UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA FACULDADE … · RESUMO A esquistossomose ... sobre a mortalidade, redução da atividade motora e alteração tegumentar dos ... Expansão do

UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

FACULDADE DE FARMÁCIA

MATHEUS COUTINHO GAZOLLA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO EXTRATO BRUTO E METABÓLITOS ISOLADOS DE Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. (Asteraceae)

Juiz de Fora

2017



Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao corpo docente da

Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal de Juiz de Fora como requisito

parcial a obtenção do título de

Farmacêutico.

Orientador: Prof. Dr. Ademar Alves da Silva Filho

Juiz de Fora

2017

II

III



Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado ao corpo docente da

Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal de Juiz de Fora como requisito

parcial a obtenção do título de

Farmacêutico.

Aprovado em 23/06/2017

BANCA EXAMINADORA

--

_______________________________________

Prof. Dr. Ademar Alves da Silva Filho - Orientador

Universidade Federal de Juiz de Fora

________________________________________

Prof.ª Dr.ª Fabíola Dutra Rocha


________________________________________

Prof. Dr. Olavo dos Santos Pereira Júnior


IV

Dedico este trabalho a meus pais, Júnior e Adriana,

a meus irmãos Victor e Bruno

e a minha querida Mariana.

V

“Há uma força motriz mais poderosa que

o vapor, a eletricidade e a energia atômica:

a vontade.”

Albert Einstein

VI

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela força e proteção constantes em todos os momentos;

Aos meus pais Júnior e Adriana e irmãos Victor e Bruno, pelo apoio e amor

incondicional;

À Mariana, por todo companheirismo e amor, por entender as minhas ausências e por

sempre me incentivar a fazer o meu melhor.

Ao meu orientador e pai científico, Ademar, pelas oportunidades e ensinamentos.

Ao Prof. Josué e todo o grupo do Núcleo de Enteroparasitas do Instituto Adolfo Lutz,

pela realização dos ensaios esquistossomicidas.

Ao Departamento de Química, por disponibilizar o equipamento de RMN.

À CentralBio, por disponibilizar o equipamento de CLAE-DAD.

À Lara Soares, por toda a paciência, ensinamentos e ajuda no isolamento e

identificação dos metabólitos.

Aos grandes amigos Ismael e Vinícius, por transformar os dias difíceis mais leves e

alegres.

Ao Jésus e Éder, por colaborar da coleta das plantas no horto.

Aos demais amigos do NIPPAN pela ajuda e cooperação neste trabalho.

Ao CNPq pela bolsa concedida e apoio financeiro.

VII

RESUMO

A esquistossomose, infecção parasitária causada pelo trematódeo do gênero

Schistosoma, afeta cerca de 240 milhões de pessoas em todo mundo. O praziquantel

é o fármaco de escolha para o tratamento dessa doença, porém há relatos da

existência de linhagens resistentes ao tratamento, reforçando a necessidade de

pesquisas para a descoberta de novos fármacos para o tratamento da

esquistossomose. Neste contexto, este estudo se destinou a avaliar a atividade

esquistossomicida in vitro do extrato bruto e dos metabólitos isolados das partes

aéreas de Tanacetum parthenium.

O isolamento dos metabólitos foi realizado através de técnicas cromatográficas,

sendo identificados pela espectroscopia de RMN de 1H e de 13C. As análises dos

espectros, juntamente com a comparação com dados da literatura, permitiram

identificar a estrutura da lactona sesquiterpênica partenolido e dos flavonoides

apigenina e santina.

Nos ensaios esquistossomicidas in vitro, o extrato TpF em concentrações

acima de 50 μg/mL apresentou resultados semelhantes ao praziquantel 5 μM, sendo

capaz de provocar a morte de 100% dos parasitos após 24h de incubação, bem como

alterar significativamente o tegumento de todos os vermes adultos. A apigenina e a

santina na concentração de 100 μM não foram ativas, mas por outro lado, o

partenolido mostrou-se muito eficaz, sendo observado uma relação dose-resposta

sobre a mortalidade, redução da atividade motora e alteração tegumentar dos

parasitos. Em concentrações maiores que 25 μM, foi capaz de matar todos os vermes

adultos e causar alterações significativas em todos os parasitos em 24h de incubação.

Já na concentração de 12,5 μM, foi capaz de atingir 100% da mortalidade a partir de

48h de incubação. Além disso, o partenolido não apresentou citotoxicidade

significante em concentrações menores que 100 μM.

Os resultados obtidos demonstram que TpF possui significativa atividade

esquistossomicida in vitro e observa-se que o partenolido é uma substância

promissora, fazendo-se necessárias investigações adicionais, principalmente sobre

seu mecanismo de ação e sobre o seu perfil de citotoxicidade in vivo.

Palavras-chave: Esquistossomose; Produtos Naturais; Tanacetum parthenium;

Partenolido

VIII

ABSTRACT

Schistosomiasis is a parasitic infection caused by trematode of the genus

Schistosoma, it affects about 240 million people worldwide. Praziquantel is the

preferred drug for the treatment of this disease, however, due to the presence of

resistant strains, it is necessary the development of new drugs to cure schistosomiasis.

In this context, this study aimed to evaluate the in vitro schistosomicidal activity of the

crude extract and the isolated metabolites from aerial parts of Tanacetum parthenium.

The isolation of metabolites was performed through chromatographic

techniques and identified by 1H and 13C NMR spectroscopy. The analysis of the spectra

and the literature data allowed the identification of sesquiterpene lactone parthenolide,

flavonoids apigenin and santin structures.

In the in vitro schistosomicidal assays, the TpF extract at concentrations higher

than 50 μg/mL showed similar results to praziquantel 5 µM, which was able to kill 100%

of the parasites after 24h of incubation, altering significantly the integument of all adult

worms. Santin and apigenin were not effective at a concentration of 100 µM, however,

parthenolide was very active and its dose-response was assessed in relation to its

mortality, reduction of the motor activity and tegumentary alteration of the parasites. At

concentrations higher than 25 μM, was able to kill all adult worms and change

significantly all parasites within 24h of incubation. At the concentration of 12.5 μM, it

killed 100% of the parasites after 48h of incubation. Besides, parthenolide showed no

expressive cytotoxicity at concentrations less than 100 μM.

The aforesaid results demonstrated that TpF has a significant schistosomicidal

activity in vitro and it was observed that parthenolide is a promising substance which

requires additional investigations, mainly on its mechanism of action and in vivo

cytotoxicity profile.

Keywords: Schistosomiasis; Natural Products; Tanacetum parthenium; Parthenolide

IX

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Número de casos de esquistossomose em Minas Gerais para cada 100 mil

habitantes entre 2007-2014.........................................................................2

Figura 2. Casal adulto de S. mansoni...........................................................................3

Figura 3. Tubérculos no tegumento de S. mansoni......................................................3

Figura 4. Ciclo biológico de S. mansoni........................................................................4

Figura 5. Estrutura química da oxamniquina................................................................5

Figura 6. Estrutura química dos enantiômeros de PZQ................................................6

Figura 7. Fármacos oriundos de produtos naturais: quinina (A), artemisinina (B) e

licochalcona A (C) .......................................................................................7

Figura 8. Metabólitos ativos contra formas de S. mansoni: alpinumisoflavona (A),

dimetilalpinumisoflavona (B) e ácido robústico (C).......................................8

Figura 9. Estrutura química do partenolido.................................................................11

Figura 10. T. parthenium no Horto da Faculdade de Farmácia/UFJF.........................13

Figura 11. Secagem de T. parthenium.......................................................................14

Figura 12. CLV do extrato bruto TpF..........................................................................15

Figura 13. Coluna de cromatografia clássica da fração TpF (4-5) ..............................15

Figura 14. CCD das frações obtidas da cromatografia líquida à vácuo de TpF. Fase

móvel: Hex:AcOEt (6:4 v/v); Revelador: Anisaldeído sulfúrico...................23

Figura 15. CCD das frações obtidas da CCC de TpF (4-5); Fase móvel: Hex:AcOEt

(6:4 v/v); Revelador: Anisaldeído sulfúrico.................................................23

Figura 16. Frasco com a fração TpF (4-5)-15............................................................ 24

Figura 17. CCD das frações obtidas TpF (6-7)-8 e TpF (6-7)-9; Fase móvel:Hex:AcOEt

(8:2 v/v); Revelador: Anisaldeído sulfúrico.................................................25

Figura 18. Cromatograma obtido por CLAE-DAD do extrato bruto hidroalcoólico

filtrado das partes aéreas de T. parthenium. Injeção de 30 µL do TpF em

coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e ACN,

variando de 40 a 100% de ACN (0 - 40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ =

200 nm.......................................................................................................26

X

Figura 19. Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE-DAD do extrato bruto

hidroalcoólico filtrado das partes aéreas de T. parthenium e do partenolido.

Injeção de 30 µL de TpF e partenolido em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm.

Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e ACN, variando de 40 a 100% de ACN

(0 - 40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 200 nm......................................26

Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE-DAD da fração TpF (4-5)-15 e espectro

de UV. Injeção de 30 µL em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel:

H3PO4 0,5% em água e ACN, variando de 40 a 100% de ACN (0-40 min),

fluxo de fase a 1mL/min, λ = 200 nm..........................................................27

Figura 21. Cromatograma obtido por CLAE-DAD da fração TpF (6-7)-8 e espectro de

UV. Injeção de 30 µL em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel:

H3PO4 0,5% em água e MeOH, variando de 40 a 100% de MeOH (0-40

min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 256 nm.................................................27

Figura 22. Cromatograma obtido por CLAE-DAD da fração TpF (6-7)-9 e espectro de

UV. Injeção de 30 µL em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel:

H3PO4 0,5% em água e MeOH, variando de 40 a 100% de MeOH (0-40

min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 270 nm.................................................28

Figura 23. Estrutura química do partenolido...............................................................29

Figura 24. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (4-5)-15 identificada

como partenolido ......................................................................................30

Figura 25. Expansão do espectro de RMN de 1H de TpF (4-5)-15 no deslocamento de

5,2 a 6,6 ppm, presença dos sinais dos hidrogênios vinílicos.....................31


2,8 a 3,9 ppm: sinais dos hidrogênios oximetínicos (δ 2,80 e 3,88 ppm)....31


1,3 a 1,8 ppm, presença dos sinais dos hidrogênios metílicos (δ 1,74 e 1,33

ppm)..........................................................................................................32

Figura 28. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (4-5)-15 identificada

como partenolido.......................................................................................33

Figura 29. Estrutura química da apigenina.................................................................34

Figura 30. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-8 identificada como

apigenina...................................................................................................35


6,2 a 6,7 ppm, correspondentes aos prótons H-6 e H-8..............................36

XI


7,0 a 8,0 ppm, correspondentes aos prótons H-2’ e H-6.............................36


como apigenina.........................................................................................38

Figura 34. Estrutura química da santina.....................................................................39

Figura 35. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-9 identificada como

santina.......................................................................................................40

Figura 36. Expansão do espectro de RMN de 1H de TpF (6-7)-9 no deslocamento

de 7,0 a 8,2 ppm, presença dos sinais dos hidrogênios do anel B ..............41


3,8 a 4,2 ppm, correspondentes às metoxilas..............................................41


como santina.............................................................................................43

Figura 39. Reação entre partenolido e cisteína. Em vermelho a carbonila α–β

insaturada e o nucleófilo sulfidrila..............................................................48

Figura 40. Efeito do partenolido no tegumento de machos de Schistosoma mansoni.

