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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
CRISTIANO EDUARDO RODRIGUES REIS
CONSTRUÇÃO DE UM BIORREATOR TUBULAR PARA CRESCIMENTO DA
MICROALGA Chlorella sp. EM MEIO DE LIXIVIADO
LORENA
2014
CRISTIANO EDUARDO RODRIGUES REIS
Construção de um biorreator tubular para crescimento da microalga Chlorella sp. em
meio de lixiviado
Trabalho de conclusão de curso
apresentado à Escola de Engenharia de
Lorena da Escola de Engenharia de
Lorena para aprovação na disciplina
LOQ4048 – Trabalho de Conclusão de
Curso II
Áreas de concentração: Engenharia
Ambiental e Processos Biotecnológicos
Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva
Lorena
2014
Resumo
REIS, C. E. R. Construção de um biorreator tubular para crescimento da
microalga Chlorella sp. em meio de lixiviado. Monografia (Trabalho de Conclusão
de Curso II em Engenharia Industrial Química) – Escola de Engenharia de Lorena,
Universidade de São Paulo, Lorena, 2014.
A utilização da carga orgânica presente em efluentes de baixíssimo valor agregado,
como o lixiviado, para o cultivo de microrganismos apresenta duas vantagens
principais: o crescimento celular a um baixo custo e a redução de compostos
poluentes no resíduo. A utilização de algumas espécies de microalgas tem ganhado
notoriedade no meio acadêmico por diversas características, como a acumulação de
lipídios, capacidade de sorção de metais pesados, fácil e rápido crescimento celular e
capacidade de crescer em meios com altas concentrações de CO2. O incentivo à
utilização de microalgas como fonte de matéria-prima para produção de
biocombustíveis, como o biodiesel, o biogás e o bioetanol, por exemplo, é decorrido
dos grandes avanços da engenharia de biossistemas nesse meio; mas que ainda
apresenta grandes lacunas a serem otimizadas. Além de outros desafios, como as
técnicas de separação celular e de extração de compostos, a utilização de
biorreatores contínuos para o crescimento celular ainda é tido como um campo
relativamente pouco estudado. A otimização de parâmetros físicos, biológicos e
químicos para cultivo em valores próximos à taxa de crescimento máxima celular,
juntamente com a redução da carga orgânica, turbidez e de metais pesados do
lixiviado compõem o escopo deste projeto de trabalho de conclusão de curso. Em
suma, visa-se a construção e a otimização de um biorreator tubular para o cultivo
celular em meio de lixiviado do aterro sanitário da cidade de Cachoeira Paulista, SP,
da microalga Chlorella sp., tida como uma das mais estudadas no meio acadêmico
em quesitos de bioenergia.
Palavras-chave: Chlorella, microalga, biorreator, lixiviado
Abstract
REIS, C. E. R. Construction of a tubular bioreactor for microalga Chlorella sp.
growth in leachate medium. Monograph (Chemical Engineering Final Project II) –
School of Engineering of Lorena, University of São Paulo, Lorena – 2014.
The utilization of organic matter present in low-value effluents, such as municipal
leachate, for microorganism cultivation shows two main advantages: low cost cell
growth and reduction of pollutants in the residue. The utilization of certain species of
microalgae have gained notoriety in the Academia for several characteristics, such as
lipid accumulation, heavy metal sorption, fast and easy cell growth and capability of
growing in environments with high concentrations of CO2. The incentive to the
utilization of microalgae as feedstock source of biofuels production, such as biodiesel,
biogas and bioethanol, for example, is due to great advances in biosystems
engineering in this field; having large blanks yet to be optimized though. Beyond other
challenges, as cell harvesting techniques and extraction of compounds, the utilization
of continuous bioreactors for cell growth is still a relatively little studied research field.
The optimization of physical, biological and chemical factors to the cultivation in
numbers close to the maximum rate of cell growth, as well as the reduction of organic
matter, measured, turbidity, and heavy metals present in the leachate, make up the
scope of this graduation project. In short, the aims are the construction and
optimization of a tubular bioreactor for cell growth, using leachate from Cachoeira
Paulista’s landfill (SP), as culture medium, of Chlorella sp., known as one of the most
studied species in the Academia in the bioenergy field.
Keywords: Chlorella sp., microalgae, bioreactor, leachate
Agradecimentos
Não poderia começar agradecendo a outrem, senão Deus e Nossa Senhora por toda
a iluminação. Agradeço também aos meus pais, pelas mais diversas razões, e
principalmente por acreditarem em mim e pelo amor incondicional.
Não menos importante, agradeço às minhas irmãs por terem me acompanhado desde
criança e sempre me motivarem, e mais em especial aos meus sobrinhos: Augusto,
Arthur e Gabrielinha, vocês são a razão do meu orgulho!
Agradeço aos meus amigos, de longa e de curta datas, de Lorena, de Lafaiete, e os
que fui encontrando ao longo das viagens. As palavras de apoio, o aprender a viver
fora de casa, as festas, momentos bons e ruins que passamos são as razões para o
meu mais sincero agradecimento.
Aos meus queridos amigos e professores da EEL, em especial aos meus orientadores:
Messias e Domingos pela orientação e amizade. Deixo meu muito obrigado também
aos professores que contribuíram de maneira muito significativa para a realização
deste projeto e de atividades a ele relacionadas, Patrícia, Júlio, Heizir, Hélcio e
Gerônimo. Meu mais sincero obrigado aos professores que marcaram minha
formação. De maneira muito querida, deixo registrado o meu mais sincero
agradecimento.
Agradeço aos funcionários da oficina da EEL, em especial ao Adilson, pelo montagem
do reator e todo o auxílio na restruturação do laboratório. Ao Capucho, pelo desenho
e pelas assistências na montagem do reator. Ao pessoal do laboratório de microalgas:
muito obrigado e continuem o trabalho pesado!
A todos que contribuíram para a minha formação, de maneira direta ou indireta, deixo
o meu obrigado.
“I do not know what I may appear to the
world, but to myself I seem to have been
only like a boy playing on the seashore,
and diverting myself in now and then
finding a smoother pebble or prettier shell
than ordinary, whilst the great ocean of
truth lay all undiscovered before me.”
Sir Isaac Newton
Lista de tabelas
Tabela 2.1: Características físico-químicas dos lixiviados no Brasil...........................25
Tabela 2.2: Biorreatores para tratamento de águas residuárias via microalgas........29
Tabela 3.1: Composição do meio f/2 sem sílica adaptado...........................................32
Tabela 3.2: Arranjo ortogonal L4 de Taguchi...............................................................36
Tabela 3.3: Planejamento experimental do projeto.....................................................36
Tabela 4.1: Resultados de porcentagem de redução de turbidez................................42
Tabela 4.2: ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de turbidez................43
Tabela 4.3: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de turbidez..43
Tabela 4.4: Resultados de teor de redução de DQO do lixiviado...............................46
Tabela 4.5: ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de DQO.....................47
Tabela 4.6: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de DQO......47
Tabela 4.7: Resultados de teor de redução de TOC do lixiviado.................................48
Tabela 4.8: ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de TOC.....................48
Tabela 4.9: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de TOC.....49
Tabela 4.10: Concentrações de metais do meio de lixiviado......................................51
Tabela 4.11: Resultados quanto à redução da concentração de Boro e Prata............51
Tabela 4.12: ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de Prata.................52
Tabela 4.13: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de Prata...52
Tabela 4.14: ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de Boro...................53
Tabela 4.15: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de Boro...53
Lista de figuras
Figura 2.1: Variação da biomassa em um cultivo em batelada...................................17
Figura 2.2: Biocoil na Universidade Murdoch, Perth, Austrália...................................21
Figura 2.3: Tanque de lixiviado no aterro sanitário de Cachoeira Paulista, SP............24
Figura 3.1: Esquema do fotobiorreator tipo Biocoil usado no projeto...........................33
Figura 3.2: Fotobiorreator usado no projeto................................................................35
Figura 4.1: Espectro de absorbância de cultivo da microalga Chlorella sp. ................39
Figura 4.2: Espectro de absorbância do lixiviado........................................................40
Figura 4.3: Curva analítica de contagem celular em função de absorbância..............41
Figura 4.4: Curvas de crescimento nos experimentos 1, 2, 3 e 4................................41
Figura 4.5: Plot dos efeitos principais sobre a redução da Turbidez..........................42
Figura 4.6: Análise visual da redução da turbidez do lixiviado pós floculação
microalgal...................................................................................................................44
Figura 4.7: Curva analítica de DQO de baixo teor – 0 a 200 mg O2/L...........................45
Figura 4.8: Curva analítica de DQO de alto teor – 200 a 2000 mg O2/L......................45
Figura 4.9: Plot dos efeitos principais sobre a média da redução de DQO..................46
Figura 4.10: Plot dos efeitos principais sobre a redução de TOC................................48
Figura 4.11: Plot dos efeitos principais para a redução da concentração de Prata......52
Figura 4.12: Plot dos efeitos principais para a redução da concentração de Boro.......53
Lista de Abreviaturas e Siglas
μ : micro (10-6);
ANOVA: Analysis of Variance – Análise de Variância
ATP: Adenosina trifosfato;
DBO: Demanda bioquímica de oxigênio (mg O2/L);
DQO: Demanda química de oxigênio (mg O2/L);
CI: Carbono Inorgânico;
CT: Carbono Total;
GL: Graus de liberdade;
NADPH: Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato;
NTU: Nephelometric Turbidity Units – Unidades Nefelométricas de Turbidez;
sp. : Espécie(s);
SQ: soma quadrática;
TOC: Total Organic Carbon – Carbono Orgânico Total (mg/L);
X: concentração celular (g/L);
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................12
1.1. Justificativa.................................................................................................13
1.2. Objetivos....................................................................................................14
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................15
2.1. Microalgas..................................................................................................15
2.2. Metabolismo...............................................................................................16
2.2.1. Autotrófico.............................................................................................16
2.2.2. Heterotrófico.........................................................................................16
2.2.3. Mixotrófico.............................................................................................16
2.3. Meios de cultivo..........................................................................................16
2.4. Regimes de cultivo.....................................................................................17
2.4.1. Descontínuos........................................................................................17
2.4.2. Semi-contínuos.....................................................................................19
2.4.3. Contínuos..............................................................................................19
2.5. Cultivo........................................................................................................19
2.5.1. Sistemas abertos..................................................................................19
2.5.2. Sistemas fechados................................................................................20
2.5.2.1. Biocoil.........................................................................................20
2.6. Aplicações dos cultivos de microalgas........................................................21
2.7. Lixiviado.....................................................................................................22
2.7.1. Definição de Lixiviado...........................................................................22
2.7.2. Métodos de Tratamento de Lixiviado.....................................................25
2.7.3. Tratamento Biológico de Efluentes........................................................26
2.7.4. Lixiviado como meio de cultivo celular...................................................27
2.7.5. Crescimento de Microalga no Lixiviado.................................................27
2.7.6. Desenvolvimento de Fotobiorreatores microalgais para tratamento de
águas residuárias..................................................................................28
2.8. Planejamento de experimentos..................................................................29
2.8.1. Método de Taguchi................................................................................30
3. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................31
3.1. Obtenção da estirpe...................................................................................31
3.2. Preparação do meio de cultivo para crescimento celular...........................31
3.3. Manutenção da cepa..................................................................................32
3.4. Obtenção e caracterização do lixiviado......................................................32
3.5. Preparação do meio de cultivo para o biorreator........................................32
3.6. Construção e operação do biorreator..........................................................33
3.7. Amostragem e separação celular...............................................................34
3.8. Planejamento de Experimentos..................................................................36
3.9. Métodos analíticos......................................................................................37
3.9.1. Análise Espectrofotométrica de Densidade Ótica..................................37
3.9.2. Análise Microscópica............................................................................37
3.9.3. Determinação do peso seco da amostra...............................................37
3.9.4. Determinação da Turbidez....................................................................37
3.9.5. Determinação da DQO..........................................................................38
3.9.6. Determinação do TOC..........................................................................38 3.9.7. Determinação dos metais......................................................................38
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................39
4.1. Relação entre contagem celular e absorbância..........................................39
4.2. Curvas de crescimento nos reatores..........................................................41
4.3. Análise da redução de turbidez...................................................................42
4.4. Análise da redução de carga orgânica........................................................45
4.4.1. Análise da redução de DQO..................................................................45
4.4.2. Análise da redução de TOC..................................................................47
4.5. Análise de redução do teor de metais.........................................................50
5. CONCLUSÃO......................................................................................................54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................55
12
1. INTRODUÇÃO
A utilização de microrganismos como fonte de matéria-prima para biocombustíveis
caracterizam a geração mais recente no meio científico. A então chamada terceira
geração corresponde à produção de biodiesel, de bioetanol e de bio-hidrogênio
obtidos de espécies de microalgas e de outros microrganismos. O interesse em
utilizar-se do crescimento celular de espécies microbianas está relacionado, dentre
outros fatores, a diversos questionamentos sobre a sustentabilidade dos combustíveis
de primeira geração, como o etanol proveniente da cana-de-açúcar e do milho, do
biodiesel da soja e de outras oleaginosas. Tal fato é devido à agricultura intensificada
para a produção dessas espécies, que aumentou a utilização de defensivos agrícolas
e de fertilizantes, reduziu a biodiversidade em muitas regiões e promoveu também um
desequilíbrio no sistema de demanda de alimentos.
