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Departamento de Química
Tratamento do bambu Dendrocalamusgiganteus com nano partículas
de prata revelam possível associação com o amido
Aluno: Guilherme Borba Neumann
Orientadores: Fatima Ventura Pereira Meirelles
Omar Pandoli
Introdução Em um mundo desejoso por soluções sustentáveis, o bambu apresenta-se como
forte aliado à construção civil, substituindo de forma eficiente, em muitos casos, a
exploração da madeira convencional, devido a sua alta durabilidade, resistência
mecânica, disponibilidade na natureza, crescimento rápido e fácil manejo.
A compreensão acerca da matriz biológica destes vegetais é de grande utilidade
para que ocorra o seu tratamento contra o ataque de pragas como insetos e fungos, a fim
de maximizar o seu uso. Dendrocalamus giganteusMunro, pertencente à família
Poaceae, é uma espécie nativa da Malásia - com crescimento médio de 22cm ao dia,
podendo chegar até 30 metros de altura e 30cm de diâmetro, de grande importância
econômica no Brasil e no mundo [1].
Trabalhos recentes comprovaram a eficiência de nano partículas de prata (NPs-
Ag) como agentes antimicrobianos, a partir da larga área de superfície x volume
associada às propriedades físico-químicas já conhecidas deste metal [2]. Tais nano
partículas apresentaram grande potencial antimicrobiano mesmo em bactérias
patogênicas resistentes aos antibióticos, sendo estáveis em altas temperaturas e pouco
voláteis [2].
É sabido que nas células parenquimáticas do colmo localiza-se o amido,
principal polímero utilizado como reserva energética, na alimentação dos
microorganismos, e também de certos invertebrados (besouros, por exemplo). Tal
observação tornou-se objeto de investigação neste trabalho.
O amido é armazenado no rizoma e no colmo do bambu, como fonte de energia
para a produção de novos brotos. O crescimento destes brotos se dá principalmente por
via da glicólise, que utiliza dos carboidratos sintetizados na fotossíntese, armazenados
em forma de amido [3]. Entretanto, devido as diferenças quantitativas[4], o amido para
armazenamento temporário, é sintetizado nos cloroplastos e, o amido para
armazenamento de longo-prazo é sintetizado nos amiloplastos das partes não
fotossintéticas das plantas – raízes, sementes e tubérculos (caules subterrâneos).
A quantidade de amido varia em diferentes estações, em diferentes regiões do
colmo e em diferentes idades do indivíduo. Regiões da base apresentam menor
quantidade do que as regiões medianas e do ápice do colmo. Períodos mais secos são
mais suscetíveis à síntese de amido, já que o armazenam para ser utilizado no
brotamento, nas estações mais úmidas do ano. Indivíduos jovens não possuem grandes
quantidades de reserva de amido, visto que metabolizam a glicose para o crescimento
vegetativo, enquanto que indivíduos mais velhos apresentam reservas mais abundantes
[3].
O parênquima, comumente tratado como tecido fundamental ou de
preenchimento é a principal sede de atividades essenciais, como a fotossíntese,
assimilação, respiração, armazenamento, secreção e excreção. Suas células possuem
paredes delgadas, primárias e não lignificadas [5]. Assim como as demais espécies de
monocotiledôneas, as espécies da família Poaceae não possuem diferenciação entre
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córtex e medula, com seus feixes vasculares dispersos no parênquima, nossa zona de
observação.
Objetivo
Analisar a estrutura anatômica do colmo de Dendrocalamus giganteus,
identificando seus respectivos tecidos, assim como a distribuição das nano partículas de
prata no órgão, buscando testar e estabelecer a metodologia para extrair e quantificar o
principal polissacarídeo de interesse, o amido.
Metodologia
Síntese de NP-Ag
A síntese das NPs-Ag foi realizada como previamente descrito em [6], utilizando
nitrato de prata (AgNO3) na presença do agente redutor borohidreto de sódio (NaBH4) e
de agente ligante citratotrissódico (Na3C6H5O7), numa concentração molar de 10-2 mol
L-1, pelo processo em batelada.
Análise anatômica do bambu
Para a análise anatômica do bambu foram realizadas duas fotomicrotomografias
(Tomógrafo Zeiss - Xradia 510, tensão de 50 kV, corrente de 80 µAmpere, lente 4X,
com tempo de exposição por projeção de 1 segundo)da seção interna do colmo de D.
giganteus tratadas com a solução coloidal de Ag-NPs na concentração molar de 10-2 mol
L-1, com e sem lavagem. Na amostra em que houve a lavagem, esta foi realizada duas
vezes com água à 25 e à 50°C [7].
Extração do amido
Antes do procedimento de extração foram construídas curvas padrões para
glicose (10μmol/mL) e para a hidrólise do amido (4mg/mL), pelo método de DNS.
Cada curva continha cinco amostras, e o branco que era descontado. O teste foi
realizado em duplicata.
