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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CAROLINA MORETTO CARNIELLI
ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNAS NA ÁREA DE
INVASÃO DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE BOCA POR
PROTEÔMICA BASEADA EM ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
CAMPINAS
2018
CAROLINA MORETTO CARNIELLI
ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNAS NA ÁREA DE INVASÃO DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE BOCA POR PROTEÔMICA
BASEADA EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientadora: ADRIANA FRANCO PAES LEME
CAMPINAS
2018
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA CAROLINA MORETTO CARNIELLI E
ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ADRIANA
FRANCO PAES LEME.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2013/16483-0
Ficha catalográficaUniversidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de BiologiaMara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Carnielli, Carolina Moretto, 1988- C217e CarEstudo da composição de proteínas na área de invasão de carcinoma
epidermóide de boca por proteômica baseada em espectrometria de massas /Carolina Moretto Carnielli. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
CarOrientador: Adriana Franco Paes Leme. CarTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Car1. Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. 2. Proteômica.
3. Espectrometria de massas. 4. Microdissecção e captura a laser. I. Leme,Adriana Franco Paes. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto deBiologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study of protein composition in the invasion area of squamous cellcarcinoma by proteomics based on mass spectrometryPalavras-chave em inglês:Carcinoma, Squamous cell of head and neckProteomicsMass spectrometryLaser capture microdissectionÁrea de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeTitulação: Doutora em CiênciasBanca examinadora:Adriana Franco Paes Leme [Orientador]Alexandre Keiji TashimaDiana Noronha NunesDaniel Guariz PinheiroMariane Tami AmanoData de defesa: 08-01-2018Programa de Pós-Graduação: Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
Campinas, 08 de janeiro de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA Profa. Dra. Adriana Franco Paes Leme
Prof. Dr. Alexandre Keiji Tashima
Profa. Dra. Diana Noronha Nunes
Prof. Dr. Daniel Guariz Pinheiro
Profa. Dra. Mariane Tami Amano Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre presente em minha vida, me dando forças e direção para
vencer os mais diversos obstáculos e seguir adiante.
À minha mãe Sonia e à minha irmã Helena, pelo amor e companheirismo que sempre
me acompanharam.
A todos os meus familiares, pelo seu carinho e apoio em cada momento.
À Profa. Dra. Adriana Franco Paes Leme, pela confiança em me receber em seu
laboratório, pela disposição, orientação e amizade. Obrigada pelo apoio em toda essa
jornada e em continuar adiante.
Ao Prof. Dr. Ricardo Della Colleta, pela disponibilidade em me auxiliar em diversas
fases desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Vitor Faça e Guilherme Lanfredi pelo auxílio nos experimentos iniciais de
proteômica baseada em alvos.
Às agências CAPES e FAPESP (Projeto 2013/16483-0), pelo financiamento que
permitiram o desenvolvimento desse trabalho.
Ao grupo MAS, por todo apoio e amizade durante esses quatro anos: Sami, Daniela,
Romênia, Bianca, Flávia, César, Rute, Ana Karina, Tatiane e Ariane. Aos demais que
já fizeram parte dessa jornada, seja no início ou no final dela, agradeço à Rebeca,
Flávia Winck, Raquel e Jamile. Agradeço à Carolina Carneiro, por todo auxílio no
desenvolvimento desse trabalho.
A todos do CNPEM e especialmente ao LNBio, por toda a equipe que possibilitou o
desenvolvimento desse trabalho.
Ao meu amigo e companheiro, Fábio Patroni, por todo o seu amor, carinho e apoio
nas mais diversas situações, fazendo a minha vida mais colorida.
RESUMO
Câncer de cabeça e pescoço é um grupo de câncer que envolve a cavidade oral, faringe e
laringe. A maioria dos casos é de carcinoma oral de células escamosas ou epidermóide
(CEC), o qual apresenta alta morbidade. Em câncer, mudanças no estroma dirigem a invasão
e metástase, cujos processos são característicos da malignidade. Evidências recentes
sugerem que a área do fronte invasivo dos carcinomas, ou seja, na interface do tumor-
hospedeiro, apresenta perfil molecular e características morfológicas diferentes em
comparação a outras áreas do mesmo, sendo considerada como uma região de interesse
para a identificação de potenciais assinaturas de prognóstico. Dessa forma, o objetivo desse
estudo foi identificar as proteínas presentes no estroma do fronte invasivo do tumor em
comparação ao estroma do interior do tumor. Para isso, a microdissecção a laser (LMD) foi
associada à espectrometria de massas (MS), técnicas consideradas de alta robustez quando
combinadas para a identificação e quantificação de proteínas em tecidos tumorais de regiões
específicas. Vinte amostras teciduais fixadas em formalina e parafina de CEC de língua foram
utilizadas para isolar o estroma da região do fronte invasivo e o estroma do interior de tumores
por LMD, seguida de extração e digestão das proteínas e análise por cromatografia líquida
acoplada à espectrometria de massas in tandem por proteômica baseada em descoberta (LC-
MS/MS). A partir das análises, incluindo análises estatísticas e a correlação com os dados
clínico-patológicos dos pacientes, cinco proteínas foram encontradas estatisticamente
significantes em relação as suas abundâncias entre as regiões do fronte invasivo e do interior
do estroma tumoral. As abundâncias de COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain), FSCN1
(Fascin-1), ITGAV (Integrin alpha-V), MB (Myoglobin) e THBS2 (Thrombospondin-2) foram
associadas ao estadiamento clínico do paciente, à presença de metástase linfonodal, à
recorrência de metástase linfonodal e ao grau de diferenciação histomorfológica do tumor (p-
valor<0,05, R<-0,7 ou 0,7<R e R2>0,5). Dentre essas proteínas, a localização de COL6A1 e
MB foram confirmadas por imunohistoquímica em um novo conjunto de amostras de CEC oral
(n=96 casos) e as proteínas COL6A1 e ITGAV foram associadas as características infiltração
capsular do linfonodo, margens livres e recorrência regional. Uma vez que a ocorrência de
metástase linfonodal é o principal fator associado ao pior prognóstico de CEC oral, a presença
dessas proteínas foi avaliada em amostras de saliva de pacientes com CEC oral com
metástase linfonodal (n=10) e em pacientes sem metástase linfonodal (n=23). Por meio da
análise proteômica baseada em alvos pelo método de monitoramento seletivo de reações
(SRM) foi demonstrado que COL6A1 e ITGAV (Integrin alpha-V) estão menos abundantes em
amostras de saliva de pacientes com metástase linfonodal. Curvas ROC revelaram um bom
desempenho dessas proteínas em classificar pacientes com ausência e presença de
metástase, apresentando uma área sob a curva (AUC) de 0.8 para COL6A1
(sensibilidade=0,739; especificidade=0,9) e AUC de 0.75 para ITGAV (sensibilidade=0,696;
especificidade=0,8). Portanto, este trabalho demonstra pela primeira vez por meio da
combinação das técnicas de LMD e MS proteínas com distribuição espacial distinta entre as
regiões de fronte invasivo e interior tumoral, presentes no estroma e também em saliva de
pacientes com CEC oral, sendo capazes de distinguir entre pacientes com e sem metástase
linfonodal, apresentando assim potencial valor prognóstico. Os presentes resultados indicam
proteínas candidatas que podem ser associadas ao prognóstico para CEC de boca que
podem guiar estratégias terapêuticas na prática clínica.
ABSTRACT
Head and neck cancers are a group of cancers that involve the oral cavity, pharynx and larynx.
The majority of head and neck cancers are squamous-cell carcinoma (SCC), which has high
morbidity. In cancer, changes in the stroma drive invasion and metastasis, the hallmarks of
malignancy. Recent evidence suggests that the invasive tumor front area of carcinomas, ie,
the tumor-host interface, have different molecular profile and distinct morphological features
compared to other areas of the tumor and may be considered as a region of interest to identify
prognostic markers. Thus, the aim of this study is to identify the proteins present in the stroma
of the invasive tumor front compared to the stroma of the inner tumor. The combination of laser
microdissection (LMD) and mass spectrometry (MS) has been considered as an approach with
high robustness to protein identification of specific regions of tumor tissues. Twenty samples
of CEC of tongue tissues fixed in paraffin and in formalin were used to isolate the stroma from
the invasive tumor front and from the inner tumor by LMD, followed by protein extraction,
protein digestion and liquid-chromatography coupled to mass spectrometry in tandem by
discovery-based proteomics (LC-MS/MS). Statistical analysis and correlation analysis with
clinicopathological data revealed five spatially distinct proteins between the stroma regions.
The abundance of COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain), FSCN1 (Fascin-1), ITGAV (Integrin
alpha-V), MB (Myoglobin) and THBS2 (Thrombospondin-2) were associated to clinical stage,
lymph node metastasis and lymph node recurrence (p-valor<0.05, R<-0.7 or 0.7<R and
R2>0.5). The location of COL6A1 and MB were confirmed by immunohistochemistry in a new
set of 96 patient samples of oral SCC (OSCC) and association to lymph node capsular
infiltration, margin status and local recurrence. Once lymph node metastasis is the main poor
prognostic factor in OSCC, the selected proteins were evaluated in saliva samples of patients
with metastasis (n=10) and without metastasis (n=23). Targeted proteomics analysis based on
SRM method (Selected Reaction Monitoring) demonstrated that COL6A1 and ITGAV were
found with lower abundance in patients with lymph metastasis and able to distinguish between
the two groups of samples by ROC analysis with an area under curve (AUC) of 0.8 for COL6A1
(sensitivity: 0.739; specificity: 0.9) and AUC of 0.75 for ITGAV (sensitivity: 0.696; specificity:
0.8). Taken together, by the association of LMD and MS (DDA and SRM) approaches, this
project demonstrate for the first time proteins spatially organized in the stroma of different
regions of the tumor, the invasive tumor front and the inner tumor, that are also present in
saliva samples of OSCC patients and able to distinguish between those with metastasis and
without metastasis, thus, with potential prognostic value. These results indicate new candidate
prognosis markers for OSCC that may guide therapeutic strategies in clinical routine.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Representação esquemática dos componentes básicos de uma neoplasia
de células escamosas.. ............................................................................................. 18
Figura 2: Imagens de cortes histológicos mostrando tecidos em diferentes condições,
do normal ao carcinoma. ........................................................................................... 19
Figura 3. Lesões de carcinoma oral de células escamosas (CEC). ......................... 20
Figura 4. Composição estrutural e proteica da matriz extracelular (ECM)................ 31
Figura 5. Componentes básicos de um espectrômetro de massas. ......................... 43
Figura 6. Representação esquemática da fragmentação de peptídeos. .................. 45
Figura 7. Comparação do fluxograma de proteômica baseada em descoberta versus
proteômica baseada em alvos. .................................................................................. 49
Figura 8. Fotomicrografia de um corte histológico de CEC oral de língua. ............... 56
Figura 9. Sequência de LMD em um corte de CEC de língua. ................................. 73
Figura 10. Representação das proteínas identificadas nas regiões estroma do fronte
invasivo tumoral (ITF) e estroma do interior tumoral. ................................................ 75
Figura 11. Associação entre as proteínas com expressão diferencial significativa entre
fronte invasivo tumoral (ITF) e interior tumoral à sobrevida livre de doença em meses.
.................................................................................................................................. 81
Figura 12. Perfil da abundância das proteínas selecionadas como alvos para
experimentos de verificação. ..................................................................................... 82
Figura 13. Marcação imunohistoquímica para as proteínas alvos em cortes de CEC
oral ............................................................................................................................ 84
Figura 14. Análise de sobrevida Kaplan-Meier para valores de score de IHC e dados
de fechamento clínico. .............................................................................................. 88
Figura 15. Avaliação das proteínas alvos por proteômica baseada em alvos. ......... 92
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Definições de TNM para câncer oral de acordo com o World Health
Organization (WHO) Classification of Tumours. ........................................................ 22
Tabela 2. Estadiamento e classificação TNM para câncer oral de acordo com o World
Health Organization (WHO) Classification of Tumours. ............................................ 23
Tabela 3. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC de língua utilizados no
estudo de proteômica baseada em descoberta. ........................................................ 55
Tabela 4. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC de língua utilizados no
estudo de proteômica baseada em descoberta quanto ao grau de diferenciação
histológica e estágio clínico de CEC. ........................................................................ 56
Tabela 5. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC oral utilizados para as
análises por imunohistoquímica. ............................................................................... 58
Tabela 6. Método de score baseado na intensidade e porcentagem de marcação das
proteínas para avaliação da marcação imunohistoquímica nas áreas fronte invasivo e
interior tumoral de CEC oral. ..................................................................................... 64
Tabela 7. Dados clínico-patológicos de pacientes com CEC oral utilizados para
análise por proteômica baseada em alvos. ............................................................... 66
Tabela 8. Transições utilizadas para monitorar as proteínas de interesse por
proteômica baseada em alvos. .................................................................................. 68
Tabela 9. Proteínas com diferentes abundâncias entre as regiões do estroma do fronte
tumoral invasivo (ITF) e estroma do interior do tumor que apresentam correlação com
dados clínico-patológicos por análise de regressão linear. ....................................... 77
Tabela 10. Associação dos dados demográficos e clínico-patológicos com a
expressão de três proteínas alvos presentes no estroma de amostra de CEC oral. . 85
Tabela 11. Taxa de sobrevida de pacientes com CEC oral de acordo com a expressão
de proteínas. ............................................................................................................. 89
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AUC: Área sob a curva (area under curve)
BD: Tumor de brotamento (tumor buddings)
CAF: Fibroblastos associados ao carcinoma (carcinoma-associated fribroblasts)
CEC: Carcinoma de células escamosas ou epidermóide
CID: Dissociação induzida por colisão (collision induced dissociation)
DDA: Aquisição dependente de dados (data-dependent acquisition)
ECD: Dissociação por captura de elétrons (electron capture dissociation)
ECM: Matriz extracelular (extra cellular matrix)
emPAI: Índice modificado de abundância de proteínas de forma exponencial
(exponentially modifed protein abundance index)
EMT: Transição epitélio-mesenquimal (epitelial mesenchymal transition)
ESI: Ionização por eletrospray (electrospray ionization)
ETD: Dissociação por transferência de elétrons (electron-transfer dissociation)
FFPE: formalin-fixed paraffin-embedded
FT-MS: Fourier transform ion cyclotron mass spectrometer
FWHM: Largura total do pico na metade de sua altura máxima (full width of the peak
at half its maximum height)
GAG: Glicosaminoglicanos
HCD: Dissociação induzida por alta energia de colisão (high-energy collisional
dissociation)
HPV: Papilomavírus humano
HRM: Modelo de risco histológico (histological risk model)
IHC: Imunohistoquímica (immunohistochemistry)
ITF: Fronte invasivo tumoral (invasive tumor front)
iTRAQ: Etiquetas isobáricas para quantificação relativa e absoluta (isobaric tag for
relative and absolute quantitation)
LC-MS/MS: Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas in tandem
(liquid-chromatography tandem-mass spectrometry)
LFQ: Quantificação label-free (label-free quantification)
LHR: Resposta linfocítica do hospedeiro (lymphocytic host response)
LMD: Microdissecção a laser (laser microdissection)
MALDI: Ionização a laser auxiliada por matriz (matrix-assisted laser
desorption/ionization)
MG: Classificação das margens (margin grading)
MRM: Multiple reaction monitoring
NSAF: Fator de abundância espectral normalizado (normalized spectral abundance
factor)
dNSAF: Fator distribuído de abundância espectral normalizado (distributed
normalized spectral abundance fator)
PAI: Índice de abundância de proteínas (protein abundance índices)
PG: Proteoglicanos
PNI: Invasão perineural (perineural invasion)
PRM: Monitoramento de reações paralelas (parallel reaction monitoring)
ROC: Curvas de características de operação do receptor (receiver operating
characteristic)
SIL: Marcação isotópica estável (stable isotope-labelled)
SILAC: Stable isotope-based labeling with amino acids
SRM: Monitoramento seletivo de reações (selected reaction monitoring)
TME: Microambiente tumoral (tumor microenvironment)
TNM: Tumor-node-metastasis
TOF: tempo de voo (time-of-flight)
WHO: World Health Organization
WPOI: Pior padrão de invasão (worst pattern of invasion)
XIC: Cromatograma de íon extraído (Extracted ion chromatogram)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
1.1 Epidemiologia do câncer oral ........................................................................... 15
1.2 Patogênese do câncer oral .............................................................................. 17
1.3 Tratamento, prognóstico e sobrevida ............................................................... 20
1.4 Sistemas de classificação histológica em CEC oral ......................................... 24
1.5 Região de fronte invasivo tumoral .................................................................... 27
1.6 Ambiente tecidual em câncer – estroma .......................................................... 29
1.7 Alvos terapêuticos e marcadores de prognóstico em CEC oral ....................... 33
1.8 A complexidade do CEC oral e a importância da proteômica clínica ............... 35
1.9 Proteômica baseada em descoberta e proteômica baseada em alvos ............ 39
1.10 Associação da microdissecção a laser à proteômica baseada em
espectrometria de massas ..................................................................................... 50
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 52
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 52
2.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 52
3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 53
3.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa ................................................... 53
3.2 Seleção das amostras teciduais ....................................................................... 53
3.3 Processamento das amostras teciduais e microdissecção a laser (LMD) ....... 59
3.4 Extração de proteínas e digestão enzimática para proteômica baseada em
descoberta ............................................................................................................. 60
3.5 Análise por espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) com aquisição
dependente de dados (DDA) ................................................................................. 60
3.6 Análise dos dados brutos de proteômica baseada em descoberta .................. 61
3.7 Correlação da abundância de proteínas identificadas por proteômica baseada
em descoberta com dados clínico-patológicos dos pacientes ............................... 63
3.8 Análise imunohistoquímica dos tecidos de CEC oral ....................................... 63
3.9 Coleta de amostras de saliva ........................................................................... 64
3.10 Seleção dos peptídeos proteotípicos e das transições .................................. 66
3.11 Preparação das amostras de saliva para proteômica baseada em alvos ...... 70
3.12 Verificação dos peptídeos por proteômica baseada em alvos ....................... 70
3.13 Análise quantitativa e estatística dos dados de proteômica baseada em alvos
(SRM) ..................................................................................................................... 71
3.14 Predição do valor prognóstico de proteínas para CEC oral ........................... 72
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 73
4.1 Proteínas identificadas a partir da associação da microdissecção a laser e
espectrometria de massas por proteômica baseada em descoberta ..................... 73
4.2 Dados clínico-patológicos correlacionados com a abundância de proteínas
identificadas por proteômica baseada em descoberta no estroma de CEC oral .... 76
4.3 Verificação da abundância das proteínas selecionadas por imunohistoquímica e
correlação com dados clínico-patológicos ............................................................. 83
4.4 Avaliação das proteínas alvos em saliva de pacientes com CEC oral por
proteômica baseada em alvos ............................................................................... 89
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 93
6 CONCLUSÃO ......................................................................................................... 99
APÊNDICE 1 ........................................................................................................... 110
APÊNDICE 2 ........................................................................................................... 113
ANEXO 1 ................................................................................................................. 114
Anexo 2 ................................................................................................................... 117
Anexo 3 ................................................................................................................... 118
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia do câncer oral
O termo câncer oral engloba um conjunto de neoplasias de cabeça e
pescoço que acometem a cavidade oral em suas mais variadas etiologias e aspectos
histopatológicos. O carcinoma oral de células escamosas ou epidermóide (CEC) é
considerado o tipo mais comum de câncer da cavidade oral, apresentando alta
prevalência, com uma estimativa de 300 mil novos casos no mundo por ano, além de
alta recorrência e mortalidade, com 145 mil mortes por ano e sobrevida de
aproximadamente 5 anos (Ferlay et al. 2015; Chi et al. 2015).
A distribuição geográfica de câncer oral é variável nas diferentes regiões
do mundo devido a diferentes hábitos, cultura, expectativa de vida e educação
preventiva da população (Petti 2009; Túri et al. 2013; Jadhav & Gupta 2013). Em
muitos países o câncer oral tem sido considerado um crescente problema de saúde
pública, uma vez que seu diagnóstico é realizado em estágios avançados da doença,
o que acarreta em um baixo prognóstico (Scully & Felix 2005). Segundo dados do
GLOBOCAN 2012, a incidência de câncer de lábios e da cavidade oral representa
cerca de 2% de todos os novos casos de câncer diagnosticados mundialmente (Ferlay
et al. 2015). No Brasil, estima-se que no ano de 2016, surgiram 11.140 novos casos
de câncer da cavidade oral em homens e 4.350 em mulheres. Tais valores
correspondem a um risco estimado de 11,27 casos novos a cada 100 mil homens e
4,21 a cada 100 mil mulheres (Instituto Nacional de Cancer José Alencar Gomes da
Silva 2016). Essas taxas de incidência de câncer da cavidade oral também
apresentam variações entre as regiões do Brasil, sendo mais frequente nas regiões
sul e sudeste entre homens, e na região sudeste e nordeste entre mulheres do país
(Instituto Nacional de Cancer José Alencar Gomes da Silva 2016).
Entre as localizações de mais alto risco para o desenvolvimento do CEC
oral estão o lábio inferior, as margens póstero-laterais, a base da língua e o assoalho
bucal, podendo ocorrer também na gengiva e nas glândulas parótidas e salivares
(Bagan et al. 2010; Rivera 2015). O CEC oral possui uma etiologia multifatorial, com
a participação de fatores tanto extrínsecos quanto intrínsecos, podendo também
16
ocorrer a participação de mais de um fator (cocarcinogênese) no desenvolvimento da
doença (Petti 2009; Scully & Felix 2005). Entre os fatores de risco extrínsecos
encontram-se o uso de tabaco, o consumo de álcool, exposição à radiação
ultravioleta, além da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) principalmente dos
subtipos 16 e 18, enquanto os fatores intrínsecos que podem estar envolvidos no
desenvolvimento da doença compreendem alterações genéticas, deficiências
nutricionais e imunossupressão (Winn et al. 2015; Instituto Nacional de Cancer José
Alencar Gomes da Silva 2016).
Muitos casos apontam um aumento no número de pessoas que
desenvolvem câncer devido à exposição a agentes etiológicos. O consumo de tabaco
e o álcool tem sido relatado na literatura como os principais fatores de riscos para o
desenvolvimento de CEC oral. Um consórcio realizado pelo International Head and
Neck Cancer Epidemiology (INHANCE) com 35 estudos abrangendo 25.500 casos de
câncer de cabeça e pescoço e 37.100 controles apontou o papel significante do uso
de tabaco e álcool na etiologia do câncer oral (Winn et al. 2015). O consumo de tabaco
por fumo demonstrou um aumento no risco de desenvolvimento de câncer da
cavidade oral, bem como etilistas com alto consumo de álcool. Juntos, o consumo de
tabaco por fumo e de álcool estavam presentes em 64% dos casos de câncer da
cavidade oral, demonstrando o elevado risco de desenvolvimento da doença
apresentado por esse comportamento. Além disso, uma diminuição no risco de
desenvolvimento de câncer oral foi observada em pessoas que deixaram de usar
tabaco por fumo, e após 20 anos sem consumo, o risco chega a ser comparável ao
de não fumantes.
O perfil epidemiológico clássico dos pacientes com câncer da cavidade oral
compreende homens da quinta a oitava décadas de vida, tabagistas e etilistas
crônicos. Entretanto, tem sido observado uma mudança nesse perfil devido ao
aparecimento de novos casos em pacientes jovens e pacientes do sexo feminino
possivelmente associados a fatores como predisposição genética e HPV, além da
mudança do hábito tabagista entre as mulheres (Túri et al. 2013; Van Monsjou et al.
2013; Fakhry & D’Souza 2013). O HPV está etiologicamente envolvido com o câncer
cervical, entretanto, estudos têm investigado a prevalência de HPV em pacientes de
câncer de cabeça e pescoço (Van Monsjou et al. 2013; Antonsson et al. 2015; Ndiaye
et al. 2014), demonstrando uma associação entre a infecção por HPV e a ocorrência
17
de CEC da cavidade oral e de orofaringe durante a carcinogênese (Hansson et al.