A: morfologia geral mostrando a região dorsal de um macho de S. mansoni,

com destaque, em vermelho, para o local onde é feito a análise morfológica

no tegumento. B: Controle negativo. C: partenolido 12,5 µM. D: partenolido

25 µM. E: partenolido 50 µM. F: PZQ 5 µM. Barras = 200 µm (A) e 50 µm

(B-F) ..........................................................................................................49

Figura 41. Efeito do partenolido nos tubérculos de machos de S. mansoni. Os valores

são média de dez vermes. As barras representam o desvio padrão da

média. Diferença significativa entre o controle negativo e os grupos tratados

com compostos e praziquantel (PZQ 5 µM): *(p < 0,05), **(p < 0,01), ***(p

< 0,001) .....................................................................................................50

Figura 42. Viabilidade celular de células Vero em contato com partenolido em

diferentes concentrações. Os resultados foram analisados pelo programa

GraphPad Prism 5®, expressos como média ± desvio padrão da média a p

˂ 0,001.......................................................................................................51

XII

LISTA DE TABELAS Tabela 1. Gradiente utilizado como fase móvel para TpF e partenolido......................17

Tabela 2. Gradiente utilizado como fase móvel para TpF (6-7)-8 e TpF (6-7)-9..........17

Tabela 3. Frações obtidas por CLV do extrato TpF.....................................................22

Tabela 4. Frações obtidas por CCC da fração TpF (4-5).............................................24

Tabela 5. Frações obtidas por CCC da fração TpF (6-7)............................................24

Tabela 6. Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF(4-5)-15 e dados do

partenolido descritos na literatura...............................................................................29

Tabela 7. Dados de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF(4-5)-15 e dados do

partenolido descritos na literatura...............................................................................32

Tabela 8. Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-8 e dados da

apigenina descritos na literatura.................................................................................34

Tabela 9. Dados de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (6-7)-8 e dados da

apigenina descritos na literatura.................................................................................37

Tabela 10. Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-9 e dados da santina

descritos na literatura..................................................................................................39

Tabela 11. Dados de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (6-7)-9 e dados da santina

descritos na literatura..................................................................................................42

Tabela 12. Atividade esquistossomicida in vitro de TpF sobre os vermes adultos de S.

mansoni......................................................................................................................44

Tabela 13. Atividade esquistossomicida in vitro dos metabólitos isolados partenolido,

apigenina e santina sobre os vermes adultos de S. mansoni......................................45

Tabela 14. Atividade esquistossomicida in vitro do partenolido em diferentes

concentrações sobre os vermes adultos de S. mansoni..............................................47

XIII

LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

ACN Acetonitrila

AcOEt Acetato de Etila

CCC Cromatografia em Coluna Clássica

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CDCl3 Clorofórmio deuterado

CHCl3 Clorofórmio

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLV Cromatografia líquida à vácuo

DAD Detector de Arranjo de Diodos

DCM Diclorometano

DMSO Dimetilsulfóxido

EtOH Etanol

Hex Hexano

J Constante de acoplamento

Me2CO Acetona

MeOH Metanol

MHz Megahertz

OMS Organização Mundial de Saúde

OXA Oxamniquina

PZQ Praziquantel

RMN Ressonância Magnética Nuclear

TMS Tetrametilsilano

UV Ultravioleta

W Watt

δ Deslocamento químico

XIV

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

1.1 Esquistossomose ................................................................................................ 1

1.1.1 DOENÇA ............................................................................................................ 1

1.1.2 EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................... 1

1.1.3 MORFOLOGIA ................................................................................................... 3

1.1.4 CICLO BIOLÓGICO ........................................................................................... 4

1.1.5 TRATAMENTOS E RESISTÊNCIA .................................................................... 5

1.2 Produtos Naturais e Atividade Esquistossomicida .......................................... 6

1.3 Família Asteraceae .............................................................................................. 9

1.4 Gênero Tanacetum .............................................................................................. 9

1.5 Espécie Tanacetum parthenium ....................................................................... 9

1.6 Partenolido ......................................................................................................... 10

2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 12

3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 13

3.1 Obtenção do partenolido padronizado ............................................................ 13

3.2 Coleta e identificação do material vegetal ...................................................... 13

3.3 Obtenção do extrato hidroalcoólico de T. parthenium .................................. 13

3.4 Isolamento dos metabólitos de T. parthenium ............................................... 14

3.5 Identificação estrutural das substâncias isoladas ......................................... 16

3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Arranjo de

Diodos (CLAE-DAD) ................................................................................................ 16

3.7 Avaliação in vitro da atividade esquistossomicida ........................................ 17

3.7.1 LINHAGEM DO S. mansoni ............................................................................. 18

3.7.2 ANIMAIS HOSPEDEIROS ............................................................................... 18

3.7.3 MANUTENÇÃO DO CICLO EVOLUTIVO DE S. mansoni ............................... 18

3.7.4 OBTENÇÃO DOS VERMES ADULTOS DE S. mansoni .................................. 19

3.7.5 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA O ENSAIO ............................................. 19

3.7.6 ENSAIO ESQUISTOSSOMICIDA in vitro ......................................................... 19

3.7.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA DO TEGUMENTO DOS VERMES ADULTOS

UTILIZANDO MICROSCOPIA CONFOCAL .............................................................. 20

3.8 Avaliação da citotoxicidade ............................................................................. 21

3.8.1 Linhagem celular e condições de cultivo .......................................................... 21

3.8.2 Ensaio de citotoxicidade ................................................................................... 21

XV

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 22

4.1 Isolamento dos metabólitos ............................................................................. 22

4.2 Perfil cromatográfico do extrato bruto por CLAE-DAD .................................. 25

4.3 Pureza das substâncias isoladas .................................................................... 27

4.4 Identificação estrutural das substâncias isoladas ......................................... 28

4.4.1 SUBSTÂNCIA TpF (4-5)-15 ............................................................................. 28

4.4.2 SUBSTÂNCIA TpF (6-7)-8 ............................................................................... 34

4.4.3 SUBSTÂNCIA TpF (6-7)-9 ............................................................................... 39

4.5 Ensaios esquistossomicidas in vitro............................................................... 44

4.5.1 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO EXTRATO TpF .................... 44

4.5.2 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DOS METABÓLITOS

ISOLADOS.................................................................................................................45

4.5.3 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO PARTENOLIDO .................. 46

4.5.4 ALTERAÇÕES TEGUMENTARES DE S. mansoni NA PRESENÇA DO

PARTENOLIDO ......................................................................................................... 48

4.6 Avaliação da citotoxicidade ............................................................................. 50

5. CONCLUSÃO ....................................................................................................... 52

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 53

APÊNDICE ................................................................................................................ 62

1

1. INTRODUÇÃO

1.1 Esquistossomose

1.1.1 DOENÇA

A Organização Mundial de Saúde (OMS) classifica dezessete doenças que se

concentram em países de baixo desenvolvimento social e econômico como Doenças

Tropicais Negligenciadas, dentre elas a esquistossomose. Nesses países, além da

alta taxa de mortalidade, tais doenças são capazes de causar efeitos deletérios como

a redução da produtividade dos adultos, impactando diretamente sobre a economia

familiar, além de afetar o desenvolvimento de crianças (HOTEZ e KAMATH, 2009).

A esquistossomose, bilharziose ou, popularmente, barriga d’água é uma

doença crônica causada pelo platelminto trematódeo do gênero Schistosoma, da

classe Trematoda e família Schistosomatidae. São parasitos dioicos (sexos

separados) e digenéticos (reprodução assexuada e sexuada) que habitam as veias

mesentéricas de seus hospedeiros definitivos (GRYSEELS, 2012).

As principais espécies que infectam o homem são Schistosoma haematobium,

Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Schistosoma intercalatum e

Schistosoma mansoni (GRYSEELS, 2012). Dentre estas, apenas a S. mansoni é

encontrada no Brasil, devido às condições ambientais favoráveis ao seu

desenvolvimento e principalmente, a presença do molusco de água doce

Biomphalaria glabrata, seu hospedeiro intermediário (ELBAZ e ESMAT, 2013)

1.1.2 EPIDEMIOLOGIA

A deficiência de registros em países subdesenvolvidos torna difícil a obtenção

dos dados da esquistossomose, no entanto estima-se que a doença afeta mais de 200

milhões de pessoas no mundo e expõe outras 700 milhões ao risco de contraí-la em

regiões endêmicas de mais de 70 países (OMS, 2017).

Devido ao seu caráter debilitante, esta doença causa prejuízos econômicos e

sociais aos países atingidos. Estima-se que em áreas endêmicas 60% a 80% dos

jovens de 5 a 20 anos, a faixa etária mais suscetível, e 20% a 40% dos adultos estejam

ativamente infectados. Consequentemente, aproximadamente 120 milhões de

pessoas ao redor do mundo manifestam quadros clínicos de esquistossomose e 20

2

milhões apresentam morbidade severa. Assim, compromete-se a qualidade de vida

destas populações e compromete-se a produtividade dos trabalhadores, gerando-se

perdas anuais de bilhões de dólares (COLLEY et al., 2014; HOTEZ et al., 2007;

UTZINGER et al., 2011).

No Brasil, o número de casos de esquistossomose em 2015 foi de 26.775, seja

em áreas endêmicas ou não, com alta prevalência da doença nos estados de

Pernambuco, Bahia, São Paulo e especialmente Minas Gerais, com 7.727 casos

confirmados, o que representa quase 30% de todo o País (BRASIL, 2016).

