rea de Concentrao: Engenharia de Alimentos

DESENVOLVIMENTO DE ADSORVENTES MONOLITICOS MACROPOROSOS

COM CONCANAVALINA A IMOBILIZADA PARA A PURIFICAO DE

LECTINAS

ITAPETINGA

BAHIA BRASIL

Fevereiro de 2016

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA UESB

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM

ENGENHARIA E CINCIA DE ALIMENTOS

Autora: Carilan Moreira Souza Santos

Orientador: Prof. Dr. Rafael da Costa Ilhu Fontan

2

CARILAN MOREIRA SOUZA SANTOS

DESENVOLVIMENTO DE ADSORVENTES MONOLITICOS MACROPOROSOS

COM CONCANAVALINA A IMOBILIZADA PARA A PURIFICAO DE

LECTINAS

ITAPETINGA

BAHIA BRASIL

Fevereiro de 2016

Dissertao apresentada como parte das exigncias para obteno do ttulo

de Mestre em Engenharia e Cincia de Alimentos no Programa de Ps-

Graduao em Engenharia e Cincia de Alimentos da Universidade

Estadual do Sudoeste da Bahia

Orientador: Prof. Dr. Rafael da Costa Ilhu Fontan

Co-orientadores: Prof. Dr. Renata Cristina Ferreira Bonomo

Prof. Dr. Leandro Soares Santos

3

543

S234d

Santos, Carilan Moreira Souza

Desenvolvimento de adsorventes monoliticos macroporosos com

concanavalina a imobilizada para a purificao de lectinas. / Carilan Moreira

Souza Santos. - Itapetinga: UESB, 2016.

78p.

Dissertao apresentada como parte das exigncias para obteno do ttulo

de Mestre em Engenharia e Cincia de Alimentos no Programa de Ps-

Graduao em Engenharia e Cincia de Alimentos da Universidade Estadual

do Sudoeste da Bahia. Sob a orientao do Prof. D.Sc. Rafael da Costa Ilhu

Fontan e co-orientao da Prof. D.Sc. Renata Cristina Ferreira Bonomo e Prof.

D.Sc. Leandro Soares Santos.

1. Lectinas. 2. Cromatografia de afinidade. 3. Criogel. I. Universidade

Estadual do Sudoeste da Bahia. Programa de Ps-Graduao em Engenharia e

Cincia de Alimentos. II. Fontan, Rafael da Costa Ilhu. III. Bonomo, Renata

Cristina Ferreira. IV. Santos, Leandro Soares. V. Ttulo.

CDD(21): 543

Catalogao na fonte:

Adalice Gustavo da Silva CRB/5-535

Bibliotecria UESB Campus de Itapetinga-BA

ndice Sistemtico para Desdobramento por Assunto:

1. Lectinas 2. Cromatografia de afinidade 3. Criogel

4

5

O incio da sabedoria a admisso da prpria ignorncia. Todo o meu saber consiste em

saber que nada sei. E o fato de saber isso, me coloca em vantagem sobre aqueles que acham

que sabem alguma coisa.

Scrates

6

Aos meus pais Joice e Carlos e a

minha irm Suian pelo incentivo e oraes.

Dedico!

7

AGRADECIMENTOS

Ao meu bom Deus, poder supremo sobre mim, pelas suas misericrdias infinitas em minha vida,

por me amparar em seus braos, iluminar meus caminhos e permitir-me superar todos os

obstculos para o alcance dessa vitria e a minha rainha, minha mezinha Maria que me

amparou em seu colo maternal nos momentos em que as foras me faltavam, intercedendo ao Pai

para que Suas graas me alcanassem.

Aos meus pais, Carlos e Joice, e a minha irm Suian, pelo apoio integral, pelas oraes e por

manter nossa relao sempre to especial. Muito do que fao e tudo o que sou, alicerado nesse

amor.

A todos da famlia e aos amigos, pelo incentivo e confiana depositada, entendendo minhas

ausncias e compartilhando as alegrias.

Associao Nossa Senhora das Dores, por terem honrado o ttulo de amigos, se tornando

minha famlia em Itapetinga; Vocs foram essenciais nessa trajetria, obrigada por transformar

minhas dores em sorrisos e me ensinar a prtica de amar a Jesus Cristo.

Por motivos que no caberiam aqui descrev-los, agradeo imensamente ao meu orientador

Rafael Fontan por todo suporte, pacincia, confiana, pela sabedoria compartilhada, pelo apoio e

orientao, deixo aqui registrado os meus sinceros agradecimentos.

s professoras Renata Bonomo e Sibelli Passini, agradeo de todo corao por terem me

amparado com tanto zelo nos momentos difceis, e por todo apoio concedido.

turma do LEP pelo companheirismo e amizade, tornando essa jornada mais leve e prazerosa.

A todos os funcionrios do modulo de laboratrio, por me acolherem sempre com muito carinho

e um sorriso terno!

Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), pela oportunidade e condies de

realizao do trabalho.

CAPES pela concesso da bolsa de estudo;

Fapesb e ao CNPq pelo apoio financeiro e incentivo a pesquisa.

Prof. Lizzy Verssimo pelo suporte nas anlises de microscopia eletrnica, pela prestatividade

e disponibilidade de participao na banca;

Prof Cristiane Veloso pelas contribuies ao longo do trabalho, pelas sugestes, colaborao

e participao nas bancas de qualificao e defesa da dissertao

Ao CETENE pelas anlises de espectroscopia FTIR

Finalmente quero agradecer a todos aqueles que contriburam de alguma maneira para essa

conquista. Deixo aqui o meu muito obrigada.

Se enxerguei mais longe, foi porque me apoiei sobre os ombros de gigantes

Isaac Newton

8

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS ............................................................................... 10

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................... 11

LISTA DE TABELAS .................................................................................................................... 12

RESUMO ....................................................................................................................................... 13

ABSTRACT ................................................................................................................................... 14

1. REFERENCIAL TERICO ..................................................................................................... 15

1.1 INTRODUO............................................................................................................................,,...15

1.2 REVISO DE LITERATURA .................................................................................................. 18

1.2.1 Glicoprotenas: Lectinas......................................................................................................,....18

1.2.1.1 Concanavalina A ...................................................................................................22

1.3 Mtodos de purificao...............................................................................................................24

1.3.1 Mtodo adsortivo ....................................................................................................... 27

1.3.1.1 Cromatografia lquida de afinidade (CLAF) ............................................................. 27

1.4 Monlitos Polimricos orgnicos................................................................................................30

1.4.1 Criogel monoltico supermacroporoso .......................................................................... 32

1.4.2 Criogel de poliacrilamida ............................................................................................... 34

1.5 Alterao na superfcie dos suportes cromatogrficos para imobilizao de protenas.......36

1.6 Funcionalizao dos criogis .....................................................................................................38

2 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................... 38

2.1 Objetivos especficos....................................................................................................................38

3. MATERIAL E MTODOS ....................................................................................................... 39

3.1 Produo da coluna monoltica..................................................................................................39

3.2 Ativaes dos monlitos..............................................................................................................40

3.2.1 Mtodo Epxi ................................................................................................................... 40

3.2.2 Mtodo da Base de Schiff ................................................................................................ 41

3.2.3 Mtodo do Glutaraldedo ................................................................................................ 41

3.2.4 Mtodo do Etilenodiamina ............................................................................................. 42

3.2.5 Mtodo da Dihidrazida Adpica ..................................................................................... 42

3.2.6 Incremento dos grupos epxi .......................................................................................... 43

3.3 Avaliao fsica, qumica e hidrodinmica................................................................................43

3.3.1 Capacidade de Inchamento ..................................................................................................... 44

3.3.2 Grau de expanso ..................................................................................................................... 44

3.3.3 Porosidade ................................................................................................................................. 45

3.3.4 Microscopia eletrnica de varredura ..................................................................................... 46

3.3.5 Espectroscopia FTIR ............................................................................................................... 46

9

3.3.6 Permeabilidade ao escoamento ............................................................................................. 46

3.4 Potencial de uso das colunas produzidas..................................................................................47

4. RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................................. 47

4.1 Caracterizao das matrizes de criogel....................................................................................50

4.1.1 Capacidade de inchamento e grau de expanso ............................................................ 52

4.1.2 Porosidade................................................................................................................................52

4.1.3 Estrutura dos poros por MEV...............................................................................................55

4.1.4 Espectroscopia FTIR ............................................................................................................. 55

4.1.5 Permeabilidade ao escoamento ............................................................................................ 57

4.1.6 Capacidade adsortiva de reutilizao das colunas .............................................................59

5. CONCLUSO ..................................................................................................................................60

6. REFERNCIAS ...................................................................................................................... 60

10

LISTA DE ABREVIATURAS E SMBOLOS

Abs Absorbncia

AAm Acrilamida

BSA Albumina de soro bovina

AGE Alil glicidil ter

A rea da seo transversal da coluna (m2)

S Capacidade de inchamento (g H2Og-1 criogel seco)

qmax Capacidade mxima de adsoro (mgmL-1 criogel)

L Comprimento da coluna (m)

CLAF Cromatografia lquida de afinidade

SDS Dodecil sulfato de sdio

Md Massa da amostra desidratada (kg)

Mc Massa da amostra comprimida (kg)

Mw Massa da amostra saturada com gua (kg)

MM Massa molecular

MEV Microscopia eletrnica de varredura

TEMED N,N,N,N-tetrametiletilenodiamino

MBAAm N,N- metileno-bis-acrilamida

i Parmetro do modelo

Kw Permeabilidade ao escoamento (m2)

APS Persulfato de amnio

Porosidade do criogel

pH Potencial hidrogeninico

q Quantidade de soluto adsorvido (mol.L-1)

Pw Queda de presso atravs da coluna (Pa)

Tris Tris(hidroximethil)aminometano

kDa 103 Dalton (Unidade de massa molecular)

Qw Vazo volumtrica ao escoamento (m2)

VC Volume de coluna

11

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Classificao das lectinas quanto estrutura ............................................................. 20

Figura 2: Representao estrutural da ConA.......................................................................... 23

Figura 3: Representao do monmero de Concanavalina .....................................................24

Figura 4: Etapas da cromatografia de afinidade em suportes contendo lectina imobilizada 29

Figura 5: Efeito da concentrao do polmero sobre a formao de poros nas colunas

cromatogrficas. ......................................................................................................................... 32

Figura 6: Representao da produo do criogel ...................................................................... 34

Figura 7: Imagem por microscopia eletrnica de varredura ..................................................... 35

Figura 8: Reao de crio-copolimerizao dos monmeros AAm, AGE e MBAAm para o

preparo do criogel. ...................................................................................................................... 36

Figura 9: Criogel de pAAm-AGE. ............................................................................................ 49

Figura 10: Micrografias dos criogis.......................................................................................55

Figura 11: Criogel com ConcA imobilizada utilizando-se o mtodo com epicloridrina.........56

Figura 12: Espectro FTIR dos criogis no ativados e com ConA imobilizada pelo mtodo

com

epicloridrina..............................................................................................................................57

Figura 13: Capacidade adsortiva em funo dos ciclos de uso da coluna avaliada ...............59

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificao das lectinas de plantas quanto ocorrncia. ...................................... 21

Tabela 2:Denominao de algumas lectinas............................................................................ 21

Tabela 3 - Tcnicas de separao usadas nas diferentes etapas de purificao de

biocompostos. ........................................................................................................................... 26

Tabela 4: Lectinas comumente usadas como ligantes em colunas cromatogrficas por

afinidade. .................................................................................................................................. 30

Tabela 5: Resultados de ativaes das colunas monolticas supermacroporosas .................... 49

Tabela 6: Capacidade de inchamento e grau de expanso das colunas ................................... 51

Tabela 7: Porosidade total e demais fraes constituintes dos monlitos produzidos. ........... 52

13

RESUMO

SANTOS, C. M. S. Desenvolvimento de adsorventes monolticos macroporosos com

concanavalina A imobilizada para a purificao de lectinas. Itapetinga BA: UESB,

2016. 78 p. dissertao. (Mestrado em Engenharia e Cincia de Alimentos, rea de

Concentrao em Engenharia de Alimentos).*

Tcnicas cromatogrficas esto entre as mais importantes nas estratgias de purificao de

biocompostos, sendo constante o desenvolvimento de novos adsorventes para tal uso. Nesse

sentido, ganha destaque a produo de monlitos, estruturas porosas, interconectadas, em

corpo nico. Monlitos polimricos podem ser produzidos a partir da mistura de monmeros

e um agente porognico, polimerizada in situ em um molde. A ampla variedade de

combinaes de monmeros e reagentes modificadores da superfcie permite que os

monlitos se adequem a diversos processos cromatogrficos de separao. Na presente

pesquisa foi avaliada a modificao de suportes monolticos macroporosos de poliacrilamida

por seis distintos mtodos de ativao, baseados na reatividade de radicais epxi presentes na

estrutura dos criogis e na formao de ligaes covalentes, para a imobilizao de

concanavalina A (ConA) visando ao seu uso na purificao de lectinas por cromatografia. Foi

avaliada a capacidade de imobilizao de ConA e aspectos fsicos e qumicos dos monlitos,

alm do seu potencial de uso para a adsoro de lectinas. Verificou-se que o incremento de

radicais epxi utilizando-se epicloridrina e a adio de braos espaadores com o uso do

glutaraldedo aumentaram a quantidade de ConA imobilizada, sendo que os monlitos

funcionalizados mantiveram a estrutura macroporosa predominante e baixa resistncia ao

escoamento. A capacidade adsortiva na melhor condio estudada foi superior a 100 mgde

lectina por grama de monlito desidratado, mantendo-se constante aps cinco ciclos de uso,

demonstrando a estabilidade do mesmo. Os resultados obtidos sugerem que os monlitos

desenvolvidos so promissores na purificao de lectinas por cromatografia de afinidade,

sendo necessrios mais estudos visando a sua otimizao.

Palavras chave: Lectinas, cromatografia de afinidade, criogel.

* Orientador: Rafael da Costa Ilhu Fontan, DSc.,UESB e Co-orientadores: Renata Cristina

Ferreira Bonomo, DSc. UESB e Leandro Soares Santos, DSc., UESB.

14

ABSTRACT

SANTOS, Carilan Moreira Souza, M.S. Development of monolithic macroporous

adsorbents functionalized with concanavalin A for lectin purification. Itapetinga - BA:

UESB, 2016. 78 p. (Masters of Engineering and Food Science, Concentration Area in Food

Engineering) *.

Chromatographic techniques are important in biocompounds purification strategies. It has

been observed the development of new adsorbents for such use, including the production of

monoliths, porous structures, interconnected in a single body. Polymer monoliths are

produced from a monomer mixture and a porogenic agent, polymerized in situ in a mold. A

wide variety of monomer combinations and surface-modifying reagents makes monoliths

suited to almost any kind of separation. In the present study it was evaluated the modification

of macroporous polyacrylamide monolithic supports by six different activation methods,

based on the reactivity of epoxy radical present in their structures and the formation of

covalent bonds, for the immobilization of concanavalin A (Con A) in order to their

application in lectins purification by affinity techniques. It was evaluated ConA

immobilization capacity and physical and chemical aspects of the monoliths, besides its

potential use for the lectins adsorption. It was found that the increase of epoxy radicals using

epichlorohydrin and the addition of spacer arms using glutaraldehyde increased the amount of

immobilized ConA, and the functionalized monolithic maintained predominantly

macroporous structure and low flow resistance, desirable characteristics for the

macromolecules purification. The adsorptive capacity of the activated monoliths by the most

effective method was superior to 100 mg of lectines per g of dried monolith, keeping constant

after five consecutive cycles of use, demonstrating the stability of the column. The results

suggest that developed monoliths are promising in lectin purification by affinity techniques,

requiring more studies to its optimization.

Key words: Lectins, affinity chromatography, cryogel.

* Advisor: Rafael da Costa Ilhu Fontan, DSc., UESB. Co-advisors: Renata Cristina Ferreira

Bonomo, DSc. UESB; Leandro Soares Santos, DSc., UESB

15

1. REFERENCIAL TERICO

1.1 INTRODUO

A demanda da indstria de alimentos e farmacutica por biocompostos ativos

crescente, buscando-se o emprego de tcnicas que mantenham ao mximo a bioatividade

desses compostos (GUIOCHON; BEAVER, 2011). O desenvolvimento de novas estratgias

de biosseparao e purificao de compostos de interesse tem se tornado uma necessidade

contnua e os adsorventes e trocadores inicos surgiram como alternativas para tal. Entre os

adsorventes existentes esto os monlitos polimricos, estruturas porosas altamente

interconectadas formadas em corpo nico, considerados a quarta gerao dos materiais

cromatogrficos (JUNGBAUER; HAHNA, 2008). Essas estruturas so versteis no seu uso,

podendo ser produzidos na forma de colunas, discos ou membranas, e apresentam baixo custo

se comparados a matrizes tradicionais na cromatografia (GUIOCHON, 2007).

As lectinas constituem um grupo de glicoprotenas encontradas em muitos

organismos, tais como bactrias, plantas e animais (PERIN; AKSZ, 2012). Uma das

lectinas mais estudadas a concanavalina A, isolada da leguminosa Canavalia ensiformes.

Essa protena liga-se a molculas que contem a - D -manopiranosil, - D -

glicopiranosil (anmeros de manose e glicose) e estruturas estericamente relacionadas, alm

de se complexar com uma srie de substncias que contenham esses acares. Imobilizaes

com Concanavalina A tem sido utilizada para o isolamento, fracionamento, caracterizao

estrutural e imobilizao de glicoprotenas e outros glicoconjugados biologicamente

importantes (CARLSSON et al., 1998).

As funes biolgicas dessas protenas ainda no so devidamente conhecidas,

contudo, estudos realizados revelam que lectinas de diferentes especificidades, imobilizadas

sobre suportes cromatogrficos podem ser usadas como matrizes de afinidade para fins

variados. Assim, elas tm sido utilizadas para caracterizao e anlise de glicoconjugados

(OLAJOS, 2010; CERRADA et al., 2010) podendo ser usadas para explorar superfcies

celulares, ligando-se a poro carboidrato de glicoprotenas ou glicolipdeos (GHAZARIAN

et al., 2011; NUNES et al., 2012). Vrias lectinas tm demonstrado possuir atividade

imunomoduladora e antitumoral in vivo e in vitro; elas tm sido utilizadas como agentes

teraputicos, sendo capazes de se ligar a membrana celular ou seus receptores, causando

citotoxicidade, apoptose e inibio do crescimento tumoral (GONZLEZ DE MEJA;

PRISECARU, 2005).

Para a obteno de lectinas purificadas, alguns mtodos vm sendo avaliados, como a

precipitao com etanol, filtrao em gel e troca inica (SANTANA et al., 2008), contudo, a

16

cromatografia por afinidade a mais efetiva quando se deseja obter um grau de pureza mais

elevado, alm de manter a bioatividade da molcula (PERIN; AKSZ, 2012). Para a

purificao de lectinas por cromatografia de afinidade, muito explorado o uso de interaes

que se baseiam na capacidade destas se ligarem especfica e reversivelmente a carboidratos

(GERLACH et al., 2002). A propriedade de ligao das lectinas carboidratos facilita a

purificao atravs de suportes cromatogrficos, por exemplo, a imobilizao de lectinas para

o isolamento de glicoconjugados (PEUMANS; VAN DAMME, 1998).

Gis monolticos polimricos apresentam inmeras aplicaes em diferentes reas da

biotecnologia, incluindo o uso em materiais cromatogrficos, matrizes para

eletroforese/imuno-difuso, assim como suportes de imobilizao de molculas e clulas.

Criogis so matrizes de gis formados a partir de solues de polmeros submetidas a

temperaturas inferiores ao ponto de cristalizao do solvente, gerando macroporos

interconectados que permitem que no ocorra problemas de difuso de solutos, na ordem de

micrmetros nanmetros.

Apesar das vantagens apresentadas pelos referidos suportes cromatogrficos

polimricos (criogis), sua estrutura fsica possui uma rea superficial significativamente

menor se comparada a de um leito fixo empacotado, razo pela qual sua eficincia pode ser

diminuda. Por isso, o estudo de modificaes na estrutura dos criogis uma rea essencial e

que vem se desenvolvendo rapidamente. Modificaes qumicas ou fsicas, podem ser feitas

visando aumentar a eficincia dos processos de separao (YAO et al., 2007; YUN et al.,

2007; WANG et al., 2008). As modificaes da matriz polimrica so normalmente realizadas

por meio da circulao de solues contendo os reagentes de ativao (grupos ligantes), ou

por imerso do suporte na referida soluo, tornando consequentemente, o monlito em uma

estrutura quimicamente ativada (KIM; HAGE, 2005). Essas modificaes so realizadas

objetivando alcanar maiores ndices adsortivos quando solues aquosas so difundidas

sobre essas superfcies macroporosas para reteno dos compostos de interesse.

Tem-se ento adotado alguns mtodos de imobilizao de ligantes e biomolculas para

serem empregados nesses criogis. O mtodo de imobilizao tem como princpio a interao

fsica das biomolculas ao longo do suporte com reteno de sua atividade biolgica. Essa

tecnologia tem por finalidade facilitar a separao entre a biomolcula e os demais

constituintes da soluo aquosa, alm de melhorar a estabilidade do suporte para seu reuso em

aplicaes contnuas, com efeito positivo no processo econmico (QIU et al., 2010;

JRZEBSKI et al., 2007).

Entre os mtodos de imobilizao estudados, esto o Mtodo Epxi, Mtodo da Base

de Schiff, Mtodo do Carbonildiimidazol, Mtodo do Dissuccinimidil Carbamato, Mtodo de

17

Troca Catinica, Mtodo do Glutaraldedo (LUO et al., 2002), dentre outros. (MALLIK;

JIANG; HAGE, 2004; HAGE; RUHN, 2005).

O criogel ativado pelo mtodo do glutaraldedo tende a ter uma taxa de imobilizao

maior do que o suporte ativado pelo mtodo epxi e alguns dos demais mtodos, devido um

maior espaamento entre a biomolcula imobilizada e a superfcie do criogel, por meio da

formao de braos espaadores (LUO et al., 2002). A introduo destes braos espaadores

contribui para preveno dos efeitos de impedimento estrico e limitaes difusionais,

proporcionando uma melhor posio para ao biolgica aps imobilizao (LUO et al.,

2002; KNEZEVIC et al., 2006).

A grande aplicabilidade dos monlitos polimricos para purificao de biocompostos

justifica o interesse da presente pesquisa, uma vez que estes possuem superfcies passveis de

modificaes para introduo de funcionalidades, adaptando-se s necessidades de cada

processo. Foi percebido que a imobilizao de um ligante superfcie do monlito melhorou

sua capacidade adsortiva. Contudo, necessrio que o ligante seja compatvel com as

solues usadas durante o processo de imobilizao, que possuam no mnimo um grupo

funcional atravs do qual ele ser acoplado matriz (-NH2, amino; -COOH, carboxlico; -

CHO aldedo; -SH, tiol; -OH, hidroxlico) e que este grupo funcional no seja essencial para a

sua funo biolgica, ou seja, sua capacidade de ligao no deve ser afetada pela

imobilizao (JANSON; RYDN, 1989). As protenas possuem um nmero grande de grupos

reativos e podem ser imobilizadas sem a destruio de sua estrutura ou funo. A capacidade

de lectinas imobilizadas interagirem especificamente com carboidratos as torna excelentes

ferramentas para a purificao de glicoprotenas, solveis ou derivadas de membranas. Desta

forma, o desenvolvimento e caracterizao de novos adsorventes de menor custo, com

lectinas imobilizadas, para a purificao de biocompostos, constitui uma potencial iniciativa

para a expanso do seu processamento e utilizao nos diversos segmentos industriais.

18

1.2 REVISO DE LITERATURA

1.2.1 Glicoprotenas: Lectinas

Lectinas so protenas de origem no imunolgica que reconhecem, de forma

reversvel, carboidratos livres ou conjugados superfcies celulares, atravs de seus stios de

ligao (CORREIA, COELHO e PAIVA, 2008). Esto amplamente distribudas na natureza,

sendo encontradas em todas as classes e famlias dos organismos vivos, desde animais

plantas, vrus, bactrias e fungos (BRANCO et al., 2004). Entre as plantas, tm sido relatadas

ocorrncias em folhas, frutos, razes, tubrculos e rizomas (COSTA et al., 2010; YAN et al.,

2010), sendo especialmente purificadas a partir de sementes, onde constituem at 10% do

contedo total de protenas dos extratos (PAZ et al., 2010; SANTOS et al., 2009).

O termo lectina, originado do latim legere, que significa selecionar (LAM; NG,

2011) empregado para nomear todas as protenas que possuem ao menos um domnio no

cataltico capaz de ligarem-se seletivamente e reversivelmente a mono ou oligossacardeos

(SHARON; LIS, 2002), o que permite s lectinas distinguirem acares semelhantes (LAM;

NG, 2011).

O primeiro relato sobre lectinas ocorreu em 1888, quando Stillmark observou que

extratos de Ricinus communis (mamona) aglutinava eritrcitos devido presena de uma

protena extrada, a ricina (KENNEDY et al., 1995). Em 1891, Hellin descobriu que extratos

txicos de sementes de Abrus precatorius (jequiriti) tambm produziam aglutinao de

clulas vermelhas. medida que aumentavam os fatores aglutinantes e comeavam a ser

descobertos em outras plantas, o termo hemaglutinina, que fora introduzido anteriormente, foi

se tornando constante e comum para todas as substncias que exibiam esta propriedade

biolgica particular (ELFSTRAND, 1898). Todavia, com a descoberta de que algumas

hemaglutininas aglutinavam seletivamente eritrcitos de um grupo sanguneo humano

particular dentro do sistema ABO, o termo comeou a ser introduzido para ressaltar este

aspecto de escolha (BOYD; REGUERE, 1949). Posteriormente foi percebido que as

propriedades de aglutinao das lectinas estavam baseadas no reconhecimento especfico e

ligao a carboidratos (WATKINS; MORGAN, 1952; MILHOME, 2003).

Movidos por este novo conhecimento, pesquisadores passaram a definir lectinas como

protenas de origem no imune, ligantes a carboidratos que aglutinam clulas ou precipitam

glicoconjugados (GOLDSTEIN et al., 1980) e no modificam bioquimicamente os

carboidratos ligantes (RDIGER; GABIUS, 2001).

Somente com o desenvolvimento biotecnolgico, que resultou na purificao das

lectinas, foi possvel um melhor entendimento da estrutura, ao e emprego destas molculas.

19

Presentes nos variados tecidos, elas parecem atuar como protenas de reserva vegetal

(MACEDO et al., 2011); de reconhecimento, de defesa contra fitopatgenos e predadores (S

et al., 2008; KAUR et al., 2006); de regulao e sinalizao celular (JIANG et al., 2006);

esto envolvidas no estabelecimento de simbiose entre organismos (KVENNEFORS et al.,

2008), podendo ainda serem especficas para eritrcitos de diferentes origens animais ou

tipagens (JUNG et al., 2007; WU et al., 2009) ou podem ser no especficas para grupos

sanguneos (LIU et al., 2008). Elas atuam na comunicao entre clulas, na interao entre

hospedeiro-patgeno, na embriognese, na metstase do cncer, no desenvolvimento de

tecidos, na apoptose (LI et al., 2011), na deteco, purificao, caracterizao e anlise de

glicoconjugados (OLAJOS, 2010; CERRADA, et. al., 2010) onde podem ser usadas para

explorar superfcies celulares, ligando-se poro carboidrato de glicoprotenas ou

glicolipdeos (GHAZARIAN et al., 2011).

Com base na estrutura das subunidades das lectinas, mais precisamente, nos produtos

primrios da traduo dos genes, Peumans et al. (2001) classificaram-nas em quatro grupos

principais: merolectinas, hololectinas, quimerolectinas e superlectinas, apresentadas na Figura

1.

As merolectinas so protenas pequenas, formadas exclusivamente por um nico

domnio ligante aos carboidratos. Por definio so monomricas e estruturalmente simples, e

devido sua natureza monovalente, no apresentam atividade hemaglutinante ou capacidade

de precipitar glicoconjugados. Poucas merolectinas foram descobertas, talvez pelo fato de no

apresentarem atividade hemaglutinante. Exemplos bem conhecidos so as hevenas, lectinas

de ltex de Hevea brasiliensis (seringueira), e as protenas ligantes monomricas de orqudeas

(PEUMANS; VAN DAMME, 1998).

As hololectinas so protenas oligomricas, formadas por um nico tipo de domnio

ligante, mas contm dois ou mais desses domnios que podem ser idnticos ou muito

homlogos e se ligam ao mesmo carboidrato ou a um outro estruturalmente similar. So

capazes de aglutinar clulas e/ou precipitar glicoconjugados. Ocorrem normalmente na forma

de dmeros ou tetrmeros. Diversas lectinas extradas de plantas so classificadas como

hololectinas, pode-se citar como exemplo a Concanavalina A (ConA), Canavalia brasiliensis

(ConBr) e Artocapus integrifolia (Jacalina) (PEUMANS; VAN DAMME, 1998).

As quimerolectinas so fuses de protenas tendo um ou mais stios de ligao para

carboidratos, todavia, um destes stios deve conter um acar com atividade biolgica

definida, agindo de forma independente dos demais stios, e o segundo domnio pode ter uma

atividade cataltica ou uma outra atividade biolgica independente do domnio de ligantes a

carboidratos. Tais protenas geralmente apresentam dupla funo, mas que se complementam,

20

como por exemplo, protenas envolvidas na invasividade celular, que utilizam o domnio de

reconhecimento para acar como ponto de ancoragem e subsequentemente age com o outro

domnio para efetivar a entrada na clula ou at mesmo demolio de membranas. Com

relao direta ao nmero de stios de ligao, quimerolectinas podem se comportar como

merolectinas ou hololectinas. As protenas inativadoras de ribossomos (RIPs) do tipo II e as

quitinases tipo I de plantas exemplificam respectivamente os dois casos citados (PEUMANS

& VAN DAMME, 1998).

As superlectinas so protenas formadas por dois ou mais stios de ligao para

carboidratos, porm com especificidades a carboidratos diferentes. Seu domnio cataltico

pode reconhecer acares estruturalmente no relacionados. So encontradas com menos

frequncia do que as hololectinas, porm novas estruturas para esse grupo vm sendo

elucidadas, como a lectina da banana que possui dois stios distintos de reconhecimento a

carboidratos e a lectina de bulbos de tulipa (PEUMANS & VAN DAMME, 1998).

Figura 1: Classificao das lectinas quanto estrutura

Fonte: Adaptado de PEUMANS e VAN DAMME, 1998.

Monteiro e Oliveira (2002) ampliaram essa classificao criando o termo

Multilectinas, ao mostrar a existncia de lectinas que possuem dois ou mais domnios

ligantes de carboidratos, idnticos, mas que podem se ligar a carboidratos diferentes. o caso

da jacalina, lectina de sementes Artocarpus intergrifolia (MOREIRA; AINOUZ, 1977), e da

frutalina, lectina de sementes de Artocarpus incisa (MOREIRA et al., 1998), que se ligam

tanto a D-galactose quanto a D-manose.

21

Devido a grande diversidade estrutural, especificidade sacardica e ocorrncia, no se

justifica esperar por uma funo comum a todas as lectinas de plantas. Mesmo uma lectina

particular pode assumir diferentes funes dependendo de onde e quando expressa

(RDIGER et al., 2000). Em grande parcela das lectinas de plantas estudadas, nota-se

semelhana em aspectos estruturais, como a sequncia primria, os stios de ligao para

carboidratos e a funo biolgica. Tais semelhanas, embora no sejam exatas, resultam em

diferentes atividades biolgicas (CAVADA et al., 2001). Esses compostos so utilizados

como importantes ferramentas em processos biotecnolgicos.

As lectinas podem ser classificadas no s em razo da funo que desempenham,

como quanto ocorrncia, como pode ser verificado na Tabela 1.

Tabela 1: Classificao das lectinas de plantas quanto ocorrncia.

Grupo Nmero de Lectinas Identificadas

Lectina de Leguminosas >100

Ligantes Quitina >100

Inativadoras de ribossomos (RIPs) > 20

Relacionadas a Jacalina 50

Floema de Curcubitceas

22

biomolculas. Desta forma, estas passaram a ser usadas como ferramentas para a deteco,

isolamento e caracterizao parcial de glicoconjugados (SILVA et al., 2011) assim como

possibilitaram estudos de mudanas que ocorrem em superfcies celulares durante processos

fisiolgicos a partir do reconhecimento aos diferentes carboidratos (PETROSSIAN,

BANNER e OPPENHEIMER, 2007). Algumas lectinas tm sido estudadas tambm como

mediadoras de drogas (GAO et al., 2007), outras como marcadores taxonmicos de

microorganismos diferentes (SLIFKIN; DOYLE, 1990). H aquelas com atividade

antibacteriana podendo ser teis em aplicaes teraputicas e microbiologia clnica

(HOLANDA et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008). Estudos tm empregado lectinas como

potenciais anticarcinognicos (DE MEIJA et al., 2003), conjugadas a agentes quimioterpicos

teis no tratamento de tumores induzidos em animais (HASEENABEEVI et al., 1991) ou

como uma sonda alternativa em imagens celulares e biomarcadores (WENG et al., 2006).

1.2.1.1 Concanavalina A

A concanavalina (ConA) uma lectina extrada de leguminosas, mais precisamente do

feijo-de-porco (Canavalia ensiformis). Isolada pela primeira vez em 1916 (LI et al., 2011),

foi a primeira lectina a ter sua estrutura cristalina determinada por difrao de raios-X em

1972 por Gerald M. Edelman et al., e por Karl D. Hardman e Clinton F. Ainsworth. O estudo

de sua interao especfica com carboidratos foi detalhadamente realizado por Z. Derewenda

et al., em 1989, por difrao de raios-X a uma resoluo de 2,9 , da lectina complexada a

metil--D-manopiranosil (DEREWENDA et al., 1989). a lectina mais amplamente estudada

para cromatografias de afinidade e separao de glicoenzimas, devido sua capacidade de

formar complexos com molculas que contm resduos -D-manopiranosil e -D-

glicopiranosil. Os estudos mostram que a ligao de afinidade baseada principalmente em

ligaes de hidrognio e interaes de Van der Waals (WEN; NIEMEYER, 2007).

Concanavalina A uma protena que apresenta mudana na conformao de sua estrutura

quaternria, em soluo aquosa, com variao do pH, temperatura e fora inica da soluo

(McKENZIE; SAWYER e NICHOL, 1972). A estrutura dessa lectina altamente sensvel ao

pH, favorecendo ou no a agregao de seus dmeros em tetrmeros. Em pH> 5,5 ela adquire

forma de tetrmero, mantendo-se na forma de dmero em pH< 5,5 (LI et al., 2011), como

pode ser verificado na Figura 2. A subunidade monomrica constituda por 237 resduos de

aminocidos, de massa molecular 26,5 kDa, cuja agregao de dois monmeros, forma um

dmero de MM ~53 kDa (pH < 5,5), conhecido como dmero cannico. A mudana do pH a

valores superiores a 7,0, resulta na agregao de dois dmeros em um tetrmero (MM = 104

kDa; pH > 7,0), chamado de dmero de dmeros (NAEEM; KHAN; KHAN, 2005).

23

Figura 2: Representao estrutural da Concanavalina A.

(a) Monmero; (b) Estrutura quaternria dimrica da Con A em pH < 5,5;

(c) Tetramerizao da estrutura quaternria da Con A em pH > 5,5.

Fonte: LI et al., 2011.

A conformao da estrutura quaternria da Con A tambm exerce influncia sobre sua

atividade biolgica. Na conformao tetramrica (pH 7,0) a constante de associao, Ka (M-1),

oligomanoses semelhantes a glicopeptdios, cerca de quatro a dez vezes maior quando

comparada a sua forma dimrica (pH 5,5) e a seus derivados dimricos irreversveis, succinil-

e acetil-Con A (pH 7,0) (GUNTHER et al., 1973). Maior capacidade hemaglutinante, induo

do capeamento por receptores glicoproticos e inibio do capeamento dos receptores de

imunoglobulinas, em linfcitos, tambm so atividades melhor observadas para a

conformao tetramrica. Estudos recentes sobre cncer tm empregado esta lectina em

marcaes histoqumicas de variados tipos teciduais e como agente indutor da apoptose

(morte celular programada do tipo I) em diversas linhagens celulares (LI et al., 2011; LIU et

al., 2009).

O enovelamento dos monmeros formam uma estrutura com 2 folhas anti-paralelas,

superiormente cobertas por uma terceira folha-: uma folha dorsal com seis fitas, uma folha

frontal com sete fitas e uma folha superior com cinco fitas, Figura 3, estabilizadas por dois

ctions divalentes: o on clcio (Ca2+) e o on de um metal de transio (Mn2+, Cd2+, Zn2+ e

Co2+), ligados protena atravs das cadeias laterais dos resduos de aminocidos

(CHATTERJEE; MANDAL, 2003). O on Ca2+ responsvel pela coordenao e fixao das

cadeias laterais dos aminocidos que interagem com o acar (1 camada de coordenao) e

das posies dos elementos estruturais dos aminocidos que esto em contato com estes (2

camada), estabilizando a arquitetura geral do stio de ligao. O on Mn2+ no coordena

nenhuma interao direta com a protena, entretanto sua funo fixar a posio do on clcio

(WEISS; DRICKAMER, 1996).

24

Figura 3: Representao do monmero da concanavalina A.

(A) Diagrama em fitas de Con A. Os ons clcio (roxo) e mangans (verde) esto indicados. A folha dorsal com 6 fitas, em vermelho, a folha frontal com 7 fitas, em amarelo e a folha superior com 5

fitas, em cinza. O primeiro e o ltimo resduo de aminocido esto destacadas em ciano e cinza.

(B) Diagrama topolgico do enovelamento do monmero representado em (A). A estrela indica a posio onde os ctions divalentes interagem com o monmero.

Fonte: Protein Data Banking: 2CNA (LORIS et al.,1998).

1.3 Mtodos de purificao

O isolamento e purificao de protenas alicerado pelos estudos das caractersticas

fsico-qumicas, estruturais, bem como suas propriedades biolgicas e estimulado pela sua

potencial utilizao em diversas reas da medicina clnica, bem como em pesquisa qumica e

biolgica (BANERJEE et al., 2004; VAN DAMME et al., 1996; SPILATRO et al., 1996).

Tratam-se de tcnicas especficas, que devem ser projetadas para cada protena

individualmente, uma vez que faz-se necessrio aplicar estratgias cada vez mais sensveis

para alcanar a separao desejada em pequenas diferenas, afim de se obter protenas

extremamente puras.

A separao e purificao de uma determinada protena, presente numa dada amostra,

pode ser feita com base em uma ou mais caractersticas da sua molcula que as diferenciem

dos restantes constituintes da amostra. Assim, pode-se recorrer a diferentes mtodos, tais

como: precipitao com base em diferenas de solubilidade em funo do pH, fora inica e

constante dieltrica do solvente; filtrao em gel e centrifugao em gradiente de densidade

com base em diferenas de dimenso molecular; cromatografia de troca inica com base em

diferenas de carga molecular; cromatografia de afinidade com base nas interaes

especficas entre as molculas; cromatofocagem e focagem isoeltrica com base em

diferenas nos pontos isoeltricos; eletroforese de zona em gel com base em diferenas de

25

carga e dimenso molecular. Para se conseguir graus elevados de purificao, torna-se,

geralmente, necessria a utilizao sequencial de mais do que um mtodo, baseados em

critrios de separao diferentes (ACTAS BIOQUMICA, 1991)

Mtodos convencionais utilizados na purificao de biomolculas tm sido aplicados

para lectinas. Extraes podem ser feitas a partir de solues salinas, como no isolamento da

lectina das sementes de Erythrina speciosa (KONOZY et al., 2003) ou usando tampes, como

na obteno das lectinas de cotildones de Luetzelburgia auriculata (OLIVEIRA et al., 2002),

dos tubrculos de Helianthus tuberosus (SUSEELAN et al., 2002) e da entrecasca de Hevea

brasiliensis (WITITSUWANNAKUL et al., 1998), Sambucus sieboldiana (ROJO et al.,

1997) e Morus nigra (ROUG et al., 2003).

A purificao de biomolculas exige o uso de muitas tcnicas para cada estgio de

separao, uma vez que o uso dos mtodos convencionais aplicado apenas para que seja

conseguido uma extrao parcial dos compostos presente na soluo aquosa. As tcnicas

cromatogrficas esto presentes ao longo de todos os processos de purificao. Por essa razo,

Niven (1995) afirmou que a cromatografia representava o estado da arte na purificao de

protenas. A disponibilidade de diferentes tcnicas cromatogrficas com diferentes

propriedades fornece combinao poderosa para a purificao de qualquer biomolcula

(PHARMACIA BIOTECH, 1999).

Dentre os mtodos cromatogrficos citados anteriormente, Collins et al. (1997),

afirmam em seus estudos que as lectinas podem ser purificadas atravs de cromatografia de

afinidade, cromatografia de troca inica ou cromatografia de filtrao em gel. O que varia, so

as matrizes que so utilizadas nestas tcnicas, cuja escolha depende da especificidade a

carboidratos (cromatografia de afinidade), carga lquida (cromatografia de troca inica) e

tamanho molecular da protena (cromatografia de filtrao em gel).

No esquema proposto por Belter (1986), a purificao de biomolculas exige o

emprego de vrios mtodos devendo-se buscar o mais apropriado para cada estgio de

separao. Assim, so empregados procedimentos diferentes na remoo de compostos

insolveis ou clarificao, no isolamento do produto ou captura, na purificao intermediria

e no polimento (Tabela 3). A quantidade e a variao nas metodologias usadas dependero da

natureza e das caractersticas das amostras, assim como o grau de pureza desejado no produto

final (PASECHNIK; PHLS, 1995).

26

Tabela 3 - Tcnicas de separao usadas nas diferentes etapas de purificao de biocompostos.

Estgios ou etapas

Tcnicas de separao Clarificao Captura ou

1

purificao

Purificao

intermediria

Polimento

Precipitao * * *

Centrifugao *

Homogeneizao *

Filtrao *

Cristalizao *

Sistemas aquosos bifsicos * * *

Cromatografia de troca inica *** *** ***

Cromatografia com ligante

especfico (afinidade)

*** *** **

Cromatografia por interao

hidrofbica

** *** *

Cromatografia por excluso

molecular

* ***

Diafiltrao *

Ultrafiltrao *

Cromatografia em fase reversa ** ***

Fonte: Adaptado de MATEJTSCHUK et al., (1998); BROCKLEBANK (1990); PHARMACIA

BIOTECH (1999).

Apesar do longo histrico de imobilizao de biomolculas (STRAATHOF; PANKE e

SCHMID, 2002) estima-se serem poucos e novos os testes com lectinas. A tecnologia de

imobilizao de lectinas para utilizao em processos qumicos e fsicos tm despertado

ateno devido suas aplicabilidades e o uso em processos industriais tradicionais. Nesta

vertente utilizar-se- uma lectina pura, para purificar outras presentes em extratos aquosos, a

partir do mtodo de adsoro e afinidade qumica pelo radical livre, tornando-se atrativo no

setor industrial por se tratar de um mtodo simples, eficiente, com capacidade de reutilizao

do sistema, conduo do processo em modo contnuo e facilidade de separao do ligante para

com a biomolcula adsorvida.

Com as propriedades relatadas anteriormente, tais como, atuam na comunicao entre

clulas, na metstase do cncer, no desenvolvimento de tecidos, como protenas de reserva

vegetal, dentre outras, aliadas estabilidade geralmente elevada, lectinas de diferentes

especificidades foram imobilizadas sobre suportes inertes e usadas como matrizes de

afinidade para diversos fins. Assim, elas tm sido utilizadas em cromatografia de afinidade

no s para o isolamento, como para a demonstrao da natureza glicoproteica de receptores

de hormnios, fatores de crescimento, neurotransmissores, imunoglobulinas e compostos

relacionados (PEUMANS; VAN DAMME, 1995).

27

1.3.1 Mtodo adsortivo

A purificao de uma determinada biomolcula, alm de envolver uma srie de etapas

convenientemente ordenadas, visando a obteno do mximo de rendimento e pureza, devem

gerar custos compatveis com os de mercado. O estudo adsortivo biosseletivo torna-se uma

alternativa atraente por ser um mtodo que apresenta alta seletividade e que vem sendo usado

com muito sucesso na purificao de diversas enzimas e protenas (TEOTIA et al., 2001)

A escolha do suporte cromatogrfico um ponto crucial para a obteno de bons

resultados em processos de purificao, podendo influenciar na distino da alta ou baixa

eficincia do mtodo (MENDES et al., 2011). So muitas as caractersticas requeridas para tal

suporte ser considerado ideal para determinado processo de purificao. Um suporte ideal

para processos cromatogrficos de protenas no deve conter grupos que se liguem de forma

no seletiva as molculas destas, porm devem conter grupos funcionais que permitam a

reao controlada de uma ampla variedade de adsorventes da protena (JANSON e

JNSSON, 1998).

Ademais, a coluna cromatogrfica deve ser qumica e fisicamente estvel a fim de

resistir a condies extremas ao longo dos processos, regenerao e manuteno sem perder a

capacidade de inchamento de sua estrutura, ser reativo para a introduo de braos

espaadores quando de interesse, resistente ao ataque microbiano, ser permevel (sendo

analisada sua rea superficial e distribuio dos poros) e ser vivel financeiramente

(CARDOSO et al., 2009; FREITAS et al., 2007).

1.3.1.1 Cromatografia lquida de afinidade (CLAF)

A forma mais comum de efetuar separaes biosseletivas por cromatografia de

afinidade, sendo esta, a segunda tcnica de purificao mais usada, dentre os mtodos

cromatogrficos existentes, devido ao alto grau de resoluo, capacidade e seletividade que se

pode obter. O princpio deste mtodo consiste em melhorar a capacidade de separao de

biomolculas a partir de ligaes especificas, no covalentes suportes insolveis,

favorecendo a obteno de biosseparaes com elevada seletividade (NIVEN, 1995;

PHARMACIA BIOTECH, 1999).

A tcnica consiste no processo de separao de biomolculas com base nas suas

interaes especficas com ligantes acoplados a uma fase slida (JANSON et al., 2011).

Pesquisas sobre o isolamento e purificao de protenas usaram cromatografia de partio

como o ltimo passo no processamento, no entanto, estratgias recentes mudaram esse padro

no sentido de usar a cromatografia de afinidade como um processo de etapa nica para

28

deteco e separao molecular (MOSER; HAGE, 2010; DUHITA, et al., 2009). A

cromatografia de afinidade utilizando lectinas como ligantes tem sido utilizada para a

purificao de glicoconjugados, devido sua especificidade de ligao por carboidratos

(ANIULYTE, et al., 2006; WEN, NIEMEYER, 2007). Nessa tcnica, os compostos (com

afinidade pelo ligante) so adsorvidos mediante ligao seletiva reversvel do ligante com a

molcula de interesse presente na soluo aquosa (NIVEN, 1995). ideal para a captura ou

purificao intermediria de biomolculas, podendo ser usada sempre que houver ligantes

adequados para a protena de interesse (PHARMACIA BIOTECH, 1999). A seletividade do

mtodo garantida pela especificidade nica bio-inerente interao molcula e alvo. A

dependncia absoluta da interao de afinidade em reconhecimento biolgico, em vez de

propriedades fsico-qumicas, implica que esta tcnica preserva as atividades biolgicas e

imunolgicas dos produtos isolados (NARAYANAN, 1994).

As caractersticas que o ligante deve ter, incluem ser compatvel com as solues

usadas durante o processo de imobilizao, possuir no mnimo um grupo funcional atravs do

qual ele ser acoplado matriz (-NH2, amino; -COOH, carboxlico; -CHO aldedo; -SH, tiol; -

OH, hidroxlico) e que este grupo funcional no seja essencial para a sua funo biolgica, ou

seja, sua capacidade de ligao no deve ser afetada pela imobilizao (JANSON & RYDN,

1989). Assim, a protena desejada obtida com alto grau de pureza alterando-se apenas as

condies de pH (KENNEDY et al., 1995), fora inica (FREIRE et al., 2002) ou pela eluio

com uma soluo contendo um competidor (KONOZY et al., 2003; BANERJEE et al., 2004).

O esquema de adsoro e eluio representado na Figura 4.

29

Figura 4: Etapas da cromatografia de afinidade em suportes contendo lectina

imobilizada.

(1) Adsoro da biomolcula: amostra contendo glicoprotenas aplicada coluna; o contato adsorvente

biosseletivo x biomolcula resulta em interaes no covalentes via o stio de ligao para carboidrato da lectina.

As biomolculas no retidas coluna so coletadas no tampo de equilbrio como fraes no adsorvidas. (2)

Eluio da biomolcula: glicoprotena obtida atravs da dessoro biosseletiva ou no especfica.

Fonte: Adaptado de SANTOS FILHO, 2001.

Contudo um problema observado na cromatografia de afinidade contendo protenas

imobilizadas a baixa eficincia de ligao da matriz, decorrente de impedimento estrico

que inviabiliza o acesso da molcula a ser isolada ao ligante. O uso de braos espaadores em

vrias matrizes cromatogrficas, minimiza ou resolve este problema, ampliando as

possibilidades de interao, uma vez que aumenta a acessibilidade a todos os centros de

ligao disponveis numa protena. Por outro lado, a incorporao de braos espaadores pode

promover interaes no-especficas de vrias protenas matriz (DEMARTINO, 1989;

KARMALI, 2001). Como as lectinas interagem especificamente com carboidratos, esse grupo

de protenas se constitui em excelentes ferramentas para a purificao de glicoprotenas

solveis (SANTOS FILHO, 2001). Na Tabela 4 esto listadas algumas das lectinas mais

usadas, bem como suas especificidades monossacardicas (PEUMANS; VAN DAMME,

1998).

30

Tabela 4: Lectinas comumente usadas como ligantes em colunas cromatogrficas por

afinidade.

Lectina Especificidade Matriz

Canavalia ensiformis Glc/Man Sepharose-4B

Dolichos biflorus GalNAc Agarose

Hellix pomatia GalNAc Agarose

Lens culinaris Glc/Man Sepharose-4B

Phaseolus vulgaris GalNAc Agarose

Pisum sativum Glc/Man Agarose

Arachis hypogea Gal/GalNAC Agarose

Glycine max GalNAc Agarose

Triticum vulgaris GlcNAc Agarose

Man, manose; Glc, glicose; GlcNAc, N-acetilglicosamina; Gal, galactose; GalNAc, N-

acetilgalactosamina.

Fonte: Catlogo Sigma, 2000.

Dentre os diferentes radicais encontrados na estrutura de protenas, os radicais amina

tem sido os radicais usados para a sua imobilizao. No mtodo mais amplamente empregado

a imobilizao da protena feita por reao entre o grupo amino da lectina e o resduo

imidocarbonato da Sepharose-CNBr ativada. Dentre os suportes que foram largamente

utilizados para imobilizao de lectinas, podem ser citados a Sepharose e a agarose que so

resinas comerciais utilizadas em tcnicas cromatogrficas (YOSHIDA et al., 1997).

Vrios tipos de suporte podem ser usados para aumentar a seletividade de tcnicas

com baixa resoluo na separao de biomolculas, mediante a introduo de elementos de

afinidade. Nos monlitos polimricos, por exemplo, um dos mtodos de imobilizao do

ligante no suporte por meio da adsoro. Resumidamente este mtodo descrito em dois

estgios, o primeiro, onde a soluo a ser purificada misturada com o adsorvente, e as

biomolculas que no se ligarem ao suporte sero descartadas, enquanto o complexo protena-

ligante permanece adsorvido. No segundo estgio, a protena eluda e recuperada no final do

processo. Desta forma, torna-se possvel o isolamento seletivo de uma biomolcula ou grupo

de biomolculas em amostras complexas.

1.4 Monlitos Polimricos orgnicos

Criogis so monlitos polimricos formados em meio congelado e que foram

introduzidos como uma nova matriz de separao para aplicao em vrios processos de

biosseparao (LOZINSKY et al., 2001). Os monlitos polimricos orgnicos so sintetizados

31

a partir da mistura de monmeros, agentes reticulantes e solvente formador de poros (agente

porognico), que so polimerizados in situ em um molde. A imensa variedade de

combinaes de monmeros e reagentes modificadores da superfcie permite que os

monlitos se adequem a quase qualquer tipo de separao (GUIOCHON, 2007).

A superfcie do monlito pode ser modificada a fim de funcionalizar a coluna. Essa

modificao pode ser obtida pela copolimerizao de monmeros funcionais (WIEDER et al.,

2006; LI et al., 2009), pela modificao dos grupos funcionais da superfcie (ADRIANO et

al., 2008; RODRIGUES et al., 2008; MENDES et al., 2011) ou imobilizao de monmeros

funcionais na superfcie aps a polimerizao (SAVINA et al., 2005a; HANORA et al., 2006;

YAO et al., 2007).

Devido estrutura de poros interconectados de grandes dimenses, o fluxo escoa

atravs destes de forma puramente convectiva e a resistncia transferncia de massa baixa

(HAHN et al., 2002; PODGORNIK et al., 2000), tornando os monlitos uma fase estacionria

muito atrativa para cromatografia, principalmente no processamento de grandes biomolculas

como protenas, DNA e outras possveis nano partculas. Alm disso, podem ser usados

diretamente na captura de biomolculas a partir de solues concentradas ou contendo

partculas.

Na Figura 5 mostrado esquematicamente redes polimricas em diferentes

concentraes, evidenciando o maior grau de entrelaamentos fsico-qumicos entre as cadeias

com o aumento da concentrao de polmero e, consequentemente, diminuio do tamanho

dos poros e da porosidade (conectividade entre os poros).

Figura 5: Efeito da concentrao do polmero sobre a formao de poros nas colunas

cromatogrficas.

Polmero em baixas concentraes Polmeros em altas concentraes

Fonte: Adaptado de FAGUNDES, 2011.

32

1.4.1 Criogel monoltico supermacroporoso

Os criogis, so gis polimricos formados em condies de congelamento moderado

(temperatura entre -10C e -20C). Estes foram introduzidos como nova matriz de separao

para aplicao em vrios processos de biosseparao no final da dcada de 90 (LOZINSKY et

al., 2001). Possuem um sistema contnuo de macroporos interconectados com tamanho que

varia de 10 a 100 m e se diferenciam das demais matrizes de separao por fornecer uma

baixa resistncia ao escoamento e uma difuso desobstruda de soluo.

Em decorrncia de possuir a parede dos poros mecanicamente fortes, os criogis

podem suportar altas vazes sem praticamente nenhuma compresso, permitindo assim o

transporte de massa convectivo dos solutos e de partculas de pelo menos 10 m de tamanho

(PLIEVA et al., 2004 e PERSSON et al., 2004).

Os criogis consistem em um sistema polmero-solvente imobilizado em que

macromolculas conectadas via ligaes qumicas formam uma rede tridimensional (por

ligaes que, na grande maioria das vezes, permanecem inalteradas com o tempo). A

conformao das cadeias determinada pela natureza das ligaes e o mtodo de produo do

gel. Tendo por base a natureza intermolecular das ligaes nas unies das cadeias de

polmeros, os gis podem ser divididos em dois grandes grupos: gis qumicos quando

macromolculas so ligadas por interaes eletrostticas e gis fsicos quando

macromolculas so ligadas por interaes hidrofbicas e ligaes de hidrognio

(LOZINSKY et al., 2003).

Os gis polimricos podem ser produzidos por duas principais vias: na primeira via, o

inchamento limitado devido ligaes no-cruzadas de polmeros, ou via inchamento de um

xerogel (produzido por evaporao simples do solvente dentro do gel). A segunda e, mais

comumente usada, parte da formao em um sistema lquido. Neste caso, o sistema inicial

consiste de uma soluo de monmeros em que a geleificao acontece como resultado da

polimerizao ramificada, ou de uma soluo de polmeros em que a formao do gel

resultado das ligaes qumicas-cruzadas (LOZINSKY, 2002).

A geleificao criotrpica (tambm conhecida como criogeleificao ou

crioestruturao) um tipo especfico de sntese de gis polimricos onde a formao deriva-

se do tratamento criognico de sistemas potencialmente capazes de formar gis. Os produtos

dessa criogeleificao obtidos sob condies de congelamento podem ser chamados de

criogis. A cristalizao do solvente o principal fator de diferenciao entre a

criogeleificao com a geleificao induzida por refrigerao. Os produtos deste ltimo so os

gis psicrotrpicos, isto , gis formados em condies de temperaturas mais baixas, por

exemplo, a gelatinizao da gelatina, sem que ocorra transio de fase do solvente. Estes gis

33

so termoreversveis diferenciando assim dos criogis formados sob condies de

congelamento (PLIEVA et al., 2004b).

Dois mtodos principais para produo de criogis tem sido utilizados: (a) reticulao

de polmeros, tais como lcool polivinlico, dissolvidos em gua (PLIEVA et al., 2005) e (b)

polimerizao de monmeros dissolvidos na gua. Em ambos casos a soluo deve ser

congelada antes da reao. Usando o ltimo mtodo, uma grande variedade de criogis foi

preparada a partir de monmeros, incluindo 2-hidroxietil metacrilato (PLIEVA et al., 2007),

acrilamida (PLIEVA et al., 2004a; YAO et al., 2006b; YAO et al., 2007; CHEN et al., 2008),

dimetilacrilamida (KUMAR et al., 2003), N-isopropilacrilamida (GALAEV et al., 2006;

PEREZ et al., 2007), e N- N-vinilcaprolactama (PETROV et al., 2009).

Sobre as necessidades das condies de congelamento durante a polimerizao do

monlito, pode-se inferir que os cristais de gelo em crescimento atuam como agentes

porognicos. A forma e o tamanho dos cristais determinam a forma e o tamanho dos poros

que se desenvolvem aps o descongelamento da gua presente, como pode ser observado na

Figura 6. Estes materiais polimricos altamente porosos podem ser produzidos essencialmente

a partir de qualquer precursor de formao de gel e com uma ampla variedade de morfologias

e porosidades (PLIEVA et al., 2008).

Figura 6: Representao da produo do criogel.

Fonte: Adaptado de PLIEVA et al., 2004a.

Plieva et al. (2007) fizeram uma anlise comparativa atravs da microscopia eletrnica

de varredura de criogis preparados a partir de uma mesma composio, mas submetidos a

reao de polimerizao em diferentes temperaturas (-20 e 20 C), e observaram que,

enquanto a estrutura do material preparado temperatura ambiente (20 C), compacta e

34

praticamente sem funcionalidade para cromatografia, o criogel (-20C), apresenta grandes

poros interconectados, separados por paredes slidas polimricas, que permitem o fluxo de

fludos por sua estrutura, como pode ser observado na micrografia apresentada na Figura 7.

Esta caracterstica porosa vai ao encontro com o que foi observado por Carvalho et al.

(2014) ao produzirem criogis com semelhantes concentraes de monmeros polimricos

para avaliar o processo de adsoro da protena lactoferrina nos referidos suportes. Estas

colunas cromatogrficas com poros suficientemente grandes, permitem que solues contendo

fragmentos celulares e materiais particulados em geral possam ser escoados sem provocar sua

obstruo (LOZINSKY et al., 2002.).

Figura 7: Imagem por microscopia eletrnica de varredura de (A) criogel a base de

dextrana preparado a -20C e (B) gel de dextrana convencional preparado em temperatura

ambiente.

Fonte: PLIEVA et al., 2007

1.4.2 Criogel de poliacrilamida

Por sua acessibilidade, biocompatibilidade e biodegradabilidade, hidrogis de pAAm

constituem uma das matrizes mais utilizada na preparao de hidrogis semi-interpenetrante,

que consiste em uma combinao de dois polmeros, sendo um deles em forma de rede

sintetizado ou reticulado em presena imediata de outro. Essa caracterstica conseguida

atravs da ligao cruzada da polimerizao de acrilamida na presena de monmeros

sintticos ou naturais. Tais hidrogis tm inmeras aplicaes, como sistemas de

administrao de frmacos (RISBUD; BHONDE, 2000; EKICI; SARAYDIN, 2004),

condicionadores de solo e de remediao de guas residurias (ZOHURIAAN et al., 2010).

35

Na produo de gis polimricos de poliacrilamida, os componentes comumente

utilizados para a construo das matrizes so acrilamida, N,N-metileno-bis(acrilamida),

tetrametilenodiamina, tambm chamado de TEMED, e persulfato de amnio, tambm

conhecido por APS (Figura 8).

Figura 8: Reao de crio-copolimerizao dos monmeros AAm, AGE e MBAAm para o

preparo do criogel.

Fonte: MALLIK e HAGE, 2006

Yao et al. (2006) propuseram um criogel contnuo supermacroporoso com partculas

de ferro imobilizadas durante a criopolimerizao para a utilizao de protenas (BSA) em

cromatografia. A sntese dos criogis foi feita pela co-polimerizao criognica dos radicais

de uma soluo de Acrilamida (AAm), N,N-metileno-bis-acrilamida (MBAAm), alil glicidil

ter (AGE) e nanopartculas de Fe3O4 sob temperatura de congelamento. A matriz, alm de

alta porosidade (poros 10-50 m), possuiu alta permeabilidade e baixo coeficiente de

disperso axial em uma ampla faixa de velocidade do fluido. A capacidade de adsoro da

protena (BSA) na matriz de criogel foi superior quando comparada com a mesma matriz de

criogel (reportada em trabalhos anteriores do referido autor) sem as nanopartculas

imobilizadas.

A combinao nica das propriedades dos criogis, tais como sua estrutura

macroporosa, biocompatibilidade e robustez qumica e mecnica, abrem novas oportunidades

para a concepo desses materiais macroporosos. Condies moderadas para a imobilizao

aliada a elevada estabilidade mecnica dos criogis permitem a preparao de colunas

cromatogrficas eficientes para serem empregadas em solues aquosas ou pouco viscosas,

podendo ser utilizados para a deteco analtica e captura seletiva de clulas especficas.

36

1.5 Modificaes de funcionalizao nos suportes cromatogrficos para imobilizao de

protenas

Embora j exista uma ampla variedade de suportes monolticos disponveis, no h um

que seja uma soluo universal, visto que cada tipo de biomolcula e cada sistema apresentam

suas peculiaridades. Visando aperfeioar a utilizao desses criogis como suporte para

imobilizao e purificao de biomolculas, vrias metodologias de funcionalizao de sua

superfcie so apontadas. Essas funcionalizaes so realizadas por meio da circulao de

solues contendo agentes reticulantes atravs da matriz polimrica ou por imerso do suporte

(geralmente para criogis em formato de disco) na soluo contendo os grupos ligantes (KIM;

HAGE, 2005). Os grupos reativos so introduzidos na superfcie do suporte para permitir a

formao de ligao covalente entre a biomolcula e o suporte na etapa subsequente. Com a

introduo de novas estruturas qumicas na superfcie do monlito possvel obter fases

estacionrias que interajam mais ou menos especificadamente com um composto em

particular, garantindo assim a imobilizao do mesmo, para que a partir de ento, ele possa

adsorver a biomolcula de interesse presente na fase mvel (JANSON; JNSSON, 1998).