Para a extração do amido do bambu, aproximadamente 4,0g de bambu pré-
triturado foram submetidos à fervura em banho-maria por 1 hora à 100°C em 100mL de
água destilada, sob agitação. O indivíduo amostrado possuía 4 anos de idade, sendo
utilizado parte do corte da base do colmo.
Após a extração, o material foi peneirado, sendo a solução depositada em uma
proveta de 100mL seguindo o método de obtenção de precipitados de Azzini [8], que
descreve sucessivas decantações, em diferentes tempos. Após três decantações a solução
sobrenadante restante foi dividida em frascos menores de mesmo volume, a fim de que
a secagem ocorresse mais rapidamente. O experimento foi realizado duas vezes, como
resumido na figura 1.
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Figura 1- Método utilizado para extração do amido em D. giganteus
Algumas diferenças ocorreram entre os experimentos 1 e 2, a fim de melhor
implementar a técnica de extração do amido.
No experimento 1, após 10 minutos da filtração, a primeira amostra de
precipitados foi retirada com o auxílio de uma pipeta graduada (P1). A segunda
decantação se seguiu por 24 horas, retirando-se uma segunda amostra de precipitados
(P2) tendo sido armazenada juntamente com a primeira amostra que já havia secado em
temperatura ambiente. Depois da segunda decantação, a solução sobrenadante foi
dividida em 7 frascos com o mesmo volume da amostra dos precipitados,
aproximadamente 8,7mL cada, denominados S1,S2 ... S7. Todo o material foi seco na
estufa à 60°C durante o período de 4 dias. Com este experimento determinamos o erro
da metodologia
Já no experimento 2 três amostras de precipitados foram obtidas, em diferentes
tempos de decantação (20 minutos, 24 horas e 48 horas, respectivamente), sendo
armazenadas separadamente (P1, P2 e P3). A amostra sobrenadante foi dividida em três
frascos com aproximadamente 11,67mL cada (S1, S2 e S3).
A amostra P3 do experimento 2 não foi quantificada e será usada para análise do
amido extraído por espectro Raman e infravermelho.
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Após secas, as amostras foram ressuspendidas individualmente em 2,00mL de
água destilada e utilizadas nas etapas subsequentes.
Hidrólise do amido
Alíquotas nos valores de 0,50mL de cada uma das amostras foram submetidas ao
processo de hidrólise do amido com HCl [9] por 30 minutos e posterior quantificação da
glicose produzida pelo método de DNS[9]. Alíquotas de 0,10 e 0,30 mL também foram
submetidas ao procedimento. Em cada umas das alíquotas foram adicionadas 0,50 mL
de solução de HCl 2N (avolumando-se as amostras à 1mL com água destilada), para que
todos os volumes fossem iguais, durante 30 minutos em banho-maria à 100°C.
Após hidrolisadas, 1,00mL de solução de NaOH 1N foi adicionada em cada uma
das amostras a fim de reajustar o pH. Homogeneizadas, foram retiradas alíquotas de
1,00mL de cada uma das amostras e realocadas para outros tubos para quantificação da
glicose gerada, pelo método do DNS.
O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 2
Figura 2 - Método utilizado para quantificação do amido extraído em D. giganteus (DNS)
Dosagem de glicose pelo método do DNS
*Aos tubos contendo 1,00 mL do hidrolisado foi adicionado 1,00mL de solução
DNS. Recebida a solução DNS, cada uma das soluções fora levada à banho-maria por 5
minutos. Após este tempo foi acrescentado mais 10,00ml de água destilada para que
fosse realizada a leitura no espectrofotômetro, à 540nm [9].
Demais metodologias
Concomitantemente aos testes do amido foram realizados testes
microbiológicos, junto com outro membro da equipe. Nestes experimentos foram
necessárias a utilização de métodos de preparo de meios de cultura, de plaqueamentos,
repiques etc, como descritos anteriormente [6].
Resultados e Discussão
Microtomografia
As figuras de 3 a 9 apresentam as tomografias do colmo do bambu. Os
agregados metálicos podem ser observados em branco, visto que os raios X não são
capazes de atravessá-los, o que significa dizer que as nano partículas estão se
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distribuindo dentro do tecido parenquimático, numa possível associação com o amido, o
qual é armazenado nos cloroplastos das células deste tecido (figura 10).
Figura 3 - Fotomicrotomografia de corte transversal do colmo de D. giganteus
Figura 4 - Fotomicrotomografia da seção longitudinal do colmo de D. giganteus.
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Figura 5 - Seções longitudinal e transversal de D. giganteus
Figura6 - Agregados metálicos (branco) na matriz do colmo de D. giganteus.
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Figura 7 - Agregados metálicos (branco) na matriz do colmo de D. giganteus.
Figura 8 - Agregados metálicos (branco) na matriz do colmo de D. giganteus.
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Figura9 - Agregados metálicos (branco) na matriz do colmo de D. giganteus.