Os casos em Minas Gerais possuem uma distribuição irregular em 517 dos 853

municípios do estado, tendo maior prevalência nas regiões Norte, Rio Doce, Zona da

Mata e Jequitinhonha, sendo a última a mais crítica, onde todas as cidades estão com

a prevalência maior do que 1.702 casos/100 mil habitantes no período de oito anos

(Figura 1) (SILVA e ANDRADE, 2016).

Figura 1. Número de casos de esquistossomose em Minas Gerais para cada 100 mil habitantes entre 2007-2014

Fonte: Adaptado de SILVA, J.P e DE ANDRADE, M., 2016

3

1.1.3 MORFOLOGIA

Dentre as formas evolutivas do parasito, destacam-se os vermes adultos. O

macho mede cerca de 1 cm, tem corpo achatado, tegumento recoberto de pequenas

projeções denominadas de tubérculos e canal ginecóforo formado pela dobra de suas

extremidades laterais, o qual utiliza para abrigar a fêmea e fecundá-la. A fêmea tem

aproximadamente 1,5 cm de comprimento, possui corpo cilindroide e tegumento liso

(Figura 2) (GRYSEELS, 2012).

Figura 2. Casal adulto de S. mansoni

Fonte: NIBSC/Science Photo Library – Microscopia eletrônica de transmissão

Essencial à fisiologia do parasito, os tubérculos presentes no tegumento do

macho atuam na absorção de nutrientes, excreção, osmorregulação e evasão ao

sistema imune do hospedeiro (Figura 3). Deste modo, lesões tegumentares

ocasionam sérios danos ao parasito, tornando este local potencial alvo para a ação

de substâncias esquistossomicidas (BRASCHI et al., 2006).

Figura 3. Tubérculos no tegumento de S. mansoni

Fonte: FEI Company: Microscopia eletrônica de transmissão

4

1.1.4 CICLO BIOLÓGICO

O S. mansoni possui um ciclo de vida complexo, envolvendo uma fase de

reprodução sexuada no hospedeiro definitivo, o homem, e uma fase assexuada no

hospedeiro intermediário, o caramujo Biomphalaria (REY, 2001).

O ciclo biológico de S. mansoni inicia-se quando ovos do parasito são

expelidos junto com as fezes humanas, entram em contato com água doce e liberam

miracídios. Por sua vez, os miracídios infectam caramujos Biomphalaria spp.

(hospedeiro intermediário) e, após algumas semanas, originam cercárias (forma

infectante). As cercarias liberam-se dos caramujos e penetram ativamente na pele do

ser humano (hospedeiro definitivo) durante o contato deste com águas contaminadas

(CDC, 2012).

No organismo humano, os parasitos maturam-se em vermes adultos (macho e

fêmea) e migram para as veias mesentéricas inferiores, onde a fêmea realiza a

oviposição. A maioria dos ovos fica retida nos tecidos e ocasiona sérias reações

inflamatórias (granulomas), originando quadros clínicos de hipertensão portal,

hepatoesplenomegalia e ascite. Entretanto, alguns ovos atingem a luz

intestinal e são liberados junto com as fezes, dando reinício ao ciclo (Figura 4)

GRYSEELS e STRICKLAND, 2012; NEVES, 2004; ROSS et al., 2002).

Figura 4. Ciclo biológico de S. mansoni

Fonte: GUSMÃO, M. N. A., MARCONATO, D. G., 2014

5

1.1.5 TRATAMENTOS E RESISTÊNCIA

O desenvolvimento de vacina para o controle da esquistossomose tem se

deparado com a complexidade dos diversos estágios de vida do parasito, bem como

de sua habilidade de evasão ao sistema imunológico. Em virtude disto, a

quimioterapia ainda é a única forma eficaz no controle da doença, associado ao

saneamento básico (FONSECA et al., 2015).

Desde a década de 1990, o praziquantel (PZQ) e a oxamniquina (OXA) estão

incluídos na lista da OMS como medicamentos essenciais no controle da

esquistossomose (MATTOS et al., 2006; CIOLI et al., 1995).

Figura 5. Estrutura química da oxamniquina

Fonte: elaborado pelo autor.

A OXA (Figura 5), derivado tetraidroquinolínico, é eficaz contra cercárias,

esquistossômulos e vermes adultos de S. mansoni. Porém, possui como

desvantagens o alto custo, a especificidade somente contra o S. mansoni, efeitos

colaterais consideráveis e relatos de resistência (GRYSEELS et al., 2006).

O PZQ (Figura 6), derivado pirazinoisoquinilínico comercializado como uma

mistura racêmica de enantiômeros R e S, sendo apenas o isômero R ativo, é utilizado

desde 1980, sendo eficaz contra todas as espécies de Schistosoma (MATTOS et al.,

2006). Esse fármaco promove imobilidade muscular e lesões tegumentares nos

vermes adultos, expondo-os ao sistema imune do hospedeiro (GRYSEELS, 2012;

NEVES, 2004).

Entretanto, o PZQ é inativo contra as formas jovens do parasito e além disso,

sua ampla utilização desde a década de 1980 pode induzir resistência nos parasitos

e comprometer sua eficácia, assim como o ocorrido no Brasil com o fármaco

oxamniquina, o qual teve seu uso descontinuado devido ao surgimento de focos de

resistência (CIOLI et al., 2014; VALENTIM et al., 2013).

6

Figura 6. Estrutura química dos enantiômeros de PZQ

Fonte: elaborado pelo próprio autor

Além dos inúmeros relatos demonstrando o crescente surgimento de

linhagens resistentes ao PZQ, há indicativos de falha no tratamento com este

medicamento, a qual se relaciona com as reações adversas que levam a uma

significativa taxa de não adesão ao tratamento (KOROLKOVAS e FRANÇA, 2013;

LIU et al., 2008; MAGNUSSEN, 2003). A OMS em seu Programa Especial para

Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais relata que milhões de doses de PZQ

são administrados a cada ano, e que este número terá um significativo acréscimo

nos próximos anos, aumentando, ainda mais, o risco de desenvolvimento de

resistência (WHO, 2017). Neste contexto, há uma enorme necessidade do

desenvolvimento de pesquisas para a descoberta de novos e efetivos fármacos para

o controle do avanço da esquistossomose no mundo.

1.2 Produtos Naturais e Atividade Esquistossomicida

Tendo em vista a enorme riqueza da flora do Brasil, diversas pesquisas têm

sido realizadas com produtos naturais com objetivo de encontrar substâncias que

possam ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos

antiparasitários (NEWMAN e CRAGG, 2016; KAYSER et al., 2003).

Os produtos naturais servem há milênios como fonte de compostos medicinais

ao homem (NEWMAN et al., 2015). Por consequência, sempre se atrelaram ao

desenvolvimento de fármacos. Nos últimos 30 anos, 64% das novas entidades

químicas lançadas no mercado farmacêutico mundial foram inspiradas em moléculas

oriundas de fontes naturais (NEWMAN e CRAGG, 2016; NEWMAN et al., 2015). Ainda

7

mais, 69% dos anti-infecciosos existentes são derivados ou inspirados em produtos

naturais, como os antiparasitários quinina, artemisinina e ivermectina (BUTLER, 2004;

GOA; MCTAVISH; CLISSOLD, 1991; LI e VEDERAS, 2009; NEWMAN; CRAGG;

KINGSTON, 2015).

Atualmente, renova-se o interesse pela pesquisa com produtos naturais muito

em função dos avanços obtidos na seleção, isolamento e elucidação estrutural de

compostos, em conjunto com a síntese orgânica, que permite a obtenção de grandes

quantidades de substâncias para a realização de estudos pré-clínicos e clínicos. Além

isso, a enorme biodiversidade mundial, sobretudo do Brasil que hospeda 15% a 20%

e todas as espécies animais e vegetais existentes, também motiva pesquisas nesta

área. Portanto, buscam-se continuamente nos produtos naturais substâncias bioativas

úteis ao desenvolvimento de fármacos (BARREIRO e BOLZANI, 2009)

Dentro deste contexto, como exemplos de fármacos antiparasitários oriundos

de fontes naturais (Figura 7), pode-se citar a artemisinina, uma lactona

sesquiterpênica obtida das folhas de Artemisia annua com atividade antimalárica

(MAKANGA; KRUDSOOD, 2009). Além da artemisinina, outra substância isolada de

plantas também com atividade antimalárica é a quinina, um alcaloide quinolínico

obtido das cascas da Quina (Cinchona sp) (ACHAN et al., 2009). Já a licochalcona

A, uma chalcona obtida das raízes de Glycyrrhiza inflata, demonstra expressiva

atividade leishmanicida frente à Leishmania major (ZHAI et al.,1995).

Figura 7. Fármacos oriundos de produtos naturais: quinina (A), artemisinina (B) e licochalcona A (C)

Fonte: elaborado pelo autor

8

Com relação à atividade esquistossomicida de produtos naturais, diversos

extratos brutos vegetais têm sido avaliados. Por exemplo, o estudo realizado por

Yousif e colaboradores (2007) identificou, dentre 346 extratos metanólicos de

diferentes espécies, uma promissora atividade in vitro contra vermes adultos de S.

mansoni dos extratos de Pinus canariensis (Pinaceae), Agave lophanta

(Agavaceae), Furcrae selloa (Agavaceae) e Solanum elaeagnifoliu (Solanaceae).

Embora muitos relatos demonstrem atividade esquistossomicida in vitro para

extratos brutos, grande parte dos pesquisadores têm se dedicado ao fracionamento

e isolamento dos constituintes majoritários ativos dessas preparações

(CHITWOOD, 2002).

A partir dessa abordagem, alguns estudos foram direcionados para a

avaliação de metabólitos secundários frente a S. mansoni. Por exemplo, a partir das

frações ativas do extrato diclorometânico de Millettia thonningii (Fabaceae) foram

identificados a alpinumisoflavona, dimetilalpinumisoflavona e ácido robústico (Figura

8), sendo estas isoflavonas altamente ativas in vitro contra miracídeos, cercárias e

vermes adultos de S. mansoni (LYDDIARD et al., 2002).

Figura 8. Metabólitos ativos contra formas de S. mansoni: alpinumisoflavona (A), dimetilalpinumisoflavona (B) e ácido robústico (C)


Entre as famílias de espécies vegetais de interesse medicinal que

biossintetizam metabólitos secundários de interesse e com potencial atividade

esquistossomicida, está a família Asteraceae.