Cada mtodo de imobilizao apresenta uma diferente reao qumica para atingir o

mximo de adsoro das biomolculas percoladas. Como tcnicas de funcionalizao dos

criogis tem-se a imobilizao via ligao covalente, adsoro bioespecfica, ativao

catinica, dentre outras (KIM; HAGE, 2005; MALLIK; HAGE, 2006).

Suportes polimricos com grupos epxi sobre a superfcie esto entre os mais

utilizados devido ao fato destes grupos poderem facilmente reagir com grupos amina (NH2),

tiol (SH) ou hidroxila (OH) das protenas e formar uma ligao covalente estvel (MATEO et

al., 2000; MATEO et al., 2003). Alm disso, grupos epxi so muito estveis em valores de

pH prximo ao neutro, o que torna o suporte contendo esses grupos adequados para longos

perodos de armazenamento.

1.6 Modificaes para funcionalizao da superfcie do criogel

Com fins comparativos diferentes mtodos de ativao foram utilizados para testar a

estabilidade qumica da lectina imobilizada, capaz de obter menor lixiviao da mesma, a

modificao qumica e fsica do suporte, a reduo do tamanho de seus poros e a maior mdia

de reticulao da lectina no interior dos poros (HE et al., 2006; REIS; WITULA;

HOLMBERG, 2008).

Os protocolos para a imobilizao da lectina diferem entre si, na modificao da

superfcie do suporte por meio das reaes de ativao, na qual os grupos funcionais do

suporte so modificados para produzir intermedirios reativos (FERNNDEZ-

37

FERNNDEZ; SANROMN; MOLDES, 2012). Durante o processo de interao da lectina

com o suporte pode acontecer da regio do stio ativo se tornar menos acessvel ao ligante,

ocasionando um impedimento estrico (MATEO et al., 2007), ou a forte fixao da lectina ao

suporte dificulte a ativao da mesma, caso essa possua conformaes distintas quando

ativada e no ativada (MATEO et al., 2007; MACARIO et al., 2009). Por tais motivos foram

estudados 6 distintos mtodos de imobilizao, em relao a grupos reativos presentes na

superfcie, para que fosse possvel estabelecer um comparativo entre a partir das mdias de

imobilizao obtidas por ambos e o melhor dentre eles pudesse ser aplicado para o processo

adsortivo.

O mtodo da Base de Schiff, utiliza o grupo amina da protena e a forma aldedo

ativada do suporte, via ligao covalente. Primeiramente, os grupos epxis do criogel so

convertidos em diis e estes so oxidados formando grupos aldedos, que podem interagir

com as aminas primrias das protenas, formando a base de Schiff, que por sua vez obtida

por meio de reaes de reduo empregando um agente redutor.

Outro mtodo de imobilizao via ligao covalente o da dihidrazida adpica. Neste

mtodo os grupos aldedos das biomolculas reagem com os grupos hidrazidas do suporte

para formar uma ligao hidrazona estvel (RUHN; GARVER; HAGE, 1994).

Contudo, ressalta-se que as propriedades do material do suporte macroporoso iro

influenciar os processos de adsoro, a conformao e a atividade aparente das protenas

imobilizadas ou purificadas, bem como o tamanho e superfcie qumica da natureza da

protena e do substrato na interface do material (TALBERT; GODDARD, 2012).

Um suporte ideal deve imobilizar a lectina de forma que seja conservada sua estrutura

secundria e terciria, alm de apresentar um mnimo de dessoro das biomolculas durante

a reao (HENZLER et al., 2008). A eficincia da lectina imobilizada depende fortemente da

estratgia de imobilizao e do material utilizado como suporte. Nesse contexto, h um

crescente interesse no entendimento e controle das estratgias de imobilizao para

purificao (ABBAS et al., 2009).

Inmeros mtodos de imobilizao tm sido reportados na literatura, dentre os quais se

destacam: adsoro (KILONZO et al., 2011), imobilizao por ligao covalente

(KANNOUJIA et al., 2009), aprisionamento em gis polimricos (NICHELE et al., 2011;

QUIROGA et al., 2011) e utilizao de nanopartculas magnticas como matrizes (SONG et

al., 2011). Dentre esses, o mtodo por adsoro tem sido considerado um dos mais simples e

econmicos para a imobilizao de protenas. A imobilizao de uma lectina por adsoro

oferece uma enorme faixa de aplicabilidade em virtude de haver uma mnima perturbao na

estrutura nativa da mesma (KUMAR et al., 2009).

38

2 OBJETIVO GERAL

O escopo deste trabalho o desenvolvimento e caracterizao de adsorventes

monolticos supermacroporosos funcionalizados por diferentes mtodos para a purificao de

lectinas, por meio da modificao estrutural dessas colunas monolticas com a incluso de

grupos ligantes constitudos da lectina ConA.

2.1 Objetivos especficos

Sintetizar adsorventes polimricos supermacroporosos por criogeleificao utilizando

monmeros de acrilamida, bis-acrilamida e alil glicidil ter;

Avaliar diferentes mtodos de funcionalizao dos criogis produzidos para a

imobilizao da ConA como agente ligante;

Caracterizar os criogis, com relao a aspectos fsicos, qumicos, morfolgicos e

operacionais;

Avaliar o potencial de uso das colunas produzidas, estudando a captura de uma lectina

modelo e a capacidade de reutilizao das colunas produzidas.

39

3. MATERIAL E MTODOS

Os reagentes utilizados durante os experimentos esto descritos ao longo das

metodologias. Todos os reagentes possuem, no mnimo, grau de pureza PA-ACS, e a gua

utilizada foi ultrapura (sistema Milli-Q plus).

3.1 Produo da coluna monoltica

A produo das colunas monolticas foi adaptada das metodologias propostas por

Kumar et al., (2006) e Yao et al., (2006), cujo procedimento consistiu em produzir criogis

por crio-copolimerizao dos monmeros de Acrilamida (AAm), N,N'-Metileno-bis-

acrilamida (MBAAm) e Alil Glicidil ter (AGE), sendo iniciada pelo N,N,N',N'-

Tetrametiletilenodiamina (TEMED) e Persulfato de Amnio (APS), sob condies

controladas de temperatura de congelamento -20C.

Os monmeros foram pesados individualmente em balana analtica M254A (Bel

Engineering, Piracicaba, Brasil) seguindo a proporo mssica de 4:1 (AAm +

AGE):MBAAm e 5:1 (AAm):(AGE). A mistura de polimerizao foi preparada dissolvendo-

se todos os componentes em gua ultrapura (MilliQ, Millipore) at concentrao final de 6%

(m/v) de monmeros (AAm + AGE + MBAAm). Para garantir a completa solubilizao, a

mistura foi sonicada em um banho ultrassnico (SoniClean 6, Sanders medical) por 5

minutos. A polimerizao dos radicais livres foi iniciada aps adio em banho de gelo do

APS solubilizado em gua ultrapura e TEMED, ambos em quantidade igual a 1% m/m em

relao massa de monmeros. A soluo homogeneizada foi rapidamente vertida em

seringas plsticas de 5,0 mililitros, seladas e imersas em banho termosttico (Banho

ultratermosttico, Quimis) (-20 2) C e mantidas nesta temperatura por 24 horas.

Decorrido esse tempo, as colunas foram removidas do banho e levadas temperatura de

refrigerao de 4 C por 4 horas para o descongelamento da gua cristalizada no interior da

estrutura. Logo aps, as colunas foram colocadas em estufa (60 2) C e mantidas por

aproximadamente 7 dias, at alcanar peso constante e ento finalizar a etapa de formao da

estrutura porosa.

Posteriormente, as colunas foram reidratadas e lavadas com 200 mL de gua

deionizada utilizando uma bomba peristltica (Minipuls Evolution, Gilson) vazo constante

de 1,0 mL.min-1 para remoo dos monmeros que no reagiram durante a formao da

coluna, e foram novamente secas em estufa (60 2) C, acondicionadas em dessecador e

pesadas em balana analtica, para que fosse verificado por diferena a massa de monmeros

no polimerizada.

40

Logo aps, as colunas tiveram as extremidades cortadas, o tamanho padronizado e

foram identificados individualmente, com os novos pesos registrados para dados de anlises

posteriores.

3.2 Ativaes dos monlitos

Os criogis produzidos foram ativados utilizando-se 5 metodologias distintas, por

meio da circulao e enxertia de solues contendo grupos ligantes atravs das colunas. Para

cada metodologia testada foram utilizados pelo menos oito monlitos previamente

preparados.

3.2.1 Mtodo Epxi

O mtodo de imobilizao seguiu procedimentos semelhantes ao apresentado por

Mallik, Jiang e Hage (2004), com adaptaes.

A ativao foi iniciada lavando-se o criogel com 30 mL de etanol na vazo de 2,0

mL.min-1 (foi passado 15 mL do solvente, aguardou-se 10 minutos em repouso e foi

continuada a lavagem com os 15 mL restantes). Em seguida, o etanol foi diludo em gua na

proporo 1:1 seguindo-se a mesma sequncia. Por fim, a coluna foi lavada com 30 mL de

gua. Logo aps, passou-se 40 mL de tampo carbonato 50 mmol. L-1 (pH 9,5) em re-

circulao por 30 minutos, com uma pausa de 30 minutos e recirculou novamente pelo mesmo

tempo. Em seguida foi preparada uma soluo 2,0 mg.mL-1 de concanavalina A (ConA,

Sigma) no tampo carbonato adicionado de Cloreto de clcio (CaCl2), Cloreto de Mangans

(MnCl2) e Cloreto de Magnsio (MgCl2), cofatores necessrios para a atividade da

concanavalina, todos na concentrao de 0,1 mmol. L-1 e 1% de glicose, para prevenir a

imobilizao das lectinas pelo stio de ligao aos carboidratos. 20 mL dessa soluo foi

recirculada na coluna por 16 horas. Aps essa etapa, a lectina imobilizada foi quantificada por

diferena da soluo antes e aps a recirculao. A leitura foi realizada em espectrofotmetro,

no comprimento de onda de 280 nm. Em seguida, a coluna foi lavada com 30,0 mL de tampo

carbonato, seguido de 40 mL da soluo de etanolamina no tampo (0,1 M) vazo de 2,0

mL.min-1, que foi passado tambm de forma gradativa, escoou 20 mL da soluo, repousou

por 30 minutos e foi continuado o fluxo com os 20 mL restantes, essa soluo foi usada para

bloquear os grupos epxi que no reagiram. Ao trmino, a coluna foi lavada com 30 mL do

tampo carbonato para retirada do excesso da etanolamina. Aps a ativao, a coluna foi

lavada com 40 mL de gua ultrapura e 40 mL do tampo fosfato 20 mmol (pH 7,2).

