UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ – UESC

LUANA ARAÚJO RIBEIRO

IDENTIFICAÇÃO DE DNA DE Toxoplasma gondii ATRAVÉS DO

MÉTODO DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) EM

OSTRAS (Crassostrea rhizophorae) DO LITORAL SUL DA BAHIA.

ILHÉUS – BAHIA

2013

LUANA ARAÚJO RIBEIRO

IDENTIFICAÇÃO DE DNA DE Toxoplasma gondii ATRAVÉS DO

MÉTODO DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) EM

OSTRAS (Crassostrea rhizophorae) DO LITORAL SUL DA BAHIA.

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte das

exigências para obtenção do título de Mestre

em Ciência Animal.

Área de concentração: Ciência Animal

Orientador: Prof. Dr. George Rêgo

Albuquerque

ILHÉUS – BAHIA

2013

R484 Ribeiro, Luana Araújo

Identificação de DNA de Toxoplasma gondii através do método de reação

em cadeia de polimerase (PCR) em ostras (Crassostrea rhizophorae) do

litoral sul da Bahia / Luana Araújo Ribeiro. – Ilhéus, BA: UESC, 2013.

40 f.: il.

Orientador: George Rêgo Albuquerque.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de

Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal.

Inclui referências.

1. Bivalve (Molusco) – Bahia. 2. Toxoplasma gondii – Bahia. 3. Molusco como transmissor de doenças. 4. Ostra – Camamu (BA). 5. Parasitologia. I. Título.

CDD 639.41

LUANA ARAÚJO RIBEIRO

IDENTIFICAÇÃO DE DNA DE Toxoplasma gondii ATRAVÉS DO

MÉTODO DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) EM

OSTRAS (Crassostrea rhizophorae) DO LITORAL SUL DA BAHIA.

Ilhéus – BA, 29/11/2013

___________________________________

George Rego Albuquerque – DSc

UESC/DCAA

(Orientador)

____________________________________

Amauri Arias Wenceslau – DSc

UESC/DCAA

___________________________________

Aristeu Vieira da Silva – DSc

UEFS

ILHÉUS - BAHIA

2013

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela força e determinação que me

proporcionou nesses dois anos de mestrado, foi uma experiência intensa, mas

muito boa.

Aos meus familiares e amigos, os quais me fortaleceram a cada dia de

batalha, e por suportarem minhas alterações de humor por conta da tripla jornada

(casa/trabalho/mestrado). Especialmente ao meu marido Tadeu Medeiros, pela

paciência, compreensão, companheirismo. Sei que muitas vezes fui ausente, mas

sempre esteve do meu lado para tudo. Obrigado por me ajudar a ser mais calma,

a controlar minhas emoções, e por me dar todo suporte para que eu cursasse o

mestrado. Agradeço a todos pelos momentos de descontração, risadas e resenhas.

Sem vocês eu não suportaria.

Agradeço também àqueles que me ajudaram diretamente nessa jornada

para concluir o curso:

Agradeço a Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pela

oportunidade de evoluir e buscar conhecimentos.

Ao meu orientador George Rêgo Albuquerque pela oportunidade de

realizar o mestrado e adquirir experiência. Obrigado pela paciência e assistência.

Aos bolsistas de Iniciação Científica Pedro Alcântara e Luana Nogueira,

exemplo de dedicação e responsabilidade. Com certeza as noites, os finais de

semanas e os feriados na UESC, foram mais leves e divertidos com vocês.

Agradeço imensamente a vocês por tudo, sem palavras para o tanto que devo a

vocês.

“Viver! E não ter a vergonha de ser feliz.Cantar e cantar,e cantar a beleza de ser um

eterno aprendiz. Ah meu Deus! Eu sei que a vida devia ser bem melhor e será, mas isso

não impede que eu repita: É bonita, é bonita , e é bonita”

Gonzaguinha

IDENTIFICAÇÃO DE DNA DE Toxoplasma gondii ATRAVÉS DO

MÉTODO DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) EM

OSTRAS (Crassostrea rhizophorae) DO LITORAL SUL DA BAHIA.

RESUMO

Toxoplasma gondii é um protozoário de grande importância zoonótica. Estudos

recentes demonstram que os oocistos eliminados nas fezes dos felinos estão

contaminando as águas de rios e mares, provavelmente, em decorrência de

escoamentos de esgotos e águas da chuva. Neste contexto, mamíferos marinhos

têm sido identificados portando o parasita, sendo os moluscos bivalves, através

do processo de filtro-alimentação uma das possíveis fontes de contaminação para

estes animais e para os humanos. O objetivo deste estudo foi verificar a

existência do parasita T. gondii em ostras do litoral sul baiano, utilizando a

técnica de reação em cadeia da polimerae (PCR). Um total de 624 ostras foram

adquiridas nas cidades de Ilhéus e Camamu. Foi feita a retirada das brânquias e

glândulas digestivas. Após, foram feitos pools de três órgãos e realizada extração

de DNA, com kit comercial.. Posteriormente realizou-se a identificação do

parasita através das técnicas de PCR tradicional (primers Tox4 e Tox5) e nested

PCR (primers SAG1). Na PCR tradicional, não foram identificadas amostras

positivas nas ostras, porém utilizando a técnica nested-PCR, foram identificadas

17 (8,1%) amostras positivas, sendo sete amostras (6,7%) em Ilhéus e dez (9,6%)

em Camamu. A partir do presente estudo, conclui-se que as ostras Crassostrea

rhizophorae possuem capacidade de filtrar e reter oocistos de T. gondii, e que os

estuários pesquisados encontram-se contaminados por oocistos do parasito.

Palavras-chave: molusco bivalve; ostras; PCR; Toxoplasma gondii

IDENTIFICATION OF DNA DE Toxoplasma gondii ATRAVÉS THE

METHOD OF POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Crassostrea

rhizophorae OYSTERS ON THE SOUTH COAST OF BAHIA

ABSTRACT

Toxoplasma gondii is a protozoan very important zoonotic. Recent studies show

that the oocysts shed in the feces of cats are contaminating the waters of rivers

and seas, probably as a result of flow of sewage and rainwater. In this context,

marine mammals have been identified carrying the parasite, and the bivalve

molluscs through the filter -feeding process of one of the possible sources of

contamination for these animals and humans. The aim of this study was to verify

the existence of the parasite T. gondii in oysters from the southern coast of

Bahia, using the technique of polimerae chain reaction (PCR). A total of 624

oysters were purchased in the cities of Ilheus and Camamú. Was made to remove

the gills and digestive glands. After, we made three pools organs and performed

DNA extraction with a commercial kit. Later there was the identification of the

parasite through the techniques of traditional PCR (primers and Tox4 Tox5) and

nested PCR (primers SAG1). In traditional PCR positive samples were not

identified in oysters, but using nested- PCR technique, we identified 17 (8.1%)

positive samples , seven samples (6.7%) in islets and ten (9.6%) in Camamú .

From this study it is concluded that oysters Crassostrea rhizophorae have ability

to filter and retain oocysts of T. gondii and estuaries surveyed are contaminated

with oocysts of the parasite.

Keywords: bivalve; oysters; pcr; Toxoplasma gondii.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida do Toxoplasma gondii......................................................7

Figura 2. Estuário da cidade de Ilhéus.................................................................19

Figura 3. Estuário da Cidade de Camamu – Sistema Espinhel...........................20

Figura 4. Limpeza das ostras...............................................................................21

Figura 5. Mensuração da altura das ostras...........................................................21

Figura 6. Processamento das ostras – Retirada dos tecidos.................................22

Figura 7. Eletroforese da PCR Tradicional.........................................................26

Figura 8. Eletroforese da nested-PCR.................................................................27

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO------------------------------------------------------------------------1

2. OBJETIVOS----------------------------------------------------------------------------3

2.1 Objetivo Geral--------------------------------------------------------------------------3

2.2 Objetivo Específicos-------------------------------------------------------------------3

3. REVISÃO DE LITERATURA------------------------------------------------------4

3.1Biologia Toxoplasma gondii----------------------------------------------------------4

3.1.1Ciclo do Toxoplasma gondii--------------------------------------------------------5

3.1.2Toxoplasmose em Animais e Humanos-------------------------------------------7

3.2Água como fonte de infecção para o Toxoplasma gondii----------------------10

3.3 Moluscos Bivalves-------------------------------------------------------------------13

3.3.1 Ostras (Crassostrea rhizophorae)--------------------------------------------14

3.3.2 Ostras e Toxoplasma gondii---------------------------------------------------16

4. MATERIAIS E MÉTODOS--------------------------------------------------------18

4.1 Coleta de amostras-------------------------------------------------------------------19

4.2 Processamento das amostras--------------------------------------------------------20

4.2.1 Retirada dos Tecidos---------------------------------------------------------------21

4.2.3 Análise Molecular------------------------------------------------------------------23

4.2.3.1 Extração de DNA----------------------------------------------------------------23

4.2.3.2 Quantificação de DNA----------------------------------------------------------24

4.2.3.3 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)-------------------------------------24

5. RESULTADO E DISCUSSÃO----------------------------------------------------26

6. CONCLUSÕES-----------------------------------------------------------------------32

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS-------------------------------------------33

1

1. INTRODUÇÃO

Toxoplasma gondii é um parasita com ciclo heteroxeno facultativo, onde a

fase sexuada ocorre no intestino dos felinos, hospedeiros definitivos, resultando

na formação de oocistos. A fase assexuada ocorre nos hospedeiros intermediários

(DUBEY; BEATTIE 1989; LINDSAY et al 2001; DUBEY, 1994), animais

homeotérmicos, incluindo o homem e os felinos.

Parasita de ampla distribuição mundial e alta prevalência no Brasil

(FIALHO, 2009). Toxoplasma gondii é o agente etiológico da toxoplasmose,

doença endêmica, que se agrava com a precária condição sanitária da população

(Bahia-Oliveira, 2003). É considerado um problema de saúde pública, por ser

uma zoonose, na qual um dos seus estágios, os oocistos, são altamente resistentes

no ambiente. Acredita-se que apenas um único oocisto do parasita é capaz de

infectar o ser humano (DUBEY, 2004). O Brasil possui uma alta prevalência de

infecção, com soroprevalência variando de 50 a 80%, nas populações adultas

(BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003). Os sintomas em pacientes saudáveis, humanos

ou animais, apresentam-se semelhante à gripe, com febre, dor muscular, dor de

cabeça (FRENKEL, 1990; TENTER et al., 2000). Porém em pacientes

imunossuprimidos, pode acarretar em problemas oculares, pneumonia e

alterações neurológicas. Em mulheres gestantes, especialmente no primeiro terço

da gestação, pode desencadear alterações fetais e aborto (WILSON et al., 1980).

Em animais de produção, especialmente em suínos, caprinos e ovinos, a

toxoplasmose gera grandes perdas econômicas em decorrência de problemas

reprodutivos, como abortos (FIALHO, 2009; DUBEY et al., 2011).

Oocistos de T. gondii são pequenos (10-13 milímetros) e resistentes,

podendo sobreviver no ambiente por meses, dependendo das condições

ambientais. Oocistos sobrevivem em água potável e água do mar a 20-22 0C por

aproximadamente 18 meses. A contaminação hídrica destes parasitas é de grande

relevância para a saúde pública, uma vez que, estes têm sido identificados como

2

agentes de surtos associados ao consumo de água e contaminação de sistemas de

distribuição.

A contaminação por oocistos de T. gondii nos ambientes aquáticos e

marinhos ocorrem, principalmente, pelo escoamento de águas de chuvas e de

esgotos, porém a epidemiologia de T. gondii em ambientes aquático ainda é

pouco conhecida.

As ostras são encontradas nas águas temperadas, subtropicais e tropicais

(ELDREDGE, 1994). Altamente nutritiva, são ricas em proteínas, vitaminas e

minerais (BRASIL, 1983), sendo assim, considerada uma opção de alimento para

os humanos. Através do mecanismo de filtro-alimentação, as ostras, ingerem

pequenas partículas em suspensão na água, e por não serem seletivas, podem

ingerir também microrganismos, tais como: bactérias, vírus e protozoários,

retendo-os em seus tecidos. Neste contexto, T. gondii tem sido relatado em

moluscos bivalves, tais como as ostras, e com este mecanismo de alimentação

estas tornam-se possíveis fonte de contaminação para animais e humanos, caso

venha a consumi-las in natura. Ainda podem ser consideradas como um

bioindicador de contaminação ambiental (DUBEY; JONES, 2008).

3

2. OBJETIVOS

2.1Objetivo Geral

Detectar através das técnicas de PCR e nested-PCR, DNA de T. gondii em

ostras C. rhizophorae no litoral Sul da Bahia.

2.2 Objetivos Específicos

Verificar a frequência de contaminação das ostras pelo T. gondii;

Verificar o melhor órgão para identificação do parasito (brânquia ou

glândula digestiva);

Avaliar melhor técnica ao ser empregada para obter eficiência na

identificação do T. gondii;

Verificar se há contaminação por oocistos nos estuários do Litoral Sul da

Bahia.

4

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 Biologia de Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondiié um protozoário de elevada importância zoonótica,

pertencente ao reino Protista, filo Apicomplexa, ordem Eimeriorina e família

Toxoplasmatidae (TENTER et al., 2000; DUBEY, 2010). Esta espécie foi

descrita pela primeira vez em 1908 por Charles Nicolle e Louis Manceaux, em

tecidos de um roedor (Ctenodactusgundi), o qual estava sendo utilizado para uma

pesquisa de leishmaniose. Inicialmente este parasita foi confundido com

Leishmania, mas posteriormente percebeu-se que tratava-se de um novo

organismo, nomeando-o de Toxoplasma gondii, com base na morfologia do

parasita e hospedeiro (DUBEY, 2010). No mesmo período, no Brasil, Splendore

(1908) descobriu o mesmo parasita, porém em coelho. Somente a partir de 1970

obteve-se o conhecimento dos estágios sexuais do parasita no intestino delgado

dos gatos, completando assim o conhecimento sobre o ciclo biológico de T.

gondii (DUBEY et al. 1970 a, b, c; DUBEY, 2010).

Toxoplasma gondii, coccídio intestinal, possui como hospedeiro definitivo

os felinos, domésticos e selvagens, onde ocorre a fase sexuada do parasita

(DUBEY, 1970a; DUBEY; BEATTIE 1989; TENTER et al., 2000). e os demais

animais homeotérmicos são considerados hospedeiros intermediários. Há três

estádios principais no seu ciclo evolutivo: esporozoítos nos oocistos, taquizoítos

e bradizoítos nos cistos teciduais (DUBEY, 1970a; DUBEY; BEATTIE 1989;

DUBEY, 2010).

Os oocistos de T. gondii são pequenos (11-13mm) e resistentes a maioria

dos desinfetantes, podendo sobreviver em ambiente úmido por meses ou anos

(TENTER et al.,2000). É a forma de resistência ambiental do parasito.

Taquizoíto é a forma de multiplicação rápida, podem penetrar em qualquer

célula nucleada. Ao penetrar na célula do hospedeiro, são envolvidos por uma

5

membrana, formando um vacúolo parasitóforo, onde ocorre a multiplicação

assexuada por endogenia. Quando a célula do hospedeiro não suporta mais esse

crescimento, rompe. Os taquizoítos são incapazes de viver fora do seu

hospedeiro, normalmente são destruídos pelo suco gástrico, porém são

responsáveis pela transmissão do parasito pela via transplacentária, transfusão

sanguínea ou acidentes em laboratórios (DUBEY, 2010).

O cisto tecidual contendo os bradizoítos é o estágio de resistência do

parasita nos organismos, os cistos crescem e permanece intracelular. Estes cistos

podem desenvolver-se em qualquer órgão como: pulmão, fígado e rim, mas são

mais prevalentes em tecidos neurais e musculares, tais como: cérebro, olhos,

músculo esquelético e cardíaco. O que leva a ruptura de um cisto é desconhecido,

mas este rompimento com posterior multiplicação do taquizoíto pode levar a uma

enfermidade aguda. Em contrapartida, alguns cistos podem ficar intactos ao

longo da vida do hospedeiro, e não causar dano algum a este animal (DUBEY,

2010). Os cistos do parasita podem ser destruídos através do cozimento, com

temperaturas acima de 60° C e por congelamento em – 12° C (DUBEY, 2010).

Toxoplasma gondii pode ser transmitido pela via transplacentária

(congênita); ingestão de tecidos de animais infectados contendo cistos

(carnivorismo) e também pela ingestão de água e alimentos contaminados por

oocistos esporulados (DUBEY, 1994; DUBEY et al., 2003; DUBEY, 2010).

Segundo Benensonet al. (1982) e Boiwe et al. (1997), a água tem sido

identificada como fonte de infecção em surtos de T. gondii.

3.1.1 Ciclo de Toxoplasma gondii

Os felinos após a ingestão de qualquer um dos estágios infectantes:

taquizoítos, bradizoítos e oocistos, podem excretar oocistos. Porém menos de

50% dos gatos excretam oocistos após a ingestão de taquizoíto ou oocisto,

enquanto praticamente todos eliminam oocistos após a ingestão de cistos

teciduais, contendo bradizoítos (DUBEY et al., 1970a). Após a ingestão do cisto,

a membrana é dissolvida pela ação das enzimas proteolíticas no estômago e

6

intestino, liberando os bradizoítos, os quais penetram nas células epiteliais do

intestino delgado, iniciando o desenvolvimento de várias gerações (até 5) de

merozoítas que se multiplicam assexuadamente (esquizogonia). A fase sexuada

pode iniciar dois dias após a infecção por cisto. A origem da gametogonia não foi

determinada, mas os merozoítos liberados a partir da esquizogonia, iniciam a

formação de gametas, masculino (microgametócito) e feminino

(macrogametócito). Após a fecundação dos gametas, forma-se uma parede de

oocisto ao redor do parasita, sendo estes liberados no lúmen intestinal e

excretados nas fezes dos felinos (DUBEY, 2010).

A esporulação dos oocistos ocorre no ambiente em torno de um a cinco

dias, dependendo da aeração, umidade e temperatura. Cada oocisto contém dois

esporocistos, com quatros esporozoítos (DUBEY, 2004).

O aumento da sobrevivência dos oocistos excretados pelos gatos deve-se

ao comportamento natural da espécie, principalmente os domésticos, de defecar

na sombra e enterrar as fezes, estes fatores associados a condições climáticas

favoráveis prolongam a vida útil do estágio infectante (YILMAZ; HOPKINS,

1972). As fezes do gato, contaminada com oocisto do parasita, podem ser

encontradas livres ou enterradas nas ruas, praças, calçadas, parques, feno, ração

animal e caixas de areia. As moscas, baratas, e fatores climáticos como a chuva,

podem trazer estes oocistos a superfície (DUMETRE; DARDÉ, 2003). Estudos

realizados em 39 praças de Pelotas, Rio Grande do Sul, observaram-se a

contaminação dos solos de duas praças para T. gondii (TAVARES et al. 2008).

Uma pesquisa realizada na Cidade de Victoria e adjacências de Vancouver,

mostraram que milhares de pessoas haviam se infectado com T. gondii, achados

epidemiológicos sugeriram como fonte de infecção a água de um reservatório

contaminado por oocistos (BOWIE, 1997).

Nos hospedeiros intermediários, após a ingestão de oocistos esporulados,

ocorrem a liberação dos esporozoítos, os quais penetram nos enterócitos e células

epiteliais do intestino, multiplicam-se assexuadamente formando os taquizoítos,

que se distribuem pelo organismo se multiplicando assexuadamente e,

7

posteriormente ocorre a formação dos cistos nos tecidos contendo bradizoítos,

sendo estes o estágio final do ciclo do parasita (DUBEY, 2010) (Figura 1).

Figura 1. Ciclo de vida do Toxoplasma gondii. Fonte: DUBEY, 2010.

3.1.2Toxoplasma gondii em animais e humanos

A toxoplasmose em humanos imunologicamente saudáveis geralmente é

assintomática, podendo resultar em sintomas semelhantes ao da gripe

(FRENKEL, 1990; TENTER et al., 2000), como: cefaleia, dores musculares,

febre passageira, e linfadenopatia (DUBEY, 2010). Os maiores problemas são

para mulheres infectadas pela primeira vez durante a gestação, que podem

desencadear uma série de alterações fetais que vão desde sinais de retardamento

mental, coriorretinite até morte do feto (WILSON et al, 1980) ou a criança pode

sobreviver e desenvolver a doença grave, com hidrocefalia e problemas oculares

8

e neurológicos (DUBEY, 2010). E para pessoas imunossuprimidas como

pacientes transplantados, pacientes com AIDS, ou câncer, os quais podem

desenvolver a fase aguda letal, caso não tenha tratamento adequado (DUBEY,

2004).

Os seres humanos podem adquirir T. gondii do ambiente pelo contato com

a água e solo contaminados por fezes de gatos (oocistos), através dos alimentos,

como carne crua ou mal cozida (cistos) e ou legumes lavados inadequadamente

(oocistos), ou ainda por transmissão transplacentária (taquizoítas) (TENTER et

al., 2000). Segundo Conrad (2005), a infecção pelo T. gondii acontece

principalmente pela ingestão de cistos contendo bradizoítos de hospedeiros

intermediários infectados, como porcos e ovelhas, ou por ingestão de oocisto

esporulado.

Estudos recentes estão levantando a hipótese de que a esquizofrenia pode

está relacionada a agentes infecciosos. O maior número de estudos envolveu o

parasita Toxoplasma gondii (TORREY, 2007). A toxoplasmose latente era

considerada por muitos anos uma doença inofensiva para imunocompetentes,

uma vez que tratava-se de um estágio dormente do parasita, porém nos últimos

anos essa forma de doença parasitária sugere está associado a diversos problemas

psiquiátricos e neurológicos, não antes correlacionados, tais como suicídio e a

esquizofrenia (TORREY et al., 2007; FLEGR, 2013).

Inquéritos epidemiológicos para anticorpos anti-T. gondii indicam que a

soroprevalência deste parasita é maior no Brasil do que nos Estados Unidos. O

Brasil possui uma elevada taxa de infecção em humanos. Cerca de 53,3 % das

crianças com menos de 1 ano foram consideradas soropositivas, anticorpos estes

adquiridos da mãe infectada, aproximadamente 50% das crianças em ensino

fundamental e 80% das mulheres em idade fértil, também possuíam anticorpos

para o parasita (DUBEY, 2012a). Estes dados indicam que a soroprevalência de

T. gondii em crianças e mulheres grávidas no Brasil é uma das mais altas em

todo o mundo (DUBEY e BEATTIE, 1988; TENTER et al., 2000; DUBEY,

2010a). A toxoplasmose ocular em crianças infectadas congenitamente são

consideradas cinco vezes mais graves do que nas crianças da Europa, com lesões

9

mais extensas, acredita-se que essa diferença esta relacionada a composição

genética da cepa do parasita em humanos, porém mais estudos precisam ser

realizados para estabelecer tal associação (DUBEY, 2012a).

Nos animais, o gato é de suma importância na epidemiologia do parasita,

considerado espécie-chave na transmissão da toxoplasmose, uma vez que é o

único capaz de excretar oocistos nas fezes (DUBEY; BEATTIE 1989; TENTER

et al., 2000), eliminando cerca de 200 milhões de oocistos, em apenas uma ou

duas semanas. Fatores como idade do gato, estado nutricional e números de

cistos teciduais ingeridos podem influenciar essa eliminação (DUBEY, 2010). A

infecção pelo T. gondii é mais prevalente em climas quentes e em áreas baixas do

que em clima frio e regiões montanhosas, também é maior em áreas úmidas do

que em áreas secas (DUBEY, 2010).

A toxoplasmose pode ocorrer em cães, gatos, caprinos, ovinos, aves

(FIALHO, 2008), primatas, mamíferos marinhos e uma série de animais de

sangue quente (DUBEY, 2010), porém T. gondii pode parasitar os hospedeiros

definitivos e intermediários sem produzir sinais clínicos (DUBEY, 2010). Dos

animais destinados à consumo humano, T. gondii foi isolado com maior

freqüência nos suínos do que em galinhas e bovinos (DUBEY, 2012b). Estudos

sorológicos realizados no Brasil objetivando verificar a prevalência nos animais

domésticos para o protozoário demonstram que as positividades em gatos

domésticos variam de 87% em Rondônia a 5% na cidade de São Paulo; bovinos

variando de 4% a 71% no Mato Grosso do Sul; eqüinos cerca de 4% em Jequié-

Bahia e 70% em São Paulo; e até 90 % dos suínos; 92% dos caprinos e 59% dos

ovinos pesquisados no Brasil foram positivos (DUBEY, 2012a).

Nos cães os principais sinais clínicos envolvem o sistema neuromuscular,

gastrointestinal e respiratório (BRESCIANI et al., 2001). Nos gatos os principais

sinais incluem febre, anorexia, alteração respiratória, em especial a pneumonia,

alterações neurológicas e oculares (LUCAS et al., 1999).

Em animais de produção como caprinos, ovinos, suínos (RAGOZO et al.,

2010), a toxoplasmose causa grandes prejuízos econômicos, pois leva a

alterações reprodutivas, como aborto, natimortos e nos animais recém nascidos

10

pode causar alterações neurológicas. Os bovinos e eqüinos são considerados

resistentes para T. gondii (DUBEY, 2012).

Pesquisas recentes comprovaram a presença de T. gondii em mamíferos

marinhos, como: focas, leões marinhos, golfinhos, baleias e lontras do mar

(DUBEY et al., 2003; FAYER et al., 2004; CONRAD et al., 2005;

DUBEY;JONES, 2008; MILLER et al., 2008), em países como os EUA, Itália,

Espanha, Canadá e Austrália. Segundo Dubey (2010) os principais sinais

encontrados em mamíferos marinhos, especialmente em lontras do mar, foram a

encefalite e a miocardite. Ainda não foi esclarecido como os mamíferos marinhos

se infectam na natureza, pois a maioria destes não possuem os animais de sangue

quente, considerados fontes potenciais de transmissão do T. gondii em

decorrência dos cistos presentes nos tecidos, na sua cadeia alimentar. Acredita-se

que a contaminação esteja ocorrendo por meio da ingestão de oocisto esporulado

no mar (CONRAD et al, 2005), sendo estes decorrentes do escoamento das águas

de chuva para o mar, a qual acaba carregando dejetos e fezes de felinos

contaminados (COLE et al., 2000; CONRAD et al., 2005). Há relatos de

transmissão congênita em golfinhos (FAYER et al. 2004) e toxoplasmose clínica

e subclínica nestes animais (COLE et al 2000).

Os moluscos bivalves, apesar de não ser homeotérmicos, podem atuar

como hospedeiro transportador de oocistos (LINDSAY et al., 2004; CONRAD et

al., 2005), uma vez que possuem mecanismo de filtro alimentação (FAYER et al,

2003, 2004), sendo considerado indicador de contaminação ambiental, além de

veicular o parasita para seres humanos e animais marinhos.

3.2 Águas como fonte de infecção para o Toxoplasma gondii

A contaminação da água dos rios, lagos e mares por esgotos urbanos não

tratados são responsáveis pela degradação dos recursos hídricos do Brasil e da

maioria dos países do mundo (VALENÇA, 2003). Estima-se que apenas 38% dos

dejetos e esgotos domésticos produzidos no país recebem tratamento (BRASIL,

2011) Os hospedeiros definitivos do T. gondii são capazes de excretar oocistos

11

nas fezes que potencialmente podem ser transportados para água doce e marinha

através dos esgotos ou drenagens de água pluviais (MILLER et al, 2002; FAYER

et al, 2004; CONRAD et al 2005), sendo os bancos de areia e baías, próximas aos

centros urbanos, os locais mais expostos ao T. gondii (MILLER et al., 2002) em

decorrência da maior poluição fecal nessas áreas.

A epidemiologia do T. gondii em ambientes aquático é pouco conhecida.

Há diversos indicadores de contaminação fecal da terra para o mar, dentre eles a

provável existência de oocistos do parasita em ambientes marinhos, e a presença

de anticorpos contra T. gondii em mamíferos marinhos (FAYER et al. 2004).

Pesquisas envolvendo contaminação ambiental dos mares e patógenos, em

especial os protozoários de importância zoonótica, como T. gondii, vem

ganhando destaque (CONRAD et al, 2005). Lindsay et al., (2003) mostraram que

os oocistos podem esporular na água e tornar-se infecciosos para os hospedeiros,

sobrevivendo por um período de seis meses na água do mar. Patógenos podem

ocorrer naturalmente em ambientes marinhos, por exemplo, Vibrium, mas

também podem estar chegando ao ambiente marinho pela contaminação de

estuários e de ambientes costeiros por material fecal de origem animal ou

humana. Doenças de veiculação hídrica, sobretudo aquelas causadas por

protozoários intestinais, estão crescendo e são consideradas como importantes

problemas de saúde pública (FRANCO, 2007).

Em 2009, estudos foram realizados para avaliar a sobrevivência a longo

prazo dos oocistos esporulados e mantidos na água do mar. Para tanto, oocistos

de T. gondii foram recolhidos de gatos naturalmente infectados, e foram

esporulados e armazenados em água do mar a 15 ppt, a 4°C e a temperatura

ambiente. Um volume de 0,5 ml, contendo cerca de 105 oocistos, foram

administrados oralmente para camundongos. Esfregaços de fígado, pulmão e

cérebro foram realizados para verificação de cistos teciduais. Todos os

camundongos alimentados com oocistos armazenados em água do mar a 4° C por

um período de 15 meses morreram ou foram mortos pela toxoplasmose aguda.

Porém a infectividade de oocistos mantidos a temperatura ambiente foi

diminuindo em 15 a 18 meses de armazenamento. Os camundongos inoculados

12

com oocistos armazenados nesse período foram considerados clinicamente

normais, apenas um camundongo de três, alimentados com oocisto armazenado a

18 meses tornou-se infectado. Diante do exposto, constata-se que oocistos

sobreviveram em água do mar à temperatura ambiente por pelo menos 24 meses

(LINDSAY; DUBEY 2009).

Toxoplasma gondii tem causado surtos em seres humanos (DUBEY;

JONES, 2004; MOURA, 2006; FRANCO, 2007) que consomem água

contaminada por oocistos (BOWIE et al., 1997). Um surto epidemiológico de

toxoplasmose devido a veiculação hídrica foi notificado no estado do Pará-BR,

onde 294 pessoas foram infectadas através de contaminação acidental da água

por fezes de gato (MOURA, 2006). No Rio de Janeiro a água armazenada em

poços, com baixa profundidade, próximos a níveis da rua, são freqüentemente

contaminadas por oocistos, provavelmente por conseqüência de inundações e

escoamentos de chuvas, sendo a água considerada uma das principais fontes de

infecção por oocistos, no local (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2003).

O maior surto de toxoplasmose clínica em seres humanos,

epidemiologicamente, ligado à água potável a partir de um reservatório de água

da cidade de Santa Isabel do Ivaí, estado do Paraná. Após estudos e realização de

inquérito, observou-se que alguns gatos viviam próximos as duas cisternas

subterrâneas que abastecia o local, e excretavam oocistos no ambiente. As

cisternas apesar de cloradas eram mantidas abertas, e a água não era filtrada antes

do consumo humano. Este relato demonstra o quanto o gato é importante na

epideiologia da doença, porque eles são os únicos hospedeiros que excretar

oocisto resistente no ambiente (DUBEY et al., 2004). Os casos descritos acima

coorroboram que a toxoplasmose é considerada uma zoonose transmitida pela

água, sendo esta importante disseminadora de oocisto para população, caso exista

à presença depopulações de gatos domésticos, e ou selvagens contaminados com

o parasita no local, especialmente quando no local o tratamento de água é

ineficaz ou inexistente (DUBEY, 2004).

Um sistema de saúde pública eficaz, com Vigilância Sanitária atuante

seria uma relevante medida para tentativa de minimizar os casos de toxoplasmose

13

decorrentes de água contaminada por oocisto. Práticas como eliminação

adequada de esgotos e tratamento da água são medidas que podem minimizar a

contaminação do T. gondii (FAYER et al., 2004), bem como estratégias de

prevenção a segurança alimentar e de suprimento de água (FRANCO, 2007).

3.3 Moluscos Bivalves

A classe Bivalve possui as características de ser comprida nas laterais,

com concha externa composta de duas valvas, cada valva possui uma

protuberância denominada de umbo, as duas valvas são unidas através de uma

faixa proteica, não calcificada e elástica, conhecida como ligamento, que age na

abertura destas, e o músculo abdutor age fechando-as, o manto envolve todo o

corpo (RUPPERT et al., 1996; QUAST, 2003). Os pés dos Bivalves são

lateralmente compridos e a cabeça pouco desenvolvida (RUPPERT et al., 1996).

Três grupos principais são distintos pela natureza das brânquias:

Protobrânquios, considerado o mais primitivo da classe, conhecidos como

escavadores; Lamelobrânquios, os quais encontram-se a maioria dos bivalves;

Septibrânquios os mais especializados (RUPPERT et al., 1996).

Os lamelobrânquios, também conhecidos como moluscos filtradores,

evolutivamente adaptaram-se a utilizar a brânquia e a corrente respiratória para

alimentação por filtração, ou seja, tanto partículas quanto microrganismos

existentes no ambiente são considerados fonte de alimento (RUPPERT et al.,

1996). A principal modificação para a alimentação através da filtração foi o

alongamento e dobramento dos filamentos das brânquias, o qual cada filamento

dobrou-se assumindo o formato de “U”, dando forma laminar a estas (QUAST,

2003).

Os bivalves podem ser encontrados em ambientes marinhos e de água

doce, podendo cavar substratos moles, como areia e lama, ou ainda viver preso a

superfícies de madeiras ou rochas (QUAST, 2003). Mariscos, mexilhões e ostras

são exemplos de bivalves (RUPPERT et al., 1996).

14

3.3.1 Ostra Crassostrea rhizophorae

A área costeira do litoral do Brasil caracteriza-se pela presença de

extensos manguezais, no qual existem diversos organismos comestíveis, as ostras

destacam-se nestas áreas tanto por seu sabor, quanto por seu valor nutritivo

(NASCIMENTO; PEREIRA, 2004). Ostras são ricas em proteínas, gorduras,

carboidratos, minerais (cálcio, fósforo, ferro, iodo) e vitaminas (vitamina A,

tiamina, riboflavina) (BRASIL, 1983).

O molusco de maior interesse econômico no litoral brasileiro,

especialmente na Bahia, é a ostra C. rhizophorae (NASCIMENTO et. al, 1986;

BOEHS, 2010), considerada importante como recurso pesqueiro e com grande

potencial para a cultura marinha (LENZ; BOEHS, 2011), sendo comumente

oriunda de extrativismo ou produzida em aquicultura (ROBERTSON, 2007).

A espécie C. rhizophorae, denominada também de ostra-do-mangue adere

à superfície de raízes como a Rhizophora mangle e das rochas, em regiões entre

marés, com até 2,5 metros de profundidade (RIOS, 1994). Distribuindo-se pelo

sul do Caribe, Venezuela, Suriname, costa do Brasil até o Uruguai

(NASCIMENTO, 1991).

O cultivo, bem como o crescimento das ostras depende de algumas

condições ambientais. Os principais parâmetros relevantes ao cultivo destas são:

a salinidade, a qual pode variar de acordo com o tipo de estuário ou condições

climáticas, porém não pode ser próxima à zero para não matar a ostra; e a

temperatura, fator que influencia diretamente no metabolismo da C. rhizophorae,

já que a espécie é de águas tropicais com seu melhor desenvolvimento em

temperaturas em torno de 25°C a 32°C (GESTEIRA, et al., 2004). Em locais de

temperatura elevada à gametogênese dessa espécie ocorre ao longo do ano, com

picos entre os meses de março e outubro (MELO, 2008).

As ostras têm maior crescimento entre 1-1,5 metros acima do nível zero da

maré de sizígia, abaixo deste valor, tem uma maior quantidade de lama e

predadores (peixes, caranguejo) e menos oxigênio, o que dificulta seu

15

crescimento. O crescimento das ostras acima de 1,5m da maré alta torna-se

inapropriado, pelo fato de ficar muito expostas (NASCIMENTO, 1991). As

ostras atingem a maturidade sexual com aproximadamente 120 dias após a

fixação (NASCIMENTO, 1991) quando a concha deve atingir um comprimento

mínimo de 20 milímetros (NASCIMENTO; PEREIRA, 2004). A poluição por

dejetos industriais, agrotóxicos e domésticos podem contaminar os moluscos,

inibindo não só o seu crescimento, mas a sua sobrevivência.

Os mariscos habitam águas rasas e costeiras, onde o nível de nutrientes é

considerado elevado, porém tem uma maior contaminação de esgotos. A maioria

das espécies do gênero Crassostrea alimenta-se de fitoplancton através de um par

de brânquias, porém algumas alimentam-se de matéria orgânica (SHUMAWAY,

1992 apud POTASMAN, 2002). As brânquias são responsáveis pela respiração e

filtração do alimento. As partículas de detritos e os microrganismos presente na

corrente ventilatória são retidas nos filamentos das branquiais e conduzidas

através de batimentos ciliares, até os palpos labiais e boca (BARNABÉ, 1996

apud FARIAS, 2008). As ostras C. rhizophorae tem capacidade de filtrar uma

grande quantidade de volume de água (cinco litros por hora) (BARROS et al.,

2005), e caso patógenos de veiculação hídrica estejam presentes no ambiente,

podem acumular e concentrar-se no intestino, brânquias e hemolinfa destes

animais (ROBERTSON, 2007; LEAL; FRANCO, 2008). O perigo diante da

bioacumulação de microrganismos nocivos é agravado pela tradição de consumi-

los in natura (POTASMAN, 2002).

16

3.3.2 Ostras e Toxoplasma gondii

O consumo de molusco aumentou consideravelmente nos últimos anos,

por ser um alimento considerado rico em proteína e de fácil acesso na natureza

(POTSMAN, 2002). Os moluscos, por serem filtradores, podem ser considerados

como fonte de infecção para T. gondii (LINDSAY et al., 2001, 2004; ARKUSH

et al., 2003; LINDSAY; DUBEY 2009; DUBEY, 2010).

O papel das ostras no ciclo do parasita é desconhecido, uma vez que, não

parasitam animais de sangue frio (DUBEY, 2004), porém estudos experimentais

realizados por Lindsay et al. (2001; 2004), demonstraram que os moluscos são

capazes de concentrar oocistos presentes na água, através do mecanismo de

filtração. É comprovado que os oocistos do T. gondii são capazes de esporular na

água do mar e permanecer infecciosos em camundongos (LINDSAY et al., 2001;

LINDSAY et al., 2003; ARKUSH et al., 2003; LINDSAY; DUBEY, 2009).

Objetivando determinar se ostras C. virginica são capazes de remover e

reter oocistos de T. gondii da água do mar, Lindsay et al. (2001) realizaram um

estudo com ostras adquiridas de fontes comerciais, estas foram aclimatadas num

aquário contendo 20 litros de água do mar, e a água foi contaminada

experimentalmente com cerca de 1x106

oocistos esporulados. Para tal

procedimento obter maior êxito, foi retirado o filtro do aquário, visando evitar a

filtração dos oocistos. Após 24h a água contaminada foi removida do aquário e

foi adicionada água do mar fresca, nesse momento, o filtro foi reinserido. Ostras

foram selecionadas no dia um, três e seis após contaminação. Estas foram

lavadas, foram retirados tecidos e a hemolinfa para processamento e alimentação

de camundongos. Estes foram agrupados de 2 a 3, conforme dia e material

utilizado na alimentação: tecido de ostra, homogeneizado de tecido de ostra e

hemolinfa. Após 98 dias cérebros dos camundongos foram avaliados para cistos

teciduais de T. gondii. Após análise pode-se constatar que nenhum dos

camundongos alimentados com tecidos de ostras desenvolveu a toxoplasmose

aguda ou morreram, a infecção foi encontrada em ratos alimentados com tecido

de ostra homogeneizado, porém não identificado naqueles alimentados por

17

hemolinfa. Com esse procedimento os autores demonstraram que

experimentalmente, a espécie de ostra C. virginica é capaz de remover oocistos

de T. gondii do mar e que estes são infectantes em camundongos.

Os mesmos autores em 2004 estudaram sobre a sobrevivência destes

oocistos e se as ostras são eficientes na remoção de oocisto no mar. Para isto

ostras foram colocadas em recipientes com água contaminada com oocistos por

um período de 24h, e analisadas após 85 dias pós-exposição. Cerca de 90%

destas ostras foram consideradas positivas. Posteriormente realizou ensaio

biológico com camundongos, onde foram oferecidos pedaços de ostras positivas

para o protozoário, e observou presença de cistos nestes. Indicando que T. gondii

pode permanecer viável durante meses em ostras e que estas facilmente removem

oocistos da água.

Na Itália, Seraceni et al. (2008), avaliaram a presença de T. gondii em

ostras do gênero Crassostrea e em mariscos do gênero Mytillus, no total de 140

moluscos foram pesquisados, através da técnica de nested- PCR, baseada no gene

B1, porémnão foi detectada a presença do parasita T. gondii em ostras do gênero

Crassostrea no mar Adriático.

Na Lagoa de Varano, no sul da Itália, realizou-se o primeiro estudo para

identificação de T. gondii em ostras de cultivo C. gigas. Nesta pesquisa tecidos

como brânquias, glândulas digestivas e hemolinfa foram utilizados para

identificação do parasita, estes foram submetidos a extração de DNA, nested-

PCR e PCR em tempo real, o qual foi detectado a presença do parasita nas

brânquias (16,6%), sugerindo dessa forma, constatando que caso o molusco

venha a ser consumido cru, acarretará em riscos para a saúde pública,

especialmente a mulheres grávidas e imunocompetentes (PUTIGNANI et al.,

2011).

Toxoplasma gondii foi identificado em 3,3% das ostras C. rhizophorae

pesquisadas sob condições naturais, sendo estas destinadas a comercialização e

consumo no mercado de peixe em Santos, São Paulo, significando uma potencial

forma de transmissão do parasita para o homem e animais marinhos. Nesta

pesquisa realizou-se o ensaio biológico em cacundongos porém não obteve êxito

18

no isolamento do parasita. Este relato comprova que a ostra desta espécie tem

capacidade de filtrar e reter oocisto do parasita, afirmando desta forma que o

ambiente marinho do litoral de São Paulo está contaminado com oocisto do

parasita (ESMERINE et al., 2010).

Embora não tenha sido relatado nenhum surto de protozoonoses associado

à ingestão de mariscos no mundo (LEAL; FRANCO, 2008). A falta de relato

pode ser explicada pela falta de informação da população diante da possibilidade

de ostras serem veiculadoras de zoonoses.

As ostras através de sua característica alimentar podem ser indicadoras de

contaminação do meio aquático (FARIAS, 2008), atuando como indicadores

biológicos de poluição fecal de humanos e animais nos locais onde estes são

cultivados ou coletados para consumo humano (LEAL; FRANCO, 2008).

Cabe ao Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) e a

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) as normatizações e

resoluções relacionadas à sanidade animal, bem como a Defesa Federal de

Aquicultura (DFA). No Brasil, a qualidade sanitária dos moluscos bivalves e das

ostras, encontra-se definida na Resolução n° 357, de 17 de março de 2005

(BRASIL, 2005) e Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA

(Resolução n°12, de 2 de janeiro de 2001) (BRASIL, 2001) a qual trata-se de

padrões microbiológicos para alimentos expostos à venda, e resolução, abordam

o pescado e os produtos derivados da pesca, bem como os limites bacteriológicos

permitidos para sua comercialização, valores limites para os moluscos bivalves,

resfriados ou congelados (BRASIL, 2005). Porém tradicionalmente as ostras são

consumidas cruas, sendo um impasse para o estabelecimento de normas

concretas.

4. MATERIAL E METÓDOS

O procedimento experimental foi realizado no laboratório de Parasitologia

Veterinária e Genética Animal do Hospital Veterinário da Universidade Estadual

de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, BA.

19

4.1 Coleta das Ostras

As amostras de ostras, provenientes deste estudo, foram adquiridas de

duas cidades do litoral sul da Bahia: Ilhéus (Rio Cachoeira), sendo os exemplares

oriundos de bancos naturais do estuário, coletados com o auxílio de um facão nas

raízes do mangue vermelho R.mangle no bairro Teotônio Vilela (Figura 2) e,

Camamu (Baía de Camamu - Porto Campo), as quais, as ostras foram retiradas de

sistema espinhel de cultivo, também conhecido como “longline”, cultivo

suspenso com estruturas chamadas de “lanternas”, construída por andares, os

quais ficam pendurados num cabo suportados por pesos que mantém a estrutura

fixa no fundo, como âncoras (Figura 3).

Figura 2. Estuário de Ilhéus. Fonte: www.scielo.com

20

4.2 Processamentos das Amostras

No mês de abril de 2012 iniciou-se a fase experimental da pesquisa, sendo

reservada a primeira semana para aprendizado e ou aperfeiçoamento da retirada

dos tecidos das ostras e mensurações, no laboratório de Biologia UESC,

orientada pela Dra. Guisla Boehs. Para tanto, foi comprada cerca de trinta ostras,

as quais foram pesadas, medidas e posteriormente retirados as brânquia e

glândula digestiva.

De abril a novembro de 2012 foram realizadas as coletas das ostras,

mensalmente. Um total de 340 exemplares foram coletados por cidade. As

amostras vivas adquiridas foram acondicionadas num saco de linhagem, e

transportadas, no tempo máximo de 4 horas, a temperatura ambiente, para o

Laboratório de Parasitologia Veterinária.

Figura 3. Estuário Camamu. Sistema Espinhel,Cultivo de ostras.Fonte:

http://www.finep.gov.br/imprensa/revista/edicao6/inovacao_em_pauta_6_aqu

icultura.pdf

21

4.2.1 Retirada dos Tecidos

No laboratório, as superfícies externas das ostras, as conchas, foram

lavadas com água destilada, e com o auxílio de escovinhas para retirada total das

sujidades. Depois estas foram postas num recipiente para que seja retirado o

excesso de água e posteriormente ser destinada a mensuração (Figura 4 e 5)

Figura 4. Limpeza das ostras

Os animais foram mensurados quanto ao seu eixo dorso-ventral (altura)

(Figura 6) e pesados, mediante ao uso de paquímetro digital e balança digital,

respectivamente.

Figura 5. Mensuração da altura

22

Após mensuração das ostras, estas foram separadas, aleatoriamente, em

lotes de três animais, as quais foram abertas com o auxílio de uma faca pequena.

As brânquias e glândula digestiva foram removidas, com o auxílio de um pinça e

tesoura cirúrgica (Figura 7). Os tecidos removidos foram pesados e separados em

pools de três animais, sendo posteriormente acondicionados em criotubos e

congelados a – 80º C até o processamento da extração de DNA.

Figura 6. Processamento de retirada dos Tecidos

Na pesquisa foram utilizados 104 pools de ostras de Camamu e 104 pools

de ostras da cidade de Ilhéus, cada pool contendo 3 animais, totalizando 624

ostras.

23

4.2.3Análise molecular

4.2.3.1 Extração de DNA

Após descongelamento das amostras, estas foram maceradas, e separadas

amostras de 0,1g de tecido de brânquia e glândula digestiva, os quais foram

submetidos a quebra da parede do oocisto. Para isso foi adicionado nas amostras

1:1 de esfera de vidro e 400 µl de TE, estas foram homogeneizadas (vortex) por

10 minutos à velocidade máxima. A parte aquosa (sobrenadante) foi transferida

para um microtubo de 2,0 ml. Uma lavagem com 150 µl de TE foi realizada nas

esferas de vidro restantes (parte sólida), novamente homogeneizadas e

centrifugadas, para que retirasse resíduos dos tecidos. O sobrenadante resultante

da lavagem foi transferido e unido ao microtubo de 2,0 ml, acima referido. Logo

após adicionou-se 350 µl da solução A do kit de extração Easy-DNA

(Invitrogen), homogeneizou-se, e iniciou-se os choques térmicos, sendo 5 ciclos

de congelamento no nitrogênio líquido por 15 segundos e descongelamento a

92°C por dois minutos. Em seguida, adicionou-se 5 µl de Proteinase K, e deixou-

os em banho-maria a 65°C por 1h. Após, foram adicionados 150 µl da solução B,

homogeneizado por um minuto e centrifugado por 20 minutos a 4°C. O máximo

de sobrenadante foi retirado e transferido para outro microtubo de 2,0 ml, onde

foi acrescentado 1000 µl de álcool a 100% (-20°C), homogeneizado e incubado a

-20°C por 30 minutos. Depois, as amostras foram centrifugadas a 4°C, por 15

minutos, desprezado o sobrenadante, e adicionado 500 µl de álcool a 80% (-

20°C), invertido por 5 vezes, e submetidos a uma nova centrifugação por 5

minutos a 4°C. Removeu-os resíduo do álcool, centrifugou-os novamente por 3

minutos a 4° C, desprezou-se o resíduo de álcool e deixou secar por 5 minutos,

em temperatura ambiente. As amostras foram suspendidas em 100 µl de TE e 2

µl de RNase e foram armazenadas a -20°C até realização quantificação de DNA

e realização de PCR.

24

4.2.3.2 Quantificação de DNA

Após realização da extração de DNA, realizou-se a quantificação do DNA

de todas as amostras, com o auxílio do Nanodrop (Termo Scientific), quesitos

como concentração de DNA após extração e pureza, foram observados e

analisados. As amostras que foram quantificadas acima de 1000 ng foram

padronizadas para 1000ng/10 µl.

4.2.3.3 Reação em Cadeia de Polimerase – PCR

Para identificação do T. gondii em ostras do litoral sul da Bahia, foram

utilizados dois conjuntos de primers: Toxo-4 e 5 e o Sag1 (Nested).

Primer T4 e T5

O DNA foi investigado pelo método de PCR tradicional, utilizando os

primers T4 (CGCTGCAGGGAGGAAGACGAAAGTTG) e T5

(CGCTGCAGACACAGTGCATCTGGATT) que foram descritos por Homanet

al. (2000), e amplificaram um fragmento de 529pb do DNA de T. gondii

(GenBank No.AFI46527). A PCR foi desenvolvida com 5 µl do DNA extraído e

acrescido de 20 µl de uma mistura de 0,2 mM de cada primer, 0,2mM de dNTP

(Invitrogen), 1x Tris HCl, 2,5mM MgCl2 e 2 U de Taq DNA polimerase

(Invitrogen). A amplificação do DNA do parasita foi realizada em 35 ciclos em

um termociclador (Applied Biosystems) e as condições termociclícas foram: 5

minutos a 94° C para desnaturação em um ciclo único, seguido de 33 ciclos de 1

minuto a 94°C para desnaturação, 1 minuto a 60°C para anelamento e 1 minuto a

72°C para extensão. O ciclo 35 foi realizado com um tempo de extensão de 10

minuto a 72°C. Os produtos da PCR foram submetidos a eletroforese em gel de

agarose a 1%, e corados com sybr green safe DNA (life tecchnologies).

Taquizoítos da cepa RH foram adicionadas a tecido de ostras, realizado a

extração com o Kit Easy DNA (Invitrogen) para ser utilizado como controle

25

positivo, para o controle negativo foi utilizado água ultra pura. Um controle

positivo e um negativo foi incluído em cada teste.

Primer SAG-1

O DNA foi investigado pelo método de PCR-Nested, utilizando o primer

SAG-1 (Primers Primários: F: GTTCTAACCACGCACCCTGAG; R:

AAGAGTGGGAGGCTCTGTGA; Primers Secundários: F:

CAATGTGCACCTGTAGGAAGC; R: GTGGTTCTCCGTCGGTGTGAG), e

amplificam um fragmento de 390pb do DNA de T. gondii. A primeira reação da

PCR foi desenvolvida com 5 µl do DNA extraído e acrescido de 20 µl de uma

mistura de 0,25 mM de cada primer, 0,2mM de dNTP (Invitrogen), 1x Tris HCl,

3,0 mM MgCl2 e 1,25 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen). A amplificação

do DNA do parasita foi realizada em 37 ciclos em um termociclador e as

condições termociclícas foram: 5 minutos a 94° C para desnaturação em um ciclo

único, seguido de 35 ciclos de 1 minuto a 94°C para desnaturação, 1 minuto a

58° C para anelamento e 1 minuto a 72° C para extensão. Os ciclos foram

finalizados a 72° C por 10 minutos. A Segunda Reação da PCR desenvolve-se da

mesma forma da primeira em relação a reagentes e concentração, exceto que na

segunda reação utiliza-se 2 µl do produto da primeira reação da PCR, utilizando

o mesmo ciclo para amplificação da primeira. Os produtos da PCR foram

submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1%, e corados com sybr green safe

DNA (life tecchnologies).

Taquizoítos da cepa RH foram adicionadas a tecido de ostras, realizado a

extração com o Kit Easy DNA (ivitrogen) para ser utilizado como controle

positivo, para o controle negativo foi utilizado água ultra pura. Um controle

positivo e um negativo foi incluído em cada teste para reação primária, e na

secundária foi utilizado dois negativos, um oriundo da primeira amostra e outro

da reação secundária.

26

5. RESULTADO E DISCUSSÃO

A análise molecular das 624 amostras de tecido de ostras do litoral sul da

Bahia (Ilhéus/Camamu), utilizando o método PCR tradicional, baseado nos

primer T4 e T5, foi considerada negativa para DNA de T. gondii (Figura 9).

Na identificação molecular com base no primer SAG-1 e realização de

PCR-Nested, houve a amplificação correspondente ao tamanho esperado de

392pb, sugerindo identificação molecular de T. gondii em amostras de tecidos

tanto de brânquias quanto de glândula digestivas. No total, 17 (8,1%) pools

foram positivos (Figura 10). Na cidade de Ilhéus sete (6,7%) amostras foram

consideradas positivas, sendo quatro (57,1%) pools de tecido de brânquias e três

Figura 7. Eletroforese em gel a 1% da PCR

tradicional.Controle positivo 529pb, na linha 1;

amostras negativas utilizando os primers T4 e T5; e

controle negativo, linha 7.

M 1 2 3 4 5 6 7

27

(42,9%) amostras de glândula digestiva. Na baía de Camamu dez (9,6%)

amostras foram positivas, sendo nove (90%) em brânquias e apenas uma

glândula digestiva. Todas as amostras apresentaram uma boa relação de pureza

(1,80-2,08), o que é um fator positivo para o experimento, uma vez que as

amostras ambientais podem possuir contaminações e seus detritos podem inibir a

PCR, reduzindo a sua sensibilidade, o que não ocorreu no estudo.

M

M 65B 75G 101G 2B 3B 14B 30G

Resultados negativos utilizando a PCR tradicional também já foram

encontrados por Seraceni et al. (2008), os quais pesquisaram a presença de T.

gondii em ostras do gênero Crassostrea do mar Adriático, Itália, baseada no gene

B1. Porém, ao utilizar a nested-PCR para a identificação do parasita foram

observados positividade tanto por Esmerine et al. (2010) (3,3 %) quanto por

Puttagnani et al. (2011) (16,6 %).

A nested-PCR realiza duas etapas de amplificação, primeiro ocorre a

amplificação do segmento genômico de forma abrangente, a qual pode ser

Figura 8. Eletroforese em gel a 1% das amostras positivas com a técnica

nested-PCR. M- marcador. Do 65B a 101 G amostras de Ilhéus, 2B a 30G

amostras Camamu.

392pb

28

copiado até mesmo sequências de DNA que estão fora do local específico. Na

segunda etapa, consiste na utilização do produto da primeira amplificação como

molde, sendo está realizada na sequência alvo, utilizando primers internos aos

empregados na primeira etapa (MOLINA; TOBO, 2004). A vantagem na

utilização desta técnica em relação à tradicional é que ao final das duas etapas

resultará um produto com maior especificidade, pois o DNA molde da segunda

etapa está em altas concentrações e os primers utilizados na segunda etapa, têm

menos chance de se anelarem com seqüências inespecíficas (BORGES, 2012).

Além disso, esta técnica proporciona uma maior quantidade de amostras

positivas a partir de uma mínima quantidade do parasita, devido a sua

especificidade, e sensibilidade, uma vez que aumenta a amplificação da PCR.

No presente estudo foi obtido 8,1% de positividade para T. gondii,

resultado superior ao apresentado pelo único trabalho realizado no Brasil por

Esmerine et al. (2010) com 3,3% de positividade. Diversos fatores podem estar

relacionados a essa maior positividade; o tecido utilizado, neste experimento a

ostra foi dissecada e utilizada apenas às brânquias e glândulas digestivas, locais

mais associados ao encontro de parasitos (ROBERTSON, 2007; LEAL;

FRANCO, 2008), no artigo de Esmerine et al. (2010) toda a ostra foi utilizada, o

que pode piorar a detecção do parasito; O ambiente da região sul da Bahia é

caracterizada pela presença de Mata Atlântica com uma umidade relativa

alta,favorecendo assim a manutenção de oocistos no ambiente por sobrevivem

melhor em ambientes quentes e úmidos (DUBEY; BEATTIE, 1989), com a

presença de diversas espécies de felinos selvagens (MOURA, 2003) e com

grande quantidade de gatos domésticos errantes. O clima do litoral sul da Bahia é

tropical úmido, com índice pluviométrico acima de 60 mm nos meses mais seco,

e anual em torno de 1.400 mm (KLUMPP et al., 2002). O alto índice

pluviométrico, associado à escassez de saneamento básico na região, pode ser um

fator predisponente para a identificação do parasita.

As áreas costeiras brasileiras estão cada vez mais sujeitas aos impactos

decorrente da ação do homem, especialmente devido à grande quantidade de

esgotos domésticos lançados sem tratamento nos mares e rios, o qual apenas 38%

29

dos dejetos, esgotos, produzidos no país recebem tratamento (BRASIL, 2011). O

Nordeste brasileiro é uma das regiões onde a falta de rede coletora de

esgotamento sanitário é mais grave, atingindo algo próximo a 15,3 milhões de

habitantes, com a escassez do serviço sendo maior nos estados da Bahia,

Maranhão e Piauí (BRASIL, 2008). Na Bahia, apenas 46,3% dos domicílios

possui coleta de esgotos adequada (BRASIL, 2011). Segundo Miller et al. (2002)

os bancos de areia e baías, próximas aos centros urbanos são os locais mais

expostos ao T. gondii em decorrência da maior poluição fecal nessas áreas

A detecção de oocistos em amostras ambientais é considerada um desafio

para a ciência, há uma deficiência muito grande em relação às técnicas aplicadas

para identificar o parasita com precisão, e apesar da técnica de nested-PCR ser

bastante sensível para identificar T. gondii, a forma resistente (oocistos) no

ambiente é difícil de detectar, pois possui uma parede extremamente resistente,

fato que pode interferir na extração de DNA.

Segundo Dumetre; Dardé (2003) existem diversas técnicas para quebrar a

parede dos oocistos, tai como: encistamento in vitro, digestão com proteinase K,

trituração com esferas de vidro (beads) e utilização de choques térmicos, porém

não existe um protocolo padrão para temperaturas e número de ciclos de

congelamento/descongelamento. O presente estudo aplicou a utilização de beads,

choques térmicos e adição de proteinase K, assemelhando ao processo utilizado

por Esmerine et al. (2010) exceto na utilização de esfera de vidro. Já Puttignani

et al. (2011) optou por aplicar apenas choques térmicos. Essas diferenças nos

procedimentos de extração de DNA também podem influenciar nos resultados

obtidos pelos diferentes artigos.

As ostras positivas foram identificadas nos meses de abril, agosto e

setembro em Ilhéus e em abril, junho e agosto em Camamu. Isto pode ser

justificado pelo índice pluviométrico mais alto nessa época do ano, com volume

de quase 300mm de chuva em agosto em Ilhéus e índices pluviométricos maiores

que 150mm em abril em Camamu e chegando a 300mm em junho de 2012

(INMET, 2012). Acredita-se que esteja ocorrendo uma contaminação de oocistos

da terra para a costa marinha, decorrente principalmente do escoamento das

30

águas de chuva, a qual acaba carregando dejetos e fezes de felinos contaminados,

o que já foi descrito por Cole et al. (2000) e Conrad et al. (2005). A presente

pesquisa identificou T. gondii a partir de ostras de baías (estuários), estas por sua

vez encontram-se próximo a populações ribeirinhas, onde todos os dejetos

(homem/animais) são lançados no ambiente sem nenhum tratamento.

A maior prevalência de positividade encontrada nas amostras foi

proveniente de tecidos de brânquias (76,5%), semelhante aos trabalhos de

Esmerine et al. (2010) e Puttgnani et al. (2011). Há evidencias que estes tecidos

sejam eletivos para pesquisa do parasita (POTASMAN et al., 2002; ARKUSH et

al., 2003; PUTIGNANI et al., 2011), uma vez que as ostras através do

mecanismo de filtro-alimentação são capazes de ingerir cerca de cinco litros de

água por hora, a qual partículas leves, como os oocistos de T. gondii são retidas

nas brânquias (muco e filamentos) através deste processo (RUPPERT et al.,

1996; ROBERTSON, 2007; LEAL; FRANCO, 2008).

Este é o primeiro estudo a descrever a identificação de DNA de T. gondii

em amostras de tecidos de ostras, oriundas de estuários tanto de cultivo quanto de

extrativismo natural, no Litoral do Nordeste brasileiro.

Segundo Sandes et al. (2010) o rio Cachoeira pertencente ao estuário de

Ilhéus é considerado adequado para o extrativismo de moluscos, sendo este

utilizado para subsistência da população ribeirinha, bem como para fins

lucrativos em alta estação. A baía de Camamu também é considerada boa para

cultivo de ostras, a qual possui baixa intensidade de patógenos (BRANDÃO et

al., 2013). Porém, em pesquisas que estão em curso já identificaram bactérias

como Salmonella, Staphylococcus aureus (dados não publicados).

Os moluscos bivalves refletem as condições em que vivem, sendo

considerados bioindicadores de contaminação ambiental (MILLER, et al., 2002).

Percebe-se que o ambiente estuarino tanto da cidade de Ilhéus, quanto da cidade

de Camamu estão contaminadas por oocistos de T. gondii, uma vez que as ostras

oriundas destes ambientes foram consideradas positivas para o parasita.

Toxoplasma gondii é uma parasita de grande distribuição mundial e, no

Brasil existe uma alta prevalência de infecção pelo parasita em humanos e

31

animais. Os principais relatos de toxoplasmose em brasileiros estão associados ao

consumo de carne crua ou má cozida, e a ingestão de oocistos em alimentos e

água contaminada (DUBEY et al., 2012). DUBEY (2004) sugere que infecções

por oocisto, independente da dose, são clinicamente mais graves em humanos do

que infecções adquiridas por cistos teciduais. No estudo, não permite afirmar se o

parasito está viável, porém é de conhecimento que os oocistos são capazes de

esporular na água marinha e tornam-se infecciosos por um período de seis meses

na água (LINDSAY et al., 2003).

A água pode ser uma importante via de transmissão para a toxoplasmose,

atuando como um disseminador de oocistos para a população e animais que

venham a utilizá-la. Na região, culturalmente, as ostras são ingeridas in natura, e

sabe-se que apenas um oocisto de T. gondii é capaz de gerar a infecção, logo a

população ribeirinha e aqueles que a ingerem através da comercialização estão

correndo risco de adquirir a toxoplasmose.

.

32

6. CONCLUSÕES

Conclui-se que:

As ostras Crassostrea rhizophorae são capazes de filtrar e manter

nos seus tecidos os oocistos de Toxoplasma gondii

As brânquias das ostras é o tecido eletivo para pesquisar a presença

do T. gondii

A nested-PCR é mais sensível do que a PCR tradicional para

identificar oocisto do parasito

Os estuários do litoral sul da Bahia encontram-se contaminado com

os oocistos de T. gondii

33

7. REFERÊNCIAS

AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução – RDC n°

12, de 2 de janeiro de 2001. Regulamento técnico sobre os padrões

microbiológicos para alimentos. Diário Oficial [da] República Federativa do

Brasil, Brasília, DF, 10 jan. 2001. Disponível em:

http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/12-01rdc.htm. Acesso em: 13 de março de

2013.

ARKUSH, K. D.; MILLER, M. A.; LEUTENEGGER, C. M.; GARDNER, I. A.;

PACKHAM, A. E.; HECKEROTH, A. R.; TENTER, A. M.; BARR, B. C.;

CONRAD, P. A. Molecular and bioenssay-base detection of Toxoplasma gondii

oocyst uptake by musses. Journal for Parasitology, p. 1087 – 1097, 2003.

BAHIA-OLIVEIRA, L.M.G.; JONES, J.L.; AZEVEDO-SILVA, J.; ALVES,

C.C.F.; ORÉFICE, F.; ADDISS, D.G. Highly endemic, waterbone

toxoplasmosis in North Rio de Janeiro State Brazilian. Emerging Infectious

Diseases, v.9, n.1, p. 55 – 62, 2003.

BARROS, L.M.O.; THEOPHILO, G.N.D.; COSTA, R.G.; RODRIGUES, D.P.;

VIEIRA, R.H.S. Contaminante fecal da ostra Crassostrea rhizophorae

comercializada na praia do Futuro, Fortaleza-Ceará. Revista Ciência

Agronômica, v. 36, n. 3, p. 285-289, 2005

BENENSON, M.W; TAKAFUJI, E.T; LEMON, S.M; GREENUP, R.L;

SULZER, A.J. Oocyst-transmitted toxoplasmosis associated with ingestion of

contaminated water. New England Journal of Medicine, p. 307:66 - 69, 1982.

BOEHS, G.; VILLALBA, A.; CEUTA, L.O.; LUZ, J.R. Parasites of three

commercially exploited bivalve mollusc species of the estuarine region of the

Cachoeira river (Ilhéus, Bahia, Brazil). Journal of Invertebrate Pathology, v.

103, n. 1, p. 43 – 47, 2010.

BORGES, N. M. F. Técnicas Moleculares para Identificação de Bactérias em

Alimentos. Universidade Federal de Goiás - UFG. Disponível em:

<http://www.slideshare.net/nataliaborges/tcnicas-moleculares>. Acesso em: 10

julho de 2012.

BOWIE, W.R.; KINGS, A.S.; WERKER, D.H.; ISACC-RENTON, J.L.; BELL,

A.; ENG, S.B.; MARION, S.A. Outbreak of toxoplasmosis associated with

municipal drinking water. The BC Toxoplasma Investigation Team. The Lancet.

p. 350:173–177, 1997.

BRANDÃO, R.P.; BOEHS, G.; SABRY, R.C.; CEUTA, L.O.; AGUIAR, M.S.;

QUEIROGA, F.R.; DA SILVA, P.M.S. Perkinsus sp. infecting oyster

34

Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828) on the coast of Bahia, Brazil. Journal

of Invertebrate Pathology, v. 112, n. 01, p. 138 – 141, 2013.

BRASIL. 2001. Resolução da Diretoria Colegiada nº. 12 de 02 de janeiro de

2001. Aprova o Regulamento Técnico sobre padrões microbiológicos para

alimentos. Revoga a Portaria nº 451, de 19 de setembro de 1997. Diário Oficial

da República Federativa do Brasil, Distrito Federal: Poder Executivo, 10 de

janeiro de 2001.

BRASIL. Ministério da Marinha. Manual de Maricultura. Projeto Cabo Frio.

Instituto de Pesquisa da Marinha, Rio de Janeiro. 500, 1983.

BRASIL. Ministério do Planejamento, Orçamento e Gestão. Instituto Brasileiro

de Geografia e Estatística. Síntese de Indicadores 2011. Pesquisa Nacional por

Amostra de Domicílios. Disponível em:

ftp://ftp.ibge.gov.br/Trabalho_e_Rendimento/Pesquisa_Nacional_por_Amostra_

de_Domicilios_anual/2011/tabelas_pdf/sintese_ind_6_3.pdf. Acesso em:

novembro de 2013.

BRESCIANI, K.D.S.; TONIOLLO, G.H.; COSTA, A.J.; SABATINI, G.A.;

MORAES, F.R. Clinical parasitological and obstetric observation in pregnants

bitches with experimental toxoplasmosis. Ciência Rural, v. 31, n. 6, p. 1039 –

1043, 2001.

COLE, R.A.; LINDSAY, D.S.; HOWE, D.K.; RODERICK, C.L.; DUBEY,

J.P.; THOMAS, N.J.; BAETEN, L.A. Biological and molecular characterization

of Toxoplasma gondii strains obtained from Southern sea otters (Enhydra lutris

nereis). The Journal of Parasitology. v. 86, p. 526–530, 2000.

CONRAD, P. A.; MILLER, M. A.; KREUDER, C.; JAMES, E. R.;MAZET, J.;

DABRITZ, H.; JESSUP, D. A.; FRANCES, G; GRIGG, M. E. Transmission of

Toxoplasma: Clues from the study of sea otters as sentinels of Toxoplasma

gondii flow into the marine environment. International Journal for

Parasitology, v. 35, p. 1155 – 1168, 2005.

CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE. Resolução n° 357 de 17 de

março de 2005. Dispõe sobre a qualidade dos corpos de água e diretrizes

ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e

padrões de lançamentos de efluentes e dá outras providências. Diário Oficial

[da] República Federativa do Brasil, Brasília, DF. Disponível em:

http://www.mma.gov.br/conama/res/res05/ res35705.pdf. Acesso em: 10 de

março de 2013.

DUBEY, J.P.; MILLER, N. L.; FRENKEL, J.K. The Toxoplasma gondii oocystt

from cat faeces. Journal of Experimental Medicine. v. 132, n. 4, p. 636 – 662,

1970 a.

35

DUBEY, J.P.; MILLER, N.L.; FRENKEL, J.K. Toxoplasma gondii life cycle in

cats. Journal of the American Veterinary Medical Association, v. 157, p.

1767, 1970b.

DUBEY, J.P.; MILLER, N.L.; FRENKEL, J.K. Characterization of the new fecal

form of Toxoplasma gondii. Journal Parasitology, v. 6, n. 3, p. 447 – 456, 1970

c.

DUBEY, J. P.; RAJENDRAN, C.; FERREIRA, L.R.; MARTINS, J.; KWOK, O.

C. H.; HILL, D. E.; VILENA, I.; ZHOU, C.; JONES, J.L. High prevalence and

genotypes of Toxoplasma gondii isolated from goats, from a retail meat store,

destined for human consumption in the USA, International Journal for

Parasitology, v. 41, p. 827 – 833, 2011.

DUBEY, J. P. Toxoplasmosis – a waterborne zoonosis. Veterinary

Parasitology, v. 126, p. 57 – 72, 2004.

DUBEY, J. P.; GRAHAM, D.H.; DE YOUNG, R. W.; EBERHARD, M. L.;

NACE, E. K.; WON, K.; BISHOP, H.; PUNKOSDY, G.; SREEKUMAR, C.;

VIANNA, M. C. B.; SHEN, S. K.; KNOW, O. C. H.; SUMMERS, J. A.;

DEMARIS, S.; HUMPHREYS, J.G.; LEHMANN, T. Molecular and biologic

characteristics of Toxoplasma gondii isolates from wildlife in the United States.

International Journal for Parasitology, p. 67 – 71, 2004.

DUBEY, J.P.; LAGO, E.G.; GENNARI, S.M.; SU, C.; JONES, J.L.

Toxoplasmosis in humans and animals in Brazil: high prevalence, high burden of

disease, and epidemiology. Parasitology, p. 1 – 50, 2012a.

DUBEY, J. P.; HILL, D. E.; ROZEBOOM, D. W.; RAJENDARAN, C.;

CHOUDHARY, S.; FERRERA, L. R.; KWOK, O. C. H.; SU, C. High

prevalence and genotypes of Toxoplasma gondii isolated from organic pigs in the

northern USA. Veterinary Parasitology, v. 188, p. 14 – 18, 2012b.

DUBEY, J.P.; JONES, J. L. Toxoplasma gondii infection in humans and animals

in the United States, International Journal for Parasitology, v. 38, p. 1257 –

1278, 2008.

DUBEY, J.P.; ZARNKE, R.; THOMAS, N. J.; WONG, S.K.; VAN BONN, W.;

BRIGGS, M.; DAVIS, J.W.; EWING, R.; MENSE, M.; KWOK, O.C.H.;

ROMAND, S.; THULLIEZ, P. Toxoplasma gondii, Neospora caninum,

Sarcocystis neurona, and Sarcocystis canis-like infections in marine mammals.

Veterinary Parasitology, v. 116, p. 275 – 296, 2003.

DUBLEY J. P. Toxoplasmosis of animals and humans. Estados Unidos.

Editora CRC Press, 2° edição, p. 5 – 338, 2010.

36

DUBEY, J.P.; BEATTIE, C. P. Toxoplasmosis of animals and man. Journal

Medicine Microbiology, v. 30, (1989).

DUBLEY, J.P. Toxoplasmosis. Journal of the American Veterinary Medical

Association, v. 205, n. 11, p. 1593 – 1598, 1994.

DUMÈTRE, A.; DARDÉ, M. L. How to detect Toxoplasma gondii oocysts in

environmental samples? Microbiology, v. 27, p. 651 – 661, 2003.

ELDREDGE, L.G. Perspectives in aquatic exotic species management in the

Pacific: Islands Introductions of Commercially Significant Aquatic organisms to

the Pacific Islands. Pacific Science Association, Honolulu, v.1, 41 p., 1994.

ESMERINE, P. O., GENNARI, S. M., PENA, H. F. J., Analysis of marine

bivalve shellfish from the fish market in Santos city, São Paulo state, Brazil, for

Toxoplasma gondii. Veterinary Parasitology, p 1 – 6, 2010.

FARIAS, H. QUALIDADE HIGIÊNICO-SANITÁRIA NA CADEIA

PRODUTIVA DE OSTRAS, Crassosttrea sp., CULTIVADAS NA BAÍA DE

GUARATUBA, PR, BRASIL. Dissertação apresentada ao Curso de Pós –

Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Federal do Paraná, como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias, 94

p., 2008.

FAYER, R.; DUBEY, J.P.; LINDSAY, D.S. Zoonotic protozoa: from land to sea.

Trends Parasitology, v. 20, p. 531 – 536, 2004.

FAYER, R.; TROUT, J.M.; LEWIS, E.J.; SANTIN, M.; ZHOU, L.; LALL,

A.A.; XIAO, L. Contamination of Atlantic coast commercial shellfish with

Cryptosporidium. Parasitology Research. v. 89, p. 141 – 145, 2003.

FIALHO, C.G.; TEIXEIRA, M.C.; ARAÚJO, F.A.C. Toxoplasmose animal no

Brasil. Acta Scientiae Veterinariae. v. 37, p. 1 – 23, 2009.

FLEGR, J. How and why Toxoplasma makes us crazy. Trends in Parasitology,

v. 29, n. 4, p 156 - 163 ,2013.

FRANCO, R.M.D. Protozoários de veiculação hídrica: Relevância em Saúde

Pública. Revista Panam Infectology. v. 9, p. 36 – 43, 2007.

FRENKEL, J.K.; RUIZ, A.; CHINCHILLA, M. Soil survival of Toxoplasma

oocysts in Kansas and Costa Rica. The American Journal of Tropical

Medicine and Hygiene, v. 24, p. 439 – 43, 1975.

FRENKEL, J.K. Toxoplasmosis in human beings. Journal of American

Veterinary Medical Association. v. 196, p. 240 – 248, 1990.

