresultados dos exames complementares fornecidos pelo Comitê de Assessoria emExames Complementares para análise crítica dos resultados e posteriorencaminhamento ao Comitê de Ética em Pesquisa.

Foi Responsável por analisar eventuais casos de óbito, classificando-os.

Este comitë foi notificado pelos investigadores principais de todos os eventos eintercorrências no decorrer do estudo e foi responsável por acompanhar odesdobramento dos mesmos.

A 1.5 - COMITÊ DE INTERVENÇÃO CARDIOVASCULAR

INTEGRANTES: Dr. Emerson Perin, Dr. André Luiz Silveira Sousa, Dr. JoãoAlexandre Assad, Dr. Rodrigo Verney Castelo Branco, Dr. Carlos HenriqueFalcão, Dr. Nelson F. Durval Gomes de Mattos, Dr. Luis Antônio Carvalho, Dr.Constantino Gonzales Salgado, Dr. André da Fonseca Feijó.

Responsável pelas ações clínicas que envolveram as intervenções cardiovascularespercutâneas, aí incluídos os transplantes de células por via intracoronariana e os estudoshemodinâmicos, bem como qualquer intervenção terapêutica que se fizesse necessáriaem eventuais complicações dos pacientes.

A 1.6 - COMITÊ DE GERENCIAMENTO DOS CASOS

INTEGRANTES: Auxiliar Administrativo Ana Guimarães; Rita Weiler e Enf.Patrícia.

Responsável pelo acompanhamento dos pacientes desde a sua internação.Deviam garantir o recolhimento dos dados de internação, bem como da fase pós-hospitalar. Tinham por objetivo detectar precocemente qualquer complicação advindado estudo.

A 1.7 - COMITÊ DE ARRITMIAS

INTEGRANTES: Dr. Ivan Maia, Dr. Roberto Sá.

Responsável pela detecção, identificação e manuseio de arritmias cardíacas nospacientes que participarem deste protocolo.

- 67 –Anexos


A 1.8 - COMITÊ CLÍNICO

INTEGRANTES: Dra. Suzana Alves da Silva e Dr. Fernando Oswaldo Dias Rangel.

Responsável pelo acompanhamento clínico dos pacientes e por analisar eventuaiscasos de óbito, classificando-os.

A 1.9 - COMITÊ DE SELEÇÃO

INTEGRANTES: Dra Suzana Alves da Silva.

Os pacientes candidatos ao estudo foram selecionados para participarem doprotocolo de pesquisa caso não tivessem qualquer outra possibilidade derevascularização miocárdica, percutânea ou cirúrgica. Esta decisão se baseou: primeiro,na avaliação do filme de cateterismo, realizado dentro do prazo de no máximo 12 mesesprévios a seleção; segundo, na presença de sintomas de angina e/ou insuficiênciacardíaca congestiva apesar de tratamento medicamento pleno; terceiro, na detecção deFE do VE < 50% no ecocardiograma ou ventriculografia. Uma vez selecionados para oprotocolo, o filme de cateterismo foi apresentado ao Comitê de Parecer paraInclusão/Exclusão do paciente no protocolo de pesquisa.

A 1.10 - COMITÊ DE PARECER PARA INCLUSÃO / EXCLUSÃO

INTEGRANTES: Dr. Edson Nunes, Dr. Celso Garcia, Dr. Marco Aurélio Fernandes,Dr. Luís Antonio Campos, Dr. Pedro Nogueira, Dr. André Luiz Silveira Sousa, Dr.João Alexandre Assad, Dr. Rodrigo Verney, Dr. André Feijó, Dr. Carlos Falcão,Dr. Nelson Mattos, Dr. Luis Antonio Carvalho, Dra. Suzana Alves Silva, Dr. HansDohmann, Dr. Fernando Oswaldo Dias Rangel.

Este comitê foi composto por especialistas em cardiologia, clínica eintervencionista, e por especialistas em cirurgia cardíaca. Foi responsável pelo parecerque definiu se a anatomia coronariana do paciente era passível de revascularização ounão. Cada paciente selecionado para o protocolo de pesquisa, pelo Comitê de Seleção,teve seus exames complementares e filme de caterismo avaliados por uma equipe doLaboratório de Intervenção Cardiovascular e por uma outra equipe da Unidade de Pós-Operatório, ambas do Hospital Pró-Cardíaco. A equipe do Laboratório de IntervençãoCardiovascular foi composta por 1 cardiologista clínico e 2 intervencionistas. A equipeda Unidade de Pós-Operatório foi composta por 1 cardiologista clínico e 2 cirurgiõescardíacos, de referência do Hospital Pró-Cardíaco. Cada avaliação foi dada na forma deparecer.

A 1.11 - COMITÊ DE CIRURGIA CARDÍACA

INTEGRANTES: Dr. Edson Nunes, Dr. Celso Garcia.

Responsável por qualquer parecer ou ação cirúrgica que se fizesse necessária navigência de eventual complicação.

- 68 –Anexos


A 1.12 - COMITÊ DE ASSESSORIA EM EXAMES COMPLEMENTARES

INTEGRANTES: Dr. Cláudio Tinoco Mesquita, Dr. Luciano Belém, Dr. ArnaldoRabischoffisky, Dr. Fernanda Belloni Nogueira, Dr. Julio Tolentino, Dr. RicardoViváqua, Dr. Amarino C. Oliveira Junior, Dr. André Sousa, Dr. João AlexandreAssad e Dr. Rodrigo Verney Castelo Branco.

Este Comitê foi composto por especialistas nos exames complementares descritosneste protocolo. Foi responsável pela qualidade metodológica dos exames e pelaavaliação dos resultados de forma independente. Cada um destes assessores foiresponsável pelo encaminhamento dos resultados ao Comitê de Segurança, que, após arespectiva análise, encaminhou os dados para o Comitê de Ética em Pesquisa. Após osdados terem sido analisados criticamente por ambos os Comitês, o Comitê Coordenadorpode proceder com as análises que geraram os resultados deste estudo.

A 1.13 - ASSESSORIA ONCOLÓGICA

INTEGRANTE: Dr. Carlos Andrade.

Responsável por todas as ações que envolveram oncologia clínica,seja na fase deseleção, seja em qualquer parecer que se fizesse necessário nas demais fases.

A 1.14 - COMITÊ DE AVALIAÇÃO PSICOLÓGICA E DE QUALIDADE DE VIDA

INTEGRANTE: Psicóloga Christine Rutherford.

Responsável pelo acompanhamento e avaliação psicológica e da qualidade devida dos pacientes.

A 1.15 - COMITÊ DE MANIPULAÇÃO CELULAR

INTEGRANTE: Dra Maria Izabel Doria Rossi, Dr. Hélio Dutra.

Responsável pelas ações que envolveram o manuseio, assim como o preparo domaterial aspirado da MO para obtenção da solução a ser transplantada.

A 1.16 COMITÊ DE ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

INTEGRANTE: Dra Christina Maeda Takyia, Dr. Radovan Borojevic.

Responsável pelas ações que envolveram a análise histopatológica do pacientesubmetido à autópsia.

- 69 –Anexos


A 1.17 FINANCIAMENTO DO ESTUDO

O estudo foi financiado pelo Hospital Pró-Cardíaco. Os cateteres NOGA deinjeção foram doados pela Cordis® Corporation, Johnson & Johnson company.

- 70 –Anexos


ANEXO II

Trabalho publicado na Revista Circulation Abril 2003

- 71 –Anexos


Circulation. 2003 May 13;107(18):2294-302. Epub 2003 Apr 21.

Comment in:

• Circulation. 2003 May 13;107(18):e9040-2.

Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation forsevere, chronic ischemic heart failure.

Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, Mesquita CT, Rossi MI,Carvalho AC, Dutra HS, Dohmann HJ, Silva GV, Belem L, Vivacqua R, Rangel FO,Esporcatte R, Geng YJ, Vaughn WK, Assad JA, Mesquita ET, Willerson JT.

Texas Heart Institute at St Luke's Episcopal Hospital, Houston, Tex, USA. [email protected]

BACKGROUND: This study evaluated the hypothesis that transendocardial injections ofautologous mononuclear bone marrow cells in patients with end-stage ischemic heart diseasecould safely promote neovascularization and improve perfusion and myocardial contractility.METHODS AND RESULTS: Twenty-one patients were enrolled in this prospective,nonrandomized, open-label study (first 14 patients, treatment; last 7 patients, control). Baselineevaluations included complete clinical and laboratory evaluations, exercise stress (ramptreadmill), 2D Doppler echocardiogram, single-photon emission computed tomographyperfusion scan, and 24-hour Holter monitoring. Bone marrow mononuclear cells were harvested,isolated, washed, and resuspended in saline for injection by NOGA catheter (15 injections of 0.2cc). Electromechanical mapping was used to identify viable myocardium (unipolar voltage > or=6.9 mV) for treatment. Treated and control patients underwent 2-month noninvasive follow-up,and treated patients alone underwent a 4-month invasive follow-up according to standardprotocols and with the same procedures used as at baseline. Patient population demographics andexercise test variables did not differ significantly between the treatment and control groups; onlyserum creatinine and brain natriuretic peptide levels varied in laboratory evaluations at follow-up, being relatively higher in control patients. At 2 months, there was a significant reduction intotal reversible defect and improvement in global left ventricular function within the treatmentgroup and between the treatment and control groups (P=0.02) on quantitative single-photonemission computed tomography analysis. At 4 months, there was improvement in ejectionfraction from a baseline of 20% to 29% (P=0.003) and a reduction in end-systolic volume(P=0.03) in the treated patients. Electromechanical mapping revealed significant mechanicalimprovement of the injected segments (P<0.0005) at 4 months after treatment. CONCLUSIONS:Thus, the present study demonstrates the relative safety of intramyocardial injections of bonemarrow-derived stem cells in humans with severe heart failure and the potential for improvingmyocardial blood flow with associated enhancement of regional and global left ventricularfunction.

Publication Types:

• Clinical Trial

• Controlled Clinical Trial

PMID: 12707230 [PubMed - indexed for MEDLINE]

- 72 –Anexos


Transendocardial, Autologous Bone Marrow Cell Transplantation forSevere, Chronic Ischemic Heart Failure

[Clinical Investigation and Reports]Perin, Emerson C. MD, PhD*; Dohmann, Hans F.R. MD*; Borojevic, Radovan PhD; Silva, Suzana A.

MD; Sousa, Andre L.S. MD; Mesquita, Claudio T. MD, PhD; Rossi, Maria I.D. PhD; Carvalho, AntonioC. MD, PhD; Dutra, Helio S. PhD; Dohmann, Hans J.F. MD, PhD; Silva, Guilherme V. MD; Belém,

Luciano MD; Vivacqua, Ricardo MD; Rangel, Fernando O.D. MD; Esporcatte, Roberto MD; Geng, YongJ. MD, PhD; Vaughn, William K. PhD; Assad, Joao A.R. MD; Mesquita, Evandro T. MD, PhD;

Willerson, James T. MD

From the Texas Heart Institute at St Luke’s Episcopal Hospital, Houston, Tex (E.C.P., G.V.S., Y.J.G.,W.K.V., J.T.W.); Hospital Procardiaco, Rio de Janeiro, Brazil (H.F.R.D., S.A.S., A.L.S.S., C.T.M.,H.J.F.D., L.B., R.V., F.O.D.R., R.E., J.A.R.A., E.T.M.); Federal University, Rio de Janeiro, Brazil (R.B.,M.I.D.R., A.C.C., H.S.D.); and Brazilian Millennium Institute for Tissue Bioengineering (H.F.R.D., R.B.,A.C.C.).Received March 7, 2003;revision received March 25, 2003; accepted March 26, 2003.Correspondence to Emerson C. Perin, MD, 6624 Fannin, Suite 2220, Houston, TX 77030 ([email protected]), and Hans F.R. Dohmann, MD, Rua General Polidoro, 192, CEP 22080-000–Botafogo, Rio de Janeiro, Brazil (e-mail [email protected]).Guest editor for this article was Valentin Fuster, MD, PhD, Mount Sinai School of Medicine, NY.This article originally appeared Online on April 21, 2003 (Circulation. 2003;107:r75–r83).*Drs Perin and Dohmann are co-principal investigators.

IntroductionAfter myocardial infarction, chronically ischemic (hibernating) myocardium may persist in associationwith variable degrees of scar tissue. In most circumstances, native angiogenesis is insufficient to preventthe resultant remodeling when significant injury occurs. As a consequence, infarct-related heart failureremains a major cause of morbidity and mortality.

The understanding that vasculogenesis can occur in the adult has led to intense investigation into stemcell therapy. Several recent experimental studies have confirmed the potential of pluripotential cells indifferentiating into cardiomyocytes and endothelial cells. 1,2 Further evidence from animal models hasconfirmed that pluripotential cells from bone marrow improve myocardial function and perfusion in thesetting of ischemic heart disease. 3,4 In addition, recent publications 5,6 have described beneficial effectsof intracoronary infusion of autologous, mononuclear bone marrow in the immediate postinfarctionperiod in humans. A recent report by Tse et al 7 described improvement in myocardial perfusion andsegmental contractility (as assessed by cardiac magnetic resonance imaging) in ischemic myocardialsegments treated with catheter-based delivery.

The present study addresses primarily the safety of endocardial bone marrow mononuclear cell(BMMNC) injections and secondarily the hypothesis that endocardial injections of autologous BMMNCs(ABMMNCs) in patients with end-stage ischemic heart disease may promote neovascularization and mayovercome the failure of the natural myocardial healing process.