Um problema urbano acarretado pelos grandes aglomerados é a produção de
enormes volumes de lixo, que ocasiona inúmeros problemas relacionados à saúde
pública, como proliferação de doenças, de urbanismo e arquitetura, em quesitos
estéticos, e não menos importantes, problemas de engenharia, relacionados ao
tratamento desses resíduos. Um dos derivados do lixo acumulado em lixões ou em
aterros sanitários é o lixiviado, que consiste em uma mistura de diversos componentes
derivados da decomposição química e biológica da carga orgânica dos detritos, com
carga inorgânica dispersa.
Como dito, a criação de microalgas tem recebido uma atenção diferenciada do meio
acadêmico na área de bioenergia. O fato de grande parte das microalgas
apresentarem regime fotoautotrófico, isto é, crescimento celular na presença de CO2
e luz, apresenta uma série de vantagens, sendo a mais clara delas que essas espécies
são capazes de crescerem em um meio sem adição de carga orgânica. No entanto,
foi comprovado que o regime mixotrófico, no qual há presença de carga orgânica e da
utilização de CO2, ambas como fonte de carbono para crescimento, apresenta uma
maior produtividade quando comparado ao regime meramente autotrófico. Sabido
isso, é interessante o cultivo de espécies de microalga em meios que apresentam
carga orgânica e que possuam custo zero ou mesmo negativos, como o lixiviado.
13
Grande parte dos estudos acadêmicos estão voltados para a otimização de
parâmetros químicos e biológicos no crescimento, como a determinação de pH,
temperatura e concentração de nutrientes ótimos para o crescimento celular ou para
a produção de um dado composto de interesse. Um campo de pesquisa, relativamente
menos estudado, é sobre os modos de operação contínuos para cultivo celular, ainda
mais em meios residuais, como o lixiviado.
O presente projeto de trabalho de conclusão de curso visa, portanto, a construção e a
otimização de um biorreator, de forma tubular, para o cultivo da microalga Chlorella
sp. utilizando-se o lixiviado como meio de crescimento. Serão analisados, por meio de
técnicas estatísticas de planejamento de experimentos, fatores voltados para
processos químicos e bioquímicos, como tempo de residência médio no biorreator,
temperatura do meio e não menos importante no caso da microalga, a intensidade
luminosa. Visa-se, consequentemente, uma análise primária desses fatores na
operação do biorreator para aumento do crescimento celular, isso é, acumulação de
biomassa, contendo lipídeos saponificáveis, propícios à produção de biodiesel por
transesterificação ou hidroesterificação, e de redução da carga orgânica e de metais
do lixiviado, o que facilitaria o tratamento posterior do mesmo, por técnicas como
processos oxidativos avançados.
1.1. Justificativa
Venho desenvolvendo atividades de iniciação científica ou similares desde 2010;
todas elas ligadas, direta ou indiretamente à produção de biocombustíveis. Em 2011,
realizei um intercâmbio acadêmico na Universidade de Minnesota, EUA, onde
trabalhei no laboratório de bioprocessos do prof. Bo Hu, no departamento de
bioprodutos e engenharia de biossistemas. Nessa estadia, trabalhei com cultivo de
fungos oleaginosos e desde então tenho tido um interesse bem profundo na área de
microbiologia aplicada à produção de bioenergia, aliada à utilização de meios de
cultivo residuais, como hidrolisados, efluentes e agora, lixiviado.
A fim de realizar um trabalho de conclusão de curso dentro do escopo da engenharia
química, aplicada à biotecnologia, sugeri ao prof. Messias B. Silva, meu orientador de
iniciação científica na EEL, um projeto no qual eu pudesse trabalhar com microalgas
cultivadas em lixiviado, e para tal, um crescimento em biorreator. Com esse projeto,
abordarei tópicos do meu interesse de pesquisa e ao mesmo tempo, tópicos
14
importantes que aprendi ao longo de todos os créditos feitos no curso de graduação
em engenharia química. Aliando-se a isso, a pesquisa com microalgas para fonte de
bioenergia e como fonte de descontaminação biológica é algo que vem sido explorado
cada vez mais no meio acadêmico; fazendo-se deste projeto algo inovador e de
possíveis expansões de estudo.
1.2. Objetivos
O objetivo geral do trabalho de conclusão de curso foi estudar o crescimento da
microalga Chlorella sp. em meio de lixiviado de Cachoeira Paulista utilizando-se de
um biorreator tubular do tipo Biocoil, avaliando também a redução da carga orgânica,
turbidez e metais do lixiviado. Para tal objetivo geral ser alcançado, os objetivos
específicos delineados abaixo também hão de ser:
Estudo de fatores controláveis no crescimento celular da microalga Chlorella
sp. no lixiviado em batelada;
Construção e pré-operação do biorreator;
Estudo de fatores controláveis no crescimento no biorreator;
15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Microalgas
Microalgas são microorganismos fotossintéticos (dotados de clorofila a) que podem
crescer rapidamente e viver em condições rigorosas devido à sua estrutura unicelular.
Podem ser encontradas em todo mundo, na superfície de alguns tipos de solos e
principalmente em ambientes aquáticos, apresentando-se como células isoladas,
agrupadas formando colônias ou encadeadas sob forma de segmentos lineares de
células. Em todos os casos ocorre pouca ou nenhuma diferenciação das funções ou
especialização das células, ou seja, cada célula realiza todas as funções vitais.
(LOURENÇO, 2006; MATA et al., 2010).
A primeira vez que o ser humano usou microalgas foi há mais de 2000 anos, na China,
onde a microalga Nostoc sp. foi utilizada como alimento. Há relatos também da
utilização de algas de lagos como fonte de alimentos pelos astecas (SPOLAORE et
al., 2006). Por volta do final da década de 1910, houve intensificação de estudos
relativos ao crescimento de espécies de Chlorella, verificando-se que alguns cultivos
atingiam até 50% de proteína crua (COLLA et al., 2002).
O gênero Chlorella compreende um conjunto de espécies caracterizadas por serem
unicelulares e microscópicas, esféricas e com diâmetro entre 5 e 10 μm, encontrada
comumente em lagos, com grande habilidade de realizar fotossíntese (ILLMAN et al.,
2000).
Estudos apontam que as espécies do gênero Chlorella são consideradas candidatas
promissoras para a produção comercial de lipídios devido ao rápido crescimento e
fácil cultivo, destacando a C. vulgaris como uma das espécies mais robustas para o
cultivo em tanques abertos devido ao alto potencial de resistência a contaminações
(HUNTLEY et al., 2007).
As microalgas armazenam energia na forma de ATP e NADPH, compostos utilizados
para a síntese de carboidratos, lipídios e outros compostos orgânicos, a partir de água
e redução de CO2. Essas espécies, além de possuírem um rápido crescimento, podem
conter altos teores de óleo, comparando-se com espécies de plantas oleaginosas
(LEHNINGER, 1990).
16
Microrganismos fotossintéticos como as microalgas têm sido amplamente utilizadas
em projetos de mecanismo de desenvolvimento limpo, por meio de sequestro de CO2
atmosférico a fim de produzir biomassa, além de serem responsáveis por 40% do
carbono fotossintetizado na crosta terrestre (CHISTI, 2007).
2.2. Metabolismo
As microalgas apresentam três tipos principais de metabolismo quanto à origem de
carbono:
2.2.1. Autotrófico:
No metabolismo autotrófico, as microalgas utilizam a luz como fonte única de energia
para reduzir o CO2 atmosférico em várias formas de energia química, como
polissacarídeos, proteínas, lipídios e hidrocarbonetos por meio de reações anabólicas
(MATA et al., 2010).
2.2.2. Heterotrófico:
No metabolismo heterotrófico, as microalgas utilizam apenas compostos orgânicos
dissolvidos como fonte de carbono, geralmente sob a forma de glicose ou derivados
de polissacarídeos. Nesse tipo de cultivo, são obtidas altas densidades celulares,
proporcionando menores custos relacionas à etapa de colheita de biomassa (HUANG
et al., 2010).
2.2.3. Mixotrófico:
O regime mixotrófico constitui o tipo de cultivo no qual a microalga é capaz de realizar
a fotossíntese e consumir fontes dissolvidas de carbono, isso é, a microalga consegue
sobreviver em regime autotrófico quanto heterotrófico (CHEN & WALKER, 2011).
