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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO PROGRAMA DE RESIDÊNCIA UNIPROFISSIONAL EM MEDICINA VETERINÁRIA LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA E DOENÇAS PARASITÁRIAS Infection by Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii in dogs in the northern region of Brazil. LEODIL DA COSTA FREITAS Cuiabá 2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

PROGRAMA DE RESIDÊNCIA UNIPROFISSIONAL EM

MEDICINA VETERINÁRIA

LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA E DOENÇAS PARASITÁRIAS

Infection by Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii in dogs in

the northern region of Brazil.

LEODIL DA COSTA FREITAS

Cuiabá

2015

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

PROGRAMA DE RESIDÊNCIA UNIPROFISSIONAL EM

MEDICINA VETERINÁRIA

LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA E DOENÇAS PARASITÁRIAS

Infection by Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii in dogs in

the northern region of Brazil.

Autor: Leodil da Costa Freitas

Orientador: Prof. Dr. Richard de Campos Pacheco

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de

Pós-graduação de Medicina Veterinária da Universidade

Federal de Mato Grosso, como requisito para obtenção do

título de Residência Uniprofissional em Medicina

Veterinária, área de concentração: Medicina Veterinária

Preventiva

Cuiabá

2015

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Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.

C837i Costa Freitas, Leodil da. Infection by sarcocystis neurona and toxoplasma gondii in dogs in the

northern region of Brazil. / Leodil da Costa Freitas. -- 2015 8 f. ; 30 cm.

Orientador: Richard de Campos Pacheco. Co-orientador: Daniel Moura de Aguiar. TCC (especialização em Medicina Veterinária) - Universidade

Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Residência Uniprofissional em Medicina Veterinária, Cuiabá, 2015.

Inclui bibliografia.

1. Sarcocystis neurona. 2. Toxoplasma gondii. 3. Ji- Paraná/Rondônia. 4. Indirect immunofluorescence assay. I. Título.

Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).

Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO

PROGRAMA DE RESIDÊNCIA UNIPROFISSIONAL EM MEDICINA

VETERINÁRIA

LABORATÓRIO DE PARASITOLOGIA E DOENÇAS PARASITÁRIAS

Infection by Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii in dogs in the

northern region of Brazil.

BANCA EXAMINADORA

Aprovado: ________ de fevereiro de 2015

__________________________________________

Prof. Dr. Richard de Campos Pacheco

Presidente da Banca - UFMT

__________________________________________

Alice Mamede Costa Marques Borges - UFMT

__________________________________________

Andréia Lima Tomé Melo - UFMT

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Pós-graduação de Medicina

Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso, como requisito para obtenção do

título de Residência Uniprofissional em Medicina Veterinária, área de concentração:

Medicina Veterinária Preventiva.

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Infection by sarcocystis neurona and toxoplasma gondii in dogs in the northern region of

Brazil.

Infecção por Sarcocystis neurona e Toxoplasma gondii em cães da região norte do Brasil.

Leodil da Costa Freitas1*; Thábata dos Anjos Pacheco

2; Andréia Lima Tomé Melo

2; Felipe

Wolf Jaune2; Ricardo Vilas Boas

2, Dirceu Guilherme de Souza Ramos

2 Daniel Moura de

Aguiar2, Richard de Campos Pacheco

2

RESUMO

Sarcocystis neurona e Toxoplasma gondii são protozoários do Filo Apicomplexa e família

Sarcocystidae. S. neurona é um protozoário coccídeo formador de cistos teciduais, agente

etiológico da Mieloencefalite Protozoária Equina, uma severa síndrome neurológica que

acomete eqüinos e causa grande impacto econômico nas Américas. Toxoplasmose é uma

zoonose cosmopolita e os cães são considerados sentinelas para este parasita por causa de seu

contato próximo dos seres humanos e gatos. Objetivou-se avaliar a ocorrência de anticorpos

anti-S. neurona e anti-T. gondii em cães de propriedades rurais do município de Ji-

Paraná/Rondônia. Foram analisadas 181 amostras de soro sanguíneo por meio da reação de

imunofluorescência indireta (RIFI). Das amostras testadas, observou-se ocorrência de 57

(31,49%) positivas para T. gondii e 20 (11,04%) para S. neurona, caracterizando a ampla

distribuição dos agentes na região estudada.

Palavras Chaves: Sarcocystis neurona; Toxoplasma gondii; Ji-Paraná/Rondônia;

Imunofluorescência Indireta

ABSTRACT

Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii are protozoa phylum Apicomplexa and

Sarcocystidae family. S. neurona is a coccidium forming tissue cysts, which causes of Equine

1 Discente, Residência Uniprofissional em Medicina Veterinária, UNIPRUV, Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT,

Cuiabá, Mato Grosso. 2 Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, PPGVET, Universidade Federal de Mato Grosso, UFMT, Cuiabá,

Mato Grosso.