2005). Embora a prevalência de infecções por HPV esteja associada ao
comportamento sexual, alguns estudos discutem se o consumo de álcool e de tabaco
apresentam alguma associação ao câncer oral causado por HPV, tendo ainda
controversas entre resultados provenientes de diferentes populações (McCullough et
al. 2010; Túri et al. 2013). Propriedades oncogênicas tem sido atribuídas às proteínas
E6 e E7 do HPV, as quais conferem o fenótipo de maior risco da doença e atuam na
degradação do supressor tumoral p53 e Rb (proteína retinoblastoma),
respectivamente, acarretando também na desregulação do controle do ciclo celular
(Van Monsjou et al. 2013).
Outros fatores também podem estar associados com a ocorrência de
câncer oral. A exposição crônica à radiação ultravioleta pode aumentar o risco do
desenvolvimento de câncer nos lábios (Gallagher & Lee 2006; Gallagher et al. 2010)
e outros fatores como desnutrição, baixo nível econômico e higiene também
apresentam associação ao desenvolvimento de câncer oral (Winn et al. 2015). Assim,
a prevenção depende parcialmente em evitar os fatores de risco, enquanto o
diagnóstico precoce é de suma importância para o manejo dos pacientes com CEC
oral, o que está relacionado a um melhor prognóstico (Ford & Farah 2013).
1.2 Patogênese do câncer oral
O CEC oral é uma neoplasia maligna de origem epitelial, derivada do
epitélio escamoso estratificado da mucosa oral (Rivera & Venegas 2014). Os
componentes básicos desta neoplasia são: 1) parênquima, composto por células
neoplásicas da camada escamosa do epitélio oral de superfície displásica e 2) o
estroma tumoral, composto por tecido conjuntivo subjacente, vasos sanguíneos,
células inflamatórias, fibroblastos, e outros componentes da matriz extracelular, que
confere suporte para o crescimento tumoral (Figura 1). Histologicamente o CEC oral
caracteriza-se por ilhas e cordões invasivos de células escamosas epiteliais malignas
infiltrando os tecidos normais subjacentes (Sharma et al., 2013).
18
Figura 1. Representação esquemática dos componentes básicos de uma neoplasia de células escamosas. A figura apresenta o parênquima tumoral, o qual é composto por células neoplásicas da camada escamosa do epitélio oral e o estroma tumoral, composto pelo tecido conjuntivo subjacente, vasos sanguíneos, células inflamatórias, fibroblastos, entre outros componentes da matriz extracelular. Modificado de Servier Medical Art website.
As lesões de CEC oral podem se desenvolver a partir da mucosa oral
aparentemente normal. O câncer oral é formado por meio de uma série de etapas
histopatológicas a partir da hiperplasia benigna à displasia epitelial para carcinoma in
situ, seguido por células escamosas invasivas (Shah et al. 2011) (Figura 2). O CEC
oral surge a partir de um epitélio de superfície displásico em que a queratinização de
células epiteliais escamosas pode ser observada com a possível formação de
“pérolas” de queratina associados a um padrão de crescimento invasivo. Displasias
leves apresentam uma proliferação celular atípica, com células acima da região
parabasal, enquanto que na displasia moderada e severa as células encontram-se
próximas ao limite do epitélio (Speight et al. 1996). Tumores bem diferenciados
apresentam grandes queratinócitos, que produzem abundante queratina, e células
atípicas. Os tumores moderadamente diferenciados geralmente apresentam menor
queratinização e distinto pleomorfismo nuclear e mitoses aberrantes e, por fim, o CEC
oral pobremente diferenciado apresenta predominantemente células imaturas com
numerosas mitoses aberrantes e baixa queratinização.
19
Figura 2: Imagens de cortes histológicos mostrando tecidos em diferentes condições, do normal ao carcinoma. O epitélio oral normal (A/G) apresenta uma arquitetura com vários estratos definidos e com continuidade da membrana basal. Na displasia, pode-se observar vários graus de atipia celular. Quando as alterações se apresentam na camada basal ou parabasal, corresponde a uma displasia leve (B/H). Alterações atingindo a metade do epitélio correspondem a uma displasia moderada (C/I) e quando se estendem até à superfície, a displasia é avançada (D/J). No carcinoma bem diferenciado (E/K), a invasão apresenta produção de queratina (E/K), enquanto que no carcinoma pobremente diferenciado (F/L) é difícil identificar o tecido de origem, os clones perdem adesões celulares facilitando a metástase. Fonte: doação de Prof. Ricardo Della Coletta (FOP-UNICAMP).
A malignidade é geralmente precedida por lesões potencialmente
malignas, cuja evolução histopatológica pode ser observada clinicamente pela
presença dessas lesões antes do surgimento do CEC oral. Entre as lesões
potencialmente malignas mais importantes para o CEC da cavidade oral encontra-se
a leucoplasia, que se assemelha a placas brancas na mucosa oral, e a eritroplasia,
caracterizada por lesões avermelhadas na mucosa oral. Para o CEC de lábio inferior,
a queilite actínica apresenta-se como uma lesão potencialmente maligna para essa
região anatômica (Neville & Day 2002). Tais lesões têm sido documentadas em
associação ou precedendo as lesões de CEC oral (van der Waal 2009), apresentando
maior risco de transformação maligna quando comparadas à mucosa normal, uma vez
que as alterações histopatológicas são similares às observadas nos carcinomas
pouco invasivos (Eversole 2009). Além disso, o aumento progressivo na taxa de
transformação maligna está diretamente relacionado à severidade da alteração
displásica do epitélio (Kujan et al. 2006).
O tamanho das lesões de CEC pode variar de alguns milímetros para vários
centímetros em casos mais avançados (Bagan et al. 2010). Lesões iniciais são
geralmente assintomáticas e à medida que crescem podem se tornar uma massa
exofítica (formação de aumento de volume vegetante, papilar, verruciforme), ou então
20
podem apresentar um padrão endofítico caracterizado por uma depressão (invasiva,
escavada) com uma superfície ulcerada (Neville & Day 2002) (Figura 3).
Figura 3. Lesões de carcinoma oral de células escamosas (CEC). (A) Paciente com lesão exofítica e ulcerada na borda lateral da língua (retirado de Muñoz-Corcuera et al. 2009). (B) Paciente com lesão endofítica ulcerada na borda lateral esquerda da língua (retirado de Chi et al. 2015).
1.3 Tratamento, prognóstico e sobrevida
O objetivo do tratamento de câncer oral consiste em eliminar o tumor,
restaurar a estrutura e a função da área afetada, minimizar as sequelas deixadas pela
doença e tratamento e prevenir a ocorrência de novos tumores primários. Entretanto,
casos em que não há cura, o objetivo passa a ser aumentar a qualidade de vida do
paciente durante a sobrevida (Shah & Gil 2009).
A escolha do tratamento inicial de CEC oral deve considerar alguns fatores
relacionados ao tumor primário e características relacionadas ao paciente. Dentre as
características tumorais a serem consideradas são o sítio primário, tamanho,
proximidade aos ossos da mandíbula e maxila, condição dos linfonodos cervicais,
tratamentos prévios e características histológicas como o tipo, classificação e
profundidade de invasão do tumor. Fatores relacionados ao paciente incluem idade,
condição de saúde em geral, tolerância ao tratamento e estilo de vida (fumante ou
etilista) e características socioeconômicas (Shah & Gil 2009).
Os métodos de tratamento de CEC oral podem incluir a combinação de
terapias como radioterapia e quimioterapia seguido por cirurgia, geralmente utilizada
em estágios avançados da doença, ou apenas a aplicação de uma dessas terapias
isoladamente, comumente utilizado em casos iniciais da doença. Em tumores
21
malignos da cavidade oral, a remoção cirúrgica é um dos procedimentos mais
importantes para o tratamento. Tumores pequenos e superficiais podem ser
facilmente removidos por cirurgia pela abertura da boca, enquanto tumores maiores
requerem outras técnicas cirúrgicas para a exposição e excisão tumoral. Alguns sítios
primários da cavidade oral, como tumores primários da língua, podem ser inicialmente
tratados com radioterapia, em contraste a tumores situados próximos aos ossos. Além
disso, quanto maior o tumor, maior o risco de metástase linfonodal regional, sendo
necessário considerar um tratamento eletivo (Shah & Gil 2009).
Na prática clínica, o estadiamento do câncer oral é importante para
estabelecer o plano de tratamento e determinar o prognóstico do paciente. A
necessidade de se classificar os casos de câncer em estádios baseia-se na
constatação de que as taxas de sobrevida são diferentes quando a doença está
restrita ao órgão de origem ou quando ela se estende a outros órgãos, implicando
assim no prognóstico do paciente. Portanto, estadiar um caso de neoplasia maligna
significa avaliar o seu grau de disseminação e para isso há regras internacionalmente
estabelecidas. Essas regras são estabelecidas em sistemas de classificação, os quais
obedecem a diferentes variáveis, dentre elas: a localização, tamanho ou volume do
tumor, invasão direta e linfática, presença de metástases à distância, diagnóstico
histopatológico, produção de substâncias, manifestações sistêmicas, duração dos
sinais e sintomas, sexo e idade do paciente. O sistema mais utilizado para a
classificação dos tumores, incluindo o CEC oral, é o TNM (tumor-node-metastasis),
preconizado pela União Internacional Contra o Câncer (UICC) (Edge & Compton
2010), no qual T representa o tamanho do tumor primário, N indica a condição dos
linfonodos regionais (acometimento linfonodal) e M indica a presença ou ausência de
metástase à distância (Tabelas 1 e 2). Estes parâmetros recebem graduações,
geralmente de T0 a T4, de N0 a N3 e de M0 a M1. Além das graduações numéricas,
as categorias T e N podem receber subclassificações em graduações alfabéticas (a,
b, c), sendo que tanto as graduações numéricas como as alfabéticas expressam o
nível de evolução do tumor e do comprometimento linfonodal. As categorias T, N e M
também podem ser agrupadas em combinações pré-estabelecidas e organizadas em
estádios que variam de I a IV, os quais podem ser subclassificados em A e B para
expressar o nível de evolução da doença.
22
Tabela 1. Definições de TNM para câncer oral de acordo com o World Health Organization (WHO) Classification of Tumours.
Categoria Definição
Tumor primário (T)
TX Tumor primário não pode ser avaliado T0 Sem evidência de tumor primário Tis Carcinoma in situ T1 Tumor de 2 cm ou menor em seu maior diâmetro T2 Tumor maior de 2 cm, mas não maior que 4 cm em seu
maior diâmetro T3 Tumor maior que 4 cm em seu maior diâmetro T4a Doença local moderadamente avançada
Cavidade oral: tumor invade estruturas adjacentes apenas (ex.: mandíbula e maxila, musculatura extrínseca profunda da língua, seios maxilares, pele da face)
T4b Doença local bastante avançada Cavidade oral: tumor invade espaço mastigatório, a base do crânio e/ou envolve a artéria carótida interna
Linfonodo regional (N)
NX Linfonodos não podem ser avaliados
N0 Sem metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em um único linfonodo ipsilateral, menor ou igual a 3 cm em seu maior diâmetro.
N2a Metástase em um único linfonodo ipsilateral, maior do que 3 cm, porém menor do que 6 cm em seu maior diâmetro; ou múltiplos linfonodos ipsilaterais, nenhum maior do que 6 cm em seu maior diâmetro; ou linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum maior do que 6 cm em seu maior diâmetro.
N2b Metástase em múltiplos linfonodos ipsilaterais, maior do que 3 cm, porém menor que 6cm em seu maior diâmetro.
N2c Metástase em linfonodos bilaterais e contralaterais, nenhum maior do que 6 cm em seu maior diâmetro
N3 Metástase em linfonodo maior que 6 cm em seu maior diâmetro
Metástase à distância (M)
M0 Sem metástase à distância
M1 Presença de metástase à distância
Adaptado de (Barnes et al. 2005).
23
Tabela 2. Estadiamento e classificação TNM para câncer oral de acordo com o World Health Organization (WHO) Classification of Tumours.
Estádio Classificação TNM
0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 II T2 N0 M0 III T3 N0 M0
T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N1 M0
IV
IVA T4a N0 M0 T4a N1 M0 T1 N2 M0 T2 N2 M0 T3 N2 M0 T4a N2 M0
IVB T4b qualquer N M0 Qualquer T N3 M0
IVC Qualquer T qualquer N M1
Adaptado de (Barnes et al. 2005).
Em CEC oral, casos em estágios iniciais ou mesmo avançados são tratados
cirurgicamente com a remoção de margens de 1-2 cm, podendo ser acompanhado de
dissecção do pescoço se houver acometimento linfonodal ou quando há um elevado
risco de metástase regional oculta (Chi et al. 2015). Quando em estágio inicial (T1 e
T2), os casos são tratados com cirurgia ou radioterapia e comumente apresentam um
prognóstico favorável. Tumores de estádio III ou IV geralmente requerem uma
combinação de métodos de tratamento, com cirurgia para remoção do tumor primário
e aplicação de radioterapia e/ou quimioterapia, cuja necessidade é definida de acordo
com algumas características, incluindo presença de margens cirúrgicas positivas,
invasão perineural ou linfovascular, estadiamento N2 ou N3 e extensão extracapsular
do tumor nos linfonodos (Chi et al. 2015). Assim, critérios para a ressecção cirúrgica
precisa são necessários, de forma que a indicação terapêutica do câncer depende do
estadiamento da doença. Assim, um estadiamento bem conduzido leva a condutas
terapêuticas corretamente aplicadas.
Um fator importante que afeta o resultado a longo prazo após o tratamento
inicial de câncer da cavidade oral é o estágio da doença no momento do diagnóstico
(Shah & Gil 2009). O diagnóstico precoce tem sido um dos principais fatores para a
sobrevida do paciente. Em geral, a sobrevida de 5 anos ocorre em apenas 53% dos
casos de CEC oral (Bánkfalvi & Piffkò 2005), entretanto, se detectado em estágios
iniciais as taxas de sobrevida são de 80-90% em CEC oral (Bagan et al. 2010). No
24
entanto, mais de 60% dos casos de CEC oral são diagnosticados tardiamente, o que
implica em uma maior agressividade dessa neoplasia e em tratamentos mutiladores,
impactando negativamente na qualidade de vida do paciente. Uma diminuição na taxa
de sobrevida também é observada quando ocorre metástase dos linfonodos regionais
(Neville & Day 2002). Adicionalmente, o câncer oral apresenta alta taxa de
recorrência, sendo que pacientes que sobrevivem a um primeiro quadro da doença
apresentam 20 vezes mais risco de desenvolver um segundo tumor primário (Seoane
Lestón & Diz Dios 2010; Shah et al. 2011). Assim, o diagnóstico precoce continua
sendo uma importante etapa, podendo impactar positivamente no prognóstico do
paciente e na sobrevida.
Os fatores prognósticos de CEC oral compreendem características que
compõe o sistema de classificação TNM. Entretanto, tumores de um mesmo grupo de
estadiamento TNM podem apresentar comportamentos diferentes, diferindo na
sobrevida e na resposta ao tratamento (Takes et al. 2010). Embora o prognóstico seja
pior em pacientes com tumores em estadiamentos mais avançados, o prognóstico
pode diferir significativamente dentro do mesmo grupo devido a diferenças explicadas
pelas características biológicas do tumor e a fatores relacionados à interação tumor-
hospedeiro, informações que não são incluídas no sistema TNM. Embora esse
sistema seja imperfeito, ele é amplamente utilizado no plano de tratamento e na
determinação do prognóstico. Por outro lado, estudos tem demonstrado a associação
de características clínico-patológicas e histopatológicas ao prognóstico de pacientes
com CEC oral, incluindo o padrão de crescimento, padrão de invasão em ilhas nos
tecidos subjacentes, profundidade de invasão, presença de infiltrado inflamatório,
invasão perineural, invasão vascular, dentre outros (Takes et al. 2010; Brandwein-
Gensler et al. 2010; Jadhav & Gupta 2013; Almangush et al. 2015; Sawazaki-Calone
et al. 2015). A inclusão desses critérios dentro de um sistema de classificação pode
acarretar na determinação mais precisa do prognóstico e auxiliar na decisão clínica.
1.4 Sistemas de classificação histológica em CEC oral
O estadiamento clínico com base na classificação TNM e na localização do
tumor são rotineiramente os principais critérios para o prognóstico e tratamento de
CEC oral (Scully & Bagan 2009). No entanto, é possível observar variações na
25
resposta ao tratamento e no prognóstico entre pacientes com tumores de mesmo
estadiamento, ou seja, alguns pacientes podem apresentar uma sobrevida
prolongada, enquanto outros podem morrer de metástase rapidamente. Diante disso,
foi proposto que a gradação histopatológica detalhada dos tumores poderia ajudar os
médicos na individualização do tratamento e no prognóstico de pacientes com CEC
oral (Almangush et al. 2015; Brandwein-Gensler et al. 2005; Bryne et al. 1992).
Muitos estudos têm buscado determinar quais parâmetros histológicos
mais contribuem para a determinação do prognóstico. O primeiro sistema de
classificação histopatológica de CEC oral foi desenvolvido por Broders em 1920
(Broders 1920), o qual considera que tumores pobremente diferenciados apresentam
um pobre prognóstico. Esse modelo foi mais tarde adotado pela Organização Mundial
da Saúde (WHO) (Barnes et al. 2005), porém foi criticado em alguns estudos por ser
subjetivo e devido à característica celular heterogênea que os tumores apresentam,
podendo refletir em diferenças no comportamento invasivo e metastático (Bryne et al.
1989). Outros sistemas foram propostos para padronizar a classificação e os fatores
prognósticos. Em 1984, Anneroth e colaboradores (Anneroth & Hansen 1984)
propuseram um novo sistema de classificação de malignidade, o qual avalia
características da região invasiva do tumor. Nesse sistema, 3 características das
células tumorais das regiões menos diferenciadas do tumor, juntamente com outras 3
características histológicas da relação célula tumoral e tecido conectivo, são
consideradas, sendo: grau de queratinização, número de polimorfismo, número de
mitoses, padrão de invasão, estágio da invasão e infiltração de leucócitos. Ao
comparar o valor prognóstico desse novo sistema com o sugerido por Broders, Bryne
e colaboradores (Bryne et al. 1989) mostraram que o novo sistema de classificação
maligna é um fator prognóstico altamente significativo em CEC oral, sugerindo assim
que características histológicas da região invasiva do tumor são importantes para a
predição do comportamento clínico do tumor, região em que as células mais se
assemelham às que dão origem à metástases. Mais tarde, um novo estudo realizado
por Bryne e co-autores (Bryne et al. 1992) com a avaliação histológica de 61 casos de
CEC oral, demonstrou que a classificação maligna das margens invasivas (MG,
margin grading ou deep invasive margins) do tumor apresentam um alto valor
prognóstico, concluindo que essa região pode ser utilizada para auxiliar no
planejamento do tratamento de CEC oral. Esse sistema de classificação de
26
malignidade nas margens invasivas considera o grau de queratinização, polimorfismo
nuclear, padrão de invasão e infiltração linfoplasmocitária somente nas áreas mais
invasivas do tumor. Mais tarde esse modelo de classificação maligna foi também
utilizado em um novo estudo com a inclusão do parâmetro de invasão vascular, o qual
foi fortemente associado à metástase linfonodal e sobrevida específica (Larsen et al.
2009).
Outro sistema de classificação baseado em características histológicas é o
modelo de risco histológico (HRM, histological risk model), proposto por Brandwein-
Gensler e colaboradores (2005), o qual se baseia em três parâmetros histopatológicos
para a avaliação de espécimes cirúrgico: (1) pior padrão de invasão (WPOI, worst
pattern of invasion), (2) invasão perineural (PNI, perineural invasion) e (3) resposta
linfocítica do hospedeiro (LHR, lymphocytic host response) (Brandwein-Gensler et al.
2005). Este modelo classifica os pacientes em grupos de baixo, intermediário e alto
risco e demonstrou seu poder preditivo para recidiva local e sobrevida global em CEC
oral (Brandwein-Gensler et al. 2005; Brandwein-Gensler et al. 2010). De uma forma
geral, o padrão de invasão tumoral pode ser descrito como o modo que o tumor infiltra
no tecido subjacente, na interface tumor/hospedeiro. Esse padrão de invasão pode
ocorrer de um modo disperso, com ilhas celulares ou células soltas, refletindo uma
neoplasia mais agressiva do que em padrões de crescimento mais uniformes, por
inteiro. A resposta linfocitária do hospedeiro pode estar presente ao redor da
neoplasia, como uma faixa contínua de células inflamatórias, como placas de células
inflamatórias dispersas ou então ausente. Por sua vez, a invasão perineural pode
ocorrer com a presença de células e/ou ilhas neoplásicas ao longo ou dentro de um
fascículo nervoso, o que está relacionada a um padrão mais invasivo do tumor
(Brandwein-Gensler et al. 2005).
Recentemente, Almangush e colaboradores (2014) avaliaram a eficácia de
parâmetros histomorfológicos em predizer a mortalidade de pacientes em estágios
iniciais de CEC oral, afim de agrupar pacientes em grupos de alto risco para
tratamentos multimodais, ou em grupos de baixo risco, no qual o tratamento cirúrgico
seria suficiente (Almangush et al. 2014). Resultados revelaram que a profundidade de
invasão, tumor de brotamento (do inglês tumor buddings) e pior padrão de invasão
(WPOI, worst pattern of invasion) foram os únicos parâmetros capazes de predizer
independentemente o prognóstico de pacientes em estágios iniciais (T1/T2N0M0) de
27
CEC oral de língua. Em 2015 introduziram o modelo BD, que é baseado em dois
parâmetros: 1) tumor de brotamento (B, tumor buddings), composto por duas
propriedades de malignidade: perda da coesão celular e ativo movimento invasivo; 2)
profundidade de invasão tumoral (D, depth of tumor invasion), em milímetros. O tumor
de brotamento, definido como a presença de uma única célula neoplásica ou de um
pequeno grupo composto por até 5 células neoplásicas na região de fronte invasivo,
foi utilizado como um parâmetro para avaliar o padrão de invasão, enquanto a
profundidade da invasão foi aplicada para avaliar a profundidade de invasão do tumor
nos tecidos adjacentes. A combinação desses dois fatores BD apresentaram um
importante valor prognóstico associado ao alto risco de recorrência loco-regional e
menor sobrevida em pacientes com CEC oral, conferindo também um aumento na
acurácia e na confiabilidade da predição do prognóstico comparado ao uso desses
parâmetros separadamente (Almangush et al. 2015; Sawazaki-Calone et al. 2015).
Muitos estudos tem buscado um parâmetro histológico que contribua
fortemente na determinação do prognóstico, entretanto, nenhum sistema de
classificação histopatológica tem sido universalmente aceito para CEC oral
(Sawazaki-Calone et al. 2015). As diferenças encontradas entre os perfis histológicos
de CEC oral podem estar relacionadas à agressividade do carcinoma não somente
por características histomorfológicas, mas também pela composição molecular das
distintas regiões do tumor, deixando evidente a necessidade de estudos detalhados
nessas áreas, principalmente na região de fronte tumoral, a qual tem sido
demonstrada como associada à agressividade do tumor.
1.5 Região de fronte invasivo tumoral
Em 1989, Bryne já sugeria que a histologia das áreas invasivas do tumor
(ITF, Invasive Tumor Front) eram importantes para a predição do comportamento
clínico do tumor de CEC oral e auxiliasse na escolha do tratamento (Bryne et al. 1989;
Bryne 1998). Outros estudos também utilizaram essa região ITF para definir um
sistema de classificação histológica e assim tentar predizer o prognóstico de um
paciente de CEC oral (Brandwein-Gensler et al. 2005; Almangush et al. 2014).
A região de fronte invasivo tumoral é um local dinâmico e fundamental na
diferenciação dos tumores malignos, sendo considerada a frente invasiva do epitélio
28
na margem do tecido conjuntivo na transição epitélio-mesenquimal (EMT, epithelial
mesenchymal transition) (Costa et al. 2015; Almangush et al. 2015; Salo et al. 2014).
Essa região ITF apresenta menor grau de diferenciação e alto grau de dissociação
celular, sendo composta por células que apresentam características diferentes
àquelas presentes nas demais regiões do tumor, mais semelhantes às células que
promovem metástase do que às células de outra áreas menos invasivas do tumor
(Liotta 1986; Bryne et al. 1992; Bryne 1998; Almangush et al. 2015). Além disso, as
células neoplásicas da região ITF apresentam um fenótipo mais agressivo e com
habilidade de invadir tecidos adjacentes, vasos sanguíneos e linfáticos e assim
promover metástase (Bankfalvi & Piffko 2000).
A composição molecular e morfológica da área ITF tem sido abordada em
alguns trabalhos, uma vez que eventos importantes para a disseminação do tumor
como o ganho e a perda de moléculas de adesão, a secreção de enzimas proteolíticas,
o aumento da proliferação celular e iniciação da angiogênese ocorrem na interface de
interação tumor-hospedeiro, isto é, na região de invasão do tumor (Bryne 1998;
Bankfalvi & Piffko 2000; Sharma et al. 2013). Muitos processos de adesão célula-
matriz e perda de adesão célula-célula são pré-requisitos para a progressão tumoral
e estudos sugerem que alterações na expressão de moléculas de adesão podem ser
úteis para a determinação do prognóstico. Um aumento na expressão de moléculas
de adesão como caderinas, integrinas, CD44, lamininas, tenascina e glicoproteínas já
foi observado na região ITF. Enzimas proteolíticas também participam do processo de
invasão celular e podem ser ativadas por células do estroma ou pelas células
neoplásicas da região ITF, sendo que o aumento na expressão dessas enzimas na
região de ITF em comparação com as demais áreas do tumor já foi relatado em
estudos de CEC oral. De forma semelhante, um aumento na expressão de moléculas
relacionadas à proliferação celular também já foi encontrado na região ITF comparado
às demais regiões do tumor. Outros eventos como a sinalização molecular para
iniciação da angiogênese e migração celular, bem como interações entre células
neoplásicas e células do sistema imunológico também ocorrem na região de fronte
invasivo tumoral (Bryne 1998; Bankfalvi & Piffko 2000).
Em 2013, Usami e colaboradores (Usami et al. 2013) demonstraram que a
expressão de ICAM-1, uma proteína que acredita-se estar relacionada à malignidade,
é predominante na região frontal invasiva de CEC de língua, tendo sua expressão
29
correlacionada à invasão, metástase em linfonodos e ao aumento do número de vasos
sanguíneos e linfáticos na região afetada. Adicionalmente, desequilíbrios
cromossômicos foram encontrados exclusivamente na região frontal invasiva de
carcinomas de laringe (Ambrosio et al. 2013), sendo que tais alterações
cromossômicas revelaram genes associados a um pior prognóstico.
Portanto, vários eventos moleculares de importância para a disseminação
do tumor ocorrem na interface tumor-hospedeiro, de forma que o fronte invasivo
tumoral pode refletir o prognóstico melhor que outras áreas do tumor (Sharma et al.
2013). Assim, as áreas invasivas do fronte tumoral diferem das demais regiões do
tumor e são de grande interesse para o estudo de malignidade em CEC oral, bem
como na determinação do prognóstico e contribuir para o entendimento da interação
tumor-hospedeiro.
1.6 Ambiente tecidual em câncer – estroma
O sucesso do desenvolvimento tumoral é dirigido em grande parte pelo
ambiente tecidual, no qual as células do estroma do hospedeiro participam da
indução, seleção e expansão das células neoplásticas. Tumores são tecidos
complexos formados por células neoplásicas e pelo estroma circundante. O estroma
é formado por tecido conjuntivo, contendo vários tipos de células, e atua no suporte
de tecidos e órgãos. Dentre os componentes do estroma, fibroblastos são essenciais
na síntese e depósito de matriz extracelular (ECM, extra celullar matrix) a partir da
produção de uma variedade de colágenos e fibronectinas. Coletivamente, o tecido
tumoral é referido como microambiente tumoral (TME, tumor microenvironment). Na
medida que o câncer progride, o TME ao redor também evolui através de contínuas
mudanças nas interações tumor-estroma (Koontongkaew 2013).
A ECM é uma estrutura tridimensional e acelular, presente em todos os
tecidos. Sua função vai além de prover suporte à integridade e elasticidade de tecidos,
a camadas de células na membrana basal e a células individuais como substrato para
a mobilidade celular. Por ser uma estrutura dinâmica, a ECM é constantemente
remodelada para controlar a homeostase tecidual (Hynes 2009). Em mamíferos, a
ECM é composta por diversas proteínas, incluindo colágenos, proteoglicanos (PG,
proteoglycans) e glicoproteínas (Hynes & Naba 2012). Colágenos são as principais
30
proteínas estruturais da ECM e podem ser classificadas em fibrilares (colágenos I-III,
V e VI), que proveem resistência à ECM, e não fibrilares. PGs, como aggrecan,
versican, perlecan e decorin apresentam cadeias laterais de glicosaminoglicanos
(GAGs, glycosaminoglycans) e são intercaladas entre colágenos fibrilares,
preenchendo o espaço intersticial extracelular e conferindo hidratação. Além de sua
função de modelamento da ECM, glicoproteinas como as lamininas, elastina,
fibronectinas, trombospondinas, tenascinas e nidogênio também estão envolvidas na
interação célula-ECM, atuando como ligantes para receptores da superfície celular
como as integrinas. Há ainda outras proteínas associadas à ECM e que participam de
seu modelamento, entre elas encontram-se fatores de crescimento, citocinas,
metaloproteinases como as ADAMs, mucinas, lectinas, galectinas, semaforinas e
plexinas (Murphy 2008; Bonnans et al. 2014).
Há dois tipos de ECM que diferem quanto à localização e composição: 1)
matriz do tecido intersticial conjuntivo, que envolve células e provê suporte para
tecidos e 2) membrana basal, uma forma especializada da ECM que separa o epitélio
do estroma circundante e controla a organização celular e a diferenciação por meio
de interações com receptores da superfície celular e outras proteínas da ECM
(Bonnans et al. 2014). A matriz intersticial é composta principalmente por colágeno
tipo I e fibronectina, enquanto que a membrana basal consiste em grande parte de
colágeno tipo IV, lamininas, proteoglicanos e outras proteínas sintetizadas e
secretadas pelas células epiteliais, endoteliais e fibroblastos (Figura 4) (Bonnans et
al. 2014).
31
Figura 4. Composição estrutural e proteica da matriz extracelular (ECM). A ECM pode ser dividida em dois tipos, a membrana basal, a qual separa o epitélio do estroma circundante, e a matriz intersticial, que envolve células e provê suporte para tecidos. Componentes da ECM interagem constantemente com as células epiteliais, servindo como ligantes para receptores celulares e transmitindo sinais que regulam vias e processos biológicos. (Adaptado de Bonnans et al. 2014).
A estrutura da ECM bem como as proteínas nela presentes apresentam
papéis vitais na determinação, diferenciação, proliferação, sobrevivência, migração e
invasão celular. Os processos de invasão celular e metástase ocorrem em diversos
passos, incluindo a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), invasão
local, migração celular, intravasation (invasão de vasos sanguíneos ou linfáticos por
células cancerígenas), extravasation (saída das células cancerígenas pelos capilares)
e crescimento em um sítio secundário (Hanahan & Weinberg 2000; Zetter 1998).
Embora muitos genes estejam relacionados com a disseminação do
câncer, entre os mais caracterizados estão aqueles que codificam proteases de
degradação da matriz e proteínas de adesão. Por sua vez, proteases como as
metaloproteases de matriz (MMPs, matrix metalloproteinases) degradam e
remodelam a matriz extracelular, permitindo que células tumorais possam invadir
localmente ou também formar metástase. Além de permitirem o desenvolvimento de
metástases, proteases também podem ativar fatores como fator de crescimento de
fibroblasto-2 (FGF-2), fator-α de transformação de crescimento (TGF-α) e fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF), os quais promovem o aumento do
crescimento celular, a migração celular e angiogênese. De acordo com suas funções
apresentadas no processo de metástase, altos níveis de diversas proteases têm sido
32
associados com prognósticos em diferentes malignidades (Duffy 1996; Murphy 2008;
Roy & Walsh 2014).
Assim como as proteases, moléculas de adesão também estão envolvidas
em muitos estágios durante invasão e metástase. Nos estágios iniciais da via
metastática, as células necessitam se soltar das células vizinhas e aderirem à
membrana basal. Como as células invasoras migram através da matriz extracelular,
muitos passos de adesão e liberação ganham espaço. Na circulação, células tumorais
aderem a células sanguíneas e a células endoteliais. A adesão é mediada por
proteínas transmembrânicas, como integrinas, caderinas e selectinas alterações na
expressão dessas proteínas, especialmente as caderinas e integrinas, são
frequentemente encontradas em condições de malignidade (Behrens 1993; Bendas &
Borsig 2012).
Diversos tipos celulares podem ser encontrados no TME, incluindo
fibroblastos, fibroblastos associados ao carcinoma (CAFs, carcinoma-associated
fibroblasts), miofibroblastos, células do músculo liso, células endoteliais, pericitos,
células do sistema imunológico como neutrófilos, eosinófilos, basófilos, manócitos,
linfócitos T e B, células natural killer e células apresentadoras de antígeno (APC),
como os macrófagos e células dendríticas (Koontongkaew 2013; Kalluri 2016). Esses
diferentes tipos celulares no ambiente estromal podem ser recrutados pelas células
malignas para auxiliar o crescimento tumoral e facilitar a disseminação metastática
(Xing et al. 2010). Muitos estudos têm demonstrado o papel desses componentes no
desenvolvimento e progressão tumoral, em particular os CAFs (Salo et al. 2014;
Bagordakis et al. 2016). Os CAFs são abundantes no estroma do tumor e
desempenham um papel fundamental na progressão tumoral, promovendo o
crescimento e invasão de células neoplásicas por diversos mecanismos (Xing et al.
2010). Seus precursores são fibroblastos normais e a trans-diferenciação em CAFs é
dirigida em grande parte por citocinas como o transforming growth factor-β (TGF- β)
liberadas pelas células neoplásicas (Pietras & Östman 2010; Bremnes et al. 2011;
Salo et al. 2014). CAFs podem ser identificados pela expressão de α-actina de
músculo liso (α-smooth muscle actin, αSMA) e sua presença tem sido associada a um
pobre prognóstico à invasão de ossos em CEC oral (Bremnes et al. 2011; Elmusrati
et al. 2017). Muitos reguladores moleculares secretados por CAFs apresentam papel
pró-tumorigênico. A avaliação do secretoma (proteínas secretadas) de CAFs de CEC
33
oral indicou uma indução da produção de colágeno tipo I (PINP, type I collagen N-
terminal propeptide) por essas células estromais, sendo que altos níveis da expressão
dessa proteína foi associada a um pior prognóstico da doença (Bagordakis et al.
2016). Outros estudos demonstraram que CAFs são encontrados em
aproximadamente 60% dos casos de CEC oral (Kellermann et al. 2007; Kellermann et
al. 2008), frequentemente em contato com ilhas tumorais, mas não encontrados em
tecidos livre de tumor e no estroma adjacente ao tumoral (Rodrigues et al. 2015),
sendo sua presença também associada ao pior prognóstico de CEC oral (Dourado et
al. 2017). Por sua vez, a habilidade de CAFs em influenciar o crescimento tumoral
está associada à indução da angiogênese por meio do stromal cell-derived factor 1
(SDF1) derivado de CAFs e pelo recrutamento de células endoteliais derivadas da
medula óssea (Kalluri 2016). Em estudos pré-clinicos, CAFs foram indicados como
mediadores da resistência à terapia anti-angiogênica e à terapia com o uso de
inibidores de tirosina quinase (Pietras & Östman 2010).
Nos últimos anos, a interação entre células tumorais e o estroma celular,
que é altamente responsável pela progressão de tumores e suas metástases, tem sido
investigada. Assim, um melhor entendimento da contribuição do estroma para a
progressão do câncer pode aumentar o conhecimento atual sobre a promoção do
crescimento celular por vias de sinalização e possivelmente levar a novas
intervenções terapêuticas direcionadas ao estroma do tumor (Bremnes et al. 2011;
Bonnans et al. 2014; Kalluri 2016).
Sabendo-se que características histológicas e alterações moleculares
podem diferir amplamente de uma área para outra em um mesmo tumor, o estudo da
composição de proteínas provenientes de diferentes regiões de CEC oral,
especialmente do estroma da região frontal invasiva e do interior dos tumores, tem o
potencial de fornecer um melhor entendimento dos eventos relacionados ao processo
de malignidade, bem como determinar alterações do tecido hospedeiro em resposta
ao desenvolvimento tumoral.
1.7 Alvos terapêuticos e marcadores de prognóstico em CEC oral
Procedimentos cirúrgicos continuam sendo a modalidade de tratamento
principal em CEC oral, exceto em casos inoperáveis. Muitos casos apresentam
34
capacidade de resposta limitada à quimioterapia envolvendo o uso de drogas
citotóxicas devido a mecanismos que podem tanto bloquear o transporte intracelular
desses agentes quanto interferir com os alvos desses agentes moleculares. Assim,
um melhor entendimento dos perfis moleculares e biológicos de CEC oral e da
heterogeneidade dessa doença pode facilitar o desenvolvimento de terapias mais
eficientes e específicas (Silva et al. 2011). Para isso, estudos tem buscado identificar
marcadores moleculares, os quais podem ser definidos como moléculas que indiquem
a presença do câncer ou que possam também informar sobre o comportamento futuro
do câncer quanto à possível metástase ou reposta à terapia.
Diversos fatores moleculares têm sido estudados em câncer de cabeça e
pescoço, incluindo CEC oral. O objetivo de muitos estudos na busca de um marcador
é a identificação inicial de lesões potencialmente malignas e lesões malignas, bem
como a identificação de padrões de marcadores para determinar o prognóstico e
predizer a resposta ao tratamento. Uma vasta lista de potenciais marcadores com um
papel significante no prognóstico tem sido identificada para CEC oral (Silva et al. 2011;
Rivera et al. 2017). Muitos desses estudos foram incluídos em uma recente revisão
sistemática para identificar e avaliar as evidências desses marcadores reportados
para CEC oral (Rivera et al. 2017). Entre os critérios utilizados, os autores
encontraram que a maioria dos estudos na busca por marcadores envolve a análise
de proteínas como alvos, sugerindo 41 marcadores com valor prognóstico em CEC
oral. Dentre esses trabalhos, MMP-2, MMP-1, caderina-1, mucina-1, GLUT-1, mucina-
4, interleucina-8, HPV-16, EGFR (epidermal growth factor receptor) e p53 tem
recebido grande atenção e interesse na comunidade científica. O fator de transcrição
p53, o qual é responsável por regular negativamente o ciclo celular e proteger a
integridade do genoma, também atua como um supressor tumoral por meio da inibição
da proliferação celular. Interessantemente, em CEC oral, estudos apontam que a
maior expressão de p53 indica um pobre prognóstico em casos avançados da doença
(Cutilli et al. 2013; Cutilli et al. 2016). Alterações na cascata de EGFR-Stat3 são
frequentes em CEC oral, sendo que a avaliação das proteínas envolvidas nessa
cascata de sinalização, incluindo as proteínas EGFR, o transdutor de sinal Stat3,
fatores de transcrição como H-ras e c-myc, reguladores celulares p53, ciclina D1, p16,
Rb e Bcl-2 e o marcador de proliferação celular Ki-67, demonstrou que a expressão
35
de p53 e de Stat3 juntamente com a perda de expressão de p16 são preditores
independentes de um prognóstico desfavorável (Shah et al. 2009).
Em geral, muitos estudos abordam a investigação de outras proteínas
como marcadores para CEC oral, incluindo fatores de crescimento e seus receptores,
transdutores de sinais, fatores de transcrição, reguladores do ciclo celular, proteínas
relacionadas à proliferação celular e apoptose, proteínas relacionadas à hipóxia e à
angiogênese (Shah et al. 2009; Jadhav & Gupta 2013). A maioria dos trabalhos
disponíveis na literatura utilizam apenas um marcador, enquanto que uma minoria
avalia o valor prognóstico de um grupo de marcadores. A partir da análise de poucos
marcadores, a relação e a complexidade dos eventos moleculares envolvidos com o
desenvolvimento e progressão tumoral fica difícil de ser compreendida. Dessa forma,
é clinicamente importante analisar simultaneamente uma lista de alterações
moleculares e identificar as modificações mais importantes que possam auxiliar na
compreensão da agressividade da doença e predizer o prognóstico, provendo uma
informação mais precisa a respeito da resposta ao tratamento (Shah et al. 2009).
Atualmente, o uso de marcadores é um assunto de interesse em muitas
pesquisas, uma vez que podem ter grande importância nas etapas de determinação
do diagnóstico e prognóstico. Entretanto, muitos desses estudos ainda se encontram
na fase de descoberta e requerem validação para serem aceitos na prática clínica.
Futuramente, espera-se que um diagnóstico personalizado possa guiar o tratamento
e consequentemente aumentar a chance de cura da doença.
1.8 A complexidade do CEC oral e a importância da proteômica clínica
O CEC oral é o tipo de câncer de cabeça e pescoço mais prevalente, sendo
as modalidades terapêuticas ainda baseadas na predição de índices de estadiamento
clínico e classificação histopatológica. Entretanto, esses critérios são subjetivos e
relativamente incertos devido à natureza heterogênea do tumor e à resposta variável
do paciente à terapia (Silva et al. 2011), de forma que pacientes com o mesmo estágio
da doença podem apresentar uma evolução clínica e tempo de sobrevida distintos.
Num esforço para um melhor entendimento da natureza biológica dessa doença,
pesquisadores têm buscado abordagens alternativas que possam ser úteis para
36
diagnósticos precoces e para a diminuição da mortalidade de câncer oral (Shah et al.
2009).
Há uma grande heterogeneidade celular e molecular no CEC oral, com
muitos genes e produtos proteicos potencialmente envolvidos em sua carcinogênese.
A carcinogênese oral, por sua vez, é um processo multifatorial com várias etapas,
modulado por fatores ambientais e genéticos, no qual diferentes mecanismos estão
envolvidos na progressão da aquisição de mutações, levando ao acúmulo de
alterações genéticas e a padrões de expressão alterados e modificações da estrutura
e função de proteínas (Wu et al. 2002; Rivera 2015). Tais mecanismos estão
relacionados com a autonomia na aquisição da sinalização de crescimento
(oncogenes), inibição de sinais de crescimento (genes supressores de tumor), fuga
da apoptose, imortalização celular, angiogênese e, finalmente invasão e metástase
estão presentes simultaneamente (Choontharu et al. 2012). De forma geral,
queratinócitos da mucosa oral normal são cronicamente expostos a fatores de risco
ao desenvolvimento de câncer oral, os quais podem interromper a homeostase e gerar
instabilidade genética, com alterações genéticas chaves nos genes TP53, NOTCH1,
EGFR, CDKN2 (cyclin-dependent kinase inhibitor 2a), STAT3, ciclina D1 e Rb. A
proliferação e o crescimento celular descontrolado, juntamente com alterações do
microambiente tumoral e perda de adesão celular, favorecem eventos de invasão das
células. Alterações nos níveis de E-caderina, N-caderina e vimentina promovem a
transição EMT, enquanto endotelinas promovem a proliferação de células endoteliais,
as quais produzem fatores como EGF que estimulam a migração celular (Rivera
2015). Portanto, há uma associação entre diferentes genes, seus produtos proteicos
e o desenvolvimento e progressão de CEC oral. Muitos destes genes e proteínas já
foram previamente descritos na literatura, enquanto outros apresentam funções
biológicas desconhecidas e necessitam de mais estudos.
Na busca por proteínas que sejam marcadores de diagnóstico e de
prognóstico ou até mesmo alvos de drogas e terapias, abordagens modernas de
proteômica baseada em espectrometria de massas têm sido amplamente utilizadas
para a identificação e caracterização de proteínas em diversos tipos de amostras
biológicas para o estudo de neoplasias, incluindo o CEC oral. A proteômica consiste
no estudo de proteínas em larga escala, incluindo a detecção, identificação,
quantificação, caracterização de modificações pós-traducionais (PTMs,
37
posttranslational modifications), determinação de interação proteína-proteína e
regulação (Bensimon et al. 2012). Juntamente com a espectrometria de massas, a
proteômica permite identificar e quantificar proteínas em uma determinada condição
biológica, seja em cultura de células ou tecidos e fluidos, e assim compreender vias
de sinalização e processos biológicos regulados por essas proteínas que estejam
associados a um determinado fenótipo.
Amostras de tecidos de biópsia e de peças cirúrgicas de pacientes tem sido
amplamente utilizadas no estudo de neoplasias, incluindo o CEC oral. Em seu
trabalho, Flores e colaboradores (Flores et al. 2016) combinaram técnicas de
microdissecção a laser e proteômica baseada em espectrometria de massas para
isolar células e identificar proteínas em amostras teciduais frescas de CEC oral e
mucosa oral normal. Seus resultados identificaram 2529 proteínas, dentre as quais
107 proteínas apresentaram maior expressão nas amostras de CEC oral comparado
ao tecido normal. Particularmente, a proteína EEF1D foi encontrada com maior
abundância nas amostras de CEC oral e, juntamente com seus parceiros de interação,
promoveu a ativação das proteínas ciclina D1 e vimentina. Além disso, a diminuição
de EEF1D em linhagens celulares de câncer oral resultou na diminuição da
proliferação celular, indução da transição EMT e invasão celular. Outros estudos com
amostras de biópsias de CEC oral apontam uma lista de proteínas candidatas a
marcadores de diagnóstico, incluindo ANXA4, FLNA, heat shock protein (HSP)60,
HSP27, alpha B-cristalina, ATP sintase beta, calgranulina B, miosina, tropomiosina e
galectina 1 (He et al. 2004; Liu et al. 2016). Entretanto, a aplicação dessas proteínas
como marcadores ainda se investigações adicionais.
Em comparação com amostras de tecido de biópsia, a qual é obtida de uma
forma invasiva, muitos estudos têm utilizado fluidos biológicos como saliva e plasma
sanguíneo na busca de marcadores em CEC oral. Por sua vez, a saliva apresenta
vantagens sobre o uso de plasma por ser facilmente coletada por uma técnica de
baixo custo e não invasiva. Adicionalmente, a transformação de células epiteliais da
mucosa oral em células malignas ocorre em contato com a saliva, a qual é constituída
por secreções complexas contendo proteínas, carboidratos, lipídeos, eletrólitos e
água, bem como por microrganismos da microbiota oral (Sannam Khan et al. 2016).
Assim, a saliva humana tem sido bastante estudada e considerada uma promissora
estratégia para a descoberta e avaliação de marcadores de CEC oral.
38
Em 2008, um painel de potenciais marcadores para a detecção de CEC
oral foi indicado por um estudo proteômico em saliva (Hu et al. 2008). Cinco proteínas
candidatas (M2BP, MRP14, CD59, catalase e profilina) foram validados por ELISA e
obtiveram alta sensibilidade (90%) e especificidade (83%) para detecção de CEC oral.
De forma semelhante, um outro estudo utilizou uma abordagem proteômica com
marcação isobárica por iTRAq (Isobaric tag for relative and absolute quantitation) em
saliva de pacientes com lesões orais potencialmente malignas e lesões malignas e
identificou actina e miosina como potenciais marcadores para a detecção de câncer
oral (de Jong et al. 2010). Em um estudo mais recente, dentre 19 proteínas candidatas
a marcadores de CEC oral identificadas a partir da avaliação do secretoma de uma
linhagem celular primária de CEC oral e epitélio normal adjacente, THBS2, UFD1L e
DNAJB11 foram validados em maior expressão por imunohistoquímica em CEC oral
(Hsu et al. 2014). Adicionalmente, THBS2 foi também validada com maior expressão
em amostras de saliva de pacientes com CEC oral em comparação com amostras de
indivíduos saudáveis (Hsu et al. 2014).
Considerando o papel de vesículas extracelulares liberadas por células
neoplásicas em mecanismos de sinalização mesmo a longas distâncias, Winck e
colaboradores (Winck et al. 2015) avaliaram por proteômica baseada em
espectrometria de massas o proteoma de microvesículas e o proteoma total da saliva
de pacientes com CEC oral e de indivíduos saudáveis. Proteínas relacionadas ao
sistema inflamatório, ao transporte de metais e proliferação celular foram identificados
no proteoma das vesículas extracelulares, enquanto processos imunológicos foram
encontrados no proteoma de saliva de pacientes, indicando que esses dados podem
contribuir para a determinação do prognóstico de CEC oral. A avaliação de saliva
também foi abordada em um trabalho por Kawahara e colaboradores para a avaliação
de 14 proteínas candidatas a marcadores de diagnóstico de CEC oral (Kawahara et
al. 2016). Por meio da proteômica baseada em alvos, ou seja, por meio do
monitoramento específico de proteínas pré-selecionadas por espectrometria de
massas, as proteínas C1R, LCN2, SLPI, FAM49B, TAGLN2, CFB, C3, C4B, LRG1,
SERPINA1 demonstraram maior abundância em amostras de saliva de pacientes com
CEC oral em comparação com saliva de indivíduos saudáveis. Adicionalmente, as
proteínas CFB, C3, C4B, SERPINA1 e LRG1 foram associadas ao maior risco de
desenvolvimento de CEC oral.
39
Tais estudos demonstram a grande contribuição da proteômica baseada
em espectrometria de massas na descoberta de potenciais marcadores em câncer
oral. Entretanto, nenhum candidato está sendo utilizado na prática clínica devido à
falta de validação desses marcadores em um grande número de amostras clínicas
(Rivera et al. 2017). Além disso, estratégias de proteômica baseada em descoberta
enfrentam desafios como complexidade e faixa dinâmica da mistura de proteínas
presente na amostra, baixa abundância de alguns marcadores e grande
heterogeneidade biológica da doença e entre indivíduos (Rifai et al. 2006). Outro
desafio na validação de marcadores consiste na escassez de estratégias eficientes
para a determinação de quais candidatos justificam o grande investimento financeiro
necessário para o desenvolvimento de um ensaio que demonstre sua robustez. Para
isso, a proteômica baseada em alvos, juntamente com a espectrometria de massas,
tem surgido como a ligação entre a fase de descoberta e a validação de marcadores,
dirigindo os recursos para a avaliação de apenas um grupo de proteínas candidatas
(Rifai et al. 2006).
1.9 Proteômica baseada em descoberta e proteômica baseada em alvos
A quantificação de proteínas é uma das análises mais comuns na
bioquímica. Essa caracterização indica mudanças na expressão de proteínas em um
determinado fenótipo ou a um estímulo. A proteômica baseada em espectrometria de
massas é um método sensível e oferece mais do que a identificação e a quantificação
de proteínas, permitindo também a caracterização funcional, estrutural e pós-
traducional de proteínas, bem como a determinação das relações entre elas,
denominado de interactoma e delas com o sistema biológico (Bensimon et al. 2012).
Inicialmente, muitos estudos de proteômica utilizavam a separação de
proteínas por gel bidimensional (two-dimensional gel electrophoresis, 2D-PAGE), cujo
princípio consiste em separar as proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico, a
partir da focalização isoelétrica na primeira dimensão, e de acordo com suas massas
moleculares na segunda dimensão, seguido pela análise dos spots de gel por
espectrometria de massas para identificação das proteínas (O’Farrell 1975; Celis &
Gromov 2003). Posteriormente, a proteômica utilizando gel bidimensional foi
combinada a técnicas de marcação por sondas fluorescentes, dando origem ao 2D-
40
DIGE (Fluorescence Difference Gel Electrophoresis) (Unlu et al. 1997). Nessa técnica,
cada amostra é marcada com uma sonda fluorescente denominada CyDye (Cy2, Cy3
ou Cy5) e após marcação as amostras podem ser combinadas a fim de que a corrida
seja realizada no mesmo gel 2D, minimizando a variação experimental e facilitando a
comparação entre a mesma proteína proveniente de diferentes amostras (spot
matching). Embora a proteômica por gel bidimensional tenha trazido importantes
contribuições para área, essa técnica limita-se em sensibilidade, faixa dinâmica e
reprodutibilidade (Koomen et al. 2008). A separação por gel bidimensional ainda é
utilizada em alguns estudos, entretanto, esse método tem sido substituído por outras
abordagens mais sensíveis e reprodutíveis, entre outras vantagens.
O desenvolvimento de métodos sem a separação em gel iniciou-se com a
publicação do trabalho de Yates e colaboradores em 1998. O termo shotgun protein
analysis refere-se à técnica que combina digestão enzimática de proteínas seguida
pela separação por cromatografia líquida e análise por espectrometria de massas
sequencial (LC-MS/MS, tandem mass spectrometry) (Yates 1998). Essa técnica
propiciou um ganho significante em eficiência e sensibilidade na análise de misturas
complexas de proteínas, pois muitas moléculas podem ser ionizadas ao mesmo tempo
e o espectrômetro de massas é capaz de selecionar íons individuais para a
fragmentação. A análise direta de misturas complexas apresenta grandes vantagens
em relação a outros métodos que necessitam etapas prévias de purificação, evitando
também perdas significantes de proteínas menos abundantes (Yates 2013).
O rápido avanço da proteômica nos últimos anos foi possível
principalmente devido ao desenvolvimento de duas tecnologias de ionização, como a
ionização por eletrospray (ESI, electrospray ionization) (Fenn et al. 1989) e a
dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz (MALDI, matrix-assisted laser
desorption/ionization) (Karas & Hillenkamp 1988). Juntamente com a miniaturização e
automatização da cromatografia líquida, essas tecnologias possibilitaram mensurar e
identificar peptídeos com alta sensibilidade em amostras biológicas complexas
(Mallick et al. 2007). O surgimento de novos espectrômetros de massas com maior
sensibilidade, resolução e acurácia de massas, acompanhada da geração de
algoritmos computacionais capazes de analisar os dados gerados, permitiram que a
proteômica baseada em espectrometria de massas se tornasse uma poderosa
ferramenta para a identificação e quantificação de proteínas em larga escala.
41
Fundamentalmente, a espectrometria de massas mede a relação de
massa-carga (m/z) de íons em fase gasosa. Por definição, um espectrômetro de
massas consiste em uma fonte de íons, um analisador de massas e um detector que
registra o número de íons em cada valor m/z (Aebersold & Mann 2003). O estudo de
analitos na forma de íons em fase gasosa possui duas características fundamentais:
1) o movimento desses íons podem ser precisamente controlados por um campo
magnético (proporcional a m/z) e 2) Íons em fase gasosa são transmitidos com alta
eficiência para sistemas detectores e multiplicadores de elétrons, possibilitando uma
análise com alta sensibilidade (Kinter & Sherman 2000).
A ionização por ESI e MALDI são as duas técnicas mais utilizadas para
volatilizar e ionizar proteínas ou peptídeos. O método por ESI ioniza os analitos
contidos em uma solução ácida, comumente acoplado à uma coluna de cromatografia
líquida, e são então dispersos em pequenas gotículas carregadas, as quais evaporam
e transferem o analito em sua forma ionizada para o espectrômetro de massas
(Aebersold & Mann 2003). Por sua vez, MALDI forma íons em fase gasosa a partir de
moléculas presentes em uma matriz sólida ou líquida via pulsos de laser (Hoffmann &
Stroobant 2007). Esse método é geralmente utilizado para analisar misturas simples
de peptídeos, enquanto o sistema ESI-MS são mais comuns para a análise de
misturas complexas (Aebersold & Mann 2003). Na proteômica, os principais
parâmetros do analisador de massas são a capacidade de seleção ou filtro,
sensibilidade, resolução e a acurácia de massa que determinam a qualidade do dado
(espectro) gerado. Uma vez ionizados e transferidos para o espectrômetro de massas,
os íons são analisados de acordo com suas razões massa/carga (m/z) no analisador
de massas (Aebersold & Mann 2003).
Atualmente há quatro tipos básicos de analisadores de massas utilizados
na proteômica: ion trap, tempo de voo (TOF, time-of-flight), quadrupolo e o Fourier
transform ion cyclotron (FT-MS). Nos analisadores ion trap, os íons são capturados
por um certo intervalo de tempo e então submetidos à fragmentação. Ion traps são
robustos e sensíveis, porém, uma desvantagem é a baixa acurácia de massas. O
instrumento FT-MS também é um tipo de ion trap, entretanto a captura de íons ocorre
sob um campo de alto vácuo e altamente magnético, o que oferece maior
sensibilidade, acurácia de massas, resolução e faixa dinâmica. O analisador de
massas do tipo TOF opera de forma pulsada e baseia-se no princípio de que as
42
velocidades de dois íons, criados no mesmo instante e com a mesma energia cinética
variam conforme a m/z dos íons, de forma que os mais leves atingem o detector mais
rápido que íons com m/z mais altas. A ionização do tipo MALDI foi a que melhor se
ajustou com esse tipo de analisador, uma vez que é produzida de forma pulsada
(Aebersold & Mann 2003). Por sua vez, o analisador do tipo quadrupolo consiste em
quatro barras paralelas, arranjadas em dois pares opostos, sendo que cada par
apresenta cargas opostas (positiva ou negativa). A aplicação de uma voltagem de
corrente continua (AC) e alternada (RF) gera um campo eletrostático oscilante que
afeta a trajetória centralizada dos íons. O quadrupolo age como um filtro de massas,
pois a variação das voltagens permite que apenas íons com uma determinada m/z
atravessem o centro do quadrupolo, enquanto que os outros íons são desviados da
trajetória central. As vantagens desse tipo de analisador de massas são a alta
velocidade de varredura e fácil acoplamento para análise em tandem, porém, ao filtrar
íons, o quadrupolo se torna um analisador de massas discriminatório (Kinter &
Sherman 2000).
Entre os diferentes tipos de instrumentos, a combinação de um ion trap
linear com um FT-MS rapidamente se tornou uma plataforma popular na proteômica
por combinar a sensibilidade, velocidade e a robustez dos ion traps com a alta
resolução dos instrumentos FT. Esse conceito foi aplicado por Makarov para o
desenvolvimento do analisador Orbitrap combinado a um ion trap linear (Hardman &
Makarov 2003). A estrutura de um Orbitrap consiste em um eletrodo externo no
formato de barril e um eletrodo central coaxial fusiforme. Ambos os eletrodos são
conectados de forma independente com fontes elétricas, as quais produzem um
campo com potencial de distribuição do tipo quadro-logarítmica. Uma vez injetados de
forma deslocada ao equador (z=0), os íons presos em órbita começam a oscilar no
sentido axial e rotacional em um movimento harmônico ao longo do eletrodo axial. A
frequência de oscilação do íon no sentido axial é independente da energia e posição
do íon, porém inversamente proporcional à raiz quadrada da m/z. O movimento dos
íons entre os eletrodos induzem uma corrente elétrica que pode ser medida e
posteriormente transformada em espectro de massas por meio da equação de
transformada de Fourier (Hu et al. 2005).
Por fim, os íons podem ser eletricamente detectados pelo detector. A
escolha do detector depende do tipo de instrumento e das aplicações analíticas. Após
43
serem fragmentados e analisados, o sinal dos íons alcança o detector, o qual amplifica
o sinal da corrente de íons e o transfere para o sistema de processamento de dados.
Há vários tipos de detectores que podem ser utilizados na espectrometria de massas.
Os dois tipos principais de detectores são os multiplicadores de elétrons (electron
multiplier detector) e os fotomultiplicadores. No detector do tipo multiplicador, várias
placas coletoras de íons em série são utilizadas e mantidas em potencial crescente.
Quando o íon choca a superfície do multiplicador, dois elétrons são ejetados e em
seguida atraídos pela segunda placa gerando novos dois elétrons. Esse processo
continua até chegar à extremidade do multiplicador de elétrons, resultando em uma
corrente elétrica que é analisada e registrada pelo sistema de dados. De forma
semelhante, na placa de conversão fotomultiplicadora, os íons atingem uma placa e
ocorre a emissão de elétrons, os quais atingem uma tela de fósforo e resultam na
liberação fótons. Estes, por sua vez, são detectados por uma fotomultiplicadora, que
opera em cascada como uma multiplicadora de elétrons (Hoffmann & Stroobant 2007)
(Figura 5).
Figura 5. Componentes básicos de um espectrômetro de massas. Diferentes tipos de fontes de ionização, analisadores de massas e detectores podem ser utilizados para a análise proteômica. Os mais comuns são apresentados na ilustração. Modificado de (Aebersold & Mann 2003).
44
A fragmentação de peptídeos por espectrometria de massas envolve um
aumento da energia interna dos íons promovida pela colisão com um gás inerte,
levando-os à dissociação. Comumente, a fragmentação é realizada por meio do
processo de dissociação induzida por colisão (CID, collision induced dissociation).
Neste processo, os peptídeos ionizados são introduzidos em uma região de vácuo do
espectrômetro de massas e são então isolados no primeiro analisador de massas,
sendo então acelerados para uma região do espectrômetro preenchida com um gás
inerte (hélio, argônio ou nitrogênio) proporcionando, assim, a colisão dos peptídeos
ionizados com as moléculas do gás inerte. Como resultado, a energia cinética dessas
colisões é convertida em energia vibracional interna e liberada na forma de reações
de fragmentação direcionadas pelos sítios protonados. O modelo da mobilidade do
próton descreve como a energia interna adquirida induz a transferência intramolecular
dos prótons em cada peptídeo, culminando na desestabilização das ligações do
esqueleto polipeptídico. Por consequência, ocorre a formação de dois íon-fragmentos
classificados de acordo a carga residual (próton) retida no lado N-terminal (gerando
fragmentos -a, -b e -c, dependendo da ligação que é fragmentada) ou na região C-
terminal (gerando os fragmentos -x, -y -z, dependendo da ligação que é fragmentada),
segundo a nomenclatura proposta por Roepstorff–Fohlmann–Biemann (Roepstorff &
Fohlman 1984) (Figura 6). Os pares de íons a/x, b/y e c/z são íons correspondentes
aos fragmentos opostos e complementares entre si. A fragmentação por CID favorece
principalmente a formação de íons da série b e y. Embora essa técnica seja
universalmente utilizada para sequenciar peptídeos, ela gera informações limitadas
para peptídeos grandes (>15 aa) e proteínas intactas, além de não preservar
modificações pós-traducionais (Hoffmann & Stroobant 2007).
45
Figura 6. Representação esquemática da fragmentação de peptídeos. Série de íons gerados pela fragmentação, segundo lado N-terminal ou C-terminal em que o íon retém a carga residual (próton). A formação dos pares de íons é favorecida de acordo com o método de fragmentação utilizado. (Retirado de Steen & Mann 2004).
Outro método para a fragmentação de peptídeos é a dissociação por
captura de elétrons (ECD, electron capture dissociation), na qual moléculas com
múltiplas protonações interagem com elétrons de baixa energia, resultando na quebra
da ligação peptídica N-Cα e na formação de fragmentos principalmente do tipo c e z
(Zubarev et al. 1998). Ao contrário da fragmentação por CID, a ECD preserva
modificações pós-traducionais e permite um espectro de MS/MS mais informativo e
homogêneo, com maior cobertura de sequência, sendo, portanto mais utilizado em
análises de proteínas intactas sem uso de digestão enzimática. De forma similar ao
ECD, a dissociação por transferência de elétrons (ETD, electron-transfer dissociation),
utiliza ânions com afinidade eletrônica relativamente baixa. Esses elétrons são
transferidos para cátions multiprotonados de peptídeos, resultando na fragmentação
do esqueleto peptídico e formação de íons da série c e z (Syka et al. 2004; Hoffmann
& Stroobant 2007).
Em 2007, a fragmentação por dissociação induzida por alta energia de
colisão (HCD, high-energy collisional dissociation) foi implementada pela primeira vez
no instrumento LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, U.S.A.) (Olsen, Macek et
al., 2007). Essa tecnologia é similar a CID, porém utiliza uma maior energia de colisão,
com menor tempo de ativação (~0.1 ms para HCD, comparado com ~10 a 30 ms para
CID). Além disso, a fragmentação por HCD utiliza uma câmara do tipo octapolo (e não
do tipo ion trap) e a detecção dos fragmentos é realizada em alta resolução no orbitrap,
possibilitando um espectro mais informativo principalmente na região de baixa m/z
(Olsen et al. 2007; Hoffmann & Stroobant 2007).
46
Para a interpretação dos dados de proteômica e chegar em uma hipótese
biológica, dados quantitativos são crucialmente importantes. A quantificação de
proteínas por espectrometria de massas pode ser realizada a partir da determinação
absoluta ou relativa em comparação a um padrão de referência. Abordagens de
comparação quantitativa de proteínas sem o uso de marcação isotópica é denominada
de label-free (Neilson et al. 2011). Dentre as técnicas de quantificação label-free, a
contagem de espectros (spectral counts) é bem utilizada em estudos proteômicos, a
qual se baseia no princípio de que quanto mais abundante a proteína na amostra,
maior será número de vezes que determinado(s) peptídeo(s) dessa proteína será
selecionado e fragmentado, e portanto maior será o número de espectros desse
peptídeo (Arike & Peil 2014). Muitos métodos de contagem de espectros têm sido
desenvolvidos, incluindo índices de abundância de proteínas (PAIs, protein
abundance indices) (Rappsilber et al. 2003) e o índice modificado de abundância de
proteínas de forma exponencial (emPAI, exponentially modifed protein abundance
index) (Shinoda et al. 2009), no qual o número de peptídeos observados é normalizado
com o número de peptídeos observáveis para a proteína em questão. Outro método
para quantificação label-free é denominado fator de abundância espectral normalizado
(NSAF, normalized spectral abundance factor) (Zybailov et al. 2006), no qual a
contagem de espectro de uma proteína é dividida pelo comprimento da mesma e
normalizado com a soma total de contagem de espectros em uma análise. Uma
variação desse método é o fator distribuído de abundância espectral normalizado
(dNSAF, distributed normalized spectral abundance fator) (Zhang et al. 2010), o qual
considera peptídeos comuns entre diferentes proteínas, de forma que a contagem de
espectro/peptídeos em comum entre diferentes proteínas são distribuídos para cada
proteína baseado na quantidade de peptídeos/contagem de espectros únicos para
cada proteína.
Alguns programas de análise de dados proteômicos reportam o dado
quantitativo baseado na intensidade dos peptídeos de determinada proteína
identificada. A intensidade do sinal do peptídeo ao longo da corrida cromatográfica
pode ser plotado em um gráfico juntamente com o tempo de corrida, de forma que a
área sob a curva (XIC, extracted ion chromatogram) pode ser utilizada para determinar
a quantidade de proteína presente na amostra. Muitos outros métodos para a
quantificação de proteínas têm sido desenvolvidos e podem ser determinados por
47
programas computacionais com a leitura dos dados brutos gerados pelo
espectrômetro de massas, os quais, além de fornecer a identificação das proteínas
por busca contra banco de dados, reportam informações quantitativas para as
proteínas identificadas (Ong & Mann 2005). Embora não seja o objetivo descrever e
comparar diferentes métodos de quantificação e algoritmos utilizados por programas
de busca para identificação de proteínas, o programa MaxQuant com o algoritmo
Andromeda (Cox & Mann 2008) tem sido aplicado em muitos estudos proteômicos.
MaxQuant pode ser aplicado para analisar dados de técnicas de quantificação relativa,
incluindo a quantificação label-free (LFQ, label-free quantification). Valores de LFQ
representam a quantificação relativa da proteína e são representados por um perfil de
intensidade normalizada gerado de acordo com o algoritmo implementado, o qual
considera informações de intensidade do peptídeo, tempo de retenção e m/z entre as
amostras (Cox et al. 2014).
Com o desenvolvimento de técnicas de marcação de proteínas ou
peptídeos, proteomas complexos provenientes de diferentes amostras podem ser
analisados em uma mesma corrida cromatográfica, reduzindo assim a variabilidade e
as etapas no processo de análise. A marcação baseada em isótopos (SILAC, stable
isotope-based labeling with amino acids) é amplamente utilizada para a quantificação
de proteínas provenientes de cultura de células. Entretanto, essa técnica exige passos
extras para o preparo do experimento, enquanto técnicas sem marcação (label-free)
são mais simples e mais baratas. Outra vantagem de não utilizar marcação é que
pode ser aplicada para qualquer amostra, incluindo aquelas que não podem ser
marcados metabolicamente, como por exemplo, amostras clínicas. Além disso, há um
número limitado de amostras que podem ser comparadas em um mesmo experimento
que envolve marcação devido ao número de tipos de marcadores diferentes que
podem ser aplicados simultaneamente.
Em um experimento de proteômica baseada em descoberta, ou seja,
quando o objetivo do experimento é explorar, identificar e quantificar o proteoma da
amostra, o espectrômetro de massas é operado principalmente em um modo de
aquisição dependente dos dados (DDA, data-dependent acquisition), no qual se utiliza
a informação de um espectro de varredura (survey scan ou full MS scan) para
selecionar os íons para fragmentação em um segundo experimento de espectrometria
de massas sequencial. Comumente, os íons mais abundantes detectados na primeira
48
varredura são então isolados para subsequentes fragmentações (MS/MS scans)
(Domon & Aebersold 2010). Embora essa estratégia seja poderosa para identificar
com acurácia milhares de proteínas em uma amostra complexa, peptídeos de baixa
abundância podem não ser selecionados para fragmentação, levando a uma perda de
sensibilidade e reprodutibilidade.
A partir da análise proteômica baseada em descoberta, uma lista de
proteínas pode ser identificada e análises posteriores com dados clínicos pode
levantar proteínas candidatas a marcadores de uma determinada condição, como por
exemplo, diagnosticar ou predizer o prognóstico de doenças. Entretanto, um dos
maiores desafios na identificação de marcadores é a verificação dessas proteínas
candidatas. Nesse contexto, outra abordagem chamada de proteômica baseada em
alvos (targeted proteomics) tem surgido na área de pesquisa em marcadores, cujo
objetivo é a quantificação de um conjunto ou painel de proteínas direcionadas a
responder determinada hipótese biológica (Elschenbroich & Kislinger 2011). Para isso,
proteínas pré-selecionadas em um experimento de proteômica de descoberta podem
ser avaliadas pelo método de monitoramento seletivo de reações (SRM, selected
reaction monitoring), o qual opera em um modo independente dos dados e oferece
alta reprodutibilidade, seletividade, sensibilidade e acurácia quantitativa. Quando um
instrumento do tipo triplo quadrupolo é operado no modo SRM, o primeiro e o terceiro
quadrupolo atuam como filtros de massas para selecionar de forma específica valores
m/z predefinidos de acordo com os peptídeos a serem monitorados, enquanto que o
segundo quadrupolo é utilizado como uma câmara de colisão (Gallien et al. 2011;
Bereman et al. 2012). Assim, o íon precursor e fragmento são escolhidos a partir da
informação m/z do peptídeo, em geral único para a proteína de interesse, com seu
respectivo fragmento (transição) e o instrumento é programado para selecionar,
fragmentar e quantificar somente os peptídeos de interesse (Bereman et al. 2012). O
modo SRM é caracterizado por alta sensibilidade, permitindo o monitoramento de
várias transições (dando origem ao termo multiple reaction monitoring, MRM) e a
quantificação de diferentes proteínas ao mesmo tempo, possibilitando também a
detecção de proteínas de baixa abundância em uma matriz complexa. A quantificação
precisa das proteínas é comumente realizada a partir da adição de peptídeos
proteotípicos – ou seja, peptídeos únicos que identificam apenas uma proteína em
uma análise por espectrometria de massas (Mallick et al. 2007) – para cada proteína
49
monitorada. Esses peptídeos proteotípicos podem ser marcados isotopicamente com
a versão “pesada” (heavy peptides) de resíduos de aminoácidos, comumente lisina ou
arginina, de forma que a quantificação é obtida a partir da razão do peptídeo endógeno
pelo peptídeo de referência encontrado na amostra (razão light/ heavy peptides)
(Wohlgemuth et al. 2015) (Figura 7).
