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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CAMPUS DE PATOS
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
Mycobacterium spp. EM BOVINOS POSITIVOS NO TESTE DE
TUBERCULINIZAÇÃO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária
do Centro de Saúde e Tecnologia Rural
da Universidade Federal de Campina
Grande, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre.
JOELSON MARCOLINO RAMOS
PATOS – PB
JUNHO – 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE CAMPINA GRANDE
CENTRO DE SAÚDE E TECNOLOGIA RURAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
CAMPUS DE PATOS
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
Mycobacterium spp. EM BOVINOS POSITIVOS NO TESTE DE
TUBERCULINIZAÇÃO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária
do Centro de Saúde e Tecnologia Rural da
Universidade Federal de Campina
Grande, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre.
Mestrando: Joelson Marcolino Ramos
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Santos de Azevedo
PATOS – PB
JUNHO – 2016
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO CSRT DA UFCG
R175i
Ramos, Joelson Marcolino
Isolamento e identificação de Mycobacterium spp. em bovinos
positivos no teste de tuberculinização / Joelson Marcolino Ramos. –
Patos, 2016.
52f.: il. color.
Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Universidade
Federal de Campina Grande, Centro de Saúde e Tecnologia Rural, 2016.
"Orientação: Prof. Dr. Sergio Santos de Azevedo”
“Coorientação: Prof. Dr. Albério Antônio de Barros Gomes”
Referências.
1. Isolamento micobacteriano. 2. Identificação molecular. 3. Leite. 4.
Mycobacterium bovis. 5. Tuberculose. I. Título.
CDU 614: 619
JOELSON MARCOLINO RAMOS
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
Mycobacterium spp. EM BOVINOS POSITIVOS NO TESTE DE
TUBERCULINIZAÇÃO
Dissertação aprovada em: ____/____/____
Comissão Examinadora:
________________________________________
Prof. Dr. Sérgio Santos Azevedo
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária/CSTR/UFCG
_________________________________________
Prof. Dr. Severino Silvano dos Santos Higino
Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária/CSTR/UFCG
_________________________________________
Prof.ª Dr.ª Vivianne Cambuí Figueiredo Rocha
Instituto Federal da Paraíba
AGRADECIMENTOS
Primeiramente á Deus por me permitir realizar mais uma conquista em minha
vida, pois sem ele nada seria possível, amigo verdadeiro e companhia de todas as horas
e situações.
Agradeço aos meus amados pais, Albenor e Maria Nazareth, por terem me
apoiado sempre em toda a caminhada da minha vida.
As minhas irmãs, Jacksciene, Jaciara e Janayna pela amizade, companheirismo,
carinho, briga, e atenção uns com os outros. Amo muito vocês.
A minha querida companheira Janaina por sempre estar me suportando e
mostrando o que é amar sem questionar, nestes 8 anos, mesmo antes de iniciar esta
caminhada, sempre esteve ao meu lado me ajudando a superar todas dificuldades
impostas pela vida. Te amo.
A todos os professores pelos ensinamentos que me foram dados durante o trabalho
para a minha formação, em especial para as professoras Maria das Graças e Márcia
Melo, e para os professores Almir, Pedro Isidro, Eldinê Miranda, Clebert Alves e
Albério entre outros.
Ao orientador Prof. Sérgio Santos de Azevedo, pela atenção, e compromisso,
pelos conhecimentos imprescindíveis que me passou, sendo extremamente importante
para meu crescimento profissional, por ter acreditado desde o primeiro dia de trabalho.
Só tenho a agradecer a oportunidade e os conhecimentos adquiridos nesse período de
trabalho.
À toda equipe do Laboratório de Patologia Animal por toda ajuda prestada e pela
amizade em especial ao Prof. Antônio Flavio pela disposição em todos os momentos do
trabalho.
A todos que trabalham no Laboratório de Doenças Transmissíveis do
CSTR/UFCG que deram sua contribuição para minha formação.
Ao apoio que os funcionários da SEDAP de cada ULSAV, Carpejane, Aluizio,
Sóstenes, Petrônio e Aricélio. Que me ofereceram todo o suporte técnico para a
realização da pesquisa a campo.
Aos que contribuíram direta e indiretamente para a conclusão deste trabalho,
como Samara amiga de todas as horas.
Muito obrigado!
RESUMO
Em áreas onde a tuberculose humana e a tuberculose bovina coexistem, a diferenciação
entre M. bovis e M. tuberculosis é importante para monitorar a disseminação de M.
bovis entre bovinos e destes para os seres humanos, de maneira que o objetivo deste
estudo foi isolar e identificar M. bovis em bovinos com diagnóstico positivo pelo teste
de tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. Foram utilizados 32
bovinos positivos ao teste de tuberculinização, dos quais foram colhidas amostras de
qualquer órgão com lesões sugestivas de tuberculose, e nos casos em que não foram
observadas lesões sugestivas foram colhidas amostras de linfonodos parotídeo,
sublingual, retrofaríngeo, mediastínico e mesentérico. Amostras de leite foram coletadas
de 16 animais de sete propriedades. Foram realizados exames histopatológicos, cultivo
micobacteriológico, coloração de Ziehl Neelsen e diagnóstico molecular. Vinte e um
(65,6%) animais apresentaram lesões sugestivas de tuberculose. Macroscopicamente,
foram observadas lesões granulomatosas nodulares, de aspecto caseoso e/ou calcificado,
focal e disseminadas, de tamanho e forma variados. Microscopicamente, foi
evidenciado processo inflamatório do tipo granulomatoso em diferentes estágios de
evolução, com extenso granuloma caracterizado por área central de necrose de
coagulação, material eosinofílico homogêneo, núcleos fragmentados, restos nucleares e
focos de mineralização, circundado por infiltrado inflamatório predominantemente de
macrófagos e células epitelioides encapsulado por abundante tecido conjuntivo fibroso
associado a várias camadas de células mononucleares. Com relação à distribuição das
lesões de acordo com a região corporal, 77,7% localizavam-se na cavidade torácica,
12,4% na cabeça e 9,9% na cavidade abdominal. De 55 amostras de tecido submetidas
ao cultivo de micobactérias, em 31 (56,4%) foram isoladas micobactérias, sendo que em
13 (41,9%) foi identificado M. bovis e nas demais 18 (58,1%) foi identificado
Mycobacterium spp. Foram isoladas micobactérias de cinco (31,25%) das 16 amostras
de leite, sendo três amostras classificadas como M. bovis, e duas como Mycobacterium
spp. Conclui-se que o isolamento e a identificação de M. bovis e Mycobacterium spp.
em bovinos positivos na tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil,
sugere que os seres humanos estão expostos ao risco de infecção. Isso reforça a
necessidade de intensificação e otimização de medidas de prevenção e controle
previstas no Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose
Bovina (PNCEBT), como o incentivo à certificação de propriedades rurais controladas e
livres para tuberculose e medidas de controle de trânsito e feiras de animais. Particular
atenção deve ser dada à importância da inspeção sanitária de animais de abate na
identificação de focos de tuberculose, bem como sugere-se a realização de estudos de
isolamento e identificação de micobactérias em outros Estados do Nordeste.
Palavras-chave: Isolamento micobacteriano, identificação molecular, leite,
Mycobacterium bovis, tuberculose.
ABSTRACT
In areas where human and bovine tuberculosis coexist, the differentiation between M.
bovis and M. tuberculosis is important for monitoring the spread of M. bovis among
cattle and from cattle to humans, so that the objective of this study was to isolate and
identify M. bovis from cattle with a positive diagnosis identified using tuberculin test in
the State of Paraíba, Northeastern Brazil. It were used 32 bovines positive at the
tuberculin test, from which samples of any organ with tuberculosis suggestive lesions
were collected, or samples of parotid, sublingual, retropharyngeal, mediastinal or
mesenteric lymph nodes were collected when no gross lesions were observed. Milk
samples were collected from 16 cows from seven herds. Histopathological exams,
mycobacteriological culture, Ziehl Neelsen staining and molecular diagnosis were
performed. Twenty-one (65.6%) animals presented tuberculosis suggestive lesions.
Macroscopically, it were observed caseous and/or calcified nodular granulomatous
lesions, focal and disseminated, of varying size and shape. Microscopically, it were
evidenced inflammation of granulomatous type at different stages, with extensive
granuloma characterized by central area of coagulation necrosis, homogeneous
eosinophilic material, fragmented nuclei, nuclear debris and mineralization foci
surrounded by inflammatory infiltrate predominantly macrophages and epithelioid cells
encapsulated by abundant fibrous connective tissue associated with several layers of
mononuclear cells. Related to distribution of lesions according to body region 77.7%
were from thoracic cavity, 12.4% from head and 9.9% from abdominal cavity. Of 55
samples submitted to mycobacterial culture in 31 (56.4%) mycobacteria were isolated,
being 13 (41.9%) identified as M. bovis and 18 (58.1%) as Mycobacterium spp.
Mycobacteria were isolated from five (31.25%) of the 16 milk samples; three samples
were classified as M. bovis, and two as belonging to the Mycobacterium genus. It is
concluded that the isolation and identification of M. bovis and Mycobacterium spp. in
bovines positive at tuberculin test in the State of Paraiba, Northeastern Brazil suggests
that humans are exposed to the risk of infection. This reinforces the need for
intensification and optimization of prevention and control measures foreseen in the
Bovine Brucellosis and Tuberculosis National Control and Eradication Program
(PNCEBT) as encouraging certification of tuberculosis-controlled and free rural
properties and control of animal movement and fairs. Particular attention should be
given to the importance of sanitary inspection of slaughtered animals in the
identification of tuberculosis foci, and it is suggested to carry out mycobacteria isolation
and identification surveys in other Northeastern states.
Key words: Mycobacterial isolation, molecular identification, milk, Mycobacterium
bovis, tuberculosis.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................... 12
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 13
CAPÍTULO I .................................................................................................................. 14
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis no leite de vacas no Nordeste do
Brasil ............................................................................................................................... 14
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 19
CAPÍTULO II ................................................................................................................. 22
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no teste de
tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil ........................................... 22
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 25
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 26
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 27
CONCLUSÕES .......................................................................................................... 30
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 30
CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 36
ANEXO I ........................................................................................................................ 37
ANEXO II ...................................................................................................................... 44
ANEXO III ..................................................................................................................... 49
LISTA DE QUADRO E TABELAS
CAPÍTULO II
Quadro 1- Resultados da análise de cultivo e identificação de amostras realizadas por
meio de TB Multiplex PCR com amplificação para complexo M. tuberculosis e primers
RD-4 para identificação de M. bovis no Estado da Paraíba.............................................34
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO II
Figura 1. (A) Linfonodo mediastino apresentando nódulos de aspecto caseoso. (B)
Pulmão com nódulos de aspecto caseoso disseminados, de tamanho e formas
variadas............................................................................................................................35
Figura 2. (A) Linfonodo mediastínico com área central de necrose, com material
eosinofílico homogêneo, núcleos fragmentados, restos nucleares e focos de
mineralização. Adjacente à área de necrose há inflamação granulomatosa constituída
por macrófagos, células epitelioides e linfócitos abundantes. Observa-se também
proliferação discreta de tecido conjuntivo fibroso. Obj. 10X, HE. Escala de barra =
100µm; (B) Pulmão com extenso granuloma caracterizado por área central de necrose
de coagulação, circundado por infiltrado inflamatório predominantemente de
macrófagos e células epitelioides encasulado por abundante tecido conjuntivo fibroso
associado a várias camadas de células mononucleares. Obj. 5X, HE. Escala de barra =
200µm..............................................................................................................................35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Por cento
°C Graus Celsius
μL Microlitro
AFB Acid Fast Bacilli
BAAR Bacilos Álcool-Ácido Resistentes
Bp Pares de bases
DNA Ácido Desoxirribonucleico
dNTP DesoxinucleotídeoTrifosfasto
HIV Vírus da Imunodeficiência Adquirida
HPC 1 - hexadecilpiridínio Cloreto
KCl Cloreto de Potássio
M. avium Micobacterium avium
M. bovis Micobacterium bovis
M. intracellulare Micobacterium intracellulare
M. tuberculosis Micobacterium Tuberculosis
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MgCl2 Cloreto de Magnésio
mL Mililitro
mM Milímetros
NTM Micobactérias não tuberculosas
PCR Reação em cadeia de polimerase
pH Potencial Hidrogeniônico
Pmol Picomoles
PNCEBT Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose
Rpm Rotação por minuto
S Sul
W Oeste
12
INTRODUÇÃO GERAL
A tuberculose bovina é uma zoonose de evolução crônica causada pelo
Mycobacterium bovis, que pertence ao Complexo Mycobacterium tuberculosis. A
doença é responsável por perdas econômicas relacionadas à reduzida eficiência
reprodutiva, diminuição da produção de leite e menor ganho de peso, condenação de
carcaças, e restrições ao comércio internacional de animais e produtos de origem animal
(BRASIL, 2006).
O diagnóstico presuntivo pode ser efetuado por métodos diretos e indiretos. Os
diretos envolvem detecção e identificação do agente etiológico em material biológico,
sendo que a combinação do isolamento em meio de cultura e a identificação e
genotipagem molecular tem contribuído para melhor compreensão da epidemiologia das
infecções por M. bovis, o que proporciona aumento na eficiência dos programas de
controle (CAZOLA et al., 2015).
Enquanto a maioria dos casos de tuberculose em humanos é causada por M.
tuberculosis, estima-se que cerca de 3,1% dos casos de tuberculose humana no mundo
são causados por M. bovis (EL SAYED et al., 2015). A distinção dos vários membros
do complexo M. tuberculosis é essencial para a investigação epidemiológica de casos
bovinos (OCEPEK et al., 2005), de maneira que a diferenciação entre M. bovis e M.
tuberculosis é importante para a identificação da possível fonte de infecção e das vias de
transmissão da doença, que são fundamentais para melhor controle e erradicação
(ZANINI et al. 2001, RODRIGUEZ et al., 2004).
A presente Dissertação é composta por dois capítulos. No primeiro capítulo é
apresentado um artigo submetido ao periódico Ciência Rural acerca do isolamento e
identificação de micobactérias em leite de bovinos positivos no teste de
tuberculinização, e o segundo capítulo contempla outro artigo científico submetido ao
periódico Pesquisa Veterinária Brasileira, cujo objetivo foi o isolamento e identificação
de micobactérias a partir de tecidos de bovinos positivos no teste de tuberculinização no
Estado da Paraíba.
13
REFERÊNCIAS
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Programa Nacional de
Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (PNCEBT) - Brasília:
MAPA/SDA/DSA, 2006.188p.
CAZOLA, D.O.; JORGE, K.S.G.; ZUMÁRRAGA, M.J.; SOUZA-FILHO, A.F.;
FLÁBIO R. ARAÚJO, F.R.; ANA LUIZA A.R. OSÓRIO, A.R.O. Identificação e
genotipagem de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no teste intradérmico para
tuberculose em Mato Grosso do Sul. Pesq. Vet. Bras. v.35, n.2, p.141-147, 2015.
EL-SAYED, A.; EL-SHANNAT, S.; KAMEL, M.; CASTAÑEDA-VAZQUEZ,
M.A.; CASTAÑEDA-VAZQUEZ, H. Molecular epidemiology of Mycobacterium bovis
in humans and cattle. Zoonoses Public Health.v.63, n.4, p.251-264, 2015.
OCEPEK, M.; PATE, M.; ZOLNIR-DOVC, M.; POLJAK, M. Transmission of
Mycobacterium tuberculosis from human to cattle. J. Clin. Microbiol. v.43, n.7, p.3555–
3557, 2005.
RODRIGUEZ, C.A.R.; ZUMÁRRAGA, M.J.; OLIVEIRA, E.M.D.; CATALDI, A.A.,
ROMANO, M.I.; OTTO, H.H.; BONAFÉ, V.L.; FERREIRA NETO, J.S.
Caracterização molecular de isolados de Mycobacterium bovis do Estado de São Paulo
Brasil, utilizando a técnica de spoligotyping. Arq. Inst. Biol. v.71, n.3, p.277-282, 2004.
ZANINI, M.S.; MOREIRA, E.C.; LOPES, M.T.P.; OLIVEIRA, R.S.; LEÃO, S.C.
FIORAVANTI, R.I.; R OXO, E.; ZUMÁRRAGA, M.;ROMANO, M.I.; CATALDI, A.;
SALAS, C.E. Mycobacterium bovis: Polymerase Chain Reaction identification in
bovine lymphonode biopsies and genotyping in isolates from Southeast Brazil by
Spolygotyping and Restriction Fragment Length Polymorphism. Mem. Inst.
OswaldoCruz, v.96, p.809-813, 2001.
14
CAPÍTULO I
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis no leite de vacas no Nordeste do
Brasil
(Artigo científico submetido ao periódico Ciência Rural)
15
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis no leite de vacas no Nordeste do
Brasil
Isolation and identification of Mycobacterium bovis in milk from cows in Northeastern
Brazil
Joelson Marcolino RamosI Marcos Bryan HeinemannII José Soares Ferreira NetoII Antônio
Francisco de Souza FilhoII Nicolás Céspedes CárdenasII Clebert José AlvesI Sérgio Santos de
AzevedoI*1
RESUMO
Amostras de leite de 16 vacas positivas no teste de tuberculinização no Estado da
Paraíba, Nordeste do Brasil, foram utilizadas para o isolamento e identificação de
micobactérias. Foram isoladas micobactériasa em cinco (31,25%) amostras de leite; três
amostras foram classificadas como M. bovis, e duas como pertencentes ao gênero
Mycobacterium. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo de isolamento e
identificação de M. bovis no leite de vacas no Nordeste do Brasil, o que sugere que os seres
humanos estão expostos ao risco de contaminação por ingestão.
Palavras-chave: Mycobacterium bovis; isolamento; leite
ABSTRACT
Milk samples from 16 cows that tested positive on the tuberculin test in the State of
Paraíba, Northeastern Brazil, were used for mycobacteria isolation and identification.
Mycobacteria were isolated from five (31.25%) of the 16 milk samples; three samples were
classified as M. bovis, and two as belonging to the Mycobacterium genus. To our knowledge,
this is the first study of isolation and identification of M. bovis in milk from cows in
Northeastern Brazil, which suggests that humans are at risk of contamination by ingestion.
Key words: Mycobacterium bovis; isolation; milk
ILaboratório de Doenças Transmissíveis, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Centro de Saúde e
Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande, Patos, PB, Brasil. E-mail:[email protected].
* Autor para correspondência. IILaboratório de Zoonoses Bacterianas, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal,
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, SP, Brasil.
16
A tuberculose bovina é uma zoonose de evolução crônica causada pelo
Mycobacterium bovis, que pertence ao complexo Mycobacterium tuberculosis. A doença é
responsável por perdas econômicas relacionadas à redução da eficiência reprodutiva, queda na
produção de leite e no ganho de peso, condenação de carcaças e restrições ao comércio
internacional de animais e produtos de origem animal (BRASIL, 2006).
Enquanto a maioria dos casos de tuberculose em humanos é causada por M.
tuberculosis, estima-se que cerca de 3,1% dos casos de tuberculose humana no mundo são
causados por M. bovis (EL SAYED et al., 2015). No entanto, a infecção em seres humanos
geralmente não é confirmada por isolamento e identificação do agente, o que torna impossível
identificar a possível fonte de infecção. Além disso, as doenças humanas causadas por M.
tuberculosis e M. bovis são indistinguíveis usando métodos clínicos, radiológicos e
patológicos (ROCHA et al., 2011). A transmissão de M. bovis para os seres humanos ocorre
através do consumo de leite cru e produtos lácteos, consumo de carne de animais infectados
ou através do contato com secreções de abscessos fistulados.
No Estado da Paraíba, dados oficiais indicam a ocorrência de 1.015 casos de
tuberculose humana em 2014 (BRASIL, 2015). Em áreas onde a tuberculose humana e bovina
coexistem, a diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis é importante para monitorar a
disseminação de M. bovis nos rebanhos e de bovinos para os seres humanos. Assim, o
objetivo deste estudo foi isolar e identificar M. bovis no leite de vacas com diagnóstico
positivo identificado por meio do teste da tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do
Brasil.
Foram utilizadas amostras de leite de 16 vacas que apresentaram resultado positivo no
teste de tuberculinização de sete propriedades diferentes, localizadas nos municípios de
Cacimba de Areia, Patos, Piancó e São Mamede. As propriedades foram denominadas: A
(Coordenadas: 07º13'28,9"S 37º56'21,7"W), B (07º08'41,7"S 37º07'16,7"W), C (06º56'41,7"S
37º10'22,6"W), D (06º58'37,3"S 37º16'38,7"W), E (06º57'53,5"S 37º20'32,2"W), F
(06º58'36,0"S 37º17'21,9"W) e G (07º00'24,3"S 37º16'15,6"W). O leite foi coletado
diretamente das tetas dos animais antes da ordenha, seguindo todos os métodos de antissepsia.
Uma média de 15 ml de leite por animal foi recolhido, utilizando frascos estéreis e
previamente identificados. Estes foram enviados para o laboratório em caixas isotérmicas com
gelo.
Para o isolamento de Mycobacterium spp. utilizou-se uma alíquota de 5 ml de leite,
centrifugou-se a 3000 rpm durante 20 minutos. Deste modo, foram obtidas duas fases de leite,
gordura e sedimentos, que foram acondicionadas em frascos diferentes e descontaminadas
17
pelo método de Petroff (KANTOR, 1979), inoculadas em duplicata nos meios de Stonebrink-
Leslie e Lowenstein-Jensen, e incubadas posteriormente a 37 °C durante 90 dias. Colônias
sugestivas de micobactérias foram coradas pelo método de Ziehl Neelsen; As amostras
identificadas como Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR) foram submetidos à
identificação molecular. O DNA foi extraído usando termólise (MAZARS et al., 2001).
A identificação de micobactérias e diferenciação do complexo M. tuberculosis,
complexo M. avium, complexo M. intracellurare e Mycobacterium spp. foram feitas usando o
TB Multiplex PCR (WILTON & COUSINS, 1992). Para isso, os primers utilizados foram:
MYCGEN-F (G1) (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') e MYCGEN-R (G2) (5'-
TGCACACAGGCCACAAGGGA-3') – relacionados ao gênero; TB-1F (5'-
GAACAATCCGGAGTTGACAA-3') e TB-1R (5'-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3') -
relacionados ao complexo M. tuberculosis; MYCAV-R (5'-
ACCAGAAGACATGCGTCTTG-3') - relacionado com o complexo M. avium; e MYCINT-F
(5'-CCTTTAGGCGCATGTCTTTA-3') - relacionado ao complexo M. intracellulare. Foram
utilizadas como controles positivos as estirpes AN5 para M. bovis e H37Rv para M.
tuberculosis. Reações com 50µL foram realizadas contendo o tampão de reação dNTP
(1,25mM cada), 20pmol de cada oligonucleótido, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH
8,3), 1,5 mM MgCl2, 10pmol/µL de primers, 1,25 unidades de Taq polimerase (1,0μL ) e 5µL
do DNA em estudo. Os ciclos de amplificação utilizados foram: uma vez a 94°C durante 10
minutos, a 61°C durante 2 minutos, e 72°C durante 3 minutos; 33 vezes a 94°C durante 30
segundos, 61°C durante 2 minutos, e 72°C durante 3 minutos; uma vez a 94°C durante 30
segundos, 61°C durante 2 minutos, e 72°C durante 10 minutos. Amostras com amplificação
de 1030pb foram identificadas como pertencendo ao gênero Mycobacterium, e amostras com
fragmentos de 372pb foram consideradas membros do complexo M. tuberculosis (WILTON
& COUSINS, 1992).
Todas as amostras de DNA com amplificação consistente para M. tuberculosis
utilizando o TB Multiplex PCR foram amplificadas com os iniciadores RD4 (RD4-1 5'-ATG
TGCGAGCTGAGCGATG-3'; RD4-2 5'-TGTACTATGCTGACCCATGCG-3'; e RD4-3 5'-
AAAGGAGCACCATCGTCCAC-3') para identificação de M. bovis (WARREN et al., 2006).
Reações com 25µL foram realizadas contendo o tampão de reação de dNTP (1,25 mM cada),
20pmol de cada oligonucleótido, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM
MgCl2, primers, 1,25 unidades de Taq polimerase, e 5µL do DNA genômico estudado. Os
controles positivos utilizados foram a estirpe AN5 para M. bovis e H37Rv para M.
tuberculosis. Os ciclos de PCR utilizados foram: uma vez a 95°C durante 15 minutos, 45
18
vezes a 94°C durante 1 minuto, 62°C durante 1 minuto, e 72°C durante 1 minuto, e uma vez a
72°C durante 10 minutos. Amostras com produtos amplificados de 268pb foram identificadas
como M. bovis, e de 172pb como outras micobactérias do complexo M. tuberculosis.
Foram isoladas micobactérias em cinco (31,25%) das 16 amostras de leite; três
amostras foram classificadas como M. bovis, e duas como pertencentes ao gênero
Mycobacterium. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo de isolamento e
identificação de M. bovis no leite de vacas no Nordeste do Brasil. Vários estudos foram
realizados em outros Estados a fim de isolar e identificar micobactérias no leite das vacas. Em
São Paulo, PARDO et al. (2001) isolaram M. bovis em uma amostra de leite cru; LEITE et al.
(2003), utilizando amostras de leite dos estados de São Paulo, Paraná, Santa Catarina, Goiás e
Pará, isolaram M. bovis em uma amostra de leite cru. FRANCO et al. (2013), na região
sudeste de São Paulo, isolaram M. bovis a partir de uma amostra de leite de tanque de
resfriamento individual.
O leite e os seus derivados, quando contaminados e não pasteurizados, apresentam
risco significativo de transmissão da tuberculose para os seres humanos. Estima-se que cerca
de 50% ou mais do leite produzido no Brasil não é pasteurizado (LEITE et al., 2003),
atribuindo sérios riscos de transmissão de várias doenças para os seres humanos, incluindo a
tuberculose causada por M. bovis. Vale destacar que é comum no Nordeste do Brasil o
consumo de leite cru.
Um aspecto importante foi o isolamento e identificação de Mycobacterium spp. em
duas amostras, provavelmente micobactérias não tuberculosas ambientais (NTM), que estão
presentes no meio ambiente e podem ser transmitidas aos animais e seres humanos (FRANCO
et al., 2013) através de inalação ou ingestão, resultando na colonização permanente ou
temporária do trato respiratório e digestivo (PRIMM et al., 2004). O número crescente de
indivíduos infectados com HIV predispõe ao aumento no número de casos de doenças
emergentes e reemergentes, especialmente as causadas por agentes oportunistas, tais como
Mycobacterium spp. Neste contexto, o leite não pasteurizado contaminado com micobactérias
representa sério risco para indivíduos com HIV (FRANCO et al., 2013).
A presença de M. bovis e Mycobacterium spp. no leite de vacas no Estado da Paraíba,
Nordeste do Brasil sugere que os seres humanos estão em risco de contaminação por ingestão.
Isso reforça a necessidade de implementar medidas preventivas para evitar a contaminação do
leite com NTM e M. bovis durante e após a ordenha, otimização dos programas de leite e de
produtos lácteos de qualidade, melhorar inspeções sanitárias desses produtos, e realizar
estudos para isolar e identificar micobactérias no leite de outros Estados do Nordeste.
19
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
suporte financeiro (processo no. 302131/2012-4).
COMITÊ DE ÉTICA
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (Universidade
Federal de Campina Grande – UFCG) (protocolo 25-2012).
REFERÊNCIAS
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Acesso em 20 jan. 2016.
22
CAPÍTULO II
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no teste de
tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil
(Artigo científico submetido ao periódico Pesquisa Veterinária Brasileira)
23
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no teste de
tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil
Joelson M. Ramos2, Marcos B. Heinemann3, José S. Ferreira Neto3, Antonio F. Souza Filho2,
Nicolás C. Cárdenas3, Antônio F. M. Dantas2, Clebert J. Alves2, Sérgio S. Azevedo2*
ABSTRACT. -Ramos J.M., Heinemann M.B., Ferreira Neto J.S., Souza Filho A.F., Cárdenas N.C.,
Dantas A.F.M., Alves C.J. and Azevedo S.S. 2016. [Isolation and identification of
Mycobacterium bovis from bovines positive catthe tuberculin test in the State of Paraíba,
Northeastern Brazil] Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis em bovinos positivos no
teste de tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira
00(0):000-000. Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Centro de Saúde e Tecnologia Rural,
Universidade Federal de Campina Grande, Av. Universitária s/n, Caixa Postal 61, Santa Cecília,
Patos, PB 58700-970, Brasil. E-mail: [email protected]
In areas where human and bovine tuberculosis coexist, the differentiation between M. bovis
and M. tuberculosis is important for monitoring the spread of M. bovis among cattle and from cattle
to humans, so that the objective of this study was to isolate and identify M. bovis from cattle with a
positive diagnosis identified using tuberculin test in the State of Paraíba, Northeastern Brazil. It
were used 32 bovines positive at the tuberculin test, from which samples of any organ with
tuberculosis suggestive lesions were collected, or samples of parotid, sublingual, retropharyngeal,
mediastinal or mesenteric lymph nodes were collected when no gross lesions were observed.
Samples were submitted to histopathological exam, mycobacteriological culture, Ziehl Neelsen
staining and molecular diagnosis. Twenty-one (65.6%) animals presented tuberculosis suggestive
lesions. Macroscopically, it were observed caseous and/or calcified nodular granulomatous lesions,
focal and disseminated, of varying size and shape. Microscopically, it were evidenced inflammation
of granulomatous type at different stages, with extensive granuloma characterized by central area of
coagulation necrosis, homogeneous eosinophilic material, fragmented nuclei, nuclear debris and
mineralization foci surrounded by inflammatory infiltrate predominantly macrophages and
epithelioid cells encapsulated by abundant fibrous connective tissue associated with several layers
Recebido em.........
Aceito para publicação em XXXXX 2 Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária (UAMV), Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Av.
Universitária s/n, Caixa Postal 61, Santa Cecília, Patos, PB 58700-970, Brasil. *Autor para correspondência:
[email protected] 3Laboratório de Zoonoses Bacterianas (LZB), Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal
(VPS), Universidade de São Paulo (USP), Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva 87, Butantã, São Paulo, SP 05508-
270, Brasil.
24
of mononuclear cells. Related to distribution of lesions according to body region 77.7% were from
thoracic cavity, 12.4% from head and 9.9% from abdominal cavity. Of 55 samples submitted to
mycobacterial culture in 31 (56.4%) mycobacteria were isolated, being 13 (41.9%) identified as M.
bovis and 18 (58.1%) as Mycobacterium spp. It is concluded that the isolation and identification of
M. bovis and Mycobacterium spp. in bovines positive at tuberculin test in the State of Paraiba,
Northeastern Brazil suggests that humans are exposed to the risk of infection. This reinforces the
need for intensification and optimization of prevention and control measures foreseen in the Bovine
Brucellosis and Tuberculosis National Control and Eradication Program (PNCEBT) as encouraging
certification of tuberculosis-controlled and free rural properties and control of animal movement
and fairs. Particular attention should be given to the importance of sanitary inspection of
slaughtered animals in the identification of tuberculosis foci, and it is suggested to carry out
mycobacteria isolation and identification surveys in other Northeastern states.
INDEX TERMS: Mycobacteria, bovine, immunodiagnosis, isolation and molecular identification,
Northeastern Brazil.
RESUMO. – Em áreas onde a tuberculose humana e a tuberculose bovina coexistem, a
diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis é importante para monitorar a disseminação de M.
bovis entre bovinos e destes para os seres humanos, de maneira que o objetivo deste estudo foi
isolar e identificar M. bovis em bovinos com diagnóstico positivo pelo teste de tuberculinização no
Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. Foram utilizados 32 bovinos positivos ao teste de
tuberculinização, dos quais foram colhidas amostras de qualquer órgão com lesões sugestivas de
tuberculose, e nos casos em que não foram observadas lesões sugestivas foram colhidas amostras de
linfonodos parotídeo, sublingual, retrofaríngeo, mediastínico e mesentérico. As amostras foram
submetidas a exame histopatológico, cultivo micobacteriológico, coloração de Ziehl Neelsen e
diagnóstico molecular. Vinte e um (65,6%) animais apresentaram lesões sugestivas de tuberculose.
Macroscopicamente, foram observadas lesões granulomatosas nodulares, de aspecto caseoso e/ou
calcificado, focal e disseminadas, de tamanho e forma variados. Microscopicamente, foi
evidenciado processo inflamatório do tipo granulomatoso em diferentes estágios de evolução, com
extenso granuloma caracterizado por área central de necrose de coagulação, material eosinofílico
homogêneo, núcleos fragmentados, restos nucleares e focos de mineralização, circundado por
infiltrado inflamatório predominantemente de macrófagos e células epitelioides encapsulado por
abundante tecido conjuntivo fibroso associado a várias camadas de células mononucleares. Com
relação à distribuição das lesões de acordo com a região corporal, 77,7% localizavam-se na
25
cavidade torácica, 12,4% na cabeça e 9,9% na cavidade abdominal. De 55 amostras submetidas ao
cultivo de micobactérias, em 31 (56,4%) foram isoladas micobactérias, sendo que em 13 (41,9%)
foi identificado M. bovis e nas demais 18 (58,1%) foi identificado Mycobacterium spp. Conclui-se
que o isolamento e a identificação de M. bovis e Mycobacterium spp. em bovinos positivos na
tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil, sugere que os seres humanos estão
expostos ao risco de infecção. Isso reforça a necessidade de intensificação e otimização de medidas
de prevenção e controle previstas no Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e
Tuberculose Bovina (PNCEBT), como o incentivo à certificação de propriedades rurais controladas
e livres para tuberculose e medidas de controle de trânsito e feiras de animais. Particular atenção
deve ser dada à importância da inspeção sanitária de animais de abate na identificação de focos de
tuberculose, bem como sugere-se a realização de estudos de isolamento e identificação de
micobactérias em outros Estados do Nordeste.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: Micobactérias, bovino, imunodiagnóstico, isolamento e identificação
molecular, Nordeste do Brasil.
INTRODUÇÃO
A tuberculose bovina é uma zoonose de evolução crônica causada pelo Mycobacterium bovis, que
pertence ao Complexo Mycobacterium tuberculosis (Brasil 2006). O diagnóstico pode ser efetuado
por métodos diretos e indiretos. Os diretos envolvem detecção e identificação do agente etiológico
em material biológico, sendo que a combinação do isolamento em meio de cultura e a identificação
e genotipagem molecular tem contribuído para melhor compreensão da epidemiologia das infecções
por M. bovis, o que proporciona aumento na eficiência dos programas de controle (Cazola et al.
2015).
Enquanto a maioria dos casos de tuberculose em humanos são causados por M. tuberculosis,
estima-se que cerca de 3,1% dos casos de tuberculose humana no mundo são causados por M. bovis
(El Sayed et al. 2015). No entanto, a infecção em seres humanos geralmente não é confirmada por
isolamento e identificação do agente, o que torna impossível identificar a possível fonte de infecção.
Além disso, as doenças humanas causadas por M. tuberculosis e M. bovis são indistinguíveis
usando métodos clínicos, radiológicos e patológicos (Rocha et al. 2011). A distinção dos vários
membros do complexo M. tuberculosis é essencial para a investigação epidemiológica de casos
bovinos (Ocepek et al. 2005), de maneira que a diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis é
importante para a identificação da possível fonte de infecção e das vias de transmissão da doença,
que são fundamentais para um melhor controle e erradicação da doença (Zanini et al. 2001,
Rodriguez et al. 2004). A transmissão de M. bovis para seres humanos ocorre através do consumo
26
de leite cru e produtos lácteos, consumo de carne de bovinos infectados ou do contato com
secreções de abscessos fistulados e aerossóis.
No Estado da Paraíba, dados oficiais indicam a ocorrência de 1.015 casos de tuberculose
humana em 2014 (Brasil 2015). Em áreas onde a tuberculose humana e a tuberculose bovina
coexistem, a diferenciação entre M. bovis e M. tuberculosis é importante para monitorar a
disseminação de M. bovis entre bovinos e destes para os seres humanos. Dessa maneira, o objetivo
deste estudo foi isolar e identificar M. bovis em bovinos com diagnóstico positivo pelo teste de
tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados 32 bovinos de dois a 10 anos de idade, positivos ao teste de tuberculinização,
procedentes de oito propriedades rurais com características de exploração pecuária mista, sem
histórico de tuberculose, localizadas nos municípios de Cacimba de Areia, Patos e São Mamede, na
mesorregião do Sertão do Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil. As propriedades foram
denominadas A (Coordenadas: 07o08'41.7"S 37o07'16.7"O), B (07o08'39.1"S 37o06'42.6"O), C
(06o56'41.7"S 37o10'22.6"O), D (06o58'37.3"S 37o16'38.7"O), E (06o58'36.0"S 37o17'21.9"O), F
(07o00'24.3"S 37o16'15.6"O), G (07o01'46.5"S 37o16'26.4"O) e H (06o57'53.5"S 37o20'32.2"O). O
sacrifício e necropsia dos animais seguiram as normas do Programa Nacional de Controle e
Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) com colaboração com o Serviço de Defesa
Agropecuária do Estado da Paraíba.
Foram colhidas amostras de qualquer órgão com lesões sugestivas de tuberculose. Nos casos
em que não foram observadas lesões sugestivas foram colhidas amostras de linfonodos parotídeo,
sublingual, retrofaríngeo, mediastínico e mesentérico. Uma parte de cada amostra foi congelada
para posterior utilização no isolamento e identificação de micobactérias; a outra parte foi fixada em
formol a 10% para exame histopatológico.
As amostras fixadas em formol a 10% foram clivadas e processadas rotineiramente para
confecção de lâminas histopatológicas coradas com Hematoxilina e Eosina (HE), seguindo-se a
técnica de Behmer et al. (1976). Para isolamento de micobactérias, os fragmentos de tecidos foram
submetidos à descontaminação pelo método de HPC (Ambrosio et al. 2008) com posterior
inoculação em duplicata nos meios de Stonebrink-Leslie e Lowenstein-Jensen e incubação a 37 °C
durante 90 dias. Colônias sugestivas de micobactérias foram extraídas para preparação de lâmina
para coloração de Ziehl Neelsen e extração de DNA, por meio de termólise (Mazars et al. 2001).
Foram submetidas à identificação molecular apenas amostras identificadas como Bacilos Álcool-
Ácido Resistentes (BAAR), na coloração de Ziehl Neelsen.
A identificação de micobactérias e diferenciação do complexo M. tuberculosis, complexo
27
M. avium, complexo M. intracellurare e Mycobacterium spp. foram feitas usando o TB Multiplex
PCR (Wilton & Cousins 1992). Para isso, os primers utilizados foram: MYCGEN-F (G1) (5'-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ') e MYCGEN-R (G2) (5'-TGCACACAGGCCACAAGGGA-
3') – relacionados ao género; TB-1F (5'-GAACAATCCGGAGTTGACAA-3 ') e TB-1R (5'-
AGCACGCTGTCAATCATGTA-3') - relacionados ao complexo M. tuberculosis; MYCAV-R (5'-
ACCAGAAGACATGCGTCTTG-3 ') - relacionado com o complexo M. avium; e MYCINT-F (5'-
CCTTTAGGCGCATGTCTTTA-3 ') - relacionado ao complexo M. intracellulare. Foram utilizadas
como controles positivos as estirpes AN5 para M. bovis e H37Rv para M. tuberculosis. Reações
com 50µL foram realizadas contendo o tampão de reação dNTP (1,25mM cada), 20pmol de cada
oligonucleótido, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 10pmol/µL de
primers, 1,25 unidades de Taq polimerase (1,0μL ) e 5µL do DNA em estudo. Os ciclos de
amplificação utilizados foram: uma vez a 94°C durante 10 minutos, a 61°C durante 2 minutos, e
72°C durante 3 minutos; 33 vezes a 94°C durante 30 segundos, 61°C durante 2 minutos, e 72°C
durante 3 minutos; uma vez a 94°C durante 30 segundos, 61°C durante 2 minutos, e 72°C durante
10 minutos. Amostras com amplificação de 1030pb foram identificadas como pertencendo ao
gênero Mycobacterium, e amostras com fragmentos de 372pb foram considerados membros do
complexo M. tuberculosis (Wilton & Cousins 1992).
Todas as amostras de DNA com amplificação consistente para o complexo M. tuberculosis
utilizando o TB Multiplex PCR, foram amplificadas com os iniciadores RD4 (RD4-1 5'-ATG TGC
GAGCTGAGCGATG-3 '; RD4-2 5'-TGTACTATGCTGACCCATGCG-3 '; e RD4-3 5'-AAAGGA
GCACCATCGTCCAC-3') para identificação de M. bovis (Warren et al. 2006). Reações com 25µL
foram realizadas contendo o tampão de reação de dNTP (1,25 mM cada), 20pmol de cada
oligonucleótido, 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, primers, 1,25
unidades de Taq polimerase, e 5µL do DNA genômico estudado. Os controles positivos utilizados
foram a estirpe AN5 para M. bovis e H37Rv para M. tuberculosis. Os ciclos de PCR utilizados
foram: uma vez a 95°C durante 15 minutos, 45 vezes a 94°C durante 1 minuto, 62°C durante 1
minuto, e 72°C durante 1 minuto, e uma vez a 72°C durante 10 minutos. Amostras com produtos
amplificados de 268pb foram identificadas como M. bovis, e de 172pb como outras micobactérias
do complexo M. tuberculosis.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos 32 bovinos utilizados no estudo, apenas dois (6,3%) apresentaram linfonodos submandibulares
edemaciados, sinais clínicos sugestivos de tuberculose. A infecção de bovinos por M. bovis é de
evolução lenta e os sinais clínicos são pouco frequentes. Em estágios avançados, e dependendo da
localização das lesões, os bovinos podem apresentar caquexia progressiva, hiperplasia de
28
linfonodos superficiais e/ou profundos, dispneia, tosse, mastite e infertilidade, entre outros
(Heinemann et al. 2008). Portanto, para uma vigilância ante mortem eficaz para tuberculose bovina
deve assentar-se principalmente na detecção de animais infectadas em fase inicial através da
utilização de testes de imunodiagnóstico sensíveis (Rua-Domenech et al. 2006). Por outro lado, na
necropsia, 21 (65,6%) animais apresentaram lesões sugestivas de tuberculose. De fato, o
reconhecimento das lesões macroscópicas associadas à tuberculose, principalmente durante a
inspeção sanitária de rotina nos abatedouros, é uma importante ferramenta no diagnóstico da
infecção, contribui para a identificação de focos nos rebanhos (Cazola et al. 2015) ademais, é uma
das estratégias de ação do PNCEBT em colaboração com o serviço de inspeção sanitária oficial, o
que é fundamental para a garantia da oferta de produtos de baixo risco para a saúde pública e,
consequentemente, proteção do consumidor (Biffa et al. 2010, Cazola et al. 2015). Em países como
EUA, Reino Unido e Espanha, que possuem satisfatório desempenho nos seus serviços de inspeção
nos abatedouros e programa de erradicação de tuberculose consolidado, a prevalência da doença foi
reduzida (Rua-Domenech 2006, Kantor & Ritacco 2006).
Macroscopicamente, foram observadas lesões granulomatosas nodulares, de aspecto caseoso
e/ou calcificado, focal e disseminadas, de tamanho e formas variados (Fig. 1A e 1B).
Microscopicamente, foi evidenciado processo inflamatório do tipo granulomatoso em diferentes
estágios de evolução, com extenso granuloma caracterizado por área central de necrose de
coagulação, material eosinofílico homogêneo, núcleos fragmentados, restos nucleares e focos de
mineralização, circundado por infiltrado inflamatório predominantemente de macrófagos e células
epitelioides encasulado por abundante tecido conjuntivo fibroso associado a várias camadas de
células mononucleares (Fig. 2A e 2B). Achados similares foram observados por Mendes et al.
(2013), que utilizaram bovinos abatidos em estabelecimento com Serviço de Inspeção Federal (SIF)
no Estado de Santa Catarina e verificaram lesões microscópicas caracterizadas por necrose de
caseificação central composta por material eosinofílico homogêneo, debris celulares e quantidade
variável de mineralização circundado por grande quantidade de macrófagos e células gigantes
multinucleadas de Langhans, neutrófilos em alguns casos e tecido conjuntivo. Da mesma forma,
França et al. (2013) utilizaram bovinos abatidos na Bahia e descreveram lesões tuberculosas com
estrutura discretamente diferente do tecido adjacente e nódulos com massa amorfa repleta de
material caseoso encapsulado, por vezes sendo observadas áreas multifocais coalescentes.
No total, foram colhidas 121 amostras com lesões macroscópicas sugestivas de tuberculose,
distribuídas da seguinte forma: 80 (66,1%) amostras de linfonodos (41 mediastínicos, nove
mesentéricos, sete submandibulares, 13 traqueobrônquicos, oito retrofaríngeos, e dois mamários),
37 (30,6%) de pulmão, uma (0,83%) de fígado e três (2,5%) de lesão miliar em musculo. Com
relação à distribuição das lesões de acordo com a região corporal, 94 (77,7%) lesões foram da
29
cavidade torácica, 15 (12,4%) da cabeça e 12 (9,9%) da cavidade abdominal. Proaño-Pérez et al.
(2011) avaliaram a distribuição de lesões em órgãos a partir de bovinos abatidos no Equador, como
um indicativo da possível via de transmissão, e verificaram lesões macroscópicas em linfonodos
mediastínicos (51,3%), linfonodos traqueobrônquicos (23,7%), linfonodos retrofaríngeos (9,2%),
fígado (11,8%) e em outros sítios (3,9%). Na Etiópia, 84% das lesões visíveis foram encontradas
nos pulmões e nódulos linfáticos torácicos (Teklul et al. 2004); já Biffa et al. (2012) avaliaram 337
carcaças com lesões sugestivas de tuberculose e observaram que as lesões mais frequentes estavam
nos pulmões e linfonodos respiratórios (50,9%), seguidos por linfonodos mesentéricos e intestinais
(16,5%). No Brasil, Alzamora Filho et al. (2014) constataram a ocorrência de lesões sugestivas de
tuberculose no parênquima pulmonar e nos linfonodos da cabeça e mediastínicos em 75% (135/180)
dos achados na inspeção sanitária. Cazola et al. (2015) verificaram que dos 13 bovinos positivos na
tuberculinização, sete (53,8%) apresentaram pelo menos uma lesão sugestiva de tuberculose em
linfonodos retrofaríngeos, parotídeos e pulmonares ou no pulmão, e em seis (46,2%) não foram
encontradas lesões sugestivas da doença. Esses resultados corroboram os achados do presente
estudo e reforçam a importância da via respiratória na transmissão de micobactérias. A menor
frequência de lesões sugestivas na cavidade abdominal pode ser atribuída ao fato da via oral ser
uma porta de entrada secundária à respiratória, justificando maior frequência de lesões nos
linfonodos da cavidade torácica (Palmer & Walters 2006, Taylor et al. 2007).
Para isolamento e identificação de micobactérias foram utilizadas 55 amostras, sendo destas
31 (56,4%) com lesões sugestivas de tuberculose e 24 (43,6%) sem lesões macroscópicas. No total,
foram isoladas micobactérias em 31 (56,4%) amostras, sendo que em 13 (41,9%) foi identificado M.
bovis e nas demais 18 (58,1%) foi identificado Mycobacterium spp. (Quadro 1). Do ponto de vista
epidemiológico é muito importante a identificação da espécie de micobactéria e da possível fonte de
infecção para o ser humano, uma vez que a doença em humanos, causada por M. tuberculosis e M.
bovis, é indistinguível usando métodos clínicos, radiológicos e patológicos (Rocha et al. 2011,
Wedlock et al. 2002). No entanto, são escassas as informações acerca da prevalência da infecção
por M. bovis em seres humanos, uma vez que na maioria dos casos não são procedidos o isolamento
e a identificação do agente, o que torna impossível a identificação da fonte de infecção. Por outro
lado, estima-se que cerca de 3,1% dos casos de tuberculose humana no mundo são causados por M.
bovis (El Sayed et al. 2015). Dessa maneira, a combinação do isolamento micobacteriano a partir de
tecidos bovinos e a identificação molecular contribui para melhor compreensão da epidemiologia
das infecções por M. bovis, o que contribui para o aumento da eficiência dos programas de controle
da doença (Cazola et al. 2015).
Um importante aspecto no presente trabalho foi a identificação de Mycobacterium spp. em
18 (58,1%) amostras com isolamento positivo, sendo a maioria dos isolamentos a partir de
30
linfonodos mediastínicos (seis; 33,3%) e mesentéricos (quatro; 22,2%). Esses isolados
provavelmente tratam-se de micobactérias não tuberculosas (MNT), que estão presentes no meio
ambiente e podem ser transmitidas aos animais e seres humanos (Franco et al. 2013) através de
inalação ou ingestão, resultando na colonização permanente ou temporária dos tratos respiratório e
digestivo (Primm et al. 2004). Atualmente, o aumento no número de casos de indivíduos infectados
pelo vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) predispõe à elevação do número de casos de
doenças emergentes e reemergentes, especialmente aquelas causadas por agentes etiológicos
oportunistas, como é o caso de Mycobacterium spp. Neste contexto, o contato direto com fontes de
infecção e o consumo de carne, leite e produtos lácteos contaminados representam sério risco de
transmissão do agente para indivíduos com HIV ou outras condições imunossupressoras.
CONCLUSÕES
Conclui-se que o isolamento e a identificação de M. bovis e Mycobacterium spp. em bovinos
positivos na tuberculinização no Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil, sugere que os seres
humanos estão expostos ao risco de infecção. Isso reforça a necessidade de intensificação e
otimização de medidas de prevenção e controle previstas no PNCEBT, como o incentivo à
certificação de propriedades rurais controladas e livres para tuberculose e medidas de controle de
trânsito e feiras de animais. Particular atenção deve ser dada à importância da inspeção sanitária de
animais de abate na identificação de focos da doença, bem como sugere-se a realização de estudos
de isolamento e identificação de micobactérias em outros Estados do Nordeste.
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Legenda das Figuras
Fig. 1. (A) Linfonodo mediastino apresentando nódulos de aspecto caseoso. (B) Pulmão com
nódulos de aspecto caseoso disseminados, de tamanho e formas variadas.
Fig. 2. (A) Linfonodo mediastínico com área central de necrose, com material eosinofílico
homogêneo, núcleos fragmentados, restos nucleares e focos de mineralização. Adjacente à área de
necrose há inflamação granulomatosa constituída por macrófagos, células epitelioides e linfócitos
abundantes. Observa-se também proliferação discreta de tecido conjuntivo fibroso. Obj. 10X, HE.
Escala de barra = 100µm; (B) Pulmão com extenso granuloma caracterizado por área central de
necrose de coagulação, circundado por infiltrado inflamatório predominantemente de macrófagos e
células epitelioides encasulado por abundante tecido conjuntivo fibroso associado a várias camadas
de células mononucleares. Obj. 5X, HE. Escala de barra = 200µm.
34
O Quadro
Quadro 1. Resultados da análise de cultivo e identificação de amostras realizadas por meio de
TB Multiplex PCR com amplificação para complexo M. tuberculosis e primers RD-4 para
identificação de M. bovis no Estado da Paraíba.
Bovino Município Propriedade Tecido Cultivo Identificação
molecular
03 Cacimba de Areia A Linfonodo (L.) mesentérico
Positivo Mycobacterium spp.
L. mediastínico M. bovis
04 Cacimba de Areia A L. mesentérico Positivo Mycobacterium spp.
06 Cacimba de Areia B L. submandibular Positivo Mycobacterium spp.
07 São Mamede C Pulmão Positivo M. bovis
08 São Mamede C L. mesentérico Positivo Mycobacterium spp.
09 São Mamede C Pulmão Positivo Mycobacterium spp.
11 Patos D Lesão no pescoço Positivo Mycobacterium spp.
12 Patos D Pulmão Positivo M. bovis
13 Patos D L. submandibular
Positivo Mycobacterium spp.
L. mediastínico Mycobacterium spp.
14 Patos D Lesão no pescoço Positivo Mycobacterium spp.
15 Patos D L. traqueobrônquico
Positivo M. bovis
L. mediastínico Mycobacterium spp.
16 Patos D L. mediastínico Positivo Mycobacterium spp.
17 Patos D Pulmão Positivo M. bovis
18 Patos E Pulmão
Positivo M. bovis
L. retrofaríngeo M. bovis
19 Patos E L. mediastínico Positivo Mycobacterium spp.
20 Patos E L. traqueobrônquico Positivo M. bovis
21 Patos E Pulmão Positivo Mycobacterium spp.
23 Patos F L. mamário Positivo Mycobacterium spp.
24 Patos G Lesão miliar (Toráx) Positivo M. bovis
25 Patos G L. mediastínico
Positivo M. bovis
L. traqueobrônquico Mycobacterium spp.
26 Patos G Pulmão Positivo M. bovis
28 Patos H Pulmão Positivo M. bovis
29 Patos H L. mediastínico Positivo Mycobacterium spp.
31 Patos H L. mesentérico Positivo Mycobacterium spp.
32 Patos H L. mediastínico
Positivo Mycobacterium spp.
L. mesentérico M. bovis
35
Fig. 1
Fig. 2
A B
A B
36
CONSIDERAÇÕES FINAIS
No presente trabalho, foi constatado pela primeira vez o isolamento de
micobactérias no leite, com destaque para M. bovis, o que sugere que a população está
exposta ao risco de infecção pela ingestão deste produto de origem animal e reforça a
necessidade de intensificação do controle da tuberculose no rebanho bovino do
Nordeste do Brasil, onde é comum o consumo de leite cru.
Da mesma forma, o isolamento e a identificação de M. bovis em tecidos de
bovinos positivos na tuberculinização no Estado da Paraíba sugere a importância de
intensificação e otimização de medidas de prevenção e controle previstas no PNCEBT,
como o incentivo à certificação de propriedades rurais controladas e livres para
tuberculose e medidas de controle de trânsito, feiras de animais e medidas compulsórias
de saneamento de focos de tuberculose bovina. Deve ser intensificada a inspeção
sanitária de animais de abate na identificação de focos da doença, bem como sugere-se a
realização de estudos de isolamento e identificação de micobactérias em outros estados
do Nordeste do Brasil.
37
ANEXO I
Isolation and identification of Mycobacterium bovis in milk from cows in Northeastern
Brazil
Isolamento e identificação de Mycobacterium bovis em leite de vacas no Nordeste do
Brasil
Joelson Marcolino RamosI Marcos Bryan HeinemannIIJosé Soares Ferreira NetoII Antônio
Francisco de Souza FilhoII Nicolás Céspedes CárdenasIIClebert José AlvesISérgio Santos de
AzevedoI*3
ABSTRACT:
Milk samples from 16 cows that tested positive on the tuberculin test in the State of
Paraíba, Northeastern Brazil, were used for mycobacteria isolation and identification.
Mycobacteria were isolated from five (31.25%) of the 16 milk samples; three samples were
classified as M. bovis, and two as belonging to the Mycobacterium genus. To our knowledge,
this is the first study of isolation and identification of M. bovis in milk from cows in
Northeastern Brazil, which suggests that humans are at risk of contamination by ingestion.
Key words: Mycobacterium bovis; isolation; milk.
RESUMO:
Amostras de leite de 16 vacas positivas no teste da tuberculinização no Estado da
Paraíba, Nordeste do Brasil, foram utilizadas para isolamento e identificação de
micobactérias. Foram isoladas micobactérias em cinco (31,25%) das 16 amostras de leite; três
amostras foram classificadas como M. bovis, e duas como pertencentes ao género
Mycobacterium. De acordo com nosso conhecimento este é o primeiro estudo de isolamento e
identificação de M. bovis em leite de vacas no Nordeste do Brasil, o que sugere que os seres
humanos estão em risco de contaminação por ingestão.
I Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (PPGMV), Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária
(UAMV), Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Patos, PB, Brasil. E-mail:
[email protected]. * Correspondingauthor. II Laboratório de Zoonoses Bacterianas (LZB), Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde
Animal (VPS), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), Universidade de São Paulo (USP), São
Paulo, SP, Brasil.
38
Palavras-chave: Mycobacterium bovis; isolamento; leite.
Bovine tuberculosis is a chronic, zoonotic disease caused by Mycobacterium bovis,
which belongs to the Mycobacterium tuberculosis complex. The disease is responsible for
economic losses due to reduced reproductive efficiency, decreased milk production and
decreased weight gain, carcass condemnation, and restrictions on international trade of
animals and animal products (BRASIL, 2006).
While most cases of tuberculosis in humans are caused by M. tuberculosis, it is
estimated that about 3.1% of the cases of human tuberculosis in the world are caused by M.
bovis (EL SAYED et al., 2015). However, infection in humans is generally not confirmed by
isolation and identification of the agent, making it impossible to identify the possible source
of infection. In addition, the human diseases caused by M. tuberculosis and M. bovis are
indistinguishable using clinical, radiological and pathological methods (ROCHA et al., 2011).
Transmission of M. bovis to humans occurs through consumption of raw milk and dairy
products, consumption of meat from infected animals, or through contact with secretions from
fistulated abscesses.
In the state of Paraíba, official data indicate the occurrence of 1,015 cases of human
tuberculosis in 2014 (BRASIL, 2015). In areas where human and bovine tuberculosis coexist,
the differentiation between M. bovis and M. tuberculosis is important for monitoring the
spread of M. bovis among cattle and from cattle to humans. Thus, the objective of this study
was to isolate and identify M. bovis in milk from cows with a positive diagnosis identified
using tuberculin test in the state of Paraíba, Northeastern Brazil.
Milk samples from 16 cows that tested positive on the tuberculin test from seven
different properties located in the municipalities of Cacimba de Areia, Patos, Piancó and São
Mamede were used. The properties were labeled A (Coordinates: 07º13’28.9”S
37º56’21.7”W), B (07º08’41.7”S 37º07’16.7”W), C (06º56’41.7”S 37º10’22.6”W), D
(06º58’37.3”S 37º16’38.7”W), E (06º57’53.5”S 37º20’32.2”W), F (06º58’36.0”S
37º17’21.9”W) and G (07º00’24.3”S 37º16’15.6”W). The milk was collected directly from
the teats of the animals before milking, following all methods of antisepsis. An average of 15
mL of milk per animal was collected, utilizing sterile and previously identified vials. These
were sent to the laboratory in isothermal boxes with ice.
For the isolation of Mycobacterium spp., a 5 mL aliquot of milk was used, centrifuged
at 3000 rpm for 20 minutes. In this way, two phases of milk were obtained, fat and sediment,
which were packaged in different vials and both decontaminated using the Petroff method
39
(KANTOR, 1979), inoculated in duplicate in Stonebrink and Lowenstein-Jensen mediums,
and incubated at 37 °C for 90 days. Colonies suggestive of mycobacteria were stained using
the Ziehl Neelsen method; DNA was extracted using thermolysis (MAZARS et al., 2001).
Samples identified as Acid Fast Bacilli (AFB) in Ziehl Neelsen were subjected to molecular
identification.
Identification of Mycobacterium species and differentiation of the M. tuberculosis
complex, M. avium complex, M. intracellurare complex, and other Mycobacterium spp. was
done using the TB Multiplex PCR (WILTON & COUSINS, 1992). For this, the primers used
were: MYCGEN-F (G1) (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') and MYCGEN-R (G2) (5'-
TGCACACAGGCCACAAGGGA-3') – associated with genus; TB-1F (5'-
GAACAATCCGGAGTTGACAA-3') and TB-1R (5'-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3') -
related to the M. tuberculosis complex; MYCAV-R (5'-ACCAGAAGACATGCGTCTTG-3')
– related to M. avium; and MYCINT-F (5'-CCTTTAGGCGCATGTCTTTA-3') – related to
M. intracellulare. Positive controls used were the M. bovis strain AN5 and M. tuberculosis
strain H37Rv for the M. tuberculosis complex. 50μL reactions were performed containing the
reaction buffer dNTP (1.25mM each), 20pmol of each oligonucleotide, 50mM KCl, 10mM
Tris-HCl (pH 8.3), 1.5mM MgCl2, 10pmol/ μL of primers, 1.25 units of TAQ polymerase
(1.0μL) and 5μL of the DNA under study. The amplification cycles used were the following:
once at 94 °C for 10 minutes, 61 °C for 2 minutes, and 72 °C for 3 minutes; 33 times at 94 °C
for 30 seconds, 61 °C for 2 minutes, and 72 °C for 3 minutes; once at 94 °C for 30 seconds,
61 °C for 2 minutes, and 72 °C for 10 minutes. Samples containing an amplification of
1030bp were identified as belonging to the Mycobacterium genus, and samples with 372bp
fragments were considered members of the M. tuberculosis complex (WILTON &
COUSINS, 1992).
All DNA samples with consistent amplification for M. tuberculosis using the TB
Multiplex PCR were amplified with the following primers: RD4 (RD4-1 5’-
ATGTGCGAGCTGAGCGATG-3’; RD4-2 5’-TGTACTATGCTGACCCATGCG-3’; and
RD4-3 5’-AAAGGAGCACCATCGTCCAC-3’) for identification of M. bovis (WARREN et
al., 2006). 25μL reactions were conducted containing the reaction buffer dNTPs (1.25mM
each), 20pmol of each oligonucleotide, 50mM KCl, 10mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5mM MgCl2,
primers, 1.25 units of TAQ polymerase, and 5μL of the genomic DNA being studied. The
positive controls used were the M. bovis AN5 strain and M. tuberculosis strain H37Rv. PCR
cycles used were: once at 95 °C for 15 minutes, 45 times at 94 °C for 1 minute, 62 °C for 1
minute, and 72 °C for 1 min, and once at 72 °C for 10 minutes. The sizes of the PCR products
40
indicate that the region studied is absent or present in the respective members of the M.
tuberculosis complex. Thus, the 268bp fragment resulting from amplification is consistent
with the RD4 absent in the sample, characteristic of the M. bovis species.
Mycobacteria were isolated from five (31.25%) of the 16 milk samples; three samples
were classified as M. bovis, and two as belonging to the Mycobacterium genus. To our
knowledge, this is the first study of isolation and identification of M. bovis in milk from cows
in Northeastern Brazil. Several studies have been conducted in other states in order to isolate
and identify mycobacteria in milk from cows. In São Paulo, PARDO et al. (2001) isolated M.
bovis in one sample of raw milk; LEITE et al. (2003), using milk samples from the states of
São Paulo, Paraná, Santa Catarina, Goiás and Pará, isolated M. bovis in one sample of raw
milk. FRANCO et al. (2013), in the southeast region of São Paulo, isolated M. bovis from one
milk sample from an individual cooling tank.
Milk and its derivatives, when contaminated and unpasteurized, present a significant
risk of tuberculosis transmission to humans. It is estimated that around 50% or more of milk
produced in Brazil is unpasteurized (LEITE et al., 2003), attributing serious risks of
transmission of various diseases to humans, including tuberculosis caused by M. bovis. It is
worth highlighting that it is common in northeastern Brazil to consume raw milk.
An important aspect was the isolation and identification of Mycobacterium spp. in two
samples, probably nontuberculous environmental mycobacteria (NTM), which are present in
the environment and can be transmitted to animals and humans (FRANCO et al., 2013)
through inhalation or ingestion, resulting in permanent or temporary colonization of the
respiratory and digestive tracts (PRIMM et al., 2004). The increasing number of individuals
infected with HIV predisposes an increase in the number of cases of emerging and re-
emerging diseases, especially those caused by opportunistic agents, such as Mycobacterium
spp. In this context, non-pasteurized milk infected with mycobacteria poses a serious risk to
individuals with HIV (FRANCO et al., 2013).
The presence of M. bovis and Mycobacterium spp. in milk from cows in the state of
Paraíba in Northeastern Brazil suggests that humans are at risk of contamination by ingestion.
This reinforces the need to implement preventative measures against the contamination of
milk during and after milking with NTM, optimization of milk and dairy products quality
programs, enhancing sanitary inspections of these products, and conducting studies for
isolating and identifying mycobacteria in milk from other Northeastern states.
41
ACKNOWLEDGMENTS
The authors would like to thank Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientífico e
Tecnológico (CNPq) by financial support under the code 302131/2012-4.
ETHICS COMMITTEE
This study was approved by the institutional Committee for Ethics in the Use of
Animals (Universidade Federal de Campina Grande – UFCG) (protocol 25-2012).
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human tuberculosis in Brazil. Tuberculosis (Edinburgh), v. 91, n. 1, p.14–21, 2011.
Disponível em: <http://www.tuberculosisjournal.com/article/S1472-9792(10)00129-
0/fulltext>. Acesso em: 20 jan. 2016. doi: 10.1016/j.tube.2010.10.003.
WARREN, R.M. et al. Differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex by PCR
amplification of genomic regions of difference. International Journal of Tuberculosis and
Lung Disease, v. 10, n. 7, p.818-822, 2006. Disponível em: <http://docserver.ingentaconnect
.com/deliver/connect/iuatld/10273719/v10n7/s19.pdf?expires=1461095505&id=86722049&ti
tleid=3764&accname=Guest+User&checksum=69A041568F1DEA686ED74EF48B6DE8B5
>. Acesso em 02 fev.
WILTON, S.; COUSINS, D. Detection and identification of multiple mycobacterial
pathogens by DNA amplification in a single tube. PCR Methods and Applications, v. 1,
43
n. 4, p.269-273, 1992. Disponível em:<http://genome.cshlp.org/content/1/4/269.long>.
Acesso em 20 jan. 2016.
44
ANEXO II
NORMAS DO PERIÓDICO CIÊNCIA RURAL
1. CIÊNCIA RURAL- Revista Científica do Centro de Ciências Rurais da
Universidade Federal de Santa Maria publica artigos científicos, revisões bibliográficas
e notas referentes à área de Ciências Agrárias, que deverão ser destinados com
exclusividade.
2. Os artigos científicos, revisões e notas devem ser encaminhados via eletrônica
e editados preferencialmente em idioma Inglês. Os encaminhados em Português
poderão ser traduzidos após a 1º rodada de avaliação para que ainda sejam revisados
pelos consultores ad hoc e editor associado em rodada subsequente. Entretanto, caso não
traduzidos nesta etapa e se aprovados para publicação, terão que ser obrigatoriamente
traduzidos para o Inglês por empresas credenciadas pela Ciência Rural e
obrigatoriamente terão que apresentar o certificado de tradução pelas mesmas para
seguir tramitação na CR. As despesas de tradução serão por conta dos autores. Todas as
linhas deverão ser numeradas e paginadas no lado inferior direito. O trabalho deverá ser
digitado em tamanho A4 210 x 297mm com, no máximo, 25 linhas por página em
espaço duplo, com margens superior, inferior, esquerda e direita em 2,5cm, fonte Times
New Roman e tamanho 12. O máximo de páginas será15 para artigo científico, 20 para
revisão bibliográfica e 8 para nota, incluindo tabelas, gráficos e figuras. Figuras,
gráficos e tabelas devem ser disponibilizados ao final do texto e individualmente por
página, sendo que não poderão ultrapassar as margens e nem estar com apresentação
paisagem.
3. O artigo científico (Modelo.doc,.pdf) deverá conter os seguintes tópicos:
Título (Português e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução
com Revisão de Literatura; Material e Métodos; Resultados e Discussão; Conclusão e
Referências; Agradecimento(s) e Apresentação; Fontes de Aquisição; Informe Verbal;
Comitê de Ética e Biossegurança devem aparecer antes das referências. Pesquisa
envolvendo seres humanos e animais obrigatoriamente devem apresentar parecer de
aprovação de um comitê de ética institucional já na submissão. Alternativamente pode
ser enviado um dos modelos ao lado (Declaração Modelo Humano, Declaração Modelo
Animal).
4. A revisão bibliográfica (Modelo.doc,.pdf) deverá conter os seguintes
45
tópicos: Título (Português e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words;
Introdução; Desenvolvimento; Conclusão; e Referências. Agradecimento(s) e
Apresentação; Fontes de Aquisição e Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança
devem aparecer antes das referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais
obrigatoriamente devem apresentar parecer de aprovação de um comitê de ética
institucional já na submissão. Alternativamente pode ser enviado um dos modelos ao
lado (Declaração Modelo Humano, Declaração Modelo Animal).
5. A nota (Modelodoc, pdf) deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português
e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Texto (sem subdivisão, porém
com introdução; metodologia; resultados e discussão e conclusão; podendo conter
tabelas ou figuras); Referências. Agradecimento(s) e Apresentação; Fontes de Aquisição
e Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança devem aparecer antes das
referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais obrigatoriamente devem
apresentar parecer de aprovação de um comitê de ética institucional já na submissão.
Alternativamente pode ser enviado um dos modelos ao lado (Declaração Modelo
Humano, Declaração Modelo Animal).
6. O preenchimento do campo "cover letter" deve apresentar, obrigatoriamente,
as seguintes informações em inglês, exceto para artigos submetidos em português
(lembrando que preferencialmente os artigos devem ser submetidos em inglês).
a)What is the major scientific accomplishment of your study?
b)The question your research answers?
c)Your major experimental results and overall findings?
d)The most important conclusions that can be drawn from your research?
e)Any other details that will encourage the editor to send your manuscript for review?
Para maiores informações acesse o seguinte tutorial.
7. Não serão fornecidas separatas. Os artigos encontram-se disponíveis no
formato pdf no endereço eletrônico da revista www.scielo.br/cr.
8. Descrever o título em português e inglês (caso o artigo seja em português) -
inglês e português (caso o artigo seja em inglês). Somente a primeira letra do título do
artigo deve ser maiúscula exceto no caso de nomes próprios. Evitar abreviaturas e
nomes científicos no título. O nome científico só deve ser empregado quando
estritamente necessário. Esses devem aparecer nas palavras-chave, resumo e demais
seções quando necessários.
9. As citações dos autores, no texto, deverão ser feitas com letras maiúsculas
46
seguidas do ano de publicação, conforme exemplos: Esses resultados estão de acordo
com os reportados por MILLER & KIPLINGER (1966) e LEE et al. (1996), como uma
má formação congênita (MOULTON, 1978).
10. As Referências deverão ser efetuadas no estilo ABNT (NBR 6023/2000)
conforme normas próprias da revista.
10.1. Citação de livro:
JENNINGS, P.B. The practice of large animal surgery. Philadelphia : Saunders, 1985.
2v.
TOKARNIA, C.H. et al. (Mais de dois autores) Plantas tóxicas da Amazônia a bovinos
e outros herbívoros. Manaus: INPA, 1979. 95p.
10.2. Capítulo de livro com autoria:
GORBAMAN, A. A comparative pathology of thyroid. In: HAZARD, J.B.; SMITH,
D.E. The thyroid. Baltimore : Williams & Wilkins, 1964. Cap.2, p.32-48.
10.3.Capítulo de livro sem autoria:
COCHRAN, W.C. The estimation of sample size. In: ______.Sampling techniques.
3.ed. New York : John Willey, 1977. Cap.4, p.72-90.
TURNER, A.S.; McILWRAITH, C.W. Fluidoterapia. In: ______.Técnicas cirúrgicas
em animais de grande porte. São Paulo: Roca, 1985. p.29-40.
10.4. Artigo completo:
O autor deverá acrescentar a url para o artigo referenciado e o número de identificação
DOI (Digital Object Identifiers), conforme exemplos abaixo:
MEWIS, I.; ULRICHS, CH. Action of amorphous diatomaceous earth against different
stages of the stored product pests Tribolium confusum (Coleoptera: Tene brionidae),
Tene briomolitor (Coleoptera: Tenebrionidae), Sitophilus granarius ( Coleoptera:
Curculioni-dae) and Plodiainter punctella (Lepidoptera: Pyralidae). Journal of Stored
Product Research, Amsterdam (Cidade opcional), v.37, p.153-164, 2001. Disponível
em: <http://dx.doi.org/10.1016/S0022-474X(00)00016-3>. Acesso em: 20 nov. 2008.
doi: 10.1016/S0022-474X(00)00016-3.
PINTO JUNIOR, A.R. et al (Mais de 2 autores). Response of Sitophilus oryzae (L.),
Cryptolestes ferrugineus (Stephens) and Oryzaephilus surinamensis (L.) to different
concentrations of diatomaceous earth in bulk stored wheat. Ciência Rural, Santa Maria
(Cidade opcional), v. 38, n. 8, p.2103-2108, nov. 2008. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010384782008000800002&
lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 25 nov. 2008. doi: 10.1590/S0103-84782008000800002.
47
10.5.Resumos:
RIZZARDI, M.A.; MILGIORANÇA, M.E. Avaliação de cultivares do ensaio nacional
de girassol, Passo Fundo, RS, 1991/92. In: JORNADA DE PESQUISA DA UFSM, 1.,
1992, Santa Maria, RS. Anais...Santa Maria :Pró-reitoria de Pós-graduação e Pesquisa,
1992. V.1. 420p. p.236.
10.6.Tese, dissertação:
COSTA, J.M.B.Estudo comparativo de algumas características digestivas entre bovinos
(Charolês) e bubalinos (Jafarabad). 1986. 132f. Monografia/Dissertação/Tese
(Especialização/ Mestrado/Doutorado em Zootecnia) - Curso de Pós-graduação em
Zootecnia, Universidade Federal de Santa Maria.
10.7.Boletim:
ROGIK, F.A. Indústria da lactose. São Paulo: Departamento de Produção Animal, 1942.
20p. (Boletim Técnico, 20).
10.8.Informação verbal:
Identificada no próprio texto logo após a informação, através da expressão entre
parênteses. Exemplo: ... são achados descritos por Vieira (1991 - Informe verbal). Ao
final do texto, antes das Referências Bibliográficas, citar o endereço completo do autor
(incluir E-mail), e/ou local, evento, data e tipo de apresentação na qual foi emitida a
informação.
10.9.Documentos eletrônicos:
MATERA, J.M. Afecções cirúrgicas da coluna vertebral: análise sobre as possibilidades
do tratamento cirúrgico. São Paulo: Departamento de Cirurgia, FMVZ-USP, 1997. 1
CD.
GRIFON, D.M. Artroscopic diagnosis of elbow displasia. In: WORLD SMALL
ANIMAL VETERINARY CONGRESS, 31., 2006, Prague, Czech Republic.
Proceedings…Prague: WSAVA, 2006. p.630-636. Acessado em 12 fev. 2007. Online.
Disponível em: http://www.ivis.org/proceedings/wsava/2006/lecture22/Griffon
1.pdf?LA=1
UFRGS. Transgênicos. Zero Hora Digital, Porto Alegre, 23 mar. 2000. Especiais.
Acessado em 23 mar. 2000. Online. Disponível em: http://www.zh.com.br/especial
/index.htm
ONGPHIPHADHANAKUL, B. Prevention of postmenopausal bone loss by low and
conventional doses of calcitriol or conjugated equine estrogen. Maturitas, (Ireland),
v.34,
48
n.2, p.179-184, Feb 15, 2000.Obtido via base de dados MEDLINE. 1994-2000.
Acessado em 23 mar. 2000. Online. Disponível em: http://www. Medscape.com/server-
java/MedlineSearchForm
MARCHIONATTI, A.; PIPPI, N.L. Análise comparativa entre duas técnicas de
recuperação de úlcera de córnea não infectada em nível de estroma médio. In:
SEMINARIO LATINOAMERICANO DE CIRURGIA VETERINÁRIA, 3., 1997,
Corrientes, Argentina. Anais...Corrientes: Facultad de Ciências Veterinárias - UNNE,
1997. Disquete. 1 disquete de 31/2. Para uso em PC.
11. Desenhos, gráficos e fotografias serão denominados figuras e terão o número
de ordem em algarismos arábicos. A revista não usa a denominação quadro. As figuras
devem ser disponibilizadas individualmente por página. Os desenhos figuras e gráficos
(com largura de no máximo 16cm) devem ser feitos em editor gráfico sempre em
qualidade máxima com pelo menos 300 dpi em extensão .tiff. As tabelas devem conter a
palavra tabela, seguida do número de ordem em algarismo arábico e não devem exceder
uma lauda.
12. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos serão de inteira
responsabilidade do(s) autor(es).
14. Será obrigatório o cadastro de todos autores nos metada dos de submissão. O
artigo não tramitará enquanto o referido item não for atendido. Excepcionalmente,
mediante consulta prévia para a Comissão Editorial outro expediente poderá ser
utilizado.
15. Lista de verificação (Checklist .doc, .pdf).
16. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
17. Os artigos não aprovados serão arquivados havendo, no entanto, o
encaminhamento de uma justificativa pelo indeferimento.
18. Em caso de dúvida, consultar artigos de fascículos já publicados antes de
dirigir-se à Comissão Editorial.
19. Todos os artigos encaminhados devem pagar a taxa de tramitação. Artigos
reencaminhados (com decisão de Reject and Ressubmit) deverão pagar a taxa de
tramitação novamente. Artigos arquivados por decurso de prazo não terão a taxa de
tramitação reembolsada.
20. Todos os artigos submetidos passarão por um processo de verificação de
plágio usando o programa “Cross Check”.
49
ANEXO III
NORMAS DO PERIÓDICO PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA
Os artigos devem ser submetidos através do Sistema Scholar One, link , com os
arquivos de texto na versão mais recente do Word e formatados de acordo com o
modelo de apresentação disponíveis no ato de submissão e no site da revista (www.pvb.
com.br). Devem constituir-se de resultados de pesquisa ainda não publicados e não
considerados para publicação em outro periódico. Apesar de não serem aceitas
comunicações (Short communications) sob a forma de “Notas Científicas”, não há
limite mínimo do número de páginas do artigo enviado. Embora sejam de
responsabilidade dos autores as opiniões e conceitos emitidos nos artigos, o Conselho
Editorial, com a assistência da Assessoria Científica, reserva-se o direito de sugerir ou
solicitar modificações aconselháveis ou necessárias. Os artigos submetidos são aceitos
através da aprovação pelos pares (peer review). NOTE: Em complementação aos
recursos para edição da revista é cobrada taxa de publicação (paper charge) no valor de
R$ 1.500,00 por artigo editorado, na ocasião do envio da prova final, ao autor para
correspondência.
1. Os artigos devem ser organizados em Título, ABSTRACT, RESUMO,
INTRODUÇÃO, MATERIAL E MÉTODOS, RESULTADOS, DISCUSSÃO,
CONCLUSÕES, Agradecimentos e REFERÊNCIAS:
a) o Título deve ser conciso e indicar o conteúdo do artigo; pormenores de
identificação científica devem ser colocados em MATERIAL E MÉTODOS.
b) O(s) Autor(es) deve(m) sistematicamente abreviar seus nomes quando
compridos, mas mantendo o primeiro nome e o último sobrenome por extenso, como
por exemplo: Paulo Fernando de Vargas Peixoto escreve Paulo V. Peixoto (inverso,
Peixoto P.V.); Franklin Riet-Correa Amaral escreve Franklin Riet-Correa (inverso,
Riet-Correa F.). Os artigos devem ter no máximo 8 (oito) autores;
c) o ABSTRACT deve ser uma versão do RESUMO em português, podendo ser
mais explicativo, seguido de “INDEX TERMS” que incluem palavras do título;
d) o RESUMO deve conter o que foi feito e estudado, indicando a metodologia e
dando os mais importantes resultados e conclusões, seguido dos “TERMOS DE
INDEXAÇÃO” que incluem palavras do título;
e) a INTRODUÇÃO deve ser breve, com citação bibliográfica específica
50
sem que a mesma assuma importância principal, e finalizar com a indicação do objetivo
do artigo;
f) em MATERIAL E MÉTODOS devem ser reunidos os dados que permitam a
repetição da experimentação por outros pesquisadores. Em experimentos com animais,
deve constar a aprovação do projeto pela Comissão de Ética local;
g) em RESULTADOS deve ser feita a apresentação concisa dos dados obtidos.
Quadros (em vez de Tabelas) devem ser preparados sem dados supérfluos,
apresentando, sempre que indicado, médias de várias repetições. É conveniente
expressar dados complexos, por gráficos (=Figuras), ao invés de apresentá-los em
Quadros extensos;
h) na DISCUSSÃO devem ser discutidos os resultados diante da literatura. Não
convém mencionar artigos em desenvolvimento ou planos futuros, de modo a evitar
uma obrigação do autor e da revista de publicá-los;
i) as CONCLUSÕES devem basear-se somente nos resultados apresentados;
j) Agradecimentos devem ser sucintos e não devem aparecer no texto ou em
notas de rodapé;
k) a Lista de REFERÊNCIAS, que só incluirá a bibliografia citada no artigo e a
que tenha servido como fonte para consulta indireta, deverá ser ordenada alfabética e
cronologicamente, pelo sobrenome do primeiro autor, seguido dos demais autores
(todos), em caixa alta e baixa, do ano, do título da publicação citada, e, abreviado (por
extenso em casos de dúvida), o nome do periódico ou obra, usando sempre como
exemplo os últimos fascículos da revista (www.pvb.com.br).
2. Na elaboração do texto devem ser atendidas as seguintes normas:
a) A digitação deve ser na fonte Cambria, corpo 10, entrelinha simples; a página
deve ser no formato A4, com 2cm de margens (superior, inferior, esquerda e direita), o
texto deve ser corrido e não deve ser formatado em duas colunas, com as legendas das
Figuras no final (logo após as REFERÊNCIAS). As Figuras e os Quadros devem ter
seus arquivos fornecidos separados do texto. Os nomes científicos devem ser escritos
por extenso no início de cada capítulo.
b) a redação dos artigos deve ser concisa, com a linguagem, tanto quanto
possível, no passado e impessoal; no texto, os sinais de chamada para notas de rodapé
serão números arábicos colocados em sobrescrito após a palavra ou frase que motivou a
nota. Essa numeração será contínua por todo o artigo; as notas deverão ser lançadas ao
pé da página em que estiver o respectivo número de chamada, sem o uso do “Inserir
51
nota de fim”, do Word. Todos os Quadros e todas as Figuras têm que ser citados no
texto. Estas citações serão feitas pelos respectivos números e, sempre que possível, em
ordem crescente. ABSTRACT e RESUMO serão escritos corridamente em um só
parágrafo e não devem conter citações bibliográficas.
c) no rodapé da primeira página deverá constar endereço profissional completo
de todos os autores (na língua do país dos autores), o e-mail do autor para
correspondência e dos demais autores. Em sua redação deve-se usar vírgulas em vez de
traços horizontais;
d) siglas e abreviações dos nomes de instituições, ao aparecerem pela primeira
vez no artigo, serão colocadas entre parênteses, após o nome da instituição por extenso;
e) citações bibliográficas serão feitas pelo sistema “autor e ano”; artigos de até
dois autores serão citados pelos nomes dos dois, e com mais de dois, pelo nome do
primeiro, seguido de “et al.”, mais o ano; se dois artigos não se distinguirem por esses
elementos, a diferenciação será feita através do acréscimo de letras minúsculas ao ano.
Artigos não consultados na íntegra pelo(s) autor(es), devem ser diferenciados,
colocando-se no final da respectiva referência, “(Resumo)” ou “(Apud Fulano e o
ano.)”; a referência do artigo que serviu de fonte, será incluída na lista uma só vez. A
menção de comunicação pessoal e de dados não publicados é feita no texto somente
com citação de Nome e Ano, colocando-se na lista das Referências dados adicionais,
como a Instituição de origem do(s) autor(es). Nas citações de artigos colocados
cronologicamente entre parênteses, não se usará vírgula entre o nome do autor e o ano,
nem ponto-e-vírgula após cada ano, como por exemplo: (Priester & Haves 1974, Lemos
et al. 2004, Krametter-Froetcher et. al. 2007);
f) a Lista das REFERÊNCIAS deverá ser apresentada em caixa alta e baixa, com
os nomes científicos em itálico (grifo), e sempre em conformidade com o padrão
adotado nos últimos fascículos da revista, inclusive quanto à ordenação de seus vários
elementos.
3. Os gráficos (=Figuras) devem ser produzidos em 2D, com colunas em branco,
cinza e preto, sem fundo e sem linhas. A chave das convenções adotadas será incluída
preferentemente, na área do gráfico (=Figura); evitar-se-á o uso de título ao alto do
gráfico (=Figura).
4. As legendas explicativas das Figuras devem conter informações suficientes
para que estas sejam compreensíveis, (até certo ponto auto explicativas, independente
do texto).
52
5. Os Quadros devem ser explicativos por si mesmos. Entre o título (em negrito)
e as colunas deve vir o cabeçalho entre dois traços longos, um acima e outro abaixo.
Não há traços verticais, nem fundos cinzas. Os sinais de chamada serão alfabéticos,
recomeçando, se possível, com “a” em cada Quadro; as notas serão lançadas logo
abaixo do Quadro respectivo, do qual serão separadas por um traço curto à esquerda.