* Autor para correspondência. [email protected]

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protozoal myeloencephalitis, a severe neurological syndrome that affects horses and great

economic impact in the Americas. Toxoplasmosis is a cosmopolitan zoonosis and dogs are

sentinels for this parasite because of their close contact with humans and cats. Aimed to

evaluate the occurrence of anti-S. neurona antibodies and anti-T. gondii in dogs from family

farming properties in the city of Ji-Paraná / Rondônia. We analyzed 181 samples of blood

serum by indirect immunofluorescence assay (IFA). Of the samples tested, there was

occurrence of 57 (31.49%) positive for T. gondii and 20 (11.04%) for S. neurona, featuring

the wide distribution of agents in the region studied.

Key Words: Sarcocystis neurona; Toxoplasma gondii; Ji-Paraná/Rondônia; Indirect

immunofluorescence assay.

Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii are related apicomplexans that can cause

systemic illness in many species of animals, including dogs (DUBEY et al., 2006). Equine

protozoal myeloencephalitis (EPM) due to the protozoan parasite, S. neurona continues to be

a serious neurological disease of horses in the Americas. (DUBEY et al., 2015). Toxoplasma

gondii is a widespread zoonotic protozoan that infects most, if not all, species of birds and

mammals, including dogs (DUBEY, 2010). Infection with T. gondii in dogs is also of

epidemiological importance. The prevalence of T. gondii infection in dogs may reflect the

magnitude of parasite contamination in their environment. For this reason, dogs have been

used as sentinel animal for T. gondii infection because of their close contact with people

(SALB et al., 2008). The present study aimed to carry out a serological study on S. neurona

and T. gondii infection among dogs of dairy cattle in rural areas in the municipality of Ji-

Paraná, Rondônia, in the western Brazilian Amazon region.

This study sampled dogs living in farms (i.e., population of dairy cows on family

farms). Dogs were sampled primarily for another project on the epidemiology of neosporosis

(VILAS BOAS et al., 2015) etween September 2012 and November 2013. Blood was

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collected from all the dogs (n=181) present on 61 of the 63 farms. The responsible for each

farm answered a questionnaire addressing epidemiological factors relating to handling of

animals (dairy cows and dogs) in each farm.

The immunofluorescent antibody test (IFAT) was performed to detect serum

antibodies (IgG) against S. neurona and T. gondii, using the following antigens: T. gondii RH

strain tachyzoites, as described by CAMARGO (1964) and S. neurona SN37R strain

(SOFALY et al., 2002), as described by DUARTE et al. (2003). The cut-offs adopted were

dilutions of 1:16 for T. gondii and 1:25 for S. neurona, respectively (RIVETTI el al., 2008;

ANDRÉ et al., 2010). Positive and negative control samples were included on each slide, and

a goat anti-cat immunoglobulin G (anti-IgG) labeled with fluorescein isothiocyanate was used

as conjugate. The slides were examined using an epifluorescence microscope. The samples

considered positive were subjected to a two-fold serial dilution to obtain the final titer.

Statistical analyses were performed using the statistical software EPIINFO 7.0. The

associations between dogs positive (S. neurona and/or T. gondii) and the variables were

analyzed by means of the chi-square (2) and Fisher exact tests, with significance of 5%. The

covariate variables analyzed were: presence of dogs; dogs positive for S. neurona and T.

gondii on farm; occurrence of abortion; wild canids nearby; dogs with access to cattle food;

dogs with access to water for cattle; presence of felids; presence of equidae; dogs with access

to remains of dead cattle carcasses; dogs fed with heat-treated food or foodstuffs scrapped

(with uncooked or undercooked meat); cattle grazing with dogs present; destination of the

dead animals; destination of fetuses, when observed; dogs that get stuck or loose; farming

system (extensive or intensive); has recently acquired dog; farrowing of dogs on the property;

age and sex of dogs. Statistical analyses were performed comparing these covariates and

farms with presence of seropositive dogs for S. neurona and T. gondii using the methodology

of generalized linear models (GLM).

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The Bioethical Committee for Animal Research of the Federal University of Mato

Grosso approved the present study, under protocol no. 23108.015662/12-5.

Antibodies to S. neurona (titers ≥ 25) were found 11.04% (20/181), with titers ranging

from 25 to 800, while antibodies to S T. gondii (titers ≥ 16) were found 31.49% (57/181), with

titers ranging from 16 to 2,048 (Table 1).

Table 1. Titers frequencies of antibodies against Toxoplasma gondii and Sarcocystis neurona

in dogs by means of the indirect immunofluorescent assay (IFA) of the 63 farms in the

municipality of Ji-Paraná, Rondônia, collected from September 2012 to November 2013.