41

3.2.2 Mtodo da Base de Schiff

O segundo mtodo de imobilizao via ligao covalente, foi o mtodo da base Schiff,

que seguiu a metodologia proposta por Luo et al. (2002) e Mallik et al. (2004) com

adaptaes.

Neste mtodo a coluna foi inicialmente hidratada e enxertada com 30 mL de cido

clordrico (HCl 0,1 mol.L-1), 50 C por 16 horas. Transcorrido esse tempo, a coluna foi

lavada com 30 mL de gua ultrapura na vazo de 2,0 mL.min-1. Posteriormente foi passado 40

mL de cido peridico (HIO4 0,1 mol.L-1) em gua destilada com baixa vazo (1,0 mL.min-1)

por 1 hora. O criogel foi novamente lavado com 30 mL de gua ultrapura. Foi preparado uma

soluo tampo de citrato de sdio 0,1 mol.L-1 (pH 6,4), e 30 mL desta circulou na coluna.

Logo aps, foi preparada uma soluo 2,0 mg.mL-1de ConA (Sigma) no tampo, adicionado

de cloreto de clcio (CaCl2), cloreto de mangans (MnCl2) e cloreto de magnsio (MgCl2),

todos na concentrao de 0,1 mmol.L-1, 1% (m/m) de glicose e cianoborohidreto de sdio 50

mmol.L-1 que um agente redutor seletivo. 20 mL dessa soluo foram recirculados na coluna

em temperatura ambiente por 16 horas. Aps essa etapa, a lectina imobilizada foi quantificada

por diferena na soluo de ConA antes e aps a recirculao. A leitura foi realizada em

espectofotmetro no comprimento de onda de 280 nm. Em continuidade, a coluna foi lavada

com 30 mL do tampo citrato. Sequencialmente circulou soluo de etanolamina (0,1 mol.L-1)

no tampo citrato adicionado de cianoborohidreto de sdio 50 mmol.L-1 para bloquear os

grupos aldedos restantes (passou-se 20 mL, a soluo ficou em repouso na coluna por 30

minutos, e ento passou-se os 20 mL restantes). Posteriormente, a coluna foi lavada com 30

mL do tampo citrato (pH 6,4), 30 mL de gua destilada, e por fim 30 mL do tampo fosfato

(pH 7,2).

3.2.3 Mtodo do Glutaraldedo

Para a imobilizao da ConA utilizando o mtodo do glutaraldedo, foram utilizadas

metodologias adaptadas propostas por Kumar et al., (2003) e Petro et al., (1996).

O procedimento de lavagem inicial da coluna cromatogrfica seguiu o mesmo

princpio da ativao pelo mtodo epxi citado anteriormente para sequncia etanol, etanol-

gua e gua. Finalizada essa etapa, circulou-se 30 mL de tampo carbonato 50 mmol.L-1 (pH

9,5). Tendo sido escoado esse fluido, foi aplicado 40 mL de etilenodiamino 0,5 mol.L-1 no

tampo carbonato em recirculao forada por 2 horas, repouso por 30 minutos e recirculado

por mais 2 horas. A coluna foi ento lavada com gua deionizada at pH neutro.

Posteriormente, foi aplicado 30,0 mL de tampo fosfato 0,1 mol.L-1 (pH 7,2). A sequncia foi

continuada com soluo de glutaraldedo 5% (m/v) em tampo fosfato, onde 40 mL foi

42

recirculada por 2,5 horas, pausada por 30 minutos e recirculada novamente por 2,5 horas.

Findada esta etapa, 20 mL de soluo 2mg.mL-1 de ConA (Sigma) no tampo fosfato,

adicionado de CaCl2, MnCl2 e MgCl2, todos na concentrao de 0,1 mmol.L-1 e 1% de glicose

foram recirculadas por 16 horas. Aps essa etapa, a lectina imobilizada foi quantificada nas

mesmas condies de anlise citadas nas metodologias anteriores. Em continuidade a

ativao, a coluna cromatogrfica foi lavada com 40 mL de tampo carbonato, seguido de 30

mL de soluo de borohidreto de sdio 0,1 mol.L-1 em tampo carbonato, sendo submetido a

recirculao por 1,5 horas, repousada na coluna por 30 minutos e recirculada por mais 1,5

horas, mantendo a vazo constante de 2 mL.min-1. Logo aps, a coluna foi lavada com 100

mL de gua deionizada, 40 mL de etanolamina 0,1 mol.L-1 em tampo carbonato, e

novamente lavada com gua para remoo do excesso da etanolamina, finalizando a ativao

com 30 mL de tampo fosfato.

3.2.4 Mtodo do Etilenodiamina

Para esse mtodo de imobilizao da lectina, repetiu-se a terceira metodologia,

excluindo a etapa de adio do glutaraldedo, para que fosse observado a capacidade adsortiva

da coluna macroporosa sem a incluso de braos espaadores. O criogel epxi-ativado

convertido a uma forma amina-ativado pela reao dos grupos epxi com o reagente

etilenodiamina (PETRO et al., 1996) e assim os radicais carboxila da ConA so adsorvidos na

matriz slida por meio dos grupos ligantes. Trata-se de um mtodo de aminao qumica a

partir da ativao dos grupos carboxlicos presentes na superfcie da protena por meio da

reao com o etilenodiamina.

3.2.5 Mtodo da Dihidrazida Adpica

O mtodo de imobilizao pela dihidrazida do cido adpico seguiu metodologia

descrita por Ruhn et al., (1994) com adaptaes. O procedimento foi iniciado lavando a

coluna monoltica com 30 mL de etanol anidro na vazo de 2 mL.min-1 (foi passado 15 mL do

solvente, aguardou 10 minutos em repouso e a lavagem foi continuada com as 15 mL

restantes), na sequncia, o solvente foi diludo em gua na proporo 1:1 sob as mesmas

condies, finalizando a lavagem com 30mL de gua. Logo aps, circulou-se na coluna 40

mL de tampo citrato 0,1 mol.L-1 (pH 3,0), seguido de 40 mL da soluo do agente reticulante

dihidrazida adpica 0,2 mol.L-1 no referido tampo com recirculao contnua por 4 horas.

Feito isso, os criogis foram mantidos imersos na soluo em repouso 50 C por 16 horas.

Transcorrido o tempo, a soluo foi removida da coluna com o auxlio da bomba peristltica e

o criogel foi lavado com 100 mL de gua, seguido de 40 mL do tampo fosfato 0,1M (pH

43

7,2). Posteriormente foi aplicado na coluna 20 mL da soluo de protena com sais no tampo

fosfato com recirculao. A soluo foi composta de ConA (2mg.mL-1) na soluo tampo,

adicionado de CaCl2, MnCl2 e MgCl2, todos na concentrao de 0,1 mmol.L-1 e 1% de

glicose, por 16 horas. Decorrido o tempo, a coluna foi lavada com 40 mL do tampo

carbonato 0,05 mol.L-1 (pH 9,5). Foi preparada ento uma soluo de borohidreto de sdio

(0,1 mol.L-1) no referido tampo e 40 mL desta foi percolada ao longo da coluna vazo de

2mL.min-1, com reciclo por 1,5 horas, repouso por 30 minutos e reciclo por mais 1,5 horas.

Ao findar, a coluna foi lavada novamente com 100 mL de gua e 40mL do tampo carbonato

com etanolamina (0,1 mol.L-1). Finalizando a ativao, a coluna foi novamente lavada com

mais 100 mL de gua para retirar o excesso da etanolamina, e por fim, com 40mL do tampo

fosfato 0,1 mol.L-1 (pH 7,2). Os criogis foram ento guardados imersos no tampo fosfato

em condies de refrigerao, at a caracterizao.

3.2.6 Incremento dos grupos epxi

Aps testar as 5 metodologias acima descritas, e avaliar a que obteve maior taxa de

imobilizao de ConA, foi avaliada uma ltima metodologia, que consistiu em incrementar a

quantidade de radicais epxi na coluna monoltica. Para tanto, o procedimento foi iniciado

com a lavagem da coluna macroporosa com 100 mL de gua destilada, seguida de 40 mL de

soluo de borohidreto de sdio 0,1 mol.L-1 em tampo carbonato pH 9,5 (passou-se 20 mL

da soluo na vazo de 2mL.min-1, esta foi mantida em repouso por 30 minutos, logo aps

passou-se os 20 mL restantes). Feito isso, a coluna foi lavada com NaOH 0,1 mol.L-1 em gua

destilada nas mesmas condies de escoamento da soluo anterior. Em seguida, foi

misturada soluo de NaOH 0,5 M e epicloridrina em concentrao igual a 2%. A

epicloridrina o agente de reticulao que ir aumentar os grupos epxi na coluna. Esta

soluo foi aplicada em recirculao contnua por 16 horas. Finalizou-se esta etapa lavando a

coluna com gua at alcanar pH neutro, para ento se iniciar a etapa de ativao com a

metodologia que apresentou melhores resultados.

3.3 Avaliao fsica, qumica e hidrodinmica dos criogis funcionalizados

A anlise dos aspectos fsicos (porosidade e tamanho de poros), hidrodinmicos

(permeabilidade ao escoamento e distribuio de tempos de residncia) e qumicos (grau de

enxertia, nmero de stios ativos) dos criogis vem sendo relatada por diversos autores, e os

resultados discutidos com relao s modificaes nos processos de obteno das colunas

supermacroporosas, bem como os mtodos de enxertia testados em relao interao dos

mesmos (SAVINA et al., 2005a e 2005b; YAO et al., 2006a; CHEN et al., 2008).

44

Para a caracterizao das colunas supermacroporosas produzidas, foram selecionados

8 criogis ativados, de cada uma das 6 distintas metodologias de enxertia conforme as

metodologias descritas a seguir.

3.3.1 Capacidade de Inchamento

A capacidade de inchamento do criogel (Sw/w), que corresponde quantidade da gua

absorvida por massa de criogel desidratado, foi determinada utilizando os criogis produzidos,

secos em estufa (60 2) C, at peso constante e resfriados em dessecador. Essas amostras

ti