2.3. Meios de cultivo
Dentre os mais diversos meios de cultivo disponíveis e detalhados na literatura, todos
apresentam em comum a presença de macro e micronutrientes essenciais ao
crescimento (GUILLARD, 1975).
Os macronutrientes são classificados em compostos de carbono, hidrogênio, oxigênio,
nitrogênio, fósforo, enxofre, potássio, magnésio, silício e ferro. Esses compostos
apresentam funções de grande importância, como constituir a estrutura de
17
biomoléculas, membranas e do meio intracelular; também participam do processo de
troca de energia e regulam várias atividades metabólicas (LOURENÇO, 2006).
Os micronutrientes principais são manganês, molibdênio, cobalto, boro, vanádio,
zinco, cobre e selênio. Esses participam da estrutura e atividade de diversas enzimas
(LOURENÇO, 2006).
De acordo com Lourenço (2006), há também algumas vitaminas essenciais aos meios
de cultivo, como a tiamina (vitamina B1), que atua como enzima em diversas reações,
biotina (B7), atuando no transporte de CO2 e a cianocobalamina (B12).
2.4. Regime de cultivo
Os cultivos podem ser divididos em três grandes classes: descontínuos (ou batelada),
semicontínuos e contínuos.
2.4.1. Descontínuos
Nos cultivos descontínuos, as células são inoculadas no meio fresco e esterilizado no
início do cultivo, sem quaisquer adições futuras de nutrientes (LOURENÇO, 2006).
É possível seguir o crescimento de um cultivo em batelada, ao inocular uma população
de microalgas em um meio de cultivo líquido, com uma fonte de energia adequada,
nutrientes necessários, condições químicas e físicas favoráveis (tais como pH e
adição de agente tamponante) em um sistema fechado com troca de gases. A figura
abaixo mostra as várias fases características de crescimento de população microbiana
(RICHMOND, 2004).
Figura 2.1: Variação da biomassa em um cultivo em batelada (Adaptado de RUSSO,
2011)
18
1. Fase de adaptação, ou lag
Trata-se de um período de adaptação das células extraídas de uma cultura em fase
exponencial ou estacionária para um meio fresco. Esta fase é extensa na presença
de altas concentrações de compostos tóxicos, de nutrientes dificilmente
metabolizáveis ou se o inóculo for inadequado.
2. Fase de aceleração de crescimento
Trata-se de um período onde as células já estão adaptadas e começam a se
multiplicar; a taxa específica de crescimento é inferior ao valor máximo.
3. Fase de crescimento exponencial
Fase de crescimento acelerado onde o valor da taxa específica de crescimento se
mantém constante, atingindo o valor máximo.
4. Fase de desaceleração do crescimento
Nesta fase, a concentração de um ou mais nutriente(s) torna-se limitante, com o
consequente decréscimo da taxa específica de crescimento.
5. Fase estacionária
As populações raramente conseguem manter um crescimento exponencial a altas
velocidades durante um largo período de tempo em regime batelada, visto que o
crescimento está limitado pelo esgotamento dos nutrientes ou pela acumulação de
produtos inibitórios do metabolismo. Consequentemente, a velocidade de crescimento
diminui e iguala à taxa de morte. A população de microrganismos mantém, durante
algum tempo, uma concentração aproximadamente constante de biomassa à custa
da utilização de reservas internas de nutrientes, que são libertadas para o meio devido
à lise de outras células.
6. Fase de morte
A morte resulta do esgotamento de nutrientes do cultivo de microrganismos. A cinética
de morte é equivalente à uma reação de primeira ordem, isso é, a velocidade de morte
é proporcionalmente direta à concentração de células.
19
2.4.2. Semicontínuos
Nos cultivos denominados semicontínuos, uma parcela do meio de cultivo de
microalgas é removida e substituída por meio de cultura novo, sem células. Durante a
manipulação do meio de cultivo, por meio da remoção de células e diluição da cultura,
é essencial que todos os demais parâmetros do cultivo, isso é, temperatura,
intensidade luminosa, composição do meio e pH, sejam mantidos constantes e a
coleta das algas realizadas com o cultivo ainda na fase exponencial. Isso é devido ao
fato de que, quando as células estão nesse estado de crescimento, o meio como um
todo não sofre com o efeito da diluição do cultivo (LOURENÇO, 2006).
2.4.3. Contínuos
Nos cultivos contínuos, ocorre um permanente processo de entrada de meio
esterilizado e saída de cultura em iguais taxas e de modo constante. Este tipo de
cultivo pode exigir tempos maiores para atingir a estabilidade (LOURENÇO, 2006).
2.5. Cultivo
Os cultivos de microalgas envolvem geralmente a intensificação de densidade celular,
a fim de se obter maiores concentrações de produto por unidade de volume colheita.
As microalgas podem ser cultivadas tanto em sistemas abertos quanto em sistemas
fechados. Cultivos em sistemas abertos são usualmente conduzidos em piscinas ou
tanques diretamente expostas ao meio ambiente, enquanto cultivos em sistemas
fechados são conduzidos em biorreatores, que podem ser divididos em algumas
categorias, como tubulares, flat-plate e de tipo coluna. A colheita geralmente é feita
por centrifugação, floculação ou flotação celular (LOURENÇO, 2006).
2.5.1. Sistemas abertos
Nos sistemas abertos, as microalgas são produzidas em lagos ou lagoas, piscinas,
tanques ao ar livre. Apresentam baixos custos de instalação e fácil operação de
manutenção, no entanto, estão sujeitos a contaminações e variações nos parâmetros
de cultivo, como por exemplo, temperatura e intensidade luminosa.
Na construção dos sistemas abertos, a profundidade geralmente está compreendida
em valores de 10 a 50 cm, de modo que o CO2 atmosférico seja capaz de sofrer
difusão e que também haja penetração da luz solar. São construídos usualmente em
20
cimento ou terra compactada, impermeabilizada por plástico. O tipo raceway pond é
o sistema mais utilizado tanto em nível de escala piloto, quanto em escala comercial,
devido à facilidade de set-up desse (SUALI E SARBATLY, 2012).
Nos cultivos de microalgas em maiores escalas, a agitação e/ou aeração do sistema
acarreta oxigenação do cultivo, aporte de CO2 ao meio de cultura, exposição das
células à luz e acesso homogêneo das microalgas aos nutrientes. A aeração também
pode ser promovida mediante a introdução de ar nos tanques, produzindo pequenas
bolhas. Porém a movimentação causada pela aeração não é o suficiente para
homogeneizar a distribuição das células. Em maiores escalas, são utilizadas, portanto,
pás giratórias, que geram misturas hidráulicas eficientes (LOURENÇO, 2006).
2.5.2. Sistemas fechados
Nos sistemas fechados, é comum a utilização de fotobiorreatores. O princípio de um
fotobiorreator está no fornecimento eficaz de luz para cada célula presente no cultivo.
Os fotobiorreatores são construídos com materiais oticamente transparentes, como
vidros e plásticos derivados do acrílico, permitindo plena penetração de luz. Em
comparação com tanques, os fotobiorreatores apresentam um custo de produção
muito mais elevado, porém podem gerar maiores produtividades. Dentre os tipos mais
comuns, há o flat-plate, coluna de bolhas e fermentadores aeróbicos tradicionais.
Os sistemas flat-plate são caracterizados por paralelepípedos de vidro, acrílico ou
outro material rígido e transparente. O ar é injetado pela base, enriquecido com CO2
necessário ao crescimento de biomassa e a promoção de turbulência para que todas
as células estejam ao alcance da radiação solar (LOURENÇO, 2006).
2.5.2.1. Biocoil
O desenvolvimento de uma planta piloto denominada “Biocoil” foi realizada no Reino
Unido e na Austrália na década de 1980 (ROBINSON, 1987). A proposta original era
da utilização de uma bobina de tubos de polietileno de 30 mm de diâmetro, arranjados
ao longo de um suporte aberto circular com uma alta razão de área superficial/volume
(100 m² para 1,2 m³ de cultivo). Neste mesmo projeto, havia um trocador de calor entre
os coletores solares e uma bomba, que permitia o controle da temperatura do cultivo.
21
Uma companhia de origem australiana investiu para operação de larga escala para
produção de Spirulina e Tetraselmis. Tal companhia foi à falência, mas algumas
operações adaptadas continuaram a ser realizadas no Reino Unido pela empresa
Biotechna-Graesser A. P. Ltd.
Algumas poucas estratégias de utilização do biocoil são encontradas no campo
acadêmico, como na Universidade Murdoch, em Perth, na Austrália, com o prof.
Borowitzka, e na Universidade de Minnesota, em Saint Paul, nos Estados Unidos, com
o prof. Roger Ruan. Os projetos reportados incluem remoção ou redução de metais e
toxinas de efluentes de baixa a moderada toxicidade (como esgoto doméstico),
acúmulo de lipídeos e produção de carotenoides (CHAUMONT, 1993, KONG et al.,
2010).
A figura 2 ilustra um dos primeiros reatores do tipo Biocoil, na Universidade Murdoch,
na Austrália, onde o prof. Borowitzka aprofundou a temática de produção de lipídeos
e produção de carotenos o utilizando (STERL Project).
Figura 2.2: Biocoil na Universidade Murdoch, Perth, Austrália (STERL Project)
2.6. Aplicações dos cultivos de microalgas
De acordo com Lourenço (2006), os cultivos microalgais, assim como outras diversas
fermentações, são as ferramentas que viabilizam o aproveitamento direto ou indireto
da biomassa microalgal. As aplicações mais simples consistem na alimentação
humana e animal. Algumas outras possíveis aplicações são: extração de produtos de
22
interesse da indústria farmacêutica, produção de corantes alimentícios, produção de
cosméticos, indicadores ambientais, etc.
A utilização eficiente de matéria orgânica abre espaço para aplicações
biotecnológicas, como a bioconservação da energia solar (estocagem de energia),
fermentação para produção de metano ou de etanol, por exemplo (LOURENÇO, 2006)
e também o tratamento de resíduos, como o estrume, hidrolisados e o lixiviado (REIS
et al., 2014).
2.7. Lixiviado
2.7.1. Definição de lixiviado
Há diversas denominações para o líquido residuário de aterros sanitários. De acordo
com Gomes (1995), o termo em inglês “leachate” pode ser traduzido como “lixiviado”,
“chorume”, “percolado” e “líquidos percolados”. Segundo a pesquisadora, “chorume”
é melhor empregado para o resultado de atividades metabólicas utilizando-se
nutrientes do efluente. É sabido que há presença da água da chuva no resíduo pós
ação microbiana, o que origina os termos “percolado” e “líquidos percolados”.