Sarcocystis neurona Toxoplasma gondii

Titer Positive sample (%) Titer Positive sample (%)

25 1 (5) 16 2 (3,508)

50 2 (10) 32 8 (14,035)

100 5 (25) 64 14 (24,561)

200 6 (30) 128 17 (29,824)

400 5 (25) 256 6 (10,526)

800 1 (5) 512 5 (8,771)

1600 0 (0) 1024 2 (3,508)

3200 0 (0) 2048 3 (5,263)

Total 20 (100) Total 57 (100)

Univariate correlations between examined variables and the presence of seropositive

dogs showed that the kind of food provided to dogs is associated with occurrences of S.

neurona antibodies in the farms studied (p=0,021).

Statistical analysis using the chi-square test for linear tendency was significantly

associated to T. gondii among seropositive dogs and the variable dog age resulting in χ2 =

5.990 and p = 0.014. The odds ratio analysis (OR) obtained, considering the results by age

group, was 0-12 months OR = 1.000; 12-24 months OR = 0.96; 24-36 months OR = 1.56; 36-

48 months OR = 3.44 and above 48 months OR = 2,342. The GLM analyses showed that in

farms with positive dogs to S. neurona and T. gondii was associated with kind of food

provided to dogs (heat-treated food or foodstuffs scrapped with uncooked or undercooked

meat; F-test <0,001) and with dogs that have access to bovine carcass (F-test=0,003),

respectively.

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Serological surveys indicate that T. gondii are prevalent worldwide. Approximately

30% of cats and dogs in the United States have T. gondii antibodies (DUBEY et al., 2009).

The occurrence of seropositive dogs (57%) in the study showed wide incidence of the

infectious agent in the rural area of municipality and the human exposure to the disease,

because dogs may reflect the magnitude of parasite contamination in their environment

(SALB et al., 2008).

Anti-T. gondii antibodies and dog age revealed statistically difference by the qui-

square test, with a significant increase in the number of positive animals with age. Group

of dogs at 36 to 48 months age had 3.44 times more the chance to be exposed to T. gondii

infection. The magnitude of titer is not associated with clinical signs, and this occurs because

seroprevalence increases with age due to chance of agent exposure during the lifetime rather

than disease susceptibility (DUBEY et al., 2009).

Dogs that have access to bovine carcass show significant (F-test=0,003) differences of

infection by T. gondii, indicating the possible participation of cattle in the transmission of the

parasite. Among livestock, infection by T. gondii bovines seem to be more resistant to

infection than other animals (DUBEY, 1994), however parasites may remain viable in their

tissues until slaughtering age (DUBEY, 1983), possibly serving as a source of infection.

Despite S. neurona is related apicomplexan that can cause systemic illness in dogs

(DUBEY et al., 2006). Antibodies to S. neurona detected (11.04%) suggest the exposure of

farm dogs and, possibly, other animals, as well as environmental contamination with the

parasite. Therefore, EPM due to the protozoan parasite, S. neurona should be considered in

case of neurological disease of horses in the study area, since in all farms (n=20) with positive

dogs had the presence of equine.

Dogs fed with foodstuffs scrapped showed significant differences of infection by S.

neurona. Sarcocystis species transmission should be relation with ingestion of undercooked

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meat, since during their life cycle they requires both an intermediated and a final host, usually

an herbivorous and carnivorous vertebrate animal, respectively (DUBEY et al., 2015).

However, a problem to investigated Sarcocystis species is immunologic cross-reactivity

amongst these parasites (O’DONOGHUE 1990; HAMIR et al., 1993). So, should be

considered an occurrence of infection in farm dogs for others species than S. neurona.

Acknowledgements

To the Technical Assistance and Rural Extension Association of the State of Rondônia. And

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for the scholarships

of A.L.T. Melo, T.A. Pacheco, Ramos, D.G.S., D.M. Aguiar, and R.C. Pacheco.

References

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PAMPHLETT, R.; O’DONOGHUE, P. Sarcocystis infection of human muscle. Australian &

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RIVETTI A.V.Jr. et al. Avaliação sorológica para Toxoplasma gondii pela

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SALB, A.L. et al. Dogs as Sources and Sentinels of Parasites in Humans and Wildlife,

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Normas da Revista Ciência Rural

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idioma Português ou Inglês. Todas as linhas deverão ser numeradas e paginadas no lado inferior

direito. O trabalho deverá ser digitado em tamanho A4 210 x 297mm com, no máximo, 25 linhas

por página em espaço duplo, com margens superior, inferior, esquerda e direita em 2,5cm, fonte

Times New Roman e tamanho 12. O máximo de páginas será 15 para artigo científico, 20 para

revisão bibliográfica e 8 para nota, incluindo tabelas, gráficos e figuras. Figuras, gráficos e

tabelas devem ser disponibilizados ao final do texto e individualmente por página, sendo que não

poderão ultrapassar as margens e nