1

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

FRANCISCO BERGSON PINHEIRO MOURA

AVALIAÇÃO CRANIOMORFOLÓGICA DO MORCEGO

HEMATÓFAGO Desmodus rotundus NO ESTADO DO CEARÁ

FORTALEZA

2015

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FRANCISCO BERGSON PINHEIRO MOURA

AVALIAÇÃO CRANIOMORFOLÓGICA DO MORCEGO

HEMATÓFAGO Desmodus rotundus NO ESTADO DO CEARÁ

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial para

a obtenção do grau de Mestre em Ciências

Veterinárias.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade

Animal.

Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de

carnívoros, onívoros, herbívoros e aves

Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima da Silva

Teixeira

FORTALEZA

2015

3

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Estadual do Ceará

Sistema de Bibliotecas

Moura, Francisco Bergson Pinheiro.

Avaliação crânio do morcego hematófago Desmodus

rotundus no estado do Ceará [recurso eletrônico] /

Francisco Bergson Pinheiro Moura. – 2015.

1 CD-ROM: il.; 4 ¾ pol.

CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do

trabalho acadêmico com 71 folhas, acondicionado em

caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm).

Dissertação (mestrado acadêmico) – Universidade

Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária,

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias,

Fortaleza, 2015.

Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal.

Orientação: Prof.ª Dra. Maria Fátima da Silva

Teixeira.

1. Morcegos. 2. Crânio. 3. Fenótipo. 4. Linhagem.

5. Dimorfismo sexual. I. Título.

4

5

Aos meus pais, Maria Luisa e João Adolfo, pela

educação e orientação e por serem exemplos de

vida e dedicação, aos meus irmãos, filhos e

netos, pelo apoio e amor dedicado, à Mariza

pela amizade motivadora.

6

AGRADECIMENTOS

No decorrer dos meses de dedicação a esta pesquisa, vários amigos, familiares e instituições,

cada um a seu modo, colaboraram em todas as etapas de seu desenvolvimento. O maior dos

agradecimentos é direcionado a Deus, causa primeira de todas as coisas.

À Universidade Estadual do Ceará, por meio de seu Programa de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias, que me proporcionou a oportunidade para iniciar o presente trabalho.

Ao Laboratório de Virologia da UECE (LABOVIR), por obter muitos amigos e pela

possibilidade de execução deste projeto.

À professora Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira, pela valiosa orientação e imenso apoio

oferecido nas correções, críticas e sugestões na construção desta dissertação durante o

desenvolvimento acadêmico.

A todos professores e professoras do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos repassados

que contribuíram e enriqueceram este trabalho.

À técnica em secretariado, Adriana Maria S. Albuquerque, que no decorrer dos anos do curso

sempre prestou bons serviços, tendo estes, reflexos positivos no nosso estudo.

A todos os demais funcionários que trabalham no Curso de Pós-Graduação em Ciências

Veterinárias, destacando-se João Batista e Elizangela, que sempre zelaram as salas de aulas e o

Laboratório de Virologia, respectivamente, em boas condições.

À amiga Jeane Dias Leandro, pelas importantes contribuições nas análises estatísticas na versão

final desta dissertação.

À coordenadora da 1ª Coordenadoria Regional de Saúde de Fortaleza da Secretaria de Saúde

do Estado do Ceará, Dra. Maria Verônica Sales da Silva, pelo consentimento da minha liberação

no período necessário à realização deste curso de mestrado e pelo importante apoio e

compreensão em conciliar minhas atribuições na referida unidade com minhas atividades de

pesquisa.

Ao supervisor do Núcleo de Controle de Vetores da Secretaria de Saúde do Estado do Ceará,

Dr. Benedito Neilson Rolin, que colaborou ao ceder parte dos materiais permanente e de

consumo, veículos e liberação dos técnicos para realização das atividades de campo.

Aos técnicos do Núcleo de Controle de Vetores, Jorge Bezerra da Silva, Raffael Junior de

Oliveira, Eduardo Emanuel Apolônio, Luiz Gonzaga de Castro, Antônio Cláudio Braga Pereira,

Paulo Henrique da Cruz Café, na execução das capturas dos morcegos, em especial à técnica

Maria Mariza de Lima e Silva, que participou de todas as viagens com dedicação e esforços

imensuráveis em todas as atividades de campo e laboratoriais.

Ao chefe da Divisão de Biologia Médica do Laboratório Central de Saúde Pública do Ceará

(LACEN), José Napoleão Monte da Cruz, e a médica veterinária Izabel Cristina Felix Franco,

pelo apoio dado no tocante ao acondicionamento do material biológico destinado ao futuro

diagnóstico de RT-PCR.

A todos os colegas de turma do curso, pela grande amizade e carinho, ao Sanjay que me ajudou

na primeira viagem em São benedito.

Ao meu grande amigo Dr. Wilson Uieda, que no início do meu curso de pós-graduação me

orientou sobre o uso dos coleópteros Dermestes destinados à limpeza dos crânios.

7

À Dra. Fernanda A. G. Andrade do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do

Pará, pelo envio de exemplares de coleópteros Dermestes no início deste estudo.

A todos os servidores públicos de saúde dos municípios visitados durante a pesquisa, que

dedicaram horas em colaborar nas atividades de campo, destacando-se Jardel, Neidinha, José

Airton Negreiros, Cezário Vieira da Costa Neto, Carlos Eduardo de Medeiros Santana pelo

apoio total e irrestrito nos trabalhos de campo.

Aos meus pais, Maria Luisa Pinheiro Moura e João Adolfo Abreu Moura, por estarem ao meu

lado em todos os momentos desta pesquisa com valioso e irrestrito incentivo, aos meus irmãos,

em especial ao meu irmão, Olavo, pelo estímulo e incentivo de sempre.

A todos os meus filhos e netos, pelo grande carinho e admiração.

A todos os meus amigos pelo incentivo de sempre, em especial ao amigo José Hibbis Farias

Ribeiro por ter cedido sua máquina fotográfica profissional ao substituir a minha durante a

execução dessa pesquisa.

A todos os moradores das localidades onde foram realizadas as pesquisas dos abrigos dos

morcegos hematófagos, pelo excelente acolhimento de toda a equipe de campo.

À vida de todos os animais utilizados neste trabalho que certamente contribuíram para um bem

maior na ciência.

Finalmente, agradeço a todos que, direta ou indiretamente, colaboraram na plena efetivação

desta busca científica.

8

RESUMO

Estudos sobre a morfologia craniana dos morcegos vampiros da espécie Desmodus rotundus

(D. rotundus) correlacionada aos fatores ambientais, bem como fenótipo são escassos na

literatura científica. Este delineamento experimental correlacionou caracteres que descrevem o

crânio nessa espécie com uma base de dados com vinte medidas cranianas associada ao

fenótipo, bem como explorou circunstâncias ecológicas que afetam os caracteres cranianos.

Foram utilizadas abordagens quantitativas morfológicas para averiguar a evolução do crânio do

D. rotundus quanto à existência de linhagem. Para tanto, foram capturados 41 morcegos

vampiros adultos por meio de redes de neblina (mist-nets) em quatro municípios do Estado do

Ceará com diferentes tipos climáticos e unidades fitoecológicas. Os morcegos capturados foram

submetidos à obtenção de dados taxonômicos e coleta de sistema nervoso central nos

Laboratórios de Entomologia Médica situados nas Coordenadorias Regionais de Saúde

pertencentes à Secretaria de Saúde do Estado do Ceará. Após a limpeza dos crânios realizou-se

a análise morfológica de cada exemplar e avaliação com as circunstâncias ecológicas. O projeto

foi avaliado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual do Ceará

(CEUA) sob o número 5660389/2014 e da análise e emissão de pareceres do Sistema de

Autorização e Informação Científica em Biodiversidade (SISBio) pertencente ao Instituto

Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade sob o número 46433. Uma quantidade

suficiente de exemplares foi obtida em cada município trabalhado sem causar prejuízo às

análises através de técnicas substitutivas baseada em modelos matemáticos/estatísticos, onde a

análise estatística através do Programa Epi Info7 não pôde afirmar que o tamanho do crânio do

morcego hematófago D. rotundus varia conforme o tipo climático e unidade fitoecológica onde

está inserido, levantando a hipótese de que a altitude possa influenciar no tamanho do crânio.

Porém, foi observado diferença entre as medidas externas dos machos e fêmeas para o nível de

significância considerado, verificando a existência de dimorfismo sexual. Em todos os

morcegos estudados foi possível realizar a coleta de material do sistema nervoso central

suficiente para servir nos estudos posteriores, com intuito de adquirir o conhecimento da

susceptibilidade e detecção viral da raiva nesta espécie, possibilitando obter a correlação entre

o estudo dos fatores ambientais e diagnóstico da raiva.

Palavras-chave: Morcegos. Crânio. Fenótipo. Linhagem. Dimorfismo sexual.

9

ABSTRACT

Studies on the cranial morphology of Desmodus rotundus vampire bats (D. rotundus) correlated

to environmental factors as well as phenotype are rare in the literature. This experiment

correlated characters, which describe the skull of this species with database of twenty skull

measurements of each evaluated sample associated phenotype and explore ecological

conditions affecting the cranial characters. Morphological quantitative approaches were used

to investigate skull evolution of D. rotundus regarding the existence of lineage. Thus, forty-one

adult vampire bats were captured through mist nets in four Ceará State municipalities with

different climate types and phytoecological units. Captured bats were submitted to obtain

taxonomic data and collection of central nervous system material in Medical Entomology

Laboratories set in Health Regional Coordination of Health Department of Ceará State. The

skulls were then subjected to manual cleaning with tweezers, being held morphological analysis

of each sample, comparing the data obtained from the ecological conditions. The study

underwent by assessment of the Ethics Committee for the Use of Animals of State University

of Ceará (ECUA) number 5660389/2014 and analysis and issuing opinions by the Release and

Scientific Information System Biodiversity (RSISB) belonging to Chico Mendes Institute for

Biodiversity Conservation number 46433. It was used sufficient amount of specimens in each

worked municipality without infringing the analysis through substitute technique based on

mathematical / statistical models, where the statistical analysis through Epi Info7 program could

not say that the skull size of vampire bat D. rotundus varies according to climate type and

phytoecological unit where it operates. It raises the possibility that the altitude can influence

the skull size. However, difference between the means of external measures of males and

females was observed for the considered significance level, verifying the existence of sexual

dimorphism. So, in all bats studied it was possible to collect enough central nervous system

material to serve in later studies, aiming to acquire susceptibility knowledge and viral detection

of rabies in this species, making it possible to obtain correlation between the study of

environmental factors and rabies diagnosis.

Keywords: Bats. Skull. Phenotype. Lineage. Sexual dimorphism.

10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Fotografia do morcego da Ordem Megachiroptera conhecido como raposa

voadora .........................................................................................................................

19

Figura 2 – Fotografias de espécies de morcegos da Ordem Microchiroptera.(A)

Lonchorhina aurita, (B) Trachops cirrhosus. (C) Platyrrhinus recifinus .....................

19

Figura 3 – Fotografias de espécies de morcegos hematófagos. (A) Diphylla ecaudata,

(B) Diaemus youngi e (C) Desmodus rotundus .............................................................

20

Figura 4 – Fotografia do morcego D. rotundus em seu habitat natural .......................... 21

Figura 5 – Vírus da raiva em forma de bala ...................................................................

27

Figura 6 – Patogenia da infecção pelo vírus da raiva...................................................... 30

Figura 7 – Técnica de Imunofluorescência Direta. (A) Positivo, (B) Negativo ............. 33

Figura 8 – Infiltrados perivasculares ou inflamação em torno de um vaso sanguíneo .. 34

Figura 9 – (A) Pequenos nódulos. (B) Vaso sanguíneo sem células inflamatórias

(200x). 1= Glóbulos vermelhos. 2 = Células epiteliais escamosas ................................

35

Figura 10 – Neurônio sem Corpúsculo de Negri. (B) Corpúsculo de Negri no neurônio

infectado .......................................................................................................................

35

Figure 1 - State location of Ceará in Brazil ……………………………………………

55

Figure 2 - Climate Types of Ceará State ……………………………………………... 55

Figure 3 - Phytoecological Units of Ceará ……………………………………………. 56

Figure 4 - Sample points geo-referenced in the study in Ceará State municipalities…. 56

Figure 5 - Side, ventral, frontal and occipital views of D. rotundus skull with

measurements indicated ………………………………………………………………

57

Figure 6 – Photograph of phenotypic characters: (A) Mandibular earrings. (B)

Submandibular structure ...……………………………………………..……………..

57

11

LISTA DE TABELAS

Table 1. Climate types, phytoecological units, and other characteristics of Desmodus

rotundus shelters in researched Ceará municipalities, 2015 …………………………..

46

Table 2. Capture effort done in each type of habitat sampled (h.m²) during the entire

period of study in Ceará State, Cv = cave, Mn = disabled mine ………………………

47

Table 3. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

skull measurements and municipalities, Ceará, 2015 ……………………………….

48

Table 4. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

sex and total body length (Bl), Ceará, 2015 ………………………………………….

52

Table 5. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

sex and foot length (Fl), Ceará, 2015 …………………………………………….……

52

Table 6. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

sex and forearm length (Fl), Ceará, 2015 ……………………………………………

52

Table 7. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

sex and ear height (Eh), Ceará, 2015 …………………………………………………

53

Table 8. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

sex and uropatagium width (Uw), Ceará, 2015 ………………………………………

53

Table 9. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

phenotypic characters, climate type and phytoecological unit, Ceará, 2015 …………

53

12

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Classificação do Gênero Lyssavirus ........................................................... 28

13

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABLV – Australian Bat Lyssavirus

ADN – Ácido Desoxirribonucléico

ARN – Ácido Ribonucléico

AMC – (Minimum Alveolar Concentration) Concentração Alveolar Mínima

ANOVA – Análise de Variância

CDC – Centers for Disease Control and Prevention

CEUA - Comitê de Ética para o Uso de Animais

CRES – Coordenadorias Regionais de Saúde

CV – Cave (Caverna)

D. rotundus – Desmodus rotundus

DUVV – Vírus Duvenhage

EBLU – European Bat Lyssavirus

ECUA - Ethics Committee for the Use of Animals

G – Glicoproteína

h.m² - Altura por metro quadrado

IPECE – Instituto de Pesquisa e Estratégia Econômica do Ceará

LBV - Vírus Lagos Bat

MN – (Disable mine) Mina desativada

MOKV – Vírus Mokola

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

RABV – Rabies vírus

RSISB - Release and Scientific Information System Biodiversity

RT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa

RT – Transcriptase Reversa

SESA – Secretaria de Saúde do Estado do Ceará

SISBio – Sistema de Autorização e Informação Científica em Biodiversidade

SNC –Sistema Nervoso Central

TID – Teste de Imunofluorescência Direta

14

APENDICE

APÊNDICE A - Saco de tecido de algodão numerado utilizado nas atividades de campo

para acondicionar morcego hematófago D. rotundus capturado ....................................

71

APÊNDICE B - Câmara adequadamente projetada para realização da eutanásia .........

71

APÊNDICE C - Ficha utilizada para obtenção das medidas cranianas, medidas externas

e dados inerentes aos abrigos dos morcegos hematófagos Desmodus rotundus nos

municípios trabalhados na pesquisa ................................................................................

71

APÊNDICE D - Ficha para obtenção de dados complementares da captura inerentes às

fases lunares ....................................................................................................................

72

APÊNDICE E - Ficha contendo outras espécies de morcegos capturados e soltos que

coabitam com D. rotundus nas atividades de campo .....................................................

72

APÊNDICE F - Ficha sobre as espécies agredidas por D. rotundus nos municípios

trabalhados na pesquisa no Ceará ..................................................................................

72

15

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 17

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 18

2.1 OS MORCEGOS...................................................................................................... 20

2.2 OS MORCEGOS HEMATÓFAGOS....................................................................... 19

2.3 O MORCEGO VAMPIRO Desmodus rotundus..................................................... 20

2.4 MORFOMETRIA CRANIANA .............................................................................. 22

2.5 ESPÉCIE E LINHAGEM......................................................................................... 23

2.6 TIPOS CLIMÁTICOS .............................................................................................. 23

2.7 UNIDADES FITOECOLÓGICAS .......................................................................... 24

2.8 A IMPORTÂNCIA DA RAIVA NO CONTEXTO DA MORFOLOGIA DO

TRANSMISSOR D. ROTUNDUS.................................................................................

26

2.8.1 Raiva .................................................................................................................... 26

2.8.2 Agente Etiológico ................................................................................................ 26

2.8.3 Epidemiologia ..................................................................................................... 28

2.8.4 Transmissão ........................................................................................................ 29

2.8.5 Patogenia ............................................................................................................. 29

2.9 MÉTODOS EFICIENTES DE DIAGNÓSTICOS ATUAIS PARA A RAIVA...... 31

2.9.1 Teste de Imunofluorescência Direta (TID) ...................................................... 32

2.9.2 Prova para isolamento do vírus rábico em camundongo (prova biológica).. 33

2.9.3 Exame Histopatológico ...................................................................................... 34

2.9.4 Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT-PCR) ...... 35

3 JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 37

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA ...................................................................................... 38

5 OBJETIVOS ............................................................................................................ 39

16

5.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 39

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 39

6 CAPÍTULO 1 ............................................................................................................ 40

7 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 58

8 PERSPECTIVAS ..................................................................................................... 59

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 60

10 APENDICE ............................................................................................................. 71

17

1 INTRODUÇÃO

Os organismos são constituídos por um arranjo complexo de estruturas anatômicas e

partes individualizadas que mantêm associações funcionais ao longo do desenvolvimento

(HALLGRÍMSSON et al., 2009). No início do século XIX, o anatomista francês George

Curvier enfatizou o “princípio da correlação das partes”, com intuito de dar a ideia de que as

partes dos organismos são coordenadas para formar um todo funcional (MAYR, 1982). Na

década de 50, cinco pesquisadores apresentaram métodos de correlação entre morfologia e

função. Everett Olson (1951) e Robert Miller (1958) apresentaram métodos quantitativos

baseados em correlação, para identificar empiricamente grupos de caracteres fenotípicos que

são mais fortemente integrados, com base em fatores compartilhados de desenvolvimento e

função. Os botânicos Jean Clausen e William Hiesey (1960) exploraram em um longo programa

de pesquisa as correlações de caracteres complexos em híbridos intraespecíficos de raças

ecológicas. Raisa Berg (1960) investigou os diferentes graus de integração entre conjuntos

específicos de caracteres, segundo as circunstâncias ecológicas, gerando hipóteses que são

usadas para orientar a pesquisa empírica (ARMBRUSTER et al., 1999) na detecção de módulos

ou modelos de correlação (BERG, 1960).

Em morcegos hematófagos Desmodus rotundus, praticamente não existem estudos

acerca das correlações das partes; compreendendo caracteres cranianos, características

fenotípicas e circunstâncias ecológicas que envolvem tipos climáticos e unidades

fitoecológicas. O crânio, objeto do presente estudo, pode ser um modelo imprescindível para

conduzir o estudo de integração morfológica (devido à complexidade do crescimento dos ossos)

com outras variáveis (caracteres fenotípicos e circunstâncias ecológicas), configurando talvez

uma coesão de seleção natural e evolução com susceptibilidade de infecção com os vírus da

raiva.

Como parte da análise morfológica quantitativa, os caracteres fenotípicos [brincos

mandibulares, estrutura submandibular e membrana femoral (uropatágio)] podem ser

considerados ferramentas mensuráveis obtidos a partir de dados coletados, permitindo

que mudanças evolutivas possam ser quantificadas e monitoradas, denotando aplicabilidade no

estudo, além de poder avaliar uma covariância nos caracteres morfológicos que podem

apresentar uma correlação entre morfologia e função, variando conjuntamente até certo ponto,

mapeados em alguns municípios do Estado do Ceará sobre os aspectos ambientais (climáticos

e fitoecológicos) diferenciados.

18

Dessa forma, com esta avaliação, pretendem-se analisar divergências

craniomorfológicas e futuramente correlacionar com a detecção de vírus da raiva na espécie de

morcego hematófago D. rotundus ao longo de sua distribuição no Estado do Ceará.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 OS MORCEGOS

Os morcegos pertencem à ordem Chiroptera, palavra derivada do grego cheir (mão) e

pteron (asa), uma das maiores da classe Mammalia, com 18 famílias, 202 gêneros e 1.120

espécies (SIMMONS, 2005). Este diversificado grupo de mamíferos representa

aproximadamente 22% das espécies conhecidas de mamíferos, perfazendo 5.416 espécies

(WILSON; REEDER, 2005).

A ordem Chiroptera é subdividida em Megachiroptera e Microchiroptera

(PETTIGREW, 1986). Os Megachiroptera são representados por cento e cinquenta espécies

(FENTON, 1992) e os Microchiroptera compostos por dezessete famílias e novecentos e trinta

espécies (SIMMONS, 2005).

A ordem Megachiroptera não ocorre no Brasil e está representada pela família

Pteropodidae distribuída pelo Velho Mundo, na região tropical da África, sudeste da Ásia, Índia

e Austrália (FENTON, 1992). Seus representantes possuem faces similares com as raposas

(Figura 1), sendo conhecidos popularmente como raposas-voadoras, atingindo

aproximadamente 1,5Kg e 1,7m de envergadura. As orelhas são pequenas e desprovidas de

tragus (apêndice membranoso na base auricular) sem ornamentações faciais (com exceção de

apenas uma espécie nesta família), pois não apresentam ecolocalização. São desprovidos de

cauda e uropatágio (membrana femoral) e quando estão empoleirados, a cabeça fica virada para

a região ventral (TADDEI, 1976).

19

Figura 1. Fotografia do morcego da Ordem Megachiroptera conhecido como raposa voadora.

Fonte: journeytothejungle.com.

Os morcegos da ordem Microchiroptera (Figura 2) não ocorrem nas regiões polares

(SIMMONS, 2005) e no mundo existem 17 famílias e 930 espécies. No Brasil ocorrem 9

famílias, 64 gêneros e 167 espécies (REIS et al., 2006; TAVARES et al., 2007). Esta ordem

está representada pelas famílias, com suas respectivas espécies: Phyllostomidae (90);

Mormoopidae (4); Noctilionidae (2); Emballonuridae (15); Furipteridae (1); Thyropteridae (4);

Natalidae (1); Mollosidae (26) e Vespetilionidae (24) (PERACCHI et al., 2006). No Brasil esta

ordem habita no Cerrado, na Mata Atlântica, no Pantanal, no árido do Nordeste, nos pampas

gaúchos, na Amazônia e nas áreas urbanas.

Figura 2. Fotografias de espécies de morcegos da Ordem Microchiroptera. (A) Lonchorhina

aurita, (B) Trachops cirrhosus. (C) Platyrrhinus recifinus. Fonte: Bergson 2014.

No Brasil, o que é agravado pelo aumento da população desses morcegos é o fato de

que eles compartilham os abrigos onde vive a espécie D. rotundus (SODRÉ, 2010; CUNHA,

2005).

2.2 OS MORCEGOS HEMATÓFAGOS

Os morcegos hematófagos pertencem à ordem Chiroptera, família Phyllostomidae,

subfamília Desmodontinae e inclui três espécies hematófagas (Figura 3), monotípicas e

simpátricas: Desmodus rotundus, conhecido como “morcego vampiro comum” que se alimenta

do sangue de mamíferos e aves; Diphylla ecaudata, o vampiro de pernas cabeludas e Diaemus

youngi, ambos se alimentam do sangue das aves (BRASS, 1994). Essas três espécies

apresentam apêndice nasal rudimentar, de estrutura discoide em forma de ferradura ou como

A B C

20

protuberância. A membrana femoral (uropatágio) é reduzida e não possuem cauda. As pernas,

antebraços e polegares são longos, sendo esses últimos espessados e usados como pés para

andar, saltar ou escalar de forma quadrúpede (ALTENBACH, 1979; GREENHALL et al.,

1983). Igualmente aos outros morcegos, os hematófagos também emitem sinais de

ecolocalização para a orientação espacial, contudo, suas audições são adaptadas melhores para

baixas frequências, entre 100 Hz e 10 kHz (SCHMIDT et al. 1991).

Figura 3. Espécies de morcegos hematófagos. (A) Diphylla ecaudata, (B) Diaemus youngi e

(C) Desmodus rotundus. Fonte: museudezoologia.ufv.br

2.3 O MORCEGO VAMPIRO Desmodus rotundus

A espécie microquiroptera Desmodus rotundus (Figura 4), é o morcego hematófago

mais comum com ampla distribuição, ocorrendo desde o norte do México até o Chile central

no oeste e no leste toda a extensão do litoral uruguaio, incluindo a bacia amazônica, o Paraguai

e o norte da Argentina (KOOPMAN, 1988; EMMONS, 1990). Como membro da subfamília

Desmodontinae, o D. rotundus é desprovido de cauda e apresenta redução da folha nasal e da

dentição, com incisivos e caninos extremamente afiados (GREENHALL, 1988).

Diferentemente da maioria dos morcegos que apresentam pequenos incisivos superiores e

grandes caninos, o vampiro tem grandes incisivos superiores e grandes caninos superiores que

aparecem em forma de V (triangular) quando são vistos de frente ou de perfil que permitem

esta espécie cortar a pele da sua vítima de tal maneira que algum vaso sanguíneo seja alcançado

e possa, assim, alimentar-se de sangue. Os dentes laterais são muito pequenos e em número

reduzido (GREENHALL, 1972).

A pelagem é bastante macia, em geral de coloração cinza brilhante, mas pode apresentar

também tons avermelhados, dourados ou mesmo alaranjados (BERNARD, 2005), envergadura

aproximadamente de 35cm e peso variando entre 25 e 40g (GREENHALL et al. 1983), podendo

ser considerado de médio porte, comparado às outras espécies desses animais que ocorrem no

Brasil.

A B C

21

Figura 4. Fotografia do morcego D. rotundus em seu habitat natural. Fonte: Bergson 2009.

Vivem em colônias onde um harem pode variar de <10 a 300 membros (GOMES;

UIEDA, 2004); entretanto já foram registradas aglomerações com até 2000 indivíduos

(WILKINSON, 1988), permanecendo estáveis em sua composição por longos períodos e seus

indivíduos são capazes de se reconhecer (SCHMIDT, 1978). Mamífero gregário, D. rotundus

apresenta estrutura social caracterizada por hierarquia de dominância, onde um macho

dominante toma conta de um grupo de fêmeas, localizando-se no alto do abrigo, enquanto os

outros machos ficam em localizações periféricas na colônia. O macho dominante não só possui

maior acesso às fêmeas como também se alimenta em localidades mais próximas do abrigo

(WILKINSON, 1988). Estudos têm revelado a existência de dimorfismo sexual e ocorrência de

maior número de fêmeas (ALENCAR et al. 1994; NUÑEZ; VIANNA, 1997; GOMES; UIEDA,

2004).

A gestação nesta espécie tem a duração de sete meses, com o nascimento de um filhote

por vez, ocasionalmente podendo ocorrer gêmeos. Contudo, o nascimento da maioria dos

filhotes parece se concentrar na estação mais quente e chuvosa (GOMES; UIEDA, 2004),

diferentemente do que acontece no nordeste brasileiro quando o início da reprodução se inicia

após o inverno (PICCININI, 1972). Durante o segundo mês de vida o filhote já recebe alimento

regurgitado pela mãe e a acompanha até os quatro meses, tornando-se independente aos cinco

meses (LORD, 1992; TURNER, 1975). Esta espécie não tolera climas frios, não ocorrendo em

locais que possuam temperatura média inferior a 10⁰C no mês mais frio do ano (GREENHALL

et al., 1983), podendo habitar em áreas florestadas assim como regiões desérticas, abrigando-

se em ocos de árvore, cavernas, bueiros, minas abandonadas e mesmo construções civis

(BREDT et al., 1996).

A fidelidade ao abrigo desta espécie é confusa, pois não se sabe ao certo como se

formam novas colônias. Segundo Wilkinson (1984, 1985) os grupos de fêmeas vivem e

forrageiam juntas durante anos na mesma localidade. Por outro lado, o mesmo autor afirma que

apesar de todas as fêmeas permanecerem no grupo onde nasceram após atingirem a idade

22

adulta, há dispersão das mesmas e em média uma fêmea não-aparentada une-se a um grupo

distinto daquele em que nasceu a cada dois anos. Os machos possuem padrão de dispersão

muito mais indubitável, todos os machos juvenis entre 12 e 18 meses de idade deixam o abrigo

onde nasceram, expulsos pelos machos residentes ou não, e procuram um novo abrigo sempre

a uma distância mínima de 3Km de onde nasceram (WILKINSON, 1985). Machos periféricos

percorrem grandes distâncias para alimentar-se, sobrepondo sua área de forrageamento com as

de outras colônias e nunca compartilhando território com outros machos da mesma colônia (não

há sobreposição de território entre as fêmeas de diferentes abrigos). Wilkinson (1988) acredita

que esse comportamento dos machos periféricos reflete uma busca por fêmeas disponíveis em

outros abrigos enquanto o macho residente foi se alimentar, ou por um abrigo onde tenha maior

chance de copular. A espécie D. rotundus não é migratória, mas troca de abrigos dentro de sua

área de ação (de 10 a 20 Km²). Utiliza rotas estabelecidas em suas atividades noturnas, as quais

podem ser influenciadas pela claridade da lua, quando evita voar (ALENCAR et al., 1994;

FLORES-CRESPO, 2001).

De acordo com Altringham (1996), D. rotundus prefere o sangue de mamíferos de

grande porte. A introdução de animais domésticos como cavalos, bovinos e suínos têm

aumentado o número de indivíduos dessa espécie nos últimos 300 anos. Surtos de raiva humana

transmitida por esta espécie de morcego têm sido descritos no Norte e Nordeste do Brasil,

predominantemente em comunidades rurais distantes de atendimento médico, sem

abastecimento de energia elétrica, sendo as vítimas residentes de moradias precárias, muitas

das quais trabalhando em garimpos clandestinos (DA ROSA et al., 2006; MENDES et al.,

2009). No que se refere à raiva bovina, durante o ano de 2012 foram notificados oficialmente

no Brasil 1435 casos, contabilizando-se somente aqueles diagnosticados em laboratórios

oficiais e credenciados (MAPA, 2013).

2.4 MORFOMETRIA CRANIANA

Métodos de morfometria têm sido amplamente utilizados para responder questões

referentes à integração morfológica, onde a variação de características entre indivíduos também

reflete outros fatores (HALLGRIMSSON et.al, 2009; KLINGENBERG, 2003; MONTEIRO,

2005; SANTANA; LOFGREN, 2013; ZELDITCH; WOOD, 2008).

A combinação de técnicas de morfometria e métodos comparativos tem sido usada para

avaliar os processos evolutivos que estiverem por trás da diversificação do fenótipo, por

exemplo tamanho e forma da mandíbula (MONTEIRO; NOGUEIRA, 2011), podendo servir

23

como ótima ferramenta para avaliar a craniomorfologia da espécie D. rorundus proposta neste

estudo.

Além disso, hipóteses ecológicas e fatores de desenvolvimento já foram contrastados

através de investigação sobre a integração morfológica em crânios e mandíbulas de morcegos

filostomídeos (NOGUEIRA et.al, 2009).

Dados sobre dieta, morfologia do crânio e desempenho da mordida foram relacionados

com as taxas de diversificação ao longo da história evolutiva da família ecologicamente

diversificada de mamíferos da ordem Chiroptera, família Phyllostomidae, onde os resultados

mostraram que um novo fenótipo craniano desempenhou um papel importante na evolução,

aumentando a especiação dentro da família dos filostomídeos (DUMONT et. al., 2012).

Embora este estudo esteja adotando o protocolo segundo Vizzoto e Taddei (1973) na

morfometria, o diâmetro do forâmen magno está sendo incluído como uma ferramenta que

poderá investigar sobre a postura do D. rotundus, que segundo Baer e Nanda (1976) a estrutura

óssea chamada de plano do forâmen magno representa o limite entre o occipital e o eixo cervical

que influencia a postura da cabeça e reflete o grau de flexibilidade no eixo crânio-cervical.

2.5 ESPÉCIE E LINHAGEM

O conceito da palavra espécie é de fundamental importância nos estudos sobre a

evolução quando é proposto averiguar a possibilidade de um determinado táxon possuir mais

de uma espécie. Isto ocorre devido ao fato de que as espécies são vistas como a entidade

essencial do processo evolutivo (WILEY, 1978).

No universo de conceitos sobre a palavra espécie, todos possuem seus méritos e suas

falhas ao se verificar divergências sobre alguns pontos relacionados com morfologia, genética,

biologia dentre outros, contrariando a teoria de que um conceito de espécie adequado deve ser

geral, aplicável e consistente teoricamente (HULL, 1997).

Uma vez que este trabalho se propõe avaliar o critério de divergências das características

externas e craniomorfológicas na espécie D. rotundus, será utilizado o conceito puramente

nominalista de linhagem como sendo estirpe ou descendência, causando uma forte correlação

entre morfologia e genética.

2.6 TIPOS CLIMÁTICOS

Os cinco tipos climáticos existentes no Estado do Ceará têm na maioria o clima tropical

quente representado por Tropical Quente Úmido, Tropical Quente Sub-úmido, Tropical Quente

Semiárido, Tropical Quente Semiárido Brando e Tropical Subquente Sub-úmido.

24

O clima Tropical Quente Úmido é caracterizado por ter a temperatura média maior que

22°C e pluviosidade superior a 1350mm ao ano, enquanto o clima Tropical Quente Sub-úmido

a temperatura é superior a 24°C com pluviosidade em torno de 1000 e 1350mm ao ano. O clima

Tropical Quente Semiárido já apresenta a temperatura média superior a 24°C com pluviosidade

menor que 850mm anuais e o Semiárido Brando possui uma variação de temperatura que vai

de 24°C até mais que 26°C com pluviosidade entre 850 e 1000mm ao ano. O clima Tropical

Subquente Sub-úmido possui a temperatura média menor de todos os outros climas, sendo

inferior a 22°C com pluviosidade maior que todas as anteriores, sendo superior a 1350mm ao

ano (IPLANCE, 1995).

2.7 UNIDADES FITOECOLÓGICAS

A cobertura vegetal do Estado do Ceará pode ser dividida em onze tipos de vegetação:

Complexo Vegetacional da Zona Litorânea; Floresta Subperenifólia Tropical Plúvio-Nebular

(Mata úmida); Floresta Subcaducifólia Tropical Pluvial (Mata seca); Floresta Caducifólia

Espinhosa (Caatinga arbórea); Caatinga Arbustiva Densa; Caatinga Arbustiva Aberta;

Carrasco; Floresta Perenifólia Paludosa Marítima; Floresta Mista Dicótilo-Palmácea (Mata

ciliar com carnaúba e dicotiledôneas); Floresta Subcaducifólia Tropical Xeromorfa (Cerradão)

e Cerrado. Vale salientar que o tipo de vegetação de maior ocorrência no Estado é a Caatinga,

ocupando cerca de 46% do território cearense.

O Complexo Vegetacional da Zona Litorânea é constituído por três tipos de vegetações:

a vegetação pioneira que está localizada na planície litorânea e muitas vezes nas dunas, servindo

como fixadora; a floresta à retaguarda das dunas que apresenta uma característica peculiar, pois

a duna além de ser um bom aquífero proporciona a proteção contra a abrasão eólica e a

vegetação dos tabuleiros litorâneos que encontra-se sobre os compartimentos geomorfológicos

de tabuleiros, mostrando-se, a priori, uma certa homogeneidade fisionômica e florística, mas

que na prática há uma certa diversificação vegetacional e florística notável. A Floresta

Subperenifólia Tropical Plúvio-Nebular (Mata Úmida) localiza-se sobre os setores mais

elevados das serras no Norte do Planalto da Ibiapaba e da Chapada do Araripe. A altitude e

exposição aos ventos úmidos são os principais determinantes da ocorrência dessa floresta,

considerando-se ainda a importância da água subterrânea cuja ressurgência nas encostas da

Chapada do Araripe contribui para a permanência da vegetação florestal. As árvores possuem

caules retilíneos, espessos, cobertos, muitas vezes, com liquens, orquídeas, samambaias e

bromeliáceas que alcançam 30 metros.

25

A Floresta Subcaducifólia Tropical Pluvial (Mata Seca) recobre relevos mais baixos,

chamados de serrotes menos favorecidos pelas chuvas. Neste tipo de unidade fitoecológica

encontram-se indivíduos da mata úmida e da caatinga arbórea cuja faixa de amplitude ecológica

permite viver neste ambiente.

A caatinga, termo indígena consagrado na literatura e no meio popular para designar a

vegetação xerófila que ocorre no domínio semiárido, apresenta-se com várias fisionomias.

Árvores altas, chegando a 20 metros, caules retilíneos e um sub-bosque constituído por árvores

menores, levaram à denominação dessa comunidade de Caatinga Arbórea que, de acordo com

a densidade maior ou menor da vegetação pode se denominar de Caatinga Arbórea Densa e

Caatinga Arbórea Aberta.

A degradação da Caatinga Arbórea determina o aparecimento da Caatinga Arbustiva

que é caracterizada por ter o porte mais baixo e os caules retorcidos e esbranquiçados e que,

também, de acordo coma densidade maior ou menor da vegetação pode se denominar de

Caatinga Arbustiva Densa e Caatinga Arbustiva Aberta.

O Carrasco possui uma vegetação xerófila com características bem peculiares. Esta

unidade fitoecológica está situada no Planalto da Ibiapaba e sul da Chapada do Araripe,

limitando-se desde o norte do Estado do Piauí até o sul Pernambucano. É uma comunidade

arbustiva densa com indivíduos de caules finos e muitas vezes cespitosos (que da mesma raiz,

lança vários troncos em forma de maranha) e alguns arbóreos. Na composição da flora estão

presentes espécies da caatinga, de cerrado e de mata.

A Floresta Perenifólia Paludosa Marítima conhecida popularmente como manguezal, é

periodicamente inundada duas vezes ao dia pela mistura da água salgada do mar com a água

doce do rio (salobra) que provoca a floculação das partículas de argila e matéria orgânica que

sedimentam sobre as margens inundadas, não permitindo o crescimento da maioria das plantas.

Restrito às regiões tropicais, o manguezal revela profundo poder de adaptação às duras

condições, essencialmente adversas, nas quais tem se estabelecido. Além da importância

econômica pelo teor em tanino existente nas plantas de mangue, o ambiente favorece a alta

proliferação de crustáceos.

No baixo curso dos rios, já com pouca declividade, os processos de sedimentação se

sobrepõem aos de erosão, formando as planícies aluviais com solos, muitas vezes, halomórficos

de drenagem imperfeita em zona semiárida, favorecidas pela composição química das rochas

trabalhadas por cursos d’água. Nas planícies aluviais encontra-se o habitat de preferência da

carnaúba (Copernicia prunifera), dominante entre as espécies arbustivas e trepadeiras,

constituindo a Floresta Mista Dicótilo-Palmácea.

26

Sobre a Chapada do Araripe, no nível entre 800 e 900m, com solos arenosos e distróficos

e precipitação pluvial em torno de 1.000mm, desenvolve-se a Floresta Subcaducifólia Tropical

Xeromorfa (Cerradão), cujas características estruturais externas das espécies vegetais possuem

cascas suberosas, folhas largas, brilhantes e persistentes, mas, principalmente, a composição

florística desta unidade fitoecológica leva a incluí-la como um tipo de cerrado. Devido à

densidade maior e ao porte de suas espécies vegetais têm particularizado a denominação

cerradão.

Em manchas esparsas tem sido registrada, para o Ceará, ocorrência de vegetação de

cerrado ilhada e invadida pela caatinga, atestando o saldo florístico de uma antiga cobertura

vegetal que ao longo do tempo sofreu modificações na dependência das alterações climáticas e

consequentemente pedológicas (IPLANCE, 1995).

2.8 A IMPORTÂNCIA DA RAIVA NO CONTEXTO DA MORFOLOGIA DO

TRANSMISSOR D. rotundus

2.8.1 Raiva

A raiva é uma doença viral do sistema nervoso central (cérebro e medula espinal) de animais

de sangue quente. A transmissão na natureza é a partir de animais infectados para os seres

humanos, cuja classificação é como doença zoonótica. A doença é quase sempre fatal em

animais ou em seres humanos que não recebem tratamento profilático pós-exposição e

apresenta três distintos estágios clínicos: prodrômico, furioso, e paralítico. Os animais

geralmente morrem alguns dias após o início da raiva. As descrições clínicas da doença podem

ser enganosas, considerando a variação existente entre as espécies e indivíduos infectados numa

mesma população. Os animais infectados podem não exibir todas as fases ou podem oscilar

entre os estágios clínicos; no entanto, o comportamento anormal é o sinal clínico mais

consistente da raiva em qualquer animal (THORNE, E.T.; MCLEAN, R.G., 1982;

RUPPRECHT et al., 2001).

2.8.2 Agente Etiológico

Os lyssavírus são um grupo diverso de vírus capazes de causar a raiva, que é uma doença

encefálica invariavelmente fatal em humanos e animais (ASHLEY et.al, 2013).

Os vírus da raiva apresentam dois antígenos principais: um de superfície, constituído por uma

glicoproteína (G), responsável pela formação de anticorpos neutralizantes e adsorção vírus-

célula, e outro interno, constituído por uma nucleoproteína, que é grupo específico (MS, 2014).

27

No entanto, as técnicas que usam os anticorpos monoclonais produzidos contra as proteínas

virais e as técnicas de sequenciamento do gene forneceram evidências de diferenças antigênicas

e genéticas (variantes) entre vários isolados de grandes animais selvagens e animais domésticos

hospedeiros dentro de uma determinada região geográfica.

Os vírus da raiva (Figura 5) podem permanecer viável em uma carcaça durante vários

dias a 20 °C, embora possam sobreviver muito mais tempo quando o corpo da vítima é mantido

refrigerado.

Além dos vírus da raiva, pelo menos seis outros genótipos dos lyssavírus foram

descritos, reforçando ainda mais a vigilância, principalmente entre os morcegos (GREENE;

RUPPRECHT, 2006).

Figura 5. Vírus da raiva em forma de bala. Fonte: Infectious Diseases of the Dog and Cat.

Sete genótipos de Lyssavirus são conhecidos (Quadro 1): Rabies vírus (RABV), o único

presente na América Latina e no Brasil, pode ser expresso, de acordo com o perfil, em 12

variantes antigênicas, conforme seus respectivos hospedeiros naturais (terrestres ou aéreos)

(MS, 2014), o vírus Lagos Bat (LBV), Mokola (MOKV), Duvenhage (DUVV), os dois

European Bat Lyssavirus (EBLV), e o sétimo Australian Bat Lyssavirus (ABLV) ou vírus

Ballina foi identificado em morcegos frugívoros ("raposas voadoras") na Austrália, e que tem

sido identificado em todas as espécies de animais selvagens e em alguns morcegos australianos

em cativeiros (GREENE; RUPPRECHT, 2006).

No Brasil, foram encontradas 5 variantes antigênicas: variantes 1 e 2, isoladas dos cães;

variante 3 de morcego hematófago Desmodus rotundus; e variantes 4 e 6, de morcegos

insetívoros Tadarida brasiliensis e Lasiurus cinereus. Outras duas variantes encontradas em

Cerdocyon thous (cachorro do mato) e Callithrix jacchus (sagui de tufos brancos) não são

Cadeia simples única de nucleoproteína

RNA helicoidal

Envelope

Espícula da proteína

G

28

compatíveis com o painel estabelecido pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC),

para estudos dos vírus rábicos nas Américas (MS, 2014).

Quadro 1. Classificação do Gênero Lyssavirus

Genótipo Filogrupo Sorotipo Descrição das cepas

1 I 1 Vírus clássico da raiva, incluindo o vírus de “rua”

e variantes fixas

2 II 2 Lagos Bat 1, 2 e 3

3 II 3 Mokola 1, 2, 3 e 5

4 I 4 Duvenhage 1, 2 e 3

5 e 6 I 5 European Bat Lyssavirus tipos 1 e 2

7 I 6 Australian Bat Lyssavirus

Modificado de Woldehiwet Z. 2002. Raiva: desenvolvimentos recentes, Res Vet Sci

73: 17-25. Fonte: Infectious Diseases of the Dog and Cat.

2.8.3 Epidemiologia

O total de estimativas de casos de raiva humana mundial é aproximadamente 50.000

mortes anualmente. Os relatos sugerem que mais de 25.000 mortes por raiva humana pode

ocorrer somente na Índia. Muitas ilhas nações ou peninsulares como a Antártica, Nova

Zelândia, Taiwan, algumas das ilhas do Caribe, Irlanda, Noruega, Finlândia, Suécia, Islândia,

Havaí, e Japão são declaradamente livres da raiva. Na Europa Ocidental, países como a

Espanha, Portugal, Itália e Grécia tornaram-se livres da raiva terrestre a um custo considerável

através da vacinação oral da fauna selvagem, especialmente a raposa vermelha (Vulpes vulpes),

com um risco contínuo de importação (GREENE; RUPPRECHT, 2006). Praticamente quase

todos os casos morrem.

No Brasil, a raiva é endêmica, com grandes variações entre as regiões do país. Até 2005,

dezenas de casos de raiva humana eram registrados anualmente no país. A partir de 2006, o

número de casos caiu para um dígito e vem se mantendo nessa faixa.

Os últimos casos de raiva humana transmitida por cão ou gato, portadores das variantes virais

1 ou 2, ocorreram em 1981 na Região Sul, em 2001 nas Regiões Sudeste e Centro-Oeste, em

2004 na Região Norte e mais recentemente, em 2013, na Região Nordeste. No ano de 2014, foi

alcançada a meta de zero casos, uma vez que não houve registro de raiva humana causada por

cão ou gato, com as respectivas variantes citadas (MS, 2014).

29

2.8.4 Transmissão

A raiva é quase sempre causada pela mordida de um animal com a saliva infectada.

Outras fontes de transmissão são raramente envolvidas nas infecções provenientes do cão e

gato, mas podem servir para manter a infecção nos animais selvagens.

A transmissão dos vírus exalado ou excretado tem sido sugerida para disseminação

significante em grandes colônias de morcegos cavernícolas e por infecções causadas por

exposições laboratoriais. As infecções transmitidas pelo ar, provavelmente, envolvem grandes

quantidades de vírus em aerossol sob condições de ventilação insuficiente e uma série de

exposições susceptíveis (GREENE; RUPPRECHT, 2006). Um caso de raiva humana

registrado em 1956, ocorreu em um indivíduo que trabalhava em cavernas com morcegos sem

histórico de mordedura ou outro contato com algum animal suspeito. Após investigação

epidemiológica, arriscou-se a hipótese de que o indivíduo tivesse se infectado através da

inalação de partículas virais em suspensão na caverna (BRASS,1994; WARRELL, 2004).

Teoricamente a transmissão da raiva por ingestão (carne, leite e outros derivados) é

difícil, devido sua natureza gástrica ácida que inativa os vírus da raiva, havendo, portanto, uma

necessidade de uma alta carga viral e/ou ferimento em oro faringe (INSTITUTO PASTEUR,

2009).

A infecção de raiva por via transparentaria em gambás, morcegos e bovinos tem sido

registrada. A transmissão ambiental por fômites é rara, ou nunca, envolvida. A raiva humana já

ocorreu por transplante de córnea. Foram observadas infecções com secreção de saliva

contendo vírus antes mesmo que os sinais clínicos fossem evidentes, de modo que a ausência

de anormalidades neurológicas não pode ser usada para excluir absolutamente a possibilidade

de infecção por raiva (GREENE; RUPPRECHT, 2006).

2.8.5 Patogenia

A patogenia da raiva é semelhante em todas as espécies de mamíferos. Após a

inoculação, os vírus se replicam, inicialmente nas células musculares ou nas células do tecido

sub epitelial. Ao atingir a concentração suficiente alcançam as terminações nervosas, sendo este

período de replicação extra neural responsável pelo período de incubação relativamente longo

da raiva (BRASIL, 2008).

O período de incubação é extremamente variável, desde dias até anos, com uma média

de 45 dias no homem. Em crianças, o período de incubação tende a ser menor que no indivíduo

adulto. Está diretamente relacionado à localização, extensão e profundidade da mordedura,

arranhadura, lambedura ou contato com a saliva de animais infectados; distância entre o local

30

do ferimento, do cérebro e troncos nervosos; concentração de partículas virais inoculadas e cepa

viral. Para cada espécie animal, o período de incubação é diferente, variando de 15 dias a 4

meses, exceto para os quirópteros, cujo período pode ser maior (BRASIL, 2014).

Após a inoculação intramuscular, os vírus podem entrar diretamente nos nervos

periféricos ou replicar localmente em tecido que não seja nervoso. Os vírus podem entrar nas

junções neuromusculares e fusos neuromusculares após um período variável de dias, semanas

ou meses. A glicoproteína dos vírus da raiva tem homologia com certas neurotoxinas e anexa

aos axônios terminais através de receptores de lipoproteínas, incluindo a acetilcolina. Os vírus

se espalham de forma passiva por fluxo intra axonal nos nervos periféricos, a uma taxa de até

100 (gama, 10-400) mm por dia. As fibras motoras e sensoriais podem transportar os vírus.

Quanto maior o grau de inervação no local da mordedura, quanto mais curto o período de

incubação. Em casos de raiva que ocorrem naturalmente, os períodos de incubação foram

relatados de 3 a 24 semanas (média de 3 a 8 semanas) em cães, 2 a 24 semanas (média de 4 a 6

semanas) em gatos, e 3 semanas a um ano ou mais (média de 3 a 6 semanas) em pessoas

(GREENE; RUPPRECHT, 2006) (Figura 6).

Figura 6. Patogenia da infecção pelos vírus da raiva. Os vírus da raiva se replicam nos nervos

periféricos, como também nos miócitos e se espalhar nas terminações dos nervos motores (A)

propagação retrógrada intra-axonal (centrípeta) no Sistema Nervoso Central (SNC) que ocorre

nos nervos periféricos (B) vírus se replicam nos neurônios da medula espinhal e espalham-se

rapidamente por todo o sistema nervoso, provocando paralisia inferior do neurônio motor (C)

vírus de forma progressiva entram no cérebro se multiplicam, causando déficits dos nervos

cranianos e alterações comportamentais. Os vírus se espalham centrifugamente nos nervos

periféricos e cranianos, do qual eles entram nas glândulas salivares e saliva (D) e outros tecidos.

Fonte: Infectious Diseases of the Dog and Cat.

31

2.9 MÉTODOS EFICIENTES DE DIAGNÓSTICOS ATUAIS PARA A RAIVA

O diagnóstico laboratorial rápido e preciso de raiva em humanos, bem como em outros

animais é essencial para a realização oportuna da profilaxia pós-exposição. Dentro de algumas

horas, um laboratório de diagnóstico pode determinar se um animal estava ou não com raiva e

informar aos profissionais de saúde responsáveis. Os resultados laboratoriais podem evitar

traumas físico e psicológico desnecessários no paciente, além de encargos financeiros, caso o

animal não esteja raivoso.

Do mesmo modo, a identificação laboratorial de casos de raiva positivos pode ajudar na

definição de padrões epidemiológicos atuais da doença e fornecer informações adequadas para

o desenvolvimento de programas de controle da raiva.

A gravidade da doença da raiva determina que os testes laboratoriais sejam padronizados,

rápidos, sensíveis, específicos, econômicos e confiáveis (CDC, 2015).

O método padrão de diagnóstico para a detecção de antígeno viral da raiva é o Teste de

Imunofluorescência Direta (TID) (DEAN, J.; ABELSETH, M.; ATANASIU, P., 1996),

associado com a inoculação intracerebral em camundongos (KOPROWSKI, 1996), observando

os sinais clássicos da doença. O TID trata-se de uma técnica rápida e de baixo custo, usado em

amostras em decomposição em que os vírus não podem ser detectados (MESLIN, F.; KAPLAN,

M.; KOPROWSKI, H., 1996). Neste método os resultados de amostras frescas são viáveis em

95-99% dos casos (OIE, 2011). Contudo, outros estudos relataram o efeito da degradação sobre

a validade dos testes diagnósticos de Imunofluorescência Direta e Inoculação de Tecido

Nervoso em camundongos para raiva (LEWIS, V.J.; THACKER, W. L., 1974; VALENTINI et

al, 1991; HEATTON et al, 1997; ALBAS et al, 1999; DAVID et al, 2002; ARAÚJO et al, 2008;

LOPES, M. C.; VENDITTI, L. L.; QUEIROZ, L. H., 2010).

No Brasil e em outros países tropicais, o clima quente e as flutuações na temperatura

ambiente durante o transporte e armazenamento de amostras representam um grave problema

por causar decomposição das amostras, principalmente quando elas são armazenadas a baixas

temperaturas (-20°C), sem fixação (BISWAL, M.; RATHO, R.; MISHRA, B., 2007). Estas

condições podem afetar a sensibilidade do Teste de Imunofluorescência Direta (ITO et al, 2001;

DANTAS et al, 2004.), bem como do teste de inoculação em camundongos, por causa da

degradação do antígeno viral e perda da viabilidade (MARTORELLI, 2004). Esta situação pode

ser observada após 48 e 72h em amostras à temperatura ambiente, quando os resultados tornam-

se negativos (ALBAS et al., 1999). Por esta razão, amostras positivas designadas como arquivo

para futuros estudos epidemiológicos e para outros fins, devem ser armazenadas em

temperaturas muito baixas (-30 a -80°C) por longos períodos, (BISWAL, M.; RATHO, R.;

32

MISHRA, B., 2007; MIZUNO, N.; NAGAMURA, H.; IWAMOTO, K., 1998), a fim de

preservar a atividade viral por muitos anos. O armazenamento de amostras em refrigeradores

domésticos, com uma temperatura mínima de -20°C com repetidas ações de congelamento e

descongelamento, pode causar danos nos tecidos e deve ser evitada, tornando impossível a

detecção viral (GREENE; RUPPRECHT, 2006).

Técnicas de biologia molecular, como a Reação em Cadeia da Polimerase com

Transcrição Reversa (RT-PCR) têm sido utilizadas para vários estudos de diagnósticos

retrospectivos, principalmente ao se utilizar amostras armazenadas por um longo prazo,

detectando a presença do RNA independentemente de estar viável à infecção ou não (DANTAS

et al., 2004). As amostras podem ser sequenciadas através de análise filogenética no PCR, o

que leva a identificação altamente precisa dos vírus (HEATON et al., 1997). A técnica de RT-

PCR permite a detecção do RNA dos vírus da raiva em amostras armazenadas durante longos

períodos de tempo e em diferentes estágios de decomposição, quando comparado com as

técnicas tradicionais de laboratório como o teste de inoculação em camundongos que depende

da viabilidade dos vírus por ser menos sensível e o Teste de Imunofluorescência Direta que

também não tem alta sensibilidade, quando aplicado em amostras em decomposição (ALBAS

et al., 1999).

Muitos pesquisadores detectaram o RNA viral e realizaram estudos comparativos sobre

a sensibilidade da RT-PCR e o TID em amostras de cérebros infectados com os vírus da raiva,

o que demonstrou que essa técnica molecular pode ser um teste viável nas amostras de tecidos

em decomposição e pode ser utilizado em levantamentos epidemiológicos e estudos de surtos

(ERMINE et al., 1990; SACRAMENTO, D.; BOURHY, H.; TORDO, N., 1991;

KAMOLVARIN et al., 1993; MCCOLL et al., 1993; KULONEN; BOLDINA, 1993; WHITBY

et al., 1997; CREPIN et al., 1998; NEL et al., 1998; NADIN-DAVIS, 1998; HEATON et al.,

1997; KULONEN et al., 1999; SMITH et al., 2000; ITO et al., 2001; SOARES et al., 2002).

2.9.1 Teste de Imunofluorescência Direta (TID)

Várias reações imunológicas envolvem a ligação antígeno-anticorpo e que podem ser

visualizadas ou quantificadas por meio de diferentes diagnósticos para o antígeno ou para o

anticorpo (CDC, 2015).

O Teste de Imunofluorescência Direta baseia-se na observação de animais infectados

pelos vírus da raiva que tenham proteínas dos vírus (antígenos) apresentadas nos seus tecidos

(Figura 7).

33

Este método é rápido, sensível e específico de diagnosticar a infecção rábica em

susceptíveis com utilização de anticorpos fluorescentes (imunoglobulinas antirrábicas

marcadas com isotiocianato de fluoresceína = conjugado antirrábico). A prova se baseia no

exame microscópico de impressões de fragmentos de tecido nervoso “tratados” com conjugado

específico e submetidos à luz ultravioleta. O antígeno rábico, reagindo com o conjugado e

iluminado com luz ultravioleta (comprimento de onda de 260 nanômetros), emite uma luz

esverdeada fluorescente (BRASIL, 2008).

Figura 7. Técnica de Imunofluorescência Direta. (A) Positivo, (B) Negativo. Fonte: Centers for

Disease Control and Prevention.

2.9.2 Prova para isolamento dos vírus rábicos em camundongos (prova biológica)

O animal de eleição para o isolamento é o camundongo albino suíço, por ser um dos

mais sensíveis aos vírus rábicos. O animal utilizado deve ser de boa procedência e apresentar

bom estado sanitário, com idade e peso adequados.

Esta técnica baseia-se no preparo da suspensão a 20% para inoculação. Inicialmente é

pesado 1g dos diferentes fragmentos do SNC, macerado em gral estéril e adicionado ao preparo

de 4ml de diluente de vírus. O preparo é centrifugado de 2.000 a 3.000 rotações/minuto durante

15 minutos. Retira-se o sobrenadante, onde o mesmo é mantido em refrigeração (de 2 a 8°C)

para ser inoculado em camundongos de 8 a 10 camundongos por amostra, no mesmo dia, por

via intracerebral.

A leitura é realizada diariamente por 21 dias nos camundongos inoculados, no caso de

amostras de cães e gatos, e no mínimo 30 dias, no caso de amostras de herbívoros e animais

silvestres (BRASIL, 2008).

A B

34

2.9.3 Exame Histopatológico

O exame histológico da biópsia ou tecidos de autópsia é ocasionalmente útil no

diagnóstico de casos sem suspeita de raiva que não foram testados por métodos de rotina.

Quando o tecido cerebral oriundo de animais infectados com os vírus da raiva é marcado com

um marcador histológico, tais como hematoxilina e eosina, a evidência de encefalomielite pode

ser reconhecida por um microscopista treinado.

A evidência histopatológica da encefalomielite da raiva (inflamação) no tecido cerebral

e nas meninges inclui as seguintes mudanças:

1. infiltrado mononuclear;

2. infiltrados perivasculares de linfócitos ou células polimorfo nucleares (Figura 8);

3. focos linfocitários;

4. Pequenos nódulos constituídos por células da glia (Figura 9);

5. Corpúsculos de Negri (CDC, 2015).

Figura 8. Infiltrados perivasculares ou inflamação em torno de um vaso sanguíneo. Célula

inflamatória perivascular infiltra a hematoxilina e a eosina mancha o tecido cerebral. (A) 100x.

(B) 200x. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention.

A B

35

Figura 9. (A) Pequenos nódulos. (B) Vaso sanguíneo sem células inflamatórias (200x). 1 =

glóbulos vermelhos. 2 = células epiteliais escamosas. Fonte: Fonte: Centers for Disease Control and

Prevention.

Figura 10. (A) Neurônio sem Corpúsculos de Negri. (B) Corpúsculo de Negri no neurônio

infectado. Fonte: Centers for Disease Control and Prevention.

2.9.4 Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa (RT-PCR)

Os métodos de diagnóstico molecular, especialmente a RT-PCR, estão sendo

universalmente adotados para o diagnóstico etiológico de diversas viroses animais (BÉLAK;

BALLAGIPORDÁNY, 1993). As principais vantagens dessa técnica resumem-se na rapidez

na obtenção dos resultados, a não exigência da infecciosidade da partícula viral e as altas taxas

de sensibilidade e especificidade (McPHERSON; TAYLOR; QUIRKE, 1994; TAKIUCHI et

al., 2003, 2005).

Este método amplifica a porção de ácido nucleico dos vírus da raiva, utilizando métodos

bioquímicos. Com este procedimento, o Ácido Ribonucléico (RNA) dos vírus da raiva pode ser

amplificado enzimaticamente como cópias de Ácido Desoxirribonucléico (DNA). O RNA da

1

2

A B

A B

36

raiva pode ser copiado para uma molécula de DNA, utilizando a transcriptase reversa (RT). A

cópia de DNA da raiva pode então ser amplificado ao usar a reação em cadeia da polimerase

(PCR) (CDC, 2015).

37

3 JUSTIFICATIVA

A raiva transmitida através do morcego hematófago Desmodus rotundus continua sendo

uma das causas que prejudica a cadeia produtiva da agropecuária, além de ser um sério fator de

risco de ocorrência de raiva humana. Sua importância é confirmada pelo volume de recursos

destinados à profilaxia animal e humana através do uso de imunobiológicos e de outras ações

para o seu controle.

A falta de meios práticos de controle, monitoramento, estudo e identificação da espécie

Desmodus rotundus, compromete a população dos seres vivos com relação à doença. A

presença desta espécie hematófaga no Ceará é notadamente verificada em regiões com climas

e vegetações diferenciadas, com incidência de casos de raiva em herbívoros, sem a atuação de

um programa efetivo de vigilância e controle e com subnotificação de casos dessa zoonose.

São necessários, portanto, meios que possam permitir distinguir os caracteres

morfológicos entre as populações desmodinas correlacionados com fatores ambientais (tipos

climáticos e unidades fitoecológicas), bem como numa etapa posterior adquirir o conhecimento

da susceptibilidade e detecção viral da raiva nesta espécie para melhor compreender e rastrear

as epizootiologias, possibilitando obter a correlação entre o estudo da craniomorfologia e

diagnóstico da raiva.

38

4 HIPÓTESES CIENTÍFICA

Morcegos Desmodus rotundus distribuídos nos municípios no Estado do Ceará

apresentam diferentes formas cranianas e estruturas fenotípicas correlacionadas com diferentes

fatores ambientais.

39

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Verificar e descrever diferença craniomorfológica do morcego hematófago Desmodus

rotundus, de acordo com a distribuição deste morcego no Estado do Ceará.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar medidas cranianas do morcego Desmodus rotundus distribuídos no Estado do

Ceará;

Descrever as características fenotípicas dos espécimes;

Especificar os tipos de abrigo nos quais habitam os morcegos Desmodus rotundus;

Comparar tipos de climas e vegetações onde os abrigos estão inseridos com as

características fenotípicas e cranianas;

Obter amostras de sistema nervoso central para criopreservação em estudos futuros com

testes moleculares RT-PCR, visando o diagnóstico da raiva;

Contribuir para melhor conhecimento sobre a diversidade craniomorfológica do

morcego hematófago D. rotundus.

40

6 CAPÍTULO 1

Avaliação Crânio Morfológica do Morcego vampiro Desmodus rotundus (Chiroptera,

Phyllostomidae, Desmodontinae) no Estado do Ceará, Brasil.

Morphological skull assessment of Desmodus rotundus vampire bat (Chiroptera,

Phyllostomidae, Desmodontinae) in Ceará State, Brazil.

Periódico: American Journal of Veterinary Research (Submetido em 29 de junho de 2015)

41

Morphological skull assessment of Desmodus rotundus vampire bat (Chiroptera,

Phyllostomidae, Desmodontinae) in Ceará State, Brazil.

Francisco B. P. Moura; Maria F. S. Teixeira, Dr

From Health State Department of Ceará State, Brazil (Moura) and Post Graduation Course in

Veterinary Science, State University of Ceará, Brazil

This manuscript represents a portion of a master paper submitted by Moura to the State

University of Ceará – Post Graduation Course in Veterinary Science of the requirements for a

Master of Science degree.

The author thanks Maria Teixeira for technical assistance.

Address correspondence to Moura at bergsonpmoura@gmail.com

Abstract

The correlation among characters, which describe the skull of Desmodus rotundus within a

representative database of twenty skull measurements of each evaluated sample, associated phenotypic

characteristics and ecological conditions can indicate affecting cranial characters. This study used

morphological quantitative approaches to investigate the evolution of the skull of D. rotundus in order

to confirm extant lineages. Forty-one adult vampire bats were captured through the use of mist nets in

four municipalities of Ceará State with different climate types and phytoecological units. The results

indicated by analysis of variance in block (ANOVA) through Epi Info7 program that the skull size

of vampire bat D. rotundus does not vary according to climate type and phytoecological unit

where it operates. It raises the possibility that the altitude can influence the skull size, while

external measures proved sexual dimorphism. In all bats studied it was possible to collect enough brain

material to serve in future studies, aiming to acquire knowledge of susceptibility and viral detection of

rabies in this species, making it possible to obtain correlation between the study of environmental factors

and rabies diagnosis.

Keywords: cranial characters, phenotypic characteristics, ecological conditions.

Introduction

Organisms are made up of a complex arrangement of anatomical structures and

individual parts that maintain functional associations throughout the development, according to

Hallgrímsson et al. (2009). In the early nineteenth century, French anatomist George Curvier

emphasized the "principle of correlation of parts", aiming to give the idea that parts of the bodies

are coordinated to form a functional whole, according to Mayr (1982). In the 1950s five

researchers presented methods of correlating morphology and function. Everett Olson in 1951

and Robert Miller in 1958 showed quantitative methods based on correlation to empirically

identify groups of phenotypic traits that are more highly integrated and based on factors shared

development and function. Then, the botanist Jean Clausen and William Hiesey in 1960

investigated a long program of complex correlating characters in intraspecific hybrids of

ecological races. Raisa Berg in 1960 investigated the different degrees of integration between

specific character sets, according to the ecological conditions, generating hypotheses that are

still used to guide empirical research, according to Armbruster et al. (1999) for detecting

correlation models or modules, according to Berg (1960).

In Desmodus rotundus vampire bats (E. Geoffroy, 1810), there are very few studies

on the correlation of such aspects; comprising cranial characters, phenotypic characteristics and

42

ecological circumstances surrounding climate types and phytoecological units. Skull can be an

essential model to conduct the study of morphological integration, due to the complexity of

bone growth along with other biases (phenotypic characters and ecological circumstances).

As part of the quantitative morphological analysis phenotypic characters [mandibular

earrings, submandibular structure and femoral membrane (uropatagium)] may be considered

measurable tools obtained from collected data. They display evolutionary changes that can be

quantified, signifying applicability in this study, enabling us to evaluate a covariance, i.e.

morphological characters that may present a correlation between morphology and function with

each other, mapped in some municipalities of Ceará based on various environmental factors

(climate and phytoecological). Thus, this assessment intends to analyze skull morphology

differences in this species of blood-sucking bat D. rotundus throughout its distribution in Ceará

State.

Material and Methods

Study Area

Ceará State (Figure 1) is situated in the upper part of the Northeast. It is bordered by

the Atlantic Ocean to the north and northeast, the States of Rio Grande do Norte and Paraiba to

the east, and Pernambuco and Piauí south west. Its total area is 148.920.472 km² or 9.37% of

the Northeast area and 1.74% of Brazil. It is considered to be the fourth largest in the Northeast

and seventeenth among Brazilian states in terms of area (IPECE, 2015).

Animals

Forty-one Desmodus rotundus (Chiroptera: Phyllostomidae; Desmodontinae) adult

vampire bats were analyzed (19 males and 22 females), which were captured in four

municipalities (São Benedito, Ubajara, Tauá and Potiretama) in Ceará State. Each of these

municipalities possess climate types and phytoecological units.

Species and lineage

The concept of the word species is fundamental importance in the study of evolution

when it proposes to determine the possibility of a particular taxon has more than one species.

This is due to the fact that the species are seen as essential entity of the evolutionary process,

according to Wiley (1978). In the universe of concepts about the word species, all have their

merits and their failures to be seen disagreements over some points related to morphology,

genetics, biology among others, contradicting the theory that the concept of appropriate species

should be generally applicable and consistent theoretically, Hull (1997). Since this work aims

to evaluate the criterion of differences of external and cranial morphological characteristics in

D. rotundus species, it will be used purely nominalist concept of lineage as strain or descent,

causing a strong correlation between morphology and genetics.

Climatic Types and Phytoecological Units

Climate types and phytoecological units were obtained from Instituto de Pesquisa e

Estratégia Econômica do Ceará (IPECE), an agency linked to the Department of Planning and

Ceará State management. Its mission is to provide geographic social economic information,

develop strategies and propose public policies that support the development of the state, and

present values such as ethics and transparency, scientific rigor, professional competence, inter-

institutional cooperation and commitment to society.

43

Five existing climate types in Ceará state are: Tropical Hot Semi-Arid Climate, Tropical Mild

Semi-Arid, Tropical Warm Sub-Humid areas, Tropical Warm and Humid, Tropical Hot Sub-

warm Sub-Humid areas (Figure 2), in which 3 (60%) (Tropical Hot Semi-Arid, Tropical Warm

and Humid and Tropical Hot Sub-Humid areas) were evaluated in the context of this study.

Eleven phytoecological units of Ceará are: Complex Vegetation of the Coastal Zone,

Humid Forests / Mountainous, Semi Deciduous Tropical Rain Forest (dry forest), Deciduous

Thorny Forest (arboreal Caatinga), Dense Shrubby Caatinga, Open Shrubby Caatinga,

Carrasco, Sea Swamp Evergreen Forest, Riparian Forest with Carnauba and Dicots, Tropical

Semi Deciduous Xerophitic Forest (Cerradão) and Brazilian Savanna (Cerrado) (Figure 3),

including 3 (27%) [Humid Forests / Mountainous, Semi Deciduous Tropical Rain Forest (dry

Forest) and Open Shrubby Caatinga] were evaluated in the context of this study.

Field Procedures (captures)

Field procedures started only after examination and permission from the Ethics

Committee for the Use of Animals (whose number is 5660389/2014) and stipulation for

permission for activities with scientific purpose issued by System Authorization and

Information Science Biodiversity belonging to Chico Mendes Institute for Biodiversity

Conservation (whose number is 46433). Field procedures respected principles of 3Rs of Animal

Welfare (Reduction, Refinement and Replacement) when captured few individuals in each

shelter. Capture sessions were in April and May 2015, minutes before dusk mist nets were open

for an average of six hours every night until the ground level in selected areas, with shelters and

/ or power supplies (pens, stables, pig farms, chicken coops, etc) being prioritized. There was

no standard for the number of mist nets and hour worked.

The active search for bats in shelters such as abandoned houses, caves, disabled

wells, manholes and hollow trees was also held sporadically during the period in the field, using

flashlights and dip nets in an attempt to locate and capture specimens.

Four captures were done in São Benedito, Ubajara, Tauá and Potiretama

municipalities where each sampling point was geo-referenced (Figure 4) and classified habitat

type, according to Wilson et al. (1996). It was considered climate types and phytoecological

units already recognized for Ceará State (Table 1). The capture effort was calculated by

multiplying total area of armed mist nets, which spanned 7 and 12 m long and 2.5 m high, by

the time (total number of hours after dark), according to Straube & Bianconi (2002) (Table 2).

Captured vampire bats were identified in field being kept in individual numbered

cotton fabric bags.

The major inclusion criterion of captured D. rotundus specimens was adulthood, as at

this stage there does not appear to be more bone growth to be observed, with sutures and cranial

bones being well fused. Another criterion was reproductive stage by visual check as noted in

the following categories: scrotum (adult male with obvious testicle in the scrotum) and innate

female (adult female with normal abdomen and reduced breasts). Pregnant females were not

collected (fetus detectable by palpation of abdomen), female nursing (adult female with well-

developed breasts devoid of surrounding hair, with milk secretion verified by light pressure

thereof) and post-lactating (adult female with flabby breasts, devoid of surrounding hair and no

milk secretion when pressed), according to Sekiama & Zortea (2003). These criteria aimed to

prevent environmental impact on these species populations.

44

Preparation of the samples

Forty-one D. rotundus vampire bat researched in municipalities were taken to the

Medical Entomology Laboratory located in Regional Health Coordination belonging to Health

State Department of Ceará State distributed throughout the state to subsidize activities of

obtaining taxonomic measures and collection of brain and skull.

The specimens were anesthetized with ketamine hydrochloride (Ketalar / ketamine)

intramuscularly (chest muscle), noting volume / weight ratio (1ml/kg or 100mg/kg).

Animals were weighed on a precision balance (d = 0.1g) properly calibrated and

verified external measures, such as: body length (cranial / caudal), ear height, leg length,

forearm length and uropatagium width. After external measurements were performed,

specimens were euthanized with fast action inhalational anesthetic [isoflurane = 2-chloro-2-

(difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-ethane], concentration> 1 MAC (Minimum Alveolar

Concentration ) use recommended for small mammals, as RESOLUTION No. 714, in 20 June

2002, according to Federal Council of Veterinary Medicine. Animals were placed in a chamber

properly designed so that there was uniform distribution of anesthetic and that concentration

acted quickly without leakage, causing a dose-dependent depression of central nervous system

to the animal.

The collection of nervous material (brain) was by aspiration using polypropylene

Pasteur pipette type of 170mm and tip with 3mm diameter containing 3ml of capacity through

foramen magnum, as King et al. (1998). After head dissection at the height of atlanto-occipital

joint bat, the foramen magnum was made unobstructed with the aid of a small anatomical

clamp, removing the atlas bone. The pipette tip was inserted in the foramen magnum, aspirating

the brain. Afterwards, a skin skull extraction was made.

Cleaning and conservation of skulls followed the steps: (a) removal of head leather,

stripping roughly removed the eye and brain, skull immersion in clean water during twelve

hours in order to remove the blood. (b) skulls boiled for 10 minutes. (c) withdrawal of the rest

of meat with tweezers. (d) additional cleaning baths alternated by Sodium Hypochlorite, clean

water, 20 or 30 volumes hydrogen peroxide, clean water until complete removal of the bleach

and fleshy skull waste. (e) drying at room temperature, according to Cecilio (2005). Twenty or

thirty volumes Hydrogen peroxide was necessary to remove an oily residue on the skull, which

would otherwise remain if a smaller volume (or only water) were used.

Collecting and storing material for RT-PCR

After removing the skin of the head of D. rotundus specimens for skull extraction,

brain material was collected and stored immediately in Eppendorf tubes with Trizol at -80°C in

the Central Laboratory of Ceará State for future molecular diagnostics.

Morphological Quantitative Analysis

Quantitative morphological analysis was adapted for each specimen that included 20

skull measurements commonly used in identifying bats: (1) skull length; (2) skull length plus

incisive; (3) length from alveolar edge of upper incisors to mastoid; (4) condyle-canine length;

(5) canine length to the opposite mastoid process; (6) basal length - posterior alveolar edge of

central incisors to anterior border of foramen; (7) length from posterior alveolar edge of central

incisors to the foremost point of palatal chamfer at the choanas level; (8) length from nasal to

magnum foramen; (9) mandible length; (10) external width of canines between the outer points

of upper canines; (11) interorbital width - width between the nearest points of orbital

constrictions; (12) preorbital width - width between the farthest points of orbital constrictions;

45

(13) zygomatic width - width between the outermost points of zygomatic arch; (14) width

between the side ends of skull; (15) width between mastoid processes; (16) width of tympanic

bullas at their nearest portion; (17) width of tympanic bullas at their widest portion; (18) height

of the skull - the deepest point of basi occiptal to the highest point of parietal despised sagittal

crest, ie the outermost point of foramen to the top of the skull; (19) occipital height - the leading

edge of magnum foramen to the highest point of skull; (20) diameter of magnum foramen, as

Vizzoto & Taddei (1973) (Figure 5).

Five external measurements (total length of the body, foot length, ear height, forearm

length, uropatagium width) were also analyzed, according to Taddei et.al (1998). All

measurements were taken in millimeters (mm) with the use of precision digital caliper 0-

150mm JOMARCA. The length of jaw and total length of skull have been taken, avoiding to

extend far in front of incisors, but even the most anterior region thereof.

Statistical Analysis

Analysis of Variance (ANOVA) through Epi Info7 program was used for statistical

analysis of skull measurements to compare the variances of cranial morphology and external

measures analysis. This aimed to verify existence of lineages as well as difference between the

averages of external measures of D. rotundus males and females for the significance calculated

level (α = 0,05), in order to verify the existence of sexual dimorphism.

Results and Discussion

Vampire bat D. rotundus has an emerging importance for rabies epidemiology in

Brazil, mainly in rural areas, and as carrier of rabies virus (RABV) lineages.

In this context, the results obtained in this study are valuable, because based on the existence

of this specimen in Ceará State, it is possible to affirm some unknown details concerning bat

lineages research in Brazil.

Skull measurements

After a capture effort sample of 542.5 h. m², forty-one specimens of D. rotundus have

been caught and the results indicated through Epi Info7 program that the skull size of vampire

bat D. rotundus does not vary according to climate type and phytoecological unit where it

operates. It raises the possibility that the altitude can influence the skull size as evolution way.

Potiretama municipality had the highest cranial measures than other ones (Table 3).

As Potiretama has tropical hot semi-arid climate type and open shrubby caatinga

phytoecological unit with altitude 250 m, whereas São Benedito, the second municipality with

higher values of cranial measures, has Tropical Hot Humid climate type and humid forests

phytoecological unit / mountainous completely different with very high altitude (818 m).

Perhaps altitude may differentiate skull sizes. It is expected that there was a pattern and each

climate and ecological unit presented cranial measures quite different in all municipalities,

which did not happen, because Ubajara and Tauá municipalities had very similar measures.

External measurements

However, comparisons of external measurements revealed existence of significant

differences in patterns of correlation and covariance among D. rotundus specimens, verifying

existence of sexual dimorphism, where females are bigger than males, according to Alencar et

al. (1994) (Tables 4,5,6,7,8). Therefore, in all studied bats it was possible to collect enough

46

brain material to serve in future studies, aiming to acquire susceptibility knowledge and viral

detection of rabies in this species, making it possible to obtain correlation between the study of

environmental factors and rabies diagnosis.

Phenotypic characters (mandibular earrings and submandibular structure)

A few specimens of D. rotundus captured showed mandibular earring characteristic

(Figure 6) as a modest form with low numbers (4/41) and percentage (0-20% / 100%) in 75%

of municipalities surveyed (3/4) independently of climate type and phytoecological unit (Table

9). This phenotypic change, even though modest, may be a mutation or evolution of this species

throughout Ceará State, considering this result occurred in most researched shelters that are

distant one of each other more than 20 square kilometers [corresponding area where it occurs

exchanging species shelters within its action area, according to Alencar et al. (1994) & Flores-

Crespo (2001)].

In contrast, phenotypic submandibular structure characteristic (Figure 6) showed up in

D. rotundus specimens as a significant way in large numbers (38/41) and percentage (93% /

100%) in all municipalities, independently of climate type and phytoecological unit (Table 9).

Therefore, this structure presents almost absolutely in D. rotundus specimens, denoting an

evolution concerning this structure even though its physiological function is not mentioned in

scientific literature.

Table 1. Climate types, phytoecological units, and other characteristics of Desmodus rotundus

shelters in researched Ceará municipalities, 2015.

Municipalities

Shelter /

Location

Estimated

Population (n)

Estimated

Area (m²)

Phytoecological

Unit

Climate

Type

São Benedito

Cave /

São Vicente

30

24

Humid Forests /

Mountainous

Tropical Hot

Humid

Ubajara

Cave /

Araticum

30

50

Semideciduous

Tropical Rain

Forest (Dry

Forest)

Tropical Hot

Sub-Humid

Tauá

Mine /

Quinámuiu

350>

**

Open Shrubby

Caatinga

Tropical Hot

Semi-Arid

Potiretama

Cave /

Potiretama

200>

30

Open Shrubby

Caatinga

Tropical Hot

Semi-Arid

** No condition of estimation, due to the size of the mine.

47

Table 2. Capture effort done in each type of habitat sampled (h.m²) during the entire period of

study in Ceará State, Cv = cave, Mn = disabled mine.

Researched

Municipalities

Habitat Effort (h.m²)

São Benedito Cv 87,5

Ubajara Cv 105

Tauá Mn 140

Potiretama Cv 210

Total effort ----- 542,5

48

Table 3. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to skull measurements and municipalities, Ceará, 2015.

Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama

Skull length

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 0 0 9 22,0 0 0 15 36,6

Skull length plus incisive

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 22 mm 21-24 mm < 22 mm 21-24 mm < 22 mm 21-24 mm < 22 mm 21-24 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

2 4,9 8 19,5 0 0 7 17,1 1 2,4 8 19,5 0 0 15 36,6

Length from alveolar edge

of upper incisors to mastoid

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0 10 24,4 4 9,8 3 7,3 3 7,3 6 14,6 4 9,8 11 26,8

Condyle-canine length

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

10 24,4 0 0,0 7 17,1 0 0,0 6 14,6 3 7,3 14 34,1 1 2,4

Canine length to the

opposite mastoid process

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm < 19 mm 20-23 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

4 9,8 6 14,6 5 12,2 2 4,9 6 14,6 3 7,3 3 7,3 12 29,3

Basal length

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 17 mm 18-20 mm < 17 mm 18-20 mm < 17 mm 18-20 mm < 17 mm 18-20 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0,0 10 24,4 6 14,6 1 2,4 3 7,3 6 14,6 4 9,8 11 26,8

49

Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama

Length from posterior

alveolar edge of central

incisors to the foremost

point of palatal chamfer

at the choanas level

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

10 24,4 0 0,0 4 9,8 3 7,3 9 22,0 0 0,0 15 36,6 0 0,0

Length from nasal to

magnum foramen

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 13 mm 14-15 mm < 13 mm 14-15 mm < 13 mm 14-15 mm < 13 mm 14-15 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

6 14,6 4 9,8 6 14,6 1 2,4 8 19,5 1 2,4 12 29,3 3 7,3

Mandible length

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0,0 10 24,4 0 0,0 7 17,1 1 2,4 8 19,5 1 2,4 14 34,1

External width of canines

between the outer points of

upper canines

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

9 22,0 1 2,4 2 4,9 5 12,2 5 12,2 4 9,8 4 9,8 11 26,8

Interorbital width

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 4 mm > 5 mm < 4 mm > 5 mm < 4 mm > 5 mm < 4 mm > 5 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0,0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 1 2,4 8 19,5 0 0,0 15 36,6

Preorbital width

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 5 mm > 6 mm < 5 mm > 6 mm < 5 mm > 6 mm < 5 mm > 6 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

5 12,2 5 12,2 3 7,3 4 9,8 1 2,4 8 19,5 0 0,0 15 36,6

50

Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama

Zygomatic width

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm < 11 mm 12-14 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

3 7,3 7 17,1 2 4,9 5 12,2 9 22,0 0 0,0 5 12,2 10 24,4

Width between the side

ends of skull

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0,0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 0 0,0 9 22,0 0 0,0 15 36,6

Width between

mastoid processes

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm < 5 mm 11-13 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

0 0,0 10 24,4 1 2,4 6 14,6 0 0,0 9 22,0 0 0,0 15 36,6

Width of tympanic bullas

at their nearest portion

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm < 5 mm 6-7 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

10 24,4 0 0,0 1 2,4 6 14,6 9 22,0 0 0,0 12 29,3 3 7,3

Width of tympanic bullas

at their widest portion

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm < 10 mm 11-12 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

2 4,9 8 19,5 5 12,2 2 4,9 4 9,8 5 12,2 4 9,8 11 26,8

51

Skull Measurements São Benedito Ubajara Tauá Potiretama

Height of the skull

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 10 mm 11-14 mm < 10 mm 11-14 mm < 10 mm 11-14 mm < 10 mm 11-14 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

8 19,5 2 4,9 0 0,0 7 17,1 5 12,2 4 9,8 12 29,3 3 7,3

Occipital height

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 11 mm 12-13 mm < 11 mm 12-13 mm < 11 mm 12-13 mm < 11 mm 12-13 mm

Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº %

4 9,8 6 14,6 0 0,0 7 17,1 1 2,4 8 19,5 4 9,8 11 26,8

Diameter of magnum

foramen

Parameters Parameters Parameters Parameters

< 4 mm < 4 mm < 4 mm < 4 mm

Nº % Nº % Nº % Nº %

10 24,4 7 17,1 9 22,0 15 36,6

52

Table 4. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and

total body length (Bl), Ceará, 2015.

Sex

Total body length - Bl

< 70 mm 70 mm - 79 mm 80 mm +

Nº % Nº % Nº %

Female 2 28,6 17 56,7 3 75,0

Male 5 71,4 13 43,3 1 25,0

Both sex 7 100 30 100 4 100

Table 5. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and

foot length (Fl), Ceará, 2015.

Sex

Foot length - Fl

< 15 mm 16 mm - 18 mm 19 mm +

Nº % Nº % Nº %

Female 0 0 22 59,5 0 0

Male 3 100 15 40,5 1 100

Both sex 3 100 37 100 1 100

Table 6. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and

forearm length (Fl), Ceará, 2015.

Sex

Forearm length - Fl

< 60 mm 60 mm - 65 mm 66 mm +

Nº % Nº % Nº %

Female 1 14,3 16 61,5 5 62,5

Male 6 85,7 10 38,5 3 37,5

Both sex 7 100 26 100 8 100

53

Table 7. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and

ear height (Eh), Ceará, 2015.

Sex

Ear height - Eh

< 60 mm 60 mm - 65 mm 66 mm +

Nº % Nº % Nº %

Female 1 14,3 16 61,5 5 62,5

Male 6 85,7 10 38,5 3 37,5

Both sex 7 100 26 100 8 100

Table 8. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to sex and

uropatagium width (Uw), Ceará, 2015.

Sex

Uropatagium width (Uw)

< 10 mm 10 mm - 14 mm 15 mm +

Nº % Nº % Nº %

Female 0 0 14 60,9 8 66,7

Male 6 100 9 39,1 4 33,3

Both sex 6 100 23 100 12 100

Table 9. Number and percentage of Desmodus rotundus bats captured, according to

phenotypic characters, climate type and phytoecological unit, Ceará, 2015.

Municipalities

Number

of bats

(N=41)

Phenotypic characters

Climate

type

Phytoecological

Unit

Mandibular

earrings

Submandibular

structure

N.º % N.º % N.º %

São Benedito 10 24,4 2 20,0 8 80,0 Tropical

Warm and

Humid

Humid Forest /

Mountainous

Ubajara

7

17,1

0

0

7

100

Tropical

Warm

Sub-humid

Semi Deciduous

Tropical Rain

Forest / Dry

Forest

Tauá 9 22,0 1 11,1 9 100 Tropical Hot

Semi-Arid

Open Shrubby

Caatinga

Potiretama 15 36,6 1 6,7 14 93,3 Tropical Hot

Semi-Arid

Open Shrubby

Caatinga

54

Conflict of interest

All authors declare to have no conflict of interest.

Acknowledgements

I am greatly indebted to Dr. Maria Fátima da Silva Teixeira, who was advisor in my

Postgraduate Course in Veterinary Science. I thank the following who were kind enough to

help me in field procedures catching bats, Raffael Junior de Oliveira Braga, Jorge Bezerra da

Silva, Eduardo Emanuel Apolônio, Paulo Henrique da Cruz Café, Antônio Cláudio Braga

Pereira, Luiz Gonzaga de Castro, especially Maria Mariza de Lima e Silva, who collaborated

catching and dissecting the specimens. All individuals, who contributed substantially to the

process directly and indirectly of generating this article.

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Figure 1: State location of Ceará in Brazil. Source: sopassagenteaviao.com.

Figure 2: Climate Types of Ceará State. Source: IPECE.

ClimateTypes

56

Figure 3: Phytoecological Units of Ceará. Source: IPECE.

Figure 4. Sample points geo-referenced in the study in Ceará State municipalities. (1) São

Benedito S 03° 99' 655 " WO 40° 83' 346 ' 810 m. (2) Ubajara S 03° 80' 316" WO 40° 87'

882” 230 m. (3) Tauá S 06° 02' 050" WO 40° 30' 854" 546 m and (4) Potiretama S 05° 77'

047" WO 38° 18' 306" 250 m. Source: Coordinates Track Maker Software.

Phytoecological Units

57

Figure 5. Side, ventral, frontal and occipital views of D. rotundus skull with measurements

indicated. (1) skull length. (2) skull length plus incisive. (3) length from alveolar edge of upper

incisors to mastoid. (4) condyle-canine length. (5) canine length to the opposite mastoid

process. (6) Basal length. (7) length from posterior alveolar edge of central incisors to the

foremost point palatal chamfer at choanas level. (8) length from nasal to magnum foramen.

(9) mandible length. (10) external width of canines. (11) interorbital width (12). preorbital

width. (13) zygomatic width. (14) width between the side ends of skull. (15) width between

mastoid process. (16) width of tympanic bullas at their nearest portion. (17) width of tympanic

bullas at their widest portion. (18) height of the skull. (19) occipital height. (20) diameter of

magnum foramen. Source: Biosciences Institute at the University of São Paulo.

Figure 6. Photograph of phenotypic characters: (A) Mandibular earrings. (B) Submandibular

structure. Source: Bergson 2015.

20

A B

58

7 CONCLUSÕES

Não houve modificações cranianas significativas da espécie D. rotundus, conforme

tipo climático e unidade fitoecológica onde a espécie está inserida;

A altitude foi a característica que influenciou o tamanho do crânio na espécie D.

rotundus;

Foi confirmado o dimorfismo sexual na espécie estudada;

Brinco mandibular foi uma característica recessiva, independentemente do tipo

climático e unidade fitoecológica;

Estrutura mandibular foi uma característica dominante, independentemente do tipo

climático e unidade fitoecológica.

59

8 PERSPECTIVAS

A análise e a interpretação das medidas externas e cranianas da espécie Desmodus

rotundus servirão como subsídios para estudos futuros, na perspectiva de possibilitar a

correlação entre os fatores ambientais e diagnóstico da raiva, utilizando material cerebral

obtido dos espécimes capturados.

60

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71

10 APENDICE

APÊNDICE A - Saco de tecido de algodão numerado utilizado nas atividades de campo para

acondicionar morcego hematófago D. rotundus capturado.

APÊNDICE B - Câmara adequadamente projetada para realização da eutanásia e sem fuga

dos morcegos com distribuição uniforme do anestésico inalatório de rápida ação [isoflurano

= 2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano], concentração > 1 CAM (Concentração

Alveolar Mínima) de uso recomendado para pequenos mamíferos, conforme RESOLUÇÃO

Nº 714, DE 20 DE JUNHO DE 2002 do Conselho Federal de Medicina Veterinária, com

intuito de atingir rapidamente a concentração desejada, causando depressão dose-dependente

do SNC dos espécimes.

APÊNDICE C - Ficha (exemplo) utilizada para obtenção das medidas cranianas, medidas

externas e dados inerentes aos abrigos dos morcegos hematófagos Desmodus rotundus nos

municípios trabalhados na pesquisa.

72

APÊNDICE D - Ficha para obtenção de dados complementares da captura inerentes às fases

lunares, hora do primeiro espécime capturado, tamanho das redes utilizadas, sexo do primeiro

exemplar capturado, horas de trabalho, localização do abrigo em relação às coordenadas

geográficas, data da captura e participantes das atividades.

APÊNDICE E - Ficha contendo outras espécies de morcegos capturados e soltos que coabitam

com D. rotundus nos abrigos verificados nas atividades de campo.

APÊNDICE F - Ficha sobre as espécies agredidas por D. rotundus nos municípios trabalhados

na pesquisa no Ceará, 2015.