Figura 10 – Amido nas células parenquimáticas do colmo do bambu por Liese [3]
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Curva Padrão
As curvas padrões típicas de glicose e de hidrólise do amido pelo método de
DNS são apresentadas nos gráficos 1 e 2, respectivamente.
Gráfico 1 – Gráfico do padrão de glicose pelo método de DNS
Gráfico 2 - Gráfico do padrão de amido hidrolisado em glicose pelo método de DNS
Por questões operacionais, a hidrólise foi feita por 30 minutos, entretanto como
observado em hidrólises anteriores realizadas pela equipe, com1 hora há o dobro de
formação de produtos, sendo não muito significante as diferenças nas hidrólises com
mais de 1 hora. Assim pode-se dizer que para as concentrações testadas a hidrólise total
é alcançada em 1h.
Extração do amido do bambu
Os resultados da extração do amido do bambu são apresentados a seguir. Os
valores da glicose obtida pela hidrólise do amido extraído, em mg, foi dada pela razão
entre absorvância e coeficiente angular da reta do padrão da glicose. Para cada
experimento foram utilizadas novas curvas da glicose feitas no dia da extração.
glicose (mg) = abs/coef. Angular glc
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O amido hidrolisado (Tabela 1) foi quantificado a partir da razão entre a massa
de glicose quantificada e o coeficiente angular da curva padrão de hidrólise do amido,
apresentado no gráfico 2.
Amido hidrolisado (mg) = glicose (mg) /coef. Angular amido
Tabela 1 – Resultados da hidrólise do amido extraído do bambu - Experimento 1
Alíquotas de amido hidrolisado (mL)
Amido hidrolisado (mg) média+dp (mg) Erro (%)
Precipitado 0,1 0,8155 0,8155 -
0,3 2,5167 2,5167 -
0,5 1,4600 1,4600 -
Sobrenadante 0,1 0,1354 0,1136 + 0,0196 17,2
0,1076
0,0976
0,3 0,5143 0,4275 ± 0,0753 17,6
0,3895
0,3788
0,5 1,3008 0,9894 ± 0,2699 27,2
0,8445
0,8230
Foi obtido um maior erro nas alíquotas de 0,5, que podem ser reflexo da
dificuldade de homogeneização de amostras, do tempo de hidrólise, entre outros. As
alíquotas de 0,3 e 0,1 apresentaram menor erro, o que indica que alíquotas maiores
talvez necessitem maior tempo de hidrólise. Entretanto, devido aos baixos valores de
absorvância, com valores abaixo dos encontrados na curva padrão, os resultados em
negrito na tabela não são confiáveis para análise e não foram, portanto utilizados no
cálculo do total de amido extraído.
O gráfico 3 apresenta os resultados do experimento 2. As barras representam o
desvio padrão das amostras do sobrenadante.
Gráfico 3- Quantidade de glicose quantificada na extração do amido no experimento 2
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Segundo Azzini [8], o primeiro precipitado corresponde aos resíduos da
extração, que decantam em alguns minutos. Já a segunda decantação, com duração de
24 horas corresponde à precipitação do amido. A partir disso, o gráfico pode ser
observado à luz destas informações - embora análises moleculares ainda não possam
provar a natureza química de tais precipitados -, p2 seria a glicose quantificada do
amido e p1 a glicose quantificada do resíduo.
De acordo teste estatístico de Kruskal Wallis, não há diferença significativa
entre os valores dos frascos do sobrenadante nem no experimento 1 (p-value =0.6703)
nem no experimento 2 (p-value=0,8371) [10], ou seja, estatisticamente S1=S2=S3.
O amido total obtido em ambos os experimentos diverge daqueles encontrados
na literatura por AZZINI 29,66% - 41,07% [8] e por HINO 3,28% - 9,40% [11],
quantificados a partir da massa extraída da haste do bambu. No corrente estudo, foram
encontrados teores de 2,2 % , quantificados como amido hidrolisado em glicose, a partir
do método de DNS. Tal resultado advém de 4g de uma única região da haste - a base -,
que apresenta menor quantidade de amido [12]. Portanto, a comparação entre os dados
atuais com a literatura é de difícil realização.
Conclusão
As imagens obtidas permitiram verificar que as nano partículas de prata são
encontradas na mesma região onde se localiza o amido. Tais resultados sugerem uma
possível interação entre estas espécies químicas.
Variações do protocolo de extração de Azzini permitiram verificar que o amido
pode ser extraído do bambu triturado, em diferentes tempos e proporções, sendo
necessária a escolha da alíquota adequada em cada experimento, por ser determinante
no resultado.
A utilização do método de DNS foi eficaz para a determinação dos baixos teores
de amido (na forma de glicose) presentes no bambu visto que outras metodologias são
menos sensíveis e fornecem resultados duvidosos, como a dosagem de antrona, muitas
vezes utilizadas.
Por fim, podemos dizer que o tratamento do bambu com NPs-Ag demonstra ser
uma estratégia protetora eficiente para melhorar as propriedades do vegetal com vistas a
sua utilização em diversos setores, como por exemplo, a construção civil.
Referências
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