De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas (1992), “percolado” é
definido como “líquido que passou através de um meio poroso”. De acordo ainda com
a mesma fonte, “chorume” ou também conhecido como “sumeiro” é “líquido produzido
pela decomposição de substâncias contidas nos resíduos sólidos, que tem como
características a cor escura, o mau cheiro e a elevada DBO (demanda bioquímica de
oxigênio)”; e define como “lixiviado” o “produto líquido proveniente de aterros
sanitários de resíduos sólidos urbanos”.
Para tal trabalho, será utilizada a denominação “lixiviado”, o qual é conceituado por
alguns pesquisadores (TILLMANN, 2003; RENOU, 2008) como sendo um líquido de
cor negra gerado pela decomposição de resíduos orgânicos depositados em aterros,
o qual somado à agua da chuva, percola através de uma massa de resíduos. Tal
efluente é provido de algumas fontes, como a umidade natural do aterro, da água de
constituição de materiais residuários, da água superficial e daquela resultante do
processo de decomposição. Sua composição consiste em elevados valores de DQO,
DBO, metais, ácidos graxos voláteis, nitrogênio amoniacal e poluentes tóxicos.
23
Dentre os modos de disposição de resíduos sólidos decorrentes das atividades
humanas (lixão e aterro controlado, por exemplo), os aterros sanitários ganharam
espaço por atenderem a necessidade de grandes quantidades a custos relativamente
baixos. Decorrente desse armazenamento, há a formação do lixiviado, que é
constituído de reações e processos biológicos, químicos e físicos a partir do material
depositado, além de água fluvial (CAMPOS et al., 2002).
Sabe-se que a decomposição de resíduos em aterros dá-se em três fases, com um
tempo aproximado de 15 anos até a estabilização final, sendo que há produção de
percolado por cerca de 50 anos, mesmo desativado (CAMPOS et al., 2002). A primeira
etapa consiste na decomposição aeróbica dos resíduos, gerando grandes
quantidades de gás carbônico e gás hidrogênio. Segue-se com etapas de digestão
anaeróbica, produzindo compostos simples e solúveis, como ácidos voláteis e
compostos nitrogenados de baixa massa molecular. Os produtos finais são os
compostos recalcitrantes.
A composição do lixiviado é variável e depende de fatores que compreendem as
condições pluviométricas, tempo de disposição, idade do aterro, operação e estrutura,
condições ambientais e características de como o despejo é feito. Logo, não é possível
acondicionar uma composição fixa para este resíduo.
Christensen et al (2001) dividiu os compostos orgânicos derivados do lixiviado em
duas categorias. A primeira, correspondente à matéria orgânica dissolvida,
corresponde às macromoléculas como ácidos húmicos, fúlvicos e graxos, além da
lignina. A presença destes compostos em grandes quantidades faz com que o resíduo
apresente características bem definidas, como cor, tensoatividade, atividade
fotoquímica, capacidade de tamponamento. Esses também afetam o comportamento
de outras substâncias no meio, modificam processos de oxidação e redução,
solubiliza determinados metais e varia a toxicidade. A segunda categoria corresponde
aos compostos orgânicos xenobióticos, que são hidrocarbonetos aromáticos,
compostos halogenados e fenólicos, álcoois, aldeídos, cetonas e ácidos carboxílicos
de baixa cadeia, além de outras substâncias com características tóxicas. Estes,
embora em concentrações muito menores que os ácidos húmicos e fúlvicos, possuem
toxicidade muitas vezes maior que os outros componentes presentes no lixiviado.
24
O tratamento de lixiviado se faz de enorme importância devido à possibilidade de
transferência dos contaminantes presentes no mesmo aos lençóis freáticos, a
ecossistemas e também às comunidades humanas.
O lixiviado oriundo deste trabalho é oriundo do aterro sanitário da cidade de Cachoeira
Paulista, SP, administrado pela empresa Vale Soluções Ambientais.
Conforme visto na figura 3, o lixiviado do aterro sanitário de Cachoeira Paulista, SP, é
armazenado a ceu aberto em grandes reservatórios, para futuro tratamento.
Figura 2.3: Tanque de lixiviado no aterro sanitário de Cachoeira Paulista, SP (Vale
Soluções Ambientais)
Souto e Povinelli (2006) realizaram um trabalho de grande valia quanto à análise de
lixiviados no Brasil. As tabelas de composição encontradas na literatura são, na
grande maioria, de estudos realizados no exterior, principalmente de países de clima
temperado; o que difere bastante da realidade brasileira. Os pesquisadores realizaram
uma caracterização do efluente no Brasil a partir de dados na literatura
correspondentes a 25 aterros, de 9 estados, cuja classificação encontra-se na tabela
2.1.
25
Tabela 2.1: Características físico-químicas dos lixiviados no Brasil. (SOUTO e
POVINELLI, 2006)
Variável Faixa Máxima Faixa mais provável
pH 5,7 – 8,6 7,2 – 8,6
Alcalinidade total (mg L-1 de CaCO3) 750 – 11400 750- 7100
Dureza (mg L-1 de CaCO3) 95 – 3100 95 – 2100
Condutividade (μS cm-1) 2950 – 25000 2950 – 17660
DBO (mg L-1) <20 – 30000 <20 – 8600
DQO (mg L-1) 190 – 80000 190 – 22300
Óleos e Graxas (mg L-1) 10 – 480 10 – 170
Fenóis (mg L-1 C6H5OH) 0,9 – 9,9 0,9 – 4,0
Nitrogênio Total (mg L-1) 80 – 3100 Não Há
Nitrogênio Amoniacal (mg L-1) 0,4 – 3000 0,4 – 1800
Nitrogênio Orgânico (mg L-1) 5 – 1200 400 – 1200
Nitrito (mg L-1) 0 – 50 0,0 – 15
Nitrato (mg L-1) 0 – 11 0,0 – 3,5
Fósforo Total (mg L-1) 0,1 – 40 0,1 – 15
Sulfeto (mg L-1) 0 – 35 0,0 – 10
Sulfato (mg L-1) 0 – 5400 0,0 – 1800
Cloreto (mg L-1) 500 – 5200 500 – 3000
Sólidos totais (mg L-1) 3200 – 21900 3200 – 14400
Sólidos totais voláteis (mg L-1) 630 – 20000 630 – 5000
Sólidos totais fixos (mg L-1) 2100 – 14500 2100 – 8300
Sólidos suspensos totais (mg L-1) 5,0 – 2800 5,0 – 700
Sólidos suspensos voláteis (mg L-1) 5,0 – 530 5 – 200
Ferro (mg L-1) 0,001 – 260 0,01 – 65
Manganês (mg L-1) 0,04 – 2,6 0,04 – 2,0
Cobre (mg L-1) 0,005 – 0,6 0,05 – 0,15
Níquel (mg L-1) 0,03 – 1,1 0,03 – 0,5
Cromo (mg L-1) 0,003-0,8 0,003 – 0,5
Cádmio (mg L-1) 0,0 -0,26 0 – 0,065
Chumbo (mg L-1) 0,01 – 2,8 0,01 – 0,5
Zinco (mg L-1) 0,01 – 8,0 0,01 – 1,5
De acordo com Peixoto et al (2008), as concentrações de DBO e de DQO tendem a
diminuir ao longo do tempo no lixiviado. É sabido que a DBO tende a decrescer com
uma taxa superior à da DQO, já que há a presença de material orgânico de difícil
degradação que faz parte da DQO.
2.7.2. Métodos de Tratamento do Lixiviado
Dentre as mais diversas técnicas de tratamento de efluentes, muitas são aplicáveis
ao lixiviado. Uma metodologia que vem demonstrando resultados relativamente
positivos é a recirculação do percolado pós-tratamento para dentro do aterro. O
26
resultado desta prática é a melhoria da biodegradação da matéria orgânica presente
no lixo por meio da introdução de oxigênio dissolvido, estendendo o metabolismo
aeróbico e também reduzindo a vazão a tratar; o que garante a manutenção de um
nível admissível no interior das células que não inibe o processo de decomposição
dos resíduos, e também assegurando a estabilidade geotécnica do depósito (CHAN
et al., 2002; SAN e ONAY, 2001). Problemas que devem ser atentados quanto à
recirculação estão relacionados à saturação de lixiviado quando grandes quantidades
do resíduo são recirculadas (SAN e ONAY, 2001).
Há também o tratamento bioquímico por meio de wetlands, utilizando-se de plantas
aquáticas, solos e a associação de microrganismos para remoção de contaminantes
de águas residuárias, e também do lixiviado. Além destas, há as chamadas lagoas de
estabilização, caracterizadas por sua simplicidade, eficiência e baixo custo, onde a
estabilização da matéria orgânica é realizada por oxidação de origem microbiana, e é
completada de forma cíclica na redução fotossintética por algas.
Não menos importante, há o tratamento químico, e dentro desta categoria, o
tratamento via Processos Oxidativos Avançados (POA). Estes são capazes de
promover a degradação e até mesmo, a mineralização dos poluentes. O lixiviado,
tratado por POA, pode promover uma depuração significativa o suficiente para deixá-
lo em condições de reuso (DE MORAIS e PERALTA-ZAMORA, 2005).
2.7.3. Tratamento Biológico de Efluentes
A natureza do tratamento biológico de efluentes é de tal sorte a acelerar os
mecanismos presentes de degradação natural nos corpos receptores. Logo, a
decomposição dos poluentes orgânicos é alcançada em condições controladas em
intervalos menores do que nos sistemas naturais, por meio de reações bioquímicas
utilizando-se de microrganismos como agentes de catálise (SPERLING, 2005).
A base do processo microbiológico é a utilização do material orgânico presente nos
efluentes como forma nutricional para o microrganismo. A matéria orgânica é
convertida em gás carbônico, água, material celular e produtos de fermentação
anaeróbica. Como qualquer cultivo celular, a decomposição biológica será efetiva se
houver condições favoráveis de pH, temperatura, concentração de macro e
micronutrientes, oxigênio, etc (SPERLING, 2005).
Dentre os processos de tratamento biológico, há as chamadas lagoas de
27
estabilização, fermentadores anaeróbicos, lodos ativados, reatores aeróbicos, etc.
2.7.4. Lixiviado como meio de cultivo celular
O lixiviado é constituído de uma série de compostos orgânicos e inorgânicos, dentre
os quais destacam-se produtos nitrogenados, fosforados, metais pesados, taninas e
fenóis (BERNARD et al., 1997) e é considerado um forte poluente se descartado no
solo ou em águas de superfície sem tratamento prévio (ALKALAY et al., 1998).
Comparando-se diversas técnicas de tratamento disponíveis hoje no mercado e no
meio científico, é sabido que as técnicas por via química são extremamente eficazes,
porém apresentam custos operacionais elevados (WONG et al., 1990).
