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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
HOSPITAL DR. NÉLIO MENDONÇA, FUNCHAL
ORIENTADORA:
DRA. MARLENE PIRES
ALUNO: EILYN MARISOL GOMES RODRIGUES
LISBOA, 2013
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Índice
Resumo .................................................................................................................. 7
Lista de abreviaturas ............................................................................................... 8
1- Controlo de qualidade em análises clínicas ................................................. 10
1.1- Fase pré-analítica ....................................................................................... 11
1.1.1- Colheita de amostras biológicas .......................................................... 12
1.2- Fase analítica .............................................................................................. 16
1.3- Fase pós-analítica ....................................................................................... 17
2- Resíduos hospitalares ....................................................................................... 17
Microbiologia ...................................................................................................... 19
I- Bacteriologia .................................................................................................... 20
I- 1- Diagnóstico das infeções bacterianas e fúngicas ...................................... 21
I- 1.1- Amostras ............................................................................................. 22
I- 1.2- Exame microscópico ........................................................................... 23
I- 1.3- Meios de cultura sólidos ..................................................................... 27
I- 1.4- Meios líquidos de enriquecimento ...................................................... 32
I- 1.5- Geradores ............................................................................................ 33
I- 1.6- Floras bacterianas e fúngicas normais ................................................ 33
I- 2- Provas de identificação de bactérias e fungos leveduriformes ................. 37
I- 3- Processamento dos produtos para exame bacteriológico .......................... 39
I- 3.1- Urina ................................................................................................... 39
I- 3.2- Hemocultura ....................................................................................... 41
I- 3.3- Vias respiratórias: superiores e inferiores .......................................... 43
I- 3.4- Exsudado ocular e exsudado do ouvido ............................................. 45
I- 3.5- Feridas, abcessos, exsudados purulentos, biópsia de tecido e conteúdo
de bomba ........................................................................................................ 45
I- 3.6- Líquidos biológicos ............................................................................ 47
3
I- 3.7- Fezes ................................................................................................... 49
I- 3.8- Aparelho genital .................................................................................. 51
I- 3.9- Pontas de cateter ................................................................................. 53
I- 4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos .............................................. 54
I- 4.1- Métodos laboratoriais utilizados no estudo da atividade dos
antibióticos ..................................................................................................... 54
I- 4.2- Métodos automatizados-VITEK ......................................................... 59
I- 5- Teste de despiste de resistência à meticilina do Staphylococcus em meio
de cultura sólido ................................................................................................ 62
I- 6- Controlo de qualidade interno e externo na Bacteriologia ........................ 64
II- Serologia ......................................................................................................... 65
II- 1- Colheita e amostra ................................................................................... 65
II- 2- Metodologia ............................................................................................. 66
II- 2.1- Metodologia automatizada ................................................................ 66
II- 2.2- Metodologia manual .......................................................................... 68
II- 3- Testes serológicos realizados na Serologia.............................................. 69
II- 4- Interpretação e validação das provas serológicas .................................... 70
II- 5- Controlo de qualidade interno e externo na Serologia ............................ 71
III- Parasitologia e Urinas tipo II...................................................................... 72
III- 1- Pesquisa de sangue oculto ...................................................................... 72
III- 2- Exame parasitológico nas fezes .............................................................. 73
III- 3- Urianálise (Urinas Tipo II) ..................................................................... 74
III- 3.1- Análise bioquímica .......................................................................... 75
III- 3.2- Sedimento urinário ........................................................................... 76
III- 4- Controlo de qualidade interno e externo na secção de Parasitologia e
Urinas ................................................................................................................ 77
IV- Hematologia .................................................................................................. 78
IV- 1- Amostra .................................................................................................. 81
IV- 2- Metodologia ........................................................................................... 82
IV- 3- Hemograma ............................................................................................ 82
4
IV- 4- Esfregaço de sangue periférico .............................................................. 86
IV- 4.1- Coloração de May-Grünwald-Giemsa ............................................. 87
IV- 5- Separação de hemoglobinas ................................................................... 88
IV- 5.1- HbA1C ............................................................................................. 88
IV- 5.2- HbA2 e HbF ..................................................................................... 89
IV- 6- Teste da fragilidade osmótica ................................................................. 90
IV- 7- Velocidade de sedimentação .................................................................. 91
IV- 8- Coagulação ............................................................................................. 91
IV- 8.1- Avaliação laboratorial ...................................................................... 94
IV- 8.2- Patologias mais comuns na secção de Hematologia ........................ 97
IV- 9- Controlo de qualidade interno e externo em Hematologia .................... 98
V- Bioquímica ..................................................................................................... 99
V- 1- Amostra ................................................................................................... 99
V- 2- Metodologia e análises efetuadas na secção de Bioquímica ................. 101
V- 2.1- Equipamento automatizado e método ............................................. 103
V- 2.2- Urina de 24h .................................................................................... 105
V- 2.3- Líquidos biológicos ......................................................................... 106
V- 2.4- Testes de diagnóstico rápido ........................................................... 107
V- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Bioquímica ...................... 108
VI- Hormonologia ............................................................................................. 109
VI- 1- Amostra e metodologia ........................................................................ 110
VI- 2- Análises efetuadas na secção de Hormonologia .................................. 112
VI- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Hormonologia ................ 114
VII- Imunologia ................................................................................................ 115
VII- 1- Amostra ............................................................................................... 116
VII- 2- Metodologia ........................................................................................ 116
VII- 2.1- Técnicas ........................................................................................ 116
VII- 2.2- Equipamentos automatizados ....................................................... 118
VII- 3- Análises efetuadas na secção de Imunologia ...................................... 120
5
VII- 3.1- Teste de diagnóstico rápido para a pesquisa da proteína de Bence-
Jones............................................................................................................. 121
VII- 4- Controlo de qualidade interno e externo em Imunologia ................... 121
VIII- Bibliografia .............................................................................................. 122
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Agradecimentos
Deixo aqui expressos os meus agradecimentos à Dra. Graça Andrade, pela
oportunidade de realizar o meu estágio no Hospital Dr. Nélio Mendonça,
Funchal.
Às minhas orientadoras, a Dra. Marlene Pires e a Prof. Leonor Correia, por todo
o apoio, atenção, carinho, exigência, disponibilidade e paciência que dispensaram
neste meu percurso.
A todas as pessoas das secções do Serviço de Patologia Clínica em que estagiei,
que contribuíram para que eu fizesse deste estágio uma grande experiência a
nível de formação e a nível pessoal.
Ao serviço de Hemato-Oncologia, pela informação cedida, sobre os doentes de
mieloma múltiplo. Ao Departamento de Informática e ao Departamento de
Estatística à Dra. Alexandra Borges por toda a ajuda prestada.
À minha família e amigos.
E por fim, um agradecimento muito, mas muito especial, à minha mãe, por toda a
atenção e carinho, por estar sempre presente em todas as fases da minha vida,
pelo apoio incondicional e pelos seus grandes conselhos. Sem ti, nada disto seria
possível.
7
Resumo
O meu estágio teve lugar no Hospital Dr. Nélio Mendonça, situado na avenida
Luís de Camões, no Funchal. Passei por todas estas valências do Serviço de
Patologia Clínica: Bacteriologia; Serologia; Parasitologia e Urinas; Bioquímica;
Hormonologia; Imunologia; Hematologia, por um período total de 6 meses. Este
serviço está integrado no Hospital Dr. Nélio Mendonça a par dos restantes
serviços clínicos, departamentos clínicos, unidades clínicas, unidades de apoio
clínico, consulta externa, serviço de urgência e outros serviços. Funciona 24
sobre 24 horas dando resposta aos pedidos de análise de rotina e urgência.
Este serviço também recebe as colheitas efetuadas no Hospital dos Marmeleiros e
no Hospital João da Almada, assim como, nos restantes centros de saúde da
Região Autónoma da Madeira, casas de saúde, lares, domicílio, que estão todos
estes integrados, no Serviço de Saúde da Região Autónoma da Madeira.
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Lista de abreviaturas
Ac/Acs- Anticorpo/anticorpos
ADA- Adenosina desaminase
Ag/Ags- Antigénio/ antigénios
AT- Aspirado traqueal
ATB- Antibiograma
ATCC- American type culture collection
BAAR- Bacilo álcool-ácido resistente
CDE- Coeficiente de dispersão eritrocitária
CHGM- Concentração de hemoglobina globular média
CLSI- Clinical and laboratory standards institute
CMI- Concentração mínima inibitória
EDTA- Etilenodiaminotetraacetato tripotássico
ELFA- Enzyme linked fluorescent assay
ELISA- Enzyme-linked immunosorbent assay
EQAS- External quality assurance services
EXP- Expetoração
FT- Fator tecidular
HbA1C- Hemoglobina glicada
hCG- Hormona gonodatrofina coriónica humana
HGM- Hemoglobina globular média
HPLC- High-performance liquid chromatography
INSA- Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge
ITU- Infeção do trato urinário
LBA- Lavado bronco-alveolar
LCR- Líquido cefalorraquidiano
LDH- Lactato desidrogenase
McK- MacConkey
NEQAS- National external quality assessment service
PNAEQ- Programa nacional de avaliação externa da qualidade
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RAM- Região autónoma da Madeira
RID- Imunodifusão radial
RLV- Unidade de luz relativa
RNI- Razão normal internacional
RPR- Rapid plasma reagin
SB- Secreções brônquicas
SESARAM- Serviço de saúde da região autónoma da Madeira
SS- Salmonella & Shigella
TP- Tempo de protrombina
TPHA- Treponema pallidum haemagglutination
TSA- Teste de sensibilidade antibiótica
TTP- Tempo de tromboplastina parcial
TTPA- Tempo de tromboplastina parcial ativada
VDRL- Venereal disease research laboratory
VGM- Volume globular médio
VS- Velocidade de sedimentação
vW- VonWillebrand
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1- Controlo de qualidade em análises clínicas
A qualidade consiste num espetro de atividades e processos que formam as
características de um produto ou serviço. Esse espectro divide-se em 5 níveis:
qualidade total ou gestão total da qualidade ou melhoria contínua da qualidade; a
gestão da qualidade; o sistema da qualidade; a garantia da qualidade e o controlo
da qualidade.
Atualmente, a maioria dos serviços de saúde operam duas etapas: a nível da
garantia da qualidade, que consiste num conjunto de atividades que demonstram
que uma organização atingiu um nível aceitável de qualidade; e a nível do
controlo de qualidade, que se baseia em técnicas operacionais para medir,
comparar com objetivos, identificar erros ou problemas e respetivas medidas
corretivas.
Para que uma organização como um hospital atinja os padrões de qualidade
desejados é necessária a participação ativa de todo os seus funcionários. Num
hospital, as funções de cada grupo funcional têm que estar definidas na estrutura
da gestão da qualidade da instituição.
O conceito de qualidade nas análises clínicas deverá, portanto, ser encarado
como parte do conceito mais vasto da qualidade dos serviços de saúde. Assim,
cada laboratório deverá procurar implementar à sua escala o sistema de
qualidade.
Para implementar um sistema de qualidade no laboratório tem de ser
implementado pelo menos estes três conceitos:
Controlo de qualidade
Resume numa monitorização contínua das práticas de trabalho, do equipamento e
dos reagentes, em que o próprio pessoal faz a avaliação dos resultados/dados,
chamando-se assim o controlo de qualidade interno.
Avaliação da qualidade
Ou a avaliação do desempenho, que se apoia na avaliação por terceiros, do
desempenho do laboratório através da análise dos resultados obtidos em análises
de material de controlo (amostras fictícias) realizados da forma e nas condições
11
habituais do laboratório, como se de uma amostra de um doente se tratasse, é
denominada como a avaliação da qualidade externa ou controlo de qualidade
externo.
Garantia da qualidade
É o processo total que garante a qualidade dos resultados finais fornecidos pelo
laboratório. Esta garantia da qualidade compreende não só o controlo da fase
analítica mas também das fases pré e pós analíticas do ciclo analítico. O controlo
da fase analítica compreende tanto o controlo de qualidade interno como o
externo.
1.1- Fase pré-analítica
Esta fase consiste todo o processo que envolve e antecede à fase de execução
analítica da amostra, a solicitação da amostra, a preparação do paciente, o registo,
a colheita da amostra biológica, a preparação, o transporte e a receção da
amostra.
Esta fase é da inteira responsabilidade pelo pessoal administrativo e do pessoal
da triagem dentro do serviço de Patologia Clínica (SPC), em caso das não
conformidades e das medidas corretivas. Há erros que têm de ser
resolvidos/retificados nesta fase para que não cheguem à fase analítica, por
exemplo, uma incorreta identificação da amostra (erro no nome do utente), este
problema sendo resolvido na fase pré-analítica, evitará certos problemas na
atribuição dos valores analíticos obtidos a um utente que não fez colheita,
gastando desta forma o hospital, recursos humanos e materiais, levando o
laboratório à algum prejuízo. A maior parte dos erros executados no ciclo
laboratorial é cometida na fase pré-analítica, cerca de 60%.
Na solicitação das análises, seja em formato eletrónico ou em papel, é necessário
adquirir a máxima e correta informação sobre o utente: o serviço requisitante, a
informação clinica, os dados completos do paciente, a data de solicitação e
carimbo.
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Na preparação do doente, necessitou-se fornecer as recomendações corretas do
preparo prévio para a colheita, no jejum, não realizar atividade física, não
consumir drogas e/ou álcool antes da colheita e evitar o stress.
1.1.1- Colheita de amostras biológicas
A avaliação das funções fisiológicas, recorrendo a exames laboratoriais é hoje
em dia importante e indispensável.
Os problemas mais comuns aquando da colheita e no armazenamento das
amostras podem ser:
Hemólise: trata-se da lise dos glóbulos vermelhos. Estes libertam lactato
desidrogenase e potássio, resultando numa amostra não representativa do estado
real do paciente. A hemólise pode ser causada por centrifugação excessiva,
agitação brusca, congelamento das células, colheita mal executada;
Hemoconcentração: acontece quando o garrote é deixado muito tempo no braço,
podendo ocorrer estase na veia e alguns constituintes do sangue podem ficar mais
concentrados em relação ao sangue, numa circulação normal;
Centrifugação: só deve ser feita depois do sangue repousar cerca de 20-30
minutos, após a colheita, para obtenção de soro;
Evaporação: quando as amostras não se encontram devidamente tapadas;
Contaminação química: quando as amostras múltiplas de sangue são obtidas com
o sistema fechado de colheita por vácuo. Os tubos de soro devem ser colhidos
antes dos tubos com anticoagulantes.
A colheita deve ser feita 12 horas após a última refeição, e a recolha deve ser
feita antes da realização de determinados procedimentos diagnósticos ou
terapêuticos. Na altura da colheita, procede-se à confirmação de toda a
informação com o utente.
As administrativas, após receberem a requisição médica e preencherem a ficha
informática, emitem e anexam as etiquetas de código de barras (tantas quanto
forem necessárias, conforme a requisição e os tubos de colheita necessários). A
etiqueta possui os seguintes elementos: nome completo, sexo, idade, serviço, nº
do processo clínico, se é urgente ou de rotina e a data da colheita.
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As amostras são rececionadas na sala de triagem, vindas das diversas unidades de
saúde do serviço de saúde da região autónoma da Madeira (SESARAM), e as
administrativas processam os pedidos de requisição. As amostras são rejeitadas
se estiverem indevidamente acondicionadas, mal vedadas e com derramamento
de produto, coaguladas, hemolisadas ou se as proporções de sangue
anticoagulante não foram respeitadas.
A colheita da amostra constitui uma das etapas mais importantes para assegurar
um resultado laboratorial correto. Representa o primeiro contato entre o
laboratório e o paciente. O sangue é o produto biológico mais utilizado no
laboratório.
O método mais comum para obter uma amostra de sangue é através de uma
punção venosa. O sangue venoso é retirado através de uma agulha e é recolhido
para uma seringa ou para um tubo de vácuo.
1.1.2- Execução da punção venosa
A execução da punção venosa, executou-se em várias etapas:
1- Preparação do utente:
Identificou-se e preparou-se o paciente: identificação completa; requisição
analítica corretamente preenchida; explicação do procedimento;
Efetuou-se um exame visual e a palpação das veias: viabilidade,
estabilidade, direção e profundidade da veia. As veias mais
frequentemente utilizadas são: veia cefálica mediana, veia cubital
mediana, veia cefálica e veia basílica;
Procedeu-se aos seguintes cuidados: seleção do braço do paciente do lado
de uma mastectomia e /ou onde fora submetido a uma infusão intravenosa,
de um local com hematoma, edema ou contusão, e de um local com
múltiplas punções;
Caso as veias anteriormente referidas não forem viáveis há outros locais de
punção: região dorsal da mão/ face plantar do pé.
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2- Preparação do material de colheita
Depois de escolhido o local de punção, deu-se a selecção do material necessário,
as etiquetas para identificação das amostras, as luvas, o algodão ou gaze
esterilizada, o álcool etílico a 70%, o adaptador para colheita por vácuo e a
butterfly ou seringa (o método mais utilizado no SPC é o sistema fechado de
colheita por vácuo tipo Vacuette)
Os tubos de vácuo mais utilizados no SPC são:
Tampa de cor amarela (bioquímica)
Possuem um gel ativador da coagulação para obtenção de soro. Os tubos para
bioquímica são revestidos internamente com partículas de sílica micronizada, as
quais ativam a coagulação quando os tubos são gentilmente invertidos. Esses
tubos contêm uma barreira de gel presente no fundo do tubo. Este material possui
densidade intermediária entre o sangue coagulado e o soro. Durante a
centrifugação, a barreira de gel move-se para cima posicionando-se entre o soro e
o coágulo, onde forma uma barreira estável, separando o soro dos outros
componentes celulares. O soro pode ser utilizado diretamente do tubo de colheita
(tubo primário). Esta barreira permite a estabilização da maioria dos parâmetros
no tubo primário, sob as condições de armazenamento recomendadas, até 48
horas.
Tampa de cor lilás (hematologia)
Com anticoagulante etilenodiaminotetraacetato tripotássico (EDTA) que é um
quelante do cálcio, forma sais de cálcio insolúveis e impede a coagulação do
sangue. As análises no setor de Hematologia são executadas em sangue total.
Tampa de cor azul (coagulação)
Com anticoagulante citrato de sódio que forma sais de cálcio e remove o cálcio.
Tampa de cor verde
A parede interna deste tubo é revestida com heparina de lítio. Esse anticoagulante
ativa as enzimas antiplaquetárias, bloqueando, assim, a coagulação em cascata
dos elementos do sangue. Normalmente são utilizados nos exames de química
clínica.
15
Cada tipo de anticoagulante exerce o seu efeito de maneira própria. A proporção
do anticoagulante em relação ao volume de sangue é uma variável importante, de
forma a evitar erros nos resultados.
3- Execução da colheita da amostra
Assegurou-se o correto posicionamento do antebraço e desinfecção do local da
punção com uma mecha de algodão, ou gaze embebida em álcool etílico a 70 %,
e deixou-se secar ao ar livre, logo de seguida:
1- aplicou-se o garrote;
2- associou-se a agulha ao adaptador;
3- descapsulou-se a agulha;
4- com o indicador ou o polegar de uma das mãos, esticou-se a pele do paciente
fixando a veia escolhida e, com o sistema agulha-adaptador na outra mão,
puncionou-se a veia com precisão e rapidez (movimento único). O sistema
agulha-adaptador deve estar a um ângulo de 15˚ em relação ao braço do paciente;
6- com a outra mão pegou-se no tubo de colheita adequado e conectou-se ao
adaptador;
7- com o tubo de colheita dentro do adaptador pressionou-se com o polegar, até
que a tampa ficasse perfurada;
8- logo que o sangue flui para dentro do tubo, retirou-se o garrote;
9- à medida que foram sendo preenchidos os tubos, homogeneizou-se
gentilmente por inversão os tubos com anticoagulante;
10- aquando da utilização último tubo, retirou-se a agulha. A agulha foi
descartada no contentor para resíduos corto-perfurantes;
11- colocou-se os tubos no suporte, devidamente identificados que de seguida
foram levados para a sala de triagem;
12- pediu-se ao paciente que exercesse pressão sobre o local da punção com
algodão, sem dobrar o braço, até que parasse de sangrar e aplicou-se um penso
rápido.
16
Considerações aquando da colheita
Todo o produto de origem humana deve ser considerado um potencial
transmissor de infeção e, como tal, manuseado de acordo com regras de
segurança. Contudo, é necessário especial cuidado com os produtos provenientes
de doentes com hepatites, sida e com patologias infecto-contagiosas.
Na prevenção do risco biológico, no ato da colheita, deve-se:
- usar luvas descartáveis de plástico ou de borracha. Se houver um risco alto,
tomar outras precauções adicionais como usar um avental de plástico descartável
e uma máscara;
- ter cuidado para prevenir feridas com agulhas e lancetas. Não manipular
agulhas usadas;
- utilizar sempre seringas, agulhas e lancetas descartáveis;
- o material usado nas colheitas (compressas e algodão) deve ser deitado no
contentor preto de PVC;
- as amostras devem ser enviadas ao laboratório em contentores próprios,
suficientemente resistentes, para evitar acidentes.
1.2- Fase analítica
Após a obtenção das amostras, seguiu-se a marcha laboratorial analítica. O
controlo desta fase analítica compreende tanto o controlo de qualidade interno
como o externo.
Esta fase compreende a execução da amostra, bem como tudo o que lhe está
inerente: as técnicas, os reagentes, os equipamentos, os controlos, os
calibradores, a refrigeração.
Monitorizou-se todos os reagentes e todas as técnicas todos os dias, com uma
especial atenção, na secção de Bioquímica, em que as técnicas são mais sensíveis
e os valores são mais “apertados” (e.g. creatinina), bem como nas secções de
Hormonologia e Imunologia.
17
1.3- Fase pós-analítica
Muito sucintamente, esta fase surge depois da fase analítica e nesta deu-se a
validação dos resultados, de acordo com a informação clínica do doente e a
entrega atempada ao médico ou ao serviço requisitante.
2- Resíduos hospitalares
Triagem e acondicionamento dos resíduos hospitalares
No SPC e em qualquer outro hospital, existem preocupações ambientais e com a
saúde pública, existindo um sistema de triagem e de acondicionamento de
resíduos em todos os sectores (quadro I).
Quadro I: Gestão de resíduos dos grupos I, II, III e IV
Resíduos dos grupos I e II
(resíduos não perigosos):
Resíduos dos grupos III e IV (resíduos
perigosos):
São resíduos equiparados a urbanos não
apresentam exigências especiais no seu
tratamento (I) e resíduos hospitalares não sujeitos
a tratamentos específicos, podendo ser
equiparados a urbanos (II).
Depositam-se nos
sacos de plástico preto e destinam-se à lixeira
comum. A título de exemplo, invólucros de
vários materiais em papel plastificado, papel
autocolante, papel encerado, papel metalizado,
toalhetes de papel, material de escritório.
São resíduos de risco biológico: resíduos
contaminados ou suspeitos de contaminação,
suscetíveis de incineração ou de outro pré-
tratamento eficaz, permitindo uma posterior
eliminação como resíduo urbano (III) e resíduos
hospitalares específicos; resíduos de vários tipos
de incineração obrigatória (IV). São depositados
nos contentores de polietileno, de cor preta, e
destinam-se à incineração. Encaixam-se nessa
categoria: tubos já analisados, frascos de reagentes
vazios, calibradores vazios, controlos utilizados,
monovettes utilizadas, compressas, qualquer
material que teve contacto com os produtos
biológicos.
Resíduos corto-perfurantes
Deu-se a colocação destes resíduos (exemplos: lâminas, agulhas e restante
material corto-perfurante que constituem um risco potencial de ocorrer acidentes
18
por picada ou corte.) nos contentores estanques e rígidos, identificados com o
símbolo de BioHazard, geralmente são de cor amarela e vermelha.
19
Microbiologia
A microbiologia médica é uma ciência que estuda a interação entre o ser humano
e os microrganismos, nomeadamente as bactérias, vírus, fungos e parasitas.
A microbiologia clínica ocupa-se primordialmente com a etiologia das doenças
infeciosas, com o estudo da suscetibilidade aos antimicrobianos e o controlo da
infeção associada aos cuidados de saúde. Esta valência no Hospital Dr. Nélio
Mendonça está dividida em 5 secções: Bacteriologia I; Serologia; Biologia
Molecular, que dão apoio aos vários hospitais, a Bacteriologia II e secção de
Parasitologia / Urinas direcionadas essencialmente para a saúde pública.