9

1.3 Família Asteraceae

A família Asteraceae apresenta-se como uma das maiores famílias de plantas

compilada em, aproximadamente, 1600 gêneros e com 23.000 espécies vegetais já

descritas. Dentro da família predominam ervas perenes, subarbustos e arbustos, mas

também podem ser encontrados videiras, cipós e árvores. Além disso, muitas das

espécies vegetais pertencentes a esta família são utilizadas com propósitos

medicinais pela população (KENNY et al., 2014; BESSADA et al., 2015).

Em relação aos estudos quimiotaxonômicos, estes demonstram que a família

Asteraceae tem sua rota biossintética direcionada para a produção de metabólitos

secundários pertencentes às classes dos terpenos, poliacetilenos, flavonoides,

cumarinas e lignanas, especialmente (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2009; SCOTTI et

al., 2012).

1.4 Gênero Tanacetum

Inserida na família Asteraceae encontra-se o gênero Tanacetum, que

apresenta espécies difundidas principalmente na Europa e oeste da Ásia. Espécies

desse gênero são ricas em óleos essenciais e lactonas sesquiterpênicas e têm sido

utilizadas popularmente como anti-helmíntico e para tratar a enxaqueca (UPTON et

al., 2016). Estudos farmacológicos comprovaram atividade anti-inflamatória (BROWN

et al., 1999), antibacteriana e antifúngica (NESZMELYI et al., 1992) para algumas

espécies do gênero.

Apesar das diversas atividades supracitadas atribuídas ao gênero Tanacetum,

a atividade antiparasitária para tais extratos brutos ainda são pouco

investigadas.

1.5 Espécie Tanacetum parthenium

A espécie Tanacetum parthenium (L.) Sch. Bip. (Asteraceae), sinonímia

Chrysantemum parthenium (L.) Sch. Bip., é nativa no sudeste europeu, cultivada na

maior parte da Europa, e em alguns países da América e África. Nos Estados Unidos,

Europa e Nova Zelândia é mais conhecida como "feverfew", devido a sua utilização

mais tradicional: antipirética (PAREEK et al., 2011). No Brasil, é mais conhecida como

artemísia, sendo também comuns as denominações de tanaceto, monsenhor-

amarelo, piretro-do-caucaso, margaridinha, matricária, artemijo, artemigem, macela-

10

do-reino, camomila-pequena, macela-da-serra, artemigem-dos-jardins e olguinha

(CARVALHO, 2009).

A origem do vocábulo "Artemísia", tem sua origem na mitologia grega, em que

a deusa Ártemis era quem protegia as parturientes e outras mulheres doentes. Com

esse mesmo nome popular há outras espécies dos gêneros Tanacetum, que tem

composição química distinta. Todas são utilizadas no tratamento de enfermidades

tipicamente femininas: cólicas menstruais, dores articulares, dores de cabeça

(PAREEK et al, 2011).

Recentemente, a espécie tem recebido considerável atenção em razão,

principalmente, das suas propriedades profiláticas com respeito à frequência e

severidade dos ataques de enxaqueca (PAREEK et al., 2011). Estudos fitoquímicos

relatam que extratos de artemísia contêm grande variedade de metabólitos

secundários, como esteróis, lactonas sesquiterpênicas, flavonoides e taninos

(KAPLAN et al., 2002). No entanto, estudos têm indicado que dentre as 30 lactonas

sesquiterpênicas já identificadas na referida espécie e os outros metabólitos

supracitados, o partenolido é o marcador químico e a principal substância

farmacologicamente ativa (MAJDI et al., 2011).

Tendo em vista sua capacidade profilática à enxaqueca, a partir de 2002 a

indústria farmacêutica Ativus Farmacêutica registrou o medicamento fitoterápico

Tenliv® junto à ANVISA e passo a comercializá-lo. O medicamento tem como princípio

ativo 100 mg do extrato seco de T. parthenium padronizado com 0,6 % de partenolido.

1.6 Partenolido

O partenolido (Figura 9) é uma lactona sesquiterpênica da classe dos

germacrolidos considerado o biomarcador da espécie T. parthenium. Ao partenolido

têm sido descritas diversas atividades biológicas, como analgésica (KIM et al., 2012),

antimicrobiano (BLAKEMAN e ATKINSON, 1979; IZUMI et al., 2008), além da

atividade antirreumática e anti-inflamatória (PFAFFENRATH et al., 2002).

11

Figura 9. Estrutura química do partenolido


O partenolido foi isolado pela primeira vez de Tanacetum parthenium em 1961

por Soucek e colaboradores (1961). O seu teor na planta varia com o crescimento e

desenvolvimento desta, sendo superior nas folhas em crescimento vegetativo e início

do florescimento (HENDRIKS et al., 1997). No estudo conduzido por Heptinstall e

colaboradores (1992) o maior teor de partenolido foi encontrado nas flores (1,38%),

seguido das folhas (0,95%) e apenas 0,08% em caules e raízes.

12

2. OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo geral realizar a caracterização química

do extrato bruto de T. parthenium por CLAE-DAD, isolar e avaliar a atividade

antiparasitária do extrato e de compostos isolados, visando encontrar moléculas e/ou

protótipos naturais com grande potencial esquistossomicida.

Para estes propósitos, os objetivos específicos do trabalho foram:

Produzir o extrato bruto das partes aéreas de T. parthenium;

Analisar o perfil químico do extrato de T. parthenium através de CLAE-

DAD;

Realizar o isolamento, purificação e a identificação dos principais

metabólitos secundários, especialmente lactonas sesquiterpênicas,

presentes no extrato de T. parthenium;

Avaliar a atividade esquistossomicida in vitro do extrato de T. parthenium

e das principais substâncias isoladas e identificadas;

13

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Obtenção do partenolido

Uma amostra de partenolido (pureza ≥ 98%) foi adquirido na empresa Sigma-

Aldrich® (Saint Louis, EUA). A amostra foi acondicionada em geladeira, seguindo as

recomendações do fabricante.

3.2 Coleta e identificação do material vegetal

As partes aéreas de Tanacetum parthenium foram coletadas no dia 24/10/2013

no horto da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)

(Figura 10). A exsicata da espécie vegetal foi depositada no Herbário Leopoldo

Krieger – CESJ, da UFJF, sob número de tombo CESJ 65105.

Figura 10. T. parthenium no Horto da Faculdade de Farmácia/UFJF


3.3 Obtenção do extrato hidroalcoólico de T. parthenium

Após a coleta, 1.983 g das partes aéreas de T. parthenium foram secas à

sombra em temperatura ambiente (Figura 11). Após secagem, o material vegetal foi

submetido à maceração em solução de etanol:água (EtOH:H2O 9:1 v/v). Em seguida,

a solução foi filtrada e transferida para balões de fundo redondo e concentradas com

14

auxílio de rotaevaporador à temperatura de 40 ± 5 ºC.

Os extratos obtidos foram acondicionados em temperatura ambiente em

frascos previamente pesados, resultando em 32 g de extrato bruto hidroalcoólico das

partes aéreas de T. parthenium (TpF).

Figura 11. Secagem de T. parthenium


3.4 Isolamento dos metabólitos de T. parthenium

O extrato TpF foi analisado por cromatografia em camada delgada (CCD),

fazendo uso de diferentes fases móveis contendo hexano, acetato de etila, clorofórmio

e acetona, buscando a condição que proporcionaria a melhor separação dos

metabólitos após a eluição. As placas contendo sílica como fase estacionária foram

analisadas em UV (254 e 365 nm), além do uso de reveladores universais a base de

vanilina e anisaldeído sulfúrico.

Iniciando o processo de isolamento dos metabólitos, uma porção do extrato TpF

(15 g) foi submetida à cromatografia líquida à vácuo (CLV) de 10 cm de diâmetro por

9 cm de altura, empacotada com 310 g de sílica gel (60-230 µm), utilizando-se como

fase móvel mistura de hexano:acetato de etila (Hex:AcOEt) em grau crescente de

polaridade (Figura 12).

15

Figura 12. CLV do extrato bruto TpF


T

A fração TpF (4-5) de 1,963 g foi submetida a cromatografia em coluna clássica

(CCC) de 4 cm de diâmetro e 18 cm de altura, empacotada com 30 g de sílica gel de

40-63 µm (Figura 13). A fase móvel escolhida foi a mistura de clorofórmio:acetona

(CHCl3:Me2CO) e ao fim do processo de separação foram obtidas 35 subfrações de

100 mL cada.

Figura 13. Coluna de cromatografia clássica da fração TpF (4-5)


16

A fração (6-7) foi submetida a um fracionamento por coluna clássica. A fase

estacionária foi constituída de 221 g de sílica gel (60-230 μm) 5 cm de diâmetro por

18 cm de altura como sistema eluente a solução de hexano:acetato de etila em

polaridade crescente. Foram coletadas 80 frações que por meio de análise em CCD

foram agrupadas em 10 frações.

3.5 Identificação estrutural das substâncias isoladas

Os compostos isolados foram identificados por meio da análise dos espectros

de RMN de 1H e 13C em comparação com a literatura. A obtenção dos espectros foi

realizada no Departamento de Química da UFJF, registrados no espectrômetro

Brucker Ascend TM 500®, operando a 500 MHz para 1H e a 125 MHz para 13C. Como

referência interna, utilizou-se o tetrametilsilano (TMS). Os valores de deslocamento

químico (δ) são referidos em partes por milhão (ppm), e as constantes de acoplamento

(J) em Hertz (Hz). Para a solubilização das substancias isoladas foi utilizou-se

clorofórmio deuterado (CDCl3) da marca Cambridge Isotope Laboratories® (Andover,

EUA).

3.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplada a Detector de Arranjo de

Diodos (CLAE-DAD)

O extrato bruto hidroalcoólico das partes aéreas de T. parthenium (TpF) e as

três substâncias isoladas foram analisadas por CLAE-DAD. Os cromatogramas foram

obtidos no cromatógrafo Waters® e todas as amostras foram diluídas em MeOH grau

CLAE J.T.Baker® de forma a obter uma concentração de 1 mg/mL. As soluções foram

aquecidas a 40 ºC e sonicadas por 10 minutos a fim de favorecer a solubilização. Em

seguida as amostras foram centrifugadas, seu sobrenadante retirado, filtrado em

microfiltros de 0,45 µm de porosidade e transferidas para frascos de vidro (vials)

apropriados. Foram injetados 30 µL do extrato TpF e das substâncias isoladas em

coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. A análise de TpF e do partenolido teve como fase

móvel um sistema gradiente linear de em água + H3PO4 0,5% e acetonitrila, variando

de 40 a 100% de B, conforme a tabela 1 com fluxo de fase a 1 mL/min.