MethodsPatient PopulationThis is a prospective, nonrandomized, open-label study of 21 patients with severe ischemic heart failureand no other option for standard revascularization therapies. Patients were enrolled sequentially, with thefirst 14 patients assigned to the treatment group and the last 7 patients to the control group. In accordancewith the ethics committee’s recommendations, an initial group of 4 patients was enrolled as a safetystudy. After 4 months’ follow-up of the initially injected patients (once safety was determined), theremaining study patients were enrolled. All patients were placed on maximally tolerated medical therapyat time of enrollment. The following inclusion criteria were required for patient enrollment: (1) chroniccoronary artery disease with reversible perfusion defect detectable by single-photon emission computedtomography (SPECT); (2) left ventricular (LV) ejection fraction (EF) <40%; (3) ineligibility for

- 73 –Anexos


percutaneous or surgical revascularization, as assessed by coronary arteriography; and (4) signed,informed consent. Ineligibility for surgical or percutaneous revascularization procedures was determinedby 2 expert committees: a surgical committee comprising 2 cardiovascular surgeons and a noninvasivecardiologist, and an interventional committee comprising 2 interventional cardiologists and 1 noninvasivecardiologist. Patients were not enrolled in the study if any 1 of the following exclusion criteria was met:(1) difficulty in obtaining vascular access for percutaneous procedures; (2) previous or current history ofneoplasia or other comorbidity that could impact the patient’s short-term survival; (3) significantventricular dysrhythmias (sustained ventricular tachycardia); (4) LV aneurysm; (5) unexplained abnormalbaseline laboratory abnormalities; (6) bone tissue with abnormal radiological aspect; (7) primaryhematologic disease; (8) acute myocardial infarction within 3 months of enrollment in the study; (9)presence of intraventricular thrombus by 2D Doppler echocardiogram; (10) hemodynamic instability atthe time of the procedure; (11) atrial fibrillation; or (12) any condition that, in the judgment of theinvestigator, would place the patient at undue risk.

The ethics committee of Pro-Cardiaco Hospital (Rio de Janeiro) and the Brazilian National ResearchEthics Council approved the study protocol.

Baseline EvaluationBaseline evaluation in the treatment group included a complete clinical evaluation (history and physical),laboratory evaluation (complete blood count, blood chemistry, C-reactive protein [CRP], brain natriureticpeptide [BNP], creatine kinase [CK]-MB and troponin serum levels), exercise stress test with ramptreadmill protocol, 8 2D Doppler echocardiogram, dipyridamole SPECT perfusion scan, and 24-hourHolter monitoring.

The control group underwent the above-mentioned baseline evaluation except for 24-hour Holtermonitoring, CK-MB, and troponin serum levels.

Periprocedural EvaluationPatients in the treatment group had serum CRP, complete blood count, CK, troponin, and BNP (only 9patients) levels measured and an ECG performed just before the procedure. Immediately after theprocedure, another ECG and 2D Doppler echocardiogram were performed, and 24-hour Holtermonitoring was begun. Serum CRP, CK, and troponin levels were also assessed at 24 hours. Patients weremonitored in the cardiac intensive care unit for 48 hours after the injection procedure.

Bone Marrow Aspiration and Isolation of Mononuclear CellsApproximately 4 hours before the cell injection procedure, bone marrow (50 mL) was aspirated underlocal anesthesia from the posterior iliac crest. BMMNCs were isolated by density gradient on Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences). Mononuclear cells were exhaustively washed with heparinizedsaline containing 5% human serum albumin and filtered through 100-µm nylon mesh to remove cellaggregates. The cells were finally resuspended in saline with 5% human serum albumin for injection. Asmall fraction of the cell suspension was used for cell counting and viability testing with trypan blueexclusion. Cell viability was shown to be >90% (96.2±4.9%), assuring the quality of the cell suspension.Post-hoc characterization of leukocyte differentiation markers by flow cytometry and functional assayswas done on another fraction of cells. The clonogenic capacity of hematopoietic progenitors wasevaluated by colony-forming assays (granulocyte-macrophage colony-forming unit) as previouslydescribed. 9

A high correlation between granulocyte-macrophage colony-forming units and CD45loCD34+ cells wasseen (Spearman r =0.77, P =0.0012). Fibroblast colony-forming assay was done as previously described10 to determine the presence of putative progenitor mesenchymal lineages. Bacterial and fungal culturesof the clinically used cell preparations were performed and proved negative.

Antibodies and Staining Procedure for Fluorescence-Activated Cell SorterAnalysisThe following antibodies were either biotinylated or conjugated with fluorescein isothiocyanate(Pharmingen), phycoerythrin (PE), or PerCP: anti-CD45 as a pan-leukocyte marker (clone HI30), anti-CD34 as a hematopoietic progenitor marker (clone HPCA-II), anti-CD3 as a pan–T-cell marker (cloneSK7), anti-CD4 as a T-cell subpopulation marker (clone SK3), and anti-CD8 as a T-cell subpopulationmarker (clone SK1) from Becton Dickinson; anti-CD14 as a monocyte marker (clone TUK4), anti-CD19

- 74 –Anexos


as a pan–B-cell marker (clone SJ25-C1), and anti-CD56 as an NK-cell marker (clone NKI nbl-1), fromCaltag Laboratories (Burlingame, Calif); and anti-HLA–DR (MHC-II, clone B8.12.2) from Beckman-Coulter. The biotinylated antibodies were revealed with Streptavidin PECy7 (Caltag Laboratories). Three-color immunofluorescence analysis was used for the identification of leukocyte populations in totalnucleated bone marrow cell suspensions. After staining, erythrocytes were lysed with the BectonDickinson lysis buffer solution according to the manufacturer’s instructions, and CD45 antibody was usedto assess the percentages of leukocytes in each sample. Data acquisition and analyses were performed ona fluorescence-activated cell sorter Calibur with CellQuest 3.1 software (Becton Dickinson).

Transendocardial Delivery of ABMMNCsIn the cell-injection treatment group, patients were taken to the cardiac catheterization laboratory [almostequal to]1 hour before the anticipated arrival of the bone marrow cells from the laboratory. Left heartcatheterization with biplane LV angiography was performed. Subsequently, electromechanical mapping(EMM) of the left ventricle was performed as previously described. 11 The general region for treatmentwas selected by matching the area identified as ischemic by previous SPECT perfusion imaging. Theelectromechanical map was then used to target the specific treatment area by identifying viablemyocardium (unipolar voltage >=6.9 mV) 12 within that region. Areas associated with decreasedmechanical activity (local linear shortening <12%, indicating hibernating myocardium) were preferred.

The NOGA injection catheter (Figure 1) was prepared by adjusting the needle extension at 0° and 90°flex and by placing 0.1 cc of ABMMNCs to fill the needle dead space. The injection catheter tip wasplaced across the aortic valve and into the target area, and each injection site was carefully evaluatedbefore the cells were injected. Before every injection of cells into the LV wall, the following criteria hadto be met: (1) perpendicular position of the catheter to the LV wall; (2) excellent loop stability (<4 mm);(3) underlying voltage >6.9 mV; and (4) presence of a premature ventricular contraction on extension ofthe needle into the myocardium. Fifteen injections of 0.2 cc (mean of 25.5±6.3×106 cells/patient) weredelivered (Figure 2).

[Help with image viewing][Email Jumpstart To Image]

Figure 1. The NOGA

- 75 –Anexos



Figure 2. Injection catheter advanced into the left ventricle throughthe aortic valve. The catheter tip is placed against the endocardialsurface (insert) with the needle extended into the myocardiumdelivering ABMMNCs.

Myostar injection catheter, with the needle in the extended position (insert).

Two-Month Noninvasive Follow-Up EvaluationAll patients, both treated and control, underwent noninvasive follow-up evaluations at 2 months, whichconsisted of a clinical evaluation, ramp treadmill protocol, 2D Doppler echocardiogram, anddipyridamole SPECT perfusion scan. Patients in the treatment group had repeat 24-hour Holtermonitoring. The ramp treadmill protocol was selected because it is better than standard incrementalprotocols in estimating functional capacity in these severely ill patients. 8

The predicted ·Vo2max was used to tailor the patient workload. Treadmill speed was initially 0.5 mph,and inclination was 0% to 10% with a planned duration of 10 minutes of exercise. 13,14 Theechocardiographic data were analyzed by 2 independent, blinded, experienced observers. Images werestored digitally and analyzed offline. If a discrepancy between the readings of >5% was noted, a thirdblinded observer was called and a consensus achieved. The end-systolic volume (ESV), end-diastolicvolume (EDV), and EF were measured according to standard protocols.

Dipyridamole stress and resting SPECT imaging were performed with the same stress procedure atbaseline and at follow-up. Studies were read by a blinded, experienced observer. Approximately 740MBq of technetium-99m sestamibi was injected at rest and after stress, with dipyridamole infusion at arate of 142 µg/kg of body weight per minute infused for 4 minutes. One hour later, SPECT imaging wasinitiated, using a 15% window centered over the 140-keV photopeak. Acquisitions were performed with a1-detector gamma camera (Ecam, Siemens), acquiring 32 projections over 180° (right anterior oblique45° to left posterior oblique 45°) (low-energy, high-resolution collimation; 64×64 matrixes; and 35seconds per projection). Short-axis and vertical and horizontal long-axis tomograms of the left ventriclewere extracted from the reconstructed transaxial tomograms by performing coordinate transformationwith appropriate interpolation. No attenuation or scatter correction was applied. Quantitative SPECTanalysis was performed on an ICON workstation computer (Siemens). The analysis was performed withthe use of a completely automated software package, with the exception of a quality-control check toverify the maximum count circumferential profiles. The methods for quantitative analysis have beenpreviously described. 15,16 In brief, processing parameters, including the apical and most basaltomographic short-axis slices, the central axis of the LV chamber, and a limiting radius for myocardialcount search, were automatically derived. Short-axis tomograms were then sampled by using a maximum-count circumferential profile sampling technique with a cylindrical approach for sampling the body of theleft ventricle and a spherical approach for sampling the LV apex. Comparisons were made to sex-matchednormal limits. 16 Polar map displays and quantitative values were then generated to indicate stressmyocardial perfusion defect extent and severity. 16,17

Four-Month Invasive Follow-Up Evaluation

- 76 –Anexos


Patients in the control group did not undergo NOGA mapping or repeat LV angiograms at late follow-up(because of ethics committee recommendations).

Patients in the treatment group had 4-month invasive follow-up evaluations consisting of LV angiogramsand EMM. LV angiography was performed through the femoral approach with the use of a 5F pigtailcatheter. All angiograms were obtained in 2 planes—a 30° right anterior oblique view and a 60° leftanterior oblique view—during a period of stable sinus rhythm. Ventricular volume was not measuredduring or after a premature beat. A 40-mm sphere was used as calibration device. LV EDV, ESV, and EFwere calculated by 2 blinded, experienced observers who used the area-length method. 18

EMM was performed according to established criteria 11 with a fill threshold of 15 mm. After theacquisition of points, postprocessing analysis was performed with a series of filters (moderate setting) toeliminate inner points, points that do not fit the standard stability criteria (location stability <4 mm, loopstability <6 mm, and cycle length variation <10%), points acquired during ST-segment elevation, andpoints not related to the left ventricle (eg, those in the atrium). A blinded, expert observer used a 12-segment bull’s-eye to compare electromechanical values (unipolar voltage and local linear shortening) ofinjected segments at baseline and follow-up.

Statistical AnalysesUnivariate differences in demographic characteristics (Table 1) between the control and treated groupswere assessed with [chi]2/Fisher’s exact test and t tests for discrete and continuous variables, respectively.Multivariable logistic regression was also used to determine the independent relationship between eachdemographic variable and treatment group. No statistically significant differences between the 2 groupswere found. Because each patient in both groups was used as his or her own control, changes betweenbaseline and 8 weeks in the control and treated groups were assessed with paired t tests. Logisticregression analysis was utilized to compare medications (Table 2) at baseline, 8 weeks, and 16 weekswithin the control and treatment groups and between the control and treatment groups.


TABLE 1. Demographics of the Treatment and ControlGroupsValues are mean±SD or percentage of patients.

- 77 –Anexos



TABLE 2. Percentage of Patients Receiving Selected CardiacMedications at Baseline and 8- and 16-Week Follow-Up*P forcomparison of all 3 time periods between treatment and controlgroups.

Comparisons of the changes from baseline to 8 weeks in the control and treatment groups were made withrepeated-measures ANOVA. The ANOVA model included the control versus treatment and baselineversus 8 weeks as factors and also included the interaction between the 2 factors. A probability value<0.05 was considered statistically significant.

ResultsPatient population demographics did not differ significantly between the treatment and control groups(Table 1). There were no significant differences in [beta]-blocker, ACE inhibitor, or nitrate use betweenthe 2 groups (Table 2).

Procedural DataThe total procedural time for mapping and injection was 81±19 minutes. Electromechanical mapscomprised an average of 92±16 points. Patients received an average of 15±2 cell injections in a mean of2±0.7 segments (6 inferior, 14 lateral, 2 anterior, and 5 septal). Each injection of 2 million cells wasdelivered in a volume of 0.2 cc. The cell population comprised a mean of 2.44±1.33% CD45loCD34+ cells(Table 3).


TABLE 3. Characteristics of Bone Marrow Mononuclear CellsInjected Into the Myocardium*Values are average±SD.*Results for14 patients in the treatment group, except: CD34+CD45loHLA-DR-,13 patients; CD45+CD19+, 13 patients; CD45+CD14+, 11 patients;and CD45+CD56+, 9 patients.

Safety Data

One patient in the control group died 2 weeks after enrollment in the study and was not included in theanalysis. A patient in the treatment group died at 14 weeks, presumably of sudden cardiac death. This

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patient had onset of severe angina and was found to be in asystole by emergency medical personnel. Thepatient had persistent improvement in cardiac function, as assessed by echocardiography. Baseline EFwas 30% by echocardiography and increased to 57% at 2-month follow-up, demonstrating a similarresponse as the rest of the treatment group with regard to increased contractile function. In both cases, thefamilies refused postmortem exams.

There were no major periprocedural complications. One patient had a transient episode of pulmonaryedema that was easily reversed with loop diuretics after the procedure. No sustained arrhythmias wereassociated with the injection procedures, nor did any significant arrhythmias occur while the patients werehospitalized. There were no sustained ventricular arrhythmias found on 24-hour Holter monitoring atbaseline or when repeated after the injection procedure and no significant differences in the number orpercentage of premature ventricular contractions. No postprocedural pericardial effusions were seen on2D Doppler echocardiograms. All patients were discharged on the third hospital day as per protocol.