Na secção de Bacteriologia I, na qual realizei o meu estágio, deu-se resposta ao
diagnóstico hospitalar, desde consulta externas e serviços de internamento dos
três Hospitais (H. Dr. Nélio Mendonça (HNM), H. dos Marmeleiros e o H. Dr.
João de Almada) incluindo o Serviço de Urgência.
Na secção de Bacteriologia II, respondeu-se aos pedidos de todos os centros de
saúde da região e da unidade Dr. Agostinho Cardoso.
A secção de Serologia contempla as anteriores Bacteriologias, I e II e é onde se
realizaram análises de biologia molecular e micobacteriológico.
Na secção de Parasitologia e Urinas, executou-se a análise sumária da urina
(urinas Tipo II), as pesquisas de parasitas e também de sangue oculto nas fezes.
O meu estágio teve a duração de dois meses, durante os quais acompanhei as
secções de Bacteriologia I, onde permaneci por um período maior, da Serologia e
da Parasitologia/Urinas.
20
I- Bacteriologia
No campo das doenças infeciosas, os resultados laboratoriais dependem, em
grande parte, da qualidade da amostra, do momento em que o produto é colhido,
dos cuidados a ter com a sua manipulação, bem como dos conhecimentos e
experiência dos profissionais.
Na maior parte dos casos de doença infeciosa, o diagnóstico de entrada feita pelo
médico é um diagnóstico presuntivo, tendo em conta os sinais e sintomas
apresentados pelo doente, sendo o diagnóstico definitivo realizado aquando da
identificação do agente patogénico.
O diagnóstico microbiológico abrange a caracterização de milhares de agentes
que provocam doenças infeciosas ou estão associadas a elas, sejam elas causadas
por bactérias, vírus, parasitas e fungos. As técnicas utilizadas para caracterizar
estes agentes infeciosos dependem da clínica e do tipo de agente que está a ser
investigado, tendo em conta, sempre, a flora normal da amostra para saber o que
realmente é patológico a fim de fazer uma correta reportação de resultados.
Nenhum teste, por si só, permite o isolamento ou a caracterização de todos os
organismos patogénicos potenciais. As informações clínicas do paciente e toda a
diagnóstica envolvente, como a Bioquímica ou a Hematologia, são de extrema
importância e um auxílio para um correto diagnóstico com a máxima qualidade e
fidelidade.
A maior parte dos microrganismos patogénicos cresce lentamente, levando no
mínimo 24 horas ou mais, dias ou mesmo até semanas, para o seu isolamento e
identificação. Porém o tratamento a administrar ao paciente não pode ser adiado
até que esse processo tenha sido concluído. Após a obtenção das amostras
adequadas e da informação do diagnóstico clínico presuntivo ao laboratório, o
médico inicia o tratamento antibiótico empírico contra o(s) microrganismo(s),
eventuais responsáveis pela infeção do paciente. Quando obtém resultados do
laboratório o médico poderá ponderar a eventual mudança de terapêutica e
reavaliar o diagnóstico. Essas informações por parte do laboratório consistem em
21
relatórios preliminares dos resultados, obtidos em cada etapa de isolamento e
identificação do agente etiológico da doença.
I- 1- Diagnóstico das infeções bacterianas e fúngicas
O exame laboratorial bacteriológico iniciou-se com o exame direto, seguindo-se
do exame cultural, ambos realizados em ambiente estéril. Se for isolado um
microrganismo específico na cultura passa-se à respetiva identificação e a
avaliação quanto a sua suscetibilidade aos antimicrobianos.
Utilizou-se os seguintes procedimentos laboratoriais (metodologia) no
diagnóstico clínico das causas infeciosas:
- Exame macroscópico;
- Exame microscópico;
- Sementeira em meios de cultura adequados para o enriquecimento, isolamento e
seleção de colónias;
- Caraterização das bactérias patogénicas ou potencialmente patogênicas
isoladas:
Caraterísticas morfológicas;
Caraterísticas culturais;
Caraterísticas tintoriais;
Caraterísticas bioquímicas;
Estrutura antigénica;
- Provas de sensibilidade aos agentes quimioterapêuticos e a respetiva
interpretação de acordo com o microrganismo identificado e origem do produto a
partir do qual foi isolado;
- Deteção do antigénio do agente por ensaio imunológico (aglutinação do latex)
ou anticorpos marcados com fluoresceína ou com peroxidase (Serologia);
- Hibridização DNA-DNA ou DNA-RNA para a deteção de genes específicos do
agente patogénico nas amostras do paciente (biologia molecular).
22
I- 1.1- Amostras
Deu-se a identificação adequada da amostra e rotulação, com a introdução da
informação clínica relevante ao diagnóstico, os dados de identificação do
paciente, a identificação do médico e serviço requisitante. Estes critérios estão
enquadrados na fase pré-analítica, tanto na microbiologia, como nas outras
valências do SPC, dado que um erro a esse nível pode comprometer as fases
seguintes: a analítica e a pós-analítica.
Uma colheita correta da amostra constitui uma das etapas mais importantes da
marcha laboratorial, visto que os resultados vão depender em grande parte desta
etapa (pré-analítica).
A amostra deve ser obtida do local que provavelmente há presença do agente
infecioso (num determinado estadio da doença), devendo ser manipulada de
modo a favorecer a sua sobrevida e crescimento do microrganismo.
Algumas regras gerais da colheita e manipulação das amostras:
a) a quantidade de material deve ser adequada e bem representativa (e.g. uma
amostra salivar em vez de uma expetoração);
b) obtenção de amostras significativas para o diagnóstico preferencialmente antes
da administração de antimicrobianos;
c) evitar a contaminação da amostra , utilizando apenas equipamento estéril e
sempre com precauções assépticas;
d) a amostra deve ser levada de imediato para o laboratório e processada o mais
rapidamente possível.
Acompanhou-se a rotina do laboratório, e adquiriu-se treino na execução do
exame bacteriológico de diferentes produtos:
- urina;
- sangue;
- expetoração (EXP), secreções brônquicas (SB), aspirado traqueal (AT), lavado
bronco-alveolar (LBA);
- exsudados nasais, faríngeos, ocular e ouvido;
23
- pus e líquidos biológicos (LCR, L. ascítico, L. pleural, L. peritoneal, L.
pericárdico e L. sinovial);
- exsudado vaginal, uretral e perianal;
- fezes;
- pontas de cateter.
I- 1.2- Exame microscópico
O exame macroscópico é a primeira etapa do estudo, seguido do exame
microscópico e identificação de um microrganismo com a observação e análise
da forma, tamanho e organização/agrupamento dos microrganismos.
o Exame a fresco
O exame a fresco é utilizado por e.g. no estudo das urinas, com a visualização do
sedimento urinário (e.g. com a presença de leucócitos em caso de infeção) e no
estudo micológico no exsudado vaginal para a visualização de elementos
leveduriformes (Candida albicans). Este tipo de exame é utilizado sempre que
necessário ou em caso de dúvidas.
o Exame direto
O exame direto constitui um método relativamente simples, permite o
diagnóstico presuntivo devendo ser sempre acompanhado pelo exame cultural. É
um exame de baixo custo e institui-se como uma ferramenta de apoio à
identificação do microrganismo (embora muito menos sensível que o exame
cultural).
No laboratório são efetuados dois tipos de coloração: a coloração pelo método de
Gram; a coloração para as bactérias álcool-ácido resistentes (BAAR) de Ziehl-
Neelsen:
24
Coloração pelo método de Gram
Constitui um procedimento de grande utilidade no diagnóstico microbiológico.
Quando há suspeita de infeção bacteriana, deve-se efetuar um esfregaço, corado
pelo método de Gram, figura 1, e examinadas ao microscópio
Fig. 1: Coloração pelo método de Gram.
Os corantes combinam-se quimicamente com o protoplasma bacteriano. Se a
célula ainda não estiver morta, o próprio processo de coloração irá destruí-la.
Os corantes mais utilizados são os sais. Os corantes básicos consistem num
catião dotado de cor com um anião incolor e os corantes ácidos comportam-se de
modo inverso.
As células bacterianas são ricas em ácido nucleico, que apresentam cargas
negativas na forma de grupos fosfato que se combinam com os corantes básicos
de carga positiva. Os corantes ácidos não coram as células bacterianas e podem
ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante. Os
corantes básicos coram uniformemente as células bacterianas, a não ser que o
RNA citoplasmático seja inicialmente destruído. Entretanto, podem-se utilizar
técnicas especiais de coloração para diferenciar flagelos, cápsulas, paredes
celulares, membranas celulares, grânulos, núcleos e esporos.
1.Fixação com calor ou álcool 96%: 1min.;
2.Cobrir com solução de cristal de violeta: 1
min.;
3.Lavar com H2O;
4.Cobrir com Iodo: 5 min.;
6.Descorar álcool-acetona: 10 a 30s;
7. Cobrir com Safranina: 1min.;
8. Lavar com H2O e secar.
25
Coloração de Ziehl-Neelsen
Utilizada para corar as BAAR, que são aquelas que retêm carbol-fucsina (fucsina
básica dissolvida numa mistura de fenol-álcool-água), mesmo quando descoradas
com ácido clorídrico em álcool. Um esfregaço de células em lâmina é banhado
com carbol-fucsina e aquecido em vapor, procedimento após o qual a
descoloração com ácido- álcool é efetuada. Por fim, aplica-se um contra corante
contrastante (azul de metileno). As BAAR (micobactérias e alguns dos
actinomicetos relacionados) adquirem cor vermelha, enquanto as outras
apresentam a cor do contra corante.
Os verdadeiros bacilos da tuberculose caracterizam-se pela sua álcool-ácido-
resistência, isto é, o álcool etílico a 95% contendo 3% de ácido clorídrico
descolora rapidamente todas as bactérias, exceto as micobactérias. As amostras
destinadas à pesquisa de BAAR, são para a pesquisa de Mycobacterium
tuberculosis. Estas são pesquisadas normalmente no trato respiratório no LBA,
na EXP, nas SB, no LCR e no suco gástrico.
Na bacteriologia, só se realizam as colorações para suspeita de tuberculose,
sendo o resto do diagnóstico realizado na Serologia: o exame cultural, o teste de
sensibilidade antibiótica (TSA) e também a confirmação por Biologia Molecular.
Sendo a M. tuberculosis a BAAR mais comum, as amostras de excelência
destinadas para a sua pesquisa são: LCR, lavado bronco alveolar e suco gástrico.
No exame direto, corado pelo método de Gram, os microrganismos Gram +
apresentam uma coloração púrpura-azulada, ao passo que a cor vermelha é
indicadora de microrganismos Gram -. Este exame também permite avaliar a
morfologia (cocos, bacilos, vibrião, etc.) das bactérias (fig.2).
26
Fig.2: Morfologia bacteriana.
Embora não permitindo a identificação da espécie, clarifica-nos apenas se são
bactérias gram-positivas ou gram-negativas, e também se são cocos, bacilos,
diplococos. Este método de Gram permite realizar um diagnóstico presuntivo e
orientar o estudo para a identificação do microrganismo, por exemplo, se forem
observados cocos gram-positivos dispostos em cadeia são sugestivos de
estreptococos e cocos gram-positivos dispostos em cacho são sugestivos de
estafilococos. Algumas bactérias gram-positivas não viáveis podem exibir
coloração gram-negativa, daí a importância de uma boa coloração para que não
haja enganos na identificação do tipo de bactérias presentes.
o Exame cultural
O exame cultural consiste em semear amostras biológicas, em meios de cultura,
gerais ou seletivos. Este processo é feito em meio próprio (culturas) que permita
a nutrição, o crescimento e a multiplicação de microrganismos. Para cada
produto biológico, são utilizados diferentes meios, consoante os microrganismos
possíveis de se encontrar nessa amostra e o diagnóstico clínico do doente. Este
exame permite, também, a identificação do género/espécie do agente causador da
infeção.
27
Nota: Para a realização do exame cultural, a amostra deve conter pelo menos 105
microrganismos por mililitro (mo/ml) para que possam ser detetados num
esfregaço. O meio de cultura líquido contendo 105mo/ml tem um aspeto
macroscopicamente turvo, que também pode ser observado em algumas amostras
líquidas (urina turva pode ser um sinal de infeção). Nas amostras que contêm 102
a 103 mo/ml há crescimento em meios sólidos de culturas, enquanto as que
contêm 10 mo/ml ou menos bactérias podem produzir crescimentos em meios
líquidos, sendo estes meios utilizados apenas para enriquecimentos para garantir
o crescimento da bactéria.
I- 1.3- Meios de cultura sólidos
Os meios de cultura utilizados para a realização do exame cultural, são muito
mais sensíveis e específicos que o exame direto.
Para o diagnóstico bacteriológico utilizaram-se vários meios de cultura gerais,
seletivos e diferenciais para as bactérias aeróbias, as anaeróbias facultativas e
obrigatórias.
O conhecimento sobre os mecanismos e exigências da nutrição microbiana
permite, aos microbiologistas, cultivar microrganismos em laboratório, usando
meios de cultura adequados. Uma má escolha do tipo de meio compromete, de
certo modo, a amostra e o tempo de identificação. Nos meios de cultura, os
microrganismos multiplicam-se, o que vai permitir isola-los e identifica-los. Para
além dos nutrientes necessários às exigências dos microrganismos, os meios de
cultura devem ser estéreis.
Para caracterizar individualmente um microrganismo, é necessário obtê-lo em
cultura pura (apenas um tipo de microrganismo). Essas culturas podem ser
obtidas pelos métodos de estrias ou de espalhamento em placa, obtendo-se
colónias, que são visíveis macroscopicamente e são provenientes da
multiplicação celular. À partida, as colónias individualizadas e bem distanciadas
umas das outras, são originadas, em princípio a partir de uma única célula.
O isolamento de uma estirpe bacteriana, em cultura pura a partir de uma cultura
mista (cultura que tem mais do que um tipo de microrganismos), requer o uso de
28
meios de cultura seletivos e/ou diferenciais. Os meios seletivos são formulados
para suprimir o crescimento dos microrganismos que não interessam, permitindo
o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar.
I- 1.3.1- Meios de cultura não seletivos
Meios de cultura não seletivos utilizados na Bacteriologia do HNM:
Gelose de sangue
É um meio de cultura padrão para qualquer tipo de amostra. Geralmente
preparado com 5% de sangue de carneiro, sendo um meio geral, permite a
deteção da maioria dos microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos,
bactérias exigentes e também permite a evidência de hemólise.
Gelose de chocolate Polivitex
É um meio que contém sangue aquecido com ou sem suplementos sendo um
meio não seletivo. Alguns microrganismos que não crescem em gelose de sangue
como a Neisseria spp. e Haemophilus spp. patogénicos e crescem nesta gelose.
Muller-Hinton
Este meio usou-se para o estudo da suscetibilidade aos antimicrobianos.
I- 1.3.2- Meios seletivos
Meios seletivos utilizados:
Gelose chocolate PolyVitex V.C.A.T
Normalmente denominada por gelose de chocolate. Pode ser suplementada para o
isolamento de determinadas bactérias, uma vez que inclui os seguintes
antibióticos vancomicina, colistina, anfotericina e trimetropim – com incubação a
35ºC em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, o que provoca o isolamento de
Neisseria gonorrhoeae em amostras com flora autóctone, mais utilizado para os
gonococos, visto que é uma bactéria muito exigente.
A gelose chocolate com bacitracina vai favorecer o crescimento de Haemophilus
spp. nos produtos com flora mista, devido à inibição das bactérias gram-positivas
e a maioria das Neisserias spp..
29
Gelose MacConkey (McK)
É um meio de cultura seletivo para bactérias gram-negativas suprimindo as gram-
positivas (através dos sais biliares).
Num meio diferencial podem crescer vários tipos de microrganismos, mas devido
ao diferente aspeto que tomam nesse meio, podem distinguir-se entre si as
colónias microbianas (e.g. o meio de cultura McK contém lactose e vermelho
neutro, um indicador de pH que é amarelo, a pH neutro, e rosa ou vermelho, a pH
ácido. A Escherichia coli fermenta lactose e produz ácidos originando nesse
meio colónias vermelhas ou rosa. A Salmonella, não fermenta a lactose, origina
colónias incolores nesse meio, ou seja, a presença de lactose permite diferenciar
as bactérias fermentadoras das não fermentadoras).
As amostras que são semeadas para a pesquisa de anaeróbios obrigatórios devem
ser semeadas em pelo menos dois tipos de meios, um que seja enriquecido e
suplementado e um meio seletivo contendo substâncias que inibem o crescimento
de bacilos gram-negativos e cocos gram-positivos anaeróbios facultativos.
Gelose de Chapman (manitol salgado)
É um o meio de cultura que favorece o crescimento dos gram-positivos,
precisamente para o isolamento de Staphylococcus spp. e identificação
presuntiva de S. aureus (fermentação do manitol).
Gelose de CNA (meio de azido)
Gelose com sangue, colistina e ácido nalidíxico, onde a colistina e o ácido
nalidíxico inibem o crescimento das Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp., o
que torna o meio seletivo para bactérias gram-positivas. Contudo, algumas
bactérias gram-negativas como Gardnerella vaginalis e alguns Bacteroides spp.
também se desenvolvem neste meio.
Gelose CLED (cistina- lactose - défice de eletrólitos)
É um meio não seletivo, diferencial, que vai permitir o isolamento dos agentes
mais frequentes de infeção urinária. A insuficiência de eletrólitos inibe o
30
“swarming” dos Proteus spp. e a lactose permite diferenciar os fermentadores dos
não fermentadores.
Gelose Salmonella & Shigella (SS)
Para a cultura de fezes existem meios específicos, seletivos e diferenciais como,
por exemplo, a gelose SS que favorece o crescimento da Salmonella e da
Shigella e o seu isolamento. As colónias distinguem-se pela cor. Este meio inibe
também dos “coliformes” pelo verde brilhante e sais biliares. A presença de sais
de ferro permite a deteção das estirpes produtoras de H2S.
Gelose SMID
É um meio cromogéneo para o isolamento seletivo e de diferenciação destinado à
deteção das Salmonella a partir de fezes
A coloração das colónias obtém-se através da associação de substratos:
- Dois substratos nutritivos hidrocarbonados (sorbitol e glucuronato) combinados
com um indicador colorido (vermelho neutro) que provoca a coloração rosa das
colónias de Salmonella;
- Dois substratos cromogéneos que provocam a coloração azul das colónias que
possuem uma β-glucosidade (não Salmonella).
Gelose campylobacter
É um meio para campylobacter, requer uma temperatura muito particular de
crescimento, os 42ºC durante 3 dias.
Gelose sorbitol
É um meio cromogéneo específico para Escheriachia coli O157, em que as
colónias apresentam-se de cor violeta. Se houver outro tipo de bactérias no meio,
estas apresentam-se de cor azul metálico. A incubação é durante 18h, a uma
temperatura de 35-37ºC.
31
Gelose sabouraud
Para o isolamento de fungos, é um meio que possui essencialmente glicose.
Muitas leveduras crescem em ágar de sangue. Os fungos dimórficos, na fase de
micélio crescem bem em meio sabouraud. As culturas para fungos costumam ser
efetuadas em duplicado, sendo um conjunto incubado entre 25 e 30ºC e o outro
entre 35 e 37ºC (isto em zonas endémicas com essas temperaturas que
desenvolvam esse tipo de fungos).
Gelose candida (CAN)
É um meio seletivo e cromogénico destinado ao isolamento das leveduras, à
identificação imediata de Candida albicans e à diferenciação de um conjunto de
espécies agrupando C. tropicalis, C. lusitaniae e C. Kefyr.
A hidrólise específica de um substrato cromogéneo de hexosaminidase na
presença de um indutor da enzima leva à coloração azul das colónias de C.
albicans. A hidrólise de um segundo substrato permite diferenciar as culturas
mistas e orientar a identificação para as outras espécies. As colónias que
hidrolisam este substrato são pigmentadas a rosa.
A inibição da flora bacteriana é obtida pela adição de uma mistura de
antibióticos.
Gelose de Lowenstein-jensen
Para a cultura das micobactérias (realizado na Serologia) é utilizado o meio
sólido com uma incubação até 45 dias. As culturas são observadas
periodicamente durante o período de incubação, ao fim do qual, se não houver
crescimento, é dado como resultado negativo. A colónia da micobactéria é muito
particular, sendo em forma de couve-flor. É utilizado também um meio líquido
de referência que leva ao crescimento mais rápido destas colónias do que no
meio sólido.
32
I- 1.4- Meios líquidos de enriquecimento
As culturas em caldo em meios altamente enriquecidos, os caldos de carne, são
importantes para culturas de líquidos biológicos e tecidos obtidos de biópsia.
Caldo Cooked Meat Medium (caldo de carne) e caldo Todd Hewitt
Meio líquido em tubo para o crescimento de micro-organismos.
Caldo selenito
Os meios de cultura que permitem o crescimento de uma espécie bacteriana em
detrimento de outras, caldo selenito ou caldo de tetrationato permitem o
crescimento de Salmonella a partir de fezes, sem o crescimento da flora
autóctone existente no intestino. A subcultura para meio sólido deve ocorrer
entre as 6 e 12 horas, pois esse é o prazo médio de inibição de outras estirpes, tal
como o Proteus spp..
Granada (IGLB) - caldo bifásico
Meio seletivo para o rastreio e a identificação dos estreptococos do grupo B (S.
agalactiae).
Frascos de hemocultura BACTECTM
Os meios existentes nestas garrafas são constituídos por:
- caldo nutritivo próprio para aeróbios, anaeróbios e fungos, de acordo com a
garrafa em questão;
- anticoagulante, para além da sua atividade anticoagulante, tem uma ação
fagocítica e anti-complemento e inativa parcialmente alguns antibióticos;
- penicilinase, que inativa certas penicilinas e outros antibióticos β-lactâmicos
presente no sangue do doente;
- resinas, inativam a maioria dos antibióticos pela absorção dos mesmos à
superfície das partículas de resina e outros componentes específicos do meio.
33
I- 1.5- Geradores
Há técnicas especiais de crescimento para microrganismos anaeróbios e
microaerofílicos. Os anaeróbios estritos exigem uma ausência total de oxigénio
para o seu crescimento, enquanto os microaerófilos requerem cerca de 5% de O2.
Para isso, estão disponíveis comercialmente geradores que permitem obter as
diferentes atmosferas necessárias para a cultura de microrganismos patogénicos
em laboratório, em CO2, microaerofilia e anaerobiose. Para a anaerobiose,
incuba-se 24 horas a 37˚C usando o Genbox anaer. Para o meio em CO2 incuba-
se 24 horas a 37˚C usando o Genbox CO2. Para obter uma atmosfera
microaerofílica, incuba-se 72 horas a 42˚C usando também o Genbox.
I- 1.6- Floras bacterianas e fúngicas normais
O termo “flora normal” refere-se à população de microrganismos que habita
normalmente num dado local anatómico (pele e nas mucosas) dos indivíduos
saudáveis. Alguns microrganismos, como a Mycobacterium tuberculosis, a
Salmonella thyphi e as espécies da Brucella spp., são considerados bactéricas
patogénicas sempre que encontradas em pacientes.
Muitas infeções são causadas por microrganismos que fazem parte da flora
normal ou que colonizam transitoriamente um determinado local anatómico,
como e.g., a Escherichia coli, que faz parte da flora gastrointestinal normal e
constitui a causa mais comum das infeções do trato urinário. Da mesma forma, a
grande maioria das infeções bacterianas mistas por anaeróbios é causada por
microrganismos que fazem parte da flora normal.
O número relativo de microrganismos encontrados numa cultura é importante
quando se trata de microrganismos da flora normal. Quando existe um
predomínio, poderá ser ele o próprio o responsável pela infeção. Por e.g. sempre
que os bacilos gram-negativos são numerosos como a Klebsiella pneumoniae,
estas são encontradas em associação a algumas bactérias nasofaríngeas normais
em amostras como a expetoração. Os bacilos gram-negativos são fortemente
suspeitos como causa da pneumonia, visto que normalmente não se encontram
em grande número na expetoração ou nas secreções brônquicas como também na
34
flora nasofaríngea, logo, é necessário proceder à identificação destes
microrganismos.
Já os abcessos abdominais costumam conter uma distribuição normal de
microrganismos aeróbios, anaeróbios facultativos e anaeróbios obrigatórios
representativos da flora gastrointestinal. Nestes casos, não se justifica a
identificação de todas as espécies presentes, sendo significativo as três
predominantes, comparando-as com a flora normal gastrointestinal e logo que
possível reportando-as ao médico.
Os fungos, em pequeno número, podem fazer parte da flora normal, sobretudo,
nos locais anatómicos com comunicação com o exterior, e.g. o nariz, os ouvidos.