17

Tabela 1. Gradiente utilizado como fase móvel para TpF e partenolido

A análise das outras duas substâncias isoladas consistiu em uma fase móvel

em um sistema gradiente linear de em água + H3PO4 0,5% e metanol, variando de 40

a 100%, conforme a tabela 2 com fluxo 1 mL/min.

Tabela 2. Gradiente utilizado como fase móvel para TpF (6-7)-8 e TpF (6-7)-9

Foi realizado um monitoramento utilizando-se DAD em varredura entre λ = 190

a 400 nm, sendo selecionada a leitura nos comprimentos de onda λ = 210 nm, 256

nm e 270 nm, referentes às absorvâncias dos compostos isolados.

3.7 Avaliação in vitro da atividade esquistossomicida

A atividade esquistossomicida in vitro do extrato hidroalcóolico de T.

parthenium, além das três substâncias isoladas foram avaliadas frente a vermes

adultos de S. mansoni. Os ensaios esquistossomicidas foram realizados no Núcleo de

Enteroparasitas do Instituto Adolfo Lutz em São Paulo, sob a coordenação e

responsabilidade do Prof. Dr. Josué de Moraes. Todos os experimentos foram

autorizados pelo Comitê de Ética do Instituto Adolfo Lutz, em São Paulo (CEUA,

11.794/08).

Tempo (min) H2O % ACN %

0 60 40

40 0 100

45 0 100

Tempo (min) H2O % MeOH %

0 60 40

40 0 100

45 0 100

18

3.7.1 LINHAGEM DO S. mansoni

A linhagem de S. mansoni Sambon, 1907 utilizada neste trabalho foi a BH (Belo

Horizonte, MG), mantida no Núcleo de Enteroparasitas do Instituto Adolfo Lutz (São

Paulo, SP) como previamente descrito por De Moraes et al., (2012). Os parasitos

foram mantidos em caramujos Biomphalaria glabrata Say, 1818 (hospedeiro

intermediário) e hamsters Mesocricetus auratus Waterhouse, 1839 (hospedeiro

definitivo).

3.7.2 ANIMAIS HOSPEDEIROS

Os caramujos foram mantidos em aquários de polietileno (55 x 22 x 17 cm),

com cerca de 20 litros de água declorada, em temperatura de 24 ºC, e alimentados

com alface fresca. Os aquários eram arejados com bombas de 1,5 W (DE MORAES

et al., 2009).

Os hamsters foram fornecidos pelo Biotério do Instituto Adolfo Lutz, os quais

foram mantidos em caixas de polipropileno (40 x 34 x 16 cm) com tampa metálica e

alimentados com ração e água ad libitum. Esses roedores eram recém desmamados,

de um único sexo, com massa de aproximadamente 20 g aos 21 dias de idade. Os

animais foram acomodados em maravalha com troca a cada quatro dias.

3.7.3 MANUTENÇÃO DO CICLO EVOLUTIVO DE S. mansoni

Os hamsters infectados foram sacrificados em câmara de CO2 para a retirada

dos ovos infectados do fígado e posterior obtenção dos miracídios. Os fígados foram

triturados em liquidificador em solução salina 0,85% (m/v), e a suspensão dos tecidos

homogeneizados foi deixada para sedimentação no escuro. O sedimento foi suspenso

com água declorada e exposto à luz para obtenção dos miracídios. O número e a

viabilidade dos miracídios e cercárias foram determinados com o auxílio de um

estereomicroscópio (PELLEGRINO e KATZ, 1968).

Para a infecção do hospedeiro intermediário foram utilizados 8 miracídios por

caramujo. Os moluscos sexualmente maduros foram colocados, individualmente, em

placas de cultura de células (24 poços) contendo água filtrada. A exposição do

molusco aos miracídios foi realizada sob a luz artificial durante 3 a 4 horas. Após 35

a 40 dias, os caramujos foram examinados, colocando-os, individualmente, em

placas de 24 poços e expostos à luz artificial para a eliminação das cercárias,

19

durante 2 a 3 horas. Os exemplares infectados foram protegidos da luz com a

colocação de papel escuro em torno do aquário para evitar a liberação de cercárias

(PELLEGRINO e KATZ, 1968).

Para infecção do hospedeiro definitivo, cerca de 30 caramujos infectados foram

transferidos para um recipiente de vidro contendo água declorada e submetidos a

calor e iluminação, a fim de eliminar as cercárias. Essas foram transferidas para tubos

de ensaio em vidro com capacidade de 40 mL parcialmente protegidos da luz com

papel alumínio, de modo que a entrada de luz era somente no ápice. As cercárias

foram utilizadas na infecção dos hamsters (PELLEGRINO e KATZ, 1968)

3.7.4 OBTENÇÃO DOS VERMES ADULTOS DE S. mansoni

Os vermes adultos de S. mansoni, com 49 dias de idade, foram recuperados

por perfusão do sistema porta hepático como descrito por Smithers e Terry (1965). A

perfusão foi realizada com meio RPMI 1640 contendo L-glutamina, vermelho de fenol

e heparina sódica 5 UI/ml. Os hamsters foram sacrificados por inalação de CO2 e,

posteriormente, foi realizado uma secção longitudinal na região ventral, expondo se

os órgãos internos. A veia porta foi seccionada e, através de perfusão, injetou-se meio

de cultura diretamente no coração do animal para coleta dos vermes adultos. Em

seguida, estes parasitos foram transferidos para uma placa de 24 poços (um casal por

poço) contendo 2 mL do meio RPMI 1640, e incubados, em atmosfera umidificante, a

37 °C na presença de 5% de CO2. Após 24h de incubação, os casais que se

separaram foram descartados e substituídos, sendo que os demais foram transferidos

para poços de cultura com o auxílio de uma pipeta de Pasteur.

3.7.5 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA O ENSAIO

As amostras foram dissolvidas em dimetilsulfóxido 100% (DMSO) e

posteriormente, adicionou-se meio RPMI 1640, esterilizado por filtração para obter

concentração 200 μg/mL dos extratos brutos em DMSO 0,5% (v/v). O PZQ 5 μM

preparado nas mesmas condições, foi utilizado como controle positivo.

3.7.6 ENSAIO ESQUISTOSSOMICIDA in vitro

Os ensaios in vitro com vermes adultos de S. mansoni foram realizados com

machos e fêmeas acasalados. Na placa de Petri, os pares de vermes obtidos dos

20

hamsters, por perfusão, foram lavados 2 vezes com o meio RPMI 1640 contendo

penicilina 200 U/mL, estreptomicina 200 μg/mL e anfotericina B 2 μg/mL.

Posteriormente, os parasitos acasalados foram transferidos para placas de cultura de

células com 24 poços contendo 1 casal de verme, por poço, em 2 mL do meio RPMI

1640, suplementado com 10% de soro fetal bovino e tamponado com HEPES 25 mM

(DE MORAES et al., 2011a; 2011b). Diferentes concentrações das amostras foram

diluídas no meio de cultura antes da adição dos parasitos, sendo que a concentração

final de DMSO não foi superior a 0,5%. O PZQ (5 μM) foi utilizado como controle

positivo e os poços contendo somente meio de cultura, RPMI 1640, e meio com DMSO

0,5% foram usados como controle negativo.

As culturas foram mantidas em estufa a 37 ºC, em atmosfera de CO2 a 5%

(Thermo Scientfic-Revco®) e foram monitoradas diariamente por 5 dias, com o auxílio

de um microscópio invertido e um estereomicroscópio (SMZ 1000, Nikon).

Para avaliar a toxicidade dos extratos e substâncias isoladas sobre o S.

mansoni foram considerados os seguintes parâmetros: atividade motora (motilidade),

contração muscular, alterações morfológicas no tegumento e oviposição (DE

MORAES, 2012).

Para a análise da atividade motora utilizou-se um estereomicroscópio,

enquanto que, para as alterações morfológicas, um microscópio invertido, usando

técnica de campo claro ou contraste de interferência foi utilizado.

A mortalidade dos vermes foi julgada pela ausência de movimentos durante 2

minutos. No término do período de incubação (5 dias) ou ocorrência de morte, os

parasitos foram fixados e analisados em microscopia confocal.

3.7.7 ANÁLISE MORFOLÓGICA DO TEGUMENTO DOS VERMES ADULTOS

UTILIZANDO MICROSCOPIA CONFOCAL

O efeito do extrato TpF e dos compostos isolados sobre o tegumento de vermes

adultos de S. mansoni foi monitorado com microscópio confocal de varredura a laser

(Laser Scanning Microscopy, LSM 510 META, Carl Zeiss Inc, Standort Göttingen,

Vertrieb, Deutschland). Os parasitos foram fixados em solução AFA e monitorados,

com captura de imagens, no microscópio usando os filtros de 488 nm (excitação) e

505 nm (emissão) como descrito por De Moraes et al. (2009, 2011b). A solução AFA

consiste em uma mistura de ácido acético glacial, formaldeído, etanol (95%) e água

destilada nas proporções 2:9:30:59 (v/v), respectivamente (DE MORAES, 2012).

21

3.8 Avaliação da citotoxicidade

3.8.1 Linhagem celular e condições de cultivo

A linhagem de células de mamífero utilizada nos experimentos realizados neste

trabalho foi a de células Vero ATCC CCL-81, procedentes do “American Type Culture

Collection” (Manassas, VA, USA), uma linhagem celular de rim de macaco verde

africano Cercopithecus aethiops (L.).

As células Vero foram mantidas a 37 ºC, em atmosfera de CO2 a 5%, com

repiques realizados a intervalos de 3 a 4 cinco dias, em garrafas plásticas para cultura

de células (área de 75 cm2), contendo Meio de Eagle Modificado por Dulbecco

(DMEM, adquirido na forma líquida pronta para uso; Gibco BRL, Grand Island, NY,

USA) suplementado com 10% de soro fetal bovino. O crescimento foi monitorado em

microscópio invertido até a formação de monocamadas semiconfluentes,

assegurando-se, assim, a obtenção de células em fase logarítmica de crescimento.

Por serem células aderentes, para a obtenção de suspensão, o sobrenadante das

culturas foi colhido e as células aderidas foram descoladas em solução tripsina/EDTA

0,05% (Gibco), procedimento este feito a 37 ºC (tempo aproximado, cinco minutos). A

suspensão celular foi transferida para tubos de polipropileno de fundo cônico

(capacidade de 50 mL); após centrifugação a 400 x g, por 10 minutos à temperatura

ambiente, as células foram ressuspensas em meio DMEM, contadas em câmara de

Neubauer e então utilizadas em novos repiques ou distribuídas em microplacas de 96

poços (Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA) para os ensaios de

citotoxicidade.