Two-Month Noninvasive Follow-Up Evaluations

Of all baseline and follow-up laboratory values (Table 4), only serum creatinine and BNP levels variedbetween the control and treatment groups at follow-up. Follow-up serum creatinine levels weresignificantly elevated in the control group as compared with the treatment group (P =0.03). The levels ofCRP at baseline and follow-up were not significantly different between the two groups (Table 4). Therewas a trend toward increased difference of BNP levels at follow-up between the two groups, with higherlevels in the control group (P =0.06).


TABLE 4. Laboratory Values for the Treatment and the ControlGroupsCK-MB indicates myocardial muscle creatine kinaseisoenzyme; NA, not applicable.*After treatment=2 months.

Patients in the treatment group experienced less heart failure and fewer anginal symptoms at the 2-monthfollow-up when compared with the control group, by both New York Heart Association (NYHA) andCanadian Cardiovascular Society Angina Score (CCSAS) distribution (Table 5). Baseline exercise testvariables (METs and ·Vo2max) were similar for the 2 groups. There was a significant increase, however,in METs and ·Vo2max at follow-up in the treatment group (P =0.0085 and 0.01, respectively). There wasa trend toward improvement when these variables were compared with the control group (P =0.08 forboth variables).

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TABLE 5. Comparison of Baseline and 2-Month Follow-Up Valuesfor the Treatment and Control Groups*P values reflect comparisonof the differences between treatment and control groups over time(see Methods).

Baseline comparison of ESV, EDV, and LVEF between the treatment and control groups revealedsignificant differences: The control group had smaller LV volumes (P <0.001) and a trend (P =0.054)toward higher baseline EF. Cardiac function (measured by EF on echocardiograms) had an absoluteincrease of 6% over the 2-month follow-up period in the cell-treated group. In contrast, the mean EFdecreased, although not significantly, in the control group. In addition, when the 2 groups were compared,the treatment group showed a significant improvement in EF after 2 months (P =0.03). Cardiac geometry,as assessed by ESV, also improved. A significant fall in ESV (P =0.03) and a trend toward reduction inEDV (P =0.07) were noted in the treatment group. Volumes remained unchanged within the controlgroup. When the two groups were compared at follow-up, a significant reduction in ESV was seen in thetreated patients (P =0.04).

Nuclear perfusion imaging studies were similar at baseline for the amount of total reversible defect andpercent of rest defect with 50% activity (scar). Within the control group, there was no significant changein these two variables at follow-up. Within the treatment group, there was no significant change in restdefect, with 50% activity at 2-month follow-up, but there was a significant 73% reduction in totalreversible defect (P =0.022; from 15.15±14.99% to 4.53±10.61%). A typical example of resolution ofinferolateral ischemia (baseline to follow-up) in a cell-treated patient is shown in Figure 3 A.

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Figure 3. A, SPECT polar map at baseline, showing an area ofinferolateral, reversible ischemia in white and nonreversible stressdefect in black (left). Follow-up SPECT at 2 months, showingcomplete resolution of ischemic defect and basilar nonreversibledefect with a decrease in nonreversible apical defect (right). B,Electromechanical maps from the same patient viewed from theinferior position. Mechanical map at the time of the injectionprocedure (left) shows the 15 injection sites in black distributedalong the inferior wall. The follow-up mechanical map at 4 months(right) shows marked improvement in contractile function in theinjected area.

Four-Month Invasive Follow-Up Evaluations

Results from LV angiography at baseline and 4-month follow-up are shown in Table 6. There was asustained improvement in LVEF from baseline, an increase from 20% to 29% at 4 months (31% relativeincrease) (P =0.0003) in the treated patients. There was also a continued reduction in ESV (P =0.03) at 4months. EDV remained unchanged (P =0.1). Control group patients did not have repeat LV angiograms.


TABLE 6. Angiographic and EMM Results for the TreatmentGroup at 4 Months’ Follow-Up (n=13)

On EMM, segmental analysis revealed a significant mechanical improvement of the injected segments (P<0.0005) (Table 6). Significant improvement in mechanical function at the injection site is illustrated byEMM in Figure 3 B. Unipolar voltage values did not change from baseline to follow-up.

DiscussionThe present study describes for the first time ABMMNC transplantation with the use of transendocardialinjections in patients with severe LV dysfunction, end-stage ischemic heart disease, and no other optionfor treatment. The results of our study suggest that injection of ABMMNCs is safe and improvesperfusion and myocardial contractility when viable areas of myocardium are targeted.

Wound healing is a multifaceted process that involves complex interactions between inflammatory cells,cytokines, and a number of extracellular matrix proteins, and the development of new capillaries. Becausethe normal reparative mechanisms seem to be overwhelmed when clinically significant myocardial injuryoccurs, a logical next step would be to amplify one part of this response artificially by applying stem cellslocally in the setting of ischemia or infarction when a large amount of heart muscle has been injured.

In experimental animals, bone marrow–derived cells have been shown to regenerate areas of infarctedmyocardium and coronary capillaries, 1 thus limiting functional impairment after myocardial infarction.Transendocardial injection of ABMMNCs has been shown to increase myocardial contractility andperfusion in swine. 4 Various cell lineages have been used to generate evidence that bone marrow stem

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cells differentiate into cardiomyocytes, endothelium, and smooth muscle cells. 19 Bone marrowhemangioblasts add to the development of new vessels, and mesenchymal stem cells cantransdifferentiate into functional cardiomyocytes. 20 Recently, bone marrow–derived cardiomyocyteswere demonstrated in hearts of women who received gender-mismatched bone marrow transplantation. 21Moreover, bone marrow cellular components secrete a range of cytokines, fibroblast growth factor, andvascular endothelial growth factor, 22 which are involved in the natural process of angiogenesis.Endothelial progenitor cells have been implicated in neovascularization associated with postnatalvasculogenesis and are mobilized to peripheral circulation after acute ischemic events. 23

In the present study, there is preliminary evidence that in humans, bone marrow–derived mononuclearcells are capable of enhancing perfusion, as shown by significant reductions in reversible stress defects onSPECT (P =0.02). Bone marrow–derived cells were purposefully injected into areas of hibernatingmyocardium. In hibernating areas, the underlying physiological state allows for restoration of myocardialfunction if myocardial perfusion is improved. We hypothesize that angiogenesis is the mechanism thatallowed improvement in myocardial function in the patients in our study. Furthermore, we may speculatethat an orchestrated sequence of events that includes not only the presence of the transplanted cells butalso the action of cytokines and growth factors and intricate cell-to-cell interactions may all contribute toangiogenesis as an end result. Therefore, the resultant localized increase in contractility at cell injectionsites, as seen by a significant increase in mechanical function on EMM, likely occurred as a consequenceof an underlying improvement in perfusion. However, we cannot exclude the possibility that theinjections themselves stimulated new blood vessel growth and enhanced function through the induction ofangiogenic and important growth factors.

The homing process, which results in cell engraftment, may also play a key role in the success of celltherapy. After acute events, serum vascular endothelial growth factor levels rise significantly, 23 and it islikely that homing signals may be more intense in acute and subacute ischemic syndromes. In ourpatients, all of whom had chronic disease, we opted to perform transendocardial cell-therapy deliverybecause we believe that homing signaling may not be as intense and, therefore, might not be optimal forcell engraftment. It is also likely that a smaller number of cells is required to achieve the desired effect.

EMM technology has been widely confirmed to be accurate for delineating and identifying scarred andviable myocardium and for differentiating degrees of infarct transmurality. 11,12,24 EMM thus offers atheoretical benefit over surgical or intracoronary approaches because viability of the site can bedetermined before each injection. Injections would then be performed only to targeted, viable areas ofhibernating myocardium. Many treated sites targeted in this study were in areas of totally occludedepicardial vascular beds, making intracoronary delivery impossible. Furthermore, potential ischemiaprovoked by coronary manipulation is avoided. This approved procedure seemed safer for thesechronically ill, high-risk patients because it avoided associated surgical morbidity and mortality.

Tse et al 7 recently demonstrated improvement in myocardial perfusion and segmental contractility afterABMMNC transendocardial injections. Those results are somewhat similar to results of the present study,although Tse and colleagues did not see improvement in global EF. The main difference between thestudies is the significant baseline LV dysfunction present in our group (mean EF, 20%) as compared witha normal mean EF (56.9%) in the Tse study. 7 The preliminary data of Tse and colleagues also suggestthe relative safety of the procedure.

The use of transendocardial delivery proved to be safe in our study, as cellular therapy was successfullydelivered in every case without any major periprocedural events (eg, death, myocardial infarction,ventricular arrhythmias, cardiac perforation, pericardial effusion, or development of intramyocardialtumor). Troponin levels increased by a small but significant amount, consistent with delivery viaintramuscular injection (Table 4), but the absolute rise was relatively small biologically. The stabilitybetween levels of CRP in the treatment and control groups suggests that we did not initiate a significantinflammatory reaction with cell injection.

The major limitations of this study are the small number of patients enrolled and the study design, whichlimits conclusions about efficacy. Because of ethics committee concerns, the control group was notenrolled concurrently with treated patients, did not receive a placebo injection, and did not undergoinvasive follow-up. However, treatment and control groups had similar follow-up up to 2 months. Thebenefits seen in this study with cell therapy could be attributable to the placebo effect seen in phase 1trials. Potential biases include selection bias (eg, tertiary hospital population) and investigator bias when

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assessing symptoms at follow-up (CCSAS and NYHA class) although echocardiographic, angiographic,and SPECT studies were read blindly. In addition, smaller LV volumes and a trend toward higher EFswere present in the control group. However, both groups were matched in terms of demographics,medication use, baseline laboratory values, functional status classification, treadmill workload, and·Vo2max. More importantly, similar baseline reversible and fixed ischemic defects were present in bothgroups, as one of the most important end points assessed in this study was the amount of reversibleperfusion defect at follow-up. The end point of contractility is more difficult to evaluate in light of thedifferences between the groups at baseline; however, changes in opposite directions occurred at follow-up. In addition, the slightly better LVEFs and smaller hearts should logically have biased results againstthe cell-treated group.

Although the mechanisms by which cell therapy confers clinical benefit are not well understood,correlation between cell phenotype subpopulation analysis and long-term clinical outcomes is beyond thescope of the present study. Future analyses will be performed in this regard when longer-term follow-upis available.

The treatment of patients with heart failure has become increasingly important given the growing numberof cases and their economic impact on the healthcare system. 25,26 More aggressive and widespreadtherapy in patients with chronic, ischemic heart failure will ultimately lead to a population harboringmore advanced disease with a potential yearly mortality rate as high as 50%. 27 For these patients,therapeutic options remain limited. The very high-risk nature of the patient population represented in ourstudy cohort is underscored by the fact that there was a death in both the control and the treatment groups.However, the significant improvement in LVEF noted in the treatment group on angiographic follow-upat 4 months (from 20% to 29%) may imply an improved clinical state and, it is hoped, provide somereduction in risks for the future. 28

ConclusionIn this initial prospective, nonrandomized, open-label study in no-other-option coronary artery diseasepatients with LV dysfunction, we noted improvement in symptoms, cardiac function, and perfusion withtransendocardial ABMMNC therapy, without any clinical evidence of significant harm from theprocedure itself. We believe there may be clinical potential for this relatively novel therapy. Furtherinvestigation in a larger, randomized trial is warranted.

AcknowledgmentsA NOGA mapping system and catheters were provided by Cordis Corporation (Miami Lakes, Fla).

We thank Rita Weiler, Ana Cristina Reis, RN, and Patricia Souza, RN, for their enthusiastic support andcoordination of the study patients; Cristine Rutherford for the psychological assessment and support ofthe patients; David R. Buskohl, Mark Martin, and Jacqueline Grant for their outstanding technicalsupport; and Marianne Mallia, ELS, for editorial assistance in the preparation of the manuscript.

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Key Words: cells; heart failure; ischemia; revascularization; gene therapy

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ANEXO III

Trabalho publicado na Revista Circulation Setembro 2004

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Circulation. 2004 Sep 14;110(11 Suppl 1):II213-8.

Improved exercise capacity and ischemia 6 and 12 months aftertransendocardial injection of autologous bone marrowmononuclear cells for ischemic cardiomyopathy.

Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, Silva GV, Mesquita CT, BelemL, Vaughn WK, Rangel FO, Assad JA, Carvalho AC, Branco RV, Rossi MI, Dohmann HJ,Willerson JT.

Texas Heart Institute at St. Luke's Episcopal Hospital, .), Houston, Tex, [email protected]

BACKGROUND: We recently reported the safety and feasibility of autologous bone marrowmononuclear cell (ABMMNC) injection into areas of ischemic myocardium in patients with end-stage ischemic cardiomyopathy. The present study evaluated the safety and efficacy of thistherapy at 6- and 12-month follow-up. METHODS AND RESULTS: Twenty patients with 6-and 12-month follow-up (11 treated subjects; 9 controls) were enrolled in this prospective,nonrandomized, open-label study. Complete clinical and laboratory evaluations as well asexercise stress (ramp treadmill), 2-dimensional Doppler echocardiography, single-photonemission computed tomography (SPECT) perfusion scanning, and 24-hour Holter monitoringwere performed at baseline and follow-up. Transendocardial delivery of ABMMNCs wasperformed with the aid of electromechanical mapping to identify viable myocardium. Eachpatient received 15 ABMMNC injections of 0.2 mL each. At 6 and 12 months, total reversibledefect, as measured by SPECT perfusion scanning, was significantly reduced in the treatmentgroup as compared with the control group. At 12 months, exercise capacity was significantlyimproved in the treatment group. This improvement correlated well with monocyte, B-cell,hematopoietic progenitor cell, and early hemapoietic progenitor cell phenotypes.CONCLUSIONS: The 6- and 12-month follow-up data in this study suggest thattransendocardial injection of ABMMNCs in patients with end-stage ischemic heart disease mayproduce a durable therapeutic effect and improve myocardial perfusion and exercise capacity.