O lixiviado não apresenta uma composição fixa, e varia de acordo com a localidade,
o tempo de existência do aterro e inúmeros outros fatores. Consequentemente, a
utilização de um certo tipo de lixiviado como fonte de matéria prima para tratamento
biológico pode ser inadequada para diversas outras espécies, ou então, o tratamento
eficaz de um tipo de lixiviado por uma certa espécie pode ser falho quanto à utilização
do lixiviado de outra localidade (CHEUNG et al., 1993).
Lin et al. (2011) estudaram o cultivo de algumas espécies de microalga para cultivo
no lixiviado, com o aspecto apenas de crescimento celular. De acordo com Lin et al.
(2006), uma das prováveis causas da alta toxicidade do lixiviado é a alta concentração
de nitrogênio amoniacal (NH4+/NH3), que chegam a valores de até 5000 mg/L. Essa
concentração alta inibe o crescimento de microrganismos capazes de realizar
tratamento biológico, como os de lodo ativado. Rai et al. (1996) indica que o gênero
Chlorella pode ser uma boa escolha para tratamento biológico de resíduos, visto que
as células apresentam alto poder de resiliência no crescimento em meios não
favoráveis, sejam meios ácidos, pela alta concentração de inibidores ou pela
quantidade de metais pesados presentes.
2.7.5. Crescimento de microalga no lixiviado
Lin et al (2007) provou ser possível a redução de toxicidade e de carga orgânica do
lixiviado a partir do cultivo microalgal; os pesquisadores discorrem que o a remoção
total de amônia e ortofosfato de resíduos do lixiviado é algo difícil, vista a
complexidade do efluente. Algumas estratégias para o tratamento de resíduos via
28
microalgas foram desenvolvidas com sucesso, como fotobiorreatores com sistemas
imobilizados de bactérias e algas (TAM e WONG, 1989), contudo, para o tratamento
do lixiviado propriamente dito, pouco desenvolvimento técnico foi feito.
Além do problema da concentração de compostos nocivos aos microorganismos,
como alguns de origem fenólica, o lixiviado apresenta dificuldades de natureza física
que dificultam o seu tratamento via microrganismos com regimes fototróficos (LIN et
al, 2007). A principal dificuldade apresentada de natureza física é sua turbidez e sua
cor, que permanecem altas mesmo depois de filtração por membrana. Tal limitação
reduz a penetração luminosa no percolado e consequentemente se torna um fator
limitante ao crescimento celular. Além disso, Harmmer (1996) constata que, para
tratamento de lixiviado utilizando-se microalgas em tanques, não se deve permitir uma
profundidade superior a 1,50 m, visto a necessidade de liberação do fluxo de produtos
gasosos decorridos da anaerobiose, além, obviamente, da redução significativa da
penetração luminosa.
O lixiviado, após sua estabilização, é geralmente saturado em gás carbônico derivado
das aerobioses de origem microbiana; o que é um fator positivo e significativo para o
crescimento microalgal. No entanto, como muitos dos sistemas de tratamento
microbiológicos de lixiviado levam tempos elevados, a concentração de gás carbônico
tende a se dizimar com o tempo (ADAMSSON et al., 1998).
2.7.6. Desenvolvimento de fotobiorreatores microalgais para tratamento de
águas residuárias
Pouco fora feito e reportado quanto ao desenvolvimento de fotobiorreatores utilizando-
se de microalgas para tratamento de efluentes. O único trabalho feito com reator do
tipo biocoil encontrado na literatura foi um utilizando-se da espécie Chlamydomonas
reinhardtii (KONG et al., 2010). Su (2012) sumarizou os experimentos na literatura, e
a relação de espécie com tipo de reator é encontrada no quadro 2.7.6.
29
Tabela 2.2: Biorreatores para tratamento de águas residuárias via microalgas (SU,
2012)
Espécie microalgal Tipo de reator Referência
Botryococcus braunii Erlenmeyer de 1 L com
500 mL de meio
CHINNASAMY et al.,
2010
Chlamydomonas
reinhardtii
Fotobiorreator biocoil KONG et al., 2010
Chlorella vulgaris Reator piloto GUTZEIT et al., 2005
Chlorella sp. Reator em bobina LI et al., 2011
Chlorella sp. Frascos cônicos ZHOU et al., 2011
Dunaliella terctioleta Erlenmeyer de 1 L com
500 mL de meio
CHINNASAMY et al.,
2010
Scenedesmus Fotobiorreator tubular DI TERMINI et al., 2011
Scenedesmus sp. LX1 Erlenmeyer de 250 mL LI et al., 2010
Scenedesmus sp. Frascos cônicos ZHOU et al., 2011
Scenedesmus
rubescens
Fotobiorreator em
ambiente fechado
LIN e LIN, 2011
Spirulina platensis Fotobiorreator com airlift YUAN et al., 2011
2.8. Planejamento de experimentos
O chamado projeto de experimentos está delineado numa classe de técnicas
estatísticas aplicadas ao planejamento, à condução, à análise e à interpretação de
testes controlados, buscando encontrar e definir fatores que influenciam os valores de
um parâmetro ou de um grupo de parâmetros (BARROS et al., 2010).
A otimização de parâmetros de processo e a melhoria da qualidade de produtos têm
sido amplamente alcançada com a utilização dos projetos de experimentos por meio
de aplicação de conceitos e técnicas de engenharia e de estatística aplicada
(BARROS et al., 2010)
O planejamento de experimentos leva em consideração interações entre os fatores e
pode ser utilizado para a otimização de parâmetros operacionais em sistemas com
multivariáveis e essa técnica visa maximizar ou minimizar o efeito das variáveis
respostas obtidas em cada experimentação, além de obviamente, reduzir o número
de condições experimentais, a fim de minimizar custos e tempo (AY et al., 2009).
30
2.8.1. Método de Taguchi
As técnicas de Planejamento de Experimentos vêm sendo utilizadas como uma
ferramenta para verificar o funcionamento de sistemas ou processos produtivos,
permitindo a melhoria destes como a redução da variabilidade e conformidade
próximas do resultado desejado, além de redução no tempo de processo e
conseqüentemente dos custos operacionais (BARROS et al.,1995).
O método de Taguchi é uma aplicação sistemática de Planejamento de Experimentos.
Esta técnica de Genichi Taguchi foi projetada especificamente para aperfeiçoar a
qualidade dos manufaturados japoneses (PHADKE, 1989). Este é um método
relativamente simples de ser executado e reduz extremamente o número de
experimentos necessários se comparado com as técnicas convencionais utilizadas.
No delineamento de experimentos são utilizados arranjos ortogonais. Na análise dos
resultados utiliza-se a técnica da ANOVA, que pode ser encontrado na maioria dos
softwares atuais de estatística.
31
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Obtenção da estirpe
Para o estudo deste Trabalho de Conclusão de Curso, foi utilizada a microalga
Chlorella sp., oriunda de Cabo Frio, RJ, (chlor-CF), que foi gentilmente doada pelo
Departamento de Oceanografia Biológica do Instituto Oceanográfico da Universidade
de São Paulo.
3.2. Preparação do meio de cultivo para crescimento celular
Para cada série de cultivo, todo o material usado (pipetas, erlenmeyers, micropipetas,
béqueres, etc) foi lavado em água corrente, rinsado com água destilada e autoclavado
a 121 ºC durante 20 minutos. Para os erlenmeyers de ensaio, foram utilizados como
tampa pedaços de papel alumínio desinfectados (XIA et al., 2011).
A inoculação das microalgas foi feita próximo à chama de lamparina, e o cultivo, em
sala climatizada. A iluminação, a não ser que dito diferente, fora feita com lâmpadas
fluorescentes de 40 W. A intensidade luminosa foi medida com um luxímetro e a
temperatura da sala foi mantida constante por um aparelho de ar-condicionado tipo
quente/frio. O cultivo foi feito na sala de fotobiorreatores, no laboratório do prof.
Messias B. Silva, de aproximadamente 8 m², isolada de luz difusa e portada de um
aparelho de ar-condicionado portátil quente/frio, para controle total de luz artificial e
de temperatura.
Todos os reagentes utilizados na preparação dos meios de cultivo foram de padrão
analítico, e o meio de cultivo básico, para manutenção do cultivo mãe, foi aquele
mostrado na tabela 3.1.
As soluções de estoque, utilizadas na preparação do meio de cultivo foram
autoclavadas a 110 ºC, com exceção da solução de vitaminas (Tiamina,
Cianocobalamina e Biotina), que foram filtradas através de filtros de 0,22 μm de
tamanho de poro.
O meio Guillard é baseado para cultivo de microalgas marinhas, e apresentou bons
resultados para o crescimento celular de Chlorella sp. (LOURENÇO, 2006).
32
Tabela 3.1: composição do meio f/2 sem sílica adaptado (GUILLARD, 1975)
Componentes Concentração
Sal marinho 30 g/L
NaNO3 75 g/L
NaH2PO4.H2O 5 g/L
FeCl3.6H2O 3,15 g/L
Na2EDTA 4,3 g/L
ZnSO4.7H2O 22,2 mg/L
MnCl2.4H2O 180 mg/L
Na2MoO4.2H2O 6,3 mg/L
CoCl2.6H2O 10 mg/L
CuSO4.5H2O 9,8 mg/L
Tiamina 100 mg/L
Cianocobalamina 0,5 mg/L
Biotina 0,5 mg/L
3.3. Manutenção da cepa
A cepa da microalga Chlorella sp. utilizada nesse estudo foi mantida em uma
incubadora confeccionada em madeira e dotada de um fotoperíodo, controlada por
um temporizador. A intensidade luminosa fornecida foi de 15 W por uma lâmpada
fluorescente.
Para manutenção de um banco de células, a repicagem foi feita em erlenmeyers de
volume de 250 mL, com volume útil de 100 mL, com fotoperíodo de 12 h: 12 h
(luz/escuro) e luminosidade média de 4,8 klux, correspondente à iluminação pela
lâmpada de 15 W. As repicagens foram feitas em períodos de 10 a 15 dias, na
proporção de 10 mL de cultura antecessora para 90 mL de meio de cultivo novo, e os
frascos foram agitados de forma manual uma vez ao dia.
3.4. Obtenção e caracterização do lixiviado
O lixiviado do aterro sanitário de Cachoeira Paulista, SP, foi gentilmente doado pelo
prof. Dr. Hélcio José Izário Filho, da própria Escola de Engenharia de Lorena, e a sua
caracterização físico-química foi feita nos laboratórios do prof. Dr. Hélcio José Izário
Filho, da própria Escola de Engenharia de Lorena.