37

GESTEIRA, T.C.; DANTAS NETO, M.P.; SABRY, R.C. Cultivo de Ostras de

Mangue, Crassostrea rhizophorae. Instituto de Ciências do Mar –

LABOMAR. Grupo de Estudos de Moluscos Bivalves – GEMB, 2004.

(Apostila)

KLUMPP, A.; BAUER, B.K.; GERSTEIN, C.F.; MENEZES, M. Variation of

nutrient and metal concentracion in aquatic macrophytes along the Rio Cachoeira

in Bahia (Brazil). Enviroment International, v. 28, n. 3, p.165 – 171, 2002.

LEAL, D. A.; FRANCO, R.M.B. Moluscos Bivalves Destinados ao Consumo

Humano como Vetores de Protozoários Patogênicos: Metodologia de Detecção e

Normas de Controle. Revista Panam Infectology, p. 48 – 57, 2008.

LENZ, T.M.; BOEHS, G. Ciclo reproductivo del ostión de manglar Crassostrea

rhizophorae (Bivalvia: Ostreidade) en la Bahía de Camamu, Bahia, Brasil.

Revista de Biología Tropical, v. 59, n.1, p. 137 – 149, 2011.

LINDSAY, D.; DUBEY, J. P. Long-Term Survival of Toxoplasma gondii

sporulated oocysts in Seawater, The Journal of Parasitology, v. 95, n. 4, 2009.

LINDSAY, D.D.; COLLINS, M.V.; MITCHELL, S.A.; COLLE, R.A.; FLICK,

G.J.; WETCH, C.N.; LINDQUIST, A.; DUBEY, J.P. Sporulation and Survival

of Toxoplasma gondii oocyst in Seawater. The Journal of Eukaryotic

Microbiology, v. 50, n. 6, p.687 – 688, 2003.

LINDSAY, D.S.; PHELPS, K.K.; SMITH, S.A.; FLICK, G.; SUMMER, S.;

DUBLEY, J.P. Removal of Toxoplasma gondii oocysts from sea water by eastern

oysters (Crassostrea virginica). The Journal of Eukaryotic Microbiology. v.

48, p. 197S – 198S, 2001.

LINDSAY, D.S.; COLLINS, M.V.; MITCHELL, S.M.; WETCH, C.N.;

ROSYPAL, A.C.; FLICK, G.J.; ZAJAC, A.M.; LINDQUIST, A.; DUBEY,

J.P. Survival of Toxoplasma gondii oocysts in Eastern oysters (Crassostrea

virginica). Journal Parasitology, v. 90, p1054 – 1057, 2004.

LUCAS, S.R.R.; HAGIWARA, M.K.; LOUREIRO, V.Z.; IKESAKI, J.Y.H.;

BIRGEL, E.H. Toxoplasma gondii infection in brazilian domestic outpatient cats.

Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 41, n. 4, p. 221 –

224, 1999.

MELO, B. Produção de moluscos será rastreada. O Estado de São Paulo, São

Paulo, Caderno Agrícola. p. 3. 2008.

MILLER, M. A.; MILLER, W. A.; CONRAD, P. A.; JAMES, E. R.; MELLI, A.

C.; LEUTENEGGER, C. M.; DABRITZ, H. A.; PACKHAM, A. E.;

38

PARADIES, D.; HARRIS, M.; AMES, J.; JESSUP, D. A.; WORCESTER, K.;

GRIGG, M. E. Type X Toxoplasma gondii in a wild mussel and terrestrial

mammals, runoff and toxoplasmosis of sea otters. International Journal for

Parasitology, p. 10, 2008.

MILLER, M.A.; GARDNER, I.A.; KREUDER, C.; PARADIES, D.;

WORCESTER, K.; JESSUP, D.; DODD, E.; HARRIS, M.; AMES, J.;

PACKHAMA, A.; CONRAD, P.A. Coastal freshwater runoff is a risk factor for

Toxoplasma gondii infection of southern sea otters (Enhydra lutris nereis).

Interanational Journal Parasitology, v. 32, p. 997 – 1006, 2002.

MOLINA, A. L.; TOBO, P. R. Uso das técnicas de biologia molecular para

diagnóstico. Centro de Pesquisa Experimental do Instituto de Ensino e

Pesquisa do Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, p. 139 – 142, 2004.

Disponível em:

<http://www.einstein.br/biblioteca/artigos/Vol2Num2/Serie%20Biologia%20part

e%202.pdf>. Acesso em: 13 de agosto de 2013.

MOURA, L.; BAHIA-OLIVEIRA, L.M.G.; WADA, M. Y.; , JONES, J. L.;

TUBOI, S. H.; CARMO, E. H. Waterborne Toxoplasmosis, Brazil, from field to

gene. Emerging Infectious Diseases, v.12, p. 326 – 329, 2006.

MOURA, R. T. Distribuição e ocorrência de mamíferos na Mata Atlântica do sul

da Bahia In: Prado P.I., Landau E.C., Moura R.T., Pinto L.P.S., Fonseca G.A.B.,

Alger K.N. (orgs.) Corredor de Biodiversidade da Mata Atlântica do Sul da

Bahia. Publicação em CD-ROM, Ilhéus, IESB / CI / CABS / UFMG /

UNICAMP. 2003.

NASCIMENTO, I.A. Crassostrea rhizophorae (Guilding) and C. brasiliana

(Lamarck) in South and America Central. In: Menzel W (ed) Estuarine and

marine bivalve mollusk culture. CRC Press, Boston, p. 125 – 134, 1991.

NASCIMENTO, I.A.; PEREIRA, S.A. Cultivo da ostra de mangue – Crassostrea

rhizophorae. In: POLI, C.R.; POLI, A.T.; ANDREATTA, E.; BELTRAME, E.

Aquicultura: Experiências Brasileiras. Florianópolis: Editora Multitarefa, p.

267 – 288, 2004.

NASCIMETO, I. A.; SMTH, D.H.; KERN, F.; PEREIRA, S.A. Pathological

Findings in Crassostrea rhizophorae from Todos os Santos Bay, Bahia, Brazil,

Journal of Invertebrate Pathology, v. 47, p. 340 – 349, 1986.

NICOLLE, C.; MANCEAUX, L. Sur une infection a` corps de Leishman (ou

organismes voisins) du gondi. Comptes rendus de l'Acadedmie des sciences, v.

147, p. 763 – 766, 1908.

39

POTSMAN I.; PAZ A.; ODEH, M. Infectious Outbreaks Associated with

Bivalve Shellfish Consumption: A Worldwide Perspective. Shellfish-Associated

Infectious Outbreaks, p. 921 – 928, 2002.

PUTTIGNANI, L.; MANCINELLI, L.; CHIERICO, F. D.; MENICHELLA, D.;

ADLERSTEIN, D.; ANGELICI, M. C.; MARANGI, M.; BERRILLI, F.;

CAFFARA, M.; REGALBONO, D. A. F.; GIANASPERO, A. Investigation of

Toxoplasma gondii presence in farmed shellfish by nested-PCR and real-time

PCR fluorescent amplicon generation assay (FLAG). Experimental

Parasitology, v. 127, p. 409 – 417, 2011.

QUAST, M.P. Moluscos Bivalves da Costa Sudeste do Brasil. Dissertação

apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção de título de mestre em

Ecologia. UNICAMP, Campinas, São Paulo, 2003.

RAGOZZO, A. M. A.; PENA, H. F. J.; YAI, L. E. O.; SU, C.; GENNARI, S. M.

Genetic diversity among Toxoplasma gondii isolates of small ruminants from

Brazil: novel genotypes revealed. Veterinary Parasitology, v. 170, p. 307 – 312,

2010.

RIOS, E. C. Seashells of Brazil. 2 ed. Rio Grande. Universidade do Rio Grande,

369p, 1994.

RIOS, E.C. Compendium of Brazilian Sea Shells. Universidade Federal do Rio

Grande. Museu Oceanográfico Prof. Eliézer de Carvalho Rios. Rio Grande:

Editora Evangraf, p. 500 – 501, 2009.

RUPPERT, E. E.; BARNES, R.D. Zoologia dos Invertebrados, 6º edição, 1029p.

São Paulo: Roca1996.

SANDE, D.; MELO, T.A.; OLIVEIRA, G.S.A.; BARRETO, L.; TALBOT, T.;

BOEHS, G.; ANDRIOLI, J.L. Prospecção de moluscos bivalves no estudo da

poluição dos rios Cachoeira e Santana em Ilhéus, Bahia, Brasil / Bivalve

molluscs prospection in pollution study from Cachoeira and Santana rivers in

Ilhéus, Bahia, Brazil. Brazilian Journal Veterinary Research and Animal

Science, v. 47, n. 3, p. 190 – 196, 2010.

SERACINI, S.; MACCHIA, C.; CULTRERAR, R.; RUBINS, S.; CONTINI, C.

Search of toxoplasma gondii in Sh from Adriactic Sea fishell. Toxoplasma

centennial, Búzios. Anais Búzios, p. 110, 2008.

SHUMWAY S; MUSSELS. The musse Mytilus: ecology, physiology, genetics

and culture. Gosling Ed. Amsterdam: Elsevier,:511–42, 1992

SPLENDORE, A. Un nuovo protozoa parassita de’ conigli. Incontrato nelle

lesioni anatomiche d’une malattia che ricorda in molti punti il Kala-azar dell’

40

uomo. Nota preliminare pel. Revista Sociedade Scient de São Paulo, v. 3, p.

109 – 112, 1908.

TAVARES, A. L. C., SCAINI, C. J, MULLER, G., FARIAS, N. A. R., BERNE,

M. I. A. CONTAMINAÇÃO DO SOLO DE PRAÇAS DE CONJUNTOS

HABITACIONAIS POR HELMINTOS E PROTOZOÁRIOS EM PELOTAS,

RIO GRANDE DO SUL, BRASIL. VITTALLE, Rio Grande, V. 20, P 59 – 63,

2008.

TENTER, A.M.; HECKEROTH, A.R.; WEISS, L.M. Toxoplasma gondii: from

animals to humans. International Journal for Parasitology, v. 30, n. 12-13, p.

1217 – 1258, 2000.

VALENÇA, J. F. S. Rio Salgado: agente de agravos à saúde das populações

ribeirinhas. 2003. 109 f. Dissertação (Mestrado em Desenvolvimento Regional e

Meio Ambiente) - Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, 2003.

WILSON, C.B.; REMINGTON, J.S.; STAGNO, S.; REYNOLDS, D.W.

Development of adverse sequelae in children born with subclinical congenital

Toxoplasma infection. Pediatrics, v. 66, p. 767 – 774, 1980.

YILMAZ, S.M.; HOPKINS, S.H. Effects of different conditions on duration of

infectivity of Toxoplasma gondii oocysts. Journal Parasitology, v. 58, p 938–

939, 1972.

TORREY, E. F.; BARTKO, J. J.; LUN, Z. R.; YOLKEN, R.H. Antibodies to

Toxoplasma gondii in Patients With Schizophrenia: A Meta-Analysis.

Schizophrenia Bulletin, v. 33, n. 3, p. 729 – 736, 2007.