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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ - UECE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA - FAVET

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

VETERINÁRIAS - PPGCV

HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA

CILOSTAMIDA AFETA DE FORMA DEPENDENTE DE CONCENTRAÇÃO E

TEMPO DE EXPOSIÇÃO A VIABILIDADE E A CINÉTICA DE MATURAÇÃO

IN VITRO DE OÓCITOS CAPRINOS E BOVINOS

FORTALEZA - CEARÁ

2014

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HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA

CILOSTAMIDA AFETA DE FORMA DEPENDENTE DE CONCENTRAÇÃO E

TEMPO DE EXPOSIÇÃO A VIABILIDADE E A CINÉTICA DE MATURAÇÃO IN

VITRO DE OÓCITOS CAPRINOS E BOVINOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.

FORTALEZA - CEARÁ

2014

3

4

5

Dedico,

A minha Avó, Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam)

6

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo

incentivo concedido na forma de bolsa de estudo, à Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior (CAPES), à Rede Nordeste de Biotecnologia (Renorbio), à

Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e à Fundação Cearense de Apoio ao

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo auxílio financeiro dessa

pesquisa.

A Deus por estar presente me guiando, dando força, discernimento e protegendo durante

todos os momentos desta caminhada.

Ao meu orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por ter me recebido e orientado

de forma competente e dedicada, sempre me fornecendo apoio acadêmico e incentivo

profissional.

Ao Prof. Dr. Isaac Neto por toda a sua ajuda e contribuição em meu crescimento pessoal

e profissional e por ter se mostrado sempre disponível em me ajudar.

Ao Prof. Dr. Claudio Cabral Campello por toda a sua ajuda de forma competente e

dedicada, contribuição neste trabalho e por estar sempre disponível em me ajudar.

Ao Prof. Dr. José Roberto Viana Silva por toda a sua ajuda e contribuição neste

trabalho, por ter se mostrado sempre disponível em me ajudar.

A Dr. Ana Beatriz Graça Duarte por ter me ensinado os primeiros passos metodológicos

para a realização desse estudo.

A minha equipe de trabalho Msc. Ivina Rocha Brito, Msc. Rebeca Magalhães Pedrosa

Rocha, Msc. Juliana Zani, Msc. Debora Sales, Denise Querreiro, Naiza Arcanjela que

me ensinaram e deram todo o suporte técnico para a realização desse trabalho.

A minha “mãe, pai e madrasta profissional”, Drs. Valdevane Rocha Araújo, Luis

Alberto Vieira e Carolina Maside Mielgo, a quem não tenho palavras para agradecer

toda ajuda durante o período de mestrado. Agradeço muito pela atenção e ensinamentos

sempre de forma carinhosa e amiga.

As minhas amigas Rebeca, Laritza e Naiza por me receber em suas vidas de forma tão

generosa. Agradeço pela amizade e por toda ajuda durante o tempo que estiveram no

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laboratório. Agradeço imensamente pelo ombro amigo, pelas histórias compartilhadas,

pelos risos divididos comigo.

Ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) da

UECE, por todo o suporte oferecido para realização deste estudo. E a toda equipe

LAMOFOPA que o compõe e já compôs: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, Dr.

Fabricio Sousa Martins, Dra. Ana Beatriz Graça Duarte, Dra.Carolina Maside Mielgo,

Dra. Jamily Bezerra Bruno, Dr. Carlos Henrique Lobo, Dr. Anderson, Dr. Cleidson

Manoel Gomes da Silva, Dra. Luciana Faustino, Dra. Giovanna Quintino Rodrigues,

Dra. Adeline de Andrade, Dra. Geovania Canafístula Carvalho, Simone Vieira Castro,

Gerlane Modesto, Francisco Léo, Juliana Zani, Débora Sales, Johanna Leiva, Jesús

Cadenas, Nathalie Jiatsa, Allana Pessoa, Patricia, Denise Guerreiro, Naiza Arcângela,

Victor Macedo, Érica Suzane, Livia Brunetti, Julian Pontes, Marcela Pinheiro Paz,

Lidiane Sousa, Renato Felix da Silva, Juliana Menezes, Luana Gaudêncio, Lorena

Andrade, José Arnaldo Moreira de Sousa, Alzenira de Andrade Ferreira, Adriana Maria

S. Albuquerque, Sr. João e Cezar pela convivência amistosa durante todos esses anos,

além de todos os conhecimentos transmitidos.

A minha família, agradeço pelo apoio, carinho e compreensão durante esses anos em

que estive ausente. Obrigado em especial a minha avó Vera Lucia Magalhães Vieira (in

memoriam) que foi e sempre será um exemplo de vida, alegria, dedicação e força. A

minha mãe Rosemeire Magalhães Vieira da Silva e ao meu Pai Carlos Henrique Correia

que foram meus exemplos de vida, caráter e dedicação.

A minha esposa Mônica Freitas Miranda Correia que foi a base mais sólida de

sustentação que eu poderia ter e que me deu todo apoio e ombro amigo para que eu

continuasse forte nesses dois anos de mestrado.

Finalmente, agradeço a todos que aqui não foram citados, mas ajudaram direta ou

indiretamente para que essa dissertação fosse feita.

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RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da pré-maturação in vitro com cilostamida

associada à parede folicular sobre a viabilidade e a cinética de maturação nuclear de

oócitos caprinos e bovinos. Complexos cumulus-oócitos foram maturados in vitro por

30 h (maturação in vitro convencional - Controle) ou submetidos à pré-maturação in

vitro com cilostamida (10 e 20 µM) por 6, 12 e 18 h associados à parede folicular

seguido de 24, 18 e 12 h de maturação in vitro. Os resultados mostraram que a

cilostamida a 10 µM (caprinos - 6 e 18 h, bovinos - 12 e 18 h) e 20 µM (bovinos - 6, 12

e 18 h) reduziu (P < 0,05) a percentagem de oócitos viáveis em comparação ao controle.

No que diz respeito à cinética de maturação, a cilostamida a 10 µM (caprinos - 6 e 18 h;

bovinos -12 e 18 h) e 20 µM (caprinos - 12 e 18 h; bovinos-6 e 12 h) causou um atraso

na progressão meiótica e reduziu (P < 0,05) a taxa de metafase II (MII). Por outro lado,

a exposição à cilostamida a 10 µM (caprinos - 12 h, bovino - 6 h) e a 20 µM (caprinos 6

h; bovino - 18 h) mostrou taxas de MII semelhantes a do controle. Em conclusão, a

cilostamida associada à parede folicular afeta de forma dependente da concentração e do

tempo de exposição a porcentagem de oócitos viáveis, bem como a cinética de

maturação de oócitos caprinos e bovinos.

Palavras-chave: Cilostamida, Pré-maturação, Parada meiótica, Caprino, Bovino.

9

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro pre-maturation with

cilostamide associated with follicular wall on viability and nuclear maturation kinetics

of caprine and bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes were either in vitro matured

for 30 h (conventional in vitro maturation - Control) or submitted to in vitro pre-

maturation with cilostamide (10 and 20 µM) for 6, 12 and 18 h associated with

follicular wall followed by 24, 18 and 12 h of in vitro maturation. The results showed

cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (bovine -

6, 12 and 18 h) significantly reduced the percentage of viable oocytes compared to the

control. Regarding to maturation kinetics, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h;

bovine -12 and 18 h) and 20 µM (caprine - 12 and 18 h; bovine-6 and 12 h) caused a

delay in the meiotic progression and significantly reduced the rate of metaphase II

(MII). On the other hand, the exposure to cilostamide at 10 µM (caprine - 12 h, bovine -

6 h) and 20 µM (caprine 6 h; bovine- 18 h) showed MII rates similar to the control. In

conclusion, the cilostamide associated with follicular wall affected by the concentration

and exposure time-dependent the percentage of viable oocytes and the kinetics of

maturation of caprine and bovine oocytes.

Keywords: Cilostamide, Pre-maturation, Meiosis arrest, Caprine, Bovine.

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LISTA DE TABELAS

Revisão de Literatura

Tabela 1. Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase..........................................22

Capítulo 1.

Table 1. Conventional IVM (control) and IVPM of caprine and bovine oocytes.

IVPM: In Vitro Pre-Maturation (cilostamide plus follicle walls). IVM: In Vitro

Maturation. Cilo: Cilostamide. FW: Follicular

wall……………………………………………………………………………36

Table 2. Percentages of viable caprine and bovine oocytes after IVPM with different

exposure time and concentration of cilostamide. Different lowercase letters

denote significant differences among the different exposure time, concentration

of cilostamide and control (P<0.05)…………………………………………37

Table 3. Meiotic stages of caprine and bovine oocytes after different time points of

IVM. Significant differences between different time of maturation in the same

line are indicated by uppercase letters

(P<0.05)……………………………………………………..………………...37

Table 4. Meiotic stages of caprine oocytes after IVPM with different exposure time and

concentration of cilostamide. Significant differences between treatments in the

same column are indicated by uppercase letters

(P<0.05)……………………………………..………………………………...38

Table 5. Meiotic stages of bovine oocytes after IVPM with different exposure time and

concentrations of cilostamide. Significant differences between treatments in the

same column are indicated by uppercase letters

(P<0.05)…………………………………..…………………………………...38

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LISTA DE ABREVIATURAS

ATP : Adenosina Trifosfato

BSA : Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)

°C : Graus Celsius

CaCl2 : Cloreto de cálcio

Calceína - AM : Calceína acetoximetil

CAPES : Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CNPq : Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

CO2 : Dióxido de Carbono

COCs : Cumulus–oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito)

DNA : Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)

Dr. : Doutor

Dra. : Doutora

EGF : Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal)

FSH : Hormônio Folículo Estimulante

G : Gauge

GH : Growth hormone (Hormônio do crescimento)

GV : Germinal vesicle (Vesícula germinal)

h : Horas

HC : Histologia clássica

ITS : Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio)

IGF-I :Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à

insulina - I)

IVC : In vitro culture (cultivo in vitro)

IVM : In vitro maturation (Maturação in vitro)

kg : Quilograma

LH : Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante)

LAMOFOPA : Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais

M : Molar

MAPK : Mitogen-activated protein kinase (Proteína quinase ativada por

mitógenos)

MEM : Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)

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MEM+ :Supplemented minimal essential medium (Meio essencial mínimo

suplementado)

mg : Miligrama

MI : Metaphase I (Metáfase I)

MII : Metaphase II (Metáfase II)

min : Minutos

mL : Mililitro

MOIFOPA : Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais

mRNA : Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)

Na+ : Íon sódio

ng : Nanograma

O2 : Oxigênio

p < 0.05 : Probabilidade de erro menor do que 5%

p. : Página

PPGCV : Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

RENORBIO : Rede Nordeste de Biotecnologia

RVG : Rompimento de vesícula germinal

SAS : Statistical analysis system (Sistema de análise estatística)

sec : Second (Segundo)

SD : Standard deviation (Desvio padrão)

SEM : Standard error of means (Erro padrão da média)

TE : Transferência de embriões

TCM-199 : Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199)

U : Unidade

UECE : Universidade Estadual do Ceará

VGBD : Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal)

α-MEM : Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)

μg : Microgramas

μL : Microlitro

μm : Micrômetro

µM : Micromolar

% : Porcentagem

~ : Aproximadamente

13

< : Menor

= : Igual

> : Maior

± : Mais ou Menos

≥ : Maior ou igual

SUMÁRIO

14

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 14

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 16

2.1 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE .............................................................. 16

2.2 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA ....................................................................... 17

2.2.1 Maturação citoplasmática ............................................................................ 17

2.2.2 Maturação nuclear ........................................................................................ 18

2.3 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) ................. 20

2.3.1 Co-cultivo de oócitos ................................................................................... 20

2.3.2 Co-cultivo com células somáticas ................................................................ 21

2.3.3 Co-cultivo com parede folicular e o bloqueio temporário da maturação . 21

2.4 FOSFODIESTERASES (PDES) ...................................................................... 22

2.4.1 Fosfodiesterases tipo 3 ................................................................................. 23

2.4.2 Fosfodiesterases tipo 4 ................................................................................. 24

3 JUSTIFICATIVA ............................................................................................ 25

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA .............................................................................. 27

5 OBJETIVOS .................................................................................................... 28

5.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 28

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................ 28

6 CAPÍTULO 1 ................................................................................................... 29

7 CONCLUSÃO .................................................................................................. 46

8 PERSPECTIVAS ............................................................................................. 47

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 48

14

1. INTRODUÇÃO

A maturação de oócitos de mamíferos é um processo complexo que envolve a

sincronização entre a maturação citoplasmática e maturação nuclear. A maturação

citoplasmática consiste na reorganização das organelas intracelulares, no

armazenamento de RNA, proteínas e fatores de transcrição, enquanto que a maturação

nuclear envolve principalmente a segregação cromossômica (WATSON, 2007; MAO et

al., 2014).

Oócitos maturados in vitro apresentam uma redução na capacidade de completar

a maturação citoplasmática e retomar a meiose, simultaneamente, limitando seu

potencial de desenvolvimento (CHIAN et al., 2004). Esta assincronia é devido a

maturação nuclear espontânea que leva a condensação da cromatina, impedindo assim a

síntese de RNA e o acúmulo de várias moléculas essenciais para o desenvolvimento

precoce (BILODEAU; COTÊ, 2012). A utilização de estratégias para regular o ciclo

celular meiótico seria uma alternativa útil para evitar essa assincronia entre a maturação

nuclear e citoplasmática.

Nos últimos anos, alguns estudos têm demonstrado que o monofosfato de

adenosina cíclico (AMPc) desempenha um papel fundamental na manutenção da parada

meiótica em mamíferos (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002).

CONTI et al. (2002) verificaram que o aumento dos níveis intra-oocitários de AMPc é

essencial para manter a parada meiótica in vitro, melhorando a sincronização entre a

maturação nuclear e a citoplasmática (NOGUEIRA et al., 2003). Além disso,

numerosos estudos sugerem que, durante a maturação, o bloqueio temporário pode

sincronizar a maturação nuclear e citoplasmática, quer in vivo (WIERSMA et al., 1998)

ou in vitro (vaca, MAYES et al, 2002; THOMAS et al., 2002; macaco JENSEN et al.,

2002; camundongo, COTICCHIO et al., 2004). O mecanismo mais aceito atualmente

sobre o bloqueio meiótico está diretamente relacionado a elevadas concentrações intra-

oocitárias de AMPc, reguladas pela atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e

as fosfodiesterases (PDE). Essas enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de

AMPc, respectivamente (FIMIA; SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002).

Em oócitos humanos, a parada temporária da maturação nuclear com a

cilostamida, um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (iPDE3), tem provado ser benéfica

para obter a configuração do fuso meiótico e cromossomas normais após a maturação in

15

vitro (MIV), resultando na sincronização de oócitos no estágio de vesícula germinal

(VG) (VANHOUTTE et al., 2007). Além disso, a utilização de iPDE3 a 10 µM por 24 h

de pré-maturação aumentou as taxas de maturação nuclear sem comprometer o

desenvolvimento embrionário humano (NOGUEIRA et al., 2006). Complexos cumulus

oócitos (CCOs) de bovinos co-cultivados com parede folicular por 24 h mantiveram

todos os seus oócitos no estágio de VG (LOOS et al., 1994). Em suínos, iPDE3 a 1µM

por 24 h de pré-maturação melhorou a capacidade de desenvolvimento de oócitos

maturados in vitro (DIECI et al., 2013) e aumentou as taxas de fertilização e

desenvolvimento embrionários.

Tendo em vista a importância do presente estudo, a revisão de literatura a seguir

abordará aspectos relacionados à oogênese e foliculogênese, competência oocitária, co-

cultivo celular durante a MIV e o papel das enzimas fosfodiesterases (PDEs) na

maturação.

16

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE

A oogênese consiste na formação e diferenciação das células germinativas

primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado. Este processo inicia-se

antes e termina após o processo de foliculogênese (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005).

As CGP migram para a crista genital e colonizam a gônada ainda indiferenciada, onde

recebem a denominação de oogônias e começam a multiplicar-se por divisões mitóticas.

Posteriormente, as oogônias entram na primeira divisão meiótica e param no estádio de

diplóteno, sendo chamadas de oócitos primários, os quais apresentam-se com seus

núcleos em vesícula germinativa (VG) (FIGUEIREDO et al., 2008). Nessa fase, os

oócitos são circundados por uma camada de células da pré-granulosa e são denominados

folículos primordiais. O folículo, por sua vez, é considerado a unidade morfofuncional

do ovário, cuja função é proporcionar um ambiente adequado para o crescimento e

maturação do oócito, mantendo sua viabilidade (CORTVRINDT; SMITZ, 2001).

A foliculogênese é um processo complexo que envolve a formação, crescimento

e maturação folicular sob a ação de hormônios e fatores de crescimento. O processo de

foliculogênese tem seu início com a formação dos folículos primordiais, culminando

com a formação dos folículos pré-ovulatórios ou de De Graaf (FIGUEIREDO et al.,

2008; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Durante o seu desenvolvimento, a estrutura

folicular sofre alterações devido ao crescimento oocitário, diferenciação e multiplicação

das células da granulosa (HONDA et al., 2007), sendo os folículos classificados em pré-

antrais (primordial, primário e secundário) e antrais (terciários e pré-ovulatórios)

(FIGUEIREDO et al., 2008).

Na maioria das espécies, os folículos pré-ovulatórios são caracterizados por

apresentarem um oócito maturo no momento da ovulação. A maturação oocitária

consiste em uma etapa crucial pela qual o oócito sofre modificações citoplasmáticas,

completa sua primeira divisão meiótica (maturação nuclear), progredindo até a metáfase

II (MEHLLMANN, 2005). Este processo é composto por inúmeras modificações

estruturais e moleculares no citoplasma (maturação citoplasmática). Didaticamente, essa

maturação citoplasmática pode ser subdivida em: redistribuição das organelas, dinâmica

dos filamentos do citoesqueleto e maturação molecular.

17

2.2 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA

A competência oocitária é a capacidade do oócito assegurar o desenvolvimento

embrionário após a fecundação. Ela é adquirida de maneira gradual e sincronizada ao

longo da maturação oocitária que culmina com a configuração cromossômica em

metáfase II – MII. A maturação oocitária pode ser dividida em maturação

citoplasmática, nuclear e molecular. A maturação citoplasmática engloba todas as

mudanças estruturais e a distribuição e organização das organelas citoplasmáticas. A

maturação nuclear corresponde ao processo de reversão do primeiro bloqueio meiótico

do oócito em estádio de vesícula germinal (VG) até o segundo bloqueio meiótico em

estádio de MII. Já a maturação molecular corresponde ao legado de instruções

acumuladas durante a fase de VG que controla tanto a maturação nuclear, quanto a

citoplasmática (SIRARD, 2001).

2.2.1 Maturação Citoplasmática

A maturação citoplasmática compreende as mudanças estruturais e

organizacionais das organelas que ocorrem no citoplasma do oócito, iniciando no

estágio de VG e culminando no estágio de MII. Ela envolve uma série de eventos

complexos, incluindo a síntese de proteínas e de RNA citoplasmático. A maturação

citoplasmática pode ser avaliada pela distribuição das organelas, reorganização das

mitocôndrias no citoplasma, complexo de Golgi e grânulos corticais (MAO et al.,

2014). No oócito imaturo de suínos, bovinos, camundongos e humanos, as mitocôndrias

e o complexo de Golgi estão concentrados em torno da VG, afastando-se da região

perinuclear na ruptura da vesícula germinal (RVG) e ocupando a maior parte do volume

do oócito em MII (oócitos maduros) (CRAN, 1985; FAIR, 1995; MAO et al., 2014).

Além disso, o número de complexos de Golgi, também aumenta com o diâmetro do

oócito. Localizados um pouco mais concentrados no interior do oócito produzem

grânulos corticais durante o crescimento oocitário (AUSTIN, 1956). Esses grânulos são

dispersos aleatoriamente ao longo do citoplasma dos oócitos imaturos e migram para a

região cortical do citoplasma durante a maturação meiótica em suínos (YOSHIDA et al.,

1993) e bovinos (HOSOE; SHIOYA, 1997). Esta mudança de direção dos grânulos

corticais é talvez o sinal mais facilmente observado na maturação citoplasmática.

18

As funções do reticulo endoplasmático (RE) estão relacionadas ao enovelamento

de proteínas e metabolismo de lipídios, sendo o RE a principal reserva interna de íons

de cálcio. O RE sofre redistribuição e mudanças estruturais durante a maturação do

oócito. Em camundongos, in vivo na fase VG o RE é uniformemente distribuído ao

longo do ooplasma (MANN et al., 2010), migrando para as regiões corticais em

pequenos grupos ao longo do citoplasma ao atingir MII (MEHLMANN et al., 1995;

KLINE, 2000; FITZHARRIS; BALTZ 2006; MAO et al., 2014).

Outro aspecto que pode ser utilizado para predizer a competência citoplasmática

é o diâmetro do oócito, devido ao aumento do volume citoplasmático durante o

crescimento folicular. Em suínos, oócitos com diâmetro menor que 100 µm são

incompetentes, porém, aqueles que atingem diâmetro igual ou superior a 110 µm

possuem capacidade para alcançar a competência meiótica (MORBECK et al., 1992).

Igualmente, a avaliação desse processo pode ser feita de forma indireta através dos

aspectos morfológicos, tais como a expansão das células do cumulus (SANTIQUET et

al., 2014).

A expansão do cumulus é um mecanismo independente da maturação

citoplasmática e nuclear do oócito. Entretanto, a ausência ou o pequeno número de

células de cumulus afeta negativamente a taxa de desenvolvimento embrionário em

bovinos (BLONDIN; SIRARD, 1995; LISLE et al., 2003). As interações entre as

células do cumulus e os oócitos é, portanto, contínua e essencial para a competência ao

desenvolvimento embrionário. Muitos autores consideram que a melhor forma de

avaliar a maturação é dada pela submissão do oócito maduro à fecundação, clivagem e

posterior desenvolvimento embrionário e fetal (KRISHER, 2004). Portanto, a

maturação citoplasmática deve ser interpretada como sendo um processo de capacitação

gradual (FERREIRA et al., 2009), produzindo uma estrutura fertilizável.

2.2.2 Maturação Nuclear

Maturação nuclear refere-se ao processo de reversão do primeiro bloqueio

meiótico do oócito em estádio de VG até o segundo bloqueio meiótico em estádio de

MII. A fase de VG é mantida por vários anos no animal, sendo seu mecanismo ainda

um mistério. A retomada da meiose de oócitos inclusos em folículos antrais grandes in

vivo ocorre durante o pico do Hormônio Luteinizante (LH) (HYTTEL et al., 1986),

19

enquanto que se cultivados in vitro, os oócitos podem retomar espontaneamente a

meiose (PINCUS; ENZMANN, 1935). O primeiro sinal de retomada da meiose é a

etapa de RVG (SZOLLOSI et al., 1972). No entanto, a maturação nuclear continua a sua

progressão para metáfase I (MI), sofrendo uma nova parada em MII, permanecendo

assim até a fecundação.

Os estágios de maturação nuclear podem ser classificados de acordo com sua

configuração nuclear (LANDIM-ALVARENGA; CHOI, 1999), a saber; o estágio de

VG é caracterizado pela presença de um núcleo esférico rodeado por uma membrana

nuclear integra e cromatina descondensada; RVG é a fase intermediária da maturação

nuclear onde ocorre a primeira retomada da meiose, havendo condensação

cromossômica e a desintegração da membrana nuclear; MI é caracterizada pela presença

de uma placa metafásica localizada perifericamente no ooplasma; MII ou maturação

nuclear é caracterizada pela presença dos cromossomos metafásicos na periferia do

ooplasma, bem como pela extrusão do primeiro corpúsculo polar.

2.2.3 Maturação Molecular

Maturação molecular consiste na transcrição, estoque e processamento de

RNAm que serão traduzidos em proteínas através dos ribossomos. Sendo, diretamente

relacionada com os processos de maturação e subsequentes eventos celulares, tais como

fertilização, formação de pró-núcleos e a fase inicial da embriogênese (CROCOMO et

al., 2013).

A transcrição e estoque de RNAm ocorre durante a fase de foliculogênese,

período em que o núcleo encontre-se quiescente, cessando com a retomada da meiose.

A maior parte de RNAm apresenta-se no ooplasma em forma inativa, após a ação de

sinais específicos gerados durante a maturação, fertilização e desenvolvimento

embrionário ocorre o início da tradução do RNAm. Assim, o sucesso do

armazenamento e reativação do RNAm, determina a competência do oócito para

suportar seus posteriores estágios de desenvolvimento (GOTTARDI; MINGOTI, 2009).

20

2.3 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV)

Conforme mencionado anteriormente é bem conhecido que os oócitos

necessitam atingir a maturação citoplasmática, bem como a maturação nuclear para se

tornarem capazes de assegurar a fecundação e o desenvolvimento do embrião

(MERMILLOD et al., 1999; TROUNSON; PERA, 2001).

Com o intuito de melhorar ainda mais as taxas de MIV, diferentes tipos celulares

têm sido utilizados para enriquecer os meios de cultivo in vitro. Oócitos suínos,

humanos e de camundongos já foram maturados in vitro utilizando células do próprio

folículo ovariano (células da granulosa ou da teca) (CASILLAS et al., 2014) ou de

outros tecidos, tais como células do oviduto (CHAN et al., 2013), células endoteliais e

fibroblastos (KARIMPOUR MALEKSHAH et al., 2014), ou mesmo o próprio oócito

(SUDIMAN et al., 2014). Maiores detalhes sobre esses sistemas de co-cultivo serão

descritos a seguir.

2.3.1 Co-cultivo de oócitos

O crescimento e o desenvolvimento durante a fase antral são dependentes do

contato íntimo dos oócitos com as células do cumulus, as quais desempenham uma

função crucial na secreção de fatores de crescimento, regulando a comunicação

bidirecional entre ambos (GILCHRIST et al., 2008). Dentre esses fatores, podemos citar

o fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) e proteína morfogenética óssea 15

(BMP-15), os quais são membros da superfamília TGF-β e na maioria das espécies são

encontrados exclusivamente no oócito (CRAWFORD; MCNATTY, 2012). Estudos têm

demonstrado que fatores secretados pelo próprio oócito aumentam a capacidade de

desenvolvimento de complexos cumulus-oócitos (CCOs) bovinos obtidos a partir de

ovários de matadouros (HUSSEIN et al., 2006).

VANDERHYDEN (1993) demonstrou que a regulação da expansão do cumulus

é diferente em suínos e camundongos. A expansão das células do culmulus em CCOs

suíno in vitro não é dependente do oócito, ao contrário da espécie murina

(PROCHÁZKA et al, 1991). Os oócitos mantêm um microambiente altamente

especializado, através de sinais parácrinos (LI et al., 2000). XIA et al. (1994) relataram

que os fatores secretados pelas células do cumulus, durante o co-cultivo de oócitos

21

desnudos, induzem a maturação nuclear e citoplasmática. Este microambiente aumenta

o número de oócitos com maturação citoplasmática e nuclear, o que assegura o

desenvolvimento embrionário precoce (GILCHRIST et al., 2004).

2.3.2 Co-cultivo com células somáticas

As células do cumulus podem promover a maturação citoplasmática de oócitos

ao longo do desenvolvimento folicular na fase antral, pois é durante este estágio que os

oócitos vão gradualmente adquirindo competência (LI et al., 2000). Especula-se que

alguns fatores secretados pelas células do cumulus, tais como o GDF-9 e a BMP-15

podem agir no oócito auxiliando a maturação dos oócitos co-cultivados com

monocamadas de células do cumulus (FENG et al., 2013), promovendo a sua

competência para o desenvolvimento embrionário subsequente (JU; RUI, 2012).

Visando mimetizar o microambiente natural do trato reprodutivo e produzir

fatores antioxidantes para neutralizar espécies reativas de oxigênio, vários tipos de

células têm sido utilizados em monocamadas, favorecendo a nutrição dos embriões

cultivados in vitro (JOO et al., 2001; JOHNSON et al., 2008; OMAR FAROUK;

VLAD, 2008). Desta forma, a utilização de células somáticas, independentemente de

sua origem, tem um papel importante na produção de embriões viáveis.

2.3.3 Co-cultivo com parede folicular e o bloqueio temporário da maturação

Acredita-se que o baixo desenvolvimento de oócitos maturos in vitro é devido à

assincronia entre maturação nuclear e citoplasmática (EPPIG et al., 1994). Diante disso,

numerosos estudos sugerem que o bloqueio temporário da meiose pode sincronizar a

maturação nuclear e citoplasmática, tanto in vivo (WIERSMA et al., 1998) quanto in

vitro (ratos: TSAFRIRI et al., 1996; COTICCHIO et al., 2004, bovinos: MAYES et al.,

2002; THOMAS et al., 2002; macaco: JENSEN et al., 2002). Portanto, o conhecimento

sobre o processo de bloqueio meiótico da maturação oocitária é fundamental para o

aprimoramento de técnicas eficazes na produção in vitro de embriões.

O mecanismo mais aceito atualmente sobre o bloqueio meiótico está diretamente

relacionado a elevadas concentrações intra-oocitárias de AMPc, reguladas pela

atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e as fosfodiesterases (PDE). Essas

22

enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de AMPc, respectivamente (FIMIA;

SASSONE-CORSI, 2001; CONTI et al., 2002). Pelo menos 11 isoenzimas de PDE já

foram identificadas (MANGANIELLO et al, 1995; SODERLING; BEAVO, 2000).

Entretanto, apenas as PDE do tipo 1, 3, 4, 8 e 9 estão localizadas nos compartimentos

foliculares. A PDE3 está principalmente envolvida no metabolismo de AMPc em

oócitos, enquanto que a PDE4 está envolvida no metabolismo do AMPc nas células da

granulosa (CONTI et al., 2002; SASSEVILLE et al., 2006). Considerando essas

características, LOOS et al (1994) utilizaram paredes de folículos antrais imaturos (3-6

mm) bovinos como protocolo para o bloqueio da meiose, mantendo os oócitos em

estádio de vesícula germinal intacta, permitindo a sincronização das maturações

citoplasmática e nuclear, (LOOS et al., 1994). Desta forma, a presença da PDE 4 pode

ter favorecido o bloqueio da progressão da meiose.

2.4 FOSFODIESTÉRASES (PDES)

Fosfodiesterases - PDEs são enzimas que degradam nucleotídeos cíclicos

intracelulares, o AMPc ou o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), inativando-os.

Em mamíferos, estas enzimas compreendem atualmente uma família de onze

fosfodiesterases (tabela 1) (CONTI, 2000). Elas estão presentes em todos os órgãos,

incluindo o coração, os pulmões, os olhos, o cérebro e tecidos eréteis. As PDEs podem

hidrolisar AMPc e GMPc. As PDEs 4, 7 e 8 são enzimas que degradam AMPc (CONTI,

2000; SODERLING; BEAVO, 2000) e as PDEs 5, 6 e 9 degradam GMPc. Já as PDEs

1, 2, 3, 10 e 11 degradam tanto o AMPc como o GMPc (BEAVO, 1995; CONTI, 2000;

SODERLING; BEAVO, 2000).

Cinco das onze famílias das PDEs estão presentes nos ovários: PDE1, PDE3,

PDE4, PDE8 e PDE9 (BEAVO, 1995; CONTI, 2000; CONTI; JIN, 1999; CONTI et al.,

1991; FISHER et al., 1998; GILULA et al., 1978). A PDE1 está presente nas células da

granulosa e células da teca em ratos (CONTI et al., 1984) e no oócito de camundongos

(BORNSLAEGER et al., 1984). Entretanto, a expressão da PDE3 foi relatada

unicamente no oócito (NOGUEIRA et al., 2003; JENSEN et al., 2002; RICHARD et al.,

2001; TSAFRIRI et al., 1996; REINHARDT et al., 1995) ao contrário da PDE4 que é

expressa tanto nas células da granulosa como nas células da teca (TSAFRIRI et al.,

1996).

23

Tabela 1: Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase (Francis et al., 2001). Família Inibidores PDE1 Vinpocetine, Zaprinast e SCH5 1866 PDE2 EHNA PDE3 Cilostamine. Milrinone, Amrinone, Enoximone e Lixazinone PDE4 Rolipram, RO 20-111724, Denbufyline e Sadarverine PDE5 Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021, SCH5 1866 e GF248 PDE6 Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021 e GF248 PDE7 Benzothieno-et benzothiadiazine dioxides PDE8 Dipyridamole e (IBMX - insensible) PDE9 Zaprinast e (IBMX - insensible) PDE10 Papaverine PDE11 Zaprinast e Dipyridamole

2.4.1 Fosfodiesterase tipo 3

As fosfodiesterases do tipo 3 degradam AMPc em 5'-AMP. Contudo, esta é a

única família de fosfodiesterases que é bloqueada pela ação do GMPc (REINHARDT et

al., 1995). A PDE3 tem dois genes que codificam para as enzimas A (A1, A2 e A3:

CHOI et al., 2001; SHITSUKAWA et al., 2001) e B (3B: DEGERMAN et al., 1997). A

PDE 3A e 3B têm a mesma organização estrutural. Estas duas formas são expressas e

reguladas em diferentes tipos celulares. Por exemplo, o PDE3A encontrada nas

plaquetas, no coração (OKRUHLICOVA et al., 1,996) e na placenta (CHOI et al.,

2001). O PDE3A está envolvida na agregação plaquetária (FEIJGE et al., 2004) e no

controle da contração cardíaca (HERRING et al., 2001). Já a PDE3B é encontrada nos

adipócitos, promovendo a sua diferenciação (TAIRA et al., 1993), nas células

pancreáticas β (HARNDAHL et al., 2002), nos mecanismos da lipólise e da glicólise,

bem como na regulação da ingestão de nutrientes, no hipotálamo em resposta à leptina

através PI-3kinases (ZHAO et al., 2002). Ambas PDE3 A e B estão também envolvidas

no relaxamento das células do musculo liso vascular (REINHARDT et al., 1995;

UCKERT et al., 2004).

A PDE3A é a forma predominante expressa em oócitos de mamíferos. No

folículo ovariano, a PDE3 foi localizada em oócitos de camundongos (TSAFRIRI et al.,

1996; SHITSUKAWA et al., 2001), macacos (JENSEN et al., 2002) e humanos

24

(NOGUEIRA et al., 2003). Para promover a parada meiótica dos oócitos pode ser usado

inibidores não-específicos (DEKEL; BEERS, 1978; 1980) ou o uso de inibidor

específico da PDE-3 (TSAFRIRI et al., 1996; WIERSMA et al., 1998). A inibição desta

enzima bloqueia o recomeço da meiose in vitro e in vivo em camundongos (TSAFRIRI

et al., 1996; WIERSMA et al., 1998), bem como sua utilização aumenta a taxa de

formação de blastocistos, promovendo o desenvolvimento embrionário em

camundongos (NOGUEIRA et al., 2003).

2.4.2 Fosfodiesterase tipo 4

A família da fosfodiesterase tipo 4 tem uma afinidade elevada para a hidrólise de

AMPc. Ela é encontrada nos pulmões (TOWARD; BROADLEY, 2004), cérebro ou

neurônios corticais (D'Sa et al., 2002). Elas são codificadas por quatro genes: PDE4 A,

B, C e D. Há mais de 20 variantes de PDE4 presentes em células do ovário. No folículo

de camundongos, utilizando a hibridação in situ revelou-se a presença de PDE4B nas

células da teca, enquanto PDE4D foi encontrada nas células da granulosa (TSAFRIRI et

al., 1996).

Camundongos knockout para PDE4D apresentaram uma taxa muito baixa de

fertilidade, bem como diminuição da taxa de ovulação em comparação com

camundongos selvagens (JIN et al., 1999) provavelmente devido à diminuição da

expressão do gene durante a diferenciação em células da granulosa (JIN et al., 1999;

RICHARD et al., 2003). Em todos os casos, a expressão in vivo de PDE4D é importante

para a diferenciação normal de células da granulosa e uma taxa normal de ovulação e

fertilização.

25

3. JUSTIFICATIVA

A execução de um projeto de pesquisa com enfoque na biotecnologia da

reprodução animal se justifica pela importância do modelo animal, do protocolo

escolhido, bem como na provável contribuição original dos resultados obtidos para a

ciência. De forma sucinta será abordado a seguir os três aspectos da justificativa

mencionados acima.

1. Escolha da espécie:

As espécies caprina e bovina são de grande interesse sócio-econômico no Brasil,

em função de seu importante papel na produção de carne, pele e leite, bem como

modelo experimental para animais que estão em risco de extinção, apresentam alto valor

genético ou ainda em humanos.

2. Escolha da técnica de pré-maturação in vitro:

A remoção dos complexos cumulus oócitos do ambiente ovariano pode provocar

o reinício precoce da maturação nuclear, sem que a maturação citoplasmática tenha

ocorrido, consequentemente diminuindo sua competência ao desenvolvimento. Frente a

esse problema a técnica de pré-maturação in vitro visa retardar a maturação nuclear

permitindo sua sincronização com a maturação citoplasmática. Assim torna-se

potencialmente possível obter uma população homogênea de oócitos no mesmo estágio

de maturação, aumentando, de forma significativa, a quantidade de oócitos competentes.

Além disso, esta técnica permite a flexibilização do tempo de transporte de oócitos do

campo ao laboratório, preservando sua viabilidade. Ainda, no que diz respeito à oócitos

inclusos em folículos pré-antrais crescidos in vitro, essa técnica pode auxiliar a elevar as

taxas de maturação impedindo que os oócitos retomem a meiose durante o cultivo in

vitro.

3. Originalidade do trabalho:

Até o presente momento diversos inibidores foram testados no intuito de retardar

o reinicio da maturação nuclear em bovinos. Entretanto, a associação destes inibidores

com a parede folicular ainda não foi testado. Além disso, em caprinos não existem

estudos utilizando protocolos de pré-maturação utilizando inibidores da retomada da

26

meiose. Portanto, a originalidade deste trabalho foi à investigação dos efeitos in vitro da

pré-maturação com cilostamida associada à parede folicular sobre a cinética de

maturação e viabilidade in vitro de oócitos caprinos e bovinos.

27

4. HIPÓTESE CIENTÍFICA

- A utilização de um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (cilostamida) associada à parede

folicular afeta de forma concentração e tempo de exposição dependentes o percentual de

oócitos viáveis e a cinética de maturação oocitária em caprinos e bovinos.

28

5. OBJETIVOS

5.1. Geral:

- Estudar a cinética de maturação in vitro em oócitos caprinos e bovinos.

- Avaliar o efeito da cilostamida associada à parede folicular durante a pré-maturação

sobre a taxa de viabilidade oocitária e a cinética de maturação nuclear.

3.2. Específicos:

- Determinar as taxas de VG, RVG, MI e MII após 6, 12, 18 e 30 horas de maturação in

vitro nas espécies caprina e bovina.

- Investigar o efeito de duas concentrações de cilostamida (10 µM e 20 µM) e tempos de

exposição (6, 12 e 18 horas) durante a pré-maturação in vitro sobre as taxas de

viabilidade e maturação oocitária.

29

6. CAPÍTULO 1

Cilostamida afeta de modo concentração e tempo de exposição dependente a

viabilidade e a cinética da maturação in vitro de oócitos caprinos e bovinos

Cilostamide affects in a concentration and exposure time dependent manner the viability

and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes

Artigo submetido ao periódico: Animal Reproduction

Em: novembro de 2014

30

Cilostamide affects in a concentration and exposure time dependent manner the

viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes

H.H.V. Correia¹*, L.A. Vieira¹, C.M. Mielgo¹, V.R. Araújo¹, R.M.P. Rocha¹, N.A. Ribeiro de

Sá¹, A.P.R. Rodrigues¹, J.R. Viana², J.R. Figueiredo¹

¹ Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA -

www.lamofopa.com.br) - State University of Ceará (UECE) - +55 (85) 3101.9852.

² Federal University of Ceará - Sobral, Brazil

* Corresponding author: correiahudson@yahoo.com.br

Phone/Fax: +55(85)8578-8684.

31

Abstract

The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro pre-maturation with

cilostamide associated with follicular wall on viability and nuclear maturation kinetics

of caprine and bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes were either in vitro matured

for 30 h (conventional in vitro maturation) or submitted to in vitro pre-maturation with

cilostamide (10 µM and 20 µM) for 6, 12 and 18 h associated with follicular wall

followed by 24, 18 and 12 h of in vitro maturation. The results showed cilostamide at 10

µM (caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (bovine - 6, 12 and 18 h)

significantly reduced the percentage of viable oocytes compared to the control.

Regarding to maturation kinetics, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h; bovine -

12 and 18 h) and 20 µM (caprine - 12 and 18 h; bovine-6 and 12 h) caused a delay in the

meiotic progression and significantly reduced the rate of metaphase II (MII). On the

other hand, the exposure to cilostamide at 10 µM (caprine - 12 h, bovine - 6 h) and 20

µM (caprine 6 h; bovine- 18 h) showed MII rates similar to the control. In conclusion,

the cilostamide associated with follicular wall affected in a concentration and exposure

time manner the percentage of viable oocytes and the kinetics of oocyte maturation in

caprine and bovine species.

Keywords: cilostamide, pre-maturation, meiosis arrest, caprine, bovine.

32

1. Introduction

The maturation of mammalian oocytes is a complex process involving

synchronization between cytoplasmic maturation which consists in the reorganization of

the intracellular organelles, the mRNA storage, proteins and transcription factors, and

nuclear maturation that involves mainly chromosome segregation (Watson, 2007; Mao

et al., 2014). In vitro matured oocytes are not able to complete cytoplasmic maturation

and resume meiosis simultaneously limiting their potential for development (Chian et

al., 2004). This asynchrony is due to the spontaneous nuclear maturation which leads to

chromatin condensation, thus preventing RNA synthesis and the accumulation of

several molecules essential for early development (Bilodeau, 2012). The use of

strategies to regulate the meiotic cell cycle would be a useful alternative to avoid the

asynchrony between nuclear and cytoplasmic maturation. It is believed that cyclic

adenosine monophosphate (cAMP) plays a fundamental role in the maintenance of

mammalian meiotic arrest. The increase of intra-oocyte levels of cAMP is essential to

maintain meiotic arrest in vitro (Conti et al., 2002) and improve the synchronization

between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003). In addition,

numerous studies suggested that during maturation, temporary blockage can

synchronize nuclear and cytoplasmic maturation, either in vivo (Wiersma et al., 1998) or

in vitro (bovine, Mayes et al., 2002; Thomas et al., 2002; monkey, Jensen et al., 2002

and mice, Coticchio et al., 2004). The temporary arrest of nuclear maturation of human

oocytes with the specific phosphodiesterase type 3 inhibitor (iPDE3) has proven to be

beneficial to obtain meiotic spindle configuration and normal chromosomes after the in

vitro maturation (IVM), and also resulted in synchronization of germinal vesicle (GV)

stage oocytes (Vanhoutte et al., 2007). In bovine cumulus oocyte complexes (COCs) co-

cultured with the follicular wall for 24 h maintained all of their enclosed oocytes in GV

stage (Loos et al., 1994). Furthermore, in human IVM, the use of iPDE3 at 10 µM for

24 h pre-maturation increased the rates of nuclear maturation without compromising

embryonic development (Nogueira et al., 2006). In porcine, iPDE3 at 1µM for 24 h pre-

maturation improved developmental competence of in vitro matured oocytes (Dieci et

al., 2013) and increased the fertilization and embryo development rates.

Despite the importance of the synchronization of cytoplasmic and nuclear

maturation reported in the aforementioned studies, there are no in vitro reports on the

33

utilization of cilostamide in caprine oocytes. Therefore, the aim of this study was to

evaluate the effect of pre-maturation with follicular wall associated with cilostamide,

at different concentrations (10 µM and 20 µM) and exposure times (6, 12 and 18 h), on

the viability and the kinetics of nuclear maturation of caprine and bovine oocytes.

2. Materials and methods

The reagents and chemical used in this study were obtained from Sigma

Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) unless otherwise indicated.

2.1. Source of ovaries

Ovaries (n = 80) of 40 adult crossbred cows and goats were collected at a local

slaughterhouse. Immediately post mortem, each pair of caprine and bovine ovaries was

washed twice in physiological saline solution (0,9% (w/v) NaCl) supplemented with

antibiotics (100 μg/mL kanamycin sulphate). Ovaries were transported to the laboratory

in an insulated container in physiological saline solution 0.9% at 33 °C within 4 h of

collection (Coy et al., 2008; Santiquet et al., 2014).

2.2. Collection and In vitro maturation of cumulus-oocytes complexes

In the laboratory, COCs were aspirated from medium-sized follicles (2-4 mm in

diameter in caprine and 4-6 mm in bovine) using 18-G needles connected to 10-mL

disposable syringes. Oocytes with a compact cumulus mass and a dark, evenly

granulated, cytoplasm were washed in 5 mL of tissue culture medium (TCM-199)

supplemented with 1% polyvinyl alcohol, 4.2 mM sodium bicarbonate, 10 mM HEPES,

2 mM glutamine, 50 UI/mL penicilin and 50 µg/mL streptomycin for bovine oocytes

and TCM-199 supplemented with 10 mM HEPES, 15% fetal calf serum (FCS) and 1%

antibiotics (streptomycin and penicillin) for caprine oocytes. Thus, COCs were washed

twice in the maturation medium without hormones previously equilibrated for at least 2

h at 38.5 ºC. The selected caprine and bovine oocytes were washed three times in the

maturation medium consisting of TCM-199 supplemented with 10% FCS, 0.2 mM

sodium pyruvate, 2 mM L-Glutamine, 0.05 μg/mL gentamicin, 10 UI/mL eCG and 10

34

UI/mL hCG for bovine oocytes. For caprine oocytes, the maturation medium was TCM-

199 supplemented with 1 mg/mL BSA, 1 mM/mL pyruvate, 0,5 µg/mL FSHr, 5 µg/mL

LH, 1 µg/mL 17β-estradiol, 10 ng/mL epidermal growth factor, 50 ng/mL insulin-like

growth factor 1 and 100 µM/mL cysteamine. Group of 25 to 30 oocytes were cultured

in 4-well multidish (Nunc, Roskilde, Denmark) containing 400 µL of maturation

medium for both species and incubated for 30 h at 39 °C and 5% CO2 in air.

2.3. Isolation of follicular walls

Follicles with 2-4 mm in caprine and 4-6mm in bovine were obtained by

isolation using forceps and scalpel blade. After isolation, follicles were divided into two

halves with a blade and transferred into petri dishes (35×10 mm; Corning, USA)

containing TCM-199 HEPES and antibiotics. After isolation, follicular walls (two

halves for each well) were co-cultured with COCs in medium supplemented with

cilostamide during in vitro pre-maturation as described further in the experimental

design.

2.4. Preparation of stock solutions of cilostamide

Cilostamide was diluted in dimethylsulfoxide at a concentration of 1.5 M and

stored at -20 ºC. These stock solutions were diluted in IVM medium to produce the final

concentrations of 10 mM/L or 20 mM/L.

2.5. Morphological evaluation

Only those COCs that showed an intact zona pellucida, bright and homogeneous

cumulus cells and no dark oocyte were selected. COCs were classified as degenerated

when the oocytes and surrounding cumulus cells appeared dark or if the oocytes were

misshapen.

35

2.6. Assessment of viability and nuclear chromatin configuration of caprine and

bovine oocytes after conventional in vitro maturation

After maturation for 6, 12, 18 and 30 h COCs were denuded mechanically by

repeated pipetting, with a pre-calibrated eyepiece micrometer using a stereomicroscope

(SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) at 100× magnification, assessed for viability and

nuclear chromatin configuration. The oocytes were labeled with 4 μM calcein-AM (488

nm), 2 μM ethidium homodimer-1 (568 nm) and 10 μM Hoechst 33342 (483 nm),

mounted on slides and examined using a fluorescence microscope (Nikon, Eclipse 80i,

Tokyo, Japan). The oocytes were considered viable when the cytoplasm positively

marked by calcein-AM in green and non-viable if the core is marked by ethidium

homodimer-1 in red. Calcein demonstrated the activity of intracellular esterases of

viable cells and the ethidium homodimer-1 marked the nucleic acids of non-viable cells

with ruptured membranes. Hoechst 33342 staining was used to assess of chromatin

configuration viewing of the stages of intact GV, the germinal vesicle breakdown

(GVBD), metaphase I (MI) and metaphase II (MII).

2.7. Experimental design

This experiment was conducted to evaluate the effect of in vitro pre-maturation

(IVPM) with different concentrations of cilostamide and exposure times on the viability

and chromatin configuration of caprine and bovine oocytes. The IVPM medium

consisted of IVM medium without hormones. Briefly, COCs were randomly allocated

in 4-well multidish plates containing IVM medium alone (control) or IVPM medium

supplemented with cilostamide (10 mM/L and 20 mM/L) both concentrations associated

with 2 halves of follicular walls. Thus, 20-30 oocytes were transferred to 400 µL of

IVPM in the multidish and incubated for 6, 12 and 18 h at 39 °C and 5% CO2 in air.

After the exposure times and the removal of cilostamide and follicular walls, the COC

were transferred to fresh IVM medium without cilostamide and follicular walls and

cultured for additional 24, 18 and 12 h, respectively totaling a maximum period of 30 h

of culture for all seven treatments (see Table 1). At the end of IVM, all COCs were

completely denuded using hyaluronidase, and the chromatin configuration and the

viability of their oocytes were evaluated.

36

Table 1. Conventional IVM (control) and IVPM of caprine and bovine oocytes.

Treatments IVPM (h) IVM (h) TOTAL (h)

Control

(Conventional IVM)

- 30 30

Cilo 10 µM

+

FW

6

12

18

24

18

12

30

30

30

Cilo 20 µM

+

FW

6

12

18

24

18

12

30

30

30

IVPM: In Vitro Pre-Maturation (cilostamide plus follicle walls). IVM: In Vitro

Maturation. Cilo: Cilostamide. FW: Follicular wall.

2.9. Statistical analysis

Data were analyzed as a dispersion of frequency by using Chi-square test (or

Fisher’s Exact Test when observed frequency was less than five). Differences were

considered significant when P<0.05, and the results were expressed as percentages.

3. Results

The rate of oocyte viability is shown in the Table 2. A total of 240 caprine and

235 bovine oocytes were evaluated. COCs exposed to 10 µM (caprine - 6 and 18 h;

bovine - 12 and 18 h) and 20 µM cilostamide (bovine - 6, 12 and 18 h) showed a

significant reduction in the percentage of viable oocytes compared to the control.

However, when COCs were exposed to 10 µM (caprine - 12 h; bovine - 6 h) and 20 µM

(caprine - 6, 12 and 18 h) no significant difference was observed.

37

Table 2. Percentages of viable caprine and bovine oocytes after IVPM with different

exposure time and concentration of cilostamide.

Oocyte survival (viable) (%)

Treatments IVPM Caprine Bovine

Control 0 100.00 (30/30)a 100.00 (25/25)a

10µM

cilostamide

6 74.29 (26/35)b 88.57 (31/35)ab

12 91.43 (32/35)ab 82.86 (29/35)b

18 80.00 (28/35)b 82.86 (29/35)b

20 µM

cilostamide

6 88.57 (31/35)ab 80.00 (28/35)b

12 97.14 (34/35)a 80.00 (28/35)b

18 88.57 (31/35)ab 80.00 (28/35)b

Different lowercase letters denote significant differences among the different exposure

times, concentrations of cilostamide and control (P<0.05).

Table 3. Meiotic stages of caprine and bovine oocytes after different time points of

IVM.

Meiotic stages

(%)

Time Points of IVM

6 12 18 30

Caprine

GV ------ ------ ------ ------

GVBD 20.00 (6/30)A 13.33 (4/30)A 13.33 (4/30)A ------

MI 60.00 (18/30)A 73.33 (22/30)A 20.00 (6/30)B 33.33 (10/30)B

MII 20.00 (6/30)B 13.33 (4/30)B 66.67 (20/30)A 66.67 (20/30)A

Bovine

GV ------ ------ ------ ------

GVBD 60.00 (15/25)A 16.00 (4/25)B ------ ------

MI 32.00 (8/25)A 44.00 (11/25)A 24.00 (6/25)A 32.00 (8/25)A

MII ------ 32.00 (8/25)B 76.00 (19/25)A 60.00 (15/25)A

Significant differences among different times of maturation in the same line are

indicated by uppercase letters (P<0.05).

Table 3 presents the percentage of caprine and bovine oocytes in different stages

of maturation (GV, GVBD, MI and MII) after different time points during conventional

IVM (6, 12, 18 and 30 h). In both species, the rates of MII were similar (P>0.05) after

18 and 30 h of maturation, being superior to 6 and 12 h of IVM (P<0.05).

38

Regarding to the maturation kinetics, the exposure to 10 µM cilostamide

(caprine - 6 and 18 h, bovine - 12 and 18 h) and 20 µM (caprine -12 and 18 h, bovine - 6

and 12 h) caused a delay in the meiotic progression and reduced significantly MII rates

(Table 4 and 5). On the other hand, the exposure to 10 µM (caprine - 12 h, bovine - 6 h)

and 20 µM (caprine - 6 h; bovine - 18 h) showed rates of MII similar to the control.

Table 4. Meiotic stages of caprine oocytes after IVPM with different exposure time and

concentration of cilostamide.

Table 4

Treatment Exposure time (h)

GV GVBD MI MII

Control 0 ------ 6.66 (2/30)a 26.67 (8/30)c 66.67 (20/30)a

10 µM 6 ------ 22.86 (8/35)a 31.43 (11/35)bc 20.00 (7/35)cd

10 µM 12 ------ 22.86 (8/35)a 17.14 (6/35)c 51.43 (18/35)a

10 µM 18 ------ 11.43 (4/35)a 57.14 (20/35)a 11.43 (4/35)d

20 µM 6 ------ 11.43 (4/35)a 34.29 (12/35)abc 42.86 (15/35)ab

20 µM 12 ------ 14.29 (5/35)a 45.71 (16/35)ab 37.14 (13/35)bc

20 µM 18 ------ 20.00 (7/35)a 45.71 (16/35)ab 22.86 (8/35)bcd

Significant differences among treatments in the same column are indicated by lowercase

letters (P<0.05).

Table 5. Meiotic stages of bovine oocytes after IVPM with different exposure time and

concentrations of cilostamide.

Treatment Exposure time (h)

GV GVBD MI MII

Controle 0 ------ ------ 32.00 (8/25)ab 68.00 (17/25)a

10 µM 6 ------ 5.71 (2/35)a 28.57 (10/35)b 54.29 (19/35)ab

10 µM 12 ------ 5.71 (2/35)a 42.86 (15/35)ab 34.29 (12/35)bc

10 µM 18 ------ 11.43 (4/35)a 48.57 (17/35)ab 22.86 (8/35)c

20 µM 6 ------ 2.86 (1/35)a 57.14 (20/35)a 20.00 (7/35)c

20 µM 12 ------ 2.86 (1/35)a 54.29 (19/35)a 22.86 (8/35)c

20 µM 18 ------ ------ 42.86 (15/35)ab 37.14 (13/35)abc

Significant differences among treatments in the same column are indicated by lowercase

letters (P<0.05).

39

4. Discussion

This study investigated for the first time the effects of IVPM with cilostamide

(different concentrations and exposure times) associated with the follicular wall on the

viability and kinetics of IVM of caprine oocytes. The results showed that the

concentration and exposure time of cilostamide affected the percentages of viable

oocytes and the kinetics of IVM in caprine and bovine species. Cilostamide is a

phosphodiesterase-3 inhibitor that has been used to block nuclear meiosis inducing its

synchronization with the cytoplasmic maturation of oocytes (Nogueira et al., 2003,

2006; Stouffer and Zelinski-Wooten, 2004; Vanhoutte et al., 2008). This inhibitory

effect of the phosphodiesterase-3 has been demonstrated in several species such as mice

(Nogueira et al., 2003), bovine (Albuz et al., 2010; Luciano et al., 2011) and human

(Nogueira et al., 2006).

Regarding to oocyte viability, the results showed that caprine oocytes exposed to

10 µM cilostamide associated with the follicular wall for 6 and 18 h decreased the

percentage of viable oocytes compared to the control. However, in bovine only 10 µM

cilostamide for 6 h did not reduce significantly the viability when compared to the

control. It is quite possible that these two species have different metabolic properties

and the tolerance to cilostamide (concentrations and exposure time), responding

disparately to the high level of cAMP within the oocyte (Bilodeau et al., 1993). With

regard to the kinetics of oocyte maturation, cilostamide at 10 µM (caprine - 6 and 18 h,

bovine - 12 and 18 h) and 20 µM cilostamide (caprine - 12 and 18 h, bovine - 6 and 12

h) caused a delay in the meiotic progression reducing significantly the MII rates.

Several studies have shown that exist a large variability of bovine oocytes in response to

the arrest of meiosis induced by cilostamide (Mayes and Sirard, 2002; Luciano et al.,

2011). Thomas et al, (2002) demonstrated meiotic arrest occurred when bovine COCs

and denuded oocytes were exposed to 50 µM cilostamide during 16 h of pre-IVM.

Although, the arrest of meiosis at MI with cilostamide can be possible in caprine, in

other species such as mice, there have been observed more than 90 % of the meiotic

arrest in GV stage (Vanhoutte et al., 2008). The reason for the diverse response to

cilostamide on meiotic arrest in different stage of development, in addition to the

species differences, could be due to the source of the oocytes. Caprine oocytes are

usually obtained from slaughterhouse ovaries being extremely heterogeneous in terms

40

of quality and development, unlike to the mouse oocytes recovery that is more

controlled (Thomas et al., 2002; Albuz et al., 2010).

The combination of concentration-exposure time to cilostamide seems to

influence markedly the rates of in vitro maturation. In ovine, the MII rates of oocytes

pre-matured for 22 h with 10 and 20 µM cilostamide were significantly lower than the

control (Gharibi et al., 2013). Nevertheless, when it was used a lower concentration (1

µM) no significant difference was observed when compared to the control. The present

study examined the kinetics (GV, GVBD, MI and MII) of IVM in caprine and bovine

oocytes after different culture periods (6, 12, 18 and 30 h). The results showed higher

rates of MII in caprine and bovine oocytes at 18 h of culture without any significant

increase in longer culture periods. Similar results were obtained by other authors, which

reported that the time required for IVM of bovine oocytes was 18-24 h (Sirard et al.,

1989; Wu et al, 1996; Dode and Adona, 2001; Merton et al., 2003). In contrast, caprine

oocytes required longer culture period (32 h) to complete IVM (Sharma et al., 1996).

In the present study, caprine oocytes exposed to 10 µM cilostamide for 12 h or

20 µM cilostamine for 6 h and pre-maturation bovine oocytes exposed to 10 µM

cilostamine for 6 h and 20 µM cilostamine for 18 h showed no significant difference in

the rates of maturation when compared to their respective controls without cilostamide.

We believed that this good result is due to the optimal combination of concentration-

exposure time to cilostamide with exposure times of 6 and 12 h during pre-maturation.

We suggest that in such conditions the presence of the inhibitor has provided adequate

cAMP levels (Conti et al., 2012) which could contribute to a better synchronization

between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003). In addition,

supporting this idea, Albuz et al. (2010) have reported some advantage of the PDE

inhibitors in pre-IVM, i.e., avoiding aging and the loss of oocyte and cumulus cells.

In conclusion, the combination of concentration-exposure time to cilostamide

associated with the follicular wall during pre-IVM influenced the viability and the

kinetics of IVM of caprine and bovine oocytes. Exposure to 10 µM cilostamide (caprine

- 12 h; bovine - 6 h) maintained survival rates and MII comparable to the control, and

may be used to increase in vitro embryo production in the future.

41

Acknowledgments

This research was supported by grants from the National Council for Scientific and

Technological Development (CNPq-79/2013 linha 3 – Rede Nordeste de Biotecnologia

(Rede de pesquisa do ovário artificial) – Processo N° 407594/2013-2). Hudson

Henrique Vieira Correia is the recipient of a grant from CNPq (Brazil). The authors

thank José Roberto Viana for donating cilostamide. Luis Alberto Vieira and Caroline

Maside Mielgo for assistance in manuscript preparation.

42

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46

7. CONCLUSÃO

Em conclusão, a combinação de concentração/tempo de exposição à cilostamida

associada com parede folicular durante a pré-MIV influenciou a viabilidade e a cinética

de MIV de oócitos caprinos e bovinos. A exposição a 10 µM de cilostamida (caprinos -

12 h; bovina - 6 h) manteve as taxas de sobrevivência e MII comparáveis ao controle

podendo ser potencialmente utilizadas no futuro como estratégia para aumentar a

produção in vitro de embriões no futuro.

47

8. PERSPECTIVAS

O presente trabalho definiu condições básicas (concentração e tempo de

exposição à cilostamida associada à parede folicular) para a pré-maturação in vitro de

CCOs caprinos e bovinos. A etapa seguinte será avaliar o efeito da pré-maturação nas

taxas de produção embrionária in vitro a partir de oócitos crescidos in vivo (aspiração

folicular) e in vitro (cultivo de folículos pré-antrais) caprinos e bovinos.

48

9.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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