3.5. Preparação do meio de cultivo para o biorreator
O meio de cultivo era constituído de uma parte de lixiviado de Cachoeira Paulista, SP,
com nove partes de água destilada. Após autoclavagem deste, havia a adição de
33
vitaminas, correspondente àquela do meio Guillard f/2 (100 mg/L de tiamina, 0,5 mg/L
de cianocobalamina e 0,5 mg/L de biotina, mantidas em soluções estoque). A
autoclavagem era feita geralmente um dia antes da inoculação, e era mantida em
galões comerciais de polipropileno de 20 L.
3.6. Construção e operação do biorreator
O biorreator foi construído a partir de uma adaptação do design de Biocoil
(ROBINSON, 1987).
A construção foi feita utilizando-se de um galão comercial de 20 L como tanque de
aeração, de tubos de PVC de ¾” como sistema de tubulação iluminada, com
comprimento total de 100 m, de vergalhões, abraçadeiras e demais suportes para as
lâmpadas, como pode ser visto na representação esquemática da figura 3.1.
Figura 3.1: Esquema do fotobiorreator tipo Biocoil usado no projeto
Os galões eram levados à sala de fotobiorreatores, previamente limpa e borrifadas
com álcool etílico a 70%, e a um deles, era adaptada a cortina de ar. O ar inserido era
provido de um compressor de ar BOYU ACQ-003 (1), e era passado por um filtro com
diâmetro de poro 0,22 μm e introduzido ao galão estoque, o qual será denominado
34
galão aerado (2), até a cortina de ar (3), a fim de uma aeração eficiente do meio (com
uma razão VVM aproximada de 0,56 min-1). A um galão, era ligada a bomba centrífuga
BOMAX NH-30PX-T (4) a fim de promover o carregamento ascendente do biorreator.
Conforme havia decréscimo do volume do primeiro galão, o segundo era utilizado para
completar o seu volume, até que todo o volume operacional estivesse completo (i.e.,
a parte iluminada estivesse completa com o meio de lixiviado). A parte superior do
tubo da parte iluminada era ligada à parte aerada, de modo que houvesse recirculação
de cultivo. Após visualização de estabilidade do reator (i.e., sem acréscimo ou
decréscimo significativo de volume na parte aerada), as vitaminas eram adicionadas
(40 mL de solução estoque), e aproximadamente 4 L de volume microalgal era
adicionado (o volume era adicionado de modo que a concentração inicial celular fosse
de 0,7E06 células/mL), a partir de cultivos estoque. O galão era mantido coberto com
uma rolha de algodão, de forma a prevenir a entrada de contaminantes, mas que
houvesse troca gasosa entre o meio e o ambiente. A vazão de entrada era controlada
por uma válvula do tipo bola, ou esfera (5). O tempo total de operação era de 3 dias
para cada batelada.
A amostragem era feita a partir da parte final do tubo de iluminação (6), de 24 em 24
h, tomadas na ligação feita ao galão de aeração (7), tomando um volume de cerca de
50 mL, que serviu de material para todas as análises.
Para o carregamento do reator, primeiramente, os meios de lixiviado diluído eram
autoclavados a 0,5 atm de pressão por 20 min., da forma que, para cada batelada,
foram utilizados 2 galões de 20 L cada, cheios.
3.7. Amostragem e separação celular
As amostragens, como previamente dito, foram tomadas da parte final da tubulação
da parte iluminada, sendo congeladas a -20 ºC até utilização. A única análise feita
prontamente após a amostragem foi a estimativa de concentração celular por
densidade ótica (LOURENÇO, 2006). A figura 3.2 ilustra a parte iluminada do
fotobiorreator.
35
A separação celular foi feita utilizando-se coagulação induzida por Al2(SO4)3 a 1,0 g/L
(PAPAZI et al., 2010). Havia separação de fases, e a separação celular, para as
análises químicas era feita utilizando-se filtros de diâmetro de poro de 0,45 μm.
Figura 3.2: Fotobiorreator utilizado no projeto
36
3.8. Planejamento de experimentos
Os experimentos foram delineados utilizando matrizes experimentais do tipo arranjo
ortogonal de Taguchi. A matriz do tipo L4 consiste em um arranjo de quatro linhas,
isso é, quatro experimentos com até três fatores, em dois níveis (alto e baixo).
A tabela 3.2 mostra um arranjo ortogonal L4 de Taguchi para 3 fatores, A, B e C, no
qual a operação é feita em 2 níveis (1 é o nível baixo, 2, o alto).
Tabela 3.2 Arranjo ortogonal L4 de Taguchi
Exp. A B C
1 1 1 1
2 1 2 2
3 2 1 2
4 2 2 1
No fotobiorreator, foram analisados três fatores em dois níveis: tempo de circulação
no tubo (controlado por uma válvula de bola adaptada na entrada da seção iluminada
do reator), temperatura do ambiente (controlada pelo aparelho de ar-condicionado
quente/frio) e fotoperíodo (controlado por um temporizador ligado às lâmpadas da
seção iluminada). O tempo de batelada foi fixado em 72 h para cada ensaio.
Logo, a matriz experimental, com os fatores decodificados, é a mostrada na tabela
3.3.
Tabela 3.3. Planejamento experimental do projeto
Exp. Temperatura Fotoperíodo Tempo no Tubo iluminado
1 20 ºC 12 h: 12h 5 min.
2 20 ºC 24 h: 0 h 12 min.
3 30 ºC 12 h: 12 h 12 min.
4 30 ºC 24 h: 0 h 5 min.
As respostas analisadas compreendem a redução de DQO, de TOC, de turbidez e de
metais presentes no lixiviado. A análise estatística foi feita utilizando o software
Minitab.
37
3.9. Métodos analíticos
3.9.1. Análise Espectrofotométrica de Densidade Ótica
O uso de densidade ótica para avaliação de crescimento microalgal baseia-se na
obstrução física da luz pelas células. Quanto mais células estiverem presentes na
amostra, maior será a absorção de luz e menor será a passagem de luz. Embora seja
uma alternativa prática para acompanhar o desenvolvimento das células em cultura,
é necessário estabelecer correlações entre a contagem celular e as medidas de
absorbância para a espécie (LOURENÇO, 2006).
O crescimento microalgal foi acompanhado por análise de absorbância em
espectrofotômetro UV-Vis modelo Bel Photonics, selecionando o comprimento de
onda de 690 nm, correspondente a um pico de clorofila-a, para a realização das
leituras (LOURENÇO, 2006).
3.9.2. Análise Microscópica
A contagem celular foi realizada num microscópio modelo BIOVAL com o auxílio de
um hemacitômetro, tipo câmara de Neubauer de 0,1mm de profundidade.
(LOURENÇO, 2006).
3.9.3. Determinação do peso seco da amostra
Com auxílio de uma bomba a vácuo, alíquotas de cultivo foram filtradas em filtros de
0,7 µm de porosidade (GF-3 MN) previamente pesados. Após o escoamento do
líquido, os filtros foram lavados com água destilada para remoção de impurezas no
filtrado e em seguida alocados em vidros de relógio para secagem em estufa a 105˚C
por 24 h. Depois de transcorridos o período de secagem, os filtros foram colocados
em um dessecador para evitar a absorção de umidade durante o resfriamento por
cerca de uma hora e imediatamente após a retirada dos filtros do dessecador
procedeu-se à pesagem em balança analítica ADA, modelo 210/L para a
determinação da biomassa. (LOURENÇO, 2006).
3.9.4. Determinação da turbidez
Para a determinação da turbidez nefelométrica das amostras de efluente investigadas,
utilizou-se um turbidímetro da TECNOPON-1000. Para a calibração do equipamento
utilizaram-se padrões de 0,1 NTU, 0,8 NTU, 8,0 NTU, 80,0 NTU e 1000 NTU. A análise
do lixiviado tratado foi feita após coagulação com Al2(SO4)3 e separação do
sobrenadante com filtros de 0,45 μm para remoção celular.
38
3.9.5. Determinação da DQO
A preparação dos reagentes para DQO no tubo digestor foi realizada de acordo com
metodologia rotineira do laboratório. Em frascos de digestão foram adicionados
sequencialmente: 40 mg de sulfato de mercúrio PA, 2,5 mL da solução de sulfato ácido
de prata (0,67% m/v), 0,5 mL da solução de dicromato de potássio 1,0 N, 0,3 mL de
água deionizada e 2,0 mL da amostra/padrões. A mistura foi aquecida a 150 ºC por 2
horas, em bloco digestor. Após condicionamento à temperatura ambiente, realizou-se
as medidas da absorbância de cada tubo à 620 nm para as amostras de alto teor, e à
420 nm, para as de baixo teor, utilizando uma cubeta de quartzo de 2 mL.
3.9.6. Determinação do TOC
Para as medidas de TOC foi utilizado um analisador TOC VCPH – Shimadzu. Este
equipamento mede a quantidade de carbono total (CT) e carbono inorgânico (CI) da
amostra. O TOC é dado pela subtração de CT e CI. Para a determinação de carbono
total, a amostra injetada fora carreada para um tubo de combustão a 680 °C contendo
platina suportada em alumina e que sofre oxidação catalítica a CO2. Para a
determinação de carbono inorgânico a amostra injetada reage com ácido fosfórico 25
%, sendo que todo carbono inorgânico é convertido a CO2. O CO2 produzido, tanto na
oxidação catalítica como o proveniente de carbono inorgânico, foi quantificado por
absorção no infravermelho não dispersivo (FONSECA, 2006).
Para maior eficiência do equipamento acima, as amostras foram preparadas da
seguinte maneira: Em um balão volumétrico de 25,0 mL, colocava-se 10,0 mL da
amostra, e completou-se o volume do balão com água deionizada, ajustando o pH
para 3 com solução 5,0 eq L-1 de H2SO4. A análise de TOC foi realizada pelo prof. Dr.
Hélcio J. Izário Filho.
3.9.7. Determinação dos metais
A análise de metais foi feita pelo prof. Dr. Hélcio José Izário Filho, utilizando-se a
técnica de espectrometria de emissão atômica por plasma acoplado indutivamente
(ICP-AES). O espectrômetro usado foi da marca Perkin Elmer, modelo Optima 8000.
As amostras foram avolumadas, digeridas com HNO3 e analisadas seguindo roteiro
de padrões do laboratório.
39
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos com o biorreator podem ser caracterizados quanto à curva de
crescimento obtida do cultivo e às análises estatísticas dos efeitos estudados sobre
as médias de crescimento celular, redução de turbidez, redução de demanda química
de oxigênio, redução de carbono orgânico total e redução de metais pesados.
4.1. Relação entre contagem celular e absorbância
Uma varredura de espectro do cultivo de Chlorella sp. foi feita, com passo de varredura
de 2 nm utilizando um espectofotômetro FEMTO 800 XI, a fim de determinar a região
de pico para redução de erros de medição espectrofotométricos. Conforme pode ser
visto na figura 4.1, há um pico para o comprimento de onda de 690 nm. Logo, as
medições experimentais foram realizadas a 690 nm.