Publication Types:

• Clinical Trial

• Controlled Clinical Trial


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Improved Exercise Capacity and Ischemia 6 and 12 Months AfterTransendocardial Injection of Autologous Bone Marrow Mononuclear

Cells for Ischemic Cardiomyopathy[Cell Transplantation and Tissue Engineering]

Perin, Emerson C. MD, PhD*; Dohmann, Hans F.R. MD*; Borojevic, Radovan PhD; Silva, Suzana A.MD; Sousa, Andre L.S. MD; Silva, Guilherme V. MD; Mesquita, Claudio T. MD, PhD; Belém, Luciano

MD; Vaughn, William K. PhD; Rangel, Fernando O.D. MD; Assad, Joao A.R. MD; Carvalho, Antonio C.MD, PhD; Branco, Rodrigo V.C. MD; Rossi, Maria I.D. PhD; Dohmann, Hans J.F. MD, PhD; Willerson,

James T. MD

From the Texas Heart Institute at St. Luke’s Episcopal Hospital (E.C.P., G.V.S., W.K.V., R.V.C.B.,J.T.W.), Houston, Tex; Hospital Procardiaco (H.F.R.D., S.A.S., A.L.S.S., C.T.M., L.B., F.O.D.R.,J.A.R.A., H.J.F.D.), Rio de Janeiro, Brazil; Federal University (R.B., A.C.C., M.I.D.R.), Rio de Janeiro,Brazil.Correspondence to Emerson C. Perin, MD, PhD, 6624 Fannin, Suite 2220, Houston, TX 77030 ([email protected]), or Hans F.R. Dohmann, MD, Rua General Polidoro, 192, CEP 22080-000Botafogo, Rio de Janeiro, Brazil (E-mail [email protected]).*Drs Perin and Dohmann are co-principal investigators.

Introduction

Coronary artery disease (CAD) remains a major cause of morbidity and mortality in the Western world.1The irreversible loss of cardiomyocytes after myocardial infarction leads to left ventricular (LV)remodeling and in the end to ischemic heart failure.2 In many patients, the progression of CAD leads tosuccessive rounds of revascularization therapies that commonly result in an end-stage coronary anatomyunsuited for further revascularization and associated with LV dysfunction. In recent years, stem celltransplantation has emerged as a potential modality for the treatment of cardiovascular diseases on thebasis of its possible ability to induce neovascularization and tissue replacement.3–5 Many advances inunderstanding stem cell biology have occurred, and there is increasing evidence that cell transplantationmay improve the perfusion and contractile function of the ischemic myocardium.6–12 Accordingly, stemcell transplantation could be an alternative therapy for CAD patients who have no other standard optionsfor treatment.

We have recently reported initial safety and feasibility data for autologous bone marrow mononuclear cell(ABMMNC) injection into areas of ischemic myocardium in patients with end-stage ischemic heartfailure.13 Short-term follow-up showed improvement in perfusion as assessed by single-photon emissioncomputed tomography (SPECT) and regional contractility.

Despite the accumulating evidence pointing toward a therapeutic benefit of ABMMNC therapy, manyquestions remain unanswered: what is the ideal stem cell for therapy, the ideal mechanism of action (ie,secretion of growth factors and cytokines, cell-to-cell interactions), the lifespan of stem cells within themyocardium, and the duration of the therapeutic effect. Moreover, there remains concern about thepotential toxicity of such therapy, eg, the possibility of creating a chronic pro-arrhythmic state, pro-inflammatory state, or both. To help answer these questions, we report here on the safety and efficacy ofABMMNC injection at 6 and 12 months of follow-up.

MethodsPatient PopulationThis is a prospective, nonrandomized, open-label study of 23 patients with severe ischemic heart failureand no other option for standard revascularization therapies. Patients were enrolled sequentially, with thefirst 14 patients being assigned to the treatment group and the last 9 patients assigned to the control group.In accordance with the ethics committee’s recommendations, an initial group of 4 patients was enrolled ina safety study. After 4 months of follow-up of the initially injected patients (once safety had beendetermined), the remaining study patients were enrolled. All patients were placed on maximally toleratedmedical therapy at time of enrollment. The following inclusion criteria were required for patientenrollment: (1) chronic CAD with reversible perfusion defect detectable by SPECT; (2) LV ejection

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fraction (EF) <40%; (3) ineligibility for percutaneous or surgical revascularization, as assessed bycoronary arteriography; and (4) signed, informed consent. Ineligibility for surgical or percutaneousrevascularization procedures was determined by 2 expert committees: a surgical committee comprising 2cardiovascular surgeons and 1 noninvasive cardiologist, and an interventional committee comprising 2interventional cardiologists and 1 noninvasive cardiologist. Patients were not enrolled in the study if anyone of the following exclusion criteria were met: (1) difficulty in obtaining vascular access forpercutaneous procedures; (2) previous or current history of neoplasia or other comorbidity that couldimpact the patient’s short-term survival; (3) significant ventricular dysrhythmias (sustained ventriculartachycardia); (4) LV aneurysm; (5) unexplained baseline laboratory abnormalities; (6) bone tissue withabnormal radiological aspect; (7) primary hematologic disease; (8) acute myocardial infarction within 3months of enrollment in the study; (9) presence of intraventricular thrombus as shown by 2-dimensional(2D) Doppler echocardiography; (10) hemodynamic instability at the time of the procedure; (11) atrialfibrillation; and (12) any condition that, in the judgment of the investigator, would place the patient atundue risk.

The ethics committee of Procardiaco Hospital (Rio de Janeiro) and the Brazilian National Research EthicsCouncil approved the study protocol.

Baseline EvaluationBaseline evaluation in both groups included pertinent laboratory evaluations (complete blood count, C-reactive protein [CRP], brain natriuretic peptide [BNP], and serum creatinine levels), functional status(New York Heart Association and Canadian Cardiovascular Society Angina Score class), exercise testing(ramp treadmill protocol),14 dipyridamole SPECT perfusion scanning, and 2D echocardiography aspreviously described.13 Twenty-four-hour Holter monitoring and signal-averaged electrocardiography(SAECG) were also performed at baseline.

Bone Marrow Aspiration and Isolation of Mononuclear CellsApproximately 4 hours before the cell injection procedure, bone marrow (50 mL) was aspirated underlocal anesthesia from the posterior iliac crest. ABMMNCs were isolated by density gradient in Ficoll-Paque Plus (Amersham Biosciences). Mononuclear cells were exhaustively washed with heparinizedsaline containing 5% human serum albumin and filtered through 100-µm nylon mesh to remove cellaggregates. The cells were finally resuspended in saline with 5% human serum albumin for injection.

A small fraction of the cell suspension was used for cell counting and viability testing by trypan blueexclusion. Cell viability was shown to be >90% (96.2±4.9%), assuring the quality of the cell suspension.Post-hoc characterization of leukocyte differentiation markers by flow cytometry and functional assayswere performed on another fraction of cells. The clonogenic capacity of hematopoietic progenitors wasevaluated by colony-forming assays (granulocyte-macrophage colony-forming unit) as previouslydescribed.15

A high correlation between granulocyte-macrophage colony-forming units and CD45loCD34+ cells wasseen (Spearman r=0.77, P=0.0012). Fibroblast colony-forming unit assays were performed as previouslydescribed 16 to determine the presence of putative progenitor mesenchymal lineages. Cultures of theclinically used cell preparations were grown and proved negative for bacterial and fungal contamination.

Antibodies and Staining Procedure for Fluorescence-Activated Cell SorterAnalysisThe following antibodies were either biotinylated or conjugated with FITC (Pharmingen), phycoerythrin,or PerCP: anti-CD45 as a pan-leukocyte marker (clone HI30), anti-CD34 as a hematopoietic progenitormarker (clone HPCA-II), anti-CD3 as a pan–T-cell marker (clone SK7), anti-CD4 as a T-cellsubpopulation marker (clone SK3), and anti-CD8 as a T-cell subpopulation marker (clone SK1), fromBecton Dickinson; anti-CD14 as a monocyte marker (clone TUK4), anti-CD19 as a pan–B-cell marker(clone SJ25-C1), and anti-CD56 as an NK-cell marker (clone NKI nbl-1), from Caltag Laboratories(Burlingame, Calif); and anti-HLA-DR (MHC-II, clone B8.12.2) from Beckman-Coulter. Thebiotinylated antibodies were revealed with streptavidin PECy7 (Caltag Laboratories). Three-colorimmunofluorescence analysis was used for the identification of leukocyte populations in total nucleatedbone marrow cell suspensions. After staining, erythrocytes were lysed using the Becton Dickinson lysisbuffer solution according to the manufacturer’s instructions, and CD45 antibody was used to assess the

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percentages of leukocytes in each sample. Data acquisition and analyses were performed on a Caliburfluorescence-activated cell sorter equipped with CellQuest 3.1 software (Becton Dickinson).

Transendocardial Delivery of Autologous Bone Marrow Mononuclear CellsIn the cell-injection treatment group, patients were taken to the cardiac catheterization laboratory [almostequal to]1 hour before the anticipated arrival of the bone marrow cells from the laboratory. Left heartcatheterization with biplane left ventricular angiography was performed. Subsequently, electromechanicalmapping (EMM) of the left ventricle was performed as previously described.17 The general region fortreatment was selected by matching the area identified previously by SPECT perfusion imaging asischemic. The electromechanical map was then used to target the specific treatment area by identifyingviable myocardium (unipolar voltage >=6.9 mV) within that region. Areas associated with decreasedmechanical activity (local linear shortening <12%, indicating hibernating myocardium) were preferred.

The NOGA injection catheter was prepared by adjusting the needle extension at 0° and 90° flex and byplacing 0.1 mL of ABMMNCs to fill the needle dead space. The injection catheter tip was placed acrossthe aortic valve and into the target area, and each injection site was carefully evaluated before the cellswere injected. Before every injection of cells into the LV wall, the following safety criteria had to be metto assure intramyocardial delivery: (1) perpendicular position of the catheter in relation to the LV wall;(2) excellent loop stability (<4 mm); (3) maximal needle extension of 6 mm; and (4) presence of apremature ventricular contraction (PVC) on extension of the needle into the myocardium.

Correlation of Bone Marrow Mononuclear Cell Subpopulation and Improvementin Reversible Perfusion DefectsFor every treated patient, the size of the myocardial area injected (mm2), the absolute cell numberinjected, and the concentration of each specific cell phenotype (103 cells/mm2) were calculated andsubsequently correlated with the reduction in total reversible defect as determined by quantitative SPECT(at baseline versus at 6 months) using exact Pearson moment correlation.

Two-Month, 6-Month, and 12-Month Follow-up EvaluationsAll patients, both treated and control, underwent noninvasive follow-up evaluations at 2 and 6 months,which consisted of a repeat baseline laboratory evaluation, clinical evaluation, dipyridamole SPECTperfusion scanning, ramp treadmill protocol, 2D echocardiography, repeat 24-hour Holter monitoring, andSAECG. The same noninvasive follow-up evaluation protocol (except for Holter monitoring andSAECG) was performed at 12 months. Dipyridamole SPECT imaging studies were performed using thesame stress procedure at baseline and at follow-up, as previously described.13 Studies were read by ablinded, experienced observer. The predicted Vo2max was used to tailor the patient workload. Treadmillspeed was initially 0.5 mph, and inclination was 0% to 10% with a planned exercise duration of 10minutes.18

Statistical AnalysisThe values of the continuous variables were presented as means and standard deviations; the values of thecategorical variables were presented as percentages. Comparisons between the treated and control groupsand comparisons between the 4 time points (baseline versus 2 months versus 6 months versus 12 months)were made using repeated-measures ANOVA. P<=0.05 was considered statistically significant.

ResultsOne patient was lost to follow-up and did not undergo 6-month and 12-month evaluations. Patientdemographics did not differ significantly between the treatment and control groups (Table 1). Neither did[beta]-blocker, angiotensin-converting enzyme inhibitor, or nitrate use (Table 2).

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TABLE 1. Demographics of the Treatment and Control Groups


TABLE 2. Percentage of Patients Receiving Selected CardiacMedications at Baseline, 2 Months, 6 Months, and 12 Months

Procedural Data

The mean total procedural time for mapping and injection was 81±19 minutes. Electromechanical mapscomprised an average of 89±9 points. Each injection of 2 million cells was delivered in a volume of 0.2mL.

Safety DataThere were no major periprocedural complications. One patient had a transient episode of pulmonaryedema that was easily reversed with loop diuretics after the procedure. No sustained arrhythmias wereassociated with the injection procedures, nor did any significant arrhythmias occur while the patients werehospitalized. All patients were discharged on the third hospital day as per protocol. As previouslyreported, 1 patient in the treatment group died at 14 weeks, presumably of sudden cardiac death. A secondpatient died at 11 months, presumably of a neurological cause.

Laboratory DataWhite blood cell count (WBC), CRP, BNP, and serum creatinine levels at baseline, 2 months, 6 months,and 12 months are shown in Table 3. Of all baseline and follow-up laboratory values, only serum

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creatinine levels varied between the control and treatment groups at follow-up. Follow-up serumcreatinine levels were significantly elevated in the control group as compared with the treatment group(P=0.04). The levels of CRP and WBC at baseline and follow-up were not significantly different betweenthe 2 groups. There was a trend toward lower BNP levels in the treatment group at 12-month follow-up(P=0.08).


TABLE 3. Laboratory Values for the Treatment and ControlGroups at Baseline, 2 Months, 6 Months, and 12 Months

Two-Month, 6-Month, and 12-Month Follow-up Evaluations

At the 2-month follow-up, there was a significant improvement in symptoms (New York HeartAssociation and Canadian Cardiovascular Society Angina Score) in the treatment group as compared withthe control group (Table 4). This improvement was maintained at 6 and 12 months in the treatment groupas compared with the control group (Table 4).


TABLE 4. Comparison of Clinical Values for the Treatmentand Control Groups at Baseline, 2 Months, 6 Months, and 12Months

Nuclear perfusion imaging studies in the treated and control groups were similar at baseline for theamount of total reversible defect and percent of rest defect with 50% activity (scar). At the 2-monthfollow-up, there was a significant reduction in myocardial ischemia in the treatment group as comparedwith the control group (Table 4). This improvement was maintained at 6 and 12 months (P=0.01), despiteworsening of myocardial ischemia in the treatment group (Table 4).

