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Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Caracterização química e estabilidade oxidativa de produto
reestruturado de frango sob a ação de embalagem ativa adicionada
de extratos de resíduos agroindustriais
Juan Sebastian Serrano León
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos
Piracicaba
2015
2
Juan Sebastian Serrano León Químico de Alimentos
Caracterização química e estabilidade oxidativa de produto reestruturado de
frango sob a ação de embalagem ativa adicionada de extratos de resíduos
agroindustriais
versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011
Orientadora: Prof
a. Dra. CARMEN JOSEFINA CONTRERAS CASTILLO
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos
Piracicaba
2015
3
A os meus queridos pais,
A minha avó, minha tia
e toda minha família e amigos
DEDICO
4
5
AGRADECIMENTO
A meus pais pelo infinito carinho e apoio incondicional.
A minha avó e minha tia pelo grande carinho e ilusão.
A “Secretaria Nacional de Educación Superior Ciencia Tecnología e Innovación”
(SENESCYT) e ao governo Equatoriano, pelo financiamento, e apoio económico que
facilitaram o desenvolvimento do meu mestrado.
A Prof.a Dra. Carmen Contreras Castillo, pela ajuda e cordialidade prestada desde o
primeiro e-mail de contato até a culminação deste mestrado, além da grande
oportunidade, conhecimentos, ajuda, paciência e amizade adquiridos neste
processo.
A Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz e a Universidade de São Paulo,
pela oportunidade de fazer parte da minha formação, é um orgulho poder ter sido
parte desse seleto grupo de pessoas formadas nesta prestigiosa instituição.
A Prof.a Dra. Kity Yoshida, pela toda a ajuda no desenvolvimento dos filmes ativos e
pela amabilidade, amizade, e conhecimentos prestados desde o dia que tive o
prazer de conhecê-la.
A Prof.a Dra. Sonia, pela grande ajuda com as análises estatísticas.
A os professores Drs. Severino, Cristiana, Solange, Ana e Natalia, pela ajuda com a
rápida correção da minha dissertação.
A o Erick Saldaña pela sua grande ajuda dentro desta pesquisa, além da parceria,
amizade e solidariedade durante esta etapa no Brasil.
A Miriam Selani, pela todas as dicas e ajuda durante o projeto todo, além de ser uma
grande amiga e profissional.
A Kathelyn Araújo pela sua grande amizade, companhia, e por ser minha mestre de
língua portuguesa e por fazer me sentir como em casa.
A Bia, pela grande ajuda prestada com as análises além da sua amizade.
A Bruna, Dario, Melina, pela ajuda durante as análises, processamentos e pela sua
amizade.
A o resto do pessoal do Laboratório de Processamento e Qualidade de Carne,
Mariana, Caio, Clara, Jair, Marcio, pela ajuda e parceria prestada durante este
mestrado.
Ao Vitor, Miriam, Jader, Mario, Andreia pela sua ajuda na correção do português e
pela sua amizade.
6
A os amigos e amigas, Kathy, Maris, Bia, Mima, Bruna, Balue, Daniel, Erick pelas
tantas alegrias e grandes momentos que compartilhamos juntos, que fizeram deste
desafio uma experiência inesquecível.
A o Fabio e Ana Paula pela ajuda prestada além da sempre amabilidade e amizade.
A os funcionários e todos que fizeram e fazem parte do Departamento de
Agroindústria, Alimentos e Nutrição pela ajuda prestada.
A os meus amigos sempre lembrados no Equador, pelo apoio e carinho
incondicional.
E em fim a todos aqueles que fizeram parte desse desafio acadêmico, e experiência
única, que lembrarei pelo resto da minha vida.
Por tudo isso e por muito mais, meu mais profundo agradecimento.
7
“Todo lo que hagas en la vida será insignificante,
pero es muy importante que lo hagas,
porque nadie más lo hará.”
M. Gandhi.
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SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................... 13
ABSTRACT ............................................................................................................... 15
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 21
2.1 Carne de frango e sua composição ....................................................................... 21
2.2 Oxidação Lipídica ..................................................................................................... 22
2.3 Oxidação lipídica em carne ..................................................................................... 25
2.4 Produtos e efeitos da oxidação lipídica em carne ................................................ 26
2.5 Fatores que favorecem a oxidação lipídica em carne .......................................... 27
2.5.1 Composição da gordura ............................................................................ 27
2.5.2 Oxidação lipídica induzida por luz ............................................................. 27
2.5.3 Oxigênio .................................................................................................... 28
2.5.4 Temperatura ............................................................................................. 28
2.6 Antioxidantes ............................................................................................................ 29
2.7 Mecanismo de reação dos antioxidantes .............................................................. 30
2.8 Antioxidantes sintéticos aplicados em carnes ....................................................... 31
2.9 Antioxidantes naturais aplicados em carnes ......................................................... 33
2.10 Embalagem ativa ..................................................................................................... 36
2.11 Quitosana .................................................................................................................. 38
2.12 Resíduos Agroindustriais ........................................................................................ 39
2.12.1 Película de amendoim ......................................................................................... 41
2.12.2 Pimenta Rosa ....................................................................................................... 41
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 43
3.1 Obtenção dos extratos de resíduos agroindustriais de pimenta rosa e película
de amendoim ..................................................................................................................... 43
3.2 Determinação de compostos fenólicos totais. ....................................................... 44
3.3 Preparo da embalagem antioxidante: filmes ativos de quitosana ....................... 44
3.3.1 Caracterização das embalagens antioxidante (filmes ativos de quitosana) .... 45
3.3.2 Espessura ....................................................................................................... 45
3.3.3 Teor de umidade no filme ................................................................................ 46
3.3.4 Taxa de permeabilidade .................................................................................. 46
3.3.5 Solubilidade ..................................................................................................... 46
3.3.6 Propriedades mecânicas ....................................................................................... 47
10
3.4 Avaliações nas amostras de produto de frango reestruturado ............................ 47
3.5 Determinações da concentração ótima de extrato antioxidante de película de
amendoim e pimenta rosa nas embalagens bioativas e aplicação no produto
cárneo ................................................................................................................................. 49
3.5.1 Preparo das amostras (Primeira Etapa) ................................................................ 49
3.5.2 Delineamento experimental .................................................................................... 49
3.6 Avaliação dos efeitos físico-químicos e microbiológicos com adição de extratos
diretamente na massa do produto cárneo e no filme ativo ........................................... 50
3.6.1 Preparo das amostras (Segunda Etapa) ............................................................... 51
3.7 Análise dos experimentos ....................................................................................... 52
3.8 Composição centesimal .......................................................................................... 52
3.9 Cor instrumental ....................................................................................................... 53
3.10 Avaliação do pH ....................................................................................................... 53
3.11 Determinação da oxidação lipídica (TBARS) ........................................................ 53
3.12 Índice de peróxido .................................................................................................... 54
3.13 Análises Microbiológicas ......................................................................................... 55
3.14 Análise sensorial baseado na resposta dos consumidores (Terceira Etapa) .... 56
3.14.1 Preparo das amostras ................................................................................... 56
3.14.2 Teste de aceitação e caracterização sensorial com consumidores .............. 57
3.14.3 Análise de dados sensoriais ......................................................................... 57
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 59
4.1 Teor de compostos fenólicos totais ........................................................................ 59
4.2 Otimização da quantidade de antioxidante adicionada ao filme ativo de
quitosana para retardar oxidação lipídica ....................................................................... 60
4.3 Caracterização dos filmes ativos de quitosana com extrato antioxidante .......... 70
4.4 Composição Centesimal .......................................................................................... 73
4.5 Avaliação do pH ....................................................................................................... 74
4.6 Cor instrumental ....................................................................................................... 75
4.7 Determinação da oxidação lipídica ........................................................................ 77
4.8 Avaliação microbiológica ......................................................................................... 84
4.9 Avaliação sensorial .................................................................................................. 89
4.9.1 Aceitabilidade geral .................................................................................. 89
4.9.2 Caracterização sensorial utilizando perguntas CATA .............................. 90
5 CONCLUSÕES .................................................................................................... 97
11
RECOMENDAÇÕES ................................................................................................. 99
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 101
ANEXOS .......................................................................................................................... 121
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RESUMO
Caracterização química e estabilidade oxidativa de produto reestruturado de frango sob a ação de embalagem ativa adicionada de extratos de resíduos
agroindustriais
A qualidade, aceitabilidade e a vida útil da carne de frango e principalmente seus produtos industrializados, dependem de vários fatores, sendo a oxidação lipídica um dos principais problemas de estabilidade do produto. O crescimento da tendência de consumo de compostos naturais por parte da população mundial e a demanda das indústrias de alimentos para controle da oxidação lipídica, surge como alternativa muito promissora a utilização de antioxidantes naturais. O Brasil, com uma grande produção de produtos vegetais e a economia fortemente baseada na agroindústria gera grandes quantidades de resíduos vegetais, sendo os resíduos de película de amendoim e pimenta-rosa potenciais fontes de antioxidantes. Estes resultados confirmados conforme ensaios preliminares in vitro, uma vez que são ricos em compostos bioativos, como compostos fenólicos. Além disto, a quitosana apresenta-se como uma boa matriz para incorporação de extratos contendo compostos bioativos, além de ter capacidade de formar filmes. Assim, o objetivo do estudo foi desenvolver filmes de quitosana com incorporação de antioxidantes naturais a partir dos extratos de resíduos de película de amendoim e pimenta rosa, e avaliar seu efeito sobre a oxidação lipídica em produto reestruturado de frango. O estudo foi dividido em três etapas: a primeira foi utilização da metodologia de superfície de resposta para determinação de uma concentração ótima de extrato de resíduo agroindustrial que incorporado ao filme de quitosana promova inibição da oxidação lipídica (valor de sustâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, TBARS). Na segunda etapa, foi avaliada a incorporação da concentração ótima dos extratos diretamente na carne e nos filmes ativos de quitosana, sobre as características físico-químicas (pH, cor instrumental, índice de peróxidos, e valor de TBARS) e microbiológicas dos tratamentos. Na terceira etapa foram avaliadas as características sensoriais e de aceitabilidade dos tratamentos que apresentaram menor oxidação lipídica. Os resultados revelaram que, na primeira etapa foram otimizadas as concentrações dos extratos de resíduos nos filmes ativos de quitosana. Os teores otimizados foram 80 mg de compostos fenólicos totais (CFT) / kg de carne para os resíduos de película de amendoim e de 90 mg CFT / kg de carne para pimenta rosa. Na segunda etapa, ao final do tempo de armazenamento, pode-se observar que não houve diferença significativa (p > 0,05) para os parâmetros de cor, pH e contagem de mesófilos totais. Para oxidação lipídica, todos os tratamentos apresentaram diferença significativa (p < 0,05), quando comparados com o controle. Para contagem de micro-organismos psicrotróficos totais houve diferença significativa para os tratamentos com filme ativo + extratos, quando comparados com os demais tratamentos. Na terceira etapa, os resultados mostraram que não houve diferença significativa na aceitabilidade entre os tratamentos. Adicionalmente também foi realizada uma caracterização sensorial com consumidores usando a metodologia Check-all-that-apply (CATA). Assim pode-se concluir que foram desenvolvidos filmes ativos de quitosana com adição de extratos de resíduos agroindustriais, com exelente potencial na atividade antioxidante e antimicrobiana em produtos carneos, sem influenciar na aceitabilidade sensorial.
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Palavras-chave: Filme ativo; Quitosana; Extrato de película de amendoim; Extrato de pimenta rosa; Oxidação lipídica; Carne de frango
15
ABSTRACT
Chemical and oxidative stability of restructured chicken product stored under active packaging with addition of agro-industrial residues extracts Quality, accessibility, shelf life of chicken meat and mainly of its processed
products depends on several factors, wherein lipid oxidation is a major stability product problem. The growth of the consumption trend of natural compounds by the world's population, and the demand from the food industry to control lipid oxidation appear as a very promising alternative to the use of natural antioxidants. Brazil, with a large production plant products and a strong economy based on agro-industry generates large amounts of crop residues where peanut shells and pink pepper residues are potential sources of antioxidants. According to preliminary in-vitro tests of these residues, these are rich in bioactive substances such as phenolic compounds. Moreover, chitosan presents itself as a good matrix for incorporation of extracts containing bioactive compounds, in addition to having the ability to form films. The aim of this study was to develop chitosan films incorporating natural antioxidants from peanut shells and pink pepper residues extracts, as well as to evaluate their effect on the lipid oxidation of a chicken restructured product. The study was divided into three stages: first was the use of response surface methodology to determine an optimal concentration of agro-industrial waste extract, which was incorporated into the chitosan film to promote inhibition of lipid oxidation (as an amount of reactive substances to thiobarbituric acid, TBARS). The second stage evaluated the incorporation of this optimal concentration of extracts applied directly in both the meat and the chitosan active films, in relation to the physical-chemical (pH parameters, instrumental color, peroxide value, and TBARS value) and microbiological characteristics of the treatments. The third stage evaluated the sensory characteristics and acceptability of treatments that had a lower lipid oxidation. The results revealed that the first stage optimized the concentrations of extracts from residues into the active chitosan films. The optimized concentration was 80 mg of total phenolic content (TPC) / kg of meat for peanut shells residue extract, and 90 TPC mg / kg of meat for the pink pepper extract. On the second stage, at the end of the storage time, it can be seen that there was no significant difference (p > 0.05) in parameters like color, pH and total mesophylls counts. For the lipid oxidation parameters, all treatments showed significant differences (p < 0.05) when compared with the control treatment. The microbial count of total psychrotrophic microorganisms showed significant differences for treatments with active films + residues extracts when compared with the other treatments. In the third stage, the results showed no significant difference in acceptability between treatments. Additionally, a sensory characterization with consumers using the Check-all-that-apply (CATA) methodology was also performed. Thus, it was concluded that the development of active chitosan films incorporated with extracts of agro-industrial waste was possible, which possess an antioxidant and antimicrobial potential activity without altering the sensory acceptability of the final product.
Keywords: Active film; Chitosan; Peanut shells extract; Pink pepper extract; Lipid
oxidation; Chicken meat
16
17
1 INTRODUÇÃO
A carne é considerada um dos alimentos mais importantes na dieta humana
devido ao seu alto valor nutritivo. A carne de frango se destaca pela grande
aceitação do consumidor, e isso ocorre em função do seu sabor agradável, baixo
conteúdo de gordura saturada, maciez e baixo custo, além de ser uma importante
fonte de proteínas ricas em aminoácidos essenciais (CAVA, 2007). A carne de
frango é a segunda mais consumida no mundo e, no Brasil, a avicultura é uma
atividade que tem crescido e ganhado importância nas últimas décadas. Em 2013, o
consumo per capita no Brasil chegou a 45,7 kg/ano (UNIÃO BRASILEIRA DE
AVICULTURA, 2014), sendo que a produção alcançou 12.770 milhões de toneladas,
0,98% a mais que o registrado em 2012. As exportações em 2014 foram de 3,995
milhões de toneladas, representando um crescimento de 2,6% em relação ao ano
anterior (PORTAL DA AVICULTURA, 2015).
No entanto, a carne de frango apresenta alguns problemas de conservação,
sendo a oxidação lipídica um dos principais fatores que afetam a sua qualidade, vida
útil e aceitabilidade pelos consumidores (SELANI et al., 2011). Como consequência
da oxidação lipídica, ocorrem alterações das características sensoriais, qualidade
nutricional, e a segurança do alimento, pela formação de compostos poliméricos
potencialmente tóxicos à saúde humana (SILVA; BORGES; FERREIRA, 1999).
Durante muito tempo, se buscou desenvolver estratégias para evitar a
deterioração oxidativa que acontecem em produtos cárneos. A maior parte dessas
estratégias tem como objetivo limitar a entrada do oxigênio aos componentes da
carne que são susceptíveis aos processos de oxidação como lipídeos e proteínas.
Paralelamente, vem se desenvolvendo técnicas e metodologias de armazenamento
dos produtos cárneos, como embalagem a vácuo e atmosfera modificada, com a
finalidade de evitar fenômenos de oxidação no produto final (PETTERSEN et al.,
2004; LUND et al., 2011). Uma das maneiras de prevenir a oxidação na carne ou
produto cárneo é o uso de antioxidantes.
Neste contexto, para prevenir ou retardar a oxidação lipídica, a indústria de
produtos cárneos tem utilizado aditivos sintéticos com propriedades antioxidantes
(RAMALHO; JORGE, 2006). Entretanto, o uso destes tem despertado preocupação
quanto às suas doses de segurança e toxicidade, devido às pesquisas que indicam
possíveis riscos à saúde relacionados ao seu consumo quando utilizados em
grandes quantidades (NANTITANON et al., 2010). Atualmente, tem aumentado o
18
interesse por antioxidantes naturais de extratos vegetais, aliado a proibição de
antioxidantes sintéticos em alimentos pela comunidade europeia. Os antioxidantes
sintéticos mais utilizados pela indústria de alimentos têm despertado preocupação
quanto às doses de segurança e toxicidade, pois podem estar envolvidos com
muitos riscos à saúde quando utilizados em grandes quantidades, (BARREIROS;
DAVID, 2006; MOHDALY et al., 2010; BREWER, 2011). Extratos de frutas, vegetais,
cereais, sementes e seus resíduos, são ricos em antioxidantes naturais como o
ácido ascórbico, tocoferóis, carotenoides e em compostos fenólicos (WOLFE; WU;
LIU, 2003; MANACH et al., 2005) que podem ser utilizados como fonte de
antioxidantes naturais.
Nos últimos anos novas tecnologias de embalagem estão sendo desenvolvidas
para melhorar a preservação, qualidade e segurança dos produtos alimentícios,
dentre destas estão às embalagens ativas. Muitos estudos têm sido publicados
sobre o desenvolvimento destas embalagens, principalmente para aplicação em
alimentos (MANSO et al., 2013), por meio da aplicação de filmes antimicrobianos
(OUATTARA et al., 2000; CAGRI et al., 2001) e filmes antioxidantes (BOLUMAR et
al., 2011), as quais têm mostrado bons resultados. Segundo Kannat et al. (2012), a
embalagem ativa é uma tecnologia promissora na área de alimentos visando o
aumento de vida de prateleira, com destaque na área de carnes.
As elevadas taxas de produção de resíduos agroindustriais gerados a partir de
vegetais e a importância dos antioxidantes naturais para o controle da oxidação
lipídica em alimentos e para saúde da população, torna-se importante estudos nesta
área. Assim, a incorporação de extratos obtidos de resíduos agroindustriais de
amendoim, pimenta-rosa em embalagens ativas para retardar a oxidação lipídica de
produto reestruturado de frango, pode fornecer subsídios para aplicação e
substituição de aditivos sintéticos na indústria de alimentos.
Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram:
Desenvolver e caracterizar as embalagens ativas pela a incorporação de
extratos de resíduos agroindustriais brasileiros em filmes de quitosana.
Determinar uma concentração ótima de extratos de película de
amendoim e pimenta rosa no filme ativo a ser aplicado sobre o produto
reestruturado de frango para diminuir a oxidação lipídica.
Avaliar química, física e microbiológicamente a carne de frango crua
com aplicação dos extratos de película de amendoim, pimenta rosa
19
incorporada na massa cárnea e no filme ativo de quitosana como
revestimento.
Caracterizar sensorialmente e hedônicamente os tratamentos que
apresentem menor oxidação lipídica.
20
21
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Carne de frango e sua composição
A carne de frango é umas das carnes mais consumidas no mundo. O alto
rendimento de crescimento do frango e o custo relativamente barato da carne
aumentou seu consumo mundial. O Brasil é o terceiro maior produtor de carne de
frango no mundo, e no ano de 2013 chegou a uma produção de 26 bilhões de
toneladas de carne de frango (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF
THE UNITED NATIONS, 2015). Em 2013, o consumo per capita no Brasil chegou a
45,7 kg/ano (UNIÃO BRASILEIRA DE AVICULTURA, 2014), sendo que a produção
no mesmo ano alcançou 12.770 milhões de toneladas, 0,98% a mais que o
registrado em 2012. As exportações em 2014 foram de 3,995 milhões de toneladas,
representando crescimento de 2,6% em relação ao ano anterior (PORTAL DA
AVICULTURA, 2015).
A carne encontra-se constituída por fibras musculares que estão agrupadas
pelo tecido conectivo, através do qual passam vasos sanguíneos e nervos. As fibras
musculares estão recobertas por proteína solúvel em água e outros compostos
nitrogenados além de sais minerais. A porção comestível da carne é composta,
principalmente, pelas proteínas actina e miosina com pequenas porções de
colágeno, elastina e reticulina (KIRK; SAWYER; EGAN,1996).