Normalmente, não estão presentes em zonas profundas, do aparelho respiratório
inferior, e.g. nos pulmões, desta forma quando encontrados (e.g. Aspergillus
spp.) têm de ser estudados, identificados e reportados.
Segue-se a tabela I com alguns os microrganismos residentes na flora normal nos
diferentes tratos, nomeadamente, da pele, da nasofaringe, do gastrointestinal e
por fim no genital.
35
Tabela I: Flora normal nos indivíduos saudáveis.
Bactérias da flora normal
Pele
Staphylococcus epidermidis; Staphylococcus aureus (em <nº); Micrococcus
spp.; Neisseria spp. não-patogénicas; Estreptococos α-hemolíticos e não-
hemolíticos; Difteróides; Proponibacterium spp.; Peptostreptococcus spp.;
Outros microrganismos em < nº: Candida spp., Acinobacter spp..
Nasofaringe
- Qualquer quantidade observada dos seguintes microrganismos:
Difteroides, Neisseria spp. não-patogénicas, Estreptococos α-hemolíticos e
não-hemolíticos, Staphylococcus epidermidis, anaeróbios (e.g. cocos
anaeróbios, Fusobacterium spp.).
- Em menor número, os seguintes microrganismos quando acompanhados com
os citados anteriormente:
Leveduras, Haemophilus spp., pneumococos, Staphylococcus aureus, bacilos
gram-negativos, Neisseria meningitidis.
Gastrointestinal
Várias enterobactérias, exceto Salmonella spp., Shigella spp., Yersínia spp.,
Vibrio e Campylobacter .
Bacilos gram-negativos não-fermentadores de glicose, Enterococos,
Estreptococos α-hemolíticos e não-hemolíticos, Difteroides, Staphylococcus
aureus e Leveduras (em pequeno nº) anaeróbios em grande número (e.g.
Bacteroides fragilis, Fusobacterium spp., Clostridium perfringens e
Bifidobacterium spp.-lactobacilos anaeróbios)
Genital
Qualquer quantidade observada dos seguintes microrganismos:
Corynebacterium spp e Lactobacillus spp.,estreptococos α-hemolíticos e não-
hemolíticos, Neisseria spp. não-patogénicas.
Os seguintes microrganismos quando presentes e não predominantes:
enterococos, enterobactérias e outros bacilos gram-negativos, Staphylococcus
epidermidis, Candida albicans e outras leveduras.
Anaeróbios; quando em crescimento puro ou nitidamente predominante o
Clostridium spp. e Peptostreptococcus spp. podem ser importantes. O
estreptococo do grupo B faz parte da flora em 25% nas mulheres durante o
período da gravidez, o que é preocupante na altura do parto passe para o bebé
o que pode levar a uma sépsis neonatal e meningite (no último trimestre).
36
O isolamento de bactérias e fungos são de uma importância significativa se o
microrganismo for isolado de um local normalmente estéril, ou seja desprovido
de microrganismos como, por exemplo, o sangue ou líquidos biológicos. No
entanto, muitas partes do corpo possuem uma flora microbiana normal que pode
ser alterada por influência endógena ou exógena e o isolamento de
microrganismos potenciais nestes locais, como e.g. nas vias respiratórias, na
pele, no trato intestinal, devem ser considerados no contexto da flora normal de
cada trato.
37
I- 2- Provas de identificação de bactérias e fungos leveduriformes
Na secção realizou-se alguns métodos de identificação dos vários
microrganismos, tais como:
● Provas “rápidas” de caracterização bioquímica, nomeadamente: a prova da
coagulase (a coagulase liga-se à protrombina e juntas tornam-se enzimaticamente
activas iniciando o processo de polimerização) é muito importante para distinguir
os Staphylococcus spp. de coagulase negativa da positiva; a prova da catalase
(converte o peróxido de hidrogénio em H2O e O2), um exemplo, é na
diferenciação de um estafilococo (positivo) de um estreptococo (negativo);
● Provas de suscetibilidade a antibióticos: optoquina, novobiocina e a
bacitracina;
● Provas com discos impregnados com fatores de crescimento (fator X:hemina e
V:NAD);
● Prova de filamentação para a identificação presuntiva de Candida albicans;
● Testes imunoquímicos:
- aglutinação com partículas de látex (Identificação de Streptococcus β-
hemolíticos do grupo A, B, C, G e F);
- aglutinação direta para a caracterização antigénica de Salmonella,
Shigella e E. coli O157:H7.;
● Galerias de identificação manual, Api®
/ID 32, consistem em testes
bioquímicos, com leitura visual ou automática, por comparação com uma base de
dados:
- Api 20 Strepto, para identificação de Streptococcus spp.;
- Api NH, para identificação de Haemophilus spp. e Neisseria spp.;
- Api 20E, para identificação de Enterobacteriaceae;
38
-Api 20 NE, para identificação de bactérias Gram negativas não
fermentativas;
- Api Coryne, para identificação de Corynobacteriaceae;
- Api Campy, para identificação de Campylobacter;
- ID 32 C, para identificação de fungos;
● Sistema de identificação Vitek.
39
I- 3- Processamento dos produtos para exame bacteriológico
I- 3.1- Urina
A infeção do trato urinário (ITU) é a infeção mais comum no homem. A urina é
um produto estéril. A uretra possui a sua flora normal. Quando a urina normal é
eliminada, contém um pequeno número de bactérias. Como é necessário
distinguir os microrganismos contaminantes dos etiologicamente importantes,
apenas o exame quantitativo da urina pode fornecer resultados significativos.
A colheita da amostra é muito importante visto que, se não houver uma boa
colheita, facilmente esta se contamina e torna-se necessária a sua repetição. Para
que isso não aconteça, tem de haver uma boa higienização dos órgãos genitais
exteriores antes da colheita da amostra, devendo ser colhida urina do jacto médio
e colocada num recipiente estéril.
Nos doentes algaliados, a amostra nunca deve ser obtida do saco coletor mas sim
por punção da algália, após clampagem, com a respetiva desinfeção. É necessário
transmitir essa informação ao laboratório, visto que estas urinas normalmente
vêm contaminadas por mais que um microrganismo (sendo apenas um só
microrganismo o causador da infeção).
É necessário ter atenção ao analisar as urinas, a condição clínica em que o
paciente se encontra, se provêm do ambulatório, se está hospitalizado, se está
algaliado, ITU sucessivas, com ou sem antibioterapia.
Devido à rápida multiplicação dos microrganismos na urina à temperatura
ambiente, estas amostras devem ser rapidamente levadas até ao SPC ou
refrigeradas sem ultrapassar uma noite.
O sedimento urinário realizou-se após uma centrifugação e, posteriormente, são
analisados ao microscópio: o nº de leucócitos, das células epiteliais, dos
eritrócitos e a presença de leveduras. A presença de muitos leucócitos bem como
de eritrócitos faz suspeitar de uma infeção. A observação de numerosas células
epiteliais escamosas, de lactobacilos ou flora mista, sugere uma má colheita.
O exame cultural na urocultura, para ser significativa tem que ser efetuada de
modo quantitativo.
40
O Uriline®, o meio de cultura usado na secção, é também um meio de transporte,
que consiste num recipiente estéril, contendo uma lâmina com 2 meios de cultura
sólidos contrapostos: o CLED (meio geral) e o McK. (meio seletivo para gram-
negativos).
Após a incubação da amostra, confirmou-se, se a bacteriúria era positiva (igual
ou superior a 105 colónias/mililitro), e em caso ser positiva, verificou-se se a
cultura era pura (presença de 1 microrganismo), caso contrário, seria necessário
proceder a novo isolamento para os meios sólidos (geralmente para gelose McK,
gelose manitol chapman, gelose azido e gelose Candida).
Incuba-se os meios durante 24 horas à 37ºC. Findo este tempo, se as colónias já
se apresentarem puras, efetuam-se o seu estudo de identificação e antibiograma.
Se a cultura se encontrar pura logo de início, o microrganismo já pode ser
identificado e efetuar o antibiograma.
São realizadas reservas das placas primárias para uma gelose de sangue e McK
caso sejam positivas, com o intuito de confirmar se a cultura se encontra mesmo
pura ou se existe mais que um microrganismo.
Notas:
- Quando as culturas se encontram puras, há provas rápidas de identificação
como já foi anteriormente referido, como a catalase. Há evidências que têm de
ser levadas em conta, como as características morfológicas das colónias, o odor,
se são lactose+ ou lactose – (bactérias que fermentam ou não a lactose) e o teste
da oxidase (Pseudomonas são oxidase +). Por e.g. a Escherichia coli que é o
microrganismo mais predominante nas ITU tem características muito
particulares, as colónias são secas, pequenas, vermelhas tem um cheiro
característico e não fermentam a lactose.
- Quando a cultura se encontra com mais de um microrganismo sem predomínio
é sugerido repetição de colheita. A condição clínica em que o paciente se
encontra (algaliado, doente renal, má colheita, falta de higienização) tem de ser
sempre tida em conta no estudo da análise de urina asséptica.
41
I- 3.2- Hemocultura
A hemocultura é uma análise que consiste na deteção de uma infeção sistémica
causada por bactérias e fungos. A hemocultura fornece informações na
abordagem de pacientes com picos febris associados a complicações clínicas com
ou sem sinais e sintomas localizados e também na suspeita de endocardite
infeciosa.
Nos indivíduos sem infeção generalizada, a amostra de sangue devidamente
obtida deverá ser estéril, embora os microrganismos provenientes das floras,
respiratória e gastrointestinais normais possam penetrar na corrente sanguínea,
mas são rapidamente removidos pelo sistema reticuloendotelial. Estes
microrganismos transitórios, raramente, afetam na interpretação das
hemoculturas positivas.
A secção de Bacteriologia dispõe de um equipamento, o Bactec 9240, que
permite detetar a positividade das hemoculturas. Este equipamento é de rápida
deteção de bactérias e fungos em amostras clínicas de sangue. As amostras são
colhidas dos pacientes e injetadas diretamente nos frascos de cultura Bactec.
Existem 4 tipos de frascos de hemocultura:
- frasco pediátrico: Bactec Péds Plus;
- frasco adulto aeróbio: Bactec Plus + Aerobic;
- frasco adulto anaeróbio: Bactec Plus + Anaerobic;
- frasco micológico.
Quando as hemoculturas chegam ao laboratório, colocam-se no Bactec, ficando a
incubar durante 5 dias. Este procedimento não se aplica aos fungos que ficam a
incubar durante 14 dias, a uma temperatura de 37ºC.
Na presença de microrganismos, os nutrientes do meio de cultura são
metabolizados libertando dióxido de carbono. É assim modulada a quantidade de
luz absorvida pelo material fluorescente do sensor. Os fotodetetores do
instrumento medem o nível de fluorescência a cada dez minutos, que
corresponde à quantidade de CO2 libertada pelos microrganismos. A medição é
então interpretada pelo sistema de acordo com parâmetros de positividade pré-
42
programados. Uma leitura positiva indica a presença presuntiva de
microrganismos viáveis no frasco.
Quando o equipamento deteta positividade (é necessário excluir uma
contaminação, que na maior parte das vezes acontece através da flora da pele,
devido a erros procedidos durante a colheita). Efetuam-se subculturas para meios
de cultura sólidos e exame direto pela coloração de Gram, consoante o respetivo
frasco:
Frasco pediátrico e frasco adulto aeróbio:
- gelose de sangue
- gelose manitol Chapman
- gelose chocolate polyvitex (em jarra CO2)
Frasco adulto anaeróbio:
- gelose de sangue em anerobiose
- gelose de chocolate polyvitex
Frasco micológico:
- gelose de Sabouraud
- gelose de sangue
Nota: O crescimento de microrganismos da flora normal da pele (e.g.
Staphilococcus epidermidis) ou cocos gram-positivos anaeróbios em apenas uma
das várias culturas sugere contaminação, mas, se estes microrganismos crescerem
em mais de uma cultura, aumenta a probabilidade de ser mesmo uma
bacteriémia.
Os fungos raramente são isolados no sangue.
43
I- 3.3- Vias respiratórias: superiores e inferiores
Segundo os sinais e sintomas clínicos do paciente, vão indicar o
comprometimento de determinada área das vias respiratórias, superior ou
inferior, sendo a colheita efetuada de acordo com a suspeita.
I- 3.3.1- Vias respiratórias superiores
Exsudado faríngeo
Nas vias respiratórias superiores, o microrganismo de principal interesse é o
estreptococo beta-hemolítico do grupo A, um dos principais responsáveis por
infeções respiratórias altas, nomeadamente, amigdalite, faringite e a escarlatina.
Torna-se muito importante diferenciar as infeções por estreptococos do grupo A
de outras infeções (por e.g. infeções virais) de modo a prescrição terapêutica ser
adequada ao doente. O diagnóstico precoce destas infeções permite reduzir a
severidade dos sintomas.
Realizou-se o exame direto em esfregaço por coloração de Gram e o exame
cultural em gelose de sangue e caldo Todd e incubou-se a 35-37ºC durante 24h,
para colocar em evidência e identificar o agente infecioso.
Aquando da solicitação do teste rápido para a pesquisa do antigénio do
estreptococcos do grupo A, utilizou-se a técnica de imunocromatografia
(Streptatest®) que permite a deteção direta do antigénio específico do
estreptococo do grupo A a partir de uma amostra colhida em zaragatoa, tornando
o diagnóstico rápido (5 minutos).
I- 3.3.2- Vias respiratórias inferiores
Tipo de amostras mais comuns:
A EXP o AT o LBA e a SB.
O objetivo do estudo destas amostras é diagnosticar uma possível pneumonia,
uma bronquite ou uma tuberculose. As amostras de LBA são muito úteis em
doentes imunocomprometidos com pneumonia.
44
Os agentes mais frequentes nas infeções do trato respiratório inferior são: o
Streptococcus pneumoniae e a Klebsiella penumoniae e em infeções pulmonares
crónicas a Mycobacterium tuberculosis também é um agente infecioso comum.
A EXP é uma das amostras mais rotineiras do laboratório, fácil de obter sem
sujeitar o paciente a técnicas invasivas, como por e.g. um LBA. Na colheita da
EXP, há possibilidade de contaminação pela flora bucal, nomeadamente pela
saliva. Uma boa EXP para ser significativa, deve ser proveniente das vias
inferiores, sendo possível observar macroscopicamente pelo seu aspeto mucoso e
purulento, ou seja, com alguma consistência.
No caso das SB líquidas e LBA a amostra tem que ser bem homogeneizada e
centrifugada (se a quantidade for superior a 1ml). O LBA deve ser processado
imediatamente assim que chegue ao SPC.
Nestas amostras, o procedimento laboratorial efetuou-se na câmara de fluxo
laminar. Realizou-se o exame direto pelo método de Gram e pelo método de
Ziehl-Neelsen, e o exame cultural, semeou-se em gelose de chocolate
Haemophilus (jarra com CO2), gelose de sangue, gelose manitol Chapman,
gelose McK e gelose de sabouraud (quando solicitado). Incubou-se a 37ºC,
durante 24 a 48h em aerobiose.
Notas:
- A presença de numerosas células epiteliais escamosas numa EXP, observadas
no exame direto pela coloração de Gram, sugere uma amostra salivar que tem de
ser reportada ao médico, visto que é uma amostra pouco representativa, devendo
o paciente realizar a repetição da colheita. A presença de leucócitos,
nomeadamente de polimorfonucleares, sugere uma boa colheita em caso de uma
infeção. Esta é indispensável, para avaliar o nº e tipo de microrganismos e a
presença de leucócitos polimorfonucleares. Caso existam leveduras é necessário
isolar para Sabouraud e para um meio específico de Candida.
- O exame direto pela coloração de Ziehl-Neelsen, para a pesquisa de BAAR, é
sempre efetuada nestas amostras (em caso de suspeita ou não de uma
tuberculose).
45
- Os meios utilizados para as culturas têm como objetivo isolar bactérias como os
pneumococos, as pseudomonas, as micobactérias, a Klebsiella spp. e outras
enterobacteriaceas e outros microrganismos.
I- 3.4- Exsudado ocular e exsudado do ouvido
No exame direto em ambos os exsudados realizou-se um esfregaço para a
coloração de Gram.
No exame cultural semeou-se em gelose de Haemophillus (jarra com CO2),
gelose de sangue, gelose de McK, gelose de manitol Chapaman e em leio líquido
de Todd Hewitt. Incubou-se a 3ºC durante 24 a 48h em aerobiose.
Após a incubação, sub cultivou-se do meio líquido, para meios sólidos.
Normalmente a passagem é feita para gelose de McK, gelose manitol Chapman,
gelose azido, gelose sabouraud e incubar a 37ºC, durante 24 a 48h em aerobiose.
I- 3.5- Feridas, abcessos, exsudados purulentos, biópsia de tecido e
conteúdo de bomba
O estudo microscópico destes produtos, por exame direto e pelo exame cultural,
apresentam regra geral sempre mais que um microrganismo (à exceção do
conteúdo de bomba).
Quando estudados estes microrganismos, é importante ter sempre em conta a
flora normal de cada local proveniente. Estas amostras possuem indicações
iniciais e importantes quanto à natureza do microrganismo, ajudando assim, na
escolha dos meios e posteriormente dos antimicrobianos.
O pus em abcessos fechados contém, normalmente, apenas um microrganismo
como agente causador de infeção, sendo os agentes mais comuns, os
estafilococos, estreptococos e bacilos gram-negativos. Muitos são os
microrganismos encontrados com frequência em abcessos abdominais bem como
em feridas abertas. No caso das feridas abertas, por e.g. as escaras em que a
amostra é colhida por zaragatoa trata-se, de uma amostra não muito
representativa, podendo estar contaminada com flora colonizadora da pele. Neste
46
caso, o ideal seria colher o pus através de seringa e, em caso de suspeita de uma
bacteriémia colher hemocultura.
Relativamente ao pus em zaragatoa, realizou-se o exame cultural em gelose de
sangue, gelose de chocolate (jarra com CO2), gelose de manitol Chapman, gelose
McK e em meio líquido caldo de carne, e realizou-se também lâmina para
coloração de Gram. Incubou-se a 37ºC, durante 24 a 48h em aerobiose. Após a
incubação, subcultivaram-se os meios líquidos em meios sólidos para gelose
McK, gelose manitol Chapman e gelose azido.
No que concerne ao pus não superficial, semeou-se nos mesmos meios mais o
meio de gelose de sangue para anaeróbios, e realização de lâmina pela coloração
de Zhiehl-Neelsen. Nos casos em que a cultura em anaerobiose foi positiva,
procedeu-se apenas à pesquisa da bactéria isolada usando a coloração Gram
(neste serviço não é feita a identificação das bactérias anaeróbias por falta de
recursos humanos).
Em geral, o objetivo é saber o tipo de microrganismo presente, por isso, é
semeado em todos os meios possíveis (primeiro gelose de sangue e meio líquido
de enriquecimento, depois se houver turvação então procede-se ao cultivo para
meios seletivos) para estuda-los posteriormente e por fim ponderar qual (ais) o
(s) agente (s) predominante (s) (até 3 microrganismos) relacionando sempre com
a informação clínica.
O St. aureus, Pseudomonas, Enterobactérias, Streptococcus beta hemolíticos e
Enterococos foram os agentes mais frequentemente isolados em amostras com
pus.
As amostras de biópsias de tecido não são muito comuns na rotina do laboratório,
são semeadas numa gelose de sangue (se o tecido tiver consistência), em caldo de
enriquecimento e é realizado o esfregaço para exame direto com coloração de
Gram e Zhiel-Neelsen. É valorizado qualquer crescimento microbiano.
O conteúdo de bomba é uma amostra estéril. Colocou-se a amostra num
recipiente estéril, adicionou-se caldo de carne e incubou-se a 37ºC em aerobiose
durante 5 dias. O meio foi observado diariamente para a avaliação do
crescimento bacteriano (turvação do meio). Quando a amostra tinha turvação,
47
sub-cultivou-se em gelose de chocolate Polyvitex (em CO2) e quando límpida,
realizou-se a passagem apenas ao 5º dia, também para gelose de chocolate
Polyvitex (em CO2).
I- 3.6- Líquidos biológicos
Os líquidos biológicos, pleural, peritoneal, pericárdico e sinovial devem ser
aspirados com uma técnica de assepsia, visto que se tratam de líquidos estéreis
porque qualquer contaminação na colheita atrasa e dificulta o estudo.
Aquando da amostra purulenta, efetuou-se diretamente da amostra os esfregaços
e culturas, caso contrário, o líquido teria de ser centrifugado, 5 minutos a 3000
rpm, sendo o sedimento utilizado para exame direto (Gram e Zhiel-Neelsen) e
para exame cultural, geloses de sangue, para aerobiose e anaerobiose, e gelose de
chocolate Polyvitex em jarra com CO2 (culturas para o crescimento de
microrganismos suspeitos, micobactérias, microrganismos anaeróbios e as
bactérias piogénicas).
Utilizou-se meio líquido de enriquecimento (caldo Todd e caldo de carne),
porque estes produtos têm uma flora pobre. A sua passagem para meios sólidos
efetuou-se de acordo com o diagnóstico do paciente, mas normalmente foram
para os meios de cultura, gelose de chocolate em CO2 e gelose de sangue em
aerobiose. Incubou-se os meios sólidos e líquidos a 37ºC, durante 24 a 48 horas.
Nota: A coloração de Gram é de extrema importância porque na presença de
polimorfonucleares e bactérias (caso existam) é indicador de infeção. O estudo
citológico dos esfregaços e contagem também podem revelar/sugerir a natureza
da infeção seja bacteriana, viral ou neoplásica.
I- 3.6.1- Líquido cefalorraquidiano
O líquido cefalorraquidiano (LCR) ocupa uma posição de destaque na urgência
clínica, tornando essencial o seu diagnóstico precoce, rápido e preciso.
A meningite é a grande suspeita e preocupação no LCR porque o risco de morte
ou lesão irreversível é grande, a não ser que o tratamento seja iniciado de
48
imediato. As amostras, antes do tratamento, são essenciais ao diagnóstico
etiológico.
O objetivo do diagnóstico com urgência é diferenciar uma meningite bacteriana
de uma viral. O diagnóstico inicia-se com a contagem de células e a avaliação do
tipo de células que predominam (se são mononucleares poderá tratar-se de uma
infeção viral ao contrário na presença de polimorfonucleares que indicam tratar-
se de uma infeção bacteriana) (realizado no laboratório da urgência do SPC). Nos
parâmetros bioquímicos, analisa-se a concentração da glicose e de proteínas e o
exame microscópico para a identificação de microrganismos caso existam
(estudados na Bacteriologia).
No sector de Bacteriologia, avaliou-se o volume da amostra de LCR. Se o
volume for superior a 1ml, centrifugar durante 6 minutos à uma baixa rotação, se
for inferior, não centrifugar e homogeneizar a amostra antes de semear.
Semeou-se (colocou-se 3 gotas em cada meio) em gelose de chocolate (jarra em
CO2) e gelose de sangue, incubando a 37ºC, durante 24 a 48h.
Realizou-se 2 esfregaços (1 gota em cada lâmina) em lâminas para coloração de
Gram e Ziehl-Neelsen.
O restante produto foi colocado em meio de enriquecimento, o caldo Todd, e
incubou-se a 37ºC, durante 24h. Ao fim das 24h, fez-se a passagem dos meios
líquidos para os seguintes meios sólidos, gelose de sangue e gelose de chocolate
Polyvitex.
No caso de se tratar de um individuo imunodeprimido, outro agente a considerar,
é o Criptococcus neoformans (fungo) em que a pesquisa é feita através do exame
a fresco com tinta-da-china, da pesquisa do antigénio e do exame cultural.
Os principais microrganismos de interesse clínico são Neisseriae meningitidis,
Streptococcus pneumoniae e o Haemophilus influenza.
A monitorização destes doentes por parte do SPC é feita pela normalização da
glicose e da contagem do número de células no LCR. Estes parâmetros vão
revelar a boa ou não resposta ao tratamento.
49
I- 3.7- Fezes
Os sintomas relacionados com o trato gastrointestinal, quando associadas a uma
infeção são sobretudo náuseas, vômitos e diarreia, e é diagnosticada com o
auxílio de uma coprocultura.
A flora bacteriana normal do intestino é muito rica. O aspeto macroscopicamente
das fezes já induz em algumas orientações em caso de infeção (e.g. se são
moldadas ou diarreicas especialmente nas crianças).
Qualquer tentativa de isolar bactérias patogénicas nas fezes requer a separação
dos agentes infeciosos patogénicos dos microrganismos da flora normal com o
uso de meios de cultura seletivos. Os microrganismos patogénicos mais comuns
são: a Shigella spp.; a Salmonella spp.; o Campylobacter spp.; a Escherichia coli
enteropatogénica (serotipo mais comum Escherichia coli O157:H7), e menos
comuns, o Clostridium spp., e o Vibrio spp..
Nesta amostra realizou-se o exame direto para coloração de Gram com o objetivo
de observar a flora e as percentagens relativamente a gram-positivos e gram-
negativas e à presença de polimorfonucleares (sinal de infeção).
No exame cultural, utilizaram-se meios específicos para os microrganismos
anteriormente referidos, gelose de sangue, gelose de Mck, gelose de SS, Gelose
campi (Campylobacter) e caldo selenito. Incubou-se a 37ºC, durante 24h em
aerobiose. O mesmo não se aplica à gelose campi, que teria que ser incubada a
uma temperatura de 42ºC, durante 48h, numa atmosfera microaerófila.
Após a incubação, efetuou-se a passagem do meio líquido para os seguintes
meios sólidos, gelose SS, gelose SMID, gelose McK e incubou-se a 37ºC
durante, 24h em aerobiose.
I- 3.7.1- Identificação de Campylobacter spp.
No caso de colónias suspeitas de serem Campylobacter spp., procedeu-se da
seguinte forma:
- executou-se o teste da catalase e oxidase (deve ser positivo);
- corou-se a lâmina com fucsina previamente fixada;
50
- executou-se um (TSA (em microaerofilia durante 48h) com cefalotina (deve ser
resistente) e com ácido nalidixico (deve ser sensível);
- efetuou-se um isolamento de novo para 2 placas de gelose de sangue, colocou-
se uma aerobiose (não deve haver crescimento) e outra em microaerofilia (deve
haver crescimento).
I- 3.7.2- Identificação de Escherichia coli
Perante a suspeita de Escherichia coli O157 (meio sorbitol), procedeu-se a
aglutinação direta com um antissoro E.coli O157 para confirmação, e
posteriormente realizou-se o TSA.
I- 3.7.3- Identificação de Salmonella spp.
Entre os diversos antissoros existentes para a identificação da Salmonella, a
secção de Bacteriologia utiliza apenas 3: os antissoros O:9; O:4 e 5 e O:8, de
acordo com a frequência desta bactéria na RAM. Aquando na presença de uma
Salmonella. Procedeu-se da seguinte forma:
- colocou-se uma gota omnivalent numa lâmina, se aglutinar trata-se de uma
Salmonella, caso contrário, significa que a bactéria testada não é uma
Salmonella;
- aglutinou-se posteriormente com antissoro monovalente O:9, se positiva, indica
Salmonella do grupo D. Procedeu-se então a utilização dos antissoros S. typhi e
S. enteritidis, para a identificação do serotipo;
- se o resultado for negativo, aglutinar com antissoro monovalente O:4,5 que
identifica a Salmonella do grupo B, se o resultado for positivo, utilizar o
antissoro S. typhimurium. Se negativo, aglutinar com o anti-soro monovalente
O:8 que deteta a Salmonella do grupo C2.
I- 3.7.4- Identificação de Shigella spp.
Na presença de uma Shigella, a secção de Bacteriologia dispõe de 4 tipos de
antissoros que possibilita a identificação da Shigella pertencentes aos grupos de
A, B, C e D.
51
Retiraram-se as colónias suspeitas de Shigella e colocou-se numa lâmina,
adicionou-se uma gota de antissoro Shigella flexineri (identifica as Shigella do
Grupo B). Se ocorrer aglutinação, indica reação positiva para a bactéria testada.
Repetiu-se o procedimento com os antissoros Shigella sonnei (identifica Shigella
do Grupo D), Shigella dysenteriae poly A1 e poly A2 (identifica Shigella do
grupo A) e com o antissoro Shigella boydii (identifica Shigella do Grupo C).
I- 3.7.5- Identificação de rotavírus e adenovírus
No caso das crianças, procedeu-se ao cultivo da amostra da mesma forma, mas
com a realização da pesquisa do rotavírus e do adenovírus, em fezes diarreicas.
Utilizou-se para tal, o teste imuno-cromatográfico (Vikia®
Rota-Adeno) que
permite a dupla deteção qualitativa do rotavírus e do adenovírus.
Os rotavírus e os adenovírus são responsáveis por gastroenterites agudas,
principalmente nas crianças mais novas. As diarreias virais, frequentemente
sazonais, evoluem favoravelmente. No estado agudo da doença, são excretadas
grandes quantidades de vírus, sendo estes responsáveis pela propagação da
epidemia. A cultura dos rotavírus e dos adenovírus é difícil, o que explica a
utilização preferencial das técnicas imunológicas.
I- 3.8- Aparelho genital
A Neisseria gonorrhoeae é uma bactéria associada a uma doença sexualmente
transmissível, a Gonorreia. É transmitida por contacto sexual e nos homens a
infeção é assintomática. A infecciosidade é tão elevada que a probabilidade de
contrair a infeção de uma única exposição sexual não protegida a partir de um
parceiro infetado é de 20 a 30% nos homens e uma probabilidade ainda maior
nas mulheres.
As amostras de eleição são um exsudado vaginal ou num exsudado uretral e é
necessário fazer a pesquisa do gonococo quer em meios de cultura (Gelose de
Chocolate em CO2), quer em esfregaços corados pelo método de Gram. Neste
último método, é possível observar nos polimorfonucleares, a inclusão destas
bactérias intracelulares obrigatórias (diplococos gram-negativos).
52
I- 3.8.1- Exsudado vaginal e uretral
No exsudado vaginal, o estudo é bacteriológico, micológico e parasitológico.
No exame a fresco, pesquisaram-se células, leucócitos e os elementos
leveduriformes. Aquando da presença de leveduras, a amostra semeou-se para
um meio de Candida spp., que, na maior parte das vezes, é albicans. Para além
da gelose de Candida, o exame cultural também se executou para uma gelose de
sangue e uma gelose chocolate polyvitex (jarra com CO2) e incubou-se a 37ºC,
durante 24h em aerobiose.
Efetuou-se a pesquisa de Trychomonas vaginalis, um parasita flagelado. É
possível visualiza-lo, pela sua movimentação no exame a fresco (uma
característica particular, para confirmar a presença deste parasita) e é causador de
infeção na vulva, na vagina e no colo uterino, em geral não se estende para o
útero. A sua transmissão é feita por via sexual.
I- 3.8.2- Exsudado vaginal e perianal na grávida
O exsudado vaginal e perianal consiste numa pesquisa orientada para o estudo de
Streptococcus agalactiae (Streptococcus beta hemolítico do grupo B de
Lancefield). Estes estreptococos do grupo B fazem parte da flora normal da
vagina em 5 a 25% das mulheres.
Esta pesquisa é feita nas grávidas no último trimestre de gravidez (entre as 35 e
as 37 semanas), para poder prevenir a colonização no recém-nascido por estes
estreptococos. Se o recém-nascido for infetado pode desenvolver uma meningite,
uma sépsis fulminante ou até mesmo um síndrome respiratório.
No exame direto realizou-se o esfregaço para a coloração de Gram e no exame
cultural fez-se uma gelose de sangue e o meio granada (IGLB).
Incubou-se a 37ºC, durante 24 a 48h em aerobiose.
53
I- 3.9- Pontas de cateter
O uso generalizado de acessos vasculares cria uma porta de entrada de risco
significativo de bacteriémia.
Os Staphylococcus spp. são bactérias que, mais frequentemente colonizam, os
cateteres pois têm adesinas especiais para os plásticos de que eles são feitos. Os
Staphylococcus coagulase negativa são colonizadores mais frequentes que os
Staphylococcus aureus.
O cateter semeou-se por rolamento, pela técnica de Maki, em gelose de sangue.
Após 24h de incubação, a 37ºC, realizou-se a avaliação semiquantitativa do
crescimento bacteriano, sendo valorizado e identificado um número de colónias
≥15.
O microrganismo normalmente isolado em cateter e de importância clínica é o
estafilococo coagulase negativa.
Notas:
- Em caso de infeção associada a cateter (um fragmento do cateter), é enviado ao
laboratório, associado ou não a uma hemocultura, caso esteja associado, tanto o
cateter, como a hemocultura tem que se obter o mesmo microrganismo em caso
de infeção, e descartar a hipótese de contaminação da flora da pele ou dos
procedimentos.
- Para fazer o diagnóstico de bacteriémia relacionada com cateter é necessário o
isolamento do mesmo microrganismo nas amostras obtidas de diferentes locais
em espaços de tempo diferentes, (hemocultura periférica, ponta do cateter,
zaragatoa da zona de inserção do cateter). O crescimento de diferentes
microrganismos em frascos de cultura diferentes pode sugerir uma contaminação.
54
I- 4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Os TSA são indicados para qualquer microrganismo que contribua para um
processo infecioso, que justifique uma terapia antimicrobiana.
O reconhecimento do padrão de sensibilidade à terapêutica antimicrobiana é
fundamental na medida em que se assiste ao aparecimento de estirpes
microbianas resistentes a alguns antibióticos que, por isso, deixam de ser eficazes
no tratamento das infeções.
Os antibióticos distinguem-se em:
- bactericidas: quando eliminam as bactérias, provocando a destruição da parede
bacteriana;
- bacteriostáticos: detêm o crescimento das bactérias, deixando ao sistema
imunitário a tarefa de eliminar a infeção.
O estudo do comportamento de uma bactéria aos antibióticos permite avaliar a
sua sensibilidade ou a sua resistência.
Existem vários métodos de execução do TSA ou antibiograma (ATB). A sua
seleção deve ter em conta, para além da rapidez do resultado e de uma resposta
facilmente interpretável pelo clínico, a política de utilização de antibióticos do
hospital, assim como, a política nacional de administração destes fármacos.
I- 4.1- Métodos laboratoriais utilizados no estudo da atividade dos
antibióticos
Para avaliar in vitro a suscetibilidade bacteriana aos antibióticos, podem usar-se
várias metodologias, o método de diluição, o método de difusão (Kirby-Bauer e
E-test) e métodos automatizados (VITEK).
O método de diluição consiste em meios de cultura líquidos ou sólidos
adicionados de concentrações crescentes de um dado antibiótico. Para cada um
destes meios, adiciona-se a mesma quantidade de inóculo (suspensão bacteriana).
Após a incubação à temperatura adequada, observa-se se ocorreu crescimento
bacteriano. Deste modo, avalia-se a concentração mínima inibitória (CMI) em
mg/L de antibiótico.
55
A CMI é a mais fraca concentração de um antibiótico em solução, capaz de
impedir o crescimento de uma estirpe, em relação à qual se determina a CMI
relativamente a um determinado antibiótico, num meio de composição
estandardizada.
O método de difusão consiste na utilização de meios sólidos, a inoculação de
uma dada suspensão bacteriana por espalhamento à superfície do meio. Na
superfície do meio sólido inoculado, colocam-se discos de papel impregnados
com antibióticos. Após incubação de 24 horas à temperatura adequada, medem-
se os halos de inibição à volta dos diferentes discos de papel impregnados com os
diferentes antibióticos.
O tamanho dos halos é expresso em milímetros, é avaliado em sensível (S)
resistente (R) e intermédio (I). É sensível quando o microrganismo responde à
terapêutica com o antimicrobiano utilizando a dosagem normalmente
recomendada para aquele tipo de infeção e espécie bacteriana (aparece um halo
na placa, à volta do disco do antibiótico). É resistente quando não há uma boa
resposta à terapêutica, às concentrações de antimicrobiano atingidas, com as
dosagens habitualmente utilizadas com aquele antimicrobiano, e/ou logo, está
presente um mecanismo específico de resistência (não aparece o halo). E por fim
é intermédio quando a CMI do antimicrobiano para o microrganismo é próxima
do valor que ele pode atingir no sangue ou tecidos, para a qual a resposta clínica
é inferior à de uma estirpe sensível.
Na secção de Bacteriologia utilizou-se os métodos de difusão de Kirby-Bauer e o
E-test.
Método Kirby-Bauer
Consiste num método qualitativo que permite classificar os microrganismos em
resistentes, sensíveis ou intermediários em relação a uma grande variedade de
agentes antimicrobianos.
Nesta técnica é utilizado o meio de cultura Mueller-Hinton. A densidade da
suspensão bacteriana a inocular deve ser equivalente a 0,5 unidade Mac Farland e
a concentração de cada antibiótico em discos de papel é determinada segundo as
regras Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). A droga difunde-se
56
radialmente, ocorrendo em simultâneo a multiplicação do microrganismo. Em
áreas onde a concentração do agente antimicrobiano é inibitória, não ocorre
crescimento, formando-se uma zona (halo de inibição) à volta de cada disco. O
halo de inibição corresponde ao número de microrganismos mortos.
Seleção dos antibióticos
A seleção dos discos de antibióticos, depende do produto donde provém o
microrganismo isolado. Os discos utilizados na secção foram adaptados da FDA-
EUA e recomendado pelo CLSI. Segue-se algumas tabelas (II-VIII), da seleção
dos antibióticos utilizados, consoante o microrganismo isolado e o respetivo
produto (amostra) e/ou espécie.
Tabela II: Seleção de antibióticos em cada produto biológico, na presença de
Enterobacteriaceaeas. Enterobacteriaceaeas
Produto Antibiótico
Urina Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina 10μg, Nitrofurantoina, Cotrimoxazol,
Amoxicilina+Ac. Clavulâmico, Cefuroxime, Levofloxacina/Ciprofloxacina,
Cefotaxime, Ceftazidime, Amicacina e Ofloxacina
Pus, Expetoração
ou Hemocultura
Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Amoxicilina+Ac. Clavulâmico, Co-
trimoxazol, Amicacina, Cefuroxime, Cefotaxime, Aztreonam,
Imipenem/Meropenem, Piperacilina+Tazobactam, Tobramicina, Ceftazidime e
Levofloxacina/Ciprofloxacina
LCR Ampicilina, Gentamicina, Cefotaxime, Amicacina, Meropenem, Co-trimoxazol
e Ceftazidima
Fezes Ampicilina, Ciprofloxacina e Co-trimoxazol
Se o microrganismo isolado for Salmonella typhi, utilizar os seguintes
antibióticos: ampicilina, ciprofloxacina, cotrimoxazol e cefotaxime.
Se o microrganismo isolado for Listeria, utilizar os seguintes antibióticos:
ampicilina, co-trimoxazol e gentamicina. Nas Pseudomonas, utilizar os seguintes
antibióticos: piperacilina+tazobactam, ceftazidime, amicacina, gentamicina,
imipenem/meropenem, tobramicina, aztreonam e ciprofloxacina.
57
Tabela III: Seleção de antibióticos em cada produto biológico, na presença de
Sthaphilococcus. Sthaphilococcus
Produto Antibiótico
Urina Penicilina, Oxacilina, Novobiocina, Nitrofurantoina, Gentamicina,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Vancomicina, Co-trimoxazol, Teicoplanina
Pus, Expetoração
ou Hemocultura
Penincilina, Oxacilina, Co-trimoxazol, Cefalotina, Teicoplanina, Clindamicina,
Eritromicina, Rifampicina, Vancomicina, Amicacina, Gentamicina,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Tetraciclina, Amoxicilina+Ac. Clavulâmico
LCR Penicilina, Oxacilina, Clindamicina, Co-trimoxazol, Vancomicina,
Teicoplanina, Amicacina, Rifampicina, Cloranfenicol, Gentamicina,
Eritromicina, Levofloxacina/Ciprofloxacina.
Exsudado nasal Penincilina, Oxacilina, Vancomicina, Eritromicina, Amoxicilina+Ac.
Clavulâmico, Gentamicina e Teicoplanina
Tabela IV: Seleção de antibióticos consoante a espécie aquando do isolamento de
Neisseria. Neisseria
Espécie Antibiótico
Meningococcus Penicilina, Cefotaxime, Cloranfenicol, Ampicilina
Gonococcus Penincilina, Tetraciclina, Spectinomicina, Cefalotina, Cefuroxime, Cefas de 3ª
geração, Ciprofloxacina e pesquisa da β-lactamase (nitrocefina).
Moraxella
catarrhalis
Penicilina, Amoxicilina+Ac.Clavulâmico, Cefuroxime, Cefotaxime,
Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa da β-lactamase (nitrocefina).
Tabela V: Seleção de antibióticos em cada produto biológico, na presença de
Haemophilus.
Haemophilus
Produto Antibiótico
Hemocultura e
LCR
Ampicilina, Cefotaxime, Cloranfenicol e pesquisa da β-lactamase (nitrocefina).
Expetoração, Ex.
nasal e pus
Ampicilina, Co-Trimoxazol, Eritromicina, Amoxicilina+Ac.Clavulâmico,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Cefuroxime, Tetraciclina e pesquisa da β-
lactamase (nitrocefina).
Tabela VI: Seleção de antibióticos em cada produto biológico e espécie, na presença de
Streptococcus.
Streptococcus
Espécie Antibiótico
Pneumococcus Expetoração e
Exsudados
Penicilina, Ampicilina, Optoquina
LCR e
Hemocultura
Penicilina, Oxacilina, Cefotaxime, Cloranfenicol,
Optoquina, Ampicilina, Vancomicina, Eritromicina
Streptococcus
diversos
Penicilina, Tetraciclina, Ampicilina, Cefalotina, Clindamicina, Gentamicina,
Vancomicina, Teicoplanina, Ciprofloxacina, Eritromicina
Streptococcus A Penicilina, Ampicilina, Eritromicina, Clindamicina
58
Tabela VII: Seleção de antibióticos em cada produto biológico, na presença de
Enterococcus.
Enterococcus
Produto Antibiótico
Urina Penicilina, Ampicilina, Nitrofurantoina, Co-Trimoxazol, Eritromicina,
Gentamicina HC, Estreptomicina HC, Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa
da β-lactamase (nitrocefina).
Pus Penicilina, Ampicilina, Gentamicina HC, Eritromicina, Vancomicina,
Teicoplanina, Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa da β-lactamase
(nitrocefina)
LCR e Hemocultura Ampicilina, Estreptomicina HC, Teicoplanina, Gentamicina HC, Vancomicina e
pesquisa da β-lactamase (nitrocefina).
Tabela VIII: Seleção de antibióticos usados no exsudado ocular consoante o
microrganismo isolado. Exsudado ocular
Microrganismo Antibiótico
Pneumococcus Cloranfenicol, Tetraciclina
Staphilococcus
aureus
Cloranfenicol, Ac. Fusidico, Gentamicina, Tetraciclina, Ofloxacina
Haemophilus Cloranfenicol, Tetraciclina
Enterobacteriaceaes Cloranfenicol, Tetraciclina, Colistina, Gentamicina
Pesudomonas Colistina, Gentamicina, Ofloxacina
Épsilon test (E-test)
O E-test permite determinar quantitativamente a suscetibilidade de determinado
microrganismo. Consiste na aplicação de uma tira impregnada com um gradiente
de antibiótico, tornando possível determinar o CMI pela linha de intersecção do
crescimento bacteriano com a respetiva tira.
Neste teste, a CMI é lida diretamente na escala da tira, no ponto onde a elipse de
inibição do crescimento intercepta a tira. Usou-se o E-test da vancomicina e o da
penicilina.
E-test vancomicina
Procedimento laboratorial:
- efetuou-se uma suspenção de 0,5 de Mcfarland;
- numa placa de Muller-Hinton, efetuou-se estrias apertadas em 3 direções;
- colocou-se a tira E-test e incubou-se a 37ºC durante 24h ao ar.
59
E-test penicilina
Procedimento laboratorial:
- efetuou-se uma suspenção de 0,5 de Mcfarland;
- numa placa de gelose de sangue, efetuou-se estrias apertadas em 3 direções;
- colocou-se a tira E-test;
- incubou-se a 37ºC durante 24h em CO2.
I- 4.2- Métodos automatizados-VITEK
Na secção de Bacteriologia existe o sistema automatizado denominado VITEK 2
da bioMérieux, o qual permite a identificação do microrganismo isolado, assim
como, a determinação também da sua suscetibilidade aos antimicrobianos.
O sistema VITEK automatiza todas as etapas necessárias para a realização dos
testes de identificação, usando as cartas VITEK para Gram-positivos,
estreptococos e estafilococos, para os Gram-negativos, para as Pseudomonas
spp., para fungos e para anaeróbios.
O teste de identificação pelas cartas do VITEK consiste numa combinação de
açúcares e substratos bioquímicos desidratados, os quais vão ser digeridos e
provocar uma reação, em que o VITEK, com uma memória implementada dos
vários microrganismos existentes industrializados, identifica o microrganismo
em estudo.
O TSA é umas das técnicas que se baseia na determinação da capacidade que um
microrganismo tem de se multiplicar in vitro na presença de diferentes fármacos.
O TSA nas cartas do VITEK consiste numa combinação de fármacos para
determinados microrganismos (e.g. gram-positivos ou gram-negativos) em que o
resultado é dado como sensível, resistente e intermédio, ao antibiótico.
É de salientar, que para a leitura das cartas de identificação e das cartas de TSA é
necessário fazer suspensões padronizadas das colónias (Mac Farland) para que o
teste seja bem-sucedido quer na identificação acertada do microrganismo quer no
TSA na sensibilidade e resistências reais dos microrganismos.
60
O aparelho VITEK 2 executa as análises de identificação e sensibilidade, através
da monitorização contínua do crescimento e da atividade dos microrganismos no
interior das cartas. Existem 2 sistemas óticos que executam esta função:
Sistema ótico de fluorescência
Deteta indiretamente o crescimento e a atividade dos microrganismos, usando um
derivado químico do seu crescimento, em vez dos próprios microrganismos. Esta
substância química, denominado fluoróforo, absorve a luz num comprimento de
onda de 365nm, reemitindo imediatamente a luz num comprimento de onda de
445nm.
São utilizados tubos de luz xénon e filtros óticos para criar o comprimento de
onda específico da luz. Posteriormente, um detetor de fluorescência captura a luz
reemitida pelo fluoróforo. O sistema bioquímico nestes poços foi concebido para
produzir esta substância em proporção direta ao crescimento e à atividade dos
microrganismos. A quantidade de luz reemitida que é produzida, fornece um
excelente indicador do crescimento e da atividade dos microrganismos,
utilizando uma referência interna.
Sistema ótico de transmitância
Utiliza luz visível para medir diretamente o crescimento dos microrganismos.
Este sistema baseia-se numa leitura de luz inicial do poço, antes do início de
crescimento microbiano significativo. Amostragens de transmitância de luz do
mesmo poço, com intervalos de 15 minutos, medem o crescimento de
microrganismos, através da quantidade de luz que é impedida de atravessar o
poço.
O sistema ótico utiliza díodos emissores de luz (LED) que produzem luz nos
comprimentos de onda apropriados e fotodetetores de silicone para capturar a luz
transmitida. O sistema efetua autocalibração.
A identificação VITEK cobre mais de 300 espécies encontradas em clínica e na
área industrial.
61
Galerias de antibiograma
A secção de Bacteriologia possui algumas galerias de ATB para algumas
estirpes, nomeadamente as enterobactérias, as pseudomonas e outros bacilos
gram-negativos não fermentadores, os haemophillus e as neisserias.
Estas diferentes galerias de ATB comportam 16 pares de cúpulas. O primeiro
par, sem antibiótico, que vai servir de controlo de crescimento. Os 14 pares
seguintes contêm antibióticos com uma ou duas concentrações. O último par, não
tem antibiótico, permitindo a adição de um antibiótico suplementar, caso seja
necessário.
A bactéria a analisar foi colocada em suspensão. Depois transferida para o meio
de cultura e inoculada na galeria. Após 18 a 24h de incubação, a leitura de
crescimento, por vezes, fez-se visualmente, ou no aparelho Vitek systems-ATB
expression. O resultado obtido permitiu classificar a estirpe como sensível,
intermédia ou resistente
62
I- 5- Teste de despiste de resistência à meticilina do
Staphylococcus em meio de cultura sólido
Os Staphylococcus aureus resistentes à meticilina, normalmente designados por
MRSA, são comuns em ambientes hospitalares e pouco comuns em indivíduos
provenientes da comunidade.
A resistência à oxacilina é utilizada para detetar a presença de estafilococcus
resistentes à meticilina. A maioria destes microrganismos são geralmente
resistentes também a múltiplos antibióticos, incluindo outros β-lactâmicos,
aminoglicosídeos, macrólidos, clindamicina e tetraciclina.
Realizou-se o seguinte procedimento laboratorial:
1- Fazer uma suspensão de densidade de 0,5 da escala de Mac-Farland;
2- A partir desta suspensão fazer uma diluição de 1:2;
3- Numa placa de Mueller-Hinton suplementado com 4% de cloreto de sódio
efetuar estrias apertadas em 3 direções;
4- Colocar o disco de oxacilina;
5- Incubar durante 24h, à temperatura 35-37ºC;
Nota: A ausência de um halo de inibição, é sinónimo de resistência.