Exercise capacity as assessed by metabolic equivalents and Vo2max was similar between the 2 groups atbaseline. At the 2-month follow-up, there was a significant increase in exercise capacity, as measured interms of metabolic equivalents and Vo2, in the treatment group as compared with the control group (Table4). This significant improvement was maintained at 6 and 12 months, as exercise capacity improvedslightly in the treatment group. There was no statistically significant difference between the 2 groups interms of LVEF on the 2D echocardiogram over time (Table 4).

There were no sustained ventricular arrhythmias found by 24-hour Holter monitoring at baseline andfollow-up and no significant differences in the number of PVCs at the 2- and 6-month follow-ups (Table4). Nor were there significant differences in SAECG parameters at either follow-up (Table 4).

Correlation Between Bone Marrow Mononuclear Cell Subpopulations andImprovement in Reversible Perfusion DefectsMonocyte, B-cell, hematopoietic progenitor cell, and early hematopoietic progenitor cell subpopulationscorrelated with improvement in reversible perfusion defects at 6 months (Table 5). There was also a trendtoward correlation between the fibroblast colony-forming unit subpopulation (progenitor mesenchymalcell phenotype) and improvement in reversible perfusion defects at 6 months (Table 5).

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TABLE 5. Correlation of Bone Marrow Mononuclear CellSubpopulations and Reduction in Total Reversible PerfusionDefects

Discussion

The results of our study suggest that injection of ABMMNCs is safe and improves perfusion and exercisecapacity when viable ischemic areas of myocardium are targeted.

Preliminary evidence suggests that bone marrow progenitor cells may be involved in the process ofpostnatal physiological organ vascularization.19 Other evidence suggests that bone marrow-derivedprogenitor cells may be recruited to participate in the natural healing process that occurs after tissueinjury and vascular trauma.20 Many preclinical studies have shown that the insertion of bone marrowmononuclear cells into ischemic myocardium can help re-establish tissue vascularization.3,4,6,7Furthermore, pioneering clinical studies have preliminarily confirmed the therapeutic benefit of bonemarrow mononuclear cell therapy after acute myocardial infarction or in the setting of chronic myocardialischemia.8–13

Previous studies have shown that bone marrow cells can differentiate into cardiomyocytes and endothelialcells in vitro and in vivo.8,21 In theory, ABMMNCs could contribute to neoangiogenesis or myocardialtissue replacement (or both) and as a consequence improve myocardial perfusion or LV remodeling.Improvement in tissue vascularization may also result from the ability of bone marrow cells to secreteangiogenic factors. Additionally, bone marrow cell injections per se could elicit an inflammatory responsethat activates an angiogenic process. Although the mechanisms leading to a possible benefit areincompletely understood, the sustained improvement in perfusion that we have observed in the presentstudy is intriguing.

The bone marrow mononuclear cell subset, which is quite heterogeneous, comprises mesenchymal stemcells, hematopoietic progenitor cells, endothelial progenitor cells, and more committed cell lineages suchas natural killer lymphocytes, T lymphocytes, and B lymphocytes. There is much controversy regardingwhich stem cell subtype might be responsible for the therapeutic benefit of bone marrow mononuclearcell transplantation into ischemic myocardium.22 In the present study, several different subpopulations ofABMMNCs correlated with improvement in myocardial perfusion. The statistical correlation wasexcellent for monocytes (r=0.8), good for B cells (r=0.7), and moderate for both hematopoietic progenitorcells and early hematopoietic progenitor cells (r=0.6). It seems, therefore, that various bone marrow cellsubpopulations may contribute to improved perfusion. More specifically, the present study results suggestthat the bone marrow monocyte subpopulation might have an important role to play in the angiogenicprocess. This would be in agreement with preliminary evidence that endothelial progenitor cells arederived from the monocyte/macrophage subpopulation and that their angiogenic effects most likely resultfrom growth factor secretion.23 Meanwhile, the contributions of cytokines and growth factors secreted bymonocytes and hematopoietic progenitor cells, the intricacies of cell-to-cell interactions, and the fate oftransplanted cells remain to be defined.

The homing of transplanted cells to the target ischemic area and their engraftment there are thought to beprerequisites for the therapeutic success of stem cell transplantation.22 The transendocardial route ofdelivery was chosen to maximize engraftment. EMM technology has been widely confirmed to be

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accurate for delineating and identifying scarred and viable myocardium and for differentiating degrees ofinfarct transmurality.17 EMM thus offers a theoretical benefit over surgical or intracoronary approachesbecause viability of the target site can be determined before each injection. Many treated sites targeted inthis study were in areas of totally occluded epicardial vascular beds, making intracoronary deliveryimpossible. Furthermore, the potential for provoking ischemia by coronary manipulation was avoided.

The study population and the prospective assessment of exercise capacity in this study are unique. Allpatients had previously had myocardial infarction, had no other revascularization treatment options, andhad compromised LV function (mean LVEF [treatment group], 30%). Whereas most of the studiesdescribed in the literature concern patients with preserved LVEF,9,11,12 our study concerns a high-risksubgroup within the population of patients with CAD. Thus, our findings might be of potentialsignificance.

The transendocardial injection of ABMMNCs significantly improved exercise capacity, heart failure, andangina symptoms at the 2-month follow-up. Symptomatic improvement was significant and the increasein exercise capacity was sustained at 6 and 12 months, with the treatment group steadily improving andthe control group remaining stable over time. In addition to the improved exercise capacity, the treatmentgroup also showed a trend toward a lower mean BNP level at 12 months when compared with the controlgroup (740 versus 507 pg/mL, respectively). BNP levels have been shown to be an important prognosticmarker in heart failure patients.24 Heart failure patients with a Vo2max of <14 mL/kg per minute alsohave a higher long-term mortality.18,25 Thus, the increase in Vo2max (from 17.3 mL/kg per minute to25.1 mL/kg per minute) and the trend toward improvement in BNP levels that were observed in thetreated group at 12 months will be important if confirmed by larger studies.

The short-term safety of transendocardial injection of ABMMNCs 13 or filtered ABMCs 26 into ischemicmyocardium has been demonstrated. However, the question of whether cell transplantation increases thepotential for malignant arrhythmias has also been raised.5 ABMMNCs appear to offer the advantage ofelectrical stability because data from the present study showed no malignant arrhythmias on any 24-hourHolter monitoring studies, no change in the number of PVCs after ABMMNC injection, and no change inSAECG parameters. Neither serum CRP levels nor WBC counts were elevated at 6 and 12 months aftertransendocardial injection of ABMMNCs, suggesting that the injected cells did not elicit any importantinflammatory response despite their potential for producing growth factors, cytokines, and otherproinflammatory substances.

The major limitations of this study are the small number of patients enrolled and the study design, whichlimits any conclusions about efficacy. Because of ethics committee concerns, patients in the control groupwere not enrolled concurrently with treated patients and did not receive a placebo injection. However,treatment and control groups have had similar follow-up schedules up to 12 months. The benefits of celltherapy seen in this study could be attributable to the placebo effect seen in phase I trials. Potential biasesinclude selection bias (eg, tertiary hospital population) and investigator bias, although SPECT, Holtermonitoring, and treadmill studies were read blindly and both groups were matched in terms ofdemographics, baseline laboratory values, treadmill workload, and Vo2max. Similar reversible and fixedischemic defects were present in both groups at baseline. In addition, the present study population wasrelatively young when compared with heart failure patients normally seen in clinical practice. This mightlimit the implications of the present study results because it is now known that the function of progenitorcells is age-dependent.27

ConclusionIn this initial prospective, nonrandomized, open-label study in patients with CAD, LV dysfunction, andno other revascularization treatment options, sustained improvement in exercise capacity and myocardialperfusion was noted 6 months and 12 months after transendocardial ABMMNC therapy, without anyclinical evidence of significant harm from the procedure itself. Further investigation in larger, randomizedtrials is warranted.

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Key Words: cells; heart failure; ischemia; revascularization; gene therapy

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ANEXO IV

Trabalho publicado na Revista Arquivos Brasileiros de Cardiologia Maio 2005

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Arq Bras Cardiol. 2005 May;84(5):360-6. Epub 2005 May 24.

[Sustained improvement in symptoms and exercise capacity up tosix months after autologous transendocardial transplantation ofbone marrow mononuclear cells in patients with severe ischemicheart disease]

[Article in Portuguese]

Dohmann HF, Perin EC, Borojevic R, Silva SA, Souza AL, Silva GV, Assad JA, Rossi MI,Mesquita CT, Dohmann HJ.

Hospital Pro-Cardiatico, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, [email protected]

OBJECTIVE: This study aimed at assessing the effects of autologous transendocardialtransplantation of bone marrow mononuclear cells (ATTBMMC) on symptoms, exercisecapacity, myocardial perfusion and contractility in patients with severe ischemic heart diseaseduring a 6-month follow-up period. METHODS: This prospective study comprised 21 patientsas follows: the first 14 patients forming the treated group, and the last 7 patients forming thecontrol group. Initially, all patients underwent clinical and laboratory assessment, treadmilltesting, echocardiography, myocardial scintigraphy, and 24-hour Holter. The bone marrowmononuclear cells (BMMC) were isolated, washed, and diluted in 0.9% saline solution fortransendocardial injection in areas of viable myocardium in the treated group, (15 0.2-mLinjections). All patients were reassessed in the end of 2 and 6 months of follow-up. RESULTS:The demographic data and other characteristics did not significantly differ between the groups inthe initial evaluation. No major adverse events related to the ATTBMMC were observed. In theend of 6 months, a reduction in the ischemic area was observed on nuclear perfusion imaging(P=0.05), as was a significant improvement in symptoms, functional capacity, and leftventricular overall function. CONCLUSION: This study showed that transendocardial injectionsof BMMC are safe in human beings with ischemic heart disease associated with severeventricular dysfunction. The effects observed in the short run were maintained up to the sixthmonth of follow-up.

Publication Types:

• Clinical Trial


Artigo Original

Melhora Sintomática e da Capacidade de Exercício Após o TransplanteAutólogo, Transendocárdico, de Células Mononucleares da Medula Óssea emPacientes com Cardiopatia Isquêmica Grave, Sustentada até o Sexto Mês deEvolução

Sustained Improvement in Symptoms and Exercise Capacity up to Six MonthsAfter AutologousTransendocardial Transplantation of Bone Marrow Mononuclear Cells in Patients With SevereIschemic Heart Disease

Hans Fernando R. Dohmann, Emerson C. Perin, Radovan Borojevic, Suzana A. Silva, Andre L.S. Souza, Guilherme V. Silva, João A. R. Assad, Maria I. D. Rossi, Claudio T. Mesquita, Hans J.Dohmann

Rio de Janeiro, RJ – Houston, TX - USAHospital Pró-Cardíaco, Universidade Federal do Rio de Janeiro,Texas Heart Institute, CAPES do BrasilCorrespondência: Hans Fernando R. Dohmann. Av. N. Sra. de Copacabana, 2/602 - 22010-120 - Rio de Janeiro,RJE-mail: [email protected]/[email protected] em 28/06/2004 - Aceito em 11/02/2005

Palavras-chave: células • insuficiência cardíaca • isquemia • revascularização • terapia gênica

Key words: cells • heart failure • ischemia • revascularization • gene therapy

Introdução

Em função do aprimoramento das diversas técnicas de revascularização miocárdica, percutâneas ou cirúrgicas,permitir resultados cada vez mais efetivos quanto à redução da morbidade e mortalidade de coronariopatasagudos e crônicos, o número de pacientes com cardiomiopatia isquêmica cresce progressivamente e éresponsável por mais da metade de todas as internações por insuficiência cardíaca, gerando no Brasil, segundodados do DATASUS, mais de 400.000 internações/ano.1

A taxa de mortalidade entre os pacientes com cardiomiopatia isquêmica é elevada e torna-se ainda maior nosubgrupo de pacientes com insuficiência cardíaca, superando a taxa de 30% ao ano.2 Devido à elevadamorbidade e mortalidade, estes casos consomem uma grande quantidade dos recursos do sistema de saúde.

Entender as características clínicas desta população é fundamental para que possamos identificar e desenvolvernovas técnicas capazes de suprir as necessidades desta parcela de pacientes.

Várias estratégias terapêuticas vêm sendo testadas para o tratamento tanto dos secundários à disfunçãoventricular quanto daqueles secundários ao déficit perfusional, crônico e refratário às técnicas disponíveis derevascularização miocárdica. Estas estratégias incluem o uso intermitente ou em longo prazo de uroquinase;3-5

neuroestimulação;6 revascularização transmiocárdica por laser, radiofreqüência ou mecânica;7-12 eneoangiogênese através do implante de fatores de crescimento endoteliais.13-20 Nenhuma destas técnicas, noentanto, a despeito de alguns anos de desenvolvimento, demonstrou efetividade, no sentido de alterar o mauprognóstico destes pacientes, de forma a justificar seu emprego clínico rotineiro.7-12

Mais recentemente, alternativas relacionadas à terapia celular começaram a ser desenvolvidas. Vários estudosrecentes vêm sugerindo que células originadas na medula óssea também participam intensamente da regeneraçãode várias estruturas do sistema cardiovascular.