A composição básica da carne varia muito entre os diferentes tipos de corte,
assim como também dependendo da raça, tipo de alimentação e idade do animal. A
carne de frango sem pele e colágeno possui em média 74 a 78 % de água, 19 a 24
% de proteína e de 1 a 5 % de gordura, dependendo do corte (KIRK; SAWYER;
EGAN,1996). Em termos gerais, a gordura deste tipo de carne possui maior
quantidade de ácidos graxos insaturados (10-15% do total de ácidos graxos), que as
carnes bovinas e caprinas, além de uma notável presença de ácidos graxos poli
insaturados. O ácido linoleico (18:2) é ácido graxo predominante, seguido do alfa
acido linoleico (VALSTA; TAPANAINEN; MANNISTO, 2005). Outros ácidos graxos
como o ácido mirístico (14:0), ácido palmítico (16:0), ácido cis palmitoleico (16:1),
ácido linoleico (18:1), ácido oleico (18:0) ácido linolênico (18:3), ácido araquidônico
(20:4), também podem ser encontrados na carne de frango (WOOD et al., 2002;
ENSER, 1996). Estudos demonstraram que a composição de ácidos graxos da
gordura presente em coxas e sobrecoxa de frango são aproximadamente de 18:1 n-
22
9 (35,2%) 18:1 n- 7 (4,8%), 18:2 n-6 (12,4%), 20:4 n-6 (2,2%), 18:3 n-3 (0,7%), 20:5
n-3 (0,3%), 22:5 n-3 (0,4%) e 22:6 n-3 (0,4%) (KARTIKASARI et al.2012).
2.2 Oxidação Lipídica
As gorduras dos alimentos se encontram principalmente formadas por
triacilglicerois e em menores quantidades de di e monoacilglicerois, fosfolipídios,
ácidos graxos livres entre outros materiais gordurosos não insaponificáveis. A
oxidação lipídica é a principal reação de deterioração da gordura contida em um
alimento. Este processo se caracteriza pela autooxidação dos ácidos graxos que se
encontram dentro dos alimentos, enquanto maior quantidade de ácidos graxos
insaturados tem a gordura o nível de rancidez será mais elevado.
Sensorialmente a decomposição da gordura de um alimento ocasiona “off-
flavor” que é o odor desagradável de ranço, característico de gordura oxidada, típico
de alimentos ricos em ácidos graxos insaturados (HAMILTON, 1994). A oxidação
lipídica gera uma perda de qualidade nutricional e sensorial do alimento como cor,
sabor, odor, perda de vitaminas e segurança alimentar do produto (SHAHIDI;
JANITHA; WANANSUDARA, 1992).
Quando o oxigênio que se encontra na atmosfera ou se encontra dissolvido
no produto entra em contato com o sítio mais reativo de uma molécula triglicerídea,
dá-se o início da reação de oxidação lipídica. Quimicamente, os sítios mais reativos,
são os carbonos alfa que encontram-se do lado de uma dupla ligação (REGITANO-
D’ARCE, 2006). A reação de autooxidação é uma reação em cadeia gerada pelos
radicais livres formados a partir da oxidação de um ácido graxo insaturado.
A oxidação lipídica é iniciada pelo radical hidroxila que capta um hidrogênio
do grupo metileno adjacente das duplas ligações em um ácido graxo (Figura 1). O
ácido graxo pode fazer parte de um triglicerídeo, ou de um fosfolipídio ou
esterificado a um grupo –OH do colesterol numa lipoproteína. Esse processo origina
a um radical lipídico instável, no qual sofre um reordenamento de duplas ligações e
mais a adição do oxigênio molecular forma o radical peroxil. O radical peroxil pode
reagir com o grupo acila do ácido graxo vizinho e assim começa uma reação em
cadeia, dando início ao processo de peroxidação. A reação em cadeia poderia
terminar eventualmente devido a formação de um hidroperóxido lipídico. (JAIRAM;
UCHIDA; NARAYANASWAMI, 2012).
23
Figura 1 - Peroxidação lipídica. O processo pode ser dividido em três etapas: iniciação, propagação e terminação; São apresentados os segmentos com as duplas ligações. Sendo:
RH = ácido graxo R. = radical de ácido graxo ROO. = radical peróxido ROOH = hidroperóxido Fonte: Adaptado de JAIRAM, I UCHIDA NARAYANASWAMI (2012)
A primeira etapa da oxidação lipídica, denominada iniciação, pode ter início
pela presença de compostos e radicais endógenos (H2O2, ROOH e radicais -O2,
ROO-, -OH), ou exógenos (NOx, SO3-,). Assim também pelo efeito de luz UV,
radiação, íons metálicos e temperatura (SIMIC et al., 1992), a iniciação que é
caracterizada pela captação de um átomo de hidrogênio do grupo carbonila mais
próximo da dupla ligação causado por alguns desses compostos e fatores. Segundo
Schafer e Buettner (2000) outro fator importante que pode melhorar as reações de
oxidação lipídica é a redução do pH na presença de ferro, já que é um catalisador
desta reação aumentando sua solubilidade nas células. Os íons metálicos
(especialmente de metais polivalentes) apresentam características catalíticas a
través de reações de oxidação ou redução de hidroperóxidos (Figura 2) (WATERS,
1971).
24
Figura 2 - Reações de oxidação (a) e redução (b) catalítica dos hidroperóxido por efeito do ferro (2
+,3
+).
Fonte: Adaptado de El Baky e El-Baroty (2013)
A segunda etapa de oxidação lipídica é a chamada de propagação que
geralmente começa quando um oxigênio molecular é adicionado a um radical livre
R· para formar o radical livre ROO·, logo esse radical (ROO·), subtrai um hidrogênio
a partir de um RH, para formar um ROOH e um novo radical (RO·), este processo é
o que limita a velocidade da etapa de propagação (PORTER; CALDWELL; MILLS,
1995).
Os passos da etapa de propagação em cadeia de radicais livres são mais
complexos que processos de transferência e adição de elementos, pois incluem
acoplamento de radicais com o oxigênio (Figura 3a), transferência de átomo ou
grupo funcional (3b), a fragmentação (3c), o rearranjo (3d), ou ciclização (3e)
(HOWARD, 1973).
Figura 3 - Reações de propagação na auto-oxidação de lipídeos Fonte: Adaptado de Porter, Caldwell, Mills, (1995)
A etapa de término da oxidação lipídica inicia-se com o esgotamento dos
substratos. Para isto, as reações de propagação terminam e começa a formação de
produtos finais mais estáveis. As reações de radicas terminam quando dois radicais
reagem formando um composto não radical. Os radicais dos hidroperóxidos (RO2•)
25
podem reagir ainda com outros radicais de hidroperóxidos (reação a, Figura 4),
como outros radicas livres alquila (R•) (reação b, Figura 4), ou sofrer reações de
polimerização, reações químicas características da etapa de término da oxidação
lipídica, (KUBOW, 1992). Esses hidroperóxidos produtos do término da oxidação
lipídica sofrem rupturas e decomposição, para gerar compostos menores como
álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres e outros hidrocarbonetos, produtos de elevado
peso molecular resultantes de reações de dimerização (principalmente) e
polimerização (reação c, Figura 4), (ESTERBAUER, 1993).
Figura 4 - Reações da fase da terminação da oxidação lipídica Fonte: C. FERRARI, 1998
2.3 Oxidação lipídica em carne
A oxidação lipídica é um dos problemas mais comuns em carne uma vez que
gera perda de propriedades sensoriais e mudanças bioquímicas por influência da
luz, oxigênio, temperatura, fatores tecnológicos (moagem, cocção, adição de sais,
etc.) e micro-organismos. A deterioração da carne é principalmente produzida pela
oxidação de lipídios polinsaturados das membranas celulares, que também causam
oxidação dos pigmentos proteicos da carne produzindo mudanças na cor
(ANDERSEN et al. 2003).
A carne bovina é a carne que possui a gordura mais saturada, pois sua
composição conta com 50 % de ácidos graxos saturados, o que a faz uma carne que
demora mais para oxidar, enquanto a carne suína e a de frango possuem mais de
60% de ácidos graxos insaturados, que as tornam mais susceptíveis à oxidação
lipídica (YÚFERA, 1998a, b). A oxidação lipídica em carne em geral, gera alterações
como: perda por gotejamento, descoloração, começo de odores e sabores estranhos
(off odour e off flavour), e produção de compostos tóxicos (MORRISSEY et al., 1994;
GRAY et al., 1996).
A oxidação lipídica na carne começa desde as primeiras etapas de obtenção,
desde o pré-abate, pôs-abate, e processamento. As mudanças bioquímicas durante
26
o pré-abate e pós-abate vão depender de alguns fatores, tais como a idade, espécie,
condições do abate e estresse do animal na etapa de pré-abate e eventos como pH
da carcaça, temperatura, encurtamento pelo frio das fibras musculares e técnicas
aplicadas de amaciamento, como a estimulação elétrica que podem submeter a
modificações na oxidação lipídica na etapa pós-abate. (BUCKLEY; MORRISSEY;
GRAY, 1995).
Segundo Morrissey (1998), na etapa pôs-abate no processo de conversão de
músculo em carne é o momento em que começa a deterioração lipídica. Reações
típicas da etapa post-mortem que favorecem o início da oxidação lipídica tais como:
parada da circulação de sangue e nutrientes, início de metabolismo anaeróbico,
queda do pH, interrupção do sistema antioxidante preventivo enzimático, onde o
retículo endoplasmático libera o cálcio, proteinases dependentes do cálcio começam
a degradação proteica, ferro quelante de peso molecular baixo é liberado, dando
inicio as reações de oxidação lipídica nas membranas celulares.
Diferentes estudos têm demonstrado que a quantidade de iões metálicos, tais
como os compostos de ferro heme, cobre, zinco, metais pesados que estejam
presentes nas enzimas e metaloproteínas ou aqueles que têm migrado a partir das
máquinas de processamento, seja por abrasão ou devido ao ácido ou dissolução de
metais poderiam promover um aumento na taxa de velocidade de oxidação na
carne, acelerando o processo de deterioração (JACOBSEN et al., 2008).
Além dos processos bioquímicos típicos, qualquer tipo de processamento
mecânico, como desossa, moagem, cocção, podem alterar as estabilidade das
membranas musculares da carne, facilitando interações pró-oxidantes dos ácidos
graxos insaturados e favorecendo os processos oxidativos (OLIVO, 2006).
2.4 Produtos e efeitos da oxidação lipídica em carne
Produtos da oxidação lipídica também têm sido associados com a
fisiopatologia de algumas doenças, incluindo aterosclerose, e diabetes (OLKKONEN;
LEHTO, 2004; JAVITT, 2008).
Um dos compostos que é determinante para avaliar estado oxidativo de uma
amostra, é o malonaldeído, que é um dialdeído de três carbonos. Este composto é
um dos aldeídos junto com o hexanal, pentanal, 4 hidroxinonenal que são produtos
da quebra dos hidroperóxidos resultantes da oxidação lipídica. A quantificação do
27
malonaldeído é relevante para produtos cárneos, principalmente nos que incluam
processos de moagem, mistura e cocção, pois favorecem a formação deste
composto, sendo um teste fundamental para avaliação da qualidade do produto final
(OSAWA; FELICIO; GONÇALVES, 2005).
2.5 Fatores que favorecem a oxidação lipídica em carne
2.5.1 Composição da gordura
A composição química da gordura do produto ou matéria prima de uma
determinada amostra afeta diretamente a velocidade de oxidação lipídica. Fatores
como a quantidade de ácidos graxos insaturados e, número de insaturações por
ácido graxo, são variáveis que afetam diretamente a oxidação lipídica. Existem
outras variáveis que afetam esse processo, tais como a posição da dupla ligação,
que influencia o processo de absorção de oxigênio, isômeros cis, que são mais
susceptíveis à oxidação, bem como os ácidos graxos na posição beta do
triglicerídeo, que estão mais protegidos contra oxidação lipídica (REGITANO-
D’ARCE, 2006).
2.5.2 Oxidação lipídica induzida por luz
A luz é um dos fatores que podem favorecer a velocidade de reação da
oxidação lipídica. A luz ultravioleta é uma das mais prejudicais para estabilidade
oxidativa, atuando e catalisando as reações dos ácidos graxos insaturados auto-
oxidados. A luz UV acelera a quebra dos hidroperóxidos, liberando, radicais livres,
que continuam a reação em cadeia de peroxidação. A luz do espectro visível possui
forma similar de atuação, porém existe a necessidade de compostos fotoquímicos
pró-oxidantes, tal como a clorofila, para acelerar a quebra dos hidroperóxidos
(REGITANO-D’ARCE, 2006).
A luz também pode produzir um efeito de foto-oxidação, o qual não atua
diretamente nos ácidos graxos, e sim no oxigênio presente na amostra. A luz tem a
capacidade de converter a configuração eletrônica do oxigênio molecular ao seu
estado fundamental. Em outras palavras, a absorção de energia proveniente da luz
transforma a estrutura em um oxigênio triplete (3O2), a um estado mais reativo de
oxigênio singlete 1O2. Nessa configuração, o oxigênio atua sobre os lipídios da
amostra, gerando outros oxigênios em estado singlete, como aqueles que possuem
os hidroperóxidos (BELITZ; GROSCH, 1999).
28
2.5.3 Oxigênio
O oxigênio é o elemento fundamental no processo de oxidação lipídica. Sua
presença pode estar ligada ao emprego de embalagens, como à vácuo, sachês
absorvedores de oxigênio, atmosfera inerte (nitrogênio), além de materiais com
baixa permeabilidade ao oxigênio, que podem ser opções recomendáveis para
incrementar a vida de prateleira dos produtos (REGITANO-D’ARCE, 2006).
A utilização de atmosferas modificadas em carne consiste em uma tecnologia
muito comum na área de preservação. As atmosferas mais utilizadas para embalar
carne contem alto teor de oxigênio, objetivando a preservação da estabilidade da cor
da carne (JEREMIAH, 2001), embora a presença desse elemento possa acelerar os
processos oxidativos da carne (ABUJA; ALBERTINI, 2001).
2.5.4 Temperatura
A temperatura é um parâmetro físico que tem incidência direta sobre as
velocidades das reações químicas e bioquímicas na natureza. No processo de
oxidação lipídica não é diferente: a velocidade da reação entre o oxigênio molecular
e lipídeos é diretamente proporcional ao aumento da temperatura (NAWAR, 1996).
Estima-se que a cada 15°C de aumento da temperatura, a velocidade de reação
dobra. Tal fator é explicado pelo fato de que um aumento inicial de temperatura
acelera dois fatores: as reações de propagação em cadeia e a decomposição dos
peróxidos, resultando em aumento nas concentrações de radicais livres disponíveis,
tanto para o inicio quanto para a disseminação das cadeias de reação (REGITANO-
D’ARCE, 2006).
O processo de cozimento gera aumento significativo na oxidação lipídica em
carnes (BERTELSEN; JENSEN; SKIBSTED, 2000). A aceleração das reações de
oxidação lipídica, depois do cozimento, é atribuída às modificações induzidas pelo
calor em componentes do músculo, inclusive a alteração do compartimento celular e
a exposição dos lipídios das membranas a um ambiente pró-oxidativo, ativação
térmica e liberação do ferro livre catalítico da mioglobina. Ao contrario do cozimento,
o armazenamento em temperaturas baixas gera declínio das reações químicas,
bioquímicas e microbiológicas, ajudando assim a conservar as características do
produto (KRISTENSEN; ANDERSEN, 1997; MONAHAN, 2000).
29
2.6 Antioxidantes
O termo antioxidante vem sido atribuído, geralmente, a toda sustância que,
quando em baixas concentrações, em relação à concentração do substrato oxidável,
tem por função regenerar o substrato oxidável, regenera o substrato ou previne
significativamente a oxidação do mesmo (GODIC et al., 2014). Nesse contexto, ao
reagir com o radical livre, o antioxidante cede um elétron, oxidando-se e se
transformando num radical débil, não possuindo efeitos tóxicos (HALLIWELL, 1990).
Os antioxidantes impedem a formação de radicais livres ou espécies reativas de
oxigênio, atuando como um sistema de prevenção. Porém, outras, substâncias, além
de realizarem essa inibição, favorecem a recuperação e reconstituição das
estruturas biológicas lesionadas (ARMENTEROS et al. 2012).
A atividade antioxidante pode ser efetivada por diferentes processos como,
inibição de reações de oxidação de radicais livres; inibição da formação de radicais
livres; interrupção das reações em cadeia da fase propagação na auto-oxidação
lipídica; ativação do oxigênio singlete; agentes redutores de hidroperóxido, gerando
compostos mais estáveis; quelantes de metais de transição, como o ferro; inibidor de
enzimas pro-oxidantes. (MIN; BOFF, 2002; POKORNY´, 2007; KANCHEVA, 2009).
O uso de antioxidantes na indústria de alimentos tem importância na
preservação das características típicas de cada alimento, como o sabor, cor e odor.
Desta forma, o uso de antioxidantes na indústria alimentícia vem crescendo, sendo
que estas substâncias podem ser sintéticas ou naturais (MOURE et al. 2000). Além
disso, se somarmos a alta eficiência de antioxidantes naturais (como por exemplo os
tocoferóis), além da crescente preocupação dos consumidores pela segurança
alimentar, cria-se a necessidade de identificar fontes alternativas naturais e de
antioxidantes alimentares mais seguros (WANASUNDARA; SHAHIDI, 1998).
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos presentes em frutas,
vegetais e especiarias deve-se principalmente às propriedades redox e a estrutura
química que podem atuar como agentes redutores, eliminando radicais livres ou
como agentes quelantes de metais (RICE-EVANS et al., 1997). Além disso, alguns
desses compostos fenólicos podem regenerar outros antioxidantes e atuar de forma
sinérgica (PEDRIELLI; SKIBSTED, 2002).
30
2.7 Mecanismo de reação dos antioxidantes
Dentro da classificação dos antioxidantes existem três componentes
principais, que têm como função direta eliminar a formação de radicais livres:
antioxidantes, eliminadores de radicais livres e quelantes. Deve-se destacar que os
antioxidantes e eliminadores de radicais livres podem ser considerados usualmente
como sinônimos (porém nem sempre são utilizados com essa nomenclatura).
Somado aos antioxidantes diretos, existem mais dois importantes grupos de
inibidores de radicais livres: as enzimas antioxidantes e compostos com ação
antioxidante indireta. Esse último atua na formação de radicais livres na via indireta,
por exemplo, inibindo ação de enzimas pro-oxidantes (EVENGENY; DENISOV;
AFANAS´EV, 2005b).
Os inibidores de radicais livres diretos eliminam a formação de radicais livres
reagindo para formar radicais inativos ou quelando cataliticamente com metais de
transição ativos para formar complexos inativos (EVENGENY; DENISOV;
AFANAS’EV, 2005a). Em alimentos, nas reações 1 e 2, apenas os antioxidantes
com grupos fenólicos participam, produzindo radicais fenoxi estabilizados por
ressonância. Os radicais fenoxi do antioxidante perdem a capacidade de “reparar”
cadeias de ácidos graxos insaturados quando cedem o hidrogênio (H). Apesar disso,
os compostos ainda tem a capacidade de capturar radicais alcoxi ou peroxi (reações
3 e 4), formando compostos mais estáveis e interrompendo a propagação na
oxidação lipídica (BELITZ,1999).
𝑂𝐻⦁ + 𝐴𝑛𝑡𝐻 → 𝐻2𝑂 + 𝐴𝑛𝑡⦁ Reação 1
𝑅𝑂𝑂⦁ + 𝐴𝑛𝑡𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝐴𝑛𝑡⦁ Reação 2
𝑅𝑂⦁ + 𝐴𝑛𝑡⦁ → 𝑅𝑂𝐴𝑛𝑡 Reação 3
𝑅𝑂𝑂⦁ + 𝐴𝑛𝑡⦁ → 𝑅𝑂𝑂𝐴𝑛𝑡 Reação 4
Estudos realizados por Kirsch e De Groot (2001), demonstraram que os
antioxidantes possuem também função “reparadora” de biomoléculas, pela interação
da formação de radicais livres com os antioxidantes. Os autores acreditavam que a
31
função “reparadora” dos antioxidantes era mais importante que a própria ação na
eliminação de radicais livres.
𝑅𝑂𝑂⦁𝑜𝑢 𝐻𝑂⦁ + 𝑅𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 𝑜𝑢 𝐻2𝑂 + 𝑅⦁ Reação 5
𝑅⦁ + 𝐴𝑛𝑡𝐻 → 𝑅𝐻 + 𝐴𝑛𝑡⦁ Reação 6
As reações 5 e 6 podem acontecer em sistemas biológicos, mas é difícil de
estimar a sua importância, justamente porque sempre haverá uma competição entre
a função de reparação e a reação radical livre pelo oxigênio molecular (Reação 5).
Se as constantes de velocidade da reação 7 forem muito maior em várias ordens de
magnitude que a da reação 6, a probabilidade da função “reparadora” do
antioxidante será muito pequena (EVENGENY; DENISOV; AFANAS´EV, 2005c).
𝑅⦁ + 𝑂2 → 𝑅𝑂𝑂⦁ (𝑅𝑂𝑂⦁ + 𝐴𝑛𝑡𝐻 → 𝑅𝑂𝑂𝐻 + 𝐴𝑛𝑡⦁) Reação 7
2.8 Antioxidantes sintéticos aplicados em carnes
Os fenômenos de oxidação na carne e produtos cárneos podem ser reduzidos
com a adição de ingredientes sintéticos ou naturais com potencial antioxidante, que
tenham a capacidade de eliminar os radicais livres e, assim, finalizar a cadeia de
reações que iniciam os processos oxidativos. A utilização de antioxidantes na
indústria cárnea é de grande importância porque durante o processamento ocorrem
vários fenômenos oxidativos que podem promover mudanças em suas
características, tais como cor, sabor, aroma e textura que vão alterar a qualidade
organoléptica do produto (KANNER, 1994; GRAY et al., 1996).
Tradicionalmente, a indústria de produtos cárneos utilizam vários tipos de
antioxidantes sintéticos como um método eficiente e econômico para diminuir a
aparência de fenômenos oxidativos e, assim, minimizar a produção de odores e
sabores desagradáveis, perda de vitaminas ou aminoácidos no produto pronto
(LAGUERRE et al., 2007). Os antioxidantes sintéticos mais utilizados são o butil-
hidroxi-anisol, o E-320 (BHA), butil-hidroxi-tolueno, o E-321 (BHT), o galato de
propilo (PG) e a terbutil-hidroquinona (TBHQ) (Figura 5), (SHAHIDI et al., 1987).
Porém, existem uma limitação nas quantidades específicas desses antioxidantes e
32
ainda podem apresentar inconvenientes, pois são bastante voláteis e de fácil
decomposição em temperaturas altas (AHN et al., 2007).
Figura 5 - Antioxidantes sintéticos comerciais utilizados na indústria de alimentos. a. Butil hidroxitolueno b. butil hidroxianisol c. galato de propilo d. tercbutil hidroxiquinona e. etoxiquina f. ácido cítrico g. ácido tartárico
O emprego dos antioxidantes é questionado do ponto de vista da segurança
alimentar. Diversos estudos clínicos têm comprovado o efeito tóxico destes aditivos
sintéticos. Esses produtos têm sido fortemente regulados e restringidos em muitos
países, justamente pela comprovação que níveis altos de BHT, BHA e TBHQ, que
podem atuar como agentes promotores de doenças ou como teratógenos e produzir
aumento significativo do tamanho do fígado (hepatomegalia) e marcante proliferação
do retículo endoplásmico (VAN ESCH, 1996).
Na obtenção de alguns produtos cárneos e especificamente produtos cozidos,
como os presuntos, geralmente são adicionados antioxidantes sintéticos como o
BHA ou o BHT (LAGARES; FREIXENET, 1991). Dado esse fato, adicionou-se leis
de segurança alimentar, que começaram a serem mais restritivas e paralelamente,
teve um aumento da demanda de consumidores por produtos “mais naturais”. Isto
gerou interesse por parte da indústria cárnea pela procura de antioxidantes de
33
origem natural que tenham capacidade antioxidante nas reações de oxidação na
carne e seus derivados.
2.9 Antioxidantes naturais aplicados em carnes
As principais substâncias de origem natural com capacidade de diminuir os
fenômenos oxidativos de lipídeos e proteínas são: especiarias, frutos, extratos
vegetais e produtos derivados de sementes oleaginosas, entre outros (SÁNCHEZ-
ESCALANTE et al., 2003). Os antioxidantes naturais podem ser classificados em
função de seu valor nutritivo ou de acordo com a sua solubilidade. Dentro desse
último podemos diferenciar os antioxidantes em: antioxidantes hidrofóbicos (vitamina
E e carotenoides) ou hidrofílicos (vitamina C e compostos fenólicos). Dentro dos
antioxidantes hidrofóbicos, a vitamina A pertencente ao grupo dos carotenoides e a
um conjunto de compostos fenólicos conhecidos como tocoferóis (Figura 6). O alfa
tocoferol é o mais comum e biologicamente o que tem maior ação vitamínica, é um
antioxidante lipofílico que está localizado nas membranas celulares, cuja absorção e
transporte estão vinculados com o transporte dos lipídeos. (TRABER; ATKINSON,
2007).
Figura 6 - Estruturas da vitamina E, e estrutura base dos compostos fenólicos.
Os carotenoides (Figura 7) são os responsáveis por grande parte das cores
amarelas, laranjas ou vermelhas nos alimentos vegetais e também das cores laranja
de vários alimentos de origem animal. Alguns atuam como antioxidantes do
organismo, protegendo-o frente aos radicais livres. Os mecanismos de ação,
biodisponibilidade e o poder antioxidante ainda estão sendo questionado (KRINSKY,
1989).
34
Figura 7 - Estrutura química dos carotenoides.
Dentro dos antioxidantes hidrofílicos tem-se, a vitamina C (ácido ascórbico) e
os polifenóis (compostos fenólicos) (Figura 8). A vitamina C é um importante
antioxidante hidrossolúvel que atua potencializando os efeitos de outros
antioxidantes, como a vitamina E. Suas principais funções são neutralizar o oxigênio
(O2), capturar radicais hidroxilas e aníons superóxido, além de regenerar a forma
oxidada da vitamina E, atuando de forma sinérgica com a mesma. Além disso, é
comprovado que existe melhor absorção, se na formulação contiverem vitamina E
(SHEKELLE, et al., 2003).
35
Figura 8 - a. Estrutura química da vitamina C. b. Estrutura química de alguns compostos fenólicos.
Existe grande variedade de compostos fenólicos ou polifenóis, que são
componentes naturais de plantas, frutos e verduras. Uma grande quantidade é
procedente majoritariamente das plantas e tem demonstrado ter propriedades
antioxidantes contra a oxidação de lipídeos e proteínas em óleos, carne, peixes e
sistemas modelos cárneos (ESTÉVEZ et al., 2007). Vários autores têm demonstrado
que alguns frutos e vegetais são boa fonte de antioxidantes naturais, devido ao
conteúdo de flavonóides e ácidos fenólicos (GIL et al., 2002; PANTELIDIS et al.,
2007).
A utilização de antioxidantes naturais em carne permite estender a vida útil do
produto, circunstância essa que é refletida em aumento da estabilidade da cor, que
evita a transição da mioglobina para metamioglobina, assim como mantem suas
condições organolépticas inalteráveis, retardando fenômenos oxidativos, tais como o
aumento da rancidez do produto ou aumentando a resistência em relação a
proliferação bacteriana, pois os antioxidantes de natureza polifenólica possuem
também atividade antimicrobiana (NAVEENA et al., 2008).
Os extratos de plantas e óleos essenciais são ricos em compostos fenólicos,
que se apresentam como os melhores candidatos para serem utilizados como fonte
de antioxidantes em produtos cárneos, já que podem ser obtidos facilmente a partir
de fontes naturais e também evitam aparecimento de fenômenos oxidativos. As
propriedades antioxidantes desses compostos têm sido testadas com sucesso tanto
36
em sistemas modelo como em produtos cárneos (ESTÉVEZ et al., 2007; ESTÉVEZ
et al., 2008).
Segundo Sanchéz-Escalante (2001), o extrato de alecrim foi utilizado com
êxito em carnes processadas de hambúrgueres de bovinos, e apresentou alta
capacidade antioxidante, além de efeito antimicrobiano. Este fato sugere a
possibilidade de que esses antioxidantes naturais podem ser usados como
alternativa ao uso de antioxidantes sintéticos em produtos cárneos. Porém, tais
efeitos não foram muito efetivos em produtos cárneos cozidos, elaborados a partir
de matéria prima de porco, e inclusive o emprego desses antioxidantes naturais
promoveram um pequeno efeito pró-oxidante. A presença de baixa quantidade de
antioxidantes endógenos na matéria-prima pode influenciar a atividade dos
antioxidantes naturais adicionados diretamente ao produto (ESTÉVEZ et al., 2007).
Outro método eficaz na redução dos processos oxidativos de lipídeos e
proteínas da carne ou produtos cárneos é a adição de vitamina E (tocoferóis) na
alimentação do animal. Estudos recentes demonstraram que a suplementação da
dieta do animal com vitamina E é um método eficaz para reduzir a aparição de
fenômenos de oxidação e, dessa maneira, melhorar algumas das características da
carne como cor, maciez, capacidade de retenção de água, e aumento da vida útil
destes produtos. Isto acontece pela incorporação da vitamina E no tecido muscular
pela dieta do animal aumentando a estabilidade oxidativa da carne durante o
processamento (RUIZ et al., 1999; VENTANAS et al., 2007).
2.10 Embalagem ativa
A tecnologia de embalagens ativas é baseada no conceito da incorporação de
componentes ativos dentro dos sistemas de embalagem, que liberam ou absorvem
sustâncias do alimento para embalagem e desta para o alimento embalado ou do
ambiente do produto com a finalidade de prolongar a vida de prateleira e garantir a
qualidade, segurança e características sensoriais do alimento (CAMO; BELTRÁN;
RONCALÉS, 2008; VERMEIREN et al., 1999). As tecnologias de embalagem ativas
envolvem as interações entre o produto, o filme e a atmosfera (SUPPAKUL et al.,
2003). Exemplos de embalagens ativas são os absorvedores e removedores de
substâncias (umidade, oxigênio, etileno, odores), filmes antimicrobianos,
antioxidantes e auto aquecíveis. As embalagens ativas ganharam bastante interesse
por parte da indústria de alimentos devido a seu potencial de estender a vida de
37
prateleira do produto, por manter sua qualidade e por manter a segurança da saúde
humana (WORANUCH; YOKSAN; AKASHI, 2014).
As embalagens ativas consistem em uma base polimérica com a incorporação
de aditivos bioativos na própria matriz ao invés de serem adicionados diretamente
nos produtos, tais como, agentes antimicrobianos, antioxidantes, bactericidas,
antibióticos, enzimas, dentre outros. Plásticos e polímeros celulósicos compostáveis
e recicláveis são as referências no uso de biopolímeros em embalagens de
alimentos (YOSHIDA, 2009; SARANTÓPOULOS et al., 2012).
Segundo Coma (2008), as funções das embalagens estão em manter,
transportar ou liberar sobre a superfície do alimento os compostos bioativos
(antimicrobiano, antioxidante, vitaminas, etc.). A outra vertente atual do setor de
embalagens gera a necessidade de geração e busca de alternativas para
substituição parcial dos plásticos (polímeros típicos), que são muito utilizados em
embalagens de alimentos e apresentam difícil biodegradação (YU et al., 2013).
Filmes biopoliméricos podem ser utilizados na constituição de uma embalagem
ativa, com as vantagens de serem biologicamente sintetizadas, de alta
biodegradabilidade e baixa toxicidade ao humano.
Hoje em dia a utilização de filmes elaborados a partir de biopolímeros se
apresenta como substituto potencial das embalagens de polímeros sintéticos em
produtos alimentícios, devido à alta tendência do mercado por este tipo de produtos
e por serem materiais ambientalmente “amigáveis” (HAN; ZHANG; BUFFO, 2005).
Nos últimos anos vários estudos foram realizados com aplicação de filmes ativos
com uma base biopolimérica, principalmente derivados de hidratos de carbono
como, a quitosana, celulose, amido, e alginatos (RUBIO; GUERRERO, 2012). Uma
embalagem ativa e biodegradável obtida a partir da blenda entre quitosana e
celulose, incorporando ácido caféico (polifenol) maximizou a prevenção de oxidação
lipídica em uma emulsão a base de peixe (YU et al., 2013). Garcia et al. (2004)
demonstraram que os filmes derivados de celulose e especificamente feitos de
carboximetilcelulose tem a capacidade de absorver óleo de alimentos submetidos à
fritura. Outro biopolímero muito utilizado na indústria de alimentos é o amido, onde
filmes derivados de amido apresentaram um efeito positivo na preservação de
caramelos, uva passas, e contra a oxidação lipídica de nozes e dátiles
(THARANATHAN, 2003).
38
2.11 Quitosana
A quitosana é um polissacarídeo que se obtém a partir da quitina pela da
remoção dos grupos acetila utilizando uma base forte (AZEVEDO, 2007) (Figura 9).
A quitosana também pode ser descrita como a forma desacetilada da quitina, sendo
um biopolímero que possui ampla gama de aplicação em alimentos (SHAHIDI;
ARACHCHI; JEON, 1999). As fontes de obtenção da quitina na natureza são
abundantes, especialmente nos exoesqueletos de moluscos e insetos (PETER et al.,
2002). A quitosana é obtida pela N-deacetilação da quitina e o processo de
isolamento que envolve basicamente a deproteinização e demineralização
(GILDBERG; STENBERG, 2001). De acordo com o grau de desacetilação da
quitina podem-se obter vários tipos de quitosana, que variam em algumas
propriedades físico-químicas, tais como a solubilidade, pkA e a viscosidade (SILVA
et al., 2006). A quitosana ainda é caraterizada por dois parâmetros principais: grau
de acetilação e a média do peso molecular (MUZZARELLI,1996).
Figura 9 - Reação química da desacetilação da quitosana. Fonte: DUTTA, et al., (2008).
Segundo Azevedo (2007) a quitosana em concentrações baixas é solúvel em
solução ácida de ácido acético à 1% (v/v) ou 0,01 M, tornando-se um polímero
catiônico com a protonação do grupo amino (NH2). A presença desses grupos amino
livres na cadeia do copolímero e a carga positiva em meio ácido conferem a
quitosana algumas propriedades, dentre as quais destaca-se a capacidade de
ligação (FERREIRA; ANCELMO, 2013).
39
A quitosana nos últimos anos tem chamado à atenção dos pesquisadores
devido as suas propriedades, principalmente biodegradabilidade, biocompatibilidade,
propriedades antimicrobianas e pela capacidade de formar filmes (DEVLIEGHERE;
VERMEULEN; DEBEVERE, 2004). A quitosana é um excelente formador de filmes,
justamente por possuir uma cadeia linear de polímeros como eixe central da sua
estrutura, formado por resíduos de -(1-4) 2-acetamido-2-deoxy-D-glicose (N-acetil
glicosamina) e resíduos de glicosamina (GlcN). Todavia os filmes de quitosana são
bastante frágeis e precisam de plastificantes, tanto para diminuir as forças de fricção
nas cadeias do polímero, quanto para melhorar as propriedades mecânicas do filme,
(PARK; MARSH; RHIM, 2002; ZIANI et al., 2008; VIEIRA et al. 2011).
Uma das características dos filmes de quitosana é atuar como um efetivo
conservante de alimentos, pois a atividade antimicrobiana foi comprovada por
diversos autores (PORTES et al., 2009; VÁSCONEZ, et al., 2009). A quitosana tem
apresentado em alimentos uma atividade antimicrobiana contra microrganismos
como: enterobacterias, mesófilos, pseudômonas, leveduras, bactérias ácido láticas e
alguns patogênicos (GEORGANTELIS et al., 2007). De acordo com Roller e Covill
(2000), a atividade antimicrobiana é melhorada com o uso de temperaturas de
refrigeração. Um revestimento antimicrobiano a partir de quitosana e uma blenda de
quitosana e caseinato de sódio foram considerados como alternativas para o
controle da microbiota de queijo e salame, inibindo significantemente o
desenvolvimento de bactérias mesófilas, psicrotróficos, leveduras e bolores
(MOREIRA et al., 2011).
Embora a quitosana seja um recurso de interesse para aplicação como
embalagem ativa, ainda não possui uma atividade antioxidante significativa sobre os
alimentos, sendo que a melhora dessa qualidade poderia expandir suas aplicações
em alimentos (WANG et al. 2013).
2.12 Resíduos Agroindustriais
Ao redor do mundo inteiro uma das atividades que mais gera quantidade de
resíduos é a agroindústria. Os tratamentos desses resíduos geralmente consistem
em problemas municipais nos aterros sanitários devido à alta biodegradação dos
resíduos, que aumentam a produção de lixiviados e metano (MISI; FORSTER,
2002). Os resíduos agroindustriais de frutos e vegetais geralmente são
caracterizados por serem, em sua maioria, cascas, sementes e partes não
40
comestíveis, que apresentam, na sua composição, 75 % de açúcares, 9 % celulose
e 5 % de lignina e quantidades baixas lipídeos, em extrato seco (KOSSEVA, 2011).
Estudos comprovaram que aplicação de resíduos como substituto na nutrição
animal podem beneficiar a qualidade de vida do animal, no entanto, apresentou
alterações em seus subprodutos. Ângulo et al. (2012) adicionaram na ração de
bovinos lactantes Holstein (produtores de leite) resíduos de frutas e vegetais. Nesse
estudo demonstrou que a adição destes resíduos na dieta pode ser uma ração
alternativa sem prejuízo na produção de leite e com melhora de qualidade do
produto. Outros estudos realizados comprovaram que na grande maioria os resíduos
de frutas e vegetais contém substâncias antioxidantes, como vitamina C, vitamina E,
carotenoides e compostos fenólicos (RHODES, 1996). A Figura 10 ilustra os
compostos obtidos a partir de resíduos de frutas e vegetais, e algumas aplicações
(MIRABELLA; CASTELLANI; SALA, 2013).
Figura 10 - Utilidade e compostos de resíduos de frutas e vegetais Fonte: Adaptado de Mirabella; Castellani; Sala (2013)
41
2.12.1 Película de amendoim
Até o momento, não foi encontrado na literatura informações sobre os efeitos
dos compostos bioativos presentes na película de amendoim. A película, que é um
resíduo do processamento do amendoim, apresenta coloração marrom e sabor
adstringente, devido principalmente ao grande teor de compostos fenólicos (YU et
al., 2005). Estima-se que para uma produção de amendoim de 29,1 milhões de
toneladas (safra mundial 1999/2000), a média do conteúdo de película gerada foi de
2,6%, o que corresponde a 750 mil toneladas (SOBOLEV; COLE, 2004). Nepote,
Grosso e Guzmán (2002) encontraram aproximadamente 150 mg de fenólicos totais
por grama de matéria seca e desengordurada na película de amendoim. Em estudos
anteriores, Bergamaschi (2010) avaliou diferentes resíduos produzidos na
agroindústria de alimentos no Estado de São Paulo e, observou maiores teores de
fenólicos e atividade antioxidante em extrato etanólico e aquoso da película de
amendoim. Dentre a gama de compostos fenólicos identificados na película de
amendoim, seis fazem parte da família das procianidinas do tipo A, (LOU et al.,
2004).
Estudos realizados por Duh e Yen, (1995); Yen e Duh, (1996) demonstraram
que a película de amendoim possui alto efeito antioxidante e antimutagênico e o
composto antioxidativo foi identificado como luteolina. A presença de compostos
fenólicos na película de amendoim é um fato que podem ser evidenciados pela
mudança de cor da camada externa do mesocarpo da película de amendoim
associada à presença de compostos como os flavonóides (DAIGLE et al., 1988).
Geralmente, os compostos fenólicos se concentram nas camadas mais externas das
plantas, como as cascas e tegumentos, com a finalidade de proteger materiais
contidos na porção interior (MA, et al., 2013). Os compostos fenólicos são
abundantes em quantidade e em tipos na película de amendoim e, entre eles, inclui-
se principalmente os ácidos fenólicos, unidos, esterificados e livres, flavonóides,
catequinas, epicatequinas e seus polímeros e estilbenos (difeniletilenos), (YU;
AHMEDNA; GOKTEPE, 2005).
2.12.2 Pimenta Rosa
A pimenta-rosa (Schinus Terebinthifolius Raddi) é um dos mais sofisticados
condimentos utilizados na culinária mundial e seu consumo vem sendo estimulado
desde a década de 80. As partes que apresentam propriedades medicinais são: as
42
cascas, as folhas e os frutos, apresentando atividades antidiarréica, anti-inflamatória
(AMORIM; SANTOS, 2003), cicatrizante (LUCENA et. al., 2006; LIPINSKI, 2008),
antibacteriana (DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ; PRADO, 2005; SANTOS, 2007) e
antifúngica (SANTOS et. al., 2010). A análise fitoquímica em função da presença de
substâncias fenólicas dessa planta revelou a presença de alto teor de tanino,
bioflavonóides e ácidos triterpênicos na casca e de até 5% de óleo essencial
formado por mono e sequiterpenos nos frutos e nas folhas (LORENZI; MATOS,
2008).
As variedades distintas de pimenta caracterizam-se por ter alto conteúdo de
diferentes compostos fitoquímicos como vitamina C, compostos fenólicos,
flavonóides e carotenóides (ALVAREZ-PARRILLA, et al. 2011). Esse alto conteúdo
proporciona ao fruto qualidade nutricional e sensorial, em termos de cor, gosto,
aroma e sabor, e também, oferecendo efeitos benéficos para saúde (ORNELAS-PAZ
et al., 2010). A concentração de compostos fenólicos, vitamina C, carotenoides,
depende da maturidade, condições de crescimento, e manipulação pós-colheita da
pimenta. Estes compostos são conhecidos por apresentar alta atividade antioxidante
(MATERSKA; PERUCKA, 2005).
A pimenta rosa possui muitas propriedades bioativas, a pouca informação
científica encontrada, associam ao alto conteúdo de polifenóis. Estes polifenóis
encontram-se distribuídos por todos os órgãos vegetais, como folhas, cascas, flores,
frutos e nas sementes (SANTOS et al,. 2012). Tem se reportado nas folhas e frutos
altas concentrações de monoterpenos, hidrocarbonetos de sesquiterpênicos e
ácidos graxos (AFFONSO et al., 2012).
43
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção dos extratos de resíduos agroindustriais de pimenta rosa e
película de amendoim
Após a coleta dos resíduos agroindustriais de pimenta rosa e película de
amendoim, realizou-se uma extração em solvente alcoólico (etanol 80%).
Primeiramente, foram pesadas 1 g de resíduo seco dentro de um tubo de vidro e
adicionou-se 10 ml de etanol:água (8:2, v/v). Na sequência, o material foi extraído
em banho de água, a 90ºC por 30 minutos. Em seguida, o material foi submetido a
uma extração por ultrassom por mais 15 minutos, para finalmente ser filtrado em
papel filtro Whattman Nº 3. O extrato hidroalcoólico foi armazenado a 3ºC até o
momento das análises (BERGAMACHI, 2010).
Pessagem 1 g residuo
+
10 ml Etanol 80 %
Armazenamento do
extrato 3 ºC
Banho de agua 95 ºC por
25 minutos
Ultrassom por 15 minutos
Filtrado
Extrato Pimenta Extrato Amendoim
Figura.11 - Fluxograma do processo de extração dos compostos antioxidantes dos resíduos de película amendoim e pimenta rosa
44
3.2 Determinação de compostos fenólicos totais.
A análise do teor de compostos fenólicos totais dos extratos dos resíduos
vegetais foi realizada de acordo com o método espectrofotométrico de Folin-
Ciocalteau, descrito por Singleton, Orthofer e Lamuela (1999). O ácido gálico foi o
padrão comparativo. O reagente de Folin-Ciocalteau é uma solução complexa de
íons poliméricos formados a partir de heteropoliácidos fosfomolibdicos e
fosfotungsticos. Esse reagente oxida os fenolatos, reduzindo os ácidos a um
complexo azul Mo-W. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a λ=740 nm. Os
extratos dos resíduos de película de amendoim e pimenta rosa foram diluídos 500
vezes, coletando-se uma alíquota de 0,5 mL da amostra diluída e transferindo-a para
um tubo onde se adicionou 2,5 mL do reagente Folin-Ciocalteau, diluído em água
1:10 (1:9 v/v). A mistura permaneceu em repouso de 3 a 5 minutos. Em seguida,
adicionou-se 2 mL da solução de carbonato de sódio e água (4% m/v) seguido de
repouso por duas horas, em local escuro.. A absorbância foi medida em
espectrofotômetro UV-mini 1240 (Shimadzu-Co) a λ=740 nm. Uma amostra em
branco foi conduzida nas mesmas condições e os resultados dos compostos
fenólicos totais foram expressos em equivalente de ácido gálico (mg AG/g resíduo
vegetal), calculados por meio do ajuste da curva de calibração do ácido gálico com
concentrações que variaram de 5 a 80 µg/mL.
3.3 Preparo da embalagem antioxidante: filmes ativos de quitosana
A metodologia para a obtenção dos filmes consistiu, primeiramente, na
dispersão de quitosana (Primex – ChitoClear®) ao 2 % (m/v) em solução aquosa
de ácido acético (1%, em volume), seguida de homogeneização até solubilidade
total por 60 minutos. A partir da solução filmogênica, os extratos dos resíduos
agroindustriais foram adicionados segundo as concentrações de compostos
fenólicos totais de cada extrato, para obter concentrações de 1, 14, 45, 77 e 90
mg / kg de cada um em relação à massa de carne, e glicerol como plastificante
em concentrações 0,25% (m/v), sob agitação branda de 5 a 10 minutos. Em
seguida, 20 mL da solução foi aplicada em suportes planos (placa de Petri de
plástico circulares de 9 cm, tanto na tampa como na base da placa), ocorrendo o
processo de evaporação do solvente em estufa de convecção forçada a 40ºC por
24 horas (Figura 12).
45
Figura 12 – Filmes de ativos de quitosana obtidos
3.3.1 Caracterização das embalagens antioxidante (filmes ativos de quitosana)
Os filmes foram caracterizados quanto à sua espessura, teor de umidade,
propriedades mecânicas, propriedades de barreira ao vapor de água, e
microestrutura. Estes estudos foram realizados para determinar a influência do
plastificante sobre aspetos tecnológicos do filme e também algumas propriedades de
barreira no intercambio gasoso e líquido entre o produto e o filme ativo de quitosana.
3.3.2 Espessura
As medidas da espessura dos filmes foram efetuadas utilizando um
micrômetro com sensibilidade de 0,001 mm (Modelo nº 293, Mitutoyo, Japan). A
espessura média (mm) dos filmes foi determinada a partir de cinco medidas
aleatórias (Figura 13).
Figura 13 – Medição da espessura dos filmes ativos de quitosana com micrómetro
46
3.3.3 Teor de umidade no filme
O teor de umidade dos filmes foi medido pela porcentagem da perda de
peso após a secagem em uma estufa à temperatura de 115 ºC por 24 horas
(MAHMOUD; SAVELLO, 1992).
3.3.4 Taxa de permeabilidade
Taxa de permeabilidade ao vapor d’água (TPVA): foi determinada
utilizando o método padronizado ASTM E96-95 (2005), que corresponde à técnica
gravimétrica, onde os filmes foram fixados na parte superior de um recipiente que
contém um dessecante (sílica). Este sistema foi acondicionado em uma câmara com
temperatura e umidade relativa controlada (25°C, 75% UR). A medida da massa final
foi feita após um tempo pré-determinado de incubação do sistema, e então, foi
determinado o valor da massa (M) adquirida, correspondente à diferença entre a
massa inicial e final do sistema. A determinação foi realizada utilizando-se cinco
amostras de cada ensaio (Figura 14).
Figura 14 – Sistema para medição da taxa de permeabilidade ao vapor d’água
3.3.5 Solubilidade
A matéria total solúvel (MTS) pode ser definida como a quantidade de
matéria solúvel após 24 horas de imersão em água. Os filmes (5 repetições de cada
tratamento) foram cortados em quadrados de 5 x5 cm2, secos durante 3 horas na
47
estufa a 40ºC, e imersos em 100mL de água destilada por 24 horas sob agitação
branda em temperatura ambiente. Foram preparados sistemas de filtração com
papel filtro qualitativo e tarado em balança analítica. Em seguida, retirou-se e filtrou-
se essa solução. Esse resíduo do filme não solubilizado é retido no papel filtro. O
papel filtro mais o filme não solubilizado foram secos por 24 horas e pesados. O
calculo foi feito por perda de matéria solubilizada. (SOTHORNVIT; KROCHTA,
2000).
3.3.6 Propriedades mecânicas
As amostras foram avaliadas pelo teste de tração de acordo com o
método ASTM D882 (AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS,
1995), utilizando-se um texturômetro de Brookfield. As amostras foram cortadas em
retângulos uniformes de 10 x 2,54 cm. A tensão na ruptura (TS), a elongação na
ruptura (E), o módulo elástico (MS) foram determinados, sendo a distância inicial de
separação fixada em 50 mm e a velocidade de realização do teste em 1,0 mm/s. Os
resultados foram comparados com teste de t de Student, com nível de significância
de 5%.
3.4 Avaliações nas amostras de produto de frango reestruturado
Para avaliação da estabilidade oxidativa em produto de frango reestruturado,
as análises foram realizadas em três etapas. Na Figura 15 é apresentado o
esquema do planejamento experimental do estudo.
48
PRODUTO REESTRUTURADO
DE FRANGO
PRIMEIRA ETAPA
SEGUNDA ETAPA
DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO
OTIMA DE EXTRATO NOS FILMES ATIVOS
0 DIAS
1,5 DIAS
5 DIAS
8,5 DIAS
10 DIAS
ANALISES DE ESTABILIDADE
OXIDATIVA:
TBARS
CONCENTRAÇÕES OTIMAS DE
EXTRATO ANTIOXIDANTE PARA
INIBIÇÃO OXIDATIVA
DETERMINAÇÃO DOS MELHORES
TRATAMENTOS INIBIDORES DA
OXIDAÇÃO LIPIDICA
0 DIAS
4 DIAS
3 BLOCOS
7 DIAS
MELHORES TRATAMENTOS
INIBIDORES DA OXIDAÇÃO LIPIDICA
ANALISES:
TBARS, pH, Cor, Microbiológicas, Índice
de Peróxido
TERCEIRA ETAPA
DETERMINAÇÃO DA ACEITABILIDADE
DOS MELHORES TRATAMENTOS PARA
OS CONSUMIDORES E PRODUTO
IDEAL
ANALISE SENSORIAL
Teste de
aceitabilidade,
CATA
Figura 15 - Planejamento experimental de processos e analises.
49
3.5 Determinações da concentração ótima de extrato antioxidante de película
de amendoim e pimenta rosa nas embalagens bioativas e aplicação no
produto cárneo
3.5.1 Preparo das amostras (Primeira Etapa)
As amostras de sobrecoxa de frango foram obtidas de abatedouro, localizado
no município de Rio Claro – SP, a partir de aves abatidas de aproximadamente 45
dias de idade. As aves foram depenadas, evisceradas, resfriadas, seguido de
separação das sobrecoxas para posterior resfriamento em câmara fria. O material foi
transportado em caixas térmicas com gelo até o Laboratório de Qualidade e
Processamento de Carnes do Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição
da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – Piracicaba-SP, onde foi
realizado o processamento da carne de frango.
As sobrecoxas foram processadas, trituradas (4B22-2, Hobart®) e
homogeneizadas em um cutter, adicionando-se em todos os tratamentos cloreto de
sódio, na porcentagem de 1,5%. A partir dessa mistura foram pesadas porções de
aproximadamente 50 g de carne processada de frango, moldadas na forma de
hambúrguer. As amostras cruas foram armazenadas sobre as placas Petri de 9 cm
de diâmetro, onde previamente foram elaborados os filmes ativos de quitosana,
observando cuidadosamente se o filme ficou aderido nos dois lados do hambúrguer.
Posteriormente, foram armazenadas em uma BOD (ELETROlab modelo EL101/3)
acondicionada com radiação controlada, a 1500 LX e a 3 1ºC. O tempo de
armazenamento sob refrigeração, nesta primeira etapa do estudo, foi de 10 dias de
armazenamento refrigerado.
3.5.2 Delineamento experimental
Para a otimização das concentrações de antioxidantes aplicadas nos filmes
ativo de quitosana, utilizou-se um planejamento experimental fatorial, através da
metodologia de superfície de resposta (MSR), do tipo composto central rotacional,
envolvendo duas variáveis exploratórias (tempo e concentração de extrato) e uma
variável dependente (Valor de TBARS). As faixas de concentrações de antioxidantes
utilizadas no ensaio foram tomadas baseando-se no teor de compostos fenólicos
totais (CFT) dos extratos de PA e PM. Baseado na Portaria nº 1.004, da Secretaria
de Vigilância Sanitária (BRASIL, 1998), que estabelece como limite para
50
antioxidante comercial Butil hidroxi tolueno; 0,01g BHT/100g de carne (100mg/kg),
composto que foi nosso padrão comercial de comparação. Foram utilizadas faixas
mais baixas de compostos fenólicos totais dos extratos (< 100 mg/kg de carne). O
tempo de avaliação foi de 10 dias, tempo superior do que a vida útil do produto
comercial (8 dias), justamente para poder observar melhor as interações com o
antioxidante.
As faixas do estudo são apresentadas na Tabela 1:
Tabela 1 - Faixas de estudo das variáveis exploratórias em analise de estabilidade oxidativa de produto reestruturado de frango de frango através de valor de TBA.
Nível de Variação
Variáveis
Exploratórias -1,41 -1 0 +1 +1,41
Tempo, dias 0 1,5 5 8,5 10
Concentração,
mg CFT/kg carne 1 14.0 45.5 77 90
No total foram realizados 11 ensaios combinando-se as variáveis e incluindo
três repetições do ponto central. Todos os experimentos foram realizados de
maneira aleatória e utilizando os mesmos equipamentos e as mesmas condições de
armazenamento e iluminação. Após análise dos efeitos foram analisados pela
metodologia de superfície de resposta e análise de regressão múltipla. O modelo
matemático de segunda ordem foi ajustado, incluindo termos lineares e quadráticos,
e interações entre variáveis exploratórias. Os modelos foram avaliados em relação
ao coeficiente de determinação (R2) e teste de F. O teste F, que testa a significância
da regressão e da falta de ajuste do modelo, foi realizado por meio da análise de
variância comparado ao valor da tabela de 95% de probabilidade para uma
distribuição de referência.
3.6 Avaliação dos efeitos físico-químicos e microbiológicos com adição de
extratos diretamente na massa do produto cárneo e no filme ativo
Na segunda etapa do estudo foram selecionadas duas concentrações da
região ótima da superfície de resposta, uma do extrato de película de amendoim e
uma do extrato da pimenta rosa, que foram tomadas para comparação de
tratamentos com adição das mesmas concentrações diretamente no produto cárneo,
51
adição dessas concentrações nos filmes ativos com um antioxidante comercial e
com um controle negativo.
3.6.1 Preparo das amostras (Segunda Etapa)
As matérias primas foram obtidas e transportadas até a planta de
processamento de igual forma que no item 3.3.1. Nesta segunda parte do estudo
delineou-se seis tratamentos, onde dois desses consistiram na aplicação de extrato
de película de amendoim e pimenta rosa no filme ativo de quitosana, outros dois
aplicando a mesma quantidade de extrato de película amendoim e pimenta rosa
adicionado diretamente na massa cárnea, um tratamento com BHT (antioxidante
sintético), de acordo com a Portaria nº 1.004, da Secretaria de Vigilância Sanitária
(BRASIL, 1998), sendo 0,01g BHT/100g de carne 100mg/kg), e, por fim, o controle
negativo, sem embalagem e sem adição de antioxidante (Tabela 2).
Tabela 2 - Codificação dos tratamentos
Tratamento Descrição
C Controle, produto reestruturado de frango sem adição de antioxidante.
AS Antioxidante Sintético, produto reestruturado de frango com adição de 0,1g por kg de produto.
MP Massa Pimenta, Adição do extrato de pimenta rosa direto na massa cárnea de frango. Volume equivalente a 90 mg CFT/kg de carne.
MA Massa Amendoim, Adição do extrato de película de amendoim direto na massa cárnea de frango. Volume equivalente a 80 mg CFT/kg de carne.
FP Filme Pimenta, aplicação de filme ativo de quitosana com adição do extrato de pimenta rosa sobre a produto reestruturado de frango. Volume de antioxidante no filme equivalente a 90 mg CFT/kg de carne.
FA Filme Amendoim, Adição do extrato de película de amendoim no filme ativo de quitosana. Volume de antioxidante no filme equivalente a 80 mg CFT/kg de carne.
C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
As sobrecoxas foram processadas e trituradas (4B22-2, Hobart®), e
homogeneizadas em cutter adicionando em todos os tratamentos cloreto de sódio na
porcentagem de 1,5% (em massa). Os extratos de película de amendoim e pimenta
rosa foram adicionados direto na massa cárnea no processo de homogeneização, o
antioxidante sintético BHT, foi dissolvido em 5 mL de óleo de soja sem adição de
antioxidantes. Para diminuir o erro todos os tratamentos foram adicionados o mesmo
volume de óleo de soja. A partir dessas misturas foram pesadas porções de
aproximadamente 50g de carne processada de frango, moldadas na forma de
hambúrguer. As amostras cruas foram armazenadas cuidadosamente dentro das
52
placas Petri de 9 cm de diâmetro. Todos os tratamentos foram armazenados em
uma BOD acondicionada com radiação controlada, a 1000 LX e a 3(1) ºC. Os
tempos de armazenamento sob refrigeração nesta etapa do estudo foram de 7 dias
de armazenamento refrigerado (Figura 16).
Figura 16 – Sequência do processamento das sobrecoxas de frango.
Após o processamento, foi coletada a primeira unidade experimental para
realização de análises físico-químicas e microbiológicas. As amostras restantes foram
coletadas nos tempos de 4 e 7 dias de armazenamento. O delineamento experimental
utilizado nesta segunda etapa do estudo foi de desenho de blocos ao acaso no
esquema fatorial 6 x 3, com teste de comparação de médias (Teste de Tukey).
3.7 Análise dos experimentos
As amostras cárneas desta segunda etapa foram avaliadas pela estabilidade
oxidativa, carga microbiana e qualidade das amostras, conforme as análises
descritas abaixo.
Para acompanhar a qualidade e estabilidade oxidativa do produto
reestruturado de frango durante o período de armazenamento refrigerado foram
realizadas análises de cor instrumental, avaliação do pH, determinação da oxidação
lipídica (TBARS), índice de peróxido, no primeiro dia após o processamento, após
quatro dias e sete dias de armazenamento sob refrigeração (31 ºC), 1000 LX.
3.8 Composição centesimal
Para a determinação da composição centesimal das amostras foram feitas as
análises: teor de umidade, determinada por gravimetria em estufa a 105°C, até peso
53
constante (ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS, 1999). O teor
de proteína bruta, pela determinação do nitrogênio total, pelo método de
Microkjeldahl, e conversão em proteína, multiplicando-se o valor obtido pelo fator de
6,25 (JOHNSON; ULRICH, 1974). O teor de cinza foi determinado por calcinação da
matéria orgânica em forno mufla a 550°C (PREGNOLATTO; PREGNOLATTO, 1985;
WINTERS; TENNYSON, 2005) e a quantidade de amostra utilizada seguiu o
recomendado por Winters e Tennyson (2005). O teor de lipídeos totais foi
determinado pelo método de Soxhlet, utilizando hexano como solvente extrator
(PREGNOLATTO; PREGNOLATTO, 1985). Todas as análises foram realizadas em
triplicata, em amostras cruas. Todos os resultados foram calculados em base úmida
e expressos em porcentagem (%).
3.9 Cor instrumental
A cor instrumental foi determinada utilizando colorímetro portátil da marca
Minolta Chroma Meter, Modelo CR-400, realizando-se a leitura dos parâmetros L*
(luminosidade), a* (intensidade de vermelho/verde), b* (intensidade de amarelo/azul)
do sistema CIEL*a*b*, calibrado em porcelana branca padrão com Y=93,7, x=0,3160
e y=0,3323, com uma área de medição de 8 mm de diâmetro, um ângulo de
observação de 10 ° e um iluminante D65 com o componente especular incluído.
A análise foi realizada em cinco amostras de cada tratamento, com duas
leituras em cada amostra, sobre uma superfície opaca.
3.10 Avaliação do pH
A determinação do pH foi realizada com eletrodo de penetração de corpo de
vidro, em cinco amostras de cada tratamento, com leitura em dois diferentes pontos
de cada amostra. O aparelho utilizado foi um potenciômetro da marca Oakton, pH
300, série 35618, com compensação automática de temperatura.
3.11 Determinação da oxidação lipídica (TBARS)
A determinação do valor das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) foi realizada após processamento nos tempos de 0, 4 e 7 dias de
armazenamento refrigerado (3°C). As análises foram feitas em duplicata, utilizando 3
amostras por tratamento, segundo metodologia descrita por Vyncke (1970, 1975) e
Sorensen e Jorgensen (1996). Foi utilizado como padrão o 1,1,3,3 tetraetoxipropano
(TEP), cuja hidrólise ácida gera malonaldeído na proporção de 1mol:1mol, para
54
obtenção de uma curva padrão, composta por nove pontos de diferentes
concentrações (0; 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 e 5,0 μmol/L de TEP).
Os aldeídos foram extraídos pela ultrahomogeneização a 3500 rpm (Ultra
Turrax) de 15 mL de uma solução de ácido tricloroacético (7,5%) com adição de
propil galato (0,1%) e adição de um agente quelante; o EDTA (0,1%), com
aproximadamente 5 g de amostra. Em seguida a mistura foi filtrada em papel de filtro
qualitativo, 12,5 mm. Foram coletados 5 mL do filtrado e foram adicionados de 5 mL
da solução de TBA (0,02M), agitados e colocados a 100°C (banho-maria) durante
40 minutos para reação dos compostos, e para a formação do complexo colorido,
medido em espectrofotômetro Shimadzu, modelo UV-Vis mini 1240, em
comprimentos de onda de 532 e 600 nm.
Para os cálculos da curva padrão, a concentração e a absorbância foram
plotados no eixo x e y, respectivamente, determinando a equação da reta de uma
regressão linear, a partir da qual obteve-se a concentração da amostra. Os
resultados foram expressos em valor de TBARS, definido como mg de malonaldeído
(MDA) / kg de amostra.
3.12 Índice de peróxido
A extração de gordura foi realizada de acordo com o método de Bligh and
Dyer (1959), seguindo as modificações propostas por Christie (1982) e Smedes e
Thomasen (1996). A determinação do índice de peróxido foi realizada de acordo
com a metodologia proposta pela AOCS Cd 8-53 (1990). Pesou-se 3 mL da amostra
em erlenmeyer de 250 mL com tampa esmerilhada, adicionou-se 30 mL de solução
de ácido acético clorofórmio. Agitou-se o frasco até a dissolução da amostra.
Adicionou-se 0,5 mL de solução saturada de KI. Deixou em repouso no escuro com
agitação ocasional por 1 minuto e adicionou-se 30 mL de água destilada. Titulou-se
com Na2S2O3 0,02 M, adicionando-se com vigorosa agitação até que a cor amarela
quase desapareceu. Adicionou-se 0,5 mL de solução de amido indicador e continuou
a titulação agitando vigorosamente até o desaparecimento da coloração azul. Para o
cálculo do Índice de Peróxido (mEq de peróxidos.1000 g-1 de gordura) foi utilizada a
seguinte equação:
𝐼𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝑃𝑒𝑟ó𝑥𝑖𝑑𝑜(𝑚𝐸𝑞 𝑑𝑒 𝑂𝑥𝑖𝑔ê𝑛𝑖𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝑘𝑔 𝑑𝑒 𝑔𝑟𝑎𝑠𝑎) = 𝑉 𝑥 𝑀 𝑥 1000
𝑔 𝑔𝑜𝑟𝑑𝑢𝑟𝑎 𝑥 2
55
Sendo:
V = volume de Na2S2O3 gasto na titulação da amostra;
M = molaridade da solução de Na2S2O3.
3.13 Análises Microbiológicas
As avaliações microbiológicas foram feitas com base na contagem total de
mesófilos e psicrotróficos aeróbios. As análises foram realizadas em três pontos de e
em dias diferentes, no tempo inicial (0 dias), após 4 e 7 dias respectivamente. De
cada lote de 21 amostras do tratamento, coletou-se 3 por ponto de analise, onde
foram retirados uma porção de 25 g de cada amostra. Foi pesada e diluída em 225
mL de água peptonada 0,1% e homogeneizada. Esse processo foi realizado em
sacos plásticos adequados em um equipamento tipo Stomacher MK 1204 (ITR) por
8 minutos. Após a diluição decimal seriada para contagem de Mesofilos, foram
plaqueadas pelo método pour plate, alíquotas de 1 mL em meio Plate Count Agar
DifcoTM , em triplicata de cada diluição. Em seguida as placas foram incubadas a
35°C por 48 horas. No caso dos Psicrotrófilos foram plaqueadas pelo método de
superfície, alíquotas de 0.1 mL em superfície no meio Plate Count Agar DifcoTM, em
3 placas para cada diluição correspondente. Depois as placas foram incubadas a
7°C por 10 dias. As placas a serem contadas foram as que apresentaram uma faixa
entre 25 e 250 colônias (SILVA, 2001).
Antes da avaliação sensorial foi realizada a analise microbiológica enquanto a
patógenos se refere das amostras comprovando-se assim a segurança alimentar do
produto e a integridade da saúde dos provadores. As análises microbiológicas
realizadas foram as seguintes: Clostridios sulfito redutores (LABBE, 2001),
Coliformes termotolerantes (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR
STANDARDIZATION 7251, 2005), Estafilococos Coagulase Positiva (BENNETT et
al., 2001) e Salmonella spp. (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR
STANDARDIZATION, 6579, 2007). Todas as análises foram realizadas no Centro de
Tecnologia de Carnes do Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), sob a
certificação da International Organization for Standardization - 9001.
56
3.14 Análise sensorial baseado na resposta dos consumidores (Terceira
Etapa)
Considerando os resultados obtidos nas duas etapas anteriores foram
selecionados os melhores tratamentos, quanto à oxidação lipídica, para avaliação
sensorial. Os testes sensoriais foram realizados após processamento e obtenção
dos resultados dos testes microbiológicos das amostras cruas. Isto para garantir que
as amostras estavam dentro dos limites permitidos pela legislação para ingestão. As
análises foram realizadas no Laboratório de Avaliação Sensorial do Departamento
de Agroindústria, Alimentos e Nutrição, que dispõe de cabines individuais para teste,
além de controle de iluminação, segundo as recomendações de Meilgaard; Civille e
Carr (1999). O projeto foi avaliado pelo Comitê de Ética da ESALQ para a realização
das análises sensoriais com a utilização de humanos adultos acima de 18 anos, não
fumantes (COET/0213, Protocolo nº 161).
3.14.1 Preparo das amostras
Foram selecionadas as amostras dos tratamentos com melhor estabilidade
oxidativa apresentaram (que foram MP, adição de extrato ativo de pimenta na massa
cárnea, e o tratamento FP, aplicação de filmes ativa de quitosana com adição de
extrato de pimenta na carne), além de um controle negativo. Os tratamentos foram
comparados com um produto do mercado com características similares em
duplicata, constituindo assim 5 tratamentos apresentados na Tabela 3.
Tabela 3 - Tratamentos que foram avaliados sensorialmente
Tratamento Descrição
C Controle, tratamento controle sem adição de antioxidante. MP Massa Pimenta, tratamento com adição do extrato de pimenta rosa direto na
massa cárnea. FP Filme Pimenta, tratamento com adição do extrato de pimenta rosa no filme ativo
de quitosana e aplicado na produto reestruturado. CM1 Comercial 1, hambúrguer comercial 1. CM2 Comercial 2, hambúrguer comercial 2.
FP: Filme pimenta, CM1: amostra comercial 1, MP: Massa pimenta, C: Controle, CM2: amostra comercial 2.
A análise sensorial foi realizada após obtenção dos resultados da análise
microbiológica, aproximadamente 5 dias após processamento. O cozimento do
produto reestruturado de frango (hambúrgueres) foi feito em chapa elétrica tipo grill,
até que as mesmas atingissem a temperatura interna de 72°C por 4 a 5 minutos.
57
3.14.2 Teste de aceitação e caracterização sensorial com consumidores
Para a avaliação foram recrutados 81 consumidores de hambúrguer dentre os
alunos e funcionários do Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição da
ESALQ/USP, sem restrições quanto ao sexo, idade e frequência de consumo, das
classes sociais A/B/C, segundo o Critério Padrão de Classificação Econômica Brasil
2015 (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE EMPRESAS DE PESQUISA, 2015).
Foram servidas monádicamente as 5 amostras usando um delineamento
completo balanceado, numerando os pratos com a amostra com algarismos de 3
dígitos. Os consumidores indicaram sua aceitabilidade utilizando uma escala
hedônica híbrida de 10 pontos, ancorada em 0=desgostei extremamente; 5=Nem
gostei nem desgostei e 10=gostei extremamente (VILLANUEVA, 2005).
Além do teste de aceitabilidade, foi aplicada a metodologia CATA (Check All
That Apply), traduzida como: “marque tudo o que aplique" (ARES et al., 2010). Para
o levantamento dos atributos usados no CATA, foi usado o método de rede com
consumidores, onde foi solicitado aos consumidores que descrevessem com a
seleção de características apropriadas para descrever cada amostra. Em seguida foi
pedido aos consumidores que marcaram as características que eles considerassem
como um produto idealizado descrito como “um hambúrguer com as caraterísticas
sensoriais ideais” (WORCH, 2010). Os atributos solicitados para descrição das
amostras e de um produto ideal foram: cor típica de frango, cor não típica de frango,
odor de pimenta, odor de ranço, odor estranho, odor característico, sabor de
pimenta, sabor de vinagre, sabor característico de hambúrguer, sabor não
característico de hambúrguer, sabor de ranço e aparência característica de
hambúrguer (Anexo A). Os atributos foram aleatorizados para cada amostra e para
cada provador de acordo ao recomendado por Ares et al. (2014).
3.14.3 Análise de dados sensoriais
Os dados da aceitação serão avaliados utilizando análise de variância de
duas vias (provador e amostra). Caso em que as diferenças entre as amostras foram
significativas, se realizou uma comparação de medias usando a diferença
honestamente significativa de TUKEY (HSD) com nível de significância de 5%. Os
dados coletados pelo CATA foram avaliados por Analise de Penalização, análise de
Q de Cochran e os dados que apontaram diferença significativa entre as amostras
foram consideradas na Análise de Correspondência.
58
59
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Teor de compostos fenólicos totais
Os teores de compostos fenólicos totais dos extratos de resíduos de película
de amendoim e de pimenta rosa, adicionados no produto reestruturado de frango
processada, apresentaram pequena variação de acordo com cada extração. Para o
cálculo de concentração de fenólicos totais a serem adicionados nos filmes ativos e
na carne processada de frango foi necessário determinar a concentração de
compostos fenólicos totais (CFT), expressos como ácido gálico (AG), contidos nos
resíduos agroindustriais. Os valores médios do conteúdo de fenólicos totais obtidas
a partir dos resíduos de pimenta rosa e película de amendoim estão apresentados
na Tabela 4.
Tabela 4 – Média ± desvio padrão do conteúdo de fenólicos totais dos extratos de resíduos agroindustriais
Extrato Média
Resíduos de película de amendoim (mg AG/mL) 11,96 ± 0,10
Resíduos de película de amendoim (mg AG /g) 107,69 ± 0,92
Resíduos de pimenta rosa (mg AG /mL) 5,88 ± 0,041
Resíduos de pimenta rosa (mg AG /g) 45,01 ± 0,54
mg AG/g: miligramas de ácido gálico por gramas de resíduo agroindustrial mg AG/mL: miligramas de ácido gálico por mililitros de solução Todos os resultados apresentaram um coeficiente de variação < 1 % nas analises.
Os teores de compostos fenólicos totais obtidos a partir de extrato etanólico
de amendoim foram de 107,69 mg AG/ g de resíduo de película de amendoim.
Valores semelhantes ao presente estudo foram encontrados por Nepote, Grosso e
Guzmán (2002), que relataram teor de fenólicos totais em extrato etanólico de 114,8
mg AG/g de película de amendoim. A extração dos compostos fenólicos pode variar
de acordo com o tipo de solvente utilizado. O estudo realizado por Ma (2014),
utilizando acetona, obteve concentrações similares, a partir de 4 diferentes
tratamentos variando na faixa de 166-120 mg AG/g de película de amendoim.
No caso da pimenta rosa, o teor médio de compostos fenólicos totais
encontrado foi de 45,01 mg AG/g de resíduo. Este resultado é maior do que o valor
de 10,77 mg AG/g de amostra seca apresentado por Bertoldi (2006), e é similar ao
encontrado por Biazotto (2014), encontrou um teor de 49,51 mg AG/g . Bergamachi
(2012), verificou que o etanol de 80% (etanol: água), teve melhores efeitos como
60
solvente para resíduos de plantas. O conteúdo de CFT em resíduos agroindústrias
de película de amendoim e pimenta rosa, obtidos pela extração com etanol (80%),
foram de 112,54 mg AG/g de resíduo seco de película de amendoim e de 38,42 mg
AG/g de resíduo seco de pimenta rosa.
Os valores obtidos de CFT atenderam os resultados desejados em base ao
encontrado na literatura, sendo possível pela eficiente ação do solvente extrator. O
etanol (80 etanol: 20 água) é um composto com alta polaridade, caracterizado por
ser um bom solvente para compostos polares e apolares, como são os compostos
fenólicos. Assim, fatores externos como temperatura e tempo, favorecem a extração
dos CFT dos resíduos, concordando com o estabelecido por Bergamashi (2010).
Segundo o estudo realizado por Pagani et al. (2014), os principais compostos
fenólicos responsáveis pela ação antioxidante da pimenta rosa são os ácidos p-
cumárico, vanílinico, e ferúlico. Este mesmo estudo quantificou estes três compostos
principais e obteve valores de 4,49, 10,76, 3,94 mg/g de pimenta rosa,
respectivamente. A variação de concentração de CFT pode ocorrer devido a fatores
como o tipo de armazenamento, tipo de coleção e local de coleta dos resíduos.
Uma vez quantificado o conteúdo de compostos fenólicos dos extratos dos
resíduos de película de amendoim e pimenta rosa, na segunda etapa desta pesquisa
foram otimizadas as concentrações a serem incorporadas nos filmes ativos de
quitosana, tomando como limite superior a concentração de 90 mg AG/kg carne, que
é o menor valor permitido pela legislação brasileira para o antioxidante comercial
butilhidroxitolueno (BHT), até 100 mg / kg de carne (BRASIL, 1998).
4.2 Otimização da quantidade de antioxidante adicionada ao filme ativo de
quitosana para retardar oxidação lipídica
Para a primeira etapa da pesquisa, na qual objetivou-se a determinação da
concentração ótima de compostos fenólicos a ser adicionada no filme ativo de
quitosana, foram testadas várias concentrações, variando de 1 até 90 mg AG/kg de
carne. A avaliação da concentração ótima de extratos naturais de película de
amendoim e pimenta rosa a serem incorporados como antioxidantes nos filmes
ativos de quitosana foi realizada utilizando a análise de superfície de resposta, com
delineamento composto central rotacional. Os níveis utilizados e os ensaios
experimentais para o extrato de película de amendoim, em função das duas
61
variáveis independentes, tempo (zero até dez dias) e concentração (1 até 90 mg
AG/kg de carne), bem como a variável dependente (TBARS) são apresentados na
Tabela 5.
Tabela 5 – Valores codificados e reais das variáveis independentes para a resposta de oxidação lipídica (TBARS)
Ensaios
Concentração (mg AG/kg de carne)
Tempo (dias) TBARS
(mg MDA/kg amostra)
Valor Codificado Valor Real
Valor Codificado
Valor Real
Filme Quitosana + Extrato película
amendoim
1 -1 14 -1 1,5 3,68
2 -1 14 1 8,5 4,84
3 1 77 -1 1,5 3,58
4 1 77 1 8,5 4,66
5 -1,41 1 0 5 4,60
6 1,41 90 0 5 4,11
7 0 45,5 -1,41 0 3,10
8 0 45,5 1,41 10 5,67
9 0 45,5 0 5 4,29
10 0 45,5 0 5 4,34
11 0 45,5 0 5 4,31
Observa-se que com o decorrer do tempo de armazenamento e conforme a
diminuição da concentração do extrato, os valores de TBARS aumentaram. As
amostras no início do período de armazenamento apresentaram o valor mais baixo
de TBARS (3,10 mg AG/kg). Concentrações mais elevadas de antioxidante no filme
apresentaram valores reduzidos de TBARS (4,10 mg AG/kg).
Os efeitos estimados dos valores TBARS são mostrados na equação 1, sendo
que as duas variáveis, concentração (x) e tempo (y), apresentaram efeito quadrático
significativo e negativo (p≤0,05), indicando uma região de aumento da produção de
TBARS. O modelo, de acordo a regressão, foi:
𝑻𝑩𝑨𝑹𝑺 = 𝟑, 𝟑𝟐𝟐𝟗 + 𝟔, 𝟎𝟔𝟗𝟗 × 𝟏𝟎−𝟓𝒙 − 𝟑, 𝟏𝟖𝟑𝟐 × 𝟏𝟎−𝟓𝒙𝟐 + 𝟐, 𝟏𝟗𝟗 × 𝟏𝟎−𝟏𝒚 − 𝟑, 𝟒𝟔𝟓𝟒 ×
𝟏𝟎−𝟒𝒚𝟐 − 𝟏, 𝟔𝟖 × 𝟏𝟎−𝟒𝒙𝒚 (1)
A Tabela 6 apresenta a análise de variância (ANOVA) dos resultados obtidos.
O modelo de regressão foi significativo pois apresentou um F calculado maior do
62
que do F tabelado. Deste modo, este modelo poderia ser utilizado para predizer a
variável dependente, no caso de valor de TBARS.
Tabela 6 – Analise da variância para valores de TBARS produzidos.
Fonte de Variação
Soma de Quadrados
Graus de Liberdade
Média Quadrática
F cal F tab p
Regressão 4,429953 5 0,885991 14,36804 5,050329 0,005464
Resíduo 0,308320 5 0,061664
Falta de ajuste 0,307054 3 0,102351 161,6814 19,16429 0,006153
Erro puro 0,001266 2 0,000633
Total 4,738273 10 0,473827
R2 = 0,9349.
O coeficiente de correlação (R2) da regressão foi de 0,93, ou seja, uma
porcentagem de variação explicada pelo modelo de 93,49%, indicando que o mesmo
se ajusta bem aos resultados obtidos. O teste F da regressão mostra que o valor do
F calculado é maior que do F tabelado, indicando significância entre as variáveis. O
F da falta de ajuste também apresentou alta significância (p ≤ 0,05), mas este valor
não afetou a predição do modelo (Anexo B).
A Figura 17 mostra as superfícies de contorno e de resposta obtidas da
interação entre tempo e a concentração, na resposta da produção de TBARS como
medida de oxidação lipídica para os filmes com extrato de película de amendoim.
63
Figura 17 – a. Superfície de contorno do efeito tempo e a concentração do extrato de película de
amendoim no filme ativo sobre a produção de TBARS, b. Superfície de resposta da variável produção de TBARS
A
B
64
Observa-se que a produção de TBARS é maior em amostras de carne de
frango com uma concentração baixa de extrato de película de amendoim (< 45 5 mg
AG/kg) e quando o tempo de armazenamento foi maior (> 6 dias). A superfície de
contornos mostra que entre o quarto e quinto dia e no intervalo de concentrações de
1 à 45,5 mg AG/kg de carne, dois dos pontos analisados apresentaram uma iso-
resposta, o que indica que não há diferença significativa nessa faixa de
concentrações em relação aos valores de TBARS. A superfície de contornos e de
resposta também demostraram que a concentrações maiores a 45,5 mg AG/kg de
carne e depois do dia 5, as respostas de formação de TBARS começam a diminuir
proporcionalmente a este aumento da concentração. Nossos resultados mostraram
relação inversamente proporcional entre a concentração de antioxidante e a
produção de TBARS.
No tempo de armazenamento de 1,5 dias foram avaliadas duas
concentrações de extrato, onde foi possível perceber diferentes tipos de respostas,
mesmo em um período curto. Apesar da pequena diferença nos valores de TBARS,
as respostas mostraram que existia uma maior produção de TBARS em
concentração baixa (14 mg AG/kg de carne) quando comparada com a
concentração alta (77 mg AG/kg de carne).
No caso da pimenta rosa, a otimização da concentração de extrato também
foi determinada pela análise de superfície de resposta, utilizando delineamento
composto central rotacional e nas mesmas condições de tempo e concentração que
para otimização da concentração do extrato de película de amendoim. Na Tabela 7
apresentam-se os níveis utilizados e os ensaios experimentais, em função das duas
variáveis independentes, tempo (zero até dez dias) e concentração (1 até 90 mg
AG/kg de carne) e a variável dependente, a resposta com valor de TBARS.
65
Tabela 7 – Valores codificados e reais das variáveis independentes para resposta de oxidação lipídica
Tratamento
Concentração (mg AG/kg de carne)
Tempo (dias) TBARS
(mg MDA/kg amostra)
Valor Codificado
Valor Real
Valor Codificado
Valor Real
Filme Quitosana + Extrato pimenta
1 -1 14 -1 1,5 3,49
2 -1 14 1 8,5 4,32
3 1 77 -1 1,5 3,37
4 1 77 1 8,5 4,01
5 -1,41 1 0 5 4,75
6 1,41 90 0 5 3,74
7 0 45,5 -1,41 0 3,11
8 0 45,5 1,41 10 5,11
9 0 45,5 0 5 4,21
10 0 45,5 0 5 4,15
11 0 45,5 0 5 4,13
Os resultados indicam relação direta entre a maior concentração de extrato e
o menor valor de TBARS. Os valores mais baixos de TBARS foram verificados no
tempo zero (3,11 mg AG/kg) e em amostras de carne de frango em concentrações
mais elevadas do extrato de pimenta rosa (3,74 mg AG/kg).
Os efeitos estimados sobre a resposta de oxidação lipídica (TBARS) são
apresentados pela equação 2, sendo que as duas variáveis, concentração (x) linear
e quadrática, apresentaram efeito significativo negativo (p≤0,05), indicando uma
região de aumento da produção de TBARS.
𝑻𝑩𝑨𝑹𝑺 = 𝟑, 𝟐𝟖𝟓𝟓 − 𝟑, 𝟔𝟗𝟕 × 𝟏𝟎−𝟒𝒙 − 𝟓, 𝟒𝟔𝟎𝟔 × 𝟏𝟎−𝟓𝒙𝟐 + 𝟐, 𝟔𝟖𝟏𝟗 × 𝟏𝟎−𝟏𝒚 − 𝟗, 𝟔𝟎𝟗𝟖 ×
𝟏𝟎−𝟑𝒚𝟐 − 𝟒, 𝟏𝟕𝟒 × 𝟏𝟎−𝟒𝒙𝒚 (2)
A Tabela 8 apresenta a análise de variância (ANOVA) dos resultados obtidos.
O modelo de regressão foi significativo apresentando, F calculado maior que do F
tabelado. Deste modo, o modelo poderia ser utilizado para predizer a variável
dependente, no caso o valor de TBARS.
66
Tabela 8 – Analise da variância para valores de TBARS produzidos.
Fonte de Variação
Soma de Quadrados
Graus de Liberdade
Média Quadrática
F cal F tab p
Regressão 2,849045 5 0,569809 4,41257 5,050329 0,06451
Resíduo 0,645666 5 0,129133
Falta de ajuste 0,642232 3 0,214077 124,6821 19,16429 0,007967
Erro puro 0,003434 2 0,001717
Total 3,494710 10 0,349471
R2= 81,52%.
O coeficiente de correlação (R2) foi de 0,82, indicando que o mesmo se ajusta
bem a os resultados obtidos. O teste F da regressão mostra que o valor do F
calculado é menor que do F tabelado, indicando significância entre as variáveis. O F
da falta de ajuste apresentou alta significância (p ≤ 0,05), no entanto estes valores
não afetaram a predição do modelo. (Anexo C).
A Figura 18 mostra as superfícies de contorno e de resposta obtidas da
interação entre tempo e concentração na resposta de produção de TBARS como
medida de oxidação lipídica no filme com extrato de pimenta rosa.
67
Figura 18 – A. Superfície de contorno do efeito tempo e a concentração de extrato de pimenta rosa no filme ativo sobre a produção de TBARS, B. Superfície de resposta da variável produção de TBARS
A
B
68
É possível observar também que a produção de TBARS é maior quando
utiliza-se concentração baixa e quando o tempo transcorrido foi maior. Contrário a
superfície de contornos do extrato de película de amendoim (Figura 17), a superfície
de contornos da pimenta rosa (Figura 18), mostra que entre o quarto e quinto dia há
variação da resposta na faixa de concentrações que vão de 1 à 45,5 mg AG/kg de
carne, sendo que a área de maior concentração de antioxidante apresenta uma
menor produção de TBARS. A superfície de reposta demonstra que a relação entre
a concentração do extrato de pimenta rosa e a produção de TBARS é inversamente
proporcional.
Baseando-se na superfície de contornos, a resposta apresentada para as
amostras no quinto dia de armazenamento e com concentração de 1 mg AG/kg
(quase nula) foi de 3,74 mg MDA/kg, este valor é muito similar à resposta
apresentada após 8,5 dias em amostras com concentração de 77 mg AG/kg de
carne (4,01 mg MDA/kg carne). Considerando esse resultado, verifica-se que a
adição de 77 mg AG/kg de carne poderia prolongar a vida útil do produto já que
apresenta valores baixos de TBARS. Após 1,5 dias de armazenamento, as amostras
com concentração de 14 mg AG/kg apresentaram valor de TBARS de 3,49 mg
MDA/kg. Enquanto que as amostras com concentração de 90 mg AG/kg de carne e
um tempo de armazenamento de 5 dias, apresentaram valores próximo a esse (3,74
mg MDA/kg), indicando um ganho de 3,5 dias para o tratamento com 90 mg AG/kg.
Com base nas superfícies de respostas e de contornos, se comparamos a
eficiência do extrato de pimenta rosa e do extrato de amendoim como antioxidantes
naturais adicionados em uma embalagem de quitosana para aplicação em carne de
frango, podemos afirmar que o extrato de pimenta rosa foi mais eficiente (em função
da diminuição da oxidação lipídica), especialmente quando a concentração
adicionada é maior, sendo que o teor ideal foi de 90 mg AG/kg de carne.
Não foram encontrados estudos relacionados à adição de extratos de película
de amendoim ou pimenta rosa como antioxidantes em carnes ou em filmes de
quitosana. No entanto, existem vários estudos relacionados à incorporação de
outros extratos antioxidantes em filmes ativos de quitosana. Quin et al. (2013) e
Siripatrawan e Noipha (2012), comprovaram que a incorporação de extratos
polifenólicos de chá verde em filmes de quitosana (em concentrações de 30% de
extrato e 20% extrato, respetivamente) aplicados em hambúrgueres de porco
69
tiveram efeito significativo no retardo da oxidação lipídica. Georgantelis et al. (2007),
também demonstrou que a incorporação de extrato de alecrim (260 mg diterpenos
fenólicos/ kg de carne) em filmes de quitosana apresentaram efeito positivo para
retardar a oxidação lipídica, com reduções de até 87% do teor de malonaldeído em
comparação a um controle.
A adição de extratos vegetais no filme de quitosana se apresentou como uma
alternativa eficaz para retardar a oxidação lipídica, já que proporcionou caraterísticas
antioxidantes ao filme (PONCE et al. 2008), embora neste trabalho as
concentrações utilizadas foram mais baixas que das encontradas na literatura
demonstrou-se que teve uma boa eficiência inibindo a oxidação lipídica. Através dos
dados observados, existe a possibilidade de que, com o aumento das concentrações
de CFT (maiores das avaliadas neste estudo) através da maior adição de volume
dos extratos de película de amendoim e pimenta rosa, possam ainda ser obtidos
melhores resultados.
Na literatura não foram encontrados estudos utilizando metodologia de
superfície de resposta com condições variáveis de concentração de antioxidante e
tempo na avaliação da produção de TBARS. Neste estudo, a metodologia de
superfície de resposta permitiu avaliar as concentrações ideais de extrato de
resíduos para aplicação no filme ativo de quitosana, indicando ótimos resultados
para as concentrações mais altas estudadas além de indicar a possibilidade de que
maiores concentrações dos extratos estudados (> 90 mg AG/kg) possam resultar em
valores ainda mais baixos de TBARS.
Neste estudo, pudemos observar que as regiões da superfície que
apresentaram a menor produção de TBARS foram as que indicavam as
concentrações mais altas de extrato antioxidante (90 mg AG/kg de carne). Dessa
forma, foram selecionadas da região ótima da superfície de resposta, e de forma que
as concentrações de extratos de ambos resíduos a foram as utilizadas na próxima
etapa deste estudo. Assim, para o extrato de película de amendoim foi selecionada a
concentração de 80 mg AG/kg de carne e no caso do filme de quitosana com adição
de extrato de pimenta rosa, o valor aleatório de concentração de extrato escolhido
foi de 90 mg AG/kg de carne. A concentração utilizada para o extrato de película de
amendoim foi mais baixo (80 mg AG/kg de carne) pois apresentou uma isso-
resposta, entre 80 e 90 mg AG/kg de carne, enquanto que para o extrato de pimenta
70
rosa apresento uma resposta com valores mais baixos de oxidação lipídica em 90
mg AG/kg de carne.
4.3 Caracterização dos filmes ativos de quitosana com extrato antioxidante
Os filmes de quitosana contendo os extratos antioxidantes de película de
amendoim e pimenta rosa, apresentaram elevada flexibilidade que ajudou para
evitar rasuras quando foram retirados das placas petri, assim também possuíram
aparências semelhantes entre eles. A coloração foi amarelada, com bastante
flexibilidade e uma textura lisa. Aparência era de filmes resistentes e moldados ao
tamanho do produto de carne reestruturado de frango.
Os filmes foram caracterizados quanto à espessura, solubilidade em água,
teor de umidade, barreira ao vapor d’água (Tabela 9) e propriedades mecânicas. A
caracterização dos filmes foi realizada na segunda etapa do experimento, utilizando
as concentrações de 80 mg AG/ kg carne para o extrato de película de amendoim e
90 mg AG/ kg de carne para o extrato de pimenta rosa.
Tabela 9 – Média ± desvio padrão dos valores de espessura, solubilidade em água, teor de umidade
e permeabilidade ao vapor de água para os filmes ativos de quitosana.
Tipo de Filme Espessura
(mm) Solubilidade
em água (%)
Umidade (%)
TPVA (gmm/m
2hkPa)
Quitosana + extrato de pimenta
0,063 ± 0,003 27,25 ± 0,27 20,18 ± 0,44 1.72 x 10-8
± 7,05x10-10
Quitosana + extrato de película
de amendoim 0,064 ± 0,003 27,12 ± 0,41 20,12 ± 0,82 1,77 x 10
-8 ± 7,94 x 10
-10
Todos os resultados apresentaram um coeficiente de variação < 5% nas analises. TPVA: Taxa de permeabilidade ao vapor d’água.
A espessura média dos filmes ativos de quitosana contendo extratos de
resíduos de película de amendoim (FA) e pimenta rosa (FP), foi similar, 0,063 mm e
0,064 mm, respectivamente. De acordo com o estudo realizado por Siripatrawan e
Harte (2010), no qual avaliaram a propriedades físicas dos filmes ativos de
quitosana (2 % m/v) com incorporação de extrato de chá verde, esses autores
obtiveram valor de espessura de 0,0628 mm, valores que são quase iguais aos
71
obtidos nesta pesquisa. A medição da espessura dos filmes mostra-se importante já
que é base para cálculo de alguns parâmetros de caracterização dos filmes.
O tipo de extrato antioxidante incorporado aos filmes de quitosana, não
alterou significativamente a solubilidade em água, sendo 27,25% para o FA e
27,12% para o FP. A solubilidade nos filmes é uma característica importante pois
indica o comportamento do filme em meio aquoso, também pode mostrar a
resistência à agua e além de ser um fator para medir a biodegradabilidade do filme
(GNANASAMBADAM, HETTIARACHCHY, COLEMAN, 1997). Martins et al. (2012)
avaliaram as propriedades dos filmes de quitosana (1,5 % m/v) com a incorporação
de diferentes concentrações de α-tocoferol (0, 0,1,0,2%) e comprovou-se que não
existiu diferença significativa na solubilidade pela adição deste composto, obtendo
solubilidades na faixa de 29,1-31,6 %. Wang et al. (2013) também estudaram
propriedades de filmes de quitosana (4 % m/v, em solução de 2 % v/v, de ácido
acético) com incorporação de polifenóis de chá em extrato aquoso em várias
concentrações (10, 20, 30, 40 %) esses autores determinaram que a solubilidade
estava na faixa de 25%. Estes resultados foram bastante parecidos aos obtido nesta
pesquisa.
Os valores do teor de umidade para FA foi de 20,18 % e para FP foi de 20,12
%. Sendo que o conteúdo de água na matriz filmogênica influencia nas propriedades
de barreira do filme, onde um aumento de concentração de água no filme ou de
temperatura implica movimento molecular, portanto nas propriedades de difusão
como a permeabilidade (MEHYAR, HAN, 2004). No estudo realizado por Van Beest
(2013), foi avaliada a aplicação de filmes de quitosana (1% m/v) com óleos
essenciais de orégano (CHO) e tomilho (CHT), sendo que o teor de umidade
encontrado para esses filmes foram de 24 % para o CHO e 23,7 % o CHT,
resultados similares aos obtidos neste estudo.
A permeabilidade ao vapor de água caracteriza a permeação do vapor de
água a uma temperatura estabelecida através da superfície do filme. Os resultados
para PVA foram também bastante similares para os dois tipos de filme: 1,72 x 10-5
para o FA e de 1,77 x 10-5 gmm/m2hkPa para o FP. A permeabilidade de um filme
depende da estrutura química e morfológica, natureza do material permeável e a
temperatura do ambiente. A baixa permeabilidade apresentada pelos filmes ativos
FP e FA pode ser devido ao fato que as interações covalentes entre a matriz da
quitosana e os compostos fenólicos, limitam a disponibilidade dos hidrogênios para
72
formar ligações hidrofílicas com a água, para posteriormente resultar diminuição da
afinidade do filme pela água (SIRIPATRAWAN, HARTE, 2010). Assim estudos
realizados por Martins et. al. (2012), avaliaram as propriedades dos filmes de
quitosana com a incorporação de diferentes concentrações de α-tocoferol (0,
0,1,0,2%) e obtiveram valores semelhantes a este estudo, na faixa de 6,0 - 7,3 x 10 -
-4 g m-1 h-1 kPa-1 pelo que corrobora nossos resultados.
4.3.1 Propriedades mecânicas
As propriedades mecânicas dos filmes ativos de quitosana forma medidas,
avaliando os parâmetros de tensão na ruptura (TS), elongação na ruptura (ξ) e
módulo de elasticidade (E).
Tabela 10 – Média ± desvio padrão dos valores dos parâmetros mecânicos para os filmes ativos de quitosana.
Tipo de Filme TS (MPa) ξ (%) E (GPa)
Quitosana + extrato de pimenta
16,40 ± 1,3 19,82 ± 1,7 0,12 ± 0,01
Quitosana + extrato de película de amendoim
18,84 ± 1,6 17,36 ± 0,6 0,12 ± 0,01
TS: Tensão na Ruptura; ξ: Elongação na ruptura; E: Módulo de elasticidade Todos os resultados apresentaram um coeficiente de variação < 10 % nas analises.
Os filmes contendo extrato de película de amendoim apresentaram maior
resistência e menor flexibilidade, representados pela maior TS e menor ξ, se
comparados com os filmes contendo extrato de pimenta rosa. Na comparação pelo
teste de t de Student para TS, não houve diferença significativa (p > 0,05), enquanto
para ξ houve diferença (p < 0,05) entre esses dois tipos de filmes ativos. O Módulo
de elasticidade, que indica a rigidez do material, não apresentou diferença
significativa entre os dois tratamentos. Yoshida e Oliveira (2009), reportaram valores
de TS de 21,15 MPa e ξ de 17,10 %, para filme de quitosana (1% m/v) com 0,25%
de glicerol, estando os resultados obtidos no presente trabalho dentro da faixa
encontrada para filmes de polímeros naturais com adição de glicerol.
Souza et al. (2010), avaliaram o efeito de campos elétricos sobre a estrutura
de filmes comestíveis de quitosana (1,5 % m/v), sendo que para o tratamento sem
aplicação de campos elétricos obteve TS de 14 MPa e ξ de 16 %, esses autores não
73
determinaram o valor do modulo de elasticidade. Bonilla et al. (2013) avaliaram as
propriedades mecânicas dos filmes de quitosana-amido de trigo com incorporação
de extratos de óleos essenciais, ácido cítrico e α tocofereol, sendo que o tratamento
com adição de ácido cítrico foi o que teve resultados mais próximos a este trabalho,
assim obtiveram valores de 34 MPa de TS, um ξ de 0,141 GPa, sendo que o único
valor que diferiu foi o de E, que obteve um 3%. Estas variações podem ser devidas a
vários fatores como: composição da quitosana e fonte de obtenção, presença de
plastificante, a preparação do filme e o armazenamento (SÁNCHEZ-GONZÁLEZ et
al., 2009). Park, Marsh, e Rhim, (2002), reportaram que a TS pode aumentar de
acordo com o peso molecular da quitosana, enquanto Ziani et al. (2008) fizeram
referência de que o aumento da TS e a ξ, estão relacionados com o grau de
desacetilação da amostra utilizada.
4.4 Composição Centesimal
Na segunda etapa do experimento, foi realizado em cada bloco experimental,
a caracterização físico-química da massa cárnea comum de todos os tratamentos
(sem adição dos extratos de resíduo). Na Tabela 11 apresentam-se a média dos
resultados da composição centesimal da massa cárnea utilizada.
Tabela 11 – Média mais ou menos o desvio padrão da composição centesimal (umidade, proteína, lipídeos e cinzas) da massa cárnea utilizadas nas repetições
Parâmetro Massa cárnea de sobrecoxas de frango
processado
Umidade (%) 73,46 ± 0,10
Proteína (%) 16,87 ± 0,08
Gordura (%) 7,82 ± 0,10
Cinzas (%) 1,05 ± 0,02
O coeficiente de variação para todas as repetições de cada parâmetro < 5%.
Os valores médios encontrados na caracterização da massa cárnea inicial
coincidem com os valores descritos pela Tabela Brasileira de Composição de
Alimentos (TACO; UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, 2006), a qual
apresentou para sobrecoxa de frango sem pele os valores de 72,7 % de umidade,
17, 6 % de proteína, 9,5 % de lipídeos, e 0,9% de cinzas.
74
4.5 Avaliação do pH
Os resultados de pH demonstraram que não houve diferença significativa (p >
0,05) entre os tratamentos avaliados, entre o tempo de armazenamento e nem a
interação entre eles (Anexo D). Todos os tratamentos apresentaram o mesmo
comportamento durante o tempo de armazenamento, onde se observa que no 4o dia
de armazenamento houve elevação dos valores de pH em relação ao tempo inicial,
seguido de queda no último dia de estocagem (7 dias de armazenamento).
Os valores de pH obtidos no final do período de armazenamento variaram na
faixa de 6,30 até 6,51. Embora o pH dos tratamentos com aplicação dos filmes
ativos tenham se apresentado mais elevados, não foi verificada diferença
significativa. As mudanças de pH nas carnes processadas estão sujeitas a vários
fatores como pH da solução de extrato, bactérias presentes na matéria prima,
condições de armazenamento, tipo de corte do frango. Os filmes de quitosana
possuem um pH baixo por serem preparados a base de ácido acético, enquanto que
os extratos de película de amendoim e pimenta rosa são fonte de compostos
fenólicos, sendo que muitos são ácidos fenólicos, como o ácido gálico, os quais irão
garantir caráter ácido ao extrato (LORENZO et al., 2014). Além disto, o aumento de
pH também pode ser explicado pelo aumento na produção de bases voláteis
produzidas por bactérias endógenas, que utilizam compostos de baixo peso
molecular, como aminoácidos da carnes, para decompô-las em amônia alcalina e
amônia e trimetilamina (MASNIYOM, BENJAKUL, VISESSANGUAN, 2002).
Na literatura não existe registro de estudos nos quais foram aplicados extratos
de pimenta rosa ou película de amendoim em carne ou em filmes ativos para
avaliação de pH. Porém existem vários estudos que avaliaram a aplicação de
extratos naturais em carne de frango. Selani et al. (2011) comprovaram que a adição
de extratos etanólicos de resíduos de uvas não alteraram significativamente (p >
0,05), os valores de pH de carne de frango crua apresentou valores de 6,5. Também
Teruel et al. (2015) não encontraram diferença significativa no valor de pH após a
adição de extrato de alecrim em nuggets de frango congelado, o qual apresentou
valor de pH igual a 6,35. Comparando estes valores encontrados na literatura,
verifica-se que os valores são similares aos obtidos neste estudo.
A incorporação de baixas concentrações de extratos de resíduos
agroindustriais na massa cárnea de frango processada, assim como em filmes ativos
de quitosana não alteraram o pH do produto, preservando a condição inicial de pH.
75
4.6 Cor instrumental
A cor da carne de frango foi avaliada pelos parâmetros de luminosidade (L*),
intensidade de cor vermelha (a*) e intensidade de cor amarela (b*). Os resultados
demonstraram que não houve efeito significativo (p > 0,05) entre os tratamentos e
nem efeito de interação tratamento versus tempo (Tabela 12). Isto indica que a
adição dos extratos diretamente na massa cárnea e no filme não alteraram a cor da
carne de frango processada.
Tabela 12 - Média ± desvio padrão dos parâmetros L*,b*,a* na carne crua de frango, segundo as interações de tempo e armazenamento
Parâmetr
o
Tratamentos
C AS MP MA FP FA
L* 68,67 ± 2,29a
67,93 ± 1,92a 66,66 ± 1,80
a 67,44 ± 2,22
a 67,61 ± 1,45
a 67,89 ± 1,71
a
a* 9,03 ± 1,38a 9,30 ± 0,99
a 9,41 ± 1,23
a 9,24 ± 1,04
a 9,35 ± 0,81
a 9,19 ± 1,00
a
b* 17,83 ± 0,96a 17,99 ± 1,26
a 17,58 ± 0,88
a 17,57 ± 1,26
a 18,11 ± 1,22
a 17,89 ± 1,13
a
Média seguida de letras representam diferencia estatística (p<0,05) entre os tratamentos pelo Teste de Tukey. C: Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
63
64
65
66
67
68
69
70
0 4 7
L*
Tempo (dias)
0
2
4
6
8
10
12
0 4 7
a*
Tempo (dias)
76
Figura 19 – Comportamento dos valores médios dos parâmetros L*, a* e b*, em relação ao tempo de
armazenamento.
Os parâmetros de cor da carne de frango não apresentaram diferença
estatisticamente significativa entre os tratamentos aplicados. Na Figura 19 observou-
se que após o tempo de armazenamento sob refrigeração, os valores do parâmetro
L* tiveram um aumento durante o tempo de refrigeração, o comportamento dos
valores de a* foi oposto ao observado para luminosidade L*, já que estes diminuíram
no final do período de armazenamento e os valores de b* não tiveram um
comportamento definido, já que no 4º dia houve incremento no valor e no 7º dia
houve redução. Apesar desses comportamentos, nenhum parâmetro de medição de
cor mudou significativamente. A baixa concentração de mioglobina presente na
carne de frango pode ter contribuído para que os valores de luminosidade não
mudem significativamente, assim como a presença de compostos antioxidantes
diminuem a velocidade de formação de MMb (GENOT et al. 1991).
Mesmo sem ter sido verificada diferença significativa entre os tratamentos,
observou-se queda na intensidade de cor vermelha (a*), a qual ocorreu
possivelmente devido à iniciação de oxidação lipídica, já que com ela inicia-se
também a oxidação dos pigmentos heme da carne, reduzindo sua cor vermelha
(O’GRADY et al., 2011). Muitas das modificações apresentadas na coloração de
produtos cárneos adicionando extratos de plantas dependem muito da natureza do
extrato. A diferença observada em valores de b* da carne pode ser atribuída aos
pigmentos presentes nos extratos naturais e não ao processo de oxidação
(FERNANDEZ-LOPEZ et al., 2005). A coloração avermelhada do extrato de película
de amendoim assim como a cor amarelada do extrato de pimenta rosa foram
16
17
18
19
0 4 7
b*
Tempo (dias)
77
insignificantes na coloração do produto, apesar de possuir considerável tonalidade
no extrato. A coloração vermelha escura do extrato de película de amendoim é
atribuída aos taninos presentes nesta matéria prima (O’KEEFE; WANG, 2006),
enquanto na pimenta rosa a coloração amarelada é atribuída à mistura de
compostos fenólicos, flavonoides e carotenoides (ALVAREZ-PARRILLA, et al. 2011).
Não existem trabalhos na literatura que relatem o comportamento da cor
instrumental de carne de frango crua que possui extrato de película de amendoim e
pimenta rosa, ou de aplicação em filmes ativos. Resultados similares aos obtidos
pelo presente trabalho foram também observados por Selani et al. (2011), estudando
carne de frango crua com aplicação de extratos de uva e Teruel et al. (2015),
avaliando a aplicação de extrato de alecrim (em vários solventes) em nuggets de
frango congelado, os quais não obtiveram diferença significativa entre os
tratamentos com antioxidantes naturais e o controle. Os resultados desses autores
obtiveram um comportamento semelhante ao que foi observado neste trabalho.
De forma geral, a adição de extratos naturais na massa cárnea e nos filmes
de quitosana para avaliação da cor apresentou efeitos positivos já que
instrumentalmente não houve modificação significativa da cor do produto.
4.7 Determinação da oxidação lipídica
Para determinação do estado oxidativo da gordura do produto reestruturado
de frango e cru, foram realizadas duas análises: índice de peróxido (POV) e valor de
TBARS (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). O POV avalia o estágio da
rancidez da gordura presente na carne antes de haver percepção organoléptica
(quantifica hidroperóxidos, que são os primeiros produtos da oxidação lipídica)
(CECCHI, 1999). O valor de peróxidos expressa, em miliequivalentes de oxigênio
ativo, a quantidade de peróxido contida em 1 kg de gordura (EUROPA, 2005). A
análise TBARS avalia as reações dos hidroperóxidos para dar origem a uma série
de produtos secundários da oxidação, sendo o malonaldeído (MDA) uma das
principais substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. A análise de TBARS é
expressa em mg de MDA por kg de produto. Os resultados obtidos para POV em
produto reestruturado de frango cru, durante 7 dias de estocagem estão
apresentados na Tabela 13, e a análise de variância indicou que houve diferença
significativa (p < 0,05) entre os tratamentos e entre os tempos de armazenamento.
78
Tabela 13 - Média ± desvio padrão do valor de POV (mg meq O2/kg de gordura) da carne de frango crua de acordo a tratamento e tempo de armazenamento
Tratamentos Tempo de armazenamento (dias)
0 4
7
C 2,48 ± 0,84
a 4,09 ± 0,92
d 6,81 ± 0,70
e
AS 2,49 ± 0,85
a 2,81 ± 0,88
ab 3,43 ± 0,92
bcd
MP 2,32 ± 0,79
a 2,49 ± 0,80
a 3,01 ± 0,82
abc
MA 2,45 ± 0,85
a 2,84 ± 0,86
ab 3,54 ± 0,70
bcd
FP 2,49 ± 0,80
a 3,01 ± 0,80
abc 3,52 ± 0,83
bcd
FA 2,45 ± 0,81
a 2,95 ± 0,74
abc 3,63 ± 0,80
cd
Médias seguidas de diferentes letras indicam diferencia significativa entre os tratamentos e no tempo (p<0,05), pelo Teste de Tukey. a,b,c,d,e: indicam diferença significativa para o tempo, considerando os tratamentos. C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
Logo após o processamento (tempo), observa-se que não houve diferença
significativa entre os tratamentos para os valores de POV. Neste período, a média
dos valores iniciais (dia inicial) para todos os tratamentos foi de 2,45 meq O2/kg de
gordura. Após 4 dias de armazenamento, observa-se que o tratamento C difere
significativamente dos demais tratamentos, e embora o tratamento MP tenha
apresentado o menor valor, este não foi estatisticamente diferente dos demais. No
último dia de armazenamento, o tratamento C apresentou valores significativamente
mais altos (6,81 meq O2/kg de gordura) quando comparado aos outros tratamentos.
Neste tempo de armazenamento o tratamento que apresentou o valor de POV mais
baixo foi o MP, com 3,01 meq O2/kg de gordura. Este comportamento indica que a
adição de antioxidantes na carne foi efetivo, já que diminuiu a velocidade de reação
da oxidação dos lipídeos, evitando formação em quantidades altas de
hidroperóxidos (Figura 20).
79
Figura 20 - A. Valores médios de POV para produto reestruturado de frango crua por tratamento e durante o tempo de armazenamento. C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
A ausência de adição de antioxidantes no controle aliado aos fatores
catalizadores de reações de oxidação, tais como presença de luz, tratamento
tecnológico, adição de sal no produto e alto teor de gordura, resultaram em aumento
na velocidade da oxidação e consequentemente aumento na velocidade de
produção de peróxidos. Este processo acontece devido à presença do oxigênio, que
na presença de ácidos graxos insaturados encontrados na gordura da carne de
frango, reagem com o sitio ativo da molécula que contém o ácido graxo, produzindo
um radical livre, que reage com outra molécula de oxigênio para a produção de
hidroperóxidos, que são considerados os primeiros produtos da oxidação de
gorduras (WONG, 1995). Estudo realizado por Sallam, Ishioroshi, Samejima (2004),
que avaliaram o efeito da adição de alho em diferentes concentrações como
antioxidante em salsichas de frango armazenados a 3°C e comparados com controle
e antioxidantes comerciais, obteve valores de índice peróxido na faixa de 10 – 11
meq O2/kg, após 6 dias para o controle e 5 – 6 meq O2/kg para os tratamentos com
adição de alho. Estes valores foram maiores que os encontrados pelo presente
estudo e esta diferença pode ser atribuída a maior efetividade dos antioxidantes
0
2
4
6
8
0 4 7
Ind
ice d
e P
eró
xid
o
Tempo (dias)
C AS MP MA FP FA
80
utilizados nesta pesquisa, assim como a erros sistemáticos das análises de POV e
devido à sensibilidade do método.
Waszkowiak e Dolata (2007) avaliaram o efeito do extrato de alecrim em
carne bovina processada armazenada a 4°C, e obtiveram valores de POV no
primeiro dia de armazenamento de 2,84 meq O2/kg para o controle e 1,87 meq O2/kg
para o tratamento com alecrim e após 3 dias de armazenamento, valores de 2,88
meq O2/kg para o controle e 1,92 meq O2/kg para o tratamento com alecrim. No
presente estudo, mesmo não havendo ponto de medição no 3º dia, no 4º dia os
valores de POV foram 4,09 meq O2/kg para o C e 2,49 meq O2/kg para o MP (valor
mais baixo de POV), os quais estão de acordo com os resultados de Waszkowiak e
Dolata (2007).
O POV é uma análise que pode ser alterada facilmente por vários fatores
externos, e dependendo da metodologia aplicada e das unidades em que os
resultados foram expressos, pode apresentar diversidade de erros sistemáticos que
podem alterar a resposta final. Assim, o índice peróxido não pode ser tomado como
única analise indicativa do estado oxidativo de uma amostra gordurosa. Isto se deve
ao fato de que os hidroperóxidos (compostos que são quantificados pela técnica)
são os primeiros compostos produzidos pela oxidação lipídica e sua estabilidade é
muito baixa, gerando vários produtos secundários que não são quantificados pelo
método, ocasionando, muitas vezes, falsos positivos sobre o estado oxidativo de um
produto. No entanto, um valor baixo de POV não necessariamente demonstra que
uma gordura não esteja oxidada. Nesse sentido Hęś, Korczak, Gramza (2007),
avaliaram as mudanças na oxidação lipídica de produtos cárneos congelados, e
verificaram que produtos que tiveram a adição de extrato de chá verde como
antioxidante e após 60 dias de armazenamento reportaram valores maiores que 25
meq O2/kg, enquanto que o valor de TBARS foi menor que 0,5 mg MDA/kg amostra.
Estes resultados demonstram que não existe uma relação direta entre estas
metodologias, mas que poderiam se complementar. Por esse motivo alguns autores
acompanham a avaliação do POV com outras técnicas que avaliem produtos
secundários da oxidação lipídica. A determinação das substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) é uma das mais utilizadas, além de ser altamente eficiente na
medição do estado oxidativo da gordura. Pois os hidroperóxidos e o malonaldeído (e
outros compostos reativos ao ácido tiobarbitúrico) se originam da mesma fonte, da
81
oxidação de ácidos graxos poli-insaturados, mas de diferentes fases do processo
(EL-ALIM et al., 1999), razão pela qual foram realizadas neste estudo.
Os valores determinados para oxidação lipídica medidos pelo valor de
TBARS, como complemento à análise anterior de POV, mostraram que houve
diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos e o controle, considerando
como fontes de variação, o tratamento, tempo de armazenamento e a interação
linear entre os dois.
De acordo com a Figura 21, o tratamento controle apresentou um valor mais
alto de TBARS (4,86 mg MDA/kg de amostra) ao final da estocagem (7 dias), em
comparação com os outros tratamentos. O tratamento MP apresentou valor de
TBARS mais baixo em relação as demais amostras, embora não houve diferença
significativa. Este comportamento possivelmente se deve ao fato da pimenta rosa
apresentar alta quantidade de taninos, biflavonóides e ácidos triterpênicos na casca
e de até 5% de óleo essencial formado por mono e sequiterpenos nos frutos e nas
folhas (LORENZI; MATOS, 2008). Assim as características oxido-redutoras dos
flavonóides, permitem atuar como redutores quelantes de metais de transição
(ARORA; NAIR; STRASTBURG, 1998).
Não foram encontrados trabalhos nos quais extratos de película de amendoim
e pimenta rosa foram adicionados sobre produto reestruturado de frango crua.
Estudos semelhantes realizados por Hoac et al. (2006), em peito de frango,
detectaram ao final do armazenamento por 6 dias e 8°C, valores de 0,1 -0,3 mg
MDA/ kg, valores estes que são bem menores que os apresentados neste estudo
pelo tratamento mais eficiente (MP) contra oxidação lipídica, o qual resultou em 1,75
mg MDA/kg. Esta diferença pode ser explicada pelos vários fatores que influenciam
a formação de compostos da oxidação lipídica, tais como luz, temperatura, oxigênio,
presença de ferro ou sais e nitritos adicionados (ANDERSEN et al. 2003).
Além disso, se considerarmos o tipo de corte da carne e a idade dos animais,
os resultados podem ser explicados, uma vez que o presente estudo foi realizado
utilizando sobrecoxas de frango, de animais abatidos com aproximadamente 45 dias
de idade, contendo aproximadamente 7,82% de gordura e expostos 1000 LX de luz,
que além catalisar reações de auto-oxidação dos lipídeos insaturados, muda a
configuração eletrônica do oxigênio incorporado no produto pelo processo
tecnológico, assim como o oxigênio presente no microambiente do hambúrguer, o
82
qual vai passar a um estado mais ativo, com efeito direto sobre os lipídeos para
oxidá-los (REGITANO-D’ARCE, 2006; BELITZ; GROSCH, 1999).
Figura 21 - Valores médios de TBARS para produto reestruturado de frango crua por tratamento e durante o tempo de armazenamento. C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
Para todos os tratamentos, o valor de TBARS aumentou com o tempo de
armazenamento. Este fato é devido à oxidação dos lipídeos e aos fatores de indução
para que este fenômeno aconteça, os quais foram discutidos previamente. O
tratamento controle apresentou o maior valor de TBARS ao final do tempo de
armazenamento.
Logo após o processamento dos hambúrgueres (tempo inicial) pode-se
observar que não existe diferença significativa entre os tratamentos em relação ao
valor de TBARS. No 4º dia de armazenamento foi observada diferença significativa
entre os tratamentos, onde o tratamento C apresentou valores significativamente
maiores que o tratamento MP (menor valor). Finalmente, no final do período de
armazenamento (7 dias) os valores TBARS foram significativamente diferentes.
Segundo a Tabela 14, existe diferença significativa no tempo para os valores de
TBARS considerando cada tratamento.
0
1
2
3
4
5
6
0 4 7
TB
AR
S
Tempo (dias)
C AS MP
MA FP FA
83
Tabela 14 - Média ± desvio padrão do valor de TBARS (mg MDA/kg de carne) da carne de frango crua de acordo a tratamento e tempo de armazenamento
Tratamentos Tempo de armazenamento (dias)
0
4 7
C 1,38 ± 0,73 ab
3,05 ± 0,36 cd
4,86 ± 0,81 e
AS 1,12 ± 0,79 a 1,92 ± 0,94
abcd 2,36 ± 0,83
abcd
MP 1,15 ± 0,64 a
1,47 ± 0,94 ab
1,75 ± 0,78 abc
MA 1,41 ± 0,87 ab
1,95 ± 0,73 abcd
2,43 ± 0,46 abcd
FP 1,33 ± 0,64 a 1,97 ± 0,91
abcd 2,89 ± 0,28
cd
FA 1,37 ± 0,74 ab
2,72 ± 0,33 bcd
3,14 ± 0,18 d
Médias seguidas de diferentes letras indicam diferencia significativa entre os tratamentos e no tempo (p<0,05), pelo Teste de Tukey. a,b,c,d,e: indicam diferença significativa para o tempo, considerando os tratamentos. C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
O tratamento C apresentou valores mais altos quando comparado com o
tratamento FA. Já os tratamentos AS, MP, MA e FP apresentaram resultados
similares entre eles. Isso indica que para o tempo final de armazenamento da carne
de frango, o melhor tratamento considerando os resultados da oxidação lipídica foi o
MP, que reduziu em 64% a oxidação, seguido do AS, MA, FP e FA, com reduções
de 51,4 %, 50 %, 41,5% e 35,4 dos valores de TBARS, respectivamente, sendo
todos esses valores referenciados ao valor da oxidação lipídica apresentada pelo
controle. Embora tenham sido aplicadas condições diferentes de estocagem,
estudos realizados por Selani et al. (2011), com aplicação de extrato de semente e
casca de uva (Isabel) sobre carne processada de frango crua congelada e após de 6
meses de estocagem, indicaram redução de 61% no valor de TBARS em relação ao
controle e Brannan e Mah (2007) também estudando extrato de uva (0,1%) sobre
carne de frango nas mesmas condições e reduziram em 59 % os valores de TBARS
em relação ao controle. Os resultados apresentados por estes estudos foram
similares às porcentagens obtidas pelos tratamentos aplicados neste estudo.
Com base nos tratamentos MP e FP, nos quais as concentrações de extrato
antioxidante de pimenta rosa utilizada foi a mesma, o tratamento MP apresentou 22
% mais eficiência contra oxidação lipídica que o FP; quanto aos extratos de película
de amendoim, o tratamento MA foi 14% mais efetivo; mesmo assim não houve
diferença estatística significativa entre cada par de tratamentos que possuem o
84
mesmo tipo de extrato. Este resultado nos permite afirmar que o uso de
antioxidantes em filmes ativos apresenta-se como uma alternativa viável de
aplicação na área de carnes em substituição à aplicação direta na massa cárnea, o
que poderia evitar mudanças sensoriais no produto final, sendo efetivo contra
oxidação lipídica.
As análises de TBARS e POV são medidas de controle de qualidade,
principalmente em óleos, gorduras e também em alimentos que possuam os
mesmos na sua composição. Além disso, estas duas análises avaliam os dois
primeiros produtos da oxidação lipídica: em primeiro lugar a formação dos
hidroperóxidos e em segundo a formação de malonaldeído, que é um aldeído
produto da quebra desses hidroperóxidos.
Os estudos da rancidez são fundamentais para manutenção da qualidade e
vida útil devido à produção de produtos sensorialmente indesejáveis e a oxidação de
vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos essenciais, reduzindo valor nutricional dos
alimentos gordurosos (CECCHI, 1999). O estudo da estabilidade oxidativa do
produto reestruturado de frango cru, demonstrou que pequenas quantidades de
antioxidantes podem produzir mudanças significativas, retardando velocidades de
reação da oxidação lipídica (e formação de produtos iniciais, intermediários e finais),
ajudando assim a preservar suas características físicas, químicas e sensoriais
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1995).
4.8 Avaliação microbiológica
As avaliações microbiológicas foram feitas após o processamento (tempo
inicial) e depois de 4 e 7 dias de armazenamento, para micro-organismos mesófilos
(MMA) e psicrotróficos aeróbios (MPA). Os valores da contagem microbiológica
demonstraram que não houve diferença significativa entre os tratamentos (p > 0,05).
A Figura 22 representa os valores logarítmicos da contagem após 0, 4 e 7 dias de
estocagem.
85
Figura 22 – Valores médios de log UFC/g de microrganismos mesófilos da produto reestruturado de
frango crua por tratamento e durante o tempo de armazenamento. C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
Apesar de não ter sido verificada diferença significativa entre os tratamentos,
os tratamentos FP e FA, apresentaram menor crescimento microbiano para
mesófilos aeróbios (4,82; 4,76 log UFC/g) ao final dos sete dias de estocagem.
Nestes tratamentos foram recobertos com os filmes ativos de quitosana e este efeito
de diminuição de crescimento microbiano pode ter se dado pela ação sinérgica do
filme de quitosana com os extratos ativos de pimenta e película de amendoim.
Nesse sentido, pode-se justificar à marcada atividade antimicrobiana da quitosana,
que devido à presença de grupos amino que se encontram carregados
positivamente pode interagir com as membranas das células bacterianas, que
estiveram carregadas negativamente, provocando danos irreversíveis na célula
bacteriana por perda de componentes intracelulares que constituem o
microrganismo, concordado com o estudo realizado por Kanatt et al. (2012).
Não existem pesquisas na literatura que relatem o uso dos mesmos tipos de
extratos avaliados que os utilizados na presente pesquisa, mas sim com filmes
ativos de quitosana. Petrou et al. (2012) avaliaram a atividade antimicrobiana, após
9 dias e os resultados obtidos mostraram que o tratamento de quitosana com óleo
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
0 4 7
Mesó
filo
s, lo
g U
FC
/g d
e a
mo
str
a
Tempo (dias)
C AS MP
MA FP FA
86
de orégano apresentou valores mais baixos de contagem microbiana, reduzindo o
crescimento de MMA em até 3,0 log UFC/g quando comparado com o controle (sem
adição de quitosana nem óleo de orégano). Georgantelis et al. (2007), avaliaram o
efeito antimicrobiano de extrato de alecrim e quitosana adicionados em salsichas de
porco, onde após 10 dias de armazenamento, a contagem de MMA do tratamento
que continha extrato de alecrim e quitosana conseguiu reduzir até 2,1 log UFC/g
quando comparado ao controle (sem nenhum dos três compostos). Os resultados
apresentados por esses autores estão de acordo com resultados do presente
trabalho, em que os tratamentos FP e FA, apesar de não terem apresentado
diferença significativa em relação aos outros tratamentos após sete dias diminuíram
1,2 log UFC/g o crescimento de MMA.
Em relação ao crescimento de micro-organismos psicrotróficos aeróbios
(MPA), houve diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos e no tempo de
avaliação. A Figura 23 mostra os valores médios da contagem de MPA em log
UFC/g de amostra versus tempo de estocagem.
Figura 23 - Valores médios de log UFC/g de microrganismos psicrotróficos para produto reestruturado de frango crua por tratamento e durante o tempo de armazenamento. C:Controle, AS: Antioxidante Sintético, MP: Massa Pimenta, MA: Massa amendoim, FP: Filme Pimenta, FA: Filme Amendoim.
2
3
4
5
6
7
8
0 4 7
Psic
rotr
ófi
co
s l
og
UF
C/g
Tempo (dias)
C AS MP MA FP FA
87
Observa-se que no tempo inicial os valores iniciais (aproximadamente 3 log
UFC/g) da contagem microbiológica foram muito parecidos, os quais foram
aumentando durante o tempo de avaliação. No 4º dia de armazenamento os
tratamentos FP e FA (com filme ativo) apresentaram valores significativamente mais
baixos de contagem microbiana quando comparados com os outros tratamentos. O
tratamento MA apresentou o valor mais alto (mas não significativos). Finalmente no
tempo final no 7º dia, os tratamentos FP e FA também mostraram valores (4,01; 4,02
log UFC/g) significativamente mais baixos de contagem de MPA quando
comparados com os outros tratamentos, sendo que o tratamento que apresentou
maior contagem foi o AS (6,63 log UFC/g).
Este resultado está de acordo com o relatado anteriormente para os MMA.
Dessa forma, assume-se que o mecanismo de ação da quitosana é análogo ao
mecanismo de ação sobre os MPA. Segundo o estudo de Melo et al. (2012), que
avaliou a atividade de óleo essencial de alecrim incorporado em filme de celulose
aplicado em carne de frango refrigerada (2 ± 2°C), os valores da contagem de MPA
foram < 1 log UFC/g para todos os tratamentos no começo da avaliação e de 6,86
log UFC/g para o tratamento com maior atividade microbiana (50% de óleo essencial
de alecrim no filme de celulose) após 6 dias de armazenamento. Os resultados
apresentados por esses autores são maiores que os observados neste estudo
provavelmente devido a maior eficiência dos filmes de quitosana como agentes
antimicrobianos. Higueras et al. (2014), avaliaram a atividade de filmes de
quitosana/ciclodextrina com incorporação de cravacrol em filés de frango. Após 9
dias de estocagem os resultados da contagem de MPA foram de 4,8 log UFC/g para
o melhor tratamento, enquanto que para o controle (sem componentes ativos) foi de
6 log UFC/g. Os resultados apresentados por esses autores são apenas maiores
aos resultados obtidos neste trabalho, o que pode ser possivelmente explicado
devido ao fato de que os tempos da contagem do estudo foram maiores (9 dias) que
os realizados em nosso estudo (7 dias).
Segundo descrito anteriormente pode-se afirmar que a quitosana tem efeito
antimicrobiano sobre MMA e MPA, e seu espectro de aplicação como antimicrobiano
é amplo contra muitos tipos de microrganismos. Os resultados obtidos neste
trabalho permitem comprovar que, a tecnologia de incorporação de extratos
antioxidantes nos filmes ativos de quitosana como embalagem do produto
reestruturado de frango, se apresenta como uma tecnologia altamente eficiente,
88
revelando que além de atuar contra oxidação lipídica pode também retardar
significativamente o crescimento microbiano.
O poder antimicrobiano dos filmes ativos desenvolvidos pode ser ainda mais
amplo, pois tem uma atividade comprovada contra E. coli O157:H7 (LIU et al.2009),
L. monocytogenes (ROBERTS; GREENWOOD, 2003), bactérias Gram positivas e
Gram negativas (NO et al. 2002). B. Cereus, S. aureus, S. typhimurium (PRANOTO;
RAKSHIT; SALOKHE, 2005), pelo que provavelmente e de acordo com os estudos
desses autores, a utilização de maiores concentrações de extratos de pimenta rosa
e película de amendoim poderiam potencializar a atividade antimicrobiana dos filmes
de quitosana.
Antes da análise sensorial, tomou-se o cuidado de realizar estudos
microbiológicos para microrganismos patogênicos, garantindo a segurança alimentar
do experimento. A Tabela 15 apresenta as contagens microbiológicas para os
tratamentos C, MP, e FP, os quais apresentaram valores de oxidação lipídica mais
baixos, além de um controle e um produto de carne processada de frango comercial
(CM), que foram avaliados sensorialmente.
Tabela 15 – Contagem de microrganismos patogênicos para os tratamentos que foram avaliados sensorialmente
Determinações C CM MP FP Padrão
Clostridios sulfito redutores a
46ºC (UFC/g) <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 <1,0x10 3,0x10
3
Coliformes a 45°C (NMP/g) 3,6 9,2 3,6 3,6 5,0x103
Estafilococos coagulase
positiva (UFC/g) <1,0x10
2 <1,0x10
2 <1,0x10
2 <1,0x10
2 5,0x10
3
Salmonella spp. (em 25g) Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente
UFC – Unidades formadoras de colônias; NMP – Número Mais Provável; (est) – contagem estimada.
Observa-se que todos os valores de contagem microbiana se apresentaram
satisfatórios de acordo com a legislação brasileira RDC nº 12, de 12 de janeiro de
2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (BRASIL, 2001), que estabelece
para produtos de carnes cruas, preparadas de aves, o limite de 5x103 NMP/g de
coliformes a 45°C, 5x103 UFC/g de estafilococos coagulase positiva, 3x103 UFC/g de
clostrídios sulfito redutores e ausência de Salmonella spp. em 25 g.
89
4.9 Avaliação sensorial
4.9.1 Aceitabilidade geral
A aceitabilidade de um produto é um parâmetro muito importante para ser
avaliado, pois os consumidores julgam a aceitabilidade de um produto baseado no
sabor ao invés de outras características, como benefícios na saúde. (LUCKOW;
DELAHUNTY, 2004). Segundo a Figura 24 os cinco hambúrgueres apresentaram
um nível médio-alto de aceitabilidade com escores próximos e acima de seis,
considerado como limite comercial. Para um nível de confiança de 95 % pode-se
afirmar que não existiram diferenças significativas nos escores médios de
aceitabilidade das cinco amostras avaliadas, o que indica que ocasionaram o
mesmo nível de aceitação na população de consumidores considerada, embora as
amostras não diferiram significativamente na aceitabilidade geral, foi observado uma
tendência onde a amostra MP apresentou uma menor aceitabilidade média
manifestando uma atitude hedônica média (próxima ao 5). Esses resultados podem
ser estar relacionados a incorporação do extrato bioativo de pimenta rosa direto na
massa cárnea, podendo ter gerado sabores estranhos aos palatos dos
consumidores. Uma análise mais detalhada é apresentada no item de
Caracterização sensorial utilizando as perguntas CATA.
Figura 24 – Média dos escores da aceitabilidade dos cinco hambúrgueres avaliados FP: Filme pimenta, CM1: amostra comercial 1, MP: Massa pimenta, C: Controle, CM2: amostra comercial 2.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
FP CM1 C MP CM2
Aceit
ab
ilid
ad
e
Tratamentos
90
4.9.2 Caracterização sensorial utilizando perguntas CATA
A metodologia CATA consistiu em apresentar aos consumidores uma lista de
termos, da qual selecionaram aqueles que consideraram apropriados para descrever
os hambúrgueres avaliados (VARELA; ARES, 2012). Na Tabela 16 apresenta-se a
frequência de menção de todos os atributos e tratamentos, segundo a resposta dos
consumidores utilizando a pergunta CATA (Anexo A). Foram considerados 12
termos descritores segundo a experiência do grupo envolvido nesta pesquisa, assim
como testes prévios utilizando o método de rede com 12 consumidores.
Tabela 16 – Tabela de contingência dos termos sensoriais utilizados nas perguntas CATA para todas as amostras
Atributos Tratamentos
FP CM1 C MP CM2 Ideal
Cor típica de frango 64 65 66 65 59 77
Odor estranho 17 9 9 21 14 2
Sabor característico de hambúrguer
43 43 50 26 34 73
Sabor vinagre 1 1 1 13 3 2
Sabor ranço 7 10 5 5 11 2
Cor não típica de frango 10 8 13 11 9 0
Odor de pimenta 4 4 5 12 1 9
Odor de ranço 3 4 6 2 5 2
Sabor não característico 28 22 19 29 34 1
Aparência característica 50 52 49 41 48 72
Odor característico 45 49 48 35 44 62
Sabor de pimenta 17 11 21 44 13 17
FP: Filme pimenta, CM1: amostra comercial 1, MP: Massa pimenta, C: Controle, CM2: amostra comercial 2.
Seis dos doze atributos avaliados foram significativos segundo o teste Q
Cochran (Tabela 17), o que indica discriminação intermediária por parte dos
consumidores, sugerindo que esta metodologia permitiu detectar diferenças na
percepção dos consumidores sobre os hambúrgueres de frango avaliados.
91
Tabela 17 – Teste Q Cochran dos termos sensoriais usados nas perguntas CATA para todas as amostras
Atributos Valores-p FP CM1 C MP CM2
Cor típica de frango 0,578 0.790 a 0.802
a 0.815
a 0.802
a 0.728
a
Odor estranho 0,032 0.210 a 0.111
a 0.111
a 0.259
a 0.173
a
Sabor característico de hambúrguer 0,002 0.531
ab 0.531
ab 0.617
b 0.321
a 0.420
ab
Sabor vinagre 0,000 0.012 a 0.012
a 0.012
a 0.160
b 0.037
a
Sabor ranço 0,332 0.086 a 0.123
a 0.062
a 0.062
a 0.136
a
Cor não típica de frango 0,731 0.123 a 0.099
a 0.160
a 0.136
a 0.111
a
Odor de pimenta 0,006 0.049 ab
0.049 ab
0.062 ab
0.148 b 0.012
a
Odor de ranço 0,568 0.037 a 0.049
a 0.074
a 0.025
a 0.062
a
Sabor não característico 0,094 0.346 a 0.272
a 0.235
a 0.358
a 0.420
a
Aparência característica 0,284 0.617 a 0.642
a 0.605
a 0.506
a 0.593
a
Odor característico 0,137 0.556 a 0.605
a 0.593
a 0.432
a 0.543
a
Sabor de pimenta 0,000 0.210 a 0.136
a 0.259
a 0.543
b 0.160
a
FP: Filme pimenta, CM1: amostra comercial 1, MP: Massa pimenta, C: Controle, CM2: amostra comercial 2,
Os termos “Odor estranho”, “Sabor característico de hambúrguer”, “Sabor de
vinagre”, ”Odor de pimenta”, “Sabor de pimenta”, foram significativos, indicando que
os consumidores perceberam diferenças (Teste Q de Cochran; p<0,05) entre as
amostras. Estas diferenças resultaram do fato de que os provadores selecionaram
distintos termos, provavelmente devido à adição de extrato de pimenta rosa na
massa ou no filme. Sendo que o hambúrguer ideal de frango foi descrito com a
presença dos seguintes atributos: cor típica de frango, sabor característico de
hambúrguer de frango, sabor de pimenta, aparência típica, odor característico.
Na Figura 25, é mostrada a representação dos atributos e das amostras nas
duas primeiras dimensões da Análise de Correspondência, realizada sobre os
resultados da pergunta CATA. As duas primeiras dimensões da análise conseguiram
explicar 92,99% da inércia dos dados experimentais.
92
Figura 25 – Representação dos atributos e das amostras nas duas primeiras dimensões da Analise de Correspondência das perguntas CATA.
A representação das amostras na Análise de Correspondência (Figura 25),
permite diferenciar claramente 3 grupos com características sensoriais diferentes. O
primeiro grupo formado pela amostra “Ideal” (imaginária), a qual foi correlacionada
com os seguintes atributos: “Sabor característico de hambúrguer”, “Aparência
característica” e “Odor característico”. O segundo grupo formado pelas amostras
CM1, CM2, C, e FP, foram correlacionadas com os atributos: “Odor de ranço”,
“Sabor de ranço”, “Cor típica de frango”, “Odor característico”, “Aparência
característica”, “Sabor de ranço” e “Cor não típica de frango”. O terceiro grupo
esteve formado pela amostra MP, a qual foi correlacionada com os seguintes
atributos: “Sabor de pimenta”, “Sabor de vinagre”, e “Odor de pimenta”. Estes
atributos não fazem parte de um produto ideal descrito pelos consumidores. Por
esse motivo as amostras (MP) que apresentaram essas características tiveram uma
queda na aceitabilidade. Sendo que a adição de extratos pode diminuir a
aceitabilidade de um produto, como já foi constatado por alguns autores. Selani et al.
(2011), encontraram um efeito significativo na alteração do sabor quando foi
adicionado extrato de uva em carne de frango congelada. Os tratamentos foram
percebidos como “sabor de carne de frango altamente alterado”. Por outro lado,
Siripatrawan e Noipha (2012), reportaram que quando foi incorporado extrato de chá
Cor tipica de Frango
Odor Estranho
Sabor Caracteristico de
Hamburguer
Sabor vinagre
Sabor ranço
Cor não tipica de frango
Odor de Pimenta
Odor de ranço Sabor não Caracteristico
Apariência Caracteristica
Odor caracteristico
Sabor de pimenta
FP CM1
C
MP
CM2
Ideal
-0,5
-0,3
-0,1
0,1
0,3
0,5
0,7
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Dim
2 (
31.5
1 %
)
Dim 1 (61.48 %)
93
verde em filmes de quitosana usados como revestimento em salsichas de porco,
houve diminuição na aceitabilidade do odor.
Na Figura 26 pode-se observar que os atributos que estão perto da
“Aceitabilidade”, que contribuem positivamente na sua aceitação. Assim os atributos
“Sabor característico de hambúrguer” e “Odor característico” contribuem para a
aceitabilidade, enquanto que os atributos: “Sabor não característico” e “Odor
estranho”, e não contribuem com a aceitabilidade do produto.
Figura 26 – Representação dos atributos e da aceitabilidade da Analise de Coordenadas Principais das perguntas CATA
A Figura 27 mostra os gráficos da queda da aceitabilidade em função da
porcentagem de consumidores, que descreveram cada amostra de forma diferente
para o hambúrguer ideal. Segundo Agudelo, Varela e Fiszman (2015), os atributos
com sinal (-) indicam que aquele atributo não esteve presente na amostra real e sim
na amostra “Ideal”, porém é um atributo que deveria estar presente na amostra real.
Assim os atributos: “Sabor característico”, “Aparência característica” “Odor
característico” e “Cor típica de frango” causaram diminuição da aceitabilidade maior
que 1, numa escala hedônica híbrida de 10 cm, percebida por mais de 20 % dos
consumidores. Por outro lado, o sinal (+) indica que o atributo esteve presente na
amostra real e não na “Ideal”, porém é um atributo que não deveria estar na amostra
real. A presença do atributo “Sabor não característico” provocou diminuição da
aceitabilidade maior que 1 numa escala hedônica híbrida de 10 cm, percebida por
Cor tipica de Frango
Odor Estranho
Sabor Caracteristico de
Hamburguer
Sabor vinagre
Sabor ranço
Cor não tipica de frango
Odor de Pimenta
Odor de ranço
Sabor não Caracteristico
Apariência Caracteristica
Odor caracteristico
Sabor de pimenta
Aceitabilidade
-1
-0,5
0
0,5
1
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5Dim
. 2
Dim. 1
94
mais de 20 % dos consumidores. A partir dos resultados foi demonstrado que a
aplicação de antioxidantes diretamente no produto reestruturado de frango pode
levar à redução em sua aceitabilidade. Assim, a tecnologia de filmes ativos com
incorporação de extratos apresenta-se como uma alternativa viável, já que os
resultados mostraram que aplicação de filmes com extratos no produto não gerou
sabores nem odores residuais, motivo pelo qual foram similares ao controle negativo
(sem adição de extratos nem filme).
Cor tipica de Frango
Sabor Caracteristico
de Hamburguer Odor de Pimenta
Apariência Caracteristica
Odor caracteristico
Sabor de pimenta
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 20 40 60 80 100
Qu
ed
a d
a a
ceit
ab
ilid
ad
e
Porcentagem de consumidores
A
95
Figura 27 – Queda da aceitabilidade em função da porcentagem de consumidores que descreveram
as amostras de forma diferente que a amostra ideal. A: (-) indica que os atributos não estavam presentes nas amostras e sim no ideal, B: (+) indica que os atributos estavam presentes nas amostras mas não no ideal.
Portanto, para que as amostras tenham maior aceitabilidade, tem que
apresentar os seguintes atributos: “Sabor característico”, “Aparência característica”
“Odor característico”, “Cor típica de frango” e ter ausência do atributo “Sabor não
característico”.
Cor tipica de Frango
Odor Estranho
Sabor vinagre
Sabor ranço
Cor não tipica de frango
Odor de Pimenta
Odor de ranço
Sabor não Caracteristico
Sabor de pimenta
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 20 40 60 80 100
Qu
e d
a a
ceit
ab
ilid
ad
e
Porcentagem de consumidores
B
96
97
5 CONCLUSÕES
As concentrações ótimas de extratos de resíduos agroindustriais (película de
amendoim e pimenta rosa) para inibição da oxidação lipídica estiveram nas faixas de
80 - 90 mg AG/ kg de amostra, para ambos os extratos;
O tratamento de filme de quitosana com adição de extrato de pimenta rosa
(FP) apresentou maior eficiência contra a oxidação lipídica em relação ao tratamento
de filme de quitosana com adição de extrato de película de amendoim (FA);
O tratamento de massa cárnea com adição de extrato de pimenta rosa (MP),
com incorporação do extrato de pimenta rosa diretamente na massa cárnea do
produto restruturado de frango, foi o tratamento que apresentou melhor atividade
antioxidante, produzindo valores de oxidação lipídica mais baixos, embora não
significativamente diferentes dos outros tratamentos com adição de antioxidantes
naturais e sintéticos no filme e na massa cárnea (controle, massa amendoim, filme
amendoim, filme pimenta, antioxidante sintético);
Os tratamentos FP e FA, com incorporação de extratos de pimenta rosa e
película de amendoim no filme de quitosana, respectivamente, foram os melhores
tratamentos do ponto de vista microbiológico, diferenciando-se significativamente
dos outros tratamentos;
Os extratos de resíduos agroindustriais aplicados tanto no filme ativo de
quitosana como diretamente no produto reestruturado de frango não alteraram nem
o pH e nem a cor das amostras;
A adição de dos extratos antioxidantes na massa cárnea e no filme ativo de
quitosana não produziram queda na aceitabilidade sensorial do produto
reestruturado de frango;
Neste estudo conseguiu-se desenvolver filmes ativos de quitosana com
adição de extratos de resíduos agroindustriais brasileiros, com potencial atividade
antioxidante e antimicrobiana, sem influenciar negativamente a aceitabilidade
sensorial. Na incorporação de extratos antioxidantes de película de amendoim (MA),
pimenta rosa (MP) e antioxidante sintético BHT (AS) diretamente na massa cárnea,
o tratamento MP foi o que apresentou melhor atividade antioxidante, enquanto que
para a incorporação dos extratos de película de amendoim (FA) e pimenta rosa (FP)
no filme ativo de quitosana, o tratamento que apresentou melhor atividade
antioxidante foi o FP. Porém desses dois tratamentos (MP e FP), o FP apresentou-
se como melhor tratamento por possuir um maior espectro de ação, pois além da
98
atividade antioxidante, teve diferença significativa na inibição do crescimento
microbiano quando comparado à todos os tratamentos. Além disso, quanto à
aceitabilidade sensorial e caracterização de atributos, o FP foi um dos tratamentos
que apresentou maior aceitabilidade, além de características mais parecidas com as
amostras comerciais.
99
RECOMENDAÇÕES
Recomenda-se para estudos futuros, considerar um teor mais elevado de
extratos de resíduos agroindustriais (maior teor de CFT) a serem adicionados no
filme ativo de quitosana com intuito de melhorar ainda mais a atividade antioxidante
e antimicrobiana, já que nas concentrações utilizadas neste estudo não modificaram
significativamente a aceitabilidade sensorial.
100
101
REFERÊNCIAS
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120
121
ANEXOS
122
123
Anexo A
Figura 28 - Modelo da ficha CATA aplicada na analise sensorial da carne de frango processada.
124
Anexo B
125
Figura 29 – Gráfica de valores preditos versus valores obtidos, da superfície de resposta para FA. B. Gráfica da distribuição normal para os valores obtidos na superfície de resposta da FA. C. Diagrama de Pareto dos valores obtidos para FA.
126
Anexo C
127
Figura 30 – Gráfica de valores preditos versus valores obtidos, da superfície de resposta para FP. B.
Gráfica da distribuição normal para os valores obtidos na superfície de resposta da FP. C. Diagrama de Pareto dos valores obtidos para FP.
128
Anexo D
Figura 31 - Valores médios de pH para produto reestruturado de frango crua por tratamento e durante
o tempo de armazenamento
5,9
6,1
6,3
6,5
6,7
6,9
tempo-0 tempo-4 tempo-7
pH
Tempo de armazenamento (dias)
C AS MP
MA FP FA