Figura 4.1: Espectro de absorbância de cultivo da microalga Chlorella sp.
400 450 500 550 600 650 700 750 800
Ab
sorb
ânci
a re
lati
va
Comprimento de onda (nm)
Espectro de absorbância de cultivo da microalga Chlorella sp.
40
Uma varredura de espectro também foi feito para o lixiviado, a fim de saber se haveria
alguma interferência significativa na região de análise por espectrofotometria do
crescimento da microalga. Como não há região de pico para a região de análise de
crescimento celular (690 nm), como pode ser visto a partir da figura 4.2, fora utilizado
o branco da região no lixiviado sem a inoculação celular para cálculo do crescimento
celular efetivo.
Figura 4.2: Espectro de absorbância do lixiviado
A contagem celular relaciona a absorbância do cultivo com a quantidade de células
presentes. A contagem foi feita em câmara de Neubauer. A curva analítica que
relaciona a contagem celular como função da absorbância é aquela apresentada na
figura 4.3.
Observa-se um bom coeficiente de correlação na curva analítica (R²=0,9972). A
estimativa de contagem celular nos experimentos foi, por consequência, baseada
nesta relação de densidade ótica.
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Ab
sorb
ânci
a re
lati
va
Comprimento de onda (nm)
Espectro de absorbância do lixiviado
41
Figura 4.3: Curva analítica de contagem celular em função de absorbância
4.2. Curvas de crescimento nos reatores
Figura 4.4: Curvas de crescimento nos experimentos 1, 2, 3 e 4
y = 3E+07x - 152375R² = 0,9972
0,00E+00
5,00E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
Cél
ula
s/m
L
Absorbância
Absorbância vs. Contagem celular
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 h 2 4 h 4 8 h 7 2 h
célu
las/
mL
Milh
ões
tempo
Curvas de Crescimento nos Reatores
Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4
42
Percebe-se que os experimentos 3 e 4 obtiveram perfis similares de crescimento,
atingindo uma região de crescimento estacionário após as primeiras 24 h, embora o
experimento 3 apresentou um número final de células superior. Os experimentos 1 e
2 obtiveram uma cinética de crescimento levemente diferente, provavelmente
influenciada pela temperatura; sendo que nestes, a região estacionária se mostrou
presente no tempo compreendido entre 48 h e 72 h de crescimento.
4.3. Análise da redução de turbidez
A análise da redução de turbidez foi feita com base na turbidez do lixiviado diluído,
que continha turbidez de 9,19 NTU. Os experimentos do arranjo L4 de Taguchi
geraram os dados da tabela 4.1 e da figura 4.5.
Tabela 4.1: Resultados de porcentagem de redução de turbidez
Exp. Turb. Final (NTU) Teor de redução
1 1,85 0,80
2 0,71 0,92
3 0,16 0,98
4 4,41 0,52
21
0,9
0,8
0,7
21
21
0,9
0,8
0,7
Temperatura
Mé
dia
da
s m
éd
ias
Fotoperíodo
TempoTubo
Plot dos efeitos principais sobre a redução da TurbidezMédias dos dados
Figura 4.5: Plot dos efeitos principais sobre a redução da Turbidez
43
Os resultados quantitativos estão mostrados na tabela 4.2, ANOVA dos fatores em
relação à redução de turbidez.
Tabela 4.2: ANOVA dos fatores em relação à redução de turbidez
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0121 *
Fotoperíodo 1 0,0289 *
TempoTubo 1 0,0841 *
Erro residual 0 * *
Total 3
A partir da análise estatística pela visualização qualitativa dos resultados (figura 10),
espera-se que, para uma redução na turbidez mais eficiente, deva-se trabalhar com
as variáveis temperatura e fotoperíodo nos níveis baixos (20 ºC e 12 h:12 h,
respectivamente), e a variável TempoTubo, relacionada com o tempo médio de
residência no tubo iluminado, no nível alto, ou seja, de aproximadamente 12 min.
No entanto, a partir da ANOVA, vê-se que o fator Temperatura é aquele que menos
contribui para o efeito de redução da turbidez, já que sua soma quadrática é a menor
de todas (0,0121 < 0,0289 < 0,0841). Como a matriz L4 de Taguchi é saturada com 3
fatores, não há graus de liberdade para o cálculo do erro residual. A técnica estatística
permite utilizar-se do fator com menor significância, que no caso é a Temperatura,
para cálculo de tal, atribuindo-se os graus de liberdade e às somas quadráticas do
fator menos significante para o erro residual. Assim sendo, a Temperatura deixa de
ser um fator significante para cálculo da redução de turbidez e é utilizada como fonte
do erro, o que gera a nova ANOVA. Sabendo-se que a estatística F é dada pela razão
da média quadrática do fator pela do erro, vêm os resultados da tabela 4.3.
Tabela 4.3: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de turbidez
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura (Erro) 1 0,0121 *
Fotoperíodo 1 0,0289 2,38843
TempoTubo 1 0,0841 6,95041
Total 3
44
Figura 4.6: Análise visual da redução da turbidez do lixiviado pós floculação microalgal
A partir de análise visual do lixiviado, após crescimento celular e coagulação via
Al2(SO4)3 para remoção das células, vê-se um sobrenadante de característica clara e
incolor, conforme ilustrado pela figura 4.6.
A redução da turbidez está relacionada à redução de particulado interferente na
aparência do efluente. O fotobiorreator de Biocoil adaptado apresentou resultados
promissores para a redução da turbidez (em 98%, em estudos exploratórios apenas).
É interessante notar que a temperatura não se fez de grande significância nos
resultados. Extrapolando tal ideia, a operação do fotobiorreator em condições ao ar-
livre não apresentaria diferenças significativas para tratamentos a 20 ºC ou a 30 ºC;
que é uma faixa de temperatura facilmente encontrada ao longo do ano em muitas
cidades brasileiras. O fator crítico à redução da turbidez foi a variável TempoTubo,
que está relacionada ao tempo de irradiação luminosa que cada célula leva em cada
ciclo de recirculação. Para maior redução da turbidez, deve-se operar o biorreator com
um tempo maior de irradiação luminosa, o que provavelmente faz com que as células
sejam capazes de assimilar ou metabolizar compostos de natureza cromófora, como
por exemplo a lignina, presentes no lixiviado.
45
4.4. Análise da redução da Carga Orgânica
4.4.1. Análise da redução de DQO
A análise da redução da carga orgânica, medida em DQO, foi feita a partir da análise
em baixo teor (de 0 a 200 mg O2/L) e em alto teor (200 a 2000 mg O2/L). As curvas
analíticas que relaciona DQO com a absorbância estão mostradas nas figuras 4.7 e
4.8.
Figura 4.7: Curva analítica de DQO de baixo teor – 0 a 200 mg O2/L
Figura 4.8: Curva analítica de DQO de alto teor – 200 a 2000 mg O2/L
y = -397,73x + 221,62R² = 0,9841
0
50
100
150
200
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
DQ
O (
mg
O2/
L)
Absorbância a 420 nm
Curva analítica de DQO - Baixo Teor - 0 a 200 mg O2/L
y = 2982,5x + 81,791R² = 0,9935
0
500
1000
1500
2000
2500
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
DQ
O (
mg
O2/
L)
Absorbância a 620 nm
Curva analítica de DQO - Alto Teor - 200 a 2000 mg O2/L
46
A redução da DQO nos quatro experimentos está representada na tabela 4.4.
Tabela 4.4: Resultados de teor de redução de DQO do lixiviado
Exp. Abs. 420 nm DQO final (mg O2/L) Teor de redução
1 0,061 197,75 0,21
2 0,105 179,85 0,29
3 0,128 170,71 0,32
4 0,407 79,63 0,68
O lixiviado utilizado nos experimentos foi diluído de 10 vezes (uma parte de lixiviado
in natura para 9 partes de água destilada), e apresentou uma DQO inicial de 251,8 mg
O2/L.
A análise estatística dos fatores sobre as médias de redução da DQO via metodologia
de Taguchi gera os dados da figura 4.9.
21
0,5
0,4
0,3
21
21
0,5
0,4
0,3
Temperatura
Mé
dia
da
s m
éd
ias
Fotoperíodo
TempoTubo
Plot dos efeitos principais sobre a média da redução de DQOMédias dos dados
Figura 4.9: Plot dos efeitos principais sobre a média da redução de DQO
47
Cuja análise de variância é a apresentada na tabela 4.5.
Tabela 4.5: ANOVA dos fatores em relação à redução de DQO
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0625 *
Fotoperíodo 1 0,0484 *
TempoTubo 1 0,0196 *
Erro residual 0 * *
Total 3
A análise qualitativa dos resultados permite uma conclusão rápida que para uma
melhor redução da carga orgânica, medida em DQO, as variáveis Temperatura e
Fotoperíodo devem ser operadas em seus níveis altos (30 ºC e 24 h:0 h,
respectivamente), e a variável TempoTubo, em seu nível baixo (5 min).
A ANOVA dos resultados permite dizer, a partir das médias quadráticas dos fatores,
que o fator Temperatura foi o mais significante, e a variável TempoTubo, a menos. Ao
utilizar-se da variável TempoTubo como sendo fonte dos erros, i.e., atribuindo os seus
graus de liberdade e média quadrática como fonte de erro a fim de cálculo da
estatística F, vem, pela ANOVA ilustrada pela tabela 4.5.
Tabela 4.6: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução de DQO
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0625 3,1888
Fotoperíodo 1 0,0484 2,4694
TempoTubo (Erro) 1 0,0196 *
Total 3
4.4.2. Análise da redução do Carbono Orgânico Total (TOC)
Os resultados dos experimentos 1 a 4 estão mostrados na tabela 4.6. O grau de
redução está relacionado com o TOC da amostra em branco (i.e. lixiviado diluído). O
valor inicial de TOC encontrado foi de 92,7 mg/L para o lixiviado diluído. A figura 4.10
apresenta os resultados qualitativos sobre a redução do teor de TOC. A tabela 4.8
apresenta a análise quantitativa sobre a ANOVA dos efeitos dos fatores na redução
de TOC.
48
Tabela 4.7: Resultados de teor de redução de TOC do lixiviado
Exp. TOC Final (mg/L) % redução
1 75,8 0,18
2 61,6 0,34
3 58,7 0,37
4 36,8 0,60
21
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
21
21
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
Temperatura
Mé
dia
da
s m
éd
ias
Fotoperíodo
TempoTubo
Plot dos efeitos principais sobre a redução de TOCMédias dos dados
Figura 4.10: Plot dos efeitos principais sobre a redução de TOC
Tabela 4.8: ANOVA dos fatores em relação à redução de TOC
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0511 *
Fotoperíodo 1 0,0379 *
TempoTubo 1 0,0017 *
Erro residual 0 * *
Total 3
A análise qualitativa dos resultados para redução de carga orgânica, medida em TOC,
indica que as variáveis Temperatura e Fotoperíodo devem ser operadas em nível alto
(30 ºC e 24 h:0 h, respectivamente) e a variável TempoTubo, em nível baixo (5 min).