3.8.2 Ensaio de citotoxicidade

Os ensaios de citotoxicidade foram feitos utilizando o método de coloração por

cristal violeta. Nos experimentos, as células Vero foram crescidas em placas de cultura

de 96 poços. Após 24 horas, com tapetes celulares confluentes, o meio foi removido

por aspiração e, em seguida, foram adicionados 200 µL de meio DMEM

nanocompósitos a base de borracha (1 a 50 phr) em diferentes concentrações (1 a

4000 µg/mL); borracha natural, sem nanocompósito, também foi utilizada nas mesmas

concentrações como controle. A incubação prosseguia a 37 ºC (em atmosfera de CO2

a 5%) e, após diferentes tempos, os sobrenadantes foram retirados e as células

22

aderidas foram fixadas e coradas com a adição de 50 µL de uma solução que continha

cristal violeta 0,2% em metanol 20% (v/v). Após cerca de 10 minutos, o corante foi

removido por sucessivas lavagens em água destilada e as microplacas secas à

temperatura ambiente (DE MORAES, et al. 2011).

As células viáveis ficam aderidas nas placas e, portanto, são coradas pelo

cristal violeta. Para uma análise mais detalhada da toxicidade, adicionou-se 100 µL

de etanol 99% nas microplacas e a viabilidade celular foi avaliada a partir da

absorvância de poços controles, contendo células em meio DMEM. As absorbâncias

foram lidas a 595 nm em leitor de microplaca (modelo iEMS, Labsystems, Vienna, VA,

USA).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Isolamento dos metabólitos

O processo de maceração forneceu o extrato bruto hidroalcoólico das partes

aéreas de T. parthenium, o qual foi submetido a processos cromatográficos e resultou

no isolamento das substância TpF (4-5)-15, TpF (6-7)-8 e TpF (6-7)-9.

Ao fim da CLV, foram coletadas 7 frações de aproximadamente 2000 mL e a

coluna foi finalizada com diclorometano (DCM) até a exaustão, resultando em mais

uma fração conforme a Tabela 3.

Tabela 3. Frações obtidas por CLV do extrato TpF

Eluentes Frações Massas (g) Hex:AcOEt 5% TpF-1 0,173

Hex:AcOEt 15% TpF-2 0,410






DCM 100% TpF-8 0,101

As oito frações obtidas foram analisadas em CCD, utilizando como fase móvel,

hexano:acetato de etila (6:4 v/v), revelando em luz UV no comprimento de onda 254

nm e posteriormente em anisaldeído sulfúrico (Figura 14).

23

Figura 14. CCD das frações obtidas da cromatografia líquida à vácuo de TpF. Fase móvel: Hex:AcOEt (6:4 v/v); Revelador: Anisaldeído sulfúrico


A partir da análise cromatográfica e comparação com o padrão de partenolido,

foi possível inferir a presença dessa substância nas frações 4 e 5. Para isolamento de

tal substância, estas frações foram reunidas, passando a ter o código TpF (4-5), e

posteriormente submetida a novo fracionamento.

Durante o novo processo cromatográfico, as frações eram monitoradas por

CCD e observou-se que a partir da subfração TpF (4-5)-7 o perfil apresentava-se como

uma única mancha na CCD, de mesma coloração e fator de retenção que o padrão

de partenolido (Figura 15).

Figura 15. CCD das frações obtidas da CCC de TpF (4-5) Fase móvel: Hex:AcOEt (6:4 v/v); Revelador: Anisaldeído sulfúrico


Observando o perfil das demais frações, foi possível agrupá-las em 7

subfrações, como mostra a Tabela 4.

24

Tabela 4. Frações obtidas por CCC da fração TpF (4-5)

A fração TpF (4-5)-15 (152 mg) apresentou-se como um pó branco (Figura 16)

e considerando uma única mancha em CCD, foi analisada por RMN de 1H e 13C.

Figura 16. Frasco com a fração TpF (4-5)-15


A análise cromatográfica das frações TpF-6 e TpF-7 indicava a presença de

duas substâncias majoritárias de cor amarela quando reveladas com anisaldeído

sulfúrico. Buscando o isolamento de tais substâncias, estas frações foram reunidas,

passando a ter o código TpF (6-7), e posteriormente submetida a um fracionamento

por coluna clássica, cujas frações estão descritas na tabela 5.

Tabela 5. Frações obtidas por CCC da fração TpF 6-7

Eluentes Subfrações Massas (g) CHCl3:Me2CO 0,5% TpF (4-5)-6 0,293

CHCl3:Me2CO 0,5% TpF (4-5)-15 0,152

CHCl3:Me2CO 0,5% TpF (4-5)-17 0,039

CHCl3:Me2CO 2% TpF (4-5)-22 0,232

CHCl3:Me2CO 5% TpF (4-5)-30 0,574

CHCl3:Me2CO 5% TpF (4-5)-33 0,159

Me2CO 100% TpF (4-5)-35 0,038

Eluentes Subfrações Massas (mg)

Hexano 100% TpF (6-7)-1 193 mg

Hex:AcOEt 2% TpF (6-7)-2 74 mg








AcOEt 100% TpF (6-7)-10 132 mg

25

De acordo com a análise do perfil cromatográfico das subfrações resultantes,

observou-se que as subfrações TpF (6-7)-8 de 28 mg e TpF (6-7)-9 de 335 mg

apresentavam-se como uma mancha única na CCD (Figura 17). As substâncias

isoladas apresentaram-se como um pó amarelo e para determinação da sua estrutura

química, foram avaliadas por RMN de 1H e 13C.

Figura 17. CCD das frações TpF (6-7)-8 e TpF (6-7)-9 Fase móvel: Hex:AcOEt (8:2 v/v); Revelador: Anisaldeído sulfúrico


4.2 Perfil cromatográfico do extrato bruto por CLAE-DAD

Na análise qualitativa por CLAE-DAD do extrato bruto hidroalcoólico filtrado das

partes aéreas de T. parthenium (Figura 18) pode-se observar a presença de diversas

substâncias, as quais também não podem ter a classe química inferida apenas com o

espectro de UV. Porém, estudos anteriores revelam que as partes aéreas de T.

parthenium são constituídas por óleos voláteis, esteróis, flavonoides, taninos e

lactonas sesquiterpênicas (KAPLAN et al., 2002).

26

Figura 18. Cromatograma obtido por CLAE-DAD do extrato bruto hidroalcoólico filtrado das partes aéreas de T. parthenium. Injeção de 30 µL do TpF em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e ACN, variando de 40 a 100% de ACN (0 - 40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 200 nn


Segundo Majdi e colaboradores (2011), o partenolido é o principal composto de

T. parthenium dentre as lactonas sesquiterpênicas. A partir da análise em CLAE-DAD

observa-se o partenolido, nas condições aplicadas, no tempo de retenção 14,99 min

(Figura 18). Assim, a sobreposição dos cromatogramas obtidos nas mesmas

condições cromatográficas nos permitem observar a presença do partenolido no

extrato bruto hidroalcoólico das partes aéreas de T. parthenium (Figura 19).

Figura 19. Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE-DAD do extrato bruto hidroalcoólico filtrado das partes aéreas de T. parthenium e do partenolido. Injeção de 30 µL de TpF e partenolido em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e ACN, variando de 40 a 100% de ACN (0 - 40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 200 nm

27

4.3 Pureza das substâncias isoladas

As substâncias isoladas a partir da matriz complexa, foram submetidas a CLAE-

DAD a fim de certificar a pureza dos compostos. A análise foi feita por varredura (200-

400 nm). As três substâncias apresentaram alto grau de pureza, assim como podemos

observar nos cromatogramas a seguir.

Figura 20. Cromatograma obtido por CLAE-DAD da fração TpF (4-5)-15 e espectro de UV. Injeção de 30 µL em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e acetonitrila, variando de 40 a 100% de ACN (0-40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 200 nm


Figura 21. Cromatograma obtido por CLAE-DAD da fração TpF (6-7)-8 e espectro de UV. Injeção de 30 µL em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e metanol, variando de 40 a 100% de MeOH (0-40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 256 nm


28

Figura 22. Cromatograma obtido por CLAE-DAD da fração TpF (6-7)-9 e espectro de UV. Injeção de 30 µL em coluna C18; 4,6 x 250 mm; 5 µm. Fase móvel: H3PO4 0,5% em água e metanol, variando de 40 a 100% de MeOH (0-40 min), fluxo de fase a 1 mL/min, λ = 270 nm


4.4 Identificação estrutural das substâncias isoladas

4.4.1 SUBSTÂNCIA TpF (4-5)-15

A comparação dos dados espectroscópicos obtidos da substância TpF (4-5)-15

com os dados oriundos da literatura (TIUMAN et al., 2005), permitem concluir que a

substância TpF (4-5)-15 trata-se de uma lactona sesquiterpênica, conhecida como

partenolido, representado a seguir (Figura 23).

29

Figura 23. Estrutura química do partenolido


Tabela 6. Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (4-5)-15 e dados do partenolido descritos na literatura

Experimental

CDCl3, 500 MHz TIUMAN et al., 2005.

CDCl3, 500 MHz

Posição δH (ppm) δH (ppm)

1 5,23 d (1H), J=2,6 Hz 5,21 dd (1H), J=2,7 Hz

2, 3, 7, 8, 9 1,27; 2,19; 2,38 m

(9H)

1,20 - 1,28 m (1H) 1,70 - 1,77 m (1H) 2,11 - 2,21 m (4H) 2,32 - 2,49 m (2H) 2,74 - 2,82 m (1H)

5 2,80 d (1H), J=8,8 Hz 2,79 d (1H), J=9,0 Hz

6 3,88 t (1H), J=8,4 Hz 3,86 t (1H), J=8,4 Hz

13 5,64 d (1H), J=3,0 Hz 6,34 d (1H), J=3,6 Hz

5,62 d (1H) Hβ, J=3,0 Hz 6,34 d (1H) Hα, J=3,6 Hz

14 1,74 s (3H) 1,72 s (3H)

15 1,33 s (3H) 1,31 s (3H)

30

Figura 24. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500MHz) de TpF (4-5)-15 identificada como partenolido


31

Na expansão do espectro de RMN de 1H (Figura 25) são observados sinais em

5,23; 5,64 e 6,34 ppm, correspondentes aos hidrogênios vinílicos (H-1 e H-13). (PAVIA

et al., 2010).


de 5,2 a 6,6 ppm, presença dos sinais dos hidrogênios vinílicos


Os sinais dos hidrogênios oximetínicos (H-5 e H-6) são observados em δ 2,80

ppm como um dupleto e em δ 3,88 ppm, como um tripleto, integrados para um

hidrogênio cada (Figura 26).

Figura 26. Expansão do espectro de RMN de 1H de TpF (4-5)-15 no deslocamento de 2,8 a 3,9 ppm: sinais dos hidrogênios oximetínicos (δ 2,80 e 3,88 ppm)


E ainda ressalta-se a presença de dois simpletos, em δ

1,74 e 1,33 ppm, integrados para 3 hidrogênios cada, correspondentes aos grupos

metilas H-14 e H-15, respectivamente (Figura 27).

32

Figura 27. Expansão do espectro de RMN de 1H de TpF (4-5)-15 no deslocamento de 1,3 a 1,8 ppm, presença dos sinais dos hidrogênios metílicos (δ 1,74 e 1,33 ppm)


Em relação ao espectro de RMN de 13C (Tabela 7; Figura 28), podemos concluir

que a substância TpF (4-5)-15 apresenta 15 átomos de carbono, sendo 4 carbonos

quaternários, 4 carbonos metínicos, 5 carbonos metilênicos e 2 carbonos metílicos.

Os sinais em δ 125,3; 134,6; 139,2 e 121,2 ppm foram atribuídos aos carbonos

olefínicos C11 e C13, C1 e C10, respectivamente. E o carbono carbonílico pode ser

observado em δ 169,2 ppm. Além disso, observam-se sinais em δ 61,5 e 66,4 ppm,

que ao serem comparados com os dados da literatura (TIUMAN et al., 2005) mostram-

se compatíveis com os carbonos do grupamento epóxido C-4 e C-5, respectivamente.

Tabela 7. Dados de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (4-5)-15 e dados do

partenolido descritos na literatura

Experimental

CDCl3, 125 MHz TIUMAN et al., 2005.

CDCl3, 125 MHz

Posição δC (ppm) δC (ppm)

1 125,3 125,3

2 24,1 24,1

3 36,3 36,3

4 61,5 61,5

5 66,4 66,4

6 82,4 82,4

7 47,7 47,7

8 30,6 30,6

9 41,2 41,2

10 134,6 134,6

11 139,2 139,2

12 169,2 169,3

13 121,2 121,3

14 16,9 16,9

15 17,3 17,3

33

Figura 28. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 125MHz) de TpF (4-5)-15 identificada como partenolido


34


A comparação dos dados espectroscópicos obtidos da substância TpF (6-7)-

8com os dados oriundos da literatura (MIYAZAWA & HISAMA, 2003), permitem

concluir que a substância trata-se do flavonoide 4’,5,7-triidroxiflavona conhecido como

apigenina, representado a seguir (Figura 29).

Figura 29. Estrutura química da apigenina


Tabela 8. Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-8 e dados da apigenina descritos na literatura

Experimental

CDCl3, 500 MHz MIYAZAWA & HISAMA, 2014

DMSO, 500MHz


3 6,65 s (1H) 6,68 s (1H)

6 6,27 d (1H), J=2,0 Hz 6,20 d (1H), J=2,0 Hz

8 6,55 d (1H), J=2,0 Hz 6,44 d (1H), J=2,0 Hz

3’ – 5’ 7,04 d (2H), J=8,8 Hz 6,90 d (2H), J=9,0 Hz

2’ – 6’ 7,96 d (2H), J=8,8 Hz 7,92 d (2H), J=9,0 Hz

-OH 13,03 s (1H) 13,03 s (1H)

35

Figura 30. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-8 identificada como apigenina


36

O espectro de RMN de 1H e suas expansões apresentaram sinais dupletos em

δ 6,26 e δ 6,55, correspondentes aos H-6 e H-8.


de 6,2 a 6,7 ppm, correspondentes aos prótons H-6 e H-8


Além disso, dupletos em δ 7,04 e δ 7,96 referentes aos prótons do anel B H-

3’/H-5’ e H-2’/H-6 e um simpleto em δ 6,65 corresponde ao H-3. Os sinais

apresentados caracterizam uma flavona 4’-5-7 trissubstituída.

Figura 32. Expansão do espectro de RMN de 1H de TpF (6-7)-8 no deslocamento de 7,0 a 8,0 ppm, correspondentes aos prótons H-2’ e H-6


37

O espectro de RMN de 13C apresentou doze carbonos aromáticos, sete

carbonos quaternários, cinco carbonos metílicos e uma carbonila.

Tabela 9. Dados de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (6-7)-8 e dados da apigenina descritos na literatura

Experimental

CDCl3, 125 MHz OLIVEIRA, 2014 DMSO, 75 MHz

Posição δ (ppm) δ (ppm)

2 164,2 166,2

3 103,2 103,6

4 182,2 182,9

5 161,0 162,7

6 98,8 99,3

7 164,0 164,9

8 93,9 94,1

9 157,9 159,0

10 103,0 103,7

1’ 122,4 122,7

2’ – 6’ 128,4 129,4

3’ – 5’ 116,0 116,9

4’ 162,5 164,3

38

Figura 33. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (6-7)-8 identificada como apigenina


39


A comparação dos dados espectroscópicos obtidos da substância TpF (6-7)-9

com os dados oriundos da literatura (LIRA, 2009), permitem concluir que a substância

trata-se do flavonoide 5,7-diidroxi-3,4’,6-trimetoxiflavona conhecido como santina ou

centauridina, representado a seguir (Figura 34).

Figura 34. Estrutura química da santina

Diversas atividades farmacológicas já foram atribuídas ao flavonoide santina,

podendo citar a inibição da ciclooxigenase da lipooxigenase, inibição da síntese de

óxido nítrico e da prostaglandina E2 (ABAD et al., 2004), atividade antibacteriana e

antifúngica (ALJANCIC et al., 1999).

Tabela 10. Dados de RMN de 1H (CDCl3, 500MHz) de TpF (6-7)-9 e dados da santina descritos na literatura

Experimental

CDCl3, 500 MHz LIRA, 2009

DMSO-d6, 500 MHz


8 6,57 6,56 (s, 1H)

2’ – 6’ 8,09 d J=9,0 Hz, 2H 8,01 (d, J= 9 Hz, 2H)

3’ – 5’ 7,04 d J=9,0 Hz, 2H 7,12 (d, J= 9 Hz, 2H)

CH3O – 3 3,92 3,78 (s, 3H)

CH3O – 6 3,87 3,75 (s, 3H)

CH3O – 4’ 4,06 3,85 (s, 3H)

40

Figura 35. Espectro de RMN de 1H (CDCl3, 500 MHz) de TpF (6-7)-9 identificada como santina


41

O espectro de RMN de 1H e sua expansão apresentou sinais de hidrogênio

característicos de um sistema aromático para dissubstituído, representado por dois

dupletos em δ 8,09 e δ 7,04 correspondentes aos dois pares de átomos de hidrogênio

H-2’/H-6’ e H-3’/H-5’ do anel B de flavonoides, acoplados (Figura 36).


de 7,0 a 8,2 ppm, presença dos sinais dos hidrogênios do anel B


A presença de três simpletos em δ 3,92, δ 3,87 e δ 4,06 são compatíveis com

a presença de três metoxilas na molécula. Este espectro mostrou ainda, um sinal

simples com deslocamento químico de δ 6,57 para um hidrogênio aromático,

indicando a presença de anel A trissubstituído (Figura 37).


3,8 a 4,2 ppm, correspondentes às metoxilas


42

Em relação ao espectro de RMN de 13C, observa-se a presença de dezesseis

sinais, sendo dez atribuídos a carbonos não-hidrogenados, três a carbonos metílicos

e três a carbonos metoxilícos. Os sinais encontrados ao serem comparados com os

dados da literatura (LIRA, 2009) mostram-se compatíveis.

Tabela 11. Dados de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (6-7)-9 e dados da santina

descritos na literatura

Experimental

CDCl3, 125 MHz LIRA, 2009

DMSO-d6, 125 MHz

Posição δ (ppm) δ (ppm)

2 154,99 155,26

3 138,43 137,60

4 179,22 178,21

5 152,27 152,38

6 130,20 131,17

7 156,16 157,44

9 151,82 151,61

10 106,22 104,66

1’ 122,79 122,21

4’ 161,73 161,34

8 93,12 94,04

2’ – 6’ 130,02 130,00

3’ – 5’ 114,10 114,25

CH3O - 3 60,93 59,76

CH3O - 6 60,18 59,98

CH3O – 4’ 55,46 55,44

43

Figura 38. Espectro de RMN de 13C (CDCl3, 125 MHz) de TpF (6-7)-9 identificada como santina


44

4.5 Ensaios esquistossomicidas in vitro

4.5.1 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO EXTRATO TpF

Apesar dos relatos na literatura do potencial esquistossomicida de

diferentesespécies de plantas, ainda não há estudos desta atividade para o extrato

bruto de partes aéreas de T. parthenium.

Dessa forma, avaliou-se a atividade esquistossomicida in vitro de TpF frente a

formas adultas de S. mansoni e os resultados estão descritos na Tabela 12.

Tabela 12. Atividade esquistossomicida in vitro de TpF sobre os vermes adultos de S. mansoni.

Grupos Tempo de incubação

(h)

Mortalidade (%)a

Redução na atividade motora (%)a

Alterações tegumentares

(%)a

RPMI 1640

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

DMSO 0,5%

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

PZQ 5 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

TpF 200 µg/mL

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

TpF 100 µg/mL

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

TpF 50 µg/mL

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

TpF 25 µg/mL

24 0 0 0

48 0 0 0

72 50 50 50

TpF 12,5 µg/mL

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

Após as 72h de ensaio, nenhum efeito dos controles negativos relacionados à

morte, alterações no tegumento ou na atividade motora foi observado nos

experimentos realizados. O PZQ, fármaco de escolha no tratamento da

esquistossomose, foi utilizado como controle positivo. Em 24h de incubação promoveu

45

a morte de todos os vermes na concentração de 5 μM. Assim como mostrado na tabela

12, após 24h de incubação, 100% dos vermes adultos foram mortos na presença do

TpF em 200, 100 e 50 µg/mL, bem como todos os parasitos apresentaram alterações

tegumentares significativas. Esses resultados foram equivalentes ao efeito do PZQ 5

µM. Esse resultado incrementa as atividades biológicas do extrato bruto de T.

parthenium, uma vez que Rabito e colaboradores (2014) evidenciaram grande

efetividade em ensaios in vitro e in vivo contra formas promastigotas e amastigotas de

Leishmania amazonenses.

4.5.2 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DOS METABÓLITOS ISOLADOS

As substâncias isoladas das partes aéreas de T. parthenium, partenolido,

apigenina e santina foram avaliadas, inicialmente na concentração de 100 µM, quanto

à atividade esquistossomicida in vitro frente a vermes adultos de S. mansoni. Os

resultados desse ensaio estão representados na Tabela 13.

Tabela 13. Atividade esquistossomicida in vitro dos metabólitos isolados partenolido,

apigenina e santina sobre os vermes adultos de S. mansoni.


(h)

Mortalidade (%)a



(%)a

RPMI 1640

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

DMSO 0,5%

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

PZQ 5 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

Partenolido 100 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

Apigenina 100 µM

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

Santina 100 µM

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

Os flavonoides santina e apigenina, nas 72h de incubação, não apresentaram

nenhum efeito sobre os vermes adultos. Apesar da santina na concentração testada

46

não possuir atividade esquistossomicida in vitro, Mai e colaboradores (2015)

evidenciaram atividade dessa substância em concentrações menores do que 100 µM

contra L. amazonensis e Trypanosoma brucei gambiense. A apigenina, em trabalho

desenvolvido por Kirmizibekmez e colaboradores (2011) também foi capaz de

expressar atividade frente a Trypanosoma brucei rhodesiense, Trypanosoma cruzi, L.

donovani e P. falciparum, agentes etiológicos da doença de Chagas, leishmaniose

visceral e malária, respectivamente. Isso sugere um mecanismo de ação voltado

especificamente para protozoários, uma vez que os flavonoides não apresentaram

atividade significativa frente a S. mansoni, que é um helminto.

A lactona partenolido por sua vez foi capaz de causar a morte de 100% dos

vermes adultos, assim como reduzir significativamente a atividade motora e causar

alteração tegumentar significativa em todos os vermes, em 24h de incubação. Os

resultados apresentados por essa substância se assemelham ao observado para o

extrato TpF, nas concentrações de 200, 100 e 50 µg/mL e para o controle positivo,

PZQ (5 µM). A partir do resultado deste ensaio inicial, o partenolido foi testado em

diferentes concentrações buscando a menor dose letal da substância.

4.5.3 ATIVIDADE ESQUISTOSSOMICIDA in vitro DO PARTENOLIDO

O partenolido foi capaz de exercer atividade frente aos casais de S. mansoni

em 24h em concentrações maiores que 25 µM. Na concentração de 12,5 µM, a morte

dos parasitas ocorreu somente após 48h de incubação e na concentração de 6,25 µM

o partenolido não exerceu qualquer alteração nos parâmetros avaliados em 72h de

incubação. A concentração de partenolido necessária para matar 50% dos vermes

adultos (IL50) foi de 9,5 µM em 72h (Tabela 14).

Além disso, a incubação dos vermes com o partenolido manteve os machos

separados das fêmeas, impedindo qualquer chance de ovoposição. Por outro lado,

todos os casais do grupo controle permaneceram unidos, sendo possível observar a

produção de ovos.

47

Tabela 14. Atividade esquistossomicida in vitro do partenolido em diferentes concetrações sobre os vermes adultos de S. mansoni.


(h)

Mortalidade (%)a



(%)a

RPMI 1640

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

DMSO 0,5%

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

PZQ 5 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

Partenolido 100 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

Partenolido 50 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

Partenolido 25 µM

24 100 100 100

48 100 100 100

72 100 100 100

Partenolido 12,5 µM

24 0 0 0

48 100 100 100

72 100 100 100

Partenolido 6,25 µM

24 0 0 0

48 0 0 0

72 0 0 0

O mecanismo de ação que o partenolido exerce ainda não é claro, entretanto é

conhecido que a atividade antiparasitária de lactonas sesquisterpênicas são mediadas

quimicamente por carbonilas 𝛼,𝛽 insaturadas, assim como 𝛼-metileno-𝛾-lactona

encontrado no partenolido. Essa estrutura pode reagir com nucleófilos, especialmente

sulfidrilas da cisteína por uma adição de Michael (Figura 39). Tendo em vista a

presença em grande quantidade de resíduos de cisteína nos tubérculos de S.

mansoni, essa reação pode causar alterações morfológicas e inibir várias enzimas

presentes no tegumento (DA SILVA, 2010).

A respeito disso, Izumi e colaboradores (2008), demonstraram que o

partenolido induz a perda da integridade da membrana plasmática de formas

tripomastigotas de T. cruzi. Também se associa a atividade leishmanicida do

48

partenolido com a perda da integridade da membrana e disfunção mitocondrial

(TIUMAN et al., 2014).

Figura 39. Reação entre partenolido e cisteína. Em vermelho a carbonila α-β insaturada e o nucleófilo sulfidrila

Fonte: elaborado pelo próprio autor.

4.5.4 ALTERAÇÕES TEGUMENTAR DE S. mansoni NA PRESENÇA DO PARTENOLIDO

A espécie S. mansoni, faz o uso de seus tubérculos ao longo de seu tegumento

para obter nutrientes e, portanto, avaliação da integridade e da quantidade de

tubérculos é determinante para a sobrevivência do platelminto. Os vermes foram

observados em microscopia confocal de varredura a laser (Figura 40). A análise das

imagens permite concluir que o partenolido é capaz de promover alterações

tegumentares nas as concentrações 12,5 µM, 25 µM e 50 µM. Também foi observada

relação entre concentração e a alteração do tegumento dos machos de S. mansoni.

É importante ressaltar que no grupo controle negativo (RPMI 1640 com 0.5% DMSO)

os tubérculos não apresentaram qualquer anormalidade. Em contraste, no grupo

controle positivo, (PZQ 5 μM) extensivos danos tegumentares foram observados,

assim como na maior concentração de partenolido testada.

Além da visualização por microscopia, a contagem de tubérculos intactos foi

feita após 120h de incubação dos vermes ao partenolido em diferentes concentrações

(Figura 41). Na ausência de partenolido, ou seja, o controle negativo apresentou 43

tubérculos intactos. O partenolido na concentração de 12,5 µM permitiu somente 12

tubérculos sem alteração e a 25 µM, apenas três tubérculos intactos em média foram

observados. Ao realizar a contagem de tubérculos intactos na concentração de 50 µM,

nenhum foi encontrado. Isso demonstra uma excelente atividade sobre o verme, uma

49

vez que o número encontrado na presença do partenolido é estatisticamente diferente

do encontrado no controle negativo.

Figura 40. Efeito do partenolido no tegumento de machos de Schistosoma mansoni. A: morfologia geral mostrando a região dorsal de um macho de S. mansoni, com destaque, em vermelho, para o local onde é feito a análise morfológica no tegumento. B: Controle negativo. C: partenolido 12,5 µM. D: partenolido 25 µM. E: partenolido 50 µM. F: PZQ 5 µM. Barras = 200 µm (A) e 50 µm (B-F).


50

As mudanças visíveis no aspecto dos tubérculos na presença do partenolido

são similares às evidencidas em estudos com outros compostos isolados de origem

vegetal como a piplartina, (+)-limoneno epóxido, cardamonina e licoflavona B. (DE

CASTRO et al., 2015; DE MORAES, et al., 2012; ALEIXO DE CARVALHO et al.,

2015; DE MORAES et al., 2013; DE MORAES et al., 2012)

Figura 41. Efeito do partenolido nos tubérculos de machos de S. mansoni. Os valores são média de dez vermes. As barras representam o desvio padrão da média. Diferença significativa entre o controle negativo e os grupos tratados com compostos e PZQ 5 µM: *(P < 0,05), **(P < 0,01), ***(P < 0,001).

0 12.5 25 50

0

10

20

30

40

50

***

***

***

Partenolido (M)

Tu

bé

rcu

los

in

tac

tos


4.6 Avaliação da citotoxicidade

A citotoxicidade do partenolido foi avaliada em células Vero (fibroblastos de rim

de macaco) em diferentes concentrações.

Não houve citotoxicidade do partenolido em células Vero nas concentrações

avaliadas (25 µM, 50 µM, 100 µM e 200 µM), mantendo a viabilidade celular (Figura

42). Dentre as concentrações empregadas neste ensaio, encontram-se as

concentrações utilizadas no ensaio esquistossomicida. Desta forma, a lactona

demonstrou atividade frente aos vermes adultos de S. mansoni sem alterar a

viabilidade das células de mamíferos.

51

Figura 42. Viabilidade celular de células Vero em contato com partenolido em diferentes concentrações. Os resultados foram analisados pelo programa GraphPad Prism 5®, expressos como média ± desvio padrão da média.a p˂0,001

0 25 50 100 200

0

25

50

75

100

Partenolido (M)

Via

bilid

ad

e c

elu

lar

(%)


52

5. CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico das partes aéreas de T. parthenium resultou no

isolamento e identificação da lactona sesquiterpênica partenolido, além dos

flavonoides apigenina e santina.

O extrato bruto mostrou-se ativo frente aos vermes adultos de S. mansoni,

sendo capaz de matar 100% dos vermes em concentrações maiores que 50 μg/mL,

além de causar lesão extensiva do tegumento dos parasitos, em um período de 24h

de incubação.

Em relação às substâncias isoladas, o partenolido apresentou atividade a partir

de 12,5 µM, sendo significativa em concentrações maiores que 25 µM, em que foi

capaz de atingir 100% de mortalidade em 24h de incubação. É importante destacar

que esse é o primeiro relato de atividade esquistossomicida atribuída a essa

substância.

Por outro lado, apesar de haver relatos de outras atividades antiparasitárias

dos flavonoides apigenina e santina, estes não foram ativos frente aos vermes adultos

de S. mansoni.

Os resultados de atividade do extrato bruto de partes aéreas de T. parthenium

e do partenolido, mostram que essa lactona é uma substância esquistossomicida

promissora, no entanto, fazem-se necessárias investigações adicionais,

principalmente sobre seu mecanismo de ação e sobre o seu perfil de citotoxicidade

em ensaios in vivo.

Em consequência da relevância dos resultados apresentados, este trabalho foi

publicado em forma de artigo científico, cujo conteúdo encontra-se no apêndice deste

documento.

53

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