O implante de células para o tratamento de doenças cardiovasculares encontra-se sob investigação em várioscentros no mundo. Várias linhagens celulares têm sido investigadas em modelos experimentais21-26 e asprimeiras séries de casos em humanos já foram descritas.27-31

Duas fontes de células foram utilizadas em humanos até o momento: a musculatura esquelética (origem dosmioblastos)29 e a medula óssea (fonte de células tronco nos adultos).31,32

É consistente na literatura internacional, a utilização de células originadas da MO em experimentos deneovascularização utilizando a via intracoronariana, a transendocárdica e a transepicárdica. Em modelosexperimentais de isquemia miocárdica aguda e crônica,22,33-43 o implante de (CMMO) células mononucleares demedula óssea foi capaz de melhorar a contração e a perfusão miocárdica.22,41,42,44,45 Tais resultados foramreproduzidos em estudo clínicos recentes, de fase 1, em humanos.30,31,46-49, incluindo nossa publicação anteriorquando avaliamos a segurança deste procedimento.50

Este estudo tem por objetivo avaliar a evolução clínica até seis meses após o TACMMO, sob a hipótese de queeste tratamento é capaz de promover neovascularização e, conseqüentemente, resultar em melhora sintomática eda capacidade de exercício em pacientes com cardiopatia isquêmica grave, sem indicação para outras alternativasde revascularização.48

Métodos

Estudo prospectivo, não randomizado, de 21 pacientes com cardiopatia isquêmica grave e sem outra opção deterapia de revascularização miocárdica, percutânea ou cirúrgica. A metodologia detalhada deste estudo foipublicada recentemente.50

Os critérios de inclusão foram: (1) doença arterial coronariana crônica com defeito de perfusão reversíveldetectado pela cintilografia miocárdica (SPECT); (2) fração de ejeção (FE) do ventrículo esquerdo (VE) < 40%;(3) inelegibilidade para revascularização miocárdica percutânea ou cirúrgica, avaliada pela coronariografia; (4)termo de consentimento livre e esclarecido assinado. A inelegibilidade para procedimentos de revascularizaçãomiocárdica cirúrgica ou percutânea foi determinada por 2 comitês: um comitê cirúrgico composto por 2cirurgiões cardiovasculares e um cardiologista clínico, e um comitê intervencionista formado por 2cardiologistas intervencionistas e um cardiologista clínico. Os critérios de exclusão foram: (1) dificuldade emobter acesso vascular para procedimentos percutâneos; (2) história de neoplasia ou outra co-morbidade prévia ouconcomitante que pudesse ter impacto na sobrevida em curto prazo deste paciente; (3) arritmias ventricularesmalignas; (4) aneurisma do VE; (5) anormalidades laboratoriais inexplicadas; (6) tecido ósseo com aspectoradiológico anormal; (7) doença hematológica primária; (8) infarto agudo do miocárdio nos 3 meses prévios ainclusão no protocolo; (9) presença de trombo intraventricular; (10) instabilidade hemodinâmica no momento doprocedimento; (11) fibrilação atrial; ou (12) qualquer condição que, no julgamento do investigador, pudessecolocar o paciente em risco.

Os sintomas de angina e insuficiência cardíaca seguiram a Classificação da Sociedade Canadense de Cardiologia(CSCC) e da Associação do Coração de Nova Iorque (NYHA, do inglês “New York Heart Association”),respectivamente.

As seguintes avaliações foram realizadas: Teste ergométrico (protocolo de rampa), com utilização do pico deVO2 para avaliação do consumo máximo de oxigênio; ecocardiograma uni e bidimensional com Doppler,utilizando a técnica de Simpson; cintilografia miocárdica com estresse farmacológico com dipiridamol, dosagemde peptídeo natriurético cerebral (BNP, do inglês “Brain Natriuretic Peptide”), eletrocardiograma e avaliaçãoclínica.

Os pacientes do grupo tratado foram submetidos à avaliação invasiva através de coronariografia, ventriculografiaesquerda e mapeamento eletromecânico imediatamente antes do procedimento de injeção e 4 meses após. Osistema NOGA (Cordis) foi utilizado para o mapeamento eletromecânico com o objetivo de identificar a áreade miocárdio viável (voltagem unipolar > 6.9 mV) e guiar a injeção da solução de células mononucleares.

Os pacientes do grupo controle foram submetidos somente aos exames não invasivos descritos neste protocolo.Ambos os grupos tratado e controle foram submetidos à reavaliação no seguimento de 2 e 6 meses, utilizando osmesmos procedimentos realizados na avaliação inicial. Cabe ressaltar que todos os pacientes estavam com otratamento clínico pleno, na dose máxima tolerada, no momento da inclusão no protocolo, sendo que 50% dospacientes do grupo controle e 70% dos pacientes do grupo tratado estavam em tratamento com betabloqueadorno início do protocolo (p=NS) (Tabela II).

Aspiração, isolamento das células mononucleares da medula óssea

Cerca de 4 horas antes da injeção transendocárdica de células mononucleares, 50ml de aspirado da medula ósseaforam obtidos da crista ilíaca posterior dos pacientes alocados no grupo tratado, sob anestesia local associada àsedação/analgesia. As células mononucleares foram isoladas pelo gradiente de Ficoll (AmershamBiosciences), exaustivamente lavadas com salina heparinizada contendo albumina humana 5% e posteriormentefiltradas através de uma peneira de nylon de 100 µm para remover os agregados celulares. Uma pequena fraçãoda suspensão de células foi utilizada para citometria e avaliação da viabilidade celular pelo método de exclusãoutilizando azul de trypan, com demonstração de viabilidade celular superior a 90% (96,2+4,9%), garantindo aqualidade da suspensão.

A caracterização dos marcadores de diferenciação leucocitária por citometria de fluxo e a avaliação funcionaltambém foi realizada em uma fração das células obtidas. A capacidade clonogênica dos progenitoreshematopoiéticos foi avaliada pelas unidades formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos, conformepreviamente descrito.51 Culturas de bactérias e fungos das preparações de células clinicamente utilizadas foramrealizadas.

Implante das células mononucleares da medula óssea

Os pacientes alocados no grupo tratado foram transferidos para o laboratório de intervenção cardiovascular cercade 3 horas antes do início do procedimento, para realização de coronariografia e ventriculografia esquerdaseguida de mapeamento eletromecânico, a fim de identificar áreas de miocárdio viável definidas como voltagemunipolar preservada (>6,9 mV) e atividade mecânica diminuída (encurtamento linear local <12%).52,53 Asinjeções transendocárdicas, com o cateter NOGA MyoStar®, foram realizadas em pontos com estascaracterísticas.

Cada ponto de injeção foi cuidadosamente avaliado antes das injeções, utilizando-se os seguintes critérios: 1)posição perpendicular do cateter na parede do ventrículo esquerdo; 2) excelente estabilidade do cateter (“LoopStability” < 4mm) e 3) presença de extra-sístole ventricular à exteriorização da agulha no miocárdio. Foramrealizadas 15 injeções de 0,2ml cada (25.5± 6.3x106 células/paciente).

Análise estatística

As diferenças nas características demográficas, entre os grupos, foram avaliadas através do teste qui-quadrado.Teste exato de Fisher e Teste T foram utilizados para as variáveis discretas e contínuas, respectivamente. Acomparação das mudanças ocorridas entre a fase inicial e o seguimento de 2 e 6 meses no grupo tratado e nogrupo controle foi feita através do teste ANOVA para medidas repetidas. A avaliação das mudanças ocorridas aolongo do seguimento de 6 meses do grupo tratado em relação ao grupo controle foi feita através do modeloANOVA para medidas repetidas, incluindo a interação entre os dois grupos, com análise Pos hoc de Kruskal-Wallis para variáveis não paramétricas e para variáveis contínuas com distribuição assimétrica. Análise Pos hoccom correção de Bonferroni foi realizada para variáveis contínuas, com distribuição normal. Um valor de p<0.05foi considerado estatisticamente significativo.

Bioética

O Comitê de Ética em Pesquisas envolvendo seres humanos do Hospital Pró-Cardíaco e a Comissão Nacional deÉtica em Pesquisa (CONEP) aprovaram o protocolo de pesquisa.

Resultados

Não houve diferenças quanto às características clínicas entre os grupos (tabela I). Os pacientes foram tratados deacordo com a diretriz brasileira para o tratamento de insuficiência cardíaca.54 Todos os pacientes utilizaraminibidores da enzima conversora de angiotensina (IECA) ou inibidores do receptor de angiotensina. Setenta e umpor cento dos pacientes do grupo tratado e 50% dos pacientes do grupo controle estavam em uso debetabloqueadores. Não houve diferença no uso de nitratos, IECA, beta bloqueadores ou diuréticos nos 6 mesesde seguimento, conforme demonstrado na Tabela II e Figura 1.

As características da população celular estão descritas na Tabela III. A viabilidade celular foi acima de 95%(96.2±4.9%), garantindo a qualidade da suspensão de células. As culturas de fungos e bactérias foram negativas.O tempo total do procedimento de injeção foi de 81 ± 19 minutos. Os mapas eletromecânicos contaram com 92± 16 pontos.

Não houve complicações maiores relacionadas ao procedimento. Um paciente teve um episódio transitório decongestão pulmonar que foi tratado com diuréticos e dobutamina. Nenhuma arritmia sustentada foi observadadurante o procedimento. Não foi detectado caso algum de derrame pericárdico nos exames seriados deecocardiografia realizados nas 48 horas após o procedimento. Todos os pacientes tiveram alta hospitalar 48 horasapós o procedimento de injeção conforme previsto no protocolo.

Um paciente do grupo controle morreu 2 semanas após a entrada no estudo e não foi incluído na análise. Umpaciente do grupo tratado morreu na 14a semana de seguimento por morte súbita, precedida por precordialgia deforte intensidade. Os familiares recusaram a necrópsia.

Os pacientes do grupo tratado apresentaram menos sintomas de insuficiência cardíaca e angina após 2 e 6 mesesde seguimento quando comparados ao grupo controle (p = 0,0001 e 0,008, respectivamente).

Não houve incidência de arritmias ventriculares graves na análise pelo holter de 24h realizado nas 24 horasimediatamente após o procedimento e nos seguimentos de 2 e 6 meses. Houve uma tendência à redução no

número de extra-sístoles ventriculares de 4.445+8.512/24h para 941+1.244/24h (p = 0,08) mantendo este padrãoaté o 6o mês de seguimento. O percentual de ESV variou não significativamente de 3,8±6,8% para 0,9±1,14%em 2 meses e para 0,95±1,28% em 6 meses.

No acompanhamento de 6 meses, dentre todos os valores laboratoriais (Tabela IV), somente os níveis séricos decreatinina variaram entre o grupo controle e o grupo tratado. Os níveis séricos de creatinina aumentaramsignificativamente no grupo controle quando comparados ao grupo tratado (p = 0,02). Os níveis de PCRt naavaliação inicial e no seguimento de 2 e 6 meses não apresentaram diferença significativa entre os 2 grupos(p=0,8). Houve aumento dos níveis séricos de BNP no grupo controle em relação ao grupo tratado, noseguimento de 6 meses (p = 0,003).

Na avaliação inicial a geometria ventricular diferiu significativamente entre os grupos. O grupo controleapresentou volumes sistólico e diastólico finais menores (p < 0,001) assim uma FE inicial maior (p = 0,054). Noentanto, no seguimento de 6 meses a FE diminuiu de forma significativa no grupo controle (p = 0,05), o que nãoaconteceu no grupo tratado. Os volumes cavitários se mantiveram inalterados em ambos os grupos.

O pico de VO2 foi semelhante entre os 2 grupos na avaliação inicial e ocorreu aumento significativo após 2meses no grupo tratado (de 17,96±8,78 para 23,40±8,30, p = 0,01), que se manteve (24,20±7,50) aos 6 meses deseguimento (p = 0,05), o que não foi observado no grupo controle (Tabela V). Esta variação do pico de VO2 nãofoi suficiente para gerar diferença estatística significativa na interação entre os grupos tratado e controle ao finalde 6 meses de seguimento.

O tamanho do total de defeito de perfusão reversível (TDPR) (isquemia) e o percentual de defeito de perfusãoem repouso (PDPR) com 50% de atividade (cicatriz) foi semelhante entre os grupos na avaliação inicial. Nãohouve variação do PDPR 50% em 2 ou 6 meses, em ambos os grupos. No grupo tratado houve redução absoluta,significativa, de 10% do DPRT (p = 0,022) ao final de 2 meses (redução relativa de 73%) diferindo de formasignificativa em relação ao grupo controle. Ao final de 6 meses, esta redução absoluta da área isquêmica perdeu4% do seu impacto inical, porém, mantendo uma redução absoluta (em relação à avaliação inicial) de 6% (tabelaV), bem como uma diferença significativa em relação ao grupo controle (p=0,05). Na Figura 2 está ilustrado umexemplo de resolução da isquemia ínfero-lateral em um paciente tratado.

Discussão

Este estudo descreve pela primeira vez a evolução de médio prazo (6 meses) de pacientes submetidos aotransplante transendocárdico com células autólogas mononucleares da medula óssea por meio de injeçõestransendocárdicas em pacientes com grave disfunção ventricular. Estes resultados sugerem que a injeção deCMMOs é uma terapia segura, tanto no curto prazo 50, quanto em sua evolução de 6 meses.

Existem estudos em modelos experimentais na literatura que embasam a possibilidade da neovascularização emtecidos isquêmicos com o transplante de CMMO. Nosso grupo demonstrou em ratos a capacidade de células damedula óssea gerarem um processo angiogênico, o que ficou demonstrado através de dados funcionais ehistopatológicos.55 Outros grupos obtiveram resultados semelhantes, incluindo Fuchs e Kawamoto queestudaram porcos com isquemia miocárdica crônica induzida por implante de constritores na coronária e que aseguir foram submetidos ao transplante de CMMO. Os animais foram avaliados antes de 1 mês, incluindo aanálise histopatológica, e os autores observaram melhora da perfusão miocárdica relacionada aodesenvolvimento de novos vasos.22,40 Portanto, neste estudo, a melhora da perfusão miocárdica observada nasáreas injetadas no grupo de pacientes tratados pode ter como um de seus mecanismos a angiogênese. Emboranão descrito nos resultados, a maioria dos pacientes referiu melhora dos sintomas a partir da segunda semana, oque só pôde ser demonstrado em 8 semanas conforme o desenho do estudo.