49
A ANOVA permite concluir que a Temperatura foi o fator mais significativo e
TempoTubo, o menor. Rearranjando a ANOVA da tabela 4.8 de modo a utilizar os
graus de liberdade e sua média quadrática para cálculo da estatística F dos fatores
mais significativos (Temperatura e Fotoperíodo), vem os resultados da tabela 4.9.
Tabela 4.9. ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução de TOC
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0511 29,609
Fotoperíodo 1 0,0379 21,979
TempoTubo (Erro) 1 0,0017 *
Total 3
Analisando-se os resultados obtidos para a redução da carga orgânica, medidos em
DQO e TOC, é interessante notar que ambos os resultados apresentam uma
correlação estatística. Embora o teor de redução de DQO tenha sido maior do que o
teor de redução de TOC, faz-se vista aos fatores Temperatura e Fotoperíodo em
ambas análises como de primeiro e segundo lugar quanto à significância estatística.
Ainda mais, ambos os fatores apresentam melhores resultados, i.e., maiores taxas de
redução quando operados em nível similares (altos, nos dois casos).
Uma provável conclusão para isso é que, embora o experimento 4 não tenha sido
aquele com maior número final de células, a temperatura e o fotoperíodo nele
presentes foram capazes de fazer as células assimilarem com maior rapidez os
compostos orgânicos presentes no lixiviado.
Isso pode levar a indicar que o metabolismo da espécie Chlorella sp., nas condições
estudadas, seja mixotrófico, visto que, o maior fotoperíodo fora capaz de induzir uma
maior redução da carga orgânica, partindo do pressuposto que a redução da carga
orgânica seja decorrida do metabolismo microalgal. É difícil dizer, mas uma provável
razão para que o experimento 4 não tenha sido aquele com número final de células
superior ao de todos, é que, embora o consumo da carga orgânica tenha sido maior
neste experimento, o consumo de toxinas e compostos de natureza inibitória ao
crescimento provavelmente também foi maior; o que pode ter levado à uma limitação
no crescimento celular.
50
O experimento 3 apresentou fotoperíodo de 12 h:12 h. É sabido da bioquímica que a
fase escura do crescimento fotoautrotófico é responsável por uma reprodução celular
desacelerada, quando comparada à da fase clara (LEHNINGER, 1990). Como a
variável relacionada ao tempo de residência médio no tubo de iluminação apresentou
significância estatística inferior ao dos outros fatores analisados, faz-se indiferente à
comparação dos resultados obtidos entre os experimentos 3 e 4 (aqueles com
temperatura a 30 ºC, nível alto) quanto à variável TempoTubo; deixando como fator
crítico à redução da carga orgânica o fotoperíodo (fator diferenciador entre os
experimentos 3 e 4). Embora o experimento 3 apresentou uma contagem celular
superior ao do experimento 4, a redução da carga orgânica foi bem inferior ao do
experimento 4. Logo, esta constatação pode servir de base para futuros testes quanto
à significância do fotoperíodo no tratamento de lixiviado em regime mixotrófico.
Cheung et al (1993) discutiram a natureza microalgal i.e., marinha ou de água doce,
na eficácia do crescimento celular no lixiviado. De acordo com os autores, as espécies
marinhas apresentam maiores chances de desenvolvimento, já que a alta salinidade
dos seus habitats ser um fator significativo na adaptação celular a ambientes não
favoráveis, como o lixiviado. A microalga Chlorella sp. utilizada no projeto é de
natureza marinha, e isso, aliado a outros fatores, como o design do reator e as
condições metabólicas, pode ter garantido um crescimento celular significativo e
redução relevante da carga orgânica e da turbidez do efluente.
4.5. Análise de redução do teor de metais
Os metais que apresentaram concentrações mensuráveis foram: Ag, B, Cd, Cu, Fe e
Pb. Já havia sido reportado na literatura a capacidade da Chlorella sp. em sorver
alguns metais na sua estrutura celular (REIS et al, 2014).
Na amostra de lixiviado diluído, utilizado nos experimentos, foram encontradas as
concentrações de metais apresentadas na tabela 4.10.
51
Tabela 4.10: Concentrações de metais do meio de lixiviado
Metal Branco (ppm)
Ag 0,025
B 3,380
Cd 0,110
Cu 0,870
Fe 19,615
Pb 0,280
As concentrações finais de Cu e Pb sofreram diminuição baixa o suficiente para não
serem significativas (de 0,870 ppm para 0,860 ppm para o Cu e de 0,280 ppm para
0,270 ppm para o Pb). A concentração de ferro, em todos os experimentos foi a
valores próximos de 0; não sendo possível também a análise estatística para seu
comportamento. O ferro é um dos constituintes do meio Guillard f/2, utilizado na
manutenção da cepa; podendo esta ser a razão do decréscimo significativo nos
experimentos.
A tabela 4.11 apresenta os valores finais das concentrações, com seus respectivos
teores de redução na concentração relativos ao Boro e à Prata.
Tabela 4.11: Resultados quanto à redução da concentração de Boro e Prata
Exp. Ag final (ppm) Teor de redução de Ag B final (ppm) Teor de redução de B
1 0,02 0,12 0,40 0,88
2 0,02 0,08 0,45 0,87
3 0,02 0,20 0,31 0,91
4 0,02 0,20 0,06 0,98
A análise estatística quanto à redução da concentração de prata gera a figura 4.11 e
a tabela 4.12.
52
21
0,200
0,175
0,150
0,125
0,100
21
21
0,200
0,175
0,150
0,125
0,100
TemperaturaM
éd
ia d
as
mé
dia
sFotoperíodo
TempoTubo
Plot dos efeitos principais para a redução da concentração de PrataMédias dos dados
Figura 4.11: Plot dos efeitos principais para a redução da concentração de Prata
Tabela 4.12: ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de Prata
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,01 *
Fotoperíodo 1 0,0004 *
TempoTubo 1 0,0004 *
Erro residual 0 * *
Total 3
A partir da ANOVA, vê-se que ambos os fatores Fotoperíodo e TempoTubo
apresentam as menores somas quadráticas; restando somente o fator Temperatura
com uma significância maior.
Ao utilizar-se qualquer um dos dois fatores (Fotoperíodo ou TempoTubo) como fonte
de erros, atribuindo seus graus de liberdade e médias quadráticas ao erro residual,
vem a tabela 4.13
Tabela 4.13: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de Prata
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,01 25
Fotoperíodo (Erro) 1 0,0004 *
TempoTubo (Erro) 1 0,0004 *
Total 3
53
Quanto à redução da concentração de Boro, vem a figura 4.12.
21
0,94
0,92
0,90
0,88
21
21
0,94
0,92
0,90
0,88
Temperatura
Mé
dia
da
s m
éd
ias
Fotoperíodo
TempoTubo
Plot dos efeitos principais sobre a redução do teor de BoroMédias dos dados
Figura 4.12: Plot dos efeitos principais para a redução da concentração de Boro
Cuja respectiva ANOVA é apresentada pela tabela 4.14.
Tabela 4.14. ANOVA dos fatores em relação à redução do teor de Boro
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0049 *
Fotoperíodo 1 0,0009 *
TempoTubo 1 0,0016 *
Erro residual 0 * *
Total 3
A partir da ANOVA, vê-se que a variável Fotoperíodo apresenta a menor média
quadrática. Consequentemente, ao atribuir-se os valores de graus de liberdade e
média quadrática do fator Fotoperíodo à fonte de erros residuais, obtém-se a nova
análise, apresentada na tabela 4.15.
Tabela 4.15: ANOVA adaptada dos fatores em relação à redução do teor de Boro
Fonte de erro GL SQ F
Temperatura 1 0,0049 5,4444
Fotoperíodo (Erro) 1 0,0009 *
TempoTubo 1 0,0016 3,0625
Total 3
54
Consequentemente, vê-se que a variável temperatura é a de maior significância na
redução dos teores de prata e de boro. Pode-se dizer, pela análise qualitativa, que os
níveis operacionais para maiores reduções de teores de ambos os metais é a
Temperatura em nível alto (30 ºC) e o tempo médio de residência no tubo de
iluminação, TempoTubo, no nível baixo (5 min). É permitido dizer isto, embora a
primeira vista a análise qualitativa se mostre contraditória quanto ao fator fotoperíodo
(visualizado nas figuras 15 e 16), porque o fotoperíodo se mostrou de baixa
significância; logo, a partir dos resultados analisados, e nas condições estudadas, o
fotoperíodo pouco influenciou a redução do teor de boro e prata.
É interessante ver que a redução de boro atingiu valores altos (maiores ou iguais a
87% nos quatro experimentos). Os experimentos não permitiram dizer se o metal fora
utilizado como nutriente ou fora sorvido na estrutura de parede das células. A prata
apresentou teores de redução menores, mas no entanto, significativos. Caso a prata
esteja sofrendo adsorção na parede celular, provavelmente uma concentração celular
maior, aliada a um fator temperatura adequado, proveria melhores resultados. Esses
fatores são decorridos da escolha da cepa utilizada no estudo, visto que as interações
célula-meio são específicas para cada metal (REIS et al, 2014).
55
5. CONCLUSÃO
O presente projeto foi capaz de abrir novas oportunidades de pesquisa para o
laboratório de engenharia de microalgas, coordenado pelo prof. Messias B. Silva, vista
a vasta gama de possibilidades de operação do biorreator, como estudos de operação
em forma contínua e fed-batch, estudos paramétricos para otimização do reator,
oportunidades de instrumentação, estudos de modelagem, etc.
O design do reator foi um ponto crítico para o sucesso dos experimentos, já que,
provavelmente, grande parte do tratamento do lixiviado, tal qual o crescimento celular,
seja devido à alta taxa de irradiação luminosa proveniente na parte de tubo iluminado
do reator. Como o lixiviado apresenta uma alta turbidez e cor naturalmente escura, o
tratamento microbiológico aeróbico com regimes mixotróficos em ambientes que não
favoreçam a penetração da luz não se faz muito eficiente. Portanto, a proposta de
construir-se um reator para um pré-tratamento do lixiviado, além de acumulação de
biomassa celular, se fez eficiente e abriu possibilidades de diversos projetos de
pesquisa no campo, atingindo-se resultados de remoção de TOC em 60%, de DQO
em 68%, turbidez em 98%, a totalidade de ferro e 98% de teor de boro.
Além de todos os pontos acima, é importante frisar que o preço total de construção do
reator foi inferior à R$ 1000,00. O baixo custo e a fácil operação são fatores que
podem levar o interesse de novos desenvolvimentos na área.
56
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