Figura 7. Comparação do fluxograma de proteômica baseada em descoberta versus proteômica baseada em alvos. LC-ESI: cromatografia líquida-ionização eletrospray (liquid chromatography–electrospray ionization); MS/MS: espectrometria de massas in tandem. Modificado de (Doerr 2012).
50
Outras técnicas para a proteômica baseada em alvos tem surgido, incluindo
o monitoramento de reações paralelas (PRM, parallel reaction monitoring), no qual
precursores de m/z específicos referentes aos peptídeos de interesse são isolados no
primeiro analisador e após fragmentação todos os íons fragmentos são detectados
em um espectro de MS/MS, diferindo do SRM convencional em que transições pré-
selecionadas são monitoradas. No PRM, a aquisição do espectro do precursor (MS)
é realizada em alta resolução e acurácia de massa (Gallien et al. 2013). Para isso,
espectrômetros de massas do tipo quadrupolo de alta resolução como o Q Exactives
são utilizados para a realização do método PRM, no qual o terceiro quadrupolo é
substituído por um analisador Orbitrap (ou TOF) (Peterson et al. 2012). Por outro lado,
muitos estudos de proteômica baseada em alvos são conduzidos com instrumentos
triplo quadrupolo de baixa resolução e assim operados pelo modo SRM (Lesur &
Domon 2015).
Uma das aplicações mais encontradas em proteômica baseada em alvos é
a quantificação de candidatos a marcadores para validação e verificação, visando
aumentar a confiabilidade para sua aplicação na prática clínica. Assim, a proteômica
baseada em alvos tem surgido como uma técnica para testar hipóteses geradas na
proteômica de descoberta, de forma mais precisa e quantitativa.
1.10 Associação da microdissecção a laser à proteômica baseada em
espectrometria de massas
A análise de tecidos incluindo técnicas histomorfológicas e
imunohistoquímicas são tradicionalmente utilizadas para realizar diagnóstico de
câncer. A fixação de tecidos em formalina e parafina (FFPE, formalin-fixed paraffin-
embedded) preserva detalhes celulares, estruturais e morfológicos observados por
avaliação microscópica de cortes teciduais finos. Esse processo também estabiliza os
tecidos, permitindo um fácil armazenamento à temperatura ambiente por longos
períodos (Mangé et al. 2009). Por essa razão, o armazenamento de tecidos por FFPE
tem sido utilizado por décadas e ainda hoje é o padrão ouro na prática de laboratórios
de histopatologia (Magdeldin & Yamamoto 2012). Enquanto técnicas como o
congelamento do tecido podem levar à ruptura da estrutura histológica, o uso de FFPE
permite a preservação da histomorfologia do tecido, bem como de seus componentes
51
moleculares, como DNA, RNA e proteínas por longos períodos. Outra vantagem é a
fácil preparação e baixo custo, além de permitir o armazenamento da peça cirúrgica à
temperatura ambiente, facilitando assim a criação de bancos de amostras para
estudos clínicos (Magdeldin & Yamamoto 2012; Gustafsson et al. 2015).
Considerando que tumores são tecidos com alta heterogeneidade celular e
molecular, muitas técnicas têm surgido para o isolamento de regiões de interesse ou
de populações celulares específicas. Nesse contexto, a microdissecção à laser (LMD,
laser microdissection) é uma ferramenta bem estabelecida utilizada para facilitar a
obtenção de áreas de interesse e a aquisição de populações celulares específicas.
Por meio de um sistema de laser infravermelho para captura e de laser ultravioleta
para corte acoplados a um microscópio, a LMD permite a obtenção da região de
interesse sob observação direta (Mustafa et al. 2008).
A espectrometria de massas pode ser empregada juntamente a
ferramentas não proteômicas como a LMD para detalhar o perfil proteico de uma
região de interesse, como o isolamento de células neoplásicas de células normais e
do estroma para posterior caracterização molecular (Mustafa et al. 2008; Datta et al.
2015). Os equipamentos de LMD são capazes de microdissectar tecidos com variadas
espessuras, porém cortes com espessuras inferiores a 5 µm e superiores a 15 µm
podem não serem bem processados. Os cortes são coletados em lâminas especiais
cobertas com membranas e submetidos a protocolos específicos das análises
posteriores.
A associação de ferramentas em combinação com a proteômica vem sendo
amplamente utilizada para descoberta de proteínas diferencialmente expressas no
CEC oral. Patel e colaboradores (Patel et al. 2008) utilizaram a análise proteômica
combinada à LMD para a identificação de novos candidatos para a detecção precoce,
prevenção e tratamento de CEC oral. Esse estudo detectou proteínas
diferencialmente expressas no epitélio oral normal e CEC oral, incluindo
citoqueratinas, marcadores de diferenciação e proteínas envolvidas na transdução de
sinal, migração, regulação do ciclo celular, angiogênese, matriz degradação e
proteínas de supressão tumoral e oncogênicas. Em um outro estudo (Negishi et al.
2009), a aplicação de LMD em tecidos FFPE de CEC oral permitiu o isolamento de
células neoplásicas e resultou na identificação da proteína trasnglutaminase 3 (TGM3)
52
com menor expressão em CEC oral, a qual também estava associada à menor
diferenciação histológica.
Enfim, a análise proteômica baseada em espectrometria de massas
combinada à LMD de tecidos fixados pode permitir a determinação da expressão
diferencial de proteínas em diversas regiões de interesse de amostras clínicas que,
combinadas com os dados clínico-patológicos dos pacientes, resultará em uma
melhor caracterização proteômica para auxiliar na identificação de novos marcadores
de prognóstico e alvos terapêuticos.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Comparar o estroma da região de fronte tumoral invasivo com o estroma
da região do interior do tumor de CEC de língua por meio da identificação de proteínas
diferencialmente expressas e associá-las com um valor prognóstico.
2.2 Objetivos específicos
O objetivos específicos foram:
i) identificar proteínas presentes no estroma do fronte invasivo e do interior
tumoral de tecidos fixados de CEC oral e avaliar sua expressão por proteômica
baseada descoberta;
ii) identificar proteínas com diferentes abundâncias entre o fronte invasivo
tumoral e o interior do tumor a partir da avaliação dos resultados de proteômica
baseada em descoberta;
iii) correlacionar a abundância das proteínas selecionadas com
características clínico-patológicas e com a sobrevida dos pacientes por análises
estatísticas;
iv) avaliar a abundância de proteínas selecionadas em um novo conjunto
de amostras de tecidos fixados de CEC oral por análise imunohistoquímica e
associação com dados clínico-patológicos dos pacientes;
53
v) avaliar proteínas com possível valor prognóstico em amostras de saliva
de pacientes com CEC oral com e sem metástase linfonodal por proteômica baseada
em alvos utilizando o método SRM.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
O presente trabalho tem aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
vinculado à Faculdade de Ciências Médicas UNICAMP para a utilização das amostras
de CEC oral para os estudos de proteômica baseada em descoberta, com o protocolo
CAAE 23163113.5.1001.5404 (Anexo 1), submetido via Plataforma Brasil. As etapas
e experimentos realizados neste estudo seguiram as normas referentes a este comitê
de ética no que diz respeitos ao estudo com seres humanos.
As amostras de CEC oral utilizadas para os experimentos de
imunohistoquímica, sob a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa vinculado à
Faculdade de Ciências Médicas UNICAMP, com o protocolo CAAE
71351517.7.0000.5418, seguiram as normas referentes a este comitê de ética no que
diz respeitos ao estudo com seres humanos (Anexo 2).
Para os experimentos realizados com amostras de saliva, este estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo
(ICESP), Octavio Frias de Oliveira, ICESP, São Paulo, SP, Brasil e Plataforma Brasil
sob parecer de número 675.999 e protocolo CAAE 30658014.1.1001.0065. Um termo
de consentimento foi obtido por todos os pacientes. Os procedimentos utilizados para
a coleta e anotação seguiram os protocolos definidos pelo Comitê de Ética do ICESP
(Anexo 3).
3.2 Seleção das amostras teciduais
Este estudo foi realizado com dois diferentes conjuntos de amostras de
tecidos: 1º) 20 amostras de peças cirúrgicas (n=20) de paciente com carcinoma oral
de células escamosas (CEC oral) primário de língua, fixadas em formalina e
emblocadas em parafina (FFPE) para as análises por espectrometria de massas e 2º)
54
96 amostras de peças cirúrgicas (n=96) de pacientes com CEC oral em FFPE para
marcação por imunohistoquímica (IHC).
No primeiro conjunto de amostras, os pacientes foram diagnosticados e
tratados em dois hospitais de referência em Cascavel, Paraná, Brasil: o Centro de
Oncologia de Cascavel (CEONC) e Hospital do Câncer (UOPECCAN) no período de
1998 a 2008, selecionadas pela Profa. Iris Sawazaki-Calone da Faculdade de
Odontologia da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, Paraná. Para
a seleção das amostras, foram considerados dados clínico-patológicos completos dos
pacientes em relação à progressão do CEC oral, a localização do tumor na língua e o
tratamento baseado em cirurgia radical com ou sem radioterapia pós-operatória e/ou
quimioterapia (Tabela 3 e Tabela 4). A partir da avaliação de lâminas histológicas
coradas em hematoxilina e eosina das peças cirúrgicas de cada paciente, critérios
histológicos de inclusão foram considerados quanto à presença das áreas específicas
de interesse no tumor: presença de estroma da região frontal invasiva do tumor (ITF)
e estroma do interior do tumor (Figura 8). A presença de padrão de invasão em ilhas
de células neoplásicas também foi um critério de inclusão. Em cada lâmina histológica
a região de fronte invasivo tumoral foi considerada como a área onde ilhas neoplásicas
invadem os tecidos subjacentes, como tecido conjuntivo, músculo, glândulas salivares
e vasos sanguíneos, com a delimitação de 1 mm em direção ao interior do tumor. O
interior do tumor por sua vez, foi considerado como a região mais próxima ao epitélio
de origem da neoplasia (quando este estava presente), ou seja, o mais distante da
região ITF.
55
Tabela 3. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC de língua utilizados no estudo de proteômica baseada em descoberta.
Número de Casos Porcentagem
Gênero
Masculino 17 85
Feminino 3 15
Faixa Etária
≤ 56 anos 11 55
> 56 anos 9 45
Tabagismo
(informação de 19 pacientes)
Não Tabagista 3 15,7
Tabagista/Ex Tabagista 16 84,3
Etilismo
(informação de 14 pacientes)
Não Etilista 7 50
Etilista/Ex Etilista 7 50
Estadiamento Clínico
I 3 15
II 6 30
III 5 25
IV/IVa 6 30
Infiltração/ extravasamento capsular
(informação de 19 pacientes)
Não 11 57,9
Sim 8 42,1
Tratamento
Cirurgia 5 25
Cirurgia + Radioterapia 13 0,65
Cirurgia + Radioterapia + Quimioterapia 2 0,1
Recidiva Local
Não 13 65
Sim 7 35
Recidiva Linfonodal
Não 16 80
Sim 4 20
Recidiva à Distância
Não 20 100
Sim 0 0
Sobrevida Livre de Doença
≤ 32 meses 14 70
> 32 meses 6 30
Situação
Vivo 4 20
Morto 16 80
56
Tabela 4. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC de língua utilizados no estudo de proteômica baseada em descoberta quanto ao grau de diferenciação histológica e estágio clínico de CEC.
Paciente Grau de diferenciação Estágio de CEC oral
1 Moderadamente diferenciado Inicial 2 Moderadamente diferenciado Inicial 3 Moderadamente diferenciado Avançado 4 Moderadamente diferenciado Avançado 5 Moderadamente diferenciado Avançado 6 Moderadamente diferenciado Avançado 7 Indiferenciado Avançado 8 Indiferenciado Inicial 9 Bem diferenciado Inicial 10 Moderadamente diferenciado Inicial 11 Moderadamente diferenciado Inicial 12 Moderadamente diferenciado Avançado 13 Moderadamente diferenciado Inicial 14 Moderadamente diferenciado Avançado 15 Indiferenciado Inicial 16 Moderadamente diferenciado Inicial 17 Moderadamente diferenciado Inicial 18 Moderadamente diferenciado Inicial 19 Moderadamente diferenciado Avançado 20 Moderadamente diferenciado Avançado
Figura 8. Fotomicrografia de um corte histológico de CEC oral de língua. (A) A região de fronte invasivo (aumento 2,5x), com uma profundidade de 1 mm, e a região de interior tumoral são evidenciadas na imagem. (B) Em detalhe a região de fronte invasivo tumoral (aumento 20x), destacando a presença de ilhas neoplásicas (setas) e a delimitação de uma parte do estroma tumoral (linha tracejada). (C) Detalhe da região do interior tumoral (aumento 20x) destacando a presença de ilhas neoplásicas (setas) e a delimitação de uma parte do estroma tumoral (linha tracejada).
O segundo conjunto de amostras, utilizado para os experimentos de IHC,
foi constituído por 96 peças cirúrgicas de pacientes diagnosticados e tratados no
Centro de Oncologia de Cascavel (CEONC) e Hospital do Câncer (UOPECCAN),
57
Paraná, Brasil. Os 96 casos foram selecionados para a verificação das proteínas de
interesse, baseado na disponibilidade de estroma tumoral nos cortes histológicos.
As informações clínicas dos pacientes foram: sexo, idade, hábitos como o
tabagismo e o consumo de álcool, localização do tumor, estágio TNM, estado das
margens cirúrgicas, recorrência local e linfonodal, metástase, presença de segundo
tumor primário, tratamento e sobrevivência (Tabela 5). Após o tratamento, os
pacientes foram acompanhados por pelo menos 5 anos e a recorrência da doença foi
confirmada histologicamente. Os resultados foram classificados como sobrevida
específica para a doença, com o tempo de início do tratamento até a morte devido ao
CEC oral ou a última data conhecida em que o paciente estava vivo, e para sobrevida
livre de doença, com o tempo de início do tratamento até o diagnóstico da primeira
recorrência (local, regional ou à distância) ou últimas informações de
acompanhamento para aqueles sem recorrência.
Lâminas histológicas de cada caso foram coradas em hematoxilina e
eosina avaliadas de acordo com quatro sistemas de classificação histopatológicos:
sistema de classificação da OMS (Barnes et al. 2005), sistema de MG (Bryne et al.
1992), modelo HRM (Brandwein-Gensler et al. 2005) e modelo BD (Almangush et al.
2015), todos avaliados por dois patologistas calibrados (Sawazaki-Calone et al. 2015).
58
Tabela 5. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC oral utilizados para as análises por imunohistoquímica.
Casos (N) %
Gênero (96)
Masculino 81 84,3
Feminino 15 15,7
Idade (96)
≤ 57,2 51 53,1
> 57,2 45 46,9
Tabagismo (76)
Ausente 12 15,7
Presente 64 84,3
Etilismo (67)
Ausente 20 29,8
Presente 47 70,2
Tumor primário (96)
T1/T2 78 81,2
T3/T4 18 18,8
Metástase linfonodal (96)
N0 47 48,9
N+ 49 51,1
Estadiamento clínico (96)
I 21 21,8
II 23 23,9
III 19 19,7
IV 33 34,6
Recorrência local (95)
Ausente 73 76,8
Presente 22 23,2
Recorrência linfonodal (95)
Ausente 84 88,4
Presente 11 11,6
Recorrência distante (95)
Ausente 93 97,8
Presente 2 2,2
Sobrevida livre de doença (95)
≤ 44,6 meses 60 63,1
> 44,6 meses 35 36,9
Situação (95)
Vivo 38 40
Morto 57 60
Classificação WHO* (96)
I 15 15,6
II 70 72,9
III 11 11,5
Padrão de invasão** (93)
Ilha 71 76,3
59
Satélite 22 23,7
Resposta linfocítica do hospedeiro** (96)
Ausente 26 27
Presente 70 73
Invasão perineural** (96)
Ausente 67 69,7
Presente 29 30,3
Buddings*** (95)
Ausente 16 16,8
Presente 79 83,2
* Barnes et al. 2005; ** Bradwein-Gensler et al. 2005; *** Almangush et al. 2015.
3.3 Processamento das amostras teciduais e microdissecção a laser (LMD)
Para a microdissecção a laser foram utilizadas um n=20 amostras, sendo
20 amostras originadas do estroma fronte e 20 amostras do estroma no interior do
tumor. Para cada amostra, foram preparadas 4 lâminas histológicas com cortes feitos
em micrótomo, sendo um corte na espessura de 5 μm e as outras três na espessura
de 10 μm. Uma das lâminas histológicas (corte de 5 μm de espessura) foi
confeccionada para guiar o corte por LMD e corada em hematoxilina e eosina. Os
demais cortes (3 lâminas, 10 μm de espessura) foram confeccionados em lâminas
com membrana específicas para LMD (Arcturus® PEN Membrane, Life Technologies),
seguido por coloração com hematoxilina e desidratação em etanol 90% e 100%. As
lâminas foram armazenadas em recipientes para dessecação antes da LMD, segundo
orientações do fabricante.
Após esse processo, as seções de tecido foram submetidas à LMD
utilizando o sistema Leica Laser Microdissection Systems (Equipamento Multiusuário
Projeto FAPESP 2009/53998-3, adquirido pelo Laboratório de Biologia Molecular e
Celular do Centro de Pesquisa Nuclear na Agricultura – CENA USP), para o
isolamento das duas áreas de interesse desse estudo: 1) áreas do estroma da região
frontal invasiva do tumor (ITF) e 2) o estroma do interior tumoral. A profundidade e
extensão da área microdissecada das regiões de interesse foram padronizadas na
objetiva de 10x da seguinte maneira: 1) a região de fronte invasivo foi cortada a partir
da ilha mais distante na superfície invasiva do tumor até 1 mm de profundidade do
corte histológico, contornando toda a extensão do fronte; e 2) o interior foi definido
60
desde as a ilha mais distante no interior tumoral até 1 milímetro à frente, contornando
toda sua extensão. Uma média de 1.000.000 µm² de tecido foi isolada para cada
região do estroma tumoral. Todas as amostras foram coletadas em microtubos de 600
μL, identificadas segundo cada paciente e região histológica e armazenadas à -80ºC
até o momento da extração de proteínas. Os parâmetros ajustáveis no Laser
Microdissection Leica LMD Software do equipamento referentes ao controle do laser
foram considerados ideais para essas amostras e a área em μm² cortada para cada
paciente foi registrada.
3.4 Extração de proteínas e digestão enzimática para proteômica baseada em
descoberta
Os tecidos microdissecados do estroma da região ITF e do estroma interior
foram submetidos à extração de proteínas e digestão com tripsina. Para isso, as
amostras foram tratadas com uréia na concentração final de 8 M, seguido por redução
das proteínas com ditiotreitol (DTT) a 5 mM por 25 minutos a 56°C, alquilação com
iodoacetamida (IAA) a 14 mM por 30 minutos à temperatura ambiente e protegido da
luz, adição de 1mM de cloreto de cálcio e em seguida digestão com tripsina por 16h a
37ºC (2 μg tripsina). A reação foi interrompida com ácido fórmico a 0,4% v/v e as
amostras submetidas à remoção de sais por meio de stage tips coluna C18
(Rappsilber et al. 2007). A remoção de sais das amostras consiste em condicionar a
coluna com metanol 100%, equilibrar com ácido fórmico 0,1% v/v, carregar as
amostras, lavando com ácido fórmico 0,1% v/v e eluir com uma solução de acetonitrila
80% v/v com ácido fórmico 0,1% v/v. As amostras foram então submetidas à secagem
em um concentrador a vácuo e armazenadas a -20ºC para posterior análise por
espectrometria de massas.
3.5 Análise por espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) com
aquisição dependente de dados (DDA)
As análises por LC-MS/MS foram realizadas com a ressuspensão da
mistura de peptídeos em 15 µL de ácido fórmico a 0,1% v/v, sendo 4,5 µL deste
61
volume analisados no espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher
Scientific, U.S.A.) conectado ao sistema de cromatografia líquida EASY-nLC (Proxeon
Biosystem) por meio da fonte nanoeletrospray (Proxeon). Os peptídeos foram então
separados por um gradiente de acetonitrila de 2-90% em ácido fórmico a 0,1% v/v em
uma coluna analítica PicoFrit (20 cm x 75 µm ID e de 5 µm de tamanho de partícula,
New Objective), a um fluxo de 300 nL/min durante 212 minutos, no qual o gradiente
de 35% de acetonitrila é alcançado em 175 min. A tensão do nanoeletrospray foi
ajustada para 2.2 kV e a temperatura da fonte a 275°C. Os métodos de instrumento
para o LTQ Orbitrap Velos foram realizados no modo de aquisição de análise
dependente dos dados (DDA). O espectro full scan (m/z 300-1600) foi adquirido no
analisador Orbitrap após acúmulo de íons 1e6. A resolução no Orbitrap foi definida
para r=60.000 e os 20 íons de peptídeos mais intensos com carga ≥ 2 foram
sequencialmente isolados para um valor de 5000 e fragmentados na câmara de alta
pressão ion trap por dissociação induzida por colisão (CID) (normalizada de 35%). A
exclusão dinâmica foi habilitada com uma lista de exclusão de 500 peptídeos, duração
da exclusão de 60 segundos e contagem de repetição de 1. Uma ativação de Q=0,25
e tempo de ativação de 10 ms foram utilizados.
Os dados de espectrometria de massas de proteômica baseada em
descoberta (DDA) foram depositados no Consórcio ProteomeXchange
(http://proteomecentral.proteomexchange.org), por meio do repositório PRIDE
(Vizcaíno et al. 2014; Vizcaíno et al. 2016), com o identificador PXD007232.
3.6 Análise dos dados brutos de proteômica baseada em descoberta
Dados brutos provenientes da análise por LC-MS/MS das amostras dos 20
pacientes foram processados pelo programa MaxQuant v1.3.0.3 (Cox & Mann 2008)
e os espectros MS/MS submetidos à busca contra o banco de dados de humano do
Uniprot (download em 7 de janeiro de 2015, com 89.649 sequências e 35.609.686
resíduos) por meio da ferramenta de busca Andromeda (Cox et al. 2011). Os
parâmetros de busca incluíram uma tolerância de massas de 6 ppm para íons
precursores (MS search) e de 0,5 Da para íons fragmentos (MS/MS search), com um
máximo de perda de 2 sítios de clivagens. Carbamidometilação das cisteínas foi
considerada como modificação fixa e oxidação da metionina e acetilação do N-
62
terminal de proteínas foram consideradas modificações variáveis. A identificação de
peptídeos e a identificação de proteínas foram filtradas para um máximo de 1% false
discovery rate (FDR). A quantificação das proteínas foi realizada pelo método LFQ
(label-free quantification) disponível no ambiente MaxQuant, com uma contagem
mínima (minimal ratio count) de 2 peptídeos e uma janela de 2 min. Análises
estatísticas foram realizadas com o programa Perseus v1.2.7.4, disponível junto como
pacote MaxQuant (Cox & Mann 2008). Entradas identificadas apenas por sítio de
modificação, bem como aquelas identificadas pelo banco reverso, foram excluídas
para análises posteriores. O filtro de contaminantes não foi utilizado, uma vez que
proteínas como queratina, consideradas como contaminantes, são importantes em
análises de tecidos. O proteoma de amostras de três pacientes foi removido devido à
ausência de quantificação de proteínas observado pelos valores de LFQ e pelo baixo
número de proteínas identificadas representado no histograma dos valores de LFQ
contra o número de proteínas, realizado no Perseus (Apêndice 2).
A abundância das proteínas foi calculada com base na intensidade
normalizada do espectro (LFQ intensity) e seus valores convertidos para log2. As
amostras foram agrupadas de acordo com sua origem tumoral, ou seja, estroma do
fronte invasivo ou estroma do interior tumoral. Um filtro de pelo menos 8 valores
válidos por grupo foi aplicado e valores faltantes (missing values) foram substituídos
por valores randômicos simulando uma distribuição normal, cuja média e desvio
padrão foram escolhidos para simular valores baixos próximos ao nível de ruído
(imputation width = 0.3, shift = 1.8) (Hubner et al. 2010; Marakalala et al. 2016).
Significância estatística na expressão das proteínas entre os grupos foi avaliado por
Student's t-test (p<0.05). Proteínas comuns e exclusivas foram representadas em
diagrama de Venn construído com a ferramenta on line InteractiVenn (Heberle et al.
2015). Para visualização dos dados, heat maps com valores em z-score das
intensidade em log2 LFQ e volcano plot foram construídos com a ferramenta
estatística R. A abundância das proteínas entre as corridas MS foi avaliada com a
ferramenta MSstats (Choi et al. 2014) disponível dentro do programa Skyline
(MacLean et al. 2010).
63
3.7 Correlação da abundância de proteínas identificadas por proteômica
baseada em descoberta com dados clínico-patológicos dos pacientes
A análise de regressão linear foi realizada em ambiente R para avaliar a
(relação linear entre a expressão da proteína e os) seguintes dados clínico-
patológicos: idade (>50 ou <50 anos), gênero, tabagismo, tamanho do tumor,
presença de metástase linfonodal no momento do diagnóstico, estadiamento clínico,
tipo de tratamento (cirurgia, cirurgia e radioterapia, ou combinação de cirurgia,
radioterapia e quimioterapia), sobrevida livre de doença, segundo tumor primário (de
origem histológica diferente), recorrência local, recorrência linfonodal, presença de
pior padrão de invasão (WPOI) (Brandwein-Gensler et al. 2005), presença de infiltrado
inflamatório, invasão perineural, presença de tumor de brotamento (tumor buddings)
de acordo com o modelo BD (Almangush et al. 2015), e sistema de classificação
histopatológica da OMS (WHO histopathological grading system). Um p-valor menor
que 0.05 foi considerado para definir significância estatística. O coeficiente de
correlação de Pearson (coeficiente de correlação produto-momento) foi calculado para
medir a força da associação entre as variáveis. Adicionalmente, a análise de sobrevida
foi calculada pelo método Kaplan-Meier e comparado com o Log-rank t-test, com nível
de significância de 5% (p≤0.05).
3.8 Análise imunohistoquímica dos tecidos de CEC oral
Cortes histológicos de 96 casos de CEC oral foram incubados com anti-
COL6A1 (HPA019142, policlonal, Sigma) diluído 1:1000, anti-ITGAV (HPA004856,
policlonal, Sigma) diluído 1:300 and anti-MB (HPA003123, policlonal, Sigma) diluído
1:75, de acordo com a indicação do Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org),
seguido pelo sistema de detecção Envision (Dako). As reações controle foram
realizadas a partir da exclusão dos anticorpos primários.
Após marcação histoquímica, as lâminas foram coradas com hematoxilina
e eosina para avaliação da marcação dos anticorpos por dois patologistas (valor de
concordância: kappa=0.706), seguindo protocolo de Silva e colaboradores (da Silva
et al. 2015, com modificações). As amostras foram classificadas de acordo com a
intensidade e porcentagem de marcação imunohistoquímica na região do estroma da
64
região ITF ou do estroma do interior do tumor separadamente. O score de cada
intensidade foi somado ao score da porcentagem de marcação, gerando um score
combinado, um para a região ITF e outro para a região do interior tumoral. O score da
região do interior do tumor foi subtraído do score da região ITF, afim de identificar a
diferença das intensidades entre as regiões analisadas. Valores abaixo de zero foram
considerados com menor expressão na região ITF, enquanto valores acima de zero
foram considerados com maior expressão na região ITF (Tabela 6).
Tabela 6. Método de score baseado na intensidade e porcentagem de marcação das proteínas para avaliação da marcação imunohistoquímica nas áreas fronte invasivo e interior tumoral de CEC oral.
Intensidade Porcentagem Score combinado Diferença de expressão
(ITF - interior = -6 a 6) Score
0 – negativo
1 – fraco
2 – moderado
3 – forte
0 – 0%
1 – 1 a 25%
2 – 26 a 50%
3 – >50%
Intensidade + % = 0 a 6
0 = 0
-6 a -1 = 1
1 a 6 = 2
0 mesma expressão
1 menor expressão no IFT
2 maior expressão no ITF
ITF: fronte tumoral invasivo (invasive tumor front).
A correlação entre a marcação imunohistoquímica e parâmetros
demográficos e clínico-patológicos dos pacientes foi realizada por tabulação cruzada
(cross-tabulation) e teste Qui-quadrado. Além disso, análise de sobrevida foi calculada
pelo método Kaplan-Meier e comparado por teste Log-rank t-test. Para análise de
sobrevida multivariada foi utilizado o modelo de risco proporcional de Cox. O nível de
significância considerado foi de 5% (p-valor<0.05).
3.9 Coleta de amostras de saliva
As amostras de saliva foram obtidas voluntariamente de pacientes com
CEC oral apresentando lesões ativas no momento de coleta e então distribuídas de
acordo com o estadiamente clínico (TNM), incluindo pacientes sem metástase
linfonodal (denominado de “N0”, n=10) e pacientes com metástase linfonodal
(denominado de “N+”, n=23). As informações clínico-patológicas dos pacientes são
65
apresentadas na Tabela 7. Para a coleta de saliva, os pacientes estavam em jejum
por pelo menos 1h e enxaguaram a boca com 5 mL de água potável no momento
anterior à coleta, sem estímulo, em um recipiente de vidro (procedimentos seguiram
protocolo descrito em Winck et al. 2015). As amostras de saliva foram separadas em
alíquotas e estocadas a -80°C até o momento de uso.
66
Tabela 7. Dados clínico-patológicos de pacientes com CEC oral utilizados para análise por proteômica baseada em alvos.
Número de casos %
Gênero
(informação para 33 pacientes)
Masculino 29 87,9
Feminino 4 12,1
Idade (33 pacientes)
≤ 54,5 15 45,5
> 54,5 18 54,5
Tabagismo
(informação para 33 pacientes)
Ausente 2 6,1
Presente 31 93,9
Etilismo
(informação para 33 pacientes)
Ausente 3 9,1
Presente 30 90,9
Tumor primário
(informação para 33 pacientes)
T1/T2 13 39,4
T3/T4 20 60,6
Linfonodo
(informação para 33 pacientes)
N0 10 30,3
N+ 23 69,7
Estadiamento clínico
(informação para 31 pacientes)
I 0
II 4
III 7
IV/IVa 20
Recorrência
(informação para 33 pacientes)
Ausente 32 97,0
Presente 1 3,0
Situação
(informação para 33 pacientes)
Vivo 16 48,5
Morto 17 51,5
3.10 Seleção dos peptídeos proteotípicos e das transições
Dentre as proteínas associadas às características clínico-patológicas dos
pacientes, as proteínas COL6A1 [Collagen alpha-1(VI) chain], ITGAV (Integrin alpha-
67
V) e MB (Myoglobin) foram selecionadas para a verificação em amostras de saliva de
pacientes com CEC oral sem apresentação de metástase (N0) ou com metástase
(N+). Os peptídeos foram selecionados com base em parâmetros previamente
descritos (Lange et al. 2008; Gallien et al. 2011). Resumidamente, são escolhidos 2 a
3 peptídeos por proteína considerando o número de resíduos, hidrofobicidade e
evidências de outros experimentos relatados no SRMAtlas (http://www.srmatlas.org).
Ao todo, 8 peptídeos foram selecionados e adquiridos comercialmente como
peptídeos não purificados (pureza 40-50%) marcados isotopicamente (crude heavy-
isotope-labelled peptide) (Thermo Fisher Scientific, U.S.A.). Peptídeos com marcação
isotópica estável (SIL, stable isotope-labelled) foram sintetizados com isótopos
pesados na lisina, arginina ou leucina (+8, +10 ou +7 Da, respectivamente),
localizados preferencialmente no C-terminal do peptídeo (Thermo Fisher Scientific,
U.S.A.). Três transições foram monitoradas para cada peptídeo leve e pesado,
totalizando 48 transições (8 peptídeos leves x 3 transições + 8 peptídeos pesados x 3
transições) (Tabela 8). Oito peptídeos de padrões internos de tempo de retenção
(Pierce™ Peptide Retention Time Calibration Mixture, Thermo Fisher Scientific,
U.S.A.) foram adicionados às amostras e 24 transições foram monitoradas para
controlar desvios no tempo de retenção na cromatografia líquida. Ao todo, 72
transições foram monitoradas em cada amostra.
68
Tabela 8. Transições utilizadas para monitorar as proteínas de interesse por proteômica baseada em alvos.
Sequência do peptídeo Proteína Modificação m/z do precursor
Carga do precursor
m/z do fragmento
Carga do fragmento
Íon fragmento
Melhor tempo de retenção*
Tempo de retenção predito
GLEQLLVGGSHLK COL6A1 Leve 450,929509 3 810,483214 1 y8 28,33 27,91
GLEQLLVGGSHLK COL6A1 Leve 450,929509 3 697,399149 1 y7 28,33 27,91
GLEQLLVGGSHLK COL6A1 Leve 450,929509 3 598,330736 1 y6 28,33 27,91
GLEQLLVGGSHLK COL6A1 Pesado 453,600909 3 818,497413 1 y8 28,23 27,91
GLEQLLVGGSHLK COL6A1 Pesado 453,600909 3 705,413348 1 y7 28,23 27,91
GLEQLLVGGSHLK COL6A1 Pesado 453,600909 3 606,344935 1 y6 28,23 27,91
LSIIATDHTYR COL6A1 Leve 430,56646 3 863,400606 1 y7 20,33 23,2
LSIIATDHTYR COL6A1 Leve 430,56646 3 691,315814 1 y5 20,33 23,2
LSIIATDHTYR COL6A1 Leve 430,56646 3 576,288871 1 y4 20,33 23,2
LSIIATDHTYR COL6A1 Pesado 433,902549 3 873,408875 1 y7 20,44 23,2
LSIIATDHTYR COL6A1 Pesado 433,902549 3 701,324083 1 y5 20,44 23,2
LSIIATDHTYR COL6A1 Pesado 433,902549 3 586,29714 1 y4 20,44 23,2
TAEYDVAYGESHLFR COL6A1 Leve 586,609164 3 788,404963 1 y6 25,58 28,6
TAEYDVAYGESHLFR COL6A1 Leve 586,609164 3 728,846415 2 y12 25,58 28,6
TAEYDVAYGESHLFR COL6A1 Leve 586,609164 3 647,314751 2 y11 25,58 28,6
TAEYDVAYGESHLFR COL6A1 Pesado 589,945254 3 798,413232 1 y6 25,54 28,6
TAEYDVAYGESHLFR COL6A1 Pesado 589,945254 3 733,85055 2 y12 25,54 28,6
TAEYDVAYGESHLFR COL6A1 Pesado 589,945254 3 652,318886 2 y11 25,54 28,6
IYIGDDNPLTLIVK ITGAV Leve 787,445431 2 1184,652129 1 y11 35,72 34,24
IYIGDDNPLTLIVK ITGAV Leve 787,445431 2 1127,630666 1 y10 35,72 34,24
IYIGDDNPLTLIVK ITGAV Leve 787,445431 2 1012,603723 1 y9 35,72 34,24
IYIGDDNPLTLIVK ITGAV Pesado 791,452531 2 1192,666328 1 y11 35,76 34,24
IYIGDDNPLTLIVK ITGAV Pesado 791,452531 2 1135,644865 1 y10 35,76 34,24
IYIGDDNPLTLIVK ITGAV Pesado 791,452531 2 1020,617922 1 y9 35,76 34,24
LQEVGQVSVSLQR ITGAV Leve 481,603573 3 689,394064 1 y6 22,54 24,27
LQEVGQVSVSLQR ITGAV Leve 481,603573 3 503,293622 1 y4 22,54 24,27
69
LQEVGQVSVSLQR ITGAV Leve 481,603573 3 416,261593 1 y3 22,54 24,27
LQEVGQVSVSLQR ITGAV Pesado 484,939663 3 699,402333 1 y6 22,84 24,27
LQEVGQVSVSLQR ITGAV Pesado 484,939663 3 513,301891 1 y4 22,84 24,27
LQEVGQVSVSLQR ITGAV Pesado 484,939663 3 426,269862 1 y3 22,84 24,27
STGLNAVPSQILEGQWAAR ITGAV Leve 999,523795 2 1355,706625 1 y12 31,63 32,32
STGLNAVPSQILEGQWAAR ITGAV Leve 999,523795 2 688,352534 1 y6 31,63 32,32
STGLNAVPSQILEGQWAAR ITGAV Leve 999,523795 2 503,272492 1 y4 31,63 32,32
STGLNAVPSQILEGQWAAR ITGAV Pesado 1004,52793 2 1365,714894 1 y12 31,67 32,32
STGLNAVPSQILEGQWAAR ITGAV Pesado 1004,52793 2 698,360803 1 y6 31,67 32,32
STGLNAVPSQILEGQWAAR ITGAV Pesado 1004,52793 2 513,280761 1 y4 31,67 32,32
HGATVLTALGGILK MB Leve 450,941638 3 772,492716 1 y8 31,22 33,48
HGATVLTALGGILK MB Leve 450,941638 3 600,407923 1 y6 31,22 33,48
HGATVLTALGGILK MB Leve 450,941638 3 487,323859 1 y5 31,22 33,48
HGATVLTALGGILK MB Pesado 453,613037 3 780,506915 1 y8 31,19 33,48
HGATVLTALGGILK MB Pesado 453,613037 3 608,422122 1 y6 31,19 33,48
HGATVLTALGGILK MB Pesado 453,613037 3 495,338058 1 y5 31,19 33,48
YLEFISECIIQVLQSK MB Leve 657,348293 3 815,498529 1 y7 25,76 43,3
YLEFISECIIQVLQSK MB Leve 657,348293 3 702,414465 1 y6 25,76 43,3
YLEFISECIIQVLQSK MB Leve 657,348293 3 709,389602 2 y12 25,76 43,3
YLEFISECIIQVLQSK MB Pesado 660,019693 3 823,512728 1 y7 26,04 43,3
YLEFISECIIQVLQSK MB Pesado 660,019693 3 710,428664 1 y6 26,04 43,3
YLEFISECIIQVLQSK MB Pesado 660,019693 3 713,396701 2 y12 26,04 43,3
*Melhor tempo de retenção reportado pelo programa Skyline de acordo com os dados observados experimentalmente.
70
3.11 Preparação das amostras de saliva para proteômica baseada em alvos
As amostras de saliva foram centrifugadas a 1.500 x g por 5 min, a 4°C,
para sedimentação dos debris celulares. O sobrenadante foi separado do sedimento
e então quantificado pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad, U.S.A.). Um volume
correspondente a 10 µg do total de proteínas foi utilizado para o preparo da amostra
e o volume de todas as amostras foi ajustado para que tivessem a mesma
concentração final de proteínas. Os 10 µg do total de proteínas foi então desnaturado
em solução contendo concentração final de 100 mM de Tris-HCl pH 7,5, 8 M ureia, 2
M tioureia, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT e coquetel inibidor de protease
(Protease Inhibitor Cocktail cOmplete Mini Tablets, Roche, Auckland New Zealand).
As amostras foram sonicadas por 10 min e então centrifugadas a 10.000 x g por 5
min. O sobrenadante foi coletado e as proteínas foram reduzidas com DTT e
alquiladas com iodoacetamida, seguido por digestão com tripsina (1,8 µg) a 37°C. A
reação foi interrompida com a adição de ácido trifluoracético 0,4% v/v, ou até atingir
um pH próximo de 2, seguido por remoção de sal das amostras por stage tips coluna
C18 (Rappsilber et al. 2007). Após secagem em vácuo, os peptídeos foram
ressuspendidos em 0,1% de ácido fórmico. Peptídeos SIL e padrões do tempo de
retenção iRT foram adicionados às amostras digeridas a partir de 10 µg de saliva.
A fim de prevenir viés durante a análise por espectrometria de massas, a
ordem de corrida das amostras foi preparada por randomização e blocking (Oberg &
Vitek 2009) dos grupos (N0 e N+), incluindo as réplicas técnicas (triplicatas), em
ambiente R.
3.12 Verificação dos peptídeos por proteômica baseada em alvos
Amostras foram analisados em espectrômetro de massas triplo quadrupolo
Xevo TQ-XS (Waters, Milford, MA, USA), equipado por fonte electrospray acoplada à
Acquity UPLC-Class M LC system (Waters, Milford, MA, USA) e pelo software
MassLynx (version 4.2). Uma alíquota contendo 1 µg da mistura de peptídeos foi
utilizada por cada amostra. Os peptídeos foram separados em coluna BEH Shield C18
IonKey (10 cm x 150 µm ID, matriz de resina de sílica, 1,7 µm partículas C18 - Waters,
USA) aquecida a 40°C. As amostras foram mantidas a 4°C antes de serem carregadas
71
na coluna Acquity UPLC-Class M LC. As condições cromatográficas utilizadas foram:
gradiente de 60 min e fluxo de 1,2 µL/min, iniciando com 98% A (água), seguido por
40% B (acetonitrila) por 45 min, até 85% B até 47 min e 2% B em 60 min. O
instrumento foi operado em modo SRM programado (tempo de retenção, janela de 3
min e tempo de ciclo de 3s), sob a unidade de resolução (0,7 Th de largura total do
pico na metade de sua altura máxima – full width of the peak at half its maximum
height, FWHM) nos analisadores de massas Q1 e Q3. O espectrômetro de massas foi
operado em modo positivo, com temperatura do capilar de 150°C, com fonte sob 30V,
e voltagem do capilar de 3,5 kV. A voltagem do cone foi ajustada para 50 V, fluxo de
gás no cone à 150L/h, nanofluxo de gás à 0,4 bar e energia de colisão (CE, collision
energy) foi determinada pelo programa Skyline. A energia de colisão foi determinada
pela equação linear: para peptídeos com carga 2, CE= 0,037±0,009*m/z-1,066±5,024,
e para peptídeos com carga 3, CE=0,036±0,004*m/z-1,328±2,088 (MacLean et al.
2010). O dwell time para os peptídeos monitorados foi calibrado automaticamente no
programa MassLynx v4.2, não abaixo de 0,010s, correspondendo à aproximadamente
10 ou mais pontos de aquisição por pico da cromatografia. Padrões de peptídeos
internos marcados com isótopos na porção C-terminal em lisina ou arginina, +8 ou
+10 Da, respectivamente (Thermo Fisher Scientific, U.S.A.).
3.13 Análise quantitativa e estatística dos dados de proteômica baseada em
alvos (SRM)
A visualização e avaliação dos peptídeos foi manualmente realizada com o
programa Skyline. Ambos peptídeos leve e pesado foram conferidos quanto à
qualidade do dado pela observação da co-eluição de todas as três transições,
alinhamento do tempo de eluição dos peptídeos leve e pesado, correlação da
intensidade relativa à biblioteca de espectros (dotp score), intensidade relativa aos
fragmentos leve e pesado (rdotp score) e reprodutibilidade entre as réplicas técnicas.
Cada peptídeo foi quantificado na amostra pela divisão da intensidade do peptídeo
leve (soma das transições leves) pela intensidade de cada peptídeo SIL de referência
(soma das transições pesadas) para obter a relação de peptídeo leve e pesado.
A razão leve/pesado para cada peptídeo foi obtida pelo programa Skyline.
A fim de determinar a razão de peptídeos entre os dois grupos analisados (N+ vs N0),
72
as seguintes etapas foram realizadas: 1) a razão leve/pesado de cada peptídeo
monitorado foi exportado pelo programa Skyline; 2) a média foi calculada para cada
razão leve/pesado dos peptídeos (média da razão leve/pesado); 3) para avaliar a
correlação da quantificação do peptídeo, em todas as amostras, a média de cada
peptídeo em cada grupo de amostra (média do grupo) foi calculada considerando o
valor da média leve/pesado calculado anteriormente; 4) por último, a razão entre os
dois grupos (razão N+/N0) foi calculada e transformada em log2.
De forma semelhante, para avaliar a quantidade de proteína entre os dois
grupos (N+ vs N0), as etapas foram as seguintes: 1) as médias dos valores para cada
peptídeo individual (média da razão leve/pesado) correspondente a uma proteína de
interesse foram somadas para obter a abundância relativa da respectiva proteína
(soma da razão leve/pesado de cada peptídeo da mesma proteína); 2) a partir da
média dessa soma das médias dos peptídeos de uma mesma proteína, a razão foi
calculada entre os dois grupos (razão N+/N0 de cada proteína) e transformada em
log2. Significância estatística na expressão das proteínas entre os grupos foi avaliado
por Student's t-test (p-valor<0.05) e proteínas acima do corte estabelecido foram
indicadas em um Volcano plot e em gráficos de barras.
As correlações entre a abundância das proteínas resultantes da análise por
SRM e os dados clínico-patológicos foram calculadas por tabulação cruzada e teste
Qui-quadrado. O nível de significância considerado foi de 5% (p-valor<0.05).
Dados de espectrometria de massas com o método SRM estão
depositados no repositório Panorama no seguinte link
(https://panoramaweb.org/labkey/project/LNBio%20-%20Mas%20Lab/PaesLeme-
SRM%20Saliva%20OSCC/begin.view?).
3.14 Predição do valor prognóstico de proteínas para CEC oral
Para avaliar o valor prognóstico das proteínas selecionadas para os
experimentos de verificação da abundância (COL6A1, ITGAV, MB), foi determinado o
valor da abundância de cada proteína em pacientes do grupo N0 e em pacientes do
grupo N+. Valores de ponto de corte ótimo foram determinados pela análise de curvas
de características de operação do receptor (ROC, receiver operating characteristic).
Curvas ROC foram geradas plotando a taxa de verdadeiro positivo (sensibilidade)
73
contra a taxa de falso positivo (1-especificidade) usando easyROC (Goksuluk et al.
2016) e valores de abundância das proteínas. Um intervalo de confiança (CI) de 95%
da área sob a curva (AUC, area under curve) foi determinado. Pontos de corte ótimos
para as proteínas foi calculado por meio do Youden's J statistic (Ruopp et al. 2008).
4 RESULTADOS
4.1 Proteínas identificadas a partir da associação da microdissecção a laser e
espectrometria de massas por proteômica baseada em descoberta
A microdissecção a laser (LMD) foi utilizada para individualizar as regiões
de interesse, separando as regiões do estroma do fronte invasivo tumoral (ITF) e
estroma do interior tumoral (Figura 9). Foram isoladas em média 1.413.055 μm2 para
estroma do ITF e 1.195.036 μm2 para estroma do interior tumoral.
Figura 9. Sequência de LMD em um corte de CEC de língua. (A) Região do fronte invasivo tumoral de um corte histológico de CEC de língua antes e após a remoção do estroma tumoral (corado com hematoxilina, aumento 10x). (B) Em detalhe, imagem do microtubo coletor com o tecido microdissectado (aumento 6,3x). (C) Região do interior do tumor de um corte histológico de CEC de língua antes e após a remoção do estroma tumoral (corado com hematoxilina, aumento 10x). (D) Imagem do microtubo coletor com o tecido microdissectado (aumento 6,3x).
74
A partir da proteômica quantitativa, baseada em espectrometria de massas
com aquisição dependente de dados (DDA), foram identificadas e quantificadas 1.733
proteínas nas duas regiões do estroma, após exclusão de proteínas identificadas
unicamente por sítio de modificação e aquelas identificadas pelo banco reverso.
Considerando as proteínas quantificadas ou com valores válidos em pelo menos 8
amostras em pelo menos um grupo, 704 proteínas permaneceram na lista de
identificadas e quantificadas. O número de proteínas identificadas em cada região é
apresentado em diagrama de Venn (Figura 10A), no qual é possível verificar o número
de proteínas identificadas nas duas diferentes áreas do tumor, bem como proteínas
encontradas apenas em uma das regiões. Um total de 602 proteínas foi compartilhado
entre as duas regiões do tumor estudas, sendo 42 proteínas identificadas apenas no
estroma do ITF e 60 proteínas identificadas no estroma do interior do tumor. A análise
de agrupamento apresentou diferenças no perfil de expressão de proteínas entre
amostras da mesma região do tumor, revelando a heterogeneidade da doença entre
os diferentes indivíduos (Figura 10B).
Dentre as 704 proteínas identificadas (após filtro de valores válidos), 101
proteínas revelaram expressão diferencial pelo Student’s t-test pareado (p-valor<0,05)
entre estroma do ITF e estroma do interior tumoral (Tabelas suplementares, Apêndice
1).
75
Figura 10. Representação das proteínas identificadas nas regiões estroma do fronte invasivo tumoral (ITF) e estroma do interior tumoral. (A) Número de proteínas identificadas em comum entre as regiões do estroma e proteínas identificadas apenas em uma das regiões. (B) Análise de agrupamento mostra a separação das amostras de acordo com a similaridade no perfil de abundância das proteínas, representada em z-score (log2 LFQ intensity) e em cores de acordo com baixa (azul) ou alta (vermelho) abundância. Análise de agrupamento foi realizada em ambiente R utilizando distância Euclideana e método de ligação por média para cálculo da similaridade.
76
4.2 Dados clínico-patológicos correlacionados com a abundância de proteínas
identificadas por proteômica baseada em descoberta no estroma de CEC oral
Análise de regressão linear foi utilizada para analisar a associação do
fenótipo clínico-patológico do paciente com o proteoma das diferentes regiões do
estroma de CEC oral. Dentre as 101 proteínas com expressão diferencial entre as
regiões de interesse, 5 proteínas foram associadas (p-valor<0.05, R<-0.7 ou 0.7<R e
R2>0.4) a características clínico-patológicas: a maior abundância de COL6A1
(Collagen alpha-1(VI) chain), de MB (Myoglobin) e de THBS2 (Thrombospondin-2) no
estroma ITF foi associada à metástase linfonodal, estágio clínico avançado e
recorrência linfonodal, respectivamente; enquanto a maior abundância de FSCN1
(Fascin) e ITGAV (Integrin alpha-V) no estroma do interior do tumor foi associada a
tumor altamente indiferenciado e metástase linfonodal, respectivamente (Tabela 9).
Para a correlação da abundância das proteínas à sobrevida dos pacientes,
foram selecionadas aquelas com expressão diferencial entre estroma ITF e estroma
interior (p-valor<0,05, Student’s t-test) e também três características de fechamento
clínico: presença de metástase linfonodal, segundo tumor primário de outra origem
histológica e recidiva loco-regional. Foi utilizada a análise de sobrevida univariada
Kaplan-Meier comparada por Log-rank t-test, de forma que os pacientes foram
divididos por maior ou menor abundância da proteína na região ITF, isto é, acima ou
abaixo da média da abundância da proteína entre as amostras da região ITF
proveniente dos 17 pacientes, a qual também apresenta expressão diferente entre ITF
e interior tumoral, associada a uma das três características clínico-patológica e à
sobrevida livre de doença. Dentre as 19 proteínas associadas à sobrevida livre de
doença, 13 proteínas estão associadas à característica clínica de recorrência loco
regional, 2 proteínas associadas à acometimento de linfonodo, as quais também estão
associadas a segundo sítio tumoral primário com mais outras 4 proteínas. Dentre as
proteínas com correlação com os dados clínico-patológicos, apenas a proteína
COL6A1 também está associada à sobrevida (Figura 11), de forma que a menor
expressão dessa proteína na região ITF resultou em menor tempo de sobrevida.
77
Tabela 9. Proteínas com diferentes abundâncias entre as regiões do estroma do fronte tumoral invasivo (ITF) e estroma do interior do tumor que apresentam correlação com dados clínico-patológicos por análise de regressão linear.
Nome proteína Símbolo do gene
Uniprot ID Abundância* (ITF/interior)
Dado clínico-patológico
Regressão linear (p-valor)**
Coeficiente de correlação (R)***
R quadrado múltiplo****
Collagen alpha-1(VI) chain COL6A1 P12109 0,534 Condição linfonodal 0,0006 0,7 0,5
Fascin FSCN1 Q16658 -0,673 WHO 2,34e-05 0,8 0,7
Integrin alpha-V ITGAV P06756 -1,674 Condição linfonodal 0,0014 0,7 0,5
Myoglobin MB P02144 2,901 Estadiamento clínico 0,0015 0,7 0,5
Thrombospondin-2 THBS2 P35442 -0,712 Recorrência linfonodal 0,0001 0,7 0,6
ITF: fronte tumoral invasiva; WHO: sistema de classificação da OMS (WHO Histopathological Grading System). *Abundância: razão de valores LFQ intensity em log2 **Regressão linear foi considerada com p-valor>0,05. ***Coeficiente de correlação R<-0,7 ou R>0,7 foram utilizados para considerar correlação entre as variáveis. ****R quadrado múltiplo acima de 0,5 foi considerado para verificar quanto da variação de uma variável é explicada por outra variável.
81
Figura 11. Associação entre as proteínas com expressão diferencial significativa entre fronte invasivo tumoral (ITF) e interior tumoral à sobrevida livre de doença em meses. Os gráficos apresentam as associações com p-valor<0,05 do Log-rank t-test.
A partir dos resultados de associação com as características clínico-
patológica dos pacientes, proteínas foram selecionadas como alvos para os
experimentos de verificação e foram representadas no volcano plot, o qual apresenta
o perfil da abundância das proteínas selecionadas (Figura 12A) e a abundância entre
as amostras dos pacientes (Figura 12B).
82
Figura 12. Perfil da abundância das proteínas selecionadas como alvos para experimentos de verificação. (A) Proteínas diferencialmente expressas entre o estroma do fronte invasivo tumoral (ITF) e o estroma do interior do tumor são apresentadas no volcano plot de acordo
83
com a razão da abundância (log2 razão ITF/interior do tumor) e a significância (-log10 p-valor, Student’s t-test). (B) Diagramas de caixas representam a abundância das proteínas no perfil de cada paciente normalizada pela mediana, nas diferentes corridas por espectrometria de massas (MS runs).
4.3 Verificação da abundância das proteínas selecionadas por
imunohistoquímica e correlação com dados clínico-patológicos
As proteínas avaliadas por imunohistoquímica (IHC) foram selecionadas a
partir da correlação com dados clínico-patológicos dos pacientes e que não
estivessem descritas na literatura como associadas ao CEC oral, como já abordado
para as proteínas FSCN1 (Alam et al. 2012; Campioni Rodrigues et al. 2017) e THBS2
(Hsu et al. 2014). Outro critério adicional, foi se já haviam informações sobre a
marcação imunohistoquímica dessas proteínas em tecidos de tumores no Human
Protein Atlas. Assim, para a seleção dos anticorpos específicos para cada alvo foram
consideradas as informações apresentadas pelo Human Protein Atlas, referente à
marcação imunohistoquímica do anticorpo em tecidos de câncer de cabeça e
pescoço, à diluição do anticorpo e à recuperação antigênica. A avaliação da
abundância das proteínas alvos foi realizada em um novo conjunto de amostras de
pacientes com CEC oral (n=96). Por meio do sistema de score utilizado (Tabela 5,
sessão 3.8), foi possível diferenciar a marcação entre as regiões do tumor, ITF e
interior tumoral, avaliada por dois patologistas de forma cega e independente
(kappa=0.706). Os valores de abundância das proteínas variaram de acordo com o
score criado em uma escala de 0 a 6, o que gerou uma escala de marcação para
todos os casos (Figura 13). A marcação das três proteínas avaliadas (COL6A1, ITGAV
e MB) foi predominante no estroma tumoral, com pouca observação de marcação em
células neoplásicas. Também foi possível notar marcação em músculo pela proteína
MB.
84
Figura 13. Marcação imunohistoquímica para as proteínas alvos em cortes de CEC oral. Noventa e seis casos foram utilizados para verificar a abundância das proteínas COL6A1, ITGAV e MB. A intensidade de marcação no estroma ITF ou no estroma do interior tumoral é apresentado como um heat map. Diferenças na marcação entre as diferentes regiões do estroma tumoral foram observadas, com predomínio de COL6A1 e MB no estroma do ITF e de ITGAV no estroma do interior tumoral. A marcação das três proteínas avaliadas foi predominante no estroma tumoral. A ausência de marcação foi representada pela cor branca no heat map.
A correlação da marcação das proteínas no novo conjunto de amostras de
CEC oral com os dados clínico-patológicos dos pacientes revelou a associação da
proteína COL6A1 com a condição da margem tumoral (p-valor=0,005) e infiltração
capsular do linfonodo (p-valor=0,007) (Tabela 10). A recorrência regional também foi
demonstrada em associação à expressão de ITGAV (p-valor=0,02).
85
Tabela 10. Associação dos dados clínico-patológicos com a expressão de três proteínas alvos presentes no estroma de amostra de CEC oral.
Parâmetro COL6A1 p-valor ITGAV p-valor MB p-valor
Baixo ITF n (%)
Igual n (%)
Alto ITF n (%)
Baixo ITF n (%)
Igual n (%)
Alto ITF n (%)
Baixo ITF n (%)
Igual n (%)
Alto ITF n (%)
Gênero
Masculino 10 (100) 37 (78,7) 32 (88,9) 10 (100) 44 (83,0) 14 (82,4) 02 (66,7) 68 (86,1) 03 (75,0) Feminino 0 (00) 10 (21,3) 04 (11,1) 0,16 0 (00) 09 (17,0) 03 (17,6) 0,36 01 (33,3) 11 (13,9) 01 (25,0) 0,55
Idade ≤ 58 06 (60,0) 29 (61,7) 21 (58,3) 05 (50,0) 32 (60,4) 11 (64,7) 03 (100) 45 (57,0) 03 (75,0) > 58 04 (40,0) 18 (38,3) 15 (41,7) 0,95 05 (50,0) 21 (39,6) 06 (35,3) 0,74 0 (00) 34 (43,0) 01 (25,0) 0,26
Tabagismo Não 01 (11,1) 07 (19,4) 03 (10,0) 02 (25,0) 06 (14,0) 01 (10,0) 01 (33,3) 08 (13,1) 01 (33,3) Sim 08 (88,9) 29 (80,6) 27 (90,0) 0,53 06 (75,0) 37 (86,0) 09 (90,0) 0,64 02 (66,7) 53 (86,9) 02 (66,7) 0,41
Etilista Não 01 (16,7) 13 (38,2) 05 (19,2) 02 (25,0) 13 (35,1) 01 (11,1) 01 (50,0) 13 (23,6) 02 (66,7) Sim 05 (83,3) 21 (61,8) 21 (80,8) 0,21 06 (75,0) 24 (64,9) 08 (88,9) 0,34 01 (50,0) 42 (76,4) 01 (33,3) 0,19
Sítio tumoral Língua 05 (50,0) 23 (48,9) 16 (44,4) 03 (30,0) 23 (43,4) 08 (47,1) 02 (66,7) 36 (45,6) 0 (00) Outro 05 (50,0) 24 (51,1) 20 (55,6) 0, 90 07 (70,0) 30 (56,6) 09 (52,9) 0,66 01 (33,3) 43 (54,4) 04 (100) 0,14
Tamanho do tumor (T) T1/T2 09 (90,0) 36 (76,6) 31 (86,1) 08 (80,0) 45 (84,9) 13 (76,5) 03 (100) 63 (79,7) 04 (100) T3/T4 11 (10,0) 11 (23,4) 05 (13,9) 0,41 02 (20,0) 08 (15,1) 04 (23,5) 0,71 0 (00) 16 (20,3) 0 (00) 0,41
Acometimento linfonodal (N)
N0 04 (40,0) 23 (48,9) 18 (50,0) 06 (60,0) 28 (52,8) 08 (47,1) 02 (66,7) 37 (46,8) 04 (100) N+ 06 (60,0) 24 (51,1) 18 (50,0) 0,85 04 (50,0) 25 (47,2) 09 (52,9) 0,80 01 (33,3) 42 (53,2) 0 (00) 0,09
Tratamento Cirúrgia 05 (50,0) 20 (42,6) 11 (30,6) 04 (40,0) 24 (45,3) 05 (29,4) 01 (33,3) 27 (34,2) 04 (100) Cirúrgia +RT 05 (50,0) 22 (46,8) 19 (52,8) 04 (40,0) 24 (45,3) 11 (64,7) 02 (66,7) 42 (53,2) 0 (00) Cirúrgia +RT+QT 0 (00) 05 (10,6) 06 (16,7) 0,52 02 (20,0) 05 (09,4) 01 (05,9) 0,51 0 (00) 10 (12,7) 0 (00) 0,10
Margem > 5 mm 08 (80,0) 47 (100) 35 (97,2) 10 (100) 52 (98,1) 17 (100) 03 (100) 77 (97,5) 04 (100) < 5 mm 02 (20,0) 0 (00) 0 (02,8) 0,005 00 (00) 01 (01,9) 0 (00) 0,77 0 (100) 02 (02,5) 0 (00) 0,91
Infiltração capsular linfonodal
Não 02 (50,0) 0 (00) 07 (50,0) 02 (66,7) 05 (29,4) 01 (20,0) 0 (00) 09 (33,3) 0 (00) Sim 02 (50,0) 14 (100) 07 (50,0) 0,007 01 (33,3) 12 (70,6) 04 (80,0) 0,36 01 (100) 18 (66,7) 0 (00) 0,49
Recorrência local Não 05 (50,0) 23 (48,9) 16 (44,4) 03 (30,0) 23 (43,4) 08 (47,1) 02 (66,7) 36 (45,6) 0 (00)
86
Baixo ITF: baixa expressão no fronte tumoral invasivo (ITF); Igual: expressão igual entre ITF e o interior tumoral; Alto ITF: alta expressão no fronte tumoral invasivo; RT: radioterapia; QT: quimioterapia.
Sim 05 (50,0) 24 (51,1) 20 (55,6) 0,90 07 (70,0) 30 (56,6) 09 (52,1) 0,66 01 (33,3) 43 (54,4) 04 (100) 0,14 Recorrência regional
Não 09 (90,0) 42 (89,4) 31 (86,1) 10 (100) 49 (92,5) 12 (70,6) 03 (100) 70 (88,6) 03 (75,0) Sim 01 (10,0) 05 (10,6) 05 (13,9) 0,88 0 (00) 04 (07,5) 05 (29,4) 0,02 0 (00) 09 (11,4) 01 (25,0) 0,57
Recorrência loco-regional
Não 07 (70,0) 30 (63,8) 26 (72,2) 09 (90,0) 38 (71,7) 10 (58,8) 01 (33,3) 56 (70,9) 03 (75,0) Sim 03 (30,0) 17 (36,2) 10 (27,8) 0,71 01 (10,0) 15 (23,8) 07 (41,2) 0,22 02 (66,7) 23 (29,1) 01 (25,0) 0,37 Recorrência distante
Não 09 (90,0) 47 (100) 35 (97,2) 52 (98,1) 52 (98,1) 16 (94,1) 03 (100) 77 (97,5) 04 (100) Sim 01 (10,0) 0 (00) 01 (02,8) 0,13 01 (01,9) 01 (01,9) 01 (05,9) 0,56 0 (00) 02 (02,5) 0 (00) 0,91
Segundo tumor primário
Não 08 (80,0) 36 (78,3) 27 (75,0) 08 (80,0) 36 (69,2) 14 (82,4) 03 (100) 59 (75,6) 03 (75,0) sim 02 (20,0) 10 (21,7) 09 (25,0) 0,91 02 (20,0) 16 (30,8) 03 (17,6) 0,50 0 (00) 19 (24,4) 01 (25,0) 0,61
87
A análise de sobrevida nos pacientes de CEC oral revelou a associação da
expressão de ITGAV no estroma do ITF com recorrência de acometimento dos
linfonodos (Figura 14). A sobrevida global de 5 anos, sobrevida específica à doença e
a sobrevida livre de doença foram analisadas para as três proteínas avaliadas,
entretanto, somente ITGAV apresentou associação com esses parâmetros (Tabela
11). A análise multivariada de Cox não apresentou resultados significativos para essas
proteínas em relação aos dados clínico-patológicos.
88
Figura 14. Análise de sobrevida Kaplan-Meier para valores de score de IHC e dados de fechamento clínico. A sobrevida total, sobrevida livre de doença e sobrevida específica à doença foram avaliadas em relação a dados de segundo tumor primário, local do tumor, e recorrência linfonodal. Pacientes com maior expressão de ITGAV no ITF estavam associados ao maior risco de apresentar recorrência linfonodal e baixa sobrevida (p-valor<0.05).
89
Tabela 11. Taxa de sobrevida de pacientes com CEC oral de acordo com a expressão de proteínas.
Parâmetro Sobrevida global em 5 anos % (N)
p-valor Sobrevida livre de doença em 5 anos % (N)
p-valor Sobrevida específica à doença em 5 anos % (N)
p-valor
ITGAV Maior expressão no ITF
73% (17) 65% (17) 72% (16)
Expressão igual 92% (53) 90% (52) 92% (50)
Menor expressão no ITF
100% (08) 0,0081 100% (10) 0,0288 100% (08) 0,0115
4.4 Avaliação das proteínas alvos em saliva de pacientes com CEC oral por
proteômica baseada em alvos
Um conjunto de 33 pacientes com CEC oral, com e sem metástase
linfonodal, foi selecionado para monitorar peptídeos derivados das proteínas COL6A1,
ITGAV e MB por proteômica baseada em alvos a fim de correlacionar a abundância
dessas proteínas com dados clínico-patológicos dos pacientes. Essas proteínas foram
identificadas com um total de 45 peptídeos únicos por proteômica baseada em
descoberta (DDA). Considerando observações na proteômica por DDA e do SRM
Atlas, 8 peptídeos proteotípicos foram escolhidos para monitorar as proteínas alvos.
Os peptídeos não purificados foram adquiridos comercialmente e marcados com
isótopo pesado (heavy-isotope-labelled synthetic peptides), como padrões internos, e
adicionados às amostras de saliva juntamente com os padrões de tempo de retenção
(15 iRT peptides, Pierce), para avaliar entre outras considerações, o desempenho em
experimentos de proteômica baseada em alvos diretamente com a matriz de interesse
(saliva). Nessa fase, a utilização de peptídeos não purificados tem sido indicada e
comumente utilizada em estudos proteômica baseada em alvos, uma vez que, a partir
desses resultados, uma nova seleção de peptídeos pode ser realizada para o
desenvolvimento de experimentos de quantificação absoluta (AQUA) com peptídeos
de alta pureza (acima de 98%) (Gerber et al. 2003; Elschenbroich & Kislinger 2011).
A abundância relativa das 3 proteínas foi avaliada pelo monitoramento de
pelo menos 3 peptídeos proteotípicos leves (endógeno) e 3 peptídeos pesado
(sintético) para cada proteína, pelo método SRM. Os dados gerados por SRM foram
manualmente conferidos no programa Skyline para verificação da qualidade e
90
identificação dos picos. O tempo de retenção predito de cada peptídeo foi realizado
pelo programa Skyline, a partir de uma curva padrão previamente analisada de 36
peptídeos (peptídeos sintéticos em uso no laboratório) com diferentes tempos de
retenção. A partir dessa curva padrão com um coeficiente de correlação R2 acima de
0.9, o programa Skyline é capaz de calcular e predizer o tempo de retenção do
peptídeo, considerando a sua sequência de aminoácidos e levando em consideração
as mesmas condições de gradiente de cromatografia líquida e especificações da
coluna cromatográfica. O método no qual o Skyline se baseia para fazer esses
cálculos é denominado de SSRCalc calculadora de hidrofobicidade (Krokhin 2006).
Assim, peptídeos monitorados que apresentaram pelo menos duas transições foram
alinhados no tempo de retenção predito, com os peptídeos leve e pesado, com o
mínimo de interferência e alta reprodutibilidade foi considerada para análises
posteriores. Os 8 peptídeos monitorados se enquadraram nesses critérios. Todas as
três proteínas alvos foram quantificadas pelo método SRM, demonstrando sua
aplicação para a análise de amostras clínicas como a saliva.
A fim de explorar o valor prognóstico dessas proteínas na saliva de paciente
com CEC oral, a quantificação dos peptídeos de cada proteína foi utilizada para
associar com o risco de desenvolver metástase. As amostras foram então divididas
em dois grupos, um grupo com pacientes sem metástase regional (N0) e outro grupo
de pacientes com metástase regional (N+). A maioria dos peptídeos apresentou menor
abundância em pacientes N+ em comparação com pacientes N0 (Figura 15A). A
quantificação das proteínas COL6A1 e ITGAV demonstrou que há diferença
significativa na abundância dessas proteínas entre os grupos de pacientes (Student’s
t-test, p<0.05) (Figura 15B) e também com certa variabilidade entre os pacientes
(Figura 15C). Para verificar o valor prognóstico das proteínas nas amostras clínicas
de saliva, curvas de características de operação do receptor (curvas ROC) foram
calculadas para fornecer os melhores valores de corte quanto à variação da
sensibilidade e especificidade. Dentre as proteínas selecionadas para os
experimentos de verificação, a proteína COL6A1 foi a que apresentou melhor poder
de classificação entre pacientes com ausência e presença de metástase a partir dos
resultados da curva ROC, apresentando uma área sob a curva (AUC) de 0.8
(sensibilidade=0,739; especificidade=0,9) (Figura 15D), enquanto a proteína ITGAV
apresentou AUC de 0.75 (sensibilidade=0,696; especificidade=0,8). Além disso, a
91
análise de tabulação cruzada revelou que essa mesma proteína está associada ao
estadiamento clínico (p-valor=0,04) e à metástase linfonodal (p-valor=0,01). As
presentes análises sugerem que experimentos por SRM em amostras de saliva são
capazes de discriminar pacientes em grupos de acordo com a expressão de proteínas
alvos. Além disso, ambas as técnicas de proteômica baseada em espectrometria de
massas, DDA e SRM, na busca por candidatos marcadores de prognóstico em tecido
e saliva, demonstraram diferentes abundâncias dessas proteínas entre os grupos
analisados (Figura 15E).
92
Figura 15. Avaliação das proteínas alvos por proteômica baseada em alvos. (A) Quantificação relativa dos peptídeos por SRM em amostras de saliva de 33 pacientes com CEC oral. Maioria dos peptídeos encontram-se com menor abundância nos pacientes com metástase linfonodal. (B) A diferença de expressão das proteínas COL6A1 e ITGAV é significativa entre os grupos de pacientes, N0 e N+. (C) As intensidades normalizadas das proteínas COL6A1 e ITGAV são menores entre os pacientes com metástase (N+) em comparação aos pacientes com CEC oral sem metástase. (D) Curva ROC para a predição de metástase em pacientes com CEC oral. A predição do risco foi avaliada pela área sob a curva (AUC) baseada na abundância das proteínas. A curva ROC e os gráficos complementares para
93
COL6A1 foram capazes de separar os casos N+ dos casos N0. (E) Comparação entre a quantificação das proteínas candidatas pelas técnicas DDA, em amostras de tecido, e SRM, em amostras de saliva. Log2 da razão de N+/N0 em amostras de saliva e entre ITF/interior tumoral em amostras de tecido são apresentados no gráfico.
5 DISCUSSÃO
O CEC oral representa mais de 90% de todos os cânceres de cabeça e
pescoço, e cada tumor pode apresentar padrões de dispersão e prognósticos
característicos (Ferlay et al. 2015). O principal tratamento da doença é a ressecção
cirúrgica do tumor, acompanhada ou não por radioterapia e/ou quimioterapia (Shah &
Gil 2009) e a predição do prognóstico é baseada em sistemas de estadiamento clínico
como o TNM, o qual apresenta algumas limitações devido à heterogeneidade
biológica do tumor (Takes et al. 2010). Considerando a taxa de sobrevida de 5 anos e
a alta taxa de recorrência de CEC oral (Rivera et al. 2017), há uma grande
necessidade de marcadores de prognóstico mais precisos para o tratamento de CEC
oral. Para isso, o uso de classificações histológicas que se baseiam nas
características histomorfológicas da área do fronte tumoral invasivo (ITF) do tumor
para contribuir com a determinação do prognóstico pode auxiliar na busca de
marcadores moleculares, uma vez que essa região ITF está associada à invasão e
agressividade do tumor. Por sua vez, o estroma é fundamental para o sucesso da
formação tumoral, atuando na manutenção do tecido, na diferenciação, proliferação,
migração e invasão de células neoplásicas (Salo et al. 2014).
A caracterização do proteoma de tumores é um método promissor para a
identificação de marcadores de diagnóstico e de prognóstico, bem como de alvos
terapêuticos. Um melhor entendimento do proteoma das diferentes regiões
histomorfológicas do tumor pode identificar proteínas de valor prognóstico e auxiliar
na determinação de pacientes com CEC oral, contribuindo para a redução da
recorrência tumoral ou de metástase linfonodal e melhora na taxa de sobrevida.
Assim, considerando que características histológicas e os perfis moleculares podem
diferir amplamente de uma área para outra de um mesmo tumor (Bryne 1998;
Almangush et al. 2015; Jensen et al. 2015), neste estudo buscou-se determinar a
composição de proteínas provenientes de diferentes regiões de CEC oral,
compreendendo o estroma da região do fronte invasivo tumoral (ITF) e o estroma do
94
interior tumoral, a fim de identificar proteínas com valor prognóstico em CEC oral, bem
como auxiliar no entendimento dos eventos relacionados ao processo de
agressividade da região ITF.
Muitos estudos têm utilizado amostras de tecido fixadas em formalina e
parafina (FFPE) para a caracterização molecular, incluindo análises proteômicas com
a extração e digestão de proteínas seguida por identificação por espectrometria de
massas (LC-MS/MS) para determinação do proteoma tumoral. A fim de contornar a
complexidade morfológica do tumor, características histomorfológicas foram utilizadas
neste estudo para distinguir a região ITF e a região do interior tumoral e, juntamente
com a proteômica baseada em espectrometria de massas, guiar a identificação de
proteínas associadas ao prognóstico e à agressividade de CEC oral.
A microdissecção a laser (LMD) tem sido abordada em estudos de
proteômica para avaliar células neoplásicas de origem epitelial (Patel et al. 2008;
Negishi et al. 2009; Chi et al. 2009). Até o presente momento, o presente trabalho é o
primeiro a separar o estroma da região ITF e o estroma da região do interior tumoral
para determinação do proteoma dessas áreas de CEC oral. Embora o trabalho
desenvolvido por Jensen e colaboradores (Jensen et al. 2015) tenha analisado a
região ITF e a área central de CEC oral, o isolamento do estroma não foi realizado,
de forma que o conteúdo total dessas regiões, ou seja, células neoplásicas e
componentes estromais foram analisados sem distinção.
O estroma tumoral apresenta origem histológica diferente das de células
neoplásicas, sendo composto por fibroblastos, células endoteliais, células do sistema
inflamatório e proteínas da matriz extracelular (Bremnes et al. 2011). Além disso,
alguns tipos celulares no ambiente estromal podem ser recrutados por células
malignas para auxiliar o crescimento tumoral e facilitar a disseminação metastática
(Xing et al. 2010), com muitos estudos destacando o papel de fibroblastos associados
ao carcinoma (CAFs) para a progressão tumoral (Salo et al. 2014). Assim, o estroma
é um compartimento de alta complexidade celular e molecular, atuando em vias de
sinalização e processos biológicos fundamentais para o desenvolvimento e
progressão do tumor.
A partir da associação da LMD e análises por espectrometria de massas
com aquisição dependente de dados (DDA), as regiões de interesse do estroma, ou
seja, região ITF e interior tumoral, foram caracterizadas quanto ao perfil proteico em
95
amostras de 20 peças cirúrgicas provenientes de pacientes com CEC oral. A
proteômica baseada em alvos revelou 101 proteínas com diferente localização
espacial no tumor (Students’s t-test, p-valor<0,05). A importância da separação das
regiões do tumor para a caracterização do proteoma pode também ser demonstrada
a partir da correlação da expressão das proteínas com dados clínico-patológicos dos
pacientes. A maior expressão da proteína COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain) no
estroma da região ITF foi correlacionada à metástase linfonodal, dado clínico também
associado à maior abundância da proteína ITGAV (Integrin alpha-V) no estroma do
interior tumoral, enquanto estágios avançados da doença foram associados à maior
expressão de MB (Myoglobin) no estroma da região ITF. A abundância de algumas
proteínas também foi associada à sobrevida de pacientes com CEC oral, dentre elas
algumas proteínas de matriz extracelular como o colágeno VI (COL6A1, COL6A2,
COL6A3), colágeno 7 (COL7A1), anexina 2 (ANXA2), laminina (LAMC2), mimecan
(OGN). Embora as proteínas THBS2 e de FSCN1 estivessem associadas à
recorrência linfonodal e a tumores pobremente diferenciados (classificação WHO),
respectivamente, não foram selecionadas para os experimentos de verificação da
abundância por já terem sido descritas na literatura como associadas a características
de CEC oral (Alam et al. 2012; Hsu et al. 2014; Campioni Rodrigues et al. 2017).
Uma vez identificadas proteínas correlacionadas a características clínico-
patológicas, a abundância dessas proteínas foi verificada em utilizando um conjunto
maior de amostras de pacientes com CEC oral. Muitas estratégias poderiam ser
utilizadas nesta etapa do estudo, como a proteômica baseada em alvos,
imunohistoquímica (IHC), ELISA e western blotting. Entretanto, a verificação por IHC
foi o método de escolha devido à sua aplicação na prática clínica. Adicionalmente, a
histopatologia é o padrão ouro na determinação do prognóstico de pacientes com CEC
oral a partir da avaliação morfológica como padrão de invasão das ilhas neoplásicas
e invasão perineural (Sundquist et al. 2017), de forma que tal conhecimento foi
aplicado no delineamento deste estudo.
Proteínas selecionadas a partir da proteômica baseada em descoberta e
da correlação com dados clínico-patológicos foram avaliadas por IHC. A realização de
IHC no novo conjunto de amostras, composto por 96 casos de CEC oral em FFPE,
permitiu confirmar a abundância das proteínas no estroma tumoral, corroborando a
associação dessas proteínas com dados clínicos dos pacientes. Para avaliação, as
96
amostras foram classificadas de acordo com o score baseado na intensidade e na
porcentagem de marcação na região do estroma da região ITF ou do estroma do
interior do tumor, de forma separada. Como esperado, as três proteínas avaliadas
apresentaram marcação predominante no estroma tumoral. A marcação também foi
observada no citoplasma em músculo para proteína MB.
A análise por IHC mostrou concordância com os resultados da proteômica
por DDA apenas para as proteínas COL6A1 e MB, ou seja, em ambos os
experimentos essas proteínas foram encontradas com maior expressão no estroma
do ITF, enquanto a ITGAV foi encontrada com maior abundância no estroma do
interior tumoral por marcação imunohistoquímica. Entretanto, essa diferença pode ser
causada devido à inespecificidade do anticorpo utilizado nas análises de IHC,
enquanto que espectrometria de massas foi capaz de fornecer informações
específicas e precisas de identificação e quantificação de proteínas em cada região
de interesse por meio da associação com a LMD.
Para a correlação entre a marcação imunohistoquímica e parâmetros
demográficos e clínico-patológicos dos pacientes, foi realizada tabulação cruzada
(cross-tabulation) e teste Qui-quadrado, seguida por análise de sobrevida. Com esses
resultados foi demonstrado novamente a associação da abundância dessas proteínas
com características que influenciam o prognóstico (Almangush et al. 2015; Sawazaki-
Calone et al. 2015), como invasão extracapsular (linfonodo) e margens associadas à
abundância de COL6A1 e recorrência regional associada à abundância de ITGAV. A
sobrevida dos pacientes também foi associada à expressão de ITGAV no estroma do
ITF com recorrência de metástase linfonodal. Mais uma vez, essa mesma proteína
apresentou associação à sobrevida global de 5 anos, à sobrevida específica e à
sobrevida livre de doença, demonstrando um papel biológico relevante de ITGAV no
prognóstico de pacientes com CEC oral.
A matriz extracellular (ECM) é comumente desregulada e reorganizada de
forma a contribuir com a progressão tumoral de forma direta, promovendo o
crescimento de células neoplásicas e metástase, ou indiretamente, alterando outros
componentes do microambiente tumoral (Lu et al. 2012). As proteínas da família de
integrinas são relevantes no processo de sinalização celular pois são receptores de
superfície da membrana celular amplamente expressas nas células, atuando na
adesão e interação célula-célula. Essas proteínas também estão envolvidas com a
97
mobilidade, diferenciação, migração, adesão e proliferação celular, processos de
grande importância para o desenvolvimento e progressão tumoral. Um outro aspecto
interessante é que a presença de integrinas em vesículas extracelulares circulantes
de vários linhagens celulares que tendem a promover metástase no pulmão foi
demonstrada como determinante para a ocorrência de metástase e para a
determinação do futuro sítio de metástase (Hoshino et al. 2015). Dentre essas
integrinas identificadas nas vesículas extracelulares, tanto a Integrin beta-4 (ITGB4) e
a Integrin alpha-V (ITGAV) foram encontradas no presente estudo com diferentes
abundâncias entre a região ITF e a região do interior tumoral de CEC de língua por
proteômica baseada em descoberta. Especificamente, a proteína ITGAV é um
receptor de matriz extracelular e serve como subunidade para receptores de integrina
ligados RGD-motif contendo substratos como vibronectina, fibronectina e fibrinogênio,
componentes do estroma envolvidos com a transição EMT (Jin & Varner 2004).
Adicionalmente, ITGAV tem sido associada à regulação do crescimento tumoral e
metástase em câncer de laringe e hipofaringe (Lu et al. 2011) e à progressão tumoral
de câncer colorretal (Waisberg et al. 2014). O heterodímero de ITGAV também foi
descrito associado à angiogenêse via altos níveis de bFGF e o fator de necrose
tumoral α (TNF-α) (Varner & Cheresh 1996). O uso de moléculas antagonistas de
integrinas, como os antagonistas RGD e anticorpos, tem demonstrado uma diminuição
na angiogênese, crescimento tumoral e mestástase em muitos tipos de tumor sólido,
nos quais ITGAV apresenta maior expressão, incluindo câncer de mama, melanoma
e câncer de próstata (Trikha et al. 2004; Chen et al. 2008; van der Horst et al. 2011).
O tratamento com um antagonista de ITGAV, assim como a diminuição da expressão
dessa proteína em linhagens celulares de carcinoma de bexiga, resultou na redução
da malignidade in vitro, baseada na diminuição da proliferação e migração celular (Van
Der Horst et al. 2014). Muitos desses antagonistas estão em testes clínicos de fase I
e II (Nemeth et al. 2007; O’Day et al. 2012). Apesar de todos esses estudos
descreverem sobre o papel de ITGAV em câncer, nenhum deles correlacionou a sua
distribuição de abundância no tecido, o que também faz o presente estudo ser
relevante nesse contexto de localização espacial de proteínas.
Assim como as integrinas, colágenos são proteínas abundantes na matriz
extracelular (ECM). Colágeno VI pode ser sintetizado por macrófagos e expresso em
muitos tecidos, incluindo músculo esquelético, pulmão e pele. Essa proteína pode ser
98
composta por três cadeias α distintas (α1, α2 e α3) secretadas na ECM para a
formação da rede de microfilamentos, a qual está associada à membrana basal de
células musculares e em interação com vários outros constituintes da matriz (de
Carvalho et al. 1997; Sabatelli et al. 2001). Por outro lado, colágeno VI é um importante
fator pró-tumorigênico que atua no microambiente tumoral, promovendo eventos de
inflamação e angiogênese. Além disso, COL6A1 participa de vias de sinalização que
resultam na regulação da apoptose, autofagia, proliferação, angiogênese, fibrose e
inflamação (Chen et al. 2013). A maior expressão de colágeno VI é relatada em uma
variedade de tumores em comparação com tecidos normais. O aumento da
mobilidade de células malignas pulmonares é marcado pelo tratamento com colágeno
VI, sendo que a análise do secretoma de células de câncer de pulmão mostrou que a
proteína COL6A1 é associada a características de metástase. O uso de RNA de
interferência para diminuição da abundância dessa proteína suprimiu a habilidade
metastática de células de câncer de pulmão, enquanto a super-expressão demonstrou
efeito oposto (Chiu et al. 2011). Entretanto, o mecanismo de COL6A1 na metástase
ainda não é bem compreendido, de forma as variações na abundância dessa proteína
entre as diferentes regiões do tumor encontradas no presente trabalho podem auxiliar
no entendimento da modulação dessa proteína.
A fim de avaliar se as proteínas COL6A1, ITGAV e MB são encontradas em
fluidos biológicos, cujos métodos de coleta não são invasivos, foi utilizada a
proteômica baseada em alvos para a quantificação desses alvos em saliva de 33
pacientes com CEC oral. A saliva é considerada uma fonte promissora na busca de
marcadores e de uso como biópsia líquida (Aro et al. 2017), uma vez que por estar
em contato direto com a lesão pode refletir a abundância das proteínas presentes no
tecido e assim correlacionar com fatores de prognóstico associados ao CEC oral
(Ganly et al. 2012; Shah et al. 2011; Xie et al. 2015). A análise por SRM foi capaz de
monitorar as três proteínas selecionadas na fase de descoberta. COL6A1 e ITGAV,
tipicamente proteínas de matriz extracelular, foram quantificadas em amostras de
saliva de pacientes com CEC oral, apresentando menor abundância no grupo de
pacientes com metástase (N+), em comparação à saliva de pacientes sem metástase
(N0), de forma significativa (p-valor<0,05, Student’s t-test). Na comparação da
capacidade de predição dos grupos de pacientes, a abundância da proteína COL6A1
demonstrou melhor desempenho (curva ROC, AUC 0,8) em comparação à proteína
99
ITGAV (curva ROC, AUC 0,75). O possível valor prognóstico para COL6A1 foi também
demonstrado pela associação da abundância dessa proteína em amostras de saliva
com o estadiamento clínico e à metástase linfonodal.
Interessantemente, o peptídeo (IYIGDDNPLTLIVK) de ITGAV que
apresentou maior abundância em saliva de pacientes com metástase linfonodal
também foi identificado em amostras de tecido na fase de proteômica baseada em
descoberta, entretanto, apenas foi possível encontrar esse peptídeo no interior
tumoral. Tal informação traz direções para investigar o papel de peptídeos em
processos biológicos e suas contribuições para as diferentes características
hitopatológicas encontradas entre as regiões do tumor.
Apesar de outros estudos envolvendo a análise de saliva em câncer
apontarem proteínas associadas ao prognóstico e processos relacionados à doença
(Shah et al. 2011; Winck et al. 2015; Kawahara et al. 2016), o presente estudo foi
capaz de quantificar com acurácia as proteínas selecionadas como potenciais
marcadores de prognóstico em amostras de saliva de pacientes com CEC oral
utilizando SRM, um método considerado como padrão ouro em proteômica baseada
em alvos, com resultados capazes de discriminar pacientes em grupos de acordo com
a presença ou ausência de metástase linfonodal.
6 CONCLUSÃO
O presente estudo demonstrou que a combinação de características
histomorfológicas, microdissecção a laser (LMD) e proteômica baseada em
espectrometria de massas foi capaz de mapear o proteoma do estroma de duas
diferentes áreas do tumor, revelando proteínas espacialmente distribuídas entre o
estroma do fronte tumoral invasivo (ITF) e o estroma do interior do tumor com valor
prognóstico em CEC oral. Análises por SRM revelaram o valor prognóstico de
COL6A1 e ITGAV em amostras de saliva de pacientes com CEC oral, as quais foram
capazes de distinguir entre pacientes com e sem metástase linfonodal.
Embora muitos estudos tenham se empenhado na seleção de marcadores
de agressividade ou de prognóstico para CEC oral, nenhum foi capaz de adicionar
esses marcadores na prática clínica. Dessa forma, estudos adicionais são necessários
100
em um conjunto maior de amostras a fim de fornecer novas direções sobre os
candidatos a marcadores de prognóstico apresentados pelo presente estudo e
possivelmente incluí-los na rotina clínica para CEC oral. Adicionalmente, a abordagem
aqui empregada pode contribuir com o entendimento de mecanismos de sinalização
entre as diferentes regiões do tumor, fornecendo informações sobre o comportamento
clínico de CEC oral.
Em resumo, a busca de indicadores de agressividade poderia antecipar o
comportamento clínico do CEC oral e auxiliar no prognóstico considerando a alta
heterogeneidade desta neoplasia associada aos diferentes comportamentos clínicos
e padrões de invasão.
Dessa forma, a abordagem utilizada neste estudo demonstra a importância
da combinação de diferentes métodos e materiais biológicos para buscar potenciais
marcadores ou assinaturas que possam influenciar na decisão clínica. Além disso, os
presentes resultados abrem novas perspectivas para estudos com a quantificação
absoluta das proteínas candidatas e estudos da sinalização desses alvos em câncer
oral.
101
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110
APÊNDICE 1
Tabela suplementar 1. Proteínas com abundância diferencial (Student’s t-test, p-valor<0,05) entre estroma do fronte invasivo tumoral (ITF) e estroma do interior tumoral identificadas em amostras de CEC oral.
Nome proteína
Log2 razão
ITF/interior tumoral
(LFQ intensity)
UniProt IDs
Tripeptidyl-peptidase 1 0,670785374 O14773
Myosin regulatory light chain 12A -0,300320106 J3QRS3
Prolyl 4-hydroxylase subunit alpha-2 -0,563140914 O15460
Histone H2B 0,694409807 U3KQK0
Cartilage intermediate layer protein 1 0,587885194 O75339
Core histone macro-H2A.1 0,606355273 O75367
Isoform 8 of Filamin-B -0,69978537 O75369-8
PRA1 family protein 3 0,913867931 O75915
Isoform 3 of Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP9 -1,481027331 O95302-3
Coagulation factor XIII A chain 0,997989868 P00488
Angiotensinogen 0,809130785 P01019
Kininogen-1 0,610276921 P01042
HLA class II histocompatibility antigen, DR alpha chain 0,896303498 P01903
Myoglobin 2,901378967 P02144
Keratin, type I cytoskeletal 14 -2,257044582 P02533
Prelamin-A/C -0,326420085 P02545
Interstitial collagenase -1,079376233 P03956
Isoform sGi2 of Guanine nucleotide-binding protein G(i)
subunit alpha-2 0,339628779 P04899-4
Creatine kinase M-type 2,706802841 P06732
Integrin alpha-V -1,674279451 P06756
L-lactate dehydrogenase B chain 0,427840382 P07195
Glutathione peroxidase 1 0,67878108 P07203
Isoform 2 of Annexin A2 -0,431494295 P07355-2
Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn] 2,013683559 P08294
Cathepsin G 1,26076864 P08311
Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C, isoform
CRA_d 1,101464767 A0A0A0MT22
Glutathione S-transferase P -0,438908402 P09211
Galectin-1 -0,605895039 P09382
SPARC -1,537199451 D3DQH8
Histone H2A type 1 0,441534132 P0C0S8
Non-secretory ribonuclease 3,352805634 P10153
Eosinophil peroxidase 3,059351974 P11678
Collagen alpha-1(VI) chain 0,534962699 P12109
Collagen alpha-2(VI) chain 0,561583507 P12110
Collagen alpha-3(VI) chain 0,351737972 P12111
Eosinophil cationic protein 3,594172458 P12724
Keratin, type II cytoskeletal 5 -2,149217955 P13647
111
Bone marrow proteoglycan 2,593693665 P13727
Plastin-2 1,123581304 P13796
Plastin-3 -0,451190002 P13797
Integrin beta-4 -1,239838156 P16144
Histone H1.5 0,523773777 P16401
Histone H1.2 0,635898665 P16403
HLA class II histocompatibility antigen, DRB1-11 beta
chain 0,781369351 P20039
Lamin-B1 0,519782376 P20700
Mimecan 0,913669308 P20774
Filamin-A -0,589782114 P21333
Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 2,629504995 P21980
Myosin regulatory light polypeptide 9 -0,939278199 P24844
ATP synthase subunit alpha, mitochondrial 0,383101205 P25705
High mobility group protein B2 1,064686082 P26583
Isoform 2 of Transketolase 1,226421881 P29401-2
Coronin-1A 1,318567487 P31146
14-3-3 protein sigma -1,280293902 P31947
Thrombospondin-2 -0,712335335 P35442
Myosin-9 -0,384437657 P35579
Collagen alpha-1(XV) chain 1,432731656 P39059
Eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 3 -0,613871089 P41091
Myeloid cell nuclear differentiation antigen 0,93636475 P41218
60S ribosomal protein L5 0,423002792 P46777
Matrix metalloproteinase-14 -0,686171546 P50281
PDZ and LIM domain protein 4 -0,697006591 P50479
Prolargin 0,944026898 P51888
Epiplakin -2,341058325 P58107
Myosin light polypeptide 6 -0,43705882 B7Z6Z4
Proteasome subunit alpha type 0,492847159 G3V5Z7
Destrin -0,398039879 P60981
60S ribosomal protein L26 0,792450918 P61254
Histone H4 0,381686029 P62805
40S ribosomal protein S25 0,590497281 P62851
40S ribosomal protein S26 -0,619173224 P62854
Isoform 2 of Fibulin-2 -1,073581267 P98095-2
Fatty acid-binding protein, epidermal -1,33212052 Q01469
Collagen alpha-1(VII) chain -1,34471226 Q02388
Keratin, type I cytoskeletal 17 -2,569912015 Q04695
Collagen alpha-1(XIV) chain 1,408752186 Q05707
Cytoskeleton-associated protein 4 -0,364059229 Q07065
Rho GTPase-activating protein 1 -0,52548658 Q07960
Laminin subunit beta-3 -1,698437446 Q13751
Laminin subunit gamma-2 -1,496188143 Q13753
Src substrate cortactin -0,431859637 Q14247
Plectin -0,422601593 Q15149
112
Prostacyclin synthase 1,610427835 Q16647
Fascin -0,673794229 Q16658
Histone H3.2 0,648022034 Q71DI3
Polyadenylate-binding protein 2 0,789939033 Q86U42
Fermitin family homolog 3 0,785027294 Q86UX7
Isoform 2 of Leucine-rich repeat-containing protein 15 -0,802318298 Q8TF66-2
Palladin -1,138299227 Q8WX93
Protein NDRG1 -2,00068386 Q92597
Far upstream element-binding protein 2 0,526173664 Q92945
BTB/POZ domain-containing protein KCTD12 0,65692292 Q96CX2
Reticulocalbin-3 -0,660454261 Q96D15
Calponin -1,096604219 B4DUT8
Aconitate hydratase, mitochondrial 0,664531913 A2A274
Matrix-remodeling-associated protein 5 -0,626436807 Q9NR99
Isoform 2 of Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 0,765546617 Q9NZ08-2
Myoferlin -0,693628764 Q9NZM1
LIM and cysteine-rich domains protein 1 -0,486761558 Q9NZU5
Proteasome activator complex subunit 2 0,690805162 A0A087X1Z3
Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase
SAMHD1 1,014329177 Q9Y3Z3
113
APÊNDICE 2
Figura suplementar 1. Avaliação dos valores de quantificação (LFQ intensity) por de
histograma das amostras excluídas. A baixa quantificação das proteínas nas amostras de um
mesmo paciente foi utilizada como critério de exclusão.
LFQ_intensity P11E
LFQ_intensity P11F
LFQ_intensity P19E
LFQ_intensity P19F
LFQ_intensity P20E
LFQ_intensity P20F
Declaração
As cópias de artigos de minha autoria ou de minha co-autoria, já publicados ou
submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congressos sujeitos a
arbitragem, que constam da minha Dissertação/Tese de Mestrado/Doutorado, intitulada
Discovery and targeted proteomics map of prognostic signature proteins in oral
cancer, não infringem os dispositivos da Lei n.° 9.610/98, nem o direito autoral de
qualquer editora.
Campinas, 21 de março de 2018
Assinatura : __________________________________
Nome do(a) autor(a): Carolina Moretto Carnielli
RG n.° 33062814-8
Assinatura : __________________________________
Nome do(a) orientador(a): Adriana Franco Paes Leme
RG n.° 32480203135039
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