A demonstração objetiva da melhora de perfusão é fundamental quando estamos lidando com técnicas deangiogênese, as quais contam com dados da literatura demonstrando serem altamente suscetíveis a efeitoplacebo.13-19 Recentemente foram descritos relatos de melhora sintomática de pacientes submetidos arevascularização direta por laser,7-12 que no entanto não foram confirmadas, em estudo randomizado e duplo-cego.56,57 É importante lembrar, no entanto, que ao contrário do observado com a terapia celular, arevascularização direta com laser não foi capaz de demonstrar nenhuma melhora dos exames de perfusãomiocárdica por cintilografia. De forma diferente, nosso grupo, assim como outros, já relatou melhora do padrão

de perfusão miocárdica dos pacientes submetidos ao transplante de células tronco monucleares da medulaóssea.48-50

Resultados clínicos preliminares em pacientes com infarto agudo do miocárdio recente sugerem uma redução naárea de fibrose após terapia com células mononucleares de medula óssea30,31. No entanto, não há nenhum dadoclínico que sugira este tipo de efeito no modelo de pacientes, com grave disfunção ventricular, apresentado nonosso estudo. Ao contrário, além do fato destes pacientes não terem apresentado melhora do defeito dacintilografia em repouso, o que sugeriria um possível efeito miogênico, devemos observar que houve melhora doVSF e não do VDF sugerindo um melhor desempenho contrátil das áreas viáveis e não o surgimento de novasáreas viáveis. Uma vez que as células foram injetadas somente em áreas de miocárdio isquêmico, é razoávelimaginar que aquele meio (micro) ambiente oferecesse forte sinalização angiogênica para as célulastransplantadas, como, por exemplo, pela presença do Fator de Hipóxia Tecidual (HIF-1, do inglês “hipoxiainducible factor”) gerando Fator de Crescimento Vascular Endotelial (VEGF, do inglês “vascular endothelialgrowth factor”). Se esta hipótese se confirmar, a precisão na técnica de liberação celular poderá ser deimportância para se atingir os objetivos terapêuticos de cada paciente.

Embora o pequeno número de pacientes e o desenho aberto do estudo possam justificar diferenças estatísticasobservadas na comparação de algumas variáveis (efeito hawthorne),58 os dados apresentados sugerem que osresultados demonstrados podem ser secundários à melhora da perfusão miocárdica.

Conclusão

Neste estudo inicial prospectivo, não randomizado, em pacientes com doença arterial coronária com gravedisfunção ventricular e sem outra opção de tratamento, não observamos efeitos adversos graves relacionados aoprocedimento, seja na fase de internação, seja no seguimento de 6 meses. Neste período de acompanhamentonão observamos deterioração de parâmetros mecânicos e de perfusão nas áreas injetadas, assim como nãoobservamos qualquer sinal de disfunção do sistema de condução. Houve melhora dos sintomas, da funçãocardíaca e da perfusão miocárdica no grupo tratado em relação ao grupo controle. Nós acreditamos que possaexistir um enorme potencial clínico para esta técnica. Investigações futuras conduzidas em estudos maiores erandomizados são necessárias.

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- 110 -Anexos


ANEXO V

Trabalho publicado na Revista Circulation Julho 2005

- 111 -Anexos


Circulation. 2005 Jul 26;112(4):521-6. Epub 2005 Jul 18.

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Dohmann HF, Perin EC, Takiya CM, Silva GV, Silva SA, Sousa AL, Mesquita CT, RossiMI, Pascarelli BM, Assis IM, Dutra HS, Assad JA, Castello-Branco RV, Drummond C,Dohmann HJ, Willerson JT, Borojevic R.

Hospital Procardiaco, Rio de Janeiro, Brazil. [email protected]

BACKGROUND: Cell-based therapies for treatment of ischemic heart disease are currentlyunder investigation. We previously reported the results of a phase I trial of transendocardialinjection of autologous bone marrow mononuclear (ABMM) cells in patients with end-stageischemic heart disease. The current report focuses on postmortem cardiac findings from one ofthe treated patients, who died 11 months after cell therapy. METHODS AND RESULTS:Anatomicopathologic, morphometric, and immunocytochemical findings from the anterolateralventricular wall (with cell therapy) were compared with findings from the interventricularseptum (normal perfusion and no cell therapy) and from the inferoposterior ventricular wall(extensive scar tissue and no cell therapy). No signs of adverse events were found in the cell-injected areas. Capillary density was significantly higher (P<0.001) in the anterolateral wall thanin the previously infarcted tissue in the posterior wall. The prominent vasculature of theanterolateral wall was associated with hyperplasia of pericytes, mural cells, and adventitia. Someof these cells had acquired cytoskeletal elements and contractile proteins (troponin, sarcomericalpha-actinin, actinin), as well as the morphology of cardiomyocytes, and appeared to havemigrated toward adjacent bundles of cardiomyocytes. CONCLUSIONS: Eleven months aftertreatment, morphological and immunocytochemical analysis of the sites of ABMM cell injectionshowed no abnormal cell growth or tissue lesions and suggested that an active process ofangiogenesis was present in both the fibrotic cicatricial tissue and the adjacent cardiac muscle.Some of the pericytes had acquired the morphology of cardiomyocytes, suggesting long-termsequential regeneration of the cardiac vascular tree and muscle.

Publication Types:

• Case Reports


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Transendocardial Autologous Bone Marrow Mononuclear Cell Injectionin Ischemic Heart Failure: Postmortem Anatomicopathologic and

Immunohistochemical Findings[Original Articles: Heart Failure]

Dohmann, Hans F.R. MD*; Perin, Emerson C. MD, PhD*; Takiya, Christina M. MD, PhD; Silva,Guilherme V. MD; Silva, Suzana A. MD; Sousa, Andre L.S. MD; Mesquita, Claudio T. MD, PhD; Rossi,

Maria-Isabel D. PhD; Pascarelli, Bernardo M.O. MD; Assis, Isabella M. MD; Dutra, Helio S. PhD;Assad, João A.R. MD; Castello-Branco, Rodrigo V. MD; Drummond, Cantidio MD; Dohmann, Hans J.F.

MD, PhD; Willerson, James T. MD; Borojevic, Radovan PhD

From the Hospital Procardiaco (H.F.R.D., S.A.S., A.L.S.S., C.T.M., J.A.R.A., R.V.C.B., C.D., H.J.F.D.),Rio de Janeiro, Brazil; the Texas Heart Institute at St. Luke’s Episcopal Hospital (E.C.P., G.V.S., J.T.W.),Houston, Tex; and the Institute of Biomedical Sciences and Clementino Fraga Filho Hospital, FederalUniversity (C.M.T., M.-I.D.R., B.M.O.P., I.M.A., H.S.D., R.B.), Rio de Janeiro, Brazil.Received March 31, 2004; de novo received August 13, 2004; revision received January 28, 2005;accepted February 23, 2005.*Drs Dohmann and Perin are coprincipal investigators.Correspondence to Hans F.R. Dohmann, MD, Rua General Polidoro 192, 22080-000 Rio de Janeiro,Brazil (e-mail [email protected]), or Emerson C. Perin, MD, 6624 Fannin, Suite2220, Houston TX 77030 (e-mail [email protected]).

Introduction

The role of cell-based therapy for the treatment of ischemic heart disease is currently under investigation.In view of the myocardium’s limited capacity to regenerate spontaneously after an ischemic injury, thetherapeutic use of exogenous progenitor cells has recently gained increasing interest. In vitrodemonstration of functional cardiomyocyte differentiation from bone marrow–derived progenitor cells 1,2has prompted in vivo studies in animal models, and promising results have been obtained in the repair andregeneration of acute and chronic cardiac muscle lesions. Several types of progenitor cells have been usedin experimental models, including bone marrow–derived endothelial and blood cell progenitors, as well asbone marrow mesenchymal progenitors.3–6

In humans, similar attempts have been made with surgical, intracoronary, or transendocardial introductionof bone marrow–derived cells to improve cardiac lesions.7,8 Our group recently reported the results ofthe first phase I human trial of transendocardial injection of autologous bone marrow mononuclear(ABMM) cells in patients with end-stage ischemic heart disease.9 We observed a significant increase inperfusion, contractility of ischemic myocardial segments, and functional capacity of the cell-injectionrecipients. This report presents postmortem cardiac findings from one of these patients.

Case ReportThe patient was a 55-year-old man with ischemic cardiomyopathy and 2 previous myocardial infarctions(in 1985 and 2000). He began to have symptoms of congestive heart failure 2 years before studyenrollment. One year before enrollment, the patient had an ischemic stroke with mild residual righthemiparesis and resultant episodes of chronic tonic-clonic seizures. His risk factors for coronary arterydisease included diabetes mellitus type II, hypertension, and hypercholesterolemia.

The patient’s functional capacity was evaluated at baseline by means of a ramp treadmill protocol 10 witha peak maximal oxygen consumption ([latin capital V with dot above]o2max) of 15.9 mL · kg-1 · min-1 anda workload of 4.51 metabolic equivalents (METs). A baseline single-photon-emission computedtomography (SPECT) perfusion study showed a partially reversible perfusion defect in the anterolateralwall, a fixed perfusion defect (scar) in the inferior and posterior walls, and normal perfusion in the septalwall.

Cardiac catheterization revealed a left ventricular ejection fraction of 11%, a 70% ostial and an 85%middle stenosis of the left anterior descending (LAD) coronary artery, an 80% proximal lesion of the leftcircumflex (LCx) coronary artery, and total occlusion of the first obtuse marginal artery and rightcoronary artery. The distal segments of the LAD and LCx were diffusely diseased. Owing to the severityand extent of the patient’s coronary disease, he was not considered a candidate for surgical orinterventional procedures. At enrollment in our study, he was in New York Heart Association (NYHA)

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functional class III and Canadian Cardiovascular Society (CCS) angina class III. His serum C-reactiveprotein level, complete blood count, creatine kinase level, and troponin level were normal at baseline.

The patient received a total of 3×107 ABMM cells (the Table) that had been harvested 2 hours before theprocedure. With the guidance of electromechanical mapping,11,12 the cells were injectedtransendocardially into the anterolateral wall of the left ventricle. No periprocedural complications wereobserved.


Table. Phenotype and Functional Characterization of3×107 Cells Injected via a Transendocardial Route

Noninvasive follow-up evaluation was performed 2 and 6 months after cell therapy. Invasive follow-upevaluation, with cardiac catheterization, was performed at 4 months and revealed no change in coronaryanatomy. Symptomatic and functional improvements were noted because the patient returned to NYHAand CCS class I. Holter monitoring showed no malignant ventricular arrhythmias, and signal-averagedECG parameters remained stable. There was no change in the patient’s medications after cell therapy.There was no change in the global ejection fraction or left ventricular volume on echocardiography. Thewall-motion index score (on 2-dimensional echocardiography) improved from 1.94 to 1.65 as contractilityincreased in 5 segments adjacent to the injected area. Myocardial perfusion, as assessed by SPECT,improved in the anterolateral wall. Mechanical data derived from SPECT showed improvements inregional ejection fraction, wall motion, and thickening. In addition, during ramp treadmill testing, the[latin capital V with dot above]o2max increased from 15.8 to 25.2 mL · kg-1 · min-1, and the METsincreased from 4.51 to 7.21 at 2 months. At 6-month follow-up testing, the [latin capital V with dotabove]o2max reached 31.6 mL · kg-1 · min-1, and the METs was 9.03.

From 6 to 11 months after the cell injection procedure, the patient’s cardiovascular condition remainedstable. At 11 months, however, he had a tonic-clonic seizure at home and was found in cardiopulmonaryarrest by family members.

MethodsAfter signed, informed consent was given by the family, an autopsy was performed, includingmorphological and immunocytochemical analysis of the heart. This report presents theanatomicopathologic findings about the infarcted areas of the anterolateral ventricular wall, which werethe areas that had received bone marrow cell injections. The histological findings from this region werecompared with findings from within the interventricular septum (which had normal perfusion in thecentral region and no cell therapy) and findings from the previously infarcted inferoposterior ventricularwall (which had extensive scarring and no cell therapy).

Immunocytochemical analysis of paraffin sections was performed with antibodies against factor VIII–related antigen (A0082, Dako), vimentin (M0725, Dako), smooth muscle [alpha]-actin (M0851, Dako),and CD34 and Ki-67 (NCL-l-End and NCL-Ki67MM1 respectively, Novocastra). Antibodies werereacted with Dako’s EnVision+ System/HRP, with diaminobenzidine as a chromogen. Frozen sectionswere fixed, permeated with acetone, and incubated with antibodies for troponin T (T6277, Sigma),smooth muscle [alpha]-actin, sarcomeric actinin (A7811, Sigma), and desmin (D1033, Sigma).Antibodies were revealed with anti-mouse or anti-rabbit IgG, F(ab)2 fragment, conjugated to fluorescein

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isothiocyanate (1814192 and 1238833, respectively, Boehringer-Mannheim), and counterstained with a0.1‰ solution of Evans blue dye (Merck).

Capillary density was monitored by using computerized image analysis (Image-Pro Plus,MediaCybernetics) of randomly selected fields in sections stained with hematoxylin and reacted withantibody for factor VIII–related antigen (n=108) and randomly selected fields in sections reacted withantibodies for smooth muscle [alpha]-actin (n=96). Transverse sections of capillaries identified bystaining for factor VIII and pericyte-containing capillaries identified by staining for smooth muscle[alpha]-actin were quantified separately. Results were expressed as the mean number of capillaries persquare millimeter in the case of factor VIII–stained slides or the number of capillaries containingpericytes in [alpha]-smooth-muscle-actin–stained slides. Larger vessels identified by a continuous wall ofsmooth muscle actin–positive mural cells were excluded. Differences between the anterolateral, septal,and posterior walls were assessed with Kruskal-Wallis ANOVA and the Student-Newman-Keuls methodfor pairwise multiple comparison. Results were considered significant if P was <0.05.

Evaluation of the capillary density inside the fibrotic areas within the cell-treated anterolateral wall versusthe nontreated posterior wall was performed in 40 selected fields inside the fibrotic scars, excluding theregions containing cardiomyocytes. Microscope fields (at ×100) of factor VIII–stained slides weredigitized, and the number of transverse sections of capillaries per square millimeter of fibrotic zones wasassessed. Differences between the treated infarcted zones and the nontreated fibrotic wall were assessedby the Mann-Whitney rank-sum test. Results were considered significant if P was <0.05.