Pesquisa de β- lactamases
As β-lactamases (penicilinases) são enzimas bacterianas heterogéneas que clivam
o anel β-lactâmico das penicilinas e cefalosporinas para inativar o
antimicrobiano.
As β-lactamases conferem, às bactérias que as contêm, resistência às
cefalosporinas de amplo espectro de ação (3ª geração) como a ceftazidima,
cefotaxima e ceftriaxone (oximino-cefalosporinas) e aos monobactâmicos, como
o aztreonam.
Dos vários processos usados na Bacteriologia para a pesquisa das β-lactamases,
utlizou-se o método da cefalosporina cromogénica.
63
Princípio
O disco de cefinase está impregnado com cefalosporina cromogénica
(nitrocefina). O teste é baseado na liberação de um radical cromogéneo, que irá
ocasionar uma mudança rápida de cor (de amarelo para vermelho) quando a
ligação amido no anel β-lactâmico é hidrolisado pela ação da β-lactamase.
O teste para a deteção de β-lactamase deve ser realizado em todas as amostras de
Haemophillus spp.. Quando o resultado for positivo para produção de β-
lactamase, reportar resistência à ampicilina e amoxicilina. O resultado negativo
não garante sensibilidade à ampicilina e um outro teste deverá ser realizado.
O teste da nitrocefina apresenta resultados fidedignos para a deteção da produção
de β-lactamases em isolados de Haemophillus spp., Neisseria gonorrhoeae,
Moraxella catarrhalis, Staphylococcus spp. e Enterococcus spp..
Procedimento laboratorial:
1- Humedecer com água destilada e esterilizada o disco de nitrocefina
previamente colocado na lâmina de vidro;
2- Utilizando uma ansa, remover 4 a 5 colónias morfologicamente
semelhantes da cultura e depositar na superfície do disco;
3- Verificar se há modificação da cor: resultados positivos aparecem 15
segundos a 5 minutos. Se não houver alteração da cor, o teste é negativo.
64
I- 6- Controlo de qualidade interno e externo na Bacteriologia
O controlo de qualidade interno é um controlo que assegura a qualidade dos
resultados diariamente. Através do controlo interno, pode-se avaliar o
funcionamento confiável e eficiente dos procedimentos laboratoriais, fornecendo
resultados válidos, que possam contribuir de forma eficaz no estabelecimento do
diagnóstico pelo clínico.
Na secção, fez-se diariamente a monitorização da temperatura das estufas,
mensalmente a temperatura dos frigoríficos e de acordo com o aparecimento dos
erros detetados, fez-se a monitorização dos reagentes, meios de cultura e
técnicas. Procedeu-se também à manutenção e controlo dos equipamentos.
Usou-se na secção de Bacteriologia o controlo de qualidade interno
quinzenalmente, as estirpes american tipe culture collection (ATCC): S. aureus
ATCC, E.fecalis ATCC, E.coli ATCC, K. pneumoniae ATCC, P. aeruginosa
ATCC.
Realizou-se o controlo de qualidade externo, o UK national external quality
assessment service (UK NEQAS) for Microbiology, numa periocidade mensal.
Este controlo externo consiste em amostras desconhecidas, testadas como
amostras biológicas e cujos resultados são enviados ao laboratório de referência
(Londres) dentro do prazo solicitado por esta entidade. Os resultados são
pontuados e comparados com outros laboratórios participantes.
A secção recebe mensalmente o controlo de qualidade externo-NEQAS, que
consiste em 5 amostras:
- 1 amostra de fezes que tem como objetivo, a identificação de bactérias
patogénicas;
- 2 amostras variáveis, que tem como objetivo, a identificação de bactérias
patogénicas;
- 2 amostras variáveis para, a identificação de microrganismos e TSA.
65
II- Serologia
A secção de Serologia do SPC consiste no diagnóstico laboratorial através de
técnicas imunológicas, que detetam a resposta imune específica do hospedeiro
infetado, contra o microrganismo causador da infeção, sejam eles, vírus,
bactérias, fungos e parasitas.
O diagnóstico serológico baseia-se na resposta imune humoral dependendo da
atividade dos linfócitos B, na presença de microrganismos (antigénios (Ag))
estranhos ao indivíduo infetado, pela produção de anticorpos (Ac) e por uma
reação Ag-Ac. A produção de Ac é quantificada e, a partir dessa quantificação
dos Acs, podemos obter o diagnóstico, se bem que a sua presença nem sempre
confirma o diagnóstico e podem permanecer para sempre, ou seja, um resultado
positivo nem sempre é sinal de doença contraída recentemente.
II- 1- Colheita e amostra
Os Ac são pesquisados no soro, plasma e líquidos biológicos (LCR, urina e
outros).
Colheita
A colheita é muito importante tal como a sua manipulação. Deve evitar-se
sempre a contaminação, porque se trata de uma colheita estéril.
A refrigeração deve ser feita entre as temperaturas de 2 a 8º C nos 7 dias
posteriores á colheita. Em caso de períodos mais prolongados conservar a uma
temperatura de -20ºC.
As amostras devem ser colhidas em tempos específicos, em que o 1º soro deverá
ser na fase aguda da doença e um 2º soro colhido na fase de convalescença (pelo
menos com 15 dias de intervalo).
Amostra
Não usar soros lipémicos, hemolisados ou contaminados, e em caso de soros com
partículas, deve-se proceder a uma centrifugação.
Sempre que possível evitar congelamentos e descongelamentos da amostra,
porque pode levar a alterações no doseamento das Imunoglobulinas.
66
II- 2- Metodologia
Os métodos utilizados em diagnóstico serológico são ensaios com grande
afinidade entre o Ac e o Ag, sendo uns mais sensíveis que outros.
As reações antigénio Ag-Ac podem ser detetadas num nível primário pela
marcação de um Ag com uma enzima ou com uma substância fluorescente,
ensaios imunoenzimáticos e de imunofluorescência, ou, secundariamente, pelo
reconhecimento de alterações físicas (precipitação e aglutinação) resultantes
destas reações.
II- 2.1- Metodologia automatizada
Utilizou-se vários métodos de ensaio nesta secção, nomeadamente por, enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA), Imunofluorescência, enzyme linked
fluorescent assay (ELFA) e quimioluminescência.
A secção possui um equipamento, o Ap 22, que executa métodos de ELISA e de
imunofluorescência.
ELISA
Consiste na reação dos Ac presentes na amostra, com o Ag fixo à superfície de
poliestireno da microplaca, onde num primeiro passo há uma reação Ag-Ac e um
tempo de incubação. As imunoglobulinas não ligadas nesta reação são eliminadas
durante um processo de lavagens, onde, posteriormente, após a adição do
conjugado, há novamente um tempo de incubação. A globulina anti-humana
conjugada com uma enzima vai reagir com o complexo Ag-Ac formado
anteriormente. Procede-se novamente às lavagens e a globulina que não se fixou
ao complexo é eliminada nesta etapa. Há a adição do substrato, mais tempo de
incubação, e o conjugado que contém a enzima, reage originando uma reação de
cor azul. É adicionado uma solução de paragem e a reação de cor azul altera-se
para amarelo quando é positivo. Quando não há reação Ag-Ac (no primeiro
passo) a amostra é negativa e não há cor no poço. Por fim, é feita a leitura por um
espetrofotómetro a um comprimento de onda de 450/620 nm.
67
Imunofluorescência
A Imunofluorescência é aplicada também para a deteção de Ac e/ou Ag. Na
secção de Serologia utilizou-se dois tipos de imunofluorescência:
Imunofluorescência indireta: consiste na pesquisa de Ac marcados em que
a reação imunológica baseia-se em duas etapas;
Imunofluorescência direta: consiste na pesquisa de Ag por uma só reação
imunológica (1 só Ac) que habitualmente a lâmina é visualizada num
microscópio de fluorescência.
Os Ac são marcados com fluoresceína, quer na imunofluorescência direta, quer
na indireta, que, sob uma radiação ultravioleta, emitem uma luz verde (cor de
maçã). A imunofluorescência direta é a mais utilizada na secção, pelo
equipamento Ap 22.
ELFA
Ainda nos métodos serológicos automatizados, é usado também um equipamento
VIDAS, baseado na Técnica ELFA, a qual associa o método imunoenzimático
sanduíche em duas etapas, com uma deteção final em fluorescência. Esta técnica
é realizada no VIDAS (testes de rubéola e de Citomegalovírus).
Quimioluminescência
Também é utilizado o equipamento LIAISON que usa a tecnologia de
quimioluminescência:
Principio:
Consiste numa fase sólida, composto por partículas magnéticas, onde fixam-se os
Ag. Numa primeira etapa dá-se a reação Ac-Ag, numa segunda fase junta-se o
conjugado (Ac monoclonais de ratinho anti-IgG humana conjugado com um
derivado do isoluminol). O reagente iniciador induz uma reação de
quimioluminescência (emissão dum sinal luminoso), em que o sinal luminoso e
por conseguinte a quantidade de conjugado anticorpo-isoluminol e é medido por
um fotomultiplicador em unidades relativas de luz (RLU).
68
Nota: Todos estes reagentes e procedimentos são fornecidos pelas casas
comerciais que obedecem a protocolos de validação e controlos de qualidade
interno. São fornecidos controlos positivos, negativos e, para cada reagente
utilizado, são fornecidos valores de cut-off para interpretação dos resultados.
A execução das técnicas tem de ser feitas de forma rigorosa (os critérios e
normas propostas para execução dos testes, manutenção, conservação dos
reagentes) para uma boa e correta interpretação dos resultados.
II- 2.2- Metodologia manual
No diagnóstico serológico, para além dos ensaios mencionados anteriormente,
utilizou-se as técnicas manuais (as reações de aglutinação e as reações de
hemaglutinação).
Reações de aglutinação
Baseiam-se na agregação de partículas (latex, eritrócitos, bactérias) que têm na
sua superfície o Ag, quando em contacto com os Acs específicos presentes no
soro do doente. Estas provas de aglutinação são usadas na deteção de Ag em
soro, LCR, urina, LBA (por ex. na pesquisa do Cryptococcus neoformans).
Outro exemplo de reação de aglutinação é o teste de Rosa Bengala (Brucella) que
consiste num teste rápido para a deteção de Ac aglutinantes anti-brucella no soro
(teste de despiste). O método consiste num método em cartão que deteta Ac
aglutinantes, utilizando células de Brucella inativada, coradas com rosa bengala e
suspensa num tampão ácido. O pH ácido da suspensão impede a aglutinação não
específica das bactérias. Nesta reação são detetados Ac aglutinantes das classes
IgA, IgM e IgG. A suspensão bacteriana (suspensão antigénica) vem corada para
facilitar a interpretação dos resultados.
Reações de hemaglutinação
Utilizou-se por e.g. no serodiagnóstico da distomatose (fascíola hepática) e
treponema pallidum hemaglutination assay (TPHA). Esta reação opera-se em
microplacas (poços com fundo em U). São utilizadas hemácias de carneiro
69
sensibilizadas, cobertas com o Ag da fascíola e no TPHA- hemácias de galinha
sensibilizadas e estabilizadas com Ags solúveis de Treponema pallidum. A
presença de anticorpos faz com que haja uma aglutinação de hemácias, que tem
um aspeto de véu uniforme (acastanhado ou avermelhado) que cobre o poço. A
ausência de Acs específicos faz com que as hemácias se sedimentem no fundo do
poço, assumindo a forma de botão compacto. Usa-se um controlo do soro num
dos poços, com hemácias não sensibilizadas (excluir interferências de outras
aglutininas assegurando a especificidade da reação).
Utilizaram-se também as técnicas do título de Antiestreptolisina O (ATPO -
Estreptococcus A), para a sífilis os testes rapid plasma reagin (RPR) e venereal
disease research laboratory (VDRL) (teste de screening) e o TPHA para o teste
confirmatório, a reação de Paul Bunnel para o vírus Epstein Barr (mononucleose
infeciosa) e a reação de Waller Rose para a artrite reumatoide.
II- 3- Testes serológicos realizados na Serologia
Os testes analíticos realizados com mais frequência na secção são demostradas na
tabela IX.
Tabela IX: Testes realizados na secção de Serologia com a respetiva metodologia. Método Testes
ELISA
Enterovírus; Adenovírus; Vírus Influenza A e B; Parainfluenza 1,2 e 3;
Vírus Sincicial Respiratório; Parvovírus B19; Vírus Epstein Barr (anti-
VCA e anti-EBNA); Mycoplasma pneumoniae; Clamydia trachomatis;
Aspergillus spp.; Helicobacter pylori e Leptospira spp.
ELFA Toxoplasma, Toxoplasma, Rubéola, Citomegalovírus e Herpes Simplex 1 e
2.
Aglutinação
Reação de Paul- Bunnell (anticorpos heterófilos do vírus EBV); Anti-
estreptolisina O (TASO) do Strepto β-hemolítico do grupo A; Reação de
Rosa Bengala (pesquisa de Ac anti-Brucella); Treponema pallidum pelo
teste não treponémico RPR.
Hemaglutinação Treponema pallidum pelo teste treponémico (TPHA); Aspergillus
fumigatus; Fascíola hepática e o Echinococcus.
Pesquisa de Antigénios Strepto β-hemolítico do grupo B (soro e urina); Cryptococcus neoformans.
70
II- 4- Interpretação e validação das provas serológicas
Os resultados destes testes, tais como outros realizados em outras valências do
SPC, deverão ser valorizados em conjunto com a informação clínica e com o
resultado de outros meios complementares de diagnóstico.
Em geral, são tidas em conta as principais imunoglobulinas, a IgG e a IgM. As
IgM surgem logo no início da resposta humoral, podem persistir após a doença
aguda (de 2 meses até um ano) e com o passar da infeção são substituídas pelas
IgG. A imunoglobulina IgA surge muito cedo na fase aguda da doença. Esta
imunoglobulina tem aplicação no diagnóstico de algumas infeções o que permite
fazer diagnóstico serológico mais precoce.
Estes anticorpos específicos surgem na 1ª a 2ª semana, após o contato com os
antigénios do agente infecioso, atingindo e evoluindo para um valor máximo, que
depois desce para valores basais, nem sempre detetáveis.
Na interpretação e na validação dos resultados serológicos, é necessário
distinguir uma infeção antiga de uma infeção primária. Os critérios de infeção
primária consistem num aumento de 2 vezes ou mais de título de IgG, há
presença de IgM (podem persistir até um ano) é possível visualizar a
seroconversão (inexistência de Ac na amostra anterior). Na infeção antiga, a
quantidade de Ac residuais não se altera ao longo do tempo, e na reinfeção
normalmente só há um aumento acentuado das IgGs.
Na interpretação da evolução do título de Acs:
Se as duas colheitas apresentam uma subida exponencial, significa que a
infeção é muito recente (titulo ainda a subir). Caso o título seja igual ao
anterior doseado (1º soro) ou apresente uma descida significa, indica uma
infeção antiga, ou seja, houve contacto com o agente infecioso em estudo,
mas não há relação com a situação presente.
A ausência de um aumento significativo do nível de Ac não exclui a
possibilidade de infeção. As amostras colhidas numa fase precoce no
decurso duma infeção podem não apresentar níveis de IgG detetáveis.
Nestes casos, recomenda-se a realização de teste para IgM ou obtenção de
71
uma 2ª amostra decorridos 14 a 21 dias que deverá ser testada em paralelo
com a amostra original.
No recém-nascido também poderá haver dificuldade na interpretação dos
testes serológicos, devido à presença da IgG da mãe e da imaturidade do
sistema imune. Neste caso se deverá pesquisar os Ac nucleicos para o
diagnóstico correto.
Considerações
- A evolução do título de Ac entre duas colheitas espaçadas no tempo pode
avaliar a sua possível relação com a doença aguda que queremos diagnosticar.
- Os Ag utilizados no teste podem ser comuns a outros organismos e que por isso
podemos ter resultados falsos positivos por reações cruzadas.
- As reações cruzadas surgem quando os testes são muito sensíveis mas pouco
específicos. Devem ser confirmados por outros mais específicos.
- A 1ª colheita pode ser muito precoce levando a falsos negativos. É importante
considerar os imunocomprometidos que não respondem às infeções com níveis
de Ac detetáveis.
Em suma, a altura da colheita, a evolução da doença, a especificidade e classe
das imunoglobulinas e a avaliação da evolução dos títulos de Ac ao longo do
tempo são considerações importantes a reter aquando na validação e
interpretação dos resultados.
II- 5- Controlo de qualidade interno e externo na Serologia
O controlo de qualidade interno na Serologia é feito a partir dos controlos das
casas comerciais, seguindo rigorosamente o recomendado.
No controlo de qualidade externo realizou-se o Programa Nacional de Avaliação
Externa de Qualidade do Instituto Nacional Ricardo Jorge (PNAEQ-INSA).
72
III- Parasitologia e Urinas tipo II
A secção de Parasitologia e Urinas do SPC é completamente automatizada, com
a exceção da pesquisa de parasitas nas fezes, que é feita por microscopia ótica.
Nesta secção executou-se as seguintes análises: pesquisa de sangue oculto nas
fezes, a análise sumária da urina (Urianálise), pesquisa de parasitas nas fezes
(pesquisa de Giardia lamblia) e na urina.
III- 1- Pesquisa de sangue oculto
A quantidade de hemoglobina presente nas fezes aumenta com alguns tipos de
patologias que vêm associadas a lesões hemorrágicas no intestino. A
determinação da quantidade de hemoglobina nas fezes é um método eficaz para
analisar precocemente o diagnóstico e tratamento em patologias como o cancro
do cólon.
A amostra de fezes deverá ser colhida durante os 3 dias consecutivos e anteriores
à análise (são 3 amostras por paciente para aumentar a probabilidade de encontrar
sangue, caso exista).
A pesquisa de sangue oculto nas fezes é feita por um equipamento OC-Sensor em
que o princípio do método baseia-se numa reação de aglutinação-látex:
Princípio
Um reativo ao látex prepara-se sensibilizando partículas de látex de poliestireno
com anticorpos anti-HbAo humana. Quando este reativo se mistura com a
amostra, os anticorpos anti-HbAo humana ligadas as partículas do látex reagem
com a hemoglobina da amostra. A mudança na absorvância por unidade de
tempo é resultante da reação de aglutinação-látex é proporcional à concentração
da hemoglobina na amostra. Os resultados obtidos são analisados por uma curva
de calibração dose-resposta da unidade de absorvância frente à concentração. A
concentração de hemoglobina na amostra do paciente determina-se a partir desta
curva dose-resposta.
São cerca de 3000 amostras por mês, em que são pedidas a análise de pesquisa de
sangue oculto nesta secção.
73
III- 2- Exame parasitológico nas fezes
Na pesquisa de parasitas nas fezes, que são cerca de 220 amostras por mês, é
utilizado um método de concentração, o Easy-Copros®, de modo a facilitar a
pesquisa. Esta técnica aumenta o número de cistos, trofozoítos, ovos ou larvas na
preparação, elimina a maior parte do material orgânico fecal (resíduos) e
apresenta o organismo inalterado, de forma a serem facilmente identificados.
Princípio
As técnicas de concentração estão divididas em dois tipos principais, a flutuação
e sedimentação. As técnicas de flutuação usam soluções de densidades
específicas superiores às dos ovos e cistos (normalmente sulfato de zinco ou
açúcar de Sheather) separando-os dos resíduos fecais, permitindo que os ovos e
os cistos se concentrem à superfície do tubo e a maior parte dos resíduos
depositados no fundo do tubo. As técnicas de sedimentação usam uma ação
reserva, fazendo com que os ovos e os cistos concentrem-se no fundo do tubo e a
maior parte dos resíduos fecais no topo, de forma a serem removidos. As técnicas
de sedimentação são as recomendadas para diagnóstico laboratorial porque são
fáceis de executar e menos sujeitas a erros técnicos.
A Easy-Copros é um dispositivo que tem por base o método de sedimentação por
centrifugação de Ritchie (método de sedimentação), simplificado, com a
finalidade de concentrar ovos e cistos de parasitas das amostras fecais para
posteriormente identificar.
No decorrer do estágio, observou-se os seguintes parasitas: Trichuris trichiura,
Taenia spp., Entamoeba coli e a Giardia intestinalis nas fezes e o Oxyorus na
urina (contaminação fecal). A maior parte destes parasitas é transmitida por má
higienização das mãos, contaminadas com ovos do solo e são acidentalmente
ingeridos em alimentos mal confecionados (carne crua- Taenia spp.).
A Giardia intestinalis ou Giardia lamblia é um protozoária flagelado patogénico
encontrado no duodeno e no jejuno dos seres humanos. Há indivíduos totalmente
assintomáticos que possuem este parasita (cistos) em grande número nas fezes
mas em contrapartida existem outros indivíduos cuja presença deste parasita
74
fixado à parede intestinal pode causar irritação e infeção da mucosa do duodeno
ou do jejuno que consequentemente irá provocar diarreia, aguda ou crónica,
associada a hipertrofia das criptas, atrofia das vilosidades e lesão nas células.
Pesquisa da Giardia lamblia
A Giardia lamblia pode ser pesquisada por uma técnica rápida, que consiste na
utilização de tecnologia de membrana com ouro coloidal.
Princípio da técnica:
Uma membrana de nitrocelulose é sensibilizada com um Ac dirigido contra os
quistos da Giardia lamblia. A especificidade é garantida por um anticorpo
específico aos antigénios da membrana do quisto da Giardia lamblia e que se
conjuga com o ouro coloidal. Este conjugado é seco numa membrana. A amostra
por sua vez tem que ser diluída no tampão de diluição fornecido com o teste.
Quando a fase líquida da suspensão fecal entra em contato com a tira, o
conjugado solubilizado migra com a amostra por difusão passiva e o conjugado e
amostra entra em contacto com o Ac anti-Giardia adsorvido na nitrocelulose. Se
a amostra contiver quistos de Giardia lamblia, o complexo conjugado-quisto
permanece ligado ao reagente anti-Giardia e aparece uma linha vermelha. A
solução continua a migrar até encontrar um controlo que confirma o correto
funcionamento do teste.
III- 3- Urianálise (Urinas Tipo II)
A urianálise é o estudo da urina não asséptica, que consiste num estudo
bioquímico por tiras reativas, e no estudo citológico pelo sedimento urinário.
Consiste numa análise de screening de doença renal para os utentes no geral. É
feito uma primeira avaliação macroscópica, que inclui a avaliação do parâmetro
da cor, a avaliação bioquímica, com o estudo de alguns parâmetros bioquímicos,
(e.g. glucose) por fim, a observação do sedimento urinário ao microscópio para a
visualização dos elementos figurados.
É um teste rotineiro, simples e barato. Nesta secção, a urianálise encontra-se
completamente automatizada, o equipamento SediMax, desde a análise
75
bioquímica, centrifugação e a visualização do sedimento por fotografias de
imagens do sedimento (câmara digital incorporada que tira 15 fotografias por
cada urina que é possível visualizar como se fossem 10 campos visuais do
microscópio).
III- 3.1- Análise bioquímica
A análise bioquímica consiste em tiras reativas, que estão impregnadas por
reagentes bioquímicos. A tira reativa ao entrar em contato com a urina vai fazer
com que haja reações e envolvimento de cor, que depois são avaliados numa
escala.
São analisados os seguintes parâmetros: a glicose; as proteínas; a bilirrubina; o
urobilinogénio; o pH; o sangue; os corpos cetónicos; os nitritos; leucócitos.
É necessário ter em conta a idade do doente, o sexo, dieta e exercício físico. A
presença de glicose na urina denomina-se glicosúria, que poderá tratar-se de
diabetes mellitus ou não, no caso das grávidas.
A bilirrubina existe sob duas formas, conjugada e não conjugada, mas apenas a
conjugada é solúvel em água, logo a bilirrubinúria significa a presença de
bilirrubina conjugada na urina. Isto acontece quando a circulação enterohepática
é interrompida por mecanismos de obstrução o que resulta em elevados níveis de
conjugada na circulação sistémica e que, por sua vez, é excretada.
O urobilinogénio é avaliado juntamente com a bilirrubina (produtos de excreção).
O pH varia consoante a dieta, a ingestão de fármacos. A presença de cristais
surge na variação do pH.
As cetonas são produtos dos ácidos gordos. O aparecimento das cetonas pode
indicar uma diabetes descontrolada (cetoacidose), no alcoolismo, em jejum
prolongado e vómitos.
As proteínas elevadas são indicadores de uma má excreção por parte do rim, leva
ao aumento da produção e pode aparecer em situações não patológicas, como o
excesso de exercício físico ou em situações patológicas, como por exemplo, no
mieloma múltiplo.
76
O sangue na urina (hematúria) pode ocorrer em situações como na ITU,
contaminação menstrual no caso das mulheres ou em casos neoplásicos, bexiga/
próstata. No caso da tira positiva ser forte e não for visualizado eritrócitos no
sedimento é porque se trada de mioglobina e não de hemoglobina.
Os nitritos dependem da conversão de nitratos (da dieta) para nitritos pela ação
redutora das bactérias (caso estejam presentes) na urina. Um resultado positivo
indica a presença de bactérias, logo uma possível infeção.
Os leucócitos na urina sugerem a presença de uma ITU.
Estas tiras reativas (URIFLET S®
) não têm o parâmetro da densidade, que
consiste num parâmetro que permite avaliar, por exemplo, se o individuo colheu
a 1ª urina da manhã, ou se o indivíduo em estado de desidratação ou não.
Os parâmetros bioquímicos têm que coincidir com o sedimento urinário, nos
leucócitos, nos eritrócitos, nas proteínas (visualização ou não de cilindros ou
muco), nitritos (presença ou não de bactérias). A análise bioquímica de certo
modo desperta, o que encontrar posteriormente no sedimento urinário.
III- 3.2- Sedimento urinário
No sedimento urinário realizou-se a observação e semi-quantificação (raros,
alguns ou frequentes) dos elementos celulares:
- células epiteliais, células do epitélio de transição e células tubulares;
- leucócitos, eritrócitos, cilindros hialinos, cilindros eritrocitários e leucocitários
(patológicos);
- elementos leveduriformes (estudados na Bacteriologia)
- cristais mais comuns: ácido úrico; oxalato de cálcio; fosfatos (fosfato, amónio e
magnesiano) e menos comuns e patológicos os cristais de leucina, tirosina e
cistina.
Os cilindros são formados pela proteína de Tamm-horsfall nos túbulos renais, a
forma em cilindro é a do túbulo que serviu de molde. São de formação
exclusivamente renal, portanto aquando da sua presença em excesso, é sugestivo
de doença renal, embora um cilindro hialino até 1 a cada 2 campos pode ser
normal. A presença de cilindros eritrocitários (contêm eritrócitos no seu interior)
77
é sugestiva de lesão dos túbulos renais ou capilares renais, aquando dos cilindros
leucocitários (contém leucócitos no seu interior), significa infeção e/ou
inflamação no interior do nefrónio.
Os cristais são formados por precipitações dos sais da urina por alterações na
concentração, na temperatura e no pH da urina, também podem formar cálculos
renais. Os cristais são classificados na diferença do pH:
Cristais ácidos: ácido úrico (é o mais comum) os uratos amorfos, os
cristais de oxalato de cálcio (vitamina C), os cristais de cistina, os cristais
de leucina (doença hepática), os de tirosina e os de colesterol;
Cristais alcalinos: fosfato triplo (fosfato, amónio e magnesiano), os
fosfatos amorfos e por fim os cristais de bilirrubina.
III- 4- Controlo de qualidade interno e externo na secção de
Parasitologia e Urinas
O controlo de qualidade interno é fornecido pelas casas comerciais dos
equipamentos.
O controlo externo da qualidade na pesquisa parasitológica e pesquisa de sangue
oculto nas fezes e na urianálise realizou-se o PNAEQ-INSA.
78
IV- Hematologia
A Hematologia é uma especialidade biomédica, que estuda o sangue e os órgãos
hematopoiéticos em situações fisiológicas e patológicas, bem como os
mecanismos de hemostase (primária e secundária).
O sangue é um tecido altamente especializado e em permanente renovação que,
conjuntamente com o sistema circulatório, tem como funções abastecer as
necessidades dos tecidos, órgãos e sistemas do organismo. Também tem como
função transporte de gases e nutrientes, manutenção da temperatura corporal e
equilíbrio hídrico e eletrolítico, proteção contra infeções e excreção de produtos.
O sangue é composto por duas fases, a fase líquida, que corresponde ao plasma, e
a fase sólida que corresponde aos elementos figurados do sangue. O plasma é
constituído essencialmente por água (91%), proteínas (7%) como a albumina,
globulinas (α1, α2, β1, β2 e γ), fibrinogénio e solutos (2%), iões, nutrientes,
hormonas e produtos residuais.
Em relação às proteínas do sangue, a albumina fornece a pressão osmótica
necessária para bombear água do fluido intersticial para os capilares mantendo
também a pressão sanguínea estável; as globulinas α e β são responsáveis pelo
transporte de lípidos e vitaminas lipossolúveis; as globulinas γ que são sobretudo
anticorpos e o fibrinogénio, que estão envolvidos nos processos de coagulação.
Os elementos figurados do sangue: os eritrócitos são células bicôncavas e
anucleadas (fig.3) com função de transportar o oxigénio no sangue
(hemoglobina). Têm uma duração média de vida de 120 dias. São formados
novos eritrócitos através da eritropoiese (fig.4).
Fig.3: Eritrócitos
79
Fig.4: Processo de maturação dos eritrócitos
Este processo é estimulado por uma hormona, a eritropoetina, que é segregada
nos rins. São necessários os seguintes elementos, o ferro, a vitamina B 12 e o
ácido fólico para que ocorra este processo.
Os leucócitos são células de defesa que se encontram livres no plasma com
possibilidade de movimento ameboide com funções de defesa. Dividem-se em
dois grupos de acordo com os grânulos e linhagens: leucócitos granulares ou
granulócitos (origem mielóide) que inclui os neutrófilos, os eosinófilos e os
basófilos. Os leucócitos agranulares ou agranulócitos (origem linfoide) que inclui
os linfócitos e os monócitos.
Os neutrófilos são células polimorfonuclerares, responsáveis por fagocitose de
bactérias e fungos e, na maioria das vezes, são a primeira resposta a uma infeção;
Os eosinófilos são vesículas repletas de enzimas digestivas com defesa contra
vermes e parasitas, também estão envolvidas em reações alérgicas (fagocitam os
complexos Ag - Ac); Os basófilos libertam histamina (vasodilatador) e heparina
(anticoagulante) e estão envolvidos nas reações alérgicas.
Em relação aos leucócitos agranulares, os monócitos são células fagocíticas que
por vezes se tornam macrófagos. Os linfócitos participam nas defesas imunitárias
e subdividem-se em linfócitos B e T.
O processo de maturação destas células processa-se da seguinte forma (fig.5).
80
Fig.5: Leucopoiese
Estas células têm em comum a célula primordial, com origem na medula óssea
onde se diferencia a via mieloide e a via linfoide. Na via mielóide vão-se
diferenciar, os eosinófilos, os neutrófilos, os basófilos e os monócitos e pela via
linfoide, os linfócitos B e T.
As plaquetas (fig.6) são fragmentos citoplasmáticos celulares provenientes dos
megacariócitos, produzidos também na medula óssea. São importantes na
coagulação participando na formação do tampão plaquetário e promove-se a
formação e endurecimento dos coágulos.
Fig.6: Agregado plaquetário
Os elementos figurados do sangue sofrem um processo de maturação até
chegarem propriamente a células maduras.
81
Neste estágio, na secção de Hematologia, realizou-se, em sangue periférico, a
análise das séries: leucocitária, plaquetária e eritrocitária. Na série eritrocitária,
efetuou-se a contagem total dos eritrócitos e a determinação de parâmetros
hematológicos como o da hemoglobina, do hematócrito e os índices eritrocitários
ou globulares, o volume globular médio (VGM), a hemoglobina globular média
(HGM), a concentração de hemoglobina globular média (CHGM), o coeficiente
de dispersão eritrocitária (CDE) e os reticulócitos.
Na linhagem plaquetária, realizou-se a contagem total de plaquetas e a
determinação de alguns parâmetros associados a esta linhagem, tais como, o
volume plaquetar médio.
No estudo da série leucocitária, efetuou-se a contagem total dos leucócitos, no
sangue periférico, e a respetiva fórmula leucocitária das cinco populações, os
neutrófilos, os eosinófilos, os basófilos, os linfócitos e os monócitos. Executou-
se também a velocidade de sedimentação (VS), a hemoglobina glicada (HbA1C)
e a separação das hemoglobinas, e por fim, o estudo da hemostase secundária
(Coagulação).
Nesta secção, também realizou-se o mielograma, que consiste no estudo de
avaliação da celularidade da medula óssea, assim como, das características
maturativas e morfológicas das linhagens hematopoiéticas, e a contagem
diferencial destas células.
IV- 1- Amostra
A amostra utilizada no hemograma, na VS, na HbA1C e na separação de
hemoglobinas, é sangue total com anticoagulante, o EDTA, em concentração de
1,50 +/- 0,25 mg/ml de sangue total. Este anticoagulante é um quelante do cálcio
e forma sais de cálcio insolúveis impedindo a coagulação do sangue.
Na coagulação é utilizado plasma, no qual é aplicado o anticoagulante citrato de
sódio, na proporção 9:1, para a obtenção de amostra de plasma.
82
IV- 2- Metodologia
Esta secção encontra-se praticamente automatizada, com a exceção, da execução
dos esfregaços periféricos e a coloração dos aspirados de medulas ósseas. O
hemograma efetuou-se no analisador automático Coulter® LH 750 Hematology
Analyser da Beckman Coulter (Citometria de Fluxo) Beckman Coulter. Os
esfregaços de sangue periférico realizaram-se manualmente e corados pelo
equipamento automático, o Aerospray® 7120 Hematology Slide Stainer.
Os analisadores em que se determinou a VS foram da Menarini, baseados num
método derivado ao método de Westergren.
O equipamento onde se efetuou a separação das hemoglobinas (A2, F e A1c) foi o
BioRad Variant™ II, que utiliza os princípios de high-performance liquid
chromatography (HPLC) na permuta de iões para efetuar a separação automática
das hemoglobinas normais e anormais e também na quantificação da
hemoglobina A2, F e A1c, em amostras de sangue total.
A Coagulação realizou-se no equipamento da Werfen Group - Izasa, o ACL
TOP, que consiste em três métodos, dependendo da análise: coagulimétrico,
cromogénico e imunológico.
IV- 3- Hemograma
O hemograma é um dos exames complementares de diagnóstico mais
frequentemente requisitados na secção de Hematologia, permite a avaliação e
quantificação dos elementos celulares do sangue: eritrócitos, leucócitos e
plaquetas.
Na realidade, é o exame de primeira linha no estudo da função hematológica,
contudo, uma análise atenta e cuidada dos elementos celulares implica, para além
da quantificação de cada um dos tipos de células sanguíneas, o estudo da sua
morfologia a partir dos índices eritrocitários, leucocitários e plaquetários, e da
visualização do esfregaço de sangue periférico.
83
Eritrócitos
O estudo da série eritrocitária inclui a contagem do número total de glóbulos
vermelhos, a determinação da hemoglobina, do hematócrito e dos índices
eritrocitários ou globulares (tabela X).
Tabela X: Índices Globulares Índices eritrocitários
Definição
Hemoglobina (g/dL)
Proteína nos eritrócitos que transporta O2 para os órgãos vitais e todo o
sistema vascularizado.
Hematócrito (L/L)
Volume médio do volume dos glóbulos vermelhos.
Volume globular médio
(VGM) (fl)
Valor médio do volume do glóbulo vermelho.
Hemoglobina globular média
(HGM) (pg)
Indica o peso da hemoglobina contida num glóbulo vermelho médio
Concentração da hemoglobina
globular média (HGM) (g/dL)
Indica a concentração média de Hemoglobina por unidade de volume
de glóbulos vermelhos
Os métodos e interesse destes índices estão demonstrados na tabela seguinte
(tabela XI).
Tabela XI: Método e análise dos Índices eritrocitários Índices eritrocitários do hemograma no Coulter LH750
Parâmetro Método Análise
Hemoglobina
(Hb)
Cianohematohemoglobina Detetar, avaliar e monitorizar (no tratamento) as
anemias
Hematócrito (Ht)
Calculado (Coulter) Deteção de anemias e poliglobulias; Informação
sobre o aspecto do plasma; Determinação dos
índices globulares (VGM, CHGM).
VGM
VGM(fl)= Ht(L/L)/GV(x1012
/L) Microcitose; Macrocitose; Anisocitose
(Macrocitose + Microcitose).
CHGM
CHGM(g/dL)=
Hb(g/dL)/Ht(L/L)
Hipocromia, Normocromia e Esferocitose.
Coeficiente de
dispersão
eritrocitária CDE
(%)
Analisador automático através
do histograma da dispersão do
VGM
Dispersão do volume dos eritrócitos, ou seja
para identificar uma possível anisocitose.
84
O VGM, a HGM, a CHGM e o CDE, para além de serem determinados pelo
analisador automático, podem ser visualizados num esfregaço de sangue
periférico. Podem apresentar varias formas e tamanhos, como demonstrados na
figura 7.
Fig.7: As variações do tamanho e forma mais frequentes nos glóbulos vermelhos, onde
poderão ser encontradas em algumas anemias.
Com a análise destes parâmetros, nomeadamente o VGM e o CHGM, é possível
classificar algumas anemias (anemia microcítica hipocrómica, normocítica
normocrómica, macrocítica), demonstrados na figura 8.
85
Fig.8: Classificação das anemias com base no volume globular médio.
Leucócitos
Na série leucocitária realizou-se o número total de leucócitos no sangue
periférico e a respetiva fórmula. A metodologia da citometria de fluxo classifica
o maior número de células, tendo, portanto uma maior precisão.
O analisador da Beckman-Coulter, o contador fornece os cinco elementos
diferenciais de leucócitos através da tecnologia VCS (volume, condutividade e
dispersão da luz laser (scatter)). À medida que as células passam na célula de
fluxo, são realizadas 3 medições: a impedância, a frequência baixa determina o
volume celular; a condutividade, a frequência alta permite avaliar a
condutividade interna da célula e, portanto, a sua complexidade em termos de
organelos celulares; e, por fim, a dispersão da luz dá informação acerca da forma
e estrutura celular.
Os valores de referência da linhagem leucocitária e das restantes linhagens
hematopoiéticas estão representados na figura 9.
Os valores de referência variam consoante o sexo e a idade.
86
Fig.9: Valores de referência do hemograma.
Reticulócitos
O número total de reticulócitos contabilizou-se também no analisador Beckman-
Coulter, onde se utiliza também a tecnologia VCS, referida anteriormente, após
coloração dos reticulócitos com azul de metileno (que vai ligar-se ao RNA dos
reticulócitos). O interesse na contagem dos reticulócitos é sobretudo:
- Avaliar a atividade da linhagem eritropoiética da medula, diagnosticar se uma
anemia é regenerativa (↑) ou arregenerativa (N ou↓);
- Aquando de um tratamento de anemias (ferropénica, perniciosa ou deficiência
em ácido fólico);
- Monitorização de doentes renais em tratamentos com eritropoetina;
- Avaliar se há regeneração sanguínea após uma grande perda de sangue.
IV- 4- Esfregaço de sangue periférico
O esfregaço sanguíneo permite realizar:
o estudo morfológico e dos eritrócitos, plaquetas e leucócitos;
a fórmula leucocitária;
a confirmação dos parâmetros obtidos nos auto-analisadores.
87
Na técnica para execução do esfregaço utilizou-se lâmina com lâmina. Deve
limpar-se sempre a lâmina antes de realizar o esfregaço, para evitar que a gordura
(por vezes existente) interfira no esfregaço.
Colocou-se uma gota de sangue próxima de uma das extremidades da lâmina.
Procedeu-se à sua extensão, com uma lâmina com uma inclinação de 45º.
Retrocedeu-se um pouco a lamela, havendo o contato com a gota de sangue e
esta espalha-se por capilaridade ao longo da linha de contato. De seguida fez-se
deslizar a lâmina sobre a lâmina, com movimento firme e delicado e deixou-se
secar ao ar, posteriormente, corou-se pela coloração de May-Grünwald-Giemsa
(sendo esta coloração utilizada também na coloração dos aspirados de medula
óssea).
IV- 4.1- Coloração de May-Grünwald-Giemsa
A coloração de May-Grünwald-Giemsa fundamenta-se em fixar o esfregaço pelo
metanol presente na solução de May-Grünwald (solução metanólica de eosinato
de azul de metileno). A dissociação do corante de May-Grünwald efetuada pelo
tampão de fosfatos (o eosinato de azul de metileno, ao pH conferido pelo
tampão→ eosina + azul de metileno). Vai dar-se a ação individual dos corantes,
eosina (corante ácido que vai corar os componentes citoplasmáticos da célula
(eosinófilos ou acidófilos) de rosa-alaranjado e o azul de metileno corante básico
que vai corar o núcleo e os componentes citoplasmáticos ácidos (basófilos) de
azul-arroxeado. A eosina em conjunto com o azul de metileno vão corar as
granulações (neutrófilas) de cor rosa. A ação da solução de Giemsa diluída é
fazer com que os corantes presentes no Giemsa, o eosinato de azul de metileno e
o esoinato de azur de metileno sejam dissociados pelo tampão de fosfatos, assim
os corantes individuais→ eosina + azul de metileno + azur de metileno (cora as
granulações azurófilas de vermelho-púrpura) vão exercer a sua ação. Esta
coloração May-Grünwald-Giemsa é uma coloração panótica que combina as
vantagens na utilização de vários corantes, corando elementos acidófilos,
granulações azurófilos e granulações neutrófilos.
88
O esfregaço de sangue periférico, do lado anterior para o lado posterior da lâmina
é constituído por três zonas, cabeça, corpo e franja/cauda. É na zona da franja,
onde as células se apresentam constantes e uniformes com as características e
tamanho adequados, que se deve proceder à contagem leucocitária e à análise
morfológica dos eritrócitos, leucócitos e plaquetas.
A visualização do esfregaço de sangue periférico, no microscópio ótico, inicia-se
com a objetiva de 10x para avaliar se a coloração e o esfregaço, se estiverem
adequados, segue-se para a observação com a objetiva de 40x para contagem
celular e, por fim, a observação com a objetiva de 100x, para avaliação
morfológica.
IV- 5- Separação de hemoglobinas
Este é um parâmetro que habitualmente não é avaliado na secção de
Hematologia, mas sim na secção de Bioquímica. Por uma questão de espaço
físico, é realizado e validado na secção de Hematologia.
O analisador é o VARIANT™ II HbA2/ HbA1c destina-se à determinação da
hemoglobina A2, F e A1C no sangue total, utilizando o método de HPLC, por
permuta de iões.
IV- 5.1- HbA1C
A diabetes mellitus (doença que afeta mais de 5% da população) foi definida do
ponto de vista clínico como sendo uma deficiência absoluta ou relativa da
insulina que pode progredir para uma hiperglicémia e que está muitas vezes
associada a complicações micro e macrovasculares específicas.
O objetivo do tratamento da diabetes é manter um nível constante e normal de
glicose no sangue. À medida que o nível de glicose no sangue sobe, o aumento
da glicação não enzimática das proteínas é proporcional, tanto ao nível de
glicose, como ao tempo de vida da proteína na circulação ou nos tecidos. Uma
vez que a vida média de um eritrócito é de 120 dias, a HbA1C tem sido aceite
como uma medição que reflete melhor as concentrações em jejum de glicose no
89
sangue, a concentração de glicose no sangue diária média e o grau de
desequilíbrio de carbohidratos durante os quatro meses anteriores.
A HbA1C forma-se lentamente em dois passos, através da glicação não
enzimática da HbA. Primeiro forma-se uma aldimina lábil (base de Schiff)
através da condensação reversível do grupo carbonilo (C=O) da glicose e do
grupo amina (NH) da valina do terminal N da cadeia de Hb-β. A quantidade da
aldimina formada depende da concentração de glicose no sangue.
Enquanto os eritrócitos circulam, uma parte da aldimina é sujeita a um processo
de conversão lenta (rearranjo Amadori) para formar uma cetoamina estável
(HbA1C), uma vez que a concentração da base de Schiff (aldimina) muda de
forma, com as flutuações da concentração de glicose no sangue e, uma vez que
nem toda a aldimina é convertida em HbA1C estável, é essencial fazer a
distinção entre HbA1C estável e lábil. O nível de HbA1C é proporcional à
concentração média de glicose como ao tempo de vida da Hb em circulação.
Os métodos para a determinação da HbA1C incluem a electroforese, a focagem
isoelétrica, métodos colorimétricos, ensaios imunológicos e cromatografia em
coluna. Se bem que cada técnica possa ter uma vantagem sobre as outras, pode
igualmente ter desvantagens (ex: usando métodos electroforéticos, as Hb S e C
não interferem, mas níveis elevados de HbF interferem nas medições da HbA1C.
O programa do Variant baseia-se na separação cromatográfica das hemoglobinas
num contexto de permuta de iões. A separação é otimizada para minimizar as
interferências das variantes de hemoglobina, base de Schiff e da hemoglobina
carbamilada.
IV- 5.2- HbA2 e HbF
O sangue em indivíduos adultos contém principalmente HbA, uma pequena
percentagem de HbA2 e vestígios de hemoglobina fetal, HbF.
As hemoglobinas variantes fazem parte de um grupo de distúrbios herdados, as
hemoglobinopatias, que são o resultado de uma síntese defeituosa das cadeias de
globina, formam a molécula de hemoglobina, podendo ocorrer um defeito de
duas formas: enquanto as hemoglobinas anormais resultam da produção de uma
90
cadeia de globinas estruturalmente diferentes, as hemoglobinopatias também
podem ser criadas por uma diminuição na produção de uma cadeia de globinas,
estruturalmente normal. Nesta situação, as cadeias de globina e β são
sintetizadas em quantidades desiguais. A produção desequilibrada de cadeias,
que daí resulta, dá origem a uma produção inadequada de hemoglobina normal e
cria um excesso da cadeia de globina normalmente produzida, originando um
tetrâmero instável. Os estados que resultam de tal produção desequilibrada de
cadeias denominam-se de talassémias. Os portadores da β-talassémia têm níveis
de HbA2 e F que podem ser superiores a 3,5% e a 2% da Hb total,
respetivamente. A determinação de níveis simultaneamente elevados de HbA2 e
F tornou-se o meio mais prático para diagnosticar β-talassémia. Os métodos para
a quantificação da HbA2 incluem a electroforese e a cromatografia em colunas de
permuta de aniões. Os métodos para a quantificação da HbF incluem a
electroforese, a desnaturação alcalina e a imunodifusão radial (RID).
IV- 6- Teste da fragilidade osmótica
Este teste consiste em detetar problemas de membrana nos eritrócitos. Este teste
é um meio simplificado de estimar a razão superfície/área/volume dos eritrócitos.
A sua utilidade é no diagnóstico de esferocitose hereditária (↑CHGM), mas pode
também ser utilizado na triagem para a β-talassémia. O princípio do teste: os
glóbulos vermelhos são colocados numa solução hipotónica, a água desloca-se
por osmose para o interior do eritrócito. Isto resulta na turgescência da célula,
que forma toma uma forma esférica. Após o volume crítico ser atingido, a
membrana primeiro cede e depois rompe-se (usando várias concentrações
salinas), libertando a hemoglobina e todo o seu conteúdo. A quantidade de
hemoglobina no sobrenadante é medida colorimetricamente e comparada com
uma amostra de células completamente em lise.
A fragilidade osmótica aumentada ocorre na esferocitose hereditária, na anemia
hemolítica autoimune. O aumento da resistência à hemólise é característica da β-
talassémia, em ambas as formas, homozigótica e heterozigótica, na deficiência de
ferro, ou seja em qualquer outra condição em que o aumento da
91
superfície/área/volume dos glóbulos vermelhos esteja presente (também em
alguns casos de doença hepática).
IV- 7- Velocidade de sedimentação
A VS consiste na queda espontânea dos elementos figurados do sangue (os
eritrócitos são os que existem em maior número) em suspensão no plasma. O
analisador da Menarini baseia-se de um método equivalente ao de Westergren em
que numa primeira fase há uma agregação e depois ocorre a sedimentação dos
eritrócitos.
Os valores de VS aumentados ocorrem em várias situações: infeções agudas e
crónicas (tuberculose, sífilis) processos inflamatórios agudos (apendicite);
doenças reumáticas (febre, artrite); necrose tecidular; doenças neoplásicas
(leucemias, mielomas, plasmocitomas) e em anemias. Quando a VS se encontra
diminuída poderá tratar-se de poliglobulias, hipofibrinogenémia e situações
associadas a alteração da forma dos glóbulos vermelhos (valores de referência da
VS: homem até 13mm e mulher até 10 mm). Há dados fisiológicos que vão
alterar estes valores de referência, como a idade, o sexo, a gravidez e o período
menstrual. Além dos fatores fisiológicos existem outros fatores que vão
influenciar na análise, como por e.g. a formação de rouleaux, a viscosidade do
sangue e a proporção do sangue/anticoagulante.
IV- 8- Coagulação
A coagulação no sangue envolve um sistema de amplificador biológico em que
algumas substâncias ativam por proteólise, a cascata de proteínas (figura 10)
circulantes e percursoras da coagulação.
Plaquetas
As plaquetas derivam do citoplasma dos megacariócitos após um tempo de
maturação de aproximadamente de 4 dias, cada megacariócito origina cerca de
1000 plaquetas. O tempo de sobrevivência destas células na circulação é de 7 a
92
10 dias. A contagem normal destas células varia entre os 150-400 109/ml nos
indivíduos.
As plaquetas funcionam como a base celular para a hemostase primária, os
recetores da membrana plaquetária são os mediadores primários da hemostase e
permitem que as plaquetas se liguem diretamente ao endotélio e subendotélio nos
locais de lesão. A adesão plaquetária provoca uma sinalização transmembranar,
através dos seus recetores de superfície, induzindo a ativação plaquetária e
posterior função pró-coagulante através de translocação de recetores para a
superfície da membrana celular, alteração conformacional dos recetores,
libertação do conteúdo dos grânulos e exposição dos fosfolípidos membranares.
Fig.10: Via extrínseca e via intrínseca da cascata da coagulação.
A superfície da plaqueta serve como plataforma para a montagem da cascata da
coagulação e formação de trombina, que amplifica a resposta pró-coagulante e
produz a fibrina, permitindo a hemostase secundária.
Por fim as plaquetas ajudam na consolidação do trombo através do fator XIII e
proteção contra a fibrinólise através do fator 4 plaquetário.
A síntese da maioria dos fatores de coagulação ocorre no fígado, de modo que,
nas doenças hepáticas graves, os níveis de todos esses fatores estão diminuídos,
exceto o fator VIII, que também é produzido pelas células endoteliais e as células
do sistema reticuloendotelial. A protrombina (fator II) e fatores VII, IX e X são
93
dependentes da Vitamina K para se tornarem ativos, assim como os
anticoagulantes naturais as Proteína C e S. O fator tecidular (FT) é o iniciador
fisiológico da coagulação e é expresso nos fibroblastos subendoteliais e células
musculares lisas, sendo também expresso pelos monócitos periféricos e células
endoteliais vasculares após exposição de estímulos ativadores ou inflamatórios
como as endotoxinas.
Cascata da coagulação
A cascata da coagulação (hemostase secundária) in vivo é propagada por
complexos enzimáticos que apenas funcionam eficazmente nas superfícies
membranares de fosfolípidos, fornecidos pelas plaquetas ativadas e células
endoteliais (figura 11).
O FT, expresso após lesão endotelial, liga-se ao fator VIIa circulante e o
complexo FT-VIIa liga-se aos seus substratos, fatores IX e X, na superfície
plaquetária, formando o complexo tenase, dependente de FT.
As plaquetas fornecem ainda recetores específicos para os fatores de Xa, IXa e
Va. O fator V é secretado pelos grânulos α e principalmente, fornecido pelo pool
citoplasmático. A fosfatidilserina expressa pelas plaquetas acelera as reções
enzimáticas pró-coagulantes e protege os fatores ativados dos inibidores
circulantes, culminando este processo com a formação acelerada de trombina, do
seguinte modo:
1- o complexo fator Xa-Va, juntamente com cálcio livre e fosfatidilserina
plaquetária, liga-se ao fator II (pró-trombina) formando o complexo
protombinase que gera trombina em pequenas quantidades;
2- a trombina formada inicialmente não forma fibrina em quantidades
significativas mas pode ativar os fatores VIII, V e XI;
3- a trombina exerce feedback positivo amplificando a cascata da coagulação,
aumentando exponencialmente a formação do fator Xa e trombina;
94
4- com este rápido aumento na formação de trombina, o fibrinogénio é degradado
em monómeros de fibrina que formam uma matriz integrada no coágulo de
plaquetas;
5- o fator XIII converte a fibrina solúvel num polímero insolúvel e liga a α2-
antiplasmina à fibrina, protegendo o coágulo da dissolução pela plasmina.
Fig.11: Cascata da coagulação
A avaliação laboratorial da coagulação inclui a avaliação da via extrínseca e da
via intrínseca, através do tempo de protrombina (TP) e o tempo de
tromboplastina parcial (TTP), respetivamente. O TP monitoriza primariamente a
atividade do fator VII e o TTP é o parâmetro que analisa os fatores hemofílicos,
VII, IX e XI. Ambos (TP e o TTP) detetam a deficiência dos fatores comuns às
duas vias (II, V e X).
IV- 8.1- Avaliação laboratorial
A avaliação de uma discrasia hemorrágica requer uma história clínica bem
organizada, o exame físico e laboratorial. Os exames laboratoriais, o tempo de
95
tromboplastina parcial ativada (PTTA), o TP são geralmente úteis na avaliação
inicial do doente com hemorragia (fig.12).
PTTA
Monitoriza a via intrínseca, consiste no tempo de coagulação após estimulação
plasmática com um composto de carga negativa, sendo o seu valor normal de
27s. O TTP é sensível à deficiência de fatores de contato e dos fatores de
coagulação, VIII, IX e XI. O TTP é usado também na monitorização rápida da
terapêutica com Heparina não fracionada.
TP
Monitoriza a via extrínseca, em que mede a interação entre o fator VIIa
circulante e FT-tromboplastina exógeno adicionado. O TP é altamente sensível a
deficiências dos fatores II (pró-trombina) V, VII e X. Como os fatores II, VII e X
são dependentes da Vitamina K. O TP é o mais sensível a medir a eficácia da
terapêutica da Varfarina. O TP nunca é afetado pela deficiência dos fatores VIII,
IX, XI e XII. O valor normal do TP é à volta dos 12s.
As anomalias do fatores II, V e X causam o prolongamento do TP e do APTT.
Fig.12: Testes usados no screening da coagulação.
96
O RNI (razão normalizada internacional) é importante na monitorização de
doentes hipocoagulados.
Foi criado para normalizar as variações do TP
induzido pela Varfarina e para permitir a
aplicação global de recomendações
anticoagulantes.
O RNI baseia-se no ISI (Índice de
Sensibilidade Internacional (fornecido pelo
fabricante da tromboplastina) de cada
tromboplastina, estandardizado para o FT e é
calculado da seguinte forma:
Razão (R) = Tempo formação do coágulo do plasma a testar
Tempo formação do coágulo do plasma normal
RNI=RISI
97
A tabela seguinte mostra outros parâmetros envolvidos na hemostase secundária
determinados na secção de Hematologia.
Tabela XII: Testes realizados na secção de Hematologia no estudo da hemostase
secundária. Teste
Definição
ATIII (Antitrombina III) Protease circulante que inibe a atividade da trombina e fatores IXa, Xa e
XIa. A sua ação é potenciada pela ligação à heparina
D-Dímeros Produtos de degradação de um agregado de fibrina, formados
exclusivamente a partir da degradação de um trombo. O teste é indicado
quando há suspeita clínica de trombose venosa profunda ou embolia
pulmonar, é um teste de valor preditivo negativo (permite exclusão de
diagnóstico). Pode também ajudar no diagnóstico de coagulação
intravascular disseminada, em casos de suspeita.
Proteína C ativada (APC) Cliva os fatores Va e VIIIa livres inibindo os respetivos complexos
protombinase e tenase e inibe a formação de trombina
Proteína S Cofator da APC. Funciona apenas no estado livre e não quando ligada à
proteína ligante de C4b. esta última pode estar aumentada em doenças
agudas, levando a um estado pró-coagulante
Défice de atividade da
Proteína C ativada ou
Resistência à Proteína C
ativada (APCR)
É teste de rastreio da resistência à Proteína C ativada para a mutação do
fator V Leiden (Biologia Molecular). A maioria dos pacientes com
resistência funcional à APC tem uma única mutação pontual no gene do
fator V. Esta mutação torna o fator Va incapaz de ser inativado pela APC.
Deste modo o fator Va ativa a cascata da coagulação e há um predomínio
dos fatores pró-trombóticos. O padrão de hereditariedade do fator V de
Leiden é autossómico dominante.
IV- 8.2- Patologias mais comuns na secção de Hematologia
As hemofilias são doenças hereditárias ligadas ao X, afetam a hemostase
secundária e são deficiências de fatores de coagulação mais comuns a seguir da
doença de von Willebrand (vWF) (fig. 13).
A hemofilia A consiste numa deficiência de fator VIII e tem uma maior
prevalência do que a hemofilia B, que se deve uma deficiência do fator IX. Afeta
essencialmente indivíduo do sexo masculino mas pode também afetar mulheres
se houver uma inativação extrema do cromossoma X. Clinicamente, os doentes
apresentam hemorragias e o tratamento consiste na administração de
concentrados de fator VIII ou IX, dependendo do tipo de hemofilia, viralmente
inativados ou recombinantes. Quer em casos mais graves ou ligeiros, estes
doentes necessitam de repor os fatores em falta.
98
Fig.13: Demonstração de alguns parâmetros alterados nas patologias: hemofilia A,
deficiência do fator IX e na doença de von Willebrand.
A doença de vWF é uma discrasia hemorrágica do tipo plaquetária e deve-se a
uma alteração genética ou adquirida do vWF. São os multímeros maiores de
vWF que conferem maior capacidade hemostática. Em pacientes com pouco
vWF ou em que o vWF é anormal, a adesão das plaquetas aos vasos lesados é
lenta, o que resulta em hemorragia das mucosas e aumento do tempo de
hemorragia.
O vWF é também o transportador do fator VIII, de modo que a deficiência de
vWF ou a ligação anormal vWF-fator VIII leva a uma depuração rápida do fator
VIII, diminuição dos níveis de fator VIII e aumento do TTP.
IV- 9- Controlo de qualidade interno e externo em Hematologia
O controlo interno da qualidade na secção de Hematologia provém das casas
comerciais da Bio-rad.
O controlo externo da qualidade realizou-se o PNAEQ-INSA.
99
V- Bioquímica
A bioquímica clínica é uma área laboratorial que se dedica ao estudo analítico de
amostras biológicas, tendo como objetivo principal dar apoio ao diagnóstico e
monitorização clínica de doentes.
Neste âmbito, permite avaliar funções biológicas; processos metabólicos; função
e/ou lesão de órgãos mediante, por exemplo, o doseamento de enzimas que são
produzidos /secretados por estes órgãos em condições normais ou patológicas
(por exemplo, doseamento de enzimas cardíacas na suspeita de enfarte do
miocárdio), entre outros.
Outras vertentes da bioquímica clínica são: a toxicologia (que se dedica ao
rastreio de drogas de abuso) e a monitorização de fármacos.
Estruturalmente, a secção de bioquímica clínica situa-se numa das maiores áreas
do serviço, o LabCore, que inclui também as secções de Imunologia e
Hormonologia.
O SPC dispõe ainda de uma sala de química manual onde são realizados alguns
testes de cromatografia (cobre urinários, zinco), assim como doseamentos de
fármacos imunossupressores tais como ciclosporina, tacrolimus e sirolimus.
V- 1- Amostra
A maioria dos parâmetros bioquímicos é determinada em amostra de soro, sendo
também utlizadas amostras de plasma, urina 24 h, amostra de urina ocasional,
sangue total e líquidos biológicos. É importante que, tanto o soro como o plasma,
sejam separados da parte sólida (elementos celulares) o mais breve possível após
a colheita. Este passo previne a troca de substâncias entre a porção celular e a
porção líquida, o que pode alterar os resultados dos testes.
O procedimento da colheita do sangue venoso também é muito importante, visto
que um mau procedimento pode comprometer os resultados de alguns parâmetros
analíticos, tais como o potássio e as proteínas totais.
O transporte da amostra biológica também é um fator muito importante, tendo
em conta que a maior parte das amostras provêm do exterior do HNM.
100
De entre os fatores que podem afetar a viabilidade das amostras, os mais
relevantes são: sistema de transporte, posicionamento da amostra primária à
exposição de luz solar/artificial, temperatura (↑ºC: deteriora alguns parâmetros,
diminuição da glicose, aumento do fósforo, hemólise; ↓ºC: hemólise), tempo
(máximo de 2h após a colheita de sangue venoso não centrifugado, para manter a
estabilidade) e alterações mecânicas, onde um excesso de agitação leva a
hemólise.
As condições em que a amostra biológica se encontra, por exemplo, com fibrina,
lipémicas, ictéricas, hemolisadas, têm que ser avaliadas e reportadas, podendo
condicionar a alteração de alguns parâmetros bioquímicos. As amostras de soro
com fibrina advêm do tempo insuficiente para a retração do coágulo (30 minutos
a temperatura ambiente) e da terapêutica com anticoagulantes, levando a
consequências adversas, como, obstrução das pipetas dos aparelhos o que resulta
na obtenção de resultados incorretos. As amostras lipémicas surgem pelo
aumento das lipoproteínas, principalmente dos triglicéridos, o que leva a algumas
interferências no método, como por exemplo, no aumento de ácido úrico,
proteínas totais e glicose e na diminuição por e.g. da creatinina. As amostras
ictéricas resultam do aumento da concentração das bilirrubinas, interferindo em
parâmetros como ácido úrico, colesterol total e triglicéridos, diminuindo-os. A
hemólise da amostra interfere no doseamento nomeadamente, bilirrubinas,
marcadores cardíacos (Ck e Ck-MB) e analitos intracelulares tais como o
potássio e o lactato desidrogensase (LDH).
As amostras devem ser analisadas no prazo de uma hora, deixando-as à
temperatura ambiente. Caso o prazo de análise seja superior a uma hora,
refrigera-se as amostras a 4˚C. No caso dos testes que envolvam enzimas, as
amostras devem ser congeladas imediatamente após a colheita, para evitar a
perda da atividade enzimática. As amostras para o estudo da bilirrubina devem
ser conservadas num recipiente escuro já que a bilirrubina é degradada pela luz.
Alguns parâmetros são alterados após a ingestão de alimentos (glucose,
triglicerídeos, colesterol), daí que a colheita tem que ser efetuada ao paciente em
jejum (12h antes da hora da colheita). Há outros parâmetros que podem sofrer
101
variações como, a creatinina quinase, ferro e corticoesteróides, daí que seja
fundamental a indicação da hora da colheita.
V- 2- Metodologia e análises efetuadas na secção de Bioquímica
O número de instrumentos disponíveis no mercado, para realização de análises
bioquímicas, cresceu rapidamente nos últimos anos. Muitos desses instrumentos
fornecem uma ampla variedade de técnicas e metodologias que se encontram
disponíveis em simultâneo no mesmo equipamento, sendo também de fácil
utilização sob o ponto de vista do operador.
A par dos avanços tecnológicos dos analisadores de química clínica, também se
verificou a criação de sistemas automatizados para os processos da fase pré-
analítica com o intuito de atenuar a ocorrência de erros inerentes a esta fase,
assim como garantir a segurança dos funcionários e diminuir o tempo de resposta
dado pelo laboratório.
Neste sentido, e de forma a melhorar a resposta dada pelo SPC, foi implementado
na área LabCore, um sistema automatizado de pré análise e uma cadeia robótica,
a qual permite a articulação dos vários equipamentos de bioquímica e
hormonologia com módulos de pré-analítica e um armazenador de amostras.
A secção de Bioquímica utiliza os seguintes aparelhos do LabCore da Beckman
coulter®
:
AutoMate™ Sample Processing System
o Centrifugação; determinação do nível de soro mínimo para a realização de
alíquotas; módulo de descapsulação; execução de alíquotas para as
secções de Serologia, Imunologia e Hormonologia e sua etiquetagem;
o Separação de amostras (tubos primários e alíquotas) para as várias secções
do serviço, assim como para o serviço de imunohemoterapia;
o Separação das amostras destinadas à secção de hematologia de acordo
com os parâmetros a analisar (hemograma, VS e hemoglobina glicada).
Cadeia robótica
o Módulo de entrada
102
Unidade Inlet (entrada de amostras no sistema informático
do laboratório)
Unidade Outlet (para separação de amostras rejeitadas);
o Centrífuga;
o Descapsulador;
o Analisador automatic UniCel DxI 800 (Hormonologia);
o Analisador automatic Dxi Au 5400 (Bioquímica analítica);
o Recapsulador;
o Armazenador frigorífico para amostras;
o Módulo de saída
Unidade outlet (para amostras com parâmetros analíticos a
determinar fora da cadeia robótica).
Rotina
Quando as amostras chegam à secção (após terem passado pela triagem do SPC),
são colocadas em racks do automate: com centrifugação ou sem centrifugação
(Imunologia, Serologia, Hematologia, Imunohemoterapia) e robótica
(Bioquímica e Hormonologia). Insere-se as duas primeiras no automate e a
última na cadeia robótica. Esta última é colocada na cadeia robótica se as
amostras tiverem somente pedidos de parâmetros que se realizem nos aparelhos
da cadeia.
O equipamento automate faz também a separação para uma rack específica de
amostras que não obedeçam aos critérios definidos para a sua colocação na
cadeia robótica, tais como tubos pediátricos, amostras com quantidade de soro
insuficiente ou alíquotas. No final da análise, os tubos são armazenados no
armazém refrigerado, através da seleção automática da cadeia robótica.
A fase pré-analítica é uma das fases suscetível de maior número de erros
analíticos na marcha laboratorial.
Esta automatização (LabCore) do SPC traz muitas vantagens, nomeadamente:
- reduz a exposição do técnico ao risco biológico;
- permite padronizar as várias etapas e atividades da fase pré-analítica;
103
- reduz o tempo de manipulação das amostras (preparação das amostras,
alíquotas e etc.);
- diminuição da ocorrência de erros;
- permite visualizar o trajeto da amostra (rastreabilidade da amostra).
V- 2.1- Equipamento automatizado e método
A tabela seguinte mostra os testes e a respetiva metodologia executadas no
equipamento Dxi Au5400.
Tabela XIII: Testes realizados na secção de Bioquímica .
Testes Metodologia Interesse
Glucose Ensaio enzimático (método de
hexoquinase)
Diabetes; Defeitos
congénitos enzimáticos
Bilirrubina direta
Ensaio colorimétrico
Função hepática
Bilirrubina total
Albumina Função hepática e renal;
Perturbações metabólicas e
nutricionais.
Proteínas totais
β2-microglobulina
Imuno-turbidimétrico
Patologias renais,
oncológicas, auto-imunes,
infeções bacterianas e
víricas
Ck (creatinina quinase) Ensaio enzimático com imuno-inibição
Função cardíaca
Ck-mb (creatinina quinase
miocárdio)
Teste de imuno-inibição enzimática
AST (Aspartato
aminotransferase)
Ensaio enzimático cinético
Função Hepática e
Cardíaca
ALT (Alanina
aminotransferase)
Função Hepática
104
Testes Metodologia Interesse
ApoB (Apolipoproteína B) Imuno-turbidimétrico
Avaliação cardiovascular
Perfil lipídico
Colesterol Total Ensaio enzimático colorimétrico
LDL
HDL
Triglicéridos Ensaio enzimático colorimétrico
Ureia Ensaio enzimático cinético
Função renal
Creatinina Método de Jaffé (cinético colorimétrico)
Microalbumina Ensaio imuno-turbidimétrico
Magnésio Ensaio colorimétrico - método direto no
qual os iões de magnésio formam um
complexo colorido com azul de xilidil
numa solução fortemente básica.
Ácido úrico Ensaio enzimático colorimétrico Doença renal e Gota
Fosfatase alcalina Ensaio cinético
colorimétrico
Função hepática e
Metabolismo ósseo
Amónia Ensaio enzimático Insuficiência renal;
Acidoses tubulares;
Insuficiência hepatocelular
Ferro
Ensaio colorimétrico
Anemias
Fósforo inorgánico Aporte nutricional
γGT (gama-glutamil
transferase)
Ensaio cinético
colorimétrico
Função hepática
Lactato Ensaio enzimático colorimétrico Hipoxia e distúrbios
metabólicos
LDH- Lactato
Desidrogenase
Ensaio enzimático cinético
Enzima inespecífica
(hepática, músculo
cardíaco, sistema músculo-
esquelético, doenças
Hemato-oncológicas: e.g.
testículos, linfomas e
leucemias
Proteína C-reativa Ensaio de imuno-turbidimétrico Processo inflamatório
agudo
Transferrina Ensaio de imuno-turbidimétrico Anemias
Sódio
Potássio e Cloro
Potenciometria indireta
Função Hidro-electrolítica
Função renal
105
V- 2.2- Urina de 24h
A colheita de urina de 24h constitui uma parte importante do exame. Se o
volume de urina colhida é muito reduzido, é necessário repetir a colheita.
- O início da colheita deverá dar-se referencialmente pela manhã, desprezando-
se a primeira micção;
- A partir daí, deverá colher a urina de todas as micções que se seguirem
durante as 24 horas, se possível diretamente para o recipiente, sem perder
qualquer quantidade de urina;
A última micção deverá ser rigorosamente à mesma hora em que iniciou a
recolha no dia anterior, neste exemplo às 8 horas da manhã seguinte;
A urina desta última micção deve ser, totalmente vertida no recipiente de
colheita;
- Se verificar que o frasco de 2L fornecido não é suficiente para guardar toda a
sua urina de 24 horas, pode colocar o excesso de urina numa garrafa de água
de 1,5 litros, limpa e seca.
- Durante o período de colheita da urina de 24 horas, o(s) recipiente(s) deverão
Testes Metodologia Interesse
Cálcio Ensaio colorimétrico Paratiróide; Doenças
ósseas; Doença renal
crónica; Urolitíase e
Tetania
Adenosina desaminase
(ADA)
Método colorimétrico cinético Diagnóstico e
monitorização de
tuberculose pleural e
peritoneal
Aldolase Ensaio enzimático Doenças primárias do
sistema músculo-
esquelético
Enzima conversora
Angiotensina (ECA)
Ensaio cinético Sarcoidose; Doença de
Gaucher; Lepra
Amilase Ensaio enzimático colorimétrico
Patologia pancreática Lipase Ensaio cinético colorimétrico
106
ser armazenados no frigorífico ou guardados em local muito fresco.
Interesse
Uma das principais indicações para a utilização deste tipo de amostra é a
avaliação da diurese e função renal. Neste sentido são determinados os seguintes
parâmetros:
- medição do volume da urina;
- análise bioquímica (uma amostra representativa): proteinúria, microalbuminúria
e a creatinúria;
- clearance da creatinina.
A urina de 24 horas pode ser também utilizada para doseamentos de hormonas,
metabolitos ou outras substâncias que são excretados na urina.
V- 2.3- Líquidos biológicos
Na secção de Bioquímica, faz-se o estudo bioquímico dos líquidos biológicos:
cefalorraquidiano e líquidos serosos - pleural, peritoneal, sinovial e pericárdico.
Para avaliar a citologia do líquido biológico, efetuou-se uma contagem celular no
autoanalisador hematológico COULTER® LH 750. Se a contagem celular for
inferior a 300 (limite de deteção do analisador), é realizada a contagem celular
manual em câmara de Neubauer. A contagem diferencial de células e a sua
avaliação morfológica são realizados em lâmina de citoesfregaço corado com
coloração de Wright.
Na avaliação bioquímica são determinados, essencialmente, a glucose e as
proteínas, úteis no diagnóstico diferencial entre exsudados e transudados (nos
líquidos serosos), assim como no diagnóstico diferencial de meningite bacteriana
e viral (LCR), entre outras patologias que afetam o sistema nervoso central.
Pode haver interesse em determinar outros parâmetros analíticos, como por
exemplo: triglicéridos (na suspeita de líquido quiloso) e adenosina desaminase
(ADA) (suspeita de tuberculose).
107
V- 2.4- Testes de diagnóstico rápido
Para além dos autoanalisadores, a secção possui testes de diagnóstico rápido, o
teste de gravidez e o das drogas de abuso.
V- 2.4.1- Teste imunológico de gravidez
Este teste consiste num teste de imunoensaio cromatográfico (Nadal hCG®) que
permite a avaliação qualitativa rápida da hormona gonadotrofina coriónica
humana (hCG) na urina.
Na membrana da área do teste, estão fixados anticorpos ligados à cadeia α da
hCG; na membrana da zona de controlo estão fixados Acs de cabra anti- rato.
Durante o ensaio, a amostra é misturada com partículas de ouro coloidal que
possuem à sua superfície Acs monoclonais com afinidade para a cadeia beta da
hCG. Com o resultado positivo, isto é, com a presença de hCG, um conjugado
Ac – hCG/ Ac - ouro surge, através da presença de uma linha de cor na zona do
teste. Se esta linha de cor não aparece na área do teste, o resultado é negativo.
Em ambos os casos (resultados positivo ou negativo), deverá aparecer uma linha
de cor (na zona de controlo). Se esta não aparecer, o teste é dado como inválido.
V- 2.4.2- Drogas de abuso
Utilizou-se um teste imunocromatográfico (Drug-Sreen®
) para detetar a presença
de drogas de abuso, na urina. É um teste rápido, qualitativo para deteção
simultânea de várias drogas e seus metabolitos, nomeadamente cocaína,
anfetamina, metanfetaminas, canabinóides e morfina. O teste baseia-se num
imunoensaio competitivo, sendo composto por um dispositivo com uma
membrana que contem partículas ligadas a anticorpos dirigidos contra as várias
drogas, assim como conjugados de proteína-droga. A amostra é colocada num
poço do dispositivo e migra por ação capilar ao longo da membrana. Se a
quantidade de droga na amostra for inferior ao valor de cut-off, as partículas de
Ac ligam-se aos respetivos conjugados proteína-droga, fazendo aparecer uma
linha de cor na região designada para essa droga. Se, por outro lado, a
108
concentração de droga na amostra for superior ao valor de cut-off, esta vai saturar
os sítios de ligação no Ac, e não se forma uma linha visível.
Porém, um resultado negativo não indica urina livre de droga, mas sim abaixo do
nível de deteção do teste. O teste é inválido se não surgir a linha de controlo.
V- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Bioquímica
Consiste essencialmente no controlo diário (interno) e no controlo mensal
(externo) dos parâmetros bioquímicos, feitos a partir das cartas de Levey-
Jennings (cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).
Controlo de qualidade interno
Este é realizado com materiais de controlo comerciais disponibilizados,
geralmente, em 2 ou 3 níveis de concentração, de forma a monitorizar diferentes
níveis de decisão médica. Nos analisadores automáticos utilizam-se, para a
maioria dos parâmetros, controlos Bio Rad®, tendo alguns parâmetros controlos
específicos. Os resultados são avaliados, utilizando o programa informático
Unity-Real Time®.
O controlo interno é realizado diariamente e sempre que há necessidade de
avaliar possíveis erros nos equipamentos. É realizado também o controlo de
temperaturas dos frigoríficos.
Controlo de qualidade externo
External Quality Assurance Services (EQAS) da Bio-rad
109
VI- Hormonologia
O sistema endócrino consiste em diferentes glândulas que secretam várias
hormonas diretamente na corrente sanguínea. Algumas têm ação reguladora, que
estimula a secreção das hormonas metabolicamente ativas de outras glândulas.
A secreção e a concentração de cada hormona, está sujeita a um controlo
contínuo por mecanismos de feedback negativo em condições fisiológicas
normais. Consequentemente, a concentração de cada hormona na circulação deve
enquadrar-se dentro de valores de referência normais, em condições normais de
saúde. O diagnóstico dos distúrbios endócrinos é possível principalmente através
da quantificação direta das hormonas individuais no soro.
As ações das hormonas podem ser divididas de modo amplo em funções
reguladoras, morfogénicas e integrativas.
Função reguladora
Uma das funções do sistema endócrino é a de regular a homeostasia dos líquidos
extra e intracelulares. A homeostasia é mantida pela ação das hormonas que
regulam o metabolismo hídrico, glicídico, lipídico e proteico. Outra função
reguladora importante é na resposta às necessidades, na falta do aporte
nutricional do organismo, infeções, trauma, stress e reprodução sexual.
Função morfogénica
As hormonas desempenham um papel importante no crescimento e
desenvolvimento do organismo. Os órgãos sexuais masculinos e femininos
desenvolvem-se sob a ação de hormonas, a testosterona e o estradiol
respetivamente.
Função integrativa
As hormonas são produzidas por várias glândulas endócrinas e atuam
frequentemente em conjunto para regular uma função específica. Um exemplo
disso é no metabolismo dos glúcidos normal, em que necessita de uma ação
conjunta de hormonas produzidas pelo pâncreas (insulina e o glucagon), pela
hipófise (hormona de crescimento), pelas glândulas suprarrenais
(glicocorticóides, epinefrina), pela tiroide (T4) e pelas gónadas (estrogénio).
110
VI- 1- Amostra e metodologia
A amostra utilizada na maioria dos testes nesta secção é soro, mas também
plasma para a determinação por exemplo do peptídeo natriurético cerebral para
avaliar patologias como, enfarte agudo do miocárdio e a insuficiência cardíaca
congestiva.
Nesta secção, os ensaios imunoquímicos, com reação entre Ag e o Ac, basearam-
se em métodos de electroquimiolumiscência e quimioluminescência, nos
seguintes equipamentos:
UniCelTm
DxI 800 da Beckman Coulter
O UniCelTm DxI 800 utiliza a metodologia de quimioluminiscência (CLIA).
A CLIA consiste numa reação química, que envolve a oxidação de um composto
orgânico (normalmente a fosfatase alcalina) na presença de catalisadores. A luz é
emitida a partir do produto instável formado na reação de oxidação. Os eletrões
de um átomo recebem energia, saltam para camadas mais externas e depois
voltam para as mesmas camadas mais internas, libertando energia em forma de
luz. A emissão de fotões luz é medida com um luminómetro.
Elecsys® 2010 e Cobas e 411, da Roche Diagnostics
O Elecsys®
2010 utiliza a tecnologia de deteção por electroquimioluminiscência.
As reações químicas geram luminescência a partir de um estímulo elétrico, no
qual o quelato de ruténio, juntamente com a tripropilamina, forma intermediários
eletronicamente excitados que emitem fotões. Esta excitação ocorre devido à
transferência de eletrões energéticos. A emissão de fotões de luz é medida com
um fotomultiplicador.
Estes imunoensaios consistem em dois princípios: o sanduíche e o competitivo.
o Princípio sandwich
São utilizados 2 anticorpos, um ligado à fase sólida e outro marcado com uma
substância geradora de sinal, que se ligam a substância em estudo.
111
Em ambos a quantidade de luz produzida é diretamente proporcional à
quantidade de antigénio na amostra do paciente.
Electroquimiolumiscência
A amostra liga-se ao Ac biotinilado, enquanto o Ac marcado com complexo de
ruténio reage com um sítio antigénico presente na amostra, formando um
complexo sandwich.
São adicionadas micropartículas revestidas de estreptavidina ao complexo,
ligando-se à fase sólida pela interação da biotina e da estreptavidina.
A mistura da reação é aspirada para a célula de leitura, onde as microparticulas
são fixadas magneticamente à superfície do elétrodo. É aplicada uma corrente
elétrica ao elétrodo, induzindo uma emissão quimioluminescente que é medida
por um fotomultiplicador.
Quimioluminescência
A amostra liga-se ao Ac imobilizado na fase sólida, enquanto o Ac conjugado à
fosfatase alcalina (composto orgânico) reage com um sítio antigénico presente na
amostra, formando um complexo sanduíche. É adicionado o substrato
quimioluminescente (Dioxetano), que sofre hidrólise na presença da enzima,
produzindo substâncias instáveis responsáveis pela emissão de luz. A luz gerada
é medida num luminómetro.
o Princípio competitivo
Todo o procedimento é semelhante ao princípio sanduíche, com a diferença de
haver competição entre a substância presente na amostra e outra marcada com
alguma substância geradora de sinal. Ao contrário do princípio do sandwich, a
quantidade de luz produzida é inversamente proporcional à quantidade de
antigénio presente na amostra.
Electroquimiolumiscência
Há competição entre o Ag da amostra com os anticorpos marcados com ruténio
pelo Ag biotinilado.
112
Quimioluminescência
Há competição entre o Ag da amostra e o Ag conjugado à fosfatase alcalina,
pelos sítios de ligação no Ac específico.
VI- 2- Análises efetuadas na secção de Hormonologia
Na secção realiza-se o estudo das várias hormonas e marcadores tumorais (tabela
XIV).
Tabela XIV: Testes realizados na secção de Hormonologia. Testes Equipamento Interesse
Folato
DxI 800
Anemias Vitamina B12
Ferritina
Eritropoetina
PSA total (PSA-antigénio
específico da próstata)
PSA livre-interesse: Próstata
DxI 800
Marcadores
Tumorais
CEA (antigénio
carcinoembrionário) interesse:
Carcinomas do Cólon, Pulmão e
Mama
CA125(antigénio carbohidrato)-
interesse: Carcinomas do ovário
Endométrio e Mama.
CA 19.9- interesse: Carcinoma do
Pâncreas, Estômago, Vias biliares e
colo-retal
CA 15.3- interesse: Carcinoma da
Mama e Ovário
AFP (alfa-fetoproteína) – interesse:
Células germinativas, Carcinoma
hepatocelular
NSE (Enolase Neuro-específica) -
interesse: Neuroblastoma,
Melanoma
Cobas e 411
Cyfra 21.1- interesse: Carcinoma
do pulmão
CA 72.4- interesse: Cancro gástrico
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Testes Equipamento Interesse
Mioglobina
DxI 800
Função
Cardíaca Troponina I
BNP (Peptídeo Natriurético tipo B)
Procalcitonina Elecsys 2010 Função renal
Vitamina D Elecsys 2010
Metabolismo
Ósseo
Osteocalcina
PTH (Paratormona) DxI 800
hGH (Hormona do crescimento)
TSH (Hormona estimulante da
tiróide)
DxI 800
Função da Tiroide
T3 (Triiodotironina) livre e total
T4 (Tiroxina) livre e total
Tiroglobulina (Tg) (marcador
tumoral)
Cobas e 411 Anti-Tg (Diagnóstico auto-imune
da tiróide)
Anti-TPO (Diagnóstico auto-imune
da tiróide)
TRAb (Diagnóstico auto-imune da
tiróide)
Elecsys 2010
Progesterona
DxI 800
Fertilidade
Testosterona
FSH (Hormona do folículo
estimulante)
LH (Hormona luteinizante)
Prolactina
β-HCG (Hormona Gonadotropina
coriónica humana) total
Estradiol
DHEA (Dehidroepiandrosterona)
Cortisol DxI 800 Supra-renais (Síndrome de
Cushing) ACTH (Hormona
adrenocorticrópica)
Elecsys 2010
Insulina DxI 800 Diabetes
Péptido C Elecsys 2010
PAPP-A Kryptor Compact Rastreio pré-natal
β-HCG livre
114
VI- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Hormonologia
Consiste essencialmente no controlo diário (interno) e no controlo mensal
(externo) das hormonas e dos marcadores tumorais, realizados a partir das cartas
de Levey-Jennings (cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).
Controlo de qualidade interno
À semelhança da secção de Bioquímica, esta secção também utiliza materiais de
controlo comerciais, a maioria em 2 níveis, sendo os procedimentos para a sua
utilização sobreponíveis aos descritos anteriormente. Os resultados são avaliados,
utilizando o programa informático Unity-Real Time®.
O controlo interno é realizado diariamente e sempre que há necessidade de
avaliar possíveis erros nos equipamentos. É realizado também o controlo de
temperaturas dos frigoríficos.
Controlo de qualidade externo
- EQAS da Bio-rad
115
VII- Imunologia
A Imunologia clínica consiste no estudo das respostas do organismo que
fornecem imunidade, ou seja, mecanismos que estão envolvidos na proteção
contra organismos estranhos ao organismo. Apesar da complexidade do sistema
imunológico, é possível detetar, em laboratório, certos constituintes do sistema
imunitário, como os Acs.
O sistema imunológico tem funções mais amplas do que fornecer, somente,
proteção de microrganismos invasores. Um sistema imune saudável é
fundamental para uma boa saúde e, não só, envolve a prevenção ou o combate
contra as doenças infeciosas, mas também, a proteção do organismo contra
toxinas e tumores. Este sistema, fornece mecanismos de defesas específicas
contra uma variedade de substâncias estranhas ao organismo (Ags) que podem
ser vírus, células ou moléculas proteicas. Este sistema é uma organização
complexa que envolve tecidos, células, produtos celulares, mediadores químicos
biologicamente ativos, que se interagem mutuamente para produzir uma resposta
imune.
O sistema imunológico consiste em dois tipos de imunidade, a imunidade inata e
a imunidade adquirida. A imunidade inata consiste na ação concertada de
variados tipos celulares, recetores, sistemas de sinalização e mecanismos
efetores, em que as barreiras epiteliais têm um papel fundamental na proteção do
organismo contra a invasão de agentes patogénicos externos. Nestas barreiras, o
reconhecimento direto de diferentes agentes agressores induz a imunidade inata,
que constitui a primeira linha de defesa do organismo, com uma especificidade
de largo espectro. A resposta de imunidade adaptativa, é aquela que reconhece e
relembra diferentes Ags. A imunidade específica é caracterizada pela capacidade
de reconhecer, pela resposta específica e pela memória.
Os testes que avaliam a função imunológica são realizados em pacientes com
infeções recorrentes ou possuem sintomas que indicam um problema provável
com o seu sistema imunológico. Devido à sua propriedade única de reconhecer e
distinguir os vários Ags intimamente relacionados, os Acs são largamente usados
116
em testes laboratoriais. Alguns dos quais incluem: testes de aglutinação; testes de
inibição; testes de precipitação; técnicas de anticorpos fluorescentes; testes de
imunoensaios entre outros.
Os Acs usados nos testes imunológicos podem ser monoclonais ou policlonais.
Os primeiros são Acs com uma especificidade e classe e são derivados de um
clone (mono) ou linha celular. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos
em laboratório e são usados como reagentes para diversos kits
imunodiagnósticos. No caso dos anticorpos policlonais, são imunoglobulinas
com mais de um epítopo específico ou são mais derivados de mais do que uma
linha celular. Os Acs que normalmente estão presentes no soro do indivíduo
saudável ou situações reativas são policlonais.
Nesta secção de Imunologia e não só, devem-se escolher métodos baseados na
sensibilidade e especificidade dos mesmos. A especificidade refere-se à
habilidade de detetar somente o Ac ou Ag para o qual o teste foi desenvolvido. A
deteção de outras substâncias (reação cruzada) diminui a especificidade e pode
causar reações falsamente positivas. O menor limite de deteção ou a mais baixa
concentração capaz de ser detetada pelo método refere-se à sensibilidade.
VII- 1- Amostra
- Sangue total: soro
- Urina de 24h para a pesquisa da proteína de Bence-Jones.
VII- 2- Metodologia
Utilizou-se as várias técnicas/metodologias no sector de Imunologia.
VII- 2.1- Técnicas
Aglutinação
É a aglomeração ou agregação de células ou partículas devido à sua reação com
os Acs. Quando células ou partículas (ex. partículas de látex) têm moléculas de
Ag na sua superfície, vão aglutinar ao reagirem com o Ac específico. A
aglutinação representa um teste positivo. Uma variação do teste de aglutinação é
117
a inibição da aglutinação. Nos testes de inibição, um resultado positivo é
indicado pela ausência de aglutinação.
Fixação do complemento
Trata-se de um método sensível para a deteção da reação Ag-Ac. No laboratório
este método é aplicado para detetar Acs no soro do paciente. O teste de fixação
de complemento é baseado na habilidade das proteínas do complemento de
interagir com o Ac e o Ag específico para causar lise. Esse teste é feito em duas
partes, o sistema teste e o sistema indicador. No sistema de teste, o soro do
paciente e o Ag (viral, fúngico) reage na presença do complemento. Se o Ac
específico para o Ag estiver presente, então o complemento é fixado na reação
Ag-Ac e torna-se incapaz de reagir na segunda parte do teste. O sistema
indicador é adicionado aos tubos, após o soro, o complemento e o Ag terem
reagido. Um teste negativo é indicado pela hemólise, que não pode ocorrer se o
Ac, na amostra, estiver ausente. A ausência de hemólise é um teste positivo,
indicando a presença de Acs no soro do doente.
Técnica do anticorpo marcado
Os Acs podem ser marcados por moléculas (marcadores). Essas moléculas são
ligadas (conjugadas) aos Acs, possibilitando a visualização da reação. Os
marcadores podem ser corantes, enzimas ou radioisótopos. A ligação de
marcadores aos Acs não interfere com a capacidade dos Acs de se ligarem aos
Ags.
Ensaio imunoenzimático
Envolve sempre um Ag, um Ac específico para um Ag e um segundo Ac
conjugado a uma enzima. O teste permite a deteção de um Ac especial ou um Ag
na amostra do paciente.
Nota: as técnicas podem ser quantitativas. Nesse caso, requerem diluições
seriadas de tubos para estimar a concentração de imunoglobulinas para um dado
118
Ag específico. A concentração da imunoglobulina é expressa em título que é o
recíproco da última diluição que apresentou reação.
VII- 2.2- Equipamentos automatizados
Capillarys 2
O Capillarys 2 é um sistema automatizado que consiste numa eletroforese
capilar, usado na electroforese das proteínas séricas, utilizando tubos capilares
para múltiplas e simultâneas separações das seis frações diferentes: albumina;
α1-globulinas; α2-globulinas; β1-globulinas; β2-globulinas e as γ-globulinas.
Este equipamento permite realizar automaticamente todas as sequências da
eletroforese, desde o tubo de colheita até a obtenção do perfil electroforético:
identificação da amostra; diluição da amostra; lavagem dos capilares; injeção da
amostra nos capilares; migração; deteção; tratamento dos resultados e a sua
transmissão informática dos resultados obtidos.
Esta análise é muito útil na deteção de anomalias do perfil proteico.
Sebia
A imunofixação destina-se à deteção de proteínas, quando detetadas na
eletroforese das proteínas. Estas apresentam-se sob a forma de bandas anormais
situadas nas zonas de β ou γ globulinas.
A técnica divide-se em 4 partes: separação; fixação e imunoprecipitação;
lavagem; coloração. As proteínas são separadas por eletroforese em meio
alcalino, sendo depois imunoprecipitadas com antissoros monoespecíficos. Os
antissoros usados são: anti-cadeias pesadas IgG, IgA e IgM e as anti-cadeias
leves κ e λ. Estes antissoros são colocados no gel em poços para a corrida
electroforética juntamente com o soro a analisar, de modo a identificar de forma
qualitativa a natureza das bandas monoclonais. Em simultâneo há uma corrida de
eletroforese sérica a fim de orientar/avaliar na interpretação da imunofixação.
Após a imunoprecipitação, as proteínas que não estão ligadas são removidas por
lavagem e as que estão ligadas são coradas.
119
A existência de gamapatias monoclonais é detetada pelo aparecimento de uma
banda monoclonal, revelada por um antissoro de cadeia pesada e de cadeia leve.
Estas duas bandas têm que ser interpretadas em conjunto com a corrida
electroforética sérica na presença da banda monoclonal na zona das γ-globulinas.
Siemens BN Prospec
A nefelometria é utilizada como método, para o doseamento (análise
quantitativa) de algumas proteínas séricas, das imunoglobulinas IgG, IgA, IgM e
das subclasses IgG e das cadeias leves e cadeias leves livres κ e λ. Este método
consiste na medição de luz dispersa a partir do feixe principal, por uma
determinada amostra. Esta técnica baseia-se na reação de Acs específicos.
Forma-se um complexo, por ex. Ac-imunoglobulina, que dispersa a luz do feixe
incidente e a luz dispersa é proporcional à concentração de imunoglobulina
presente no soro.
ImmunoCAP™ 250 da Phadia Sweden Diagnostics
O ImmunoCAP™ 250 permite efetuar o estudo dos alergénios através do
doseamento das IgE’s específicas para um vasto painel de alergénios, utilizando
como metodologia o ensaio imunoenzimático de fluorescência. A reação produz
fluorescência diretamente proporcional à quantidade de IgE total ou específica
existente na amostra.
Zenit RA- autoimunidade
Dependendo do tipo de análise, o equipamento utiliza os princípios de medição,
por luminescência ou absorvância.
o Luminescência
São utilizados subprodutos de ésteres de acridínio luminescentes como
marcadores de deteção. Há uma reação de oxidação para uma forma excitada, em
que o regresso ao estado de estabilidade é acompanhado pela emissão de luz, que
é medida em unidade de luz relativa (RLU) pelo luminímetro (integrado no
autoanalisador). Os testes são executados usando o método competitivo ou o
método sandwich.
120
o Absorvância
As amostras e os reagentes são aspirados de acordo com os parâmetros validados
para cada teste e são transferidos para uma cuvete onde serão monitorizadas as
alterações da absorvância (densidade ótica) durante cada reação em progresso.
As medições são executadas a um comprimento de onda específico para a
análise.
A pesquisa de Ac anti-dsDNA; Ac antinucleares; Ac anti-citoplasma dos
neutrófilos (MPO e PR3); Ac anti-gliadina IgA e IgG; IgE específicas; citrulina e
transglutaminase IgA são exemplos de alguns testes realizados no estudo da
autoimunidade no sector de Imunologia.
VII- 3- Análises efetuadas na secção de Imunologia
Realizaram-se várias análises nesta secção de demonstradas na tabela seguinte.
Tabela XV: Testes realizados na secção de Imunologia com o respetivo equipamento. Testes Equipamento Interesse
Proteinograma Capillarys 2 Perfil proteico
IgG, IgA, IgM Siemens BN Prospec Resposta imunitária
Imunofixação
Cadeias Leves Kappa e Lambda Siemens BN Prospec Gamapatias monoclonais
Imunofixação
C3
Siemens BN Prospec
Proteínas do complemento
C4
α1-antitripsina Enfisema pulmonar; Cirrose
hepática
Haptoglobina Proteína de fase aguda
Ceruloplasmina Glicoproteína hepática que
assegura o transporte de cobre
no plasma. Diagnóstico na
doença de Wilson.
Cadeias Leves e Cadeias Leves
livres Kappa e Lambda
Gamapatias monoclonais
121
Testes Equipamento Interesse
IgE Total ImmunoCAP Estudo dos alergénios
IgE específica
ANA/ENA (screen)
Anticorpos anti: mitocrondiais, anticorpos
das células parietais gástricas, músculo liso
(e.g. de anticorpos anti-específico)
Zenit RA
Autoimunidade
Nesta secção, no âmbito dos estudos de autoimunidade, também se realiza a
pesquisa de auto-Acs por método de imunofluorescência indireta em células
Hep-2 e cortes de tecidos.
VII- 3.1- Teste de diagnóstico rápido para a pesquisa da proteína de
Bence-Jones
A proteína de Bence Jones é uma proteína de cadeias leves (lambda ou kappa) de
imunoglobulinas, que se pode observar na urina em caso de mieloma múltiplo,
quando a imunoglobulina monoclonal está degradada em cadeias pesadas (que
não passam para a urina) em cadeias leves. Aparece na urina em 60 a 70% dos
casos de mieloma, sendo a sua presença de mau prognóstico.
A secção executa um teste imuno-electroforético rápido, que é realizado a partir
de uma amostra de urina de 24 horas.
VII- 4- Controlo de qualidade interno e externo em Imunologia
Consiste essencialmente no controlo diário (interno) e no controlo mensal
(externo) dos testes imunológicos, feitos a partir das cartas de Levey-Jennings
(cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).
O controlo de qualidade interno é efetuado com controlo das casas comerciais,
disponibilizados geralmente em 2 ou 3 níveis de concentração. Nos analisadores
automáticos utilizam-se, para a maioria dos parâmetros, controlos Bio Rad®,
tendo alguns parâmetros controlos específicos.
No controlo de qualidade externo é efetuado, o EQAS da Bio-rad e o NEQAS.
122
VIII- Bibliografia
Bain B J, Bates I, Laffan M, Lewis S M. Practical Haematology. 11th
ed. Elsevier
Churchill Livingstone 2012
Brooks G, Carroll K, Butel J, Morse S, Mietzner T. Medical Microbiology. 25th
ed. Mc Graw Hill LANGE: USA 2010
Burtis C, Ashwood E, Bruns D. Tietz Clinical Chemistry and Molecular
Diagnostics. 4th
ed. Elsevier Saunders. 2006
Caquet René. Guia Prático de Análises Clínicas. 1ª ed. Climepsi Editores. Lisboa
Fevereiro 2004
Gaw A, Murphy M, Cowan R, O’Reilly D, Stewart M, Shepherd J. Clinical
Biochemistry. 4th
ed. Elsevier: Churchill Livingstone 2008
Hoffbrand A.V., Moss P.A.H. Essential Haematology. 6th
ed. Wiley-Blackwell:
UK 2011
Pallister C, Watson M. Haematology. 2nd
ed. Scion: UK 2010
Parslow T, Stites D, Terr A, Imboden J. Imunologia Médica. 10ª ed. Guanabara
Koogan S.A. 2004
Roitt I, Brostoff, Male D. Immunology. 6th
ed. MOSBY-Elsevier 2001