ResultsAnatomopathologic FindingsThe heart weighed 765 g. There was severe arteriosclerosis with subocclusive calcified atheromata in allcoronary arteries, calcification of the pulmonary artery, and moderate atheromatosis of the aorta. Theheart cavities were dilated, with hypertrophic walls. There was no evidence of any acute injury or oflesions that could be related to cell injections. A generalized, homogeneous endocardial opacification,affecting all the cardiac internal surfaces, was identified on histological examination as diffusefibroelastic hyperplasia of the endocardium. Minute focal and punctate scars were observed, mainly in theposterior and anterolateral walls.

The apical zone was thinned and fibrotic. The posterior and apical regions had dense, fibrotic, well-circumscribed scars that separated cardiomyocyte bundles. The septal wall exhibited focal scarsinterspersed with cardiac fibers in the regions adjacent to the anterior and posterior ventricular walls, butit was devoid of fibrosis in the central region.

The anterolateral ventricular wall that received cell injections had elongated, irregular, and parallelreddish areas throughout. In the same wall, in adjacent regions that did not receive injections, the densityand morphology of the fibrotic scars were similar to those of the posterior wall, suggesting that no overtdifferences were present among the different infarcted areas before cell injections.

Morphometric AnalysisThe capillary density was significantly higher in the areas of the anterolateral ventricular walls thatreceived cell injections than in the previously infarcted posterior wall (P<0.0001) (Figure 1A). Themedian capillary density in the anterolateral wall was apparently similar to that in the septal wall.However, the broad dispersion of the septal wall data, which may have been due to fibrotic areas inregions close or adjacent to the ventricular walls, generated a statistically significant difference betweenthese 2 groups.


Figure 1. Number of capillaries per mm2 in anterolateral, posterior,and septal walls of studied heart. A, Anti-factor VIII–associatedantigen counterstained with hematoxylin. B, Anti-smooth muscle[alpha]-actin antigen counterstained with hematoxylin. C,Capillaries reacted with anti-factor VIII–associated antigen insidefibrotic areas only in anterolateral and posterior walls. (n=108microscope fields for A; 96 microscope fields for B; and 40microscopic fields for C.) Differences were statistically significant

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among all groups in pairwise comparisons (P<0.05, Newman-Keulsmethod) for A and B. Differences were significantly different(P<0.05) between anterolateral and posterior walls in Mann-Whitney rank-sum test for C.

The density of capillaries that contained smooth muscle [alpha]-actin–positive cells within their walls wasalso assessed (Figure 1B). The number of such vessels was higher in the anterolateral wall than in theseptal and posterior walls (P<0.0001). Larger vessels identified by a continuous wall of smooth muscle[alpha]-actin–positive mural cells were not included in these analyses. The capillary density wassignificantly higher within fibrotic areas of the anterolateral wall than within fibrotic areas of the posteriorwall (P<0.0001) (Figure 1C).

Histological FindingsThe anterolateral wall showed irregular, pale regions of fibrotic tissue intercalated with dark regions ofcardiac muscle arranged in roughly parallel, interspersed bands, perpendicular to the ventricular wallplane (Figure 2A). No abnormal cell organization, growth, or differentiation or signs of previous focalnecrosis, inflammatory reactions, or tissue repair were found in the region that had received cellinjections. Inside the fibrotic tissue, trichrome and picrosirius collagen staining disclosed regions withdecreased collagen density, in which a rich vascular tree was present. The anterolateral wall also showedlarger central vessels that ramified into smaller ones, parallel to the cardiomyocyte bundles (Figure 2B).In the anterolateral wall, the peripheral zone of fibrotic areas merged into the cardiomyocyte layer andlacked well-defined limits, unlike the fibrotic areas observed in the posterior wall (Figure 2C). No fibrotictissue was seen in the central area of the septal wall (Figure 2D).


Figure 2. Gomori trichrome stain of anterolateral (A, B), posterior(C), and septal (D) walls. Increased vascular tree is present in B.Original magnification is ×40 in A, B, and D; ×100 in C.

Inflammatory cells were rare in the perivascular region: There were occasional isolated small groups oflymphocytes and, very rarely, granulocytes. At the interface between fibrotic tissue and cardiomyocytebundles, 2 gradients merged: the decreasing blood vessel diameter and the increasing cardiomyocyte size.Very small cardiomyocytes were seen isolated in the fibrotic matrix adjacent to capillaries in theanterolateral wall, together with a progressively increasing number of fibroblastoid cells that wereisolated or interspersed in small groups among the cardiomyocyte bundles.

Immunocytochemistry Findings

Immunocytochemical labeling of factor VIII–associated antigen identified a thin endothelial layer ofblood vessels in the posterior, septal (Figure 3A), and anterolateral (Figure 3B) ventricular walls. In theanterolateral wall, neither factor VIII nor CD34 was found in the fibroblastoid cell population inside thefibrotic matrix. In the posterior ventricular wall and septum, smooth muscle [alpha]-actin was readilyidentified in blood vessel wall cells. This protein was present both in pericytes and in the smooth muscle

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cells of the thin vessel wall layer (Figure 3C) in the anterolateral wall. The vascular tree of theanterolateral wall showed intense labeling in the blood vessel walls, which had a marked hypertrophy ofsmooth muscle cells (Figure 3D). The same staining pattern was present in isolated cells located in theperivascular position and in the adjacent region among cardiomyocytes and fibrotic matrix (Figure 3E).Vimentin was present in the endothelial layer of the anterolateral wall, in the perivascular cells, and incells adjacent to or in close contact with the cardiomyocytes (Figure 4A). These cells frequently formedan extensive network that permeated the fibrotic matrix and the interstitial space among cardiomyocytes(Figure 4B).


Figure 3. Immunocytochemical identification of factor VIII–associated antigen (A, B) and smooth muscle [alpha]-actin (C–E) inblood vessel walls of septal (A) and anterolateral (B–E) regions ofstudied heart, depicting increased vascular density (B) andhyperplasia of perivascular and mural cells (C–E). Ki67 reactivitywas rarely present in perivascular cells of anterolateral wall (F).Original magnification ×40 in A and B, ×400 in C and D, and×1000 in E and F.


Figure 4. Anterolateral wall that received cell injection therapy. Aand B, Immunostaining for vimentin depicted positive reaction invascular wall and in fibroblastoid interstitial cells. C and D,Immunostaining for desmin showed small groups of intenselyreactive cells between blood vessels and cardiomyocytes (C) andsmall cells inside cardiomyocyte bundles with typical striatedcytoskeleton (D). E and F, Immunostaining for troponin showedpositive reaction in all mural cells of medium-sized blood vessel.Original magnification is ×1000 in A and F; ×400 in B–E.

Desmin was identified in the same cell population. Desmin labeling was less intense in the vascular wallcells and isolated perivascular cells and was more intense in the cells adjacent to cardiomyocytes. Onsections perpendicular to the main cardiomyocyte axis, thin desmin-positive fibrils were observed mainlyin the submembrane region; on longitudinal sections, a typical transverse banded pattern of desmin wasobserved (Figure 4C and 4D). Among cardiomyocytes, some of the small cells had strong, peripheraldesmin-stained areas (Figure 4D).

In vascular and perivascular cells in the posterior wall and septum, troponin labeling was negative. In theanterolateral wall, troponin labeling was negative in capillary walls but was positive in the adjacent

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pericapillary pericytes and in cells migrating into the pericapillary matrix (Figure 4E). In larger vessels,troponin-positive cells were observed in the outer cell layers and adventitia, occasionally forming acontinuous troponin-positive cell layer around the vessel (Figure 4F). Isolated cells or small groups oftroponin-positive cells were found in the area between the fibrotic tissue and cardiomyocytes and insidethe adjacent cardiomyocyte bundles. The intensity of labeling increased in the proximity ofcardiomyocytes, where some small fibroblastoid cells disclosed a bright cytoplasm homogeneouslylabeled for troponin (Figure 5A). Occasionally, such cells had an increased volume, with troponinlabeling restricted to the periphery; the central area was filled by a troponin-negative cytoskeleton similarto the desmin-stained areas in small cardiomyocytes. In mature cardiomyocytes, troponin-specificantibody labeled the peripheral filamentous and sarcomeric cytoskeleton.


Figure 5. Anterolateral wall that received cell injection therapy. A,Immunostaining for troponin depicted small cardiomyocyte-likecells with intense reaction in peripheral cell area. B–F,Immunostaining for sarcomeric actinin depicted reactivity in muralcells of blood vessel (B–E) and isolated cells amongcardiomyocytes with actinin organization similar to that ofsarcomeres (E, F). Original magnification is ×400 in A and F;×1000 in B–E.

Labeling of sarcomeric actinin was similar to that of troponin. However, both pericapillary pericytes andmural blood vessel cells in the anterolateral region were negative for sarcomeric actinin in blood vesselsthat were deeply embedded in the fibrotic scar matrix and that remained distant from cardiomyocytebundles. The same cells located in vessels adjacent to or embedded between the cardiomyocyte bundleswere positive for sarcomeric actinin, as were the isolated cells or small groups of fibroblastoid cells(Figures 5B and 5C). Some of these cells had increased in size and, in their central region, disclosedsarcomeric actinin that was already organized in the typical banded pattern of sarcomeres (Figures 5D and5E). In this central region, isolated cells barely larger than pericytes could be observed; only a fewsarcomeres were present, suggesting that those isolated cells had acquired some cardiomyocytecharacteristics (Figure 5F).

The Ki67 antibody, which identifies cells actively engaged in replication, reacted only rarely withendothelial cells in the posterior wall. In the anterolateral region, the Ki67 antibody also reacted withpericapillary pericytes and with isolated fibroblastoid cells in the surrounding fibrotic matrix (Figure 3F).The overall cell reactivity with Ki67 antibody was relatively low.

DiscussionAccumulating evidence from both experimental animal studies 4–6 and human trials 7–9 indicates thatABMM cell therapy improves myocardial perfusion in patients with ischemic heart disease. At the sametime, clinical stem cell therapy research is focusing more on safety than on efficacy. The present reportdescribes the postmortem study of one patient who underwent transendocardial injection of ABMM cells.Accordingly, the major findings in this report pertain to the procedure’s safety: No abnormal ordisorganized tissue growth, no abnormal vascular growth, and no enhanced inflammatory reactions wereobserved. In addition, some intriguing histological and immunohistochemical findings were documented:(1) There was a higher capillary density in the cell-treated area than in nontreated areas of the heart. (2) Aproliferation of smooth muscle [alpha]-actin–positive pericytes and mural cells was noted. (3) Theaforementioned cells expressed specific cardiomyocyte proteins.

In the postnatal period, new blood vessels form through either vasculogenesis or angiogenesis, in whichproliferation of endothelial cells is followed by remodeling of the extracellular matrix and proliferation of

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blood wall cells.13–15 Endothelial cells can result from bone marrow–derived progenitors (postnatalvasculogenesis) or from the migration and proliferation of endothelial cells from existing vessels(angiogenesis).16 Mural cells such as pericytes and smooth muscle cells can be derived from bonemarrow mesenchymal cells (stroma), myofibroblasts, and/or fibroblasts.17 In the neoangiogenic process,pericytes are derived either from cells of adjacent tissues (mobilized by growth factors produced byendothelial cells) or from proliferation of adventitial and pericapillary pericytes and their distal gliding onthe abluminal side of the growing blood vessel’s basement membranes.13 The alternative origination ofpericytes from mesenchymal stem cells has been proposed and preliminarily confirmed in experimentalmodels.18 Pericytes may be essential to achieve a physiological angiogenic process with resultant durableblood vessels. In the present case, when compared with the noninjected regions, the cell-injected wall hadmarked hyperplasia of pericytes and mural cells. The observed hypertrophic pericytes displayed 2characteristics: First, although still located in the vascular wall, they expressed specific myocardialproteins and second, they were found in locations that suggested detachment, having migrated into theadjacent tissue and reached proximal cardiomyocytes that were either isolated or in small cell clumps.Closer to cardiomyocytes, the expression of myocardial proteins was enhanced, yielding brighterimmunostaining throughout the whole cytoplasm. The significance of these findings remains to beestablished. However, within the posterior wall, none of the findings was seen, and small blood vesselscould only rarely be found.

Notwithstanding the aforedescribed data, the present report has limitations that severely restrict ourability to make conclusions about the role of ABMM cells in myocardial regeneration. The findings couldhave occurred by chance. It is impossible to exclude the influence of a natural recovery process as thecause for the difference in vascular density between cell-treated and nontreated areas. Comparisons ofcapillary density among different sections of wall were based on specimens from a single patient.Moreover, this is an isolated, uncontrolled case involving late events after injection of unlabeled cells; itprecluded the use of any imaging technique that could have helped to colocalize and identify the presenceof stem cell direct descendants within the vessel wall or myocardium. Therefore, the significantdifference in vascular density between cell-treated and nontreated areas cannot be extrapolated to a largerpopulation of similar patients. However, the increased vascular density within the cell-injectedanterolateral wall accompanied that wall’s improvement in perfusion as assessed by SPECT, whereas allother walls remained unchanged.

ConclusionAt 11-month follow-up evaluation, stem cell therapy was not associated with any adverse histologicalfindings. Morphological and immunohistochemical analysis of the area that underwent ABMM cellimplantation suggested that that area had more capillaries than nontreated areas and that ABMM celltherapy was associated with hyperplasia of pericytes, mural cells, and adventitia. Some of these cells hadacquired cytoskeletal elements and contractile proteins (desmin, troponin, and sarcomeric actinin).

AcknowledgmentsThe authors thank L. Maximilian Buja, MD, and Silvio Litovsky, MD, for reviewing the pathologicalfindings; Marianne Mallia-Hughes, ELS, and Virginia Fairchild of the Section of Scientific Publicationsof the Texas Heart Institute, for editorial assistance; and William K. Vaughn, PhD, for assistance withstatistical questions.

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Key Words: angiogenesis; stem cells; heart failure; revascularization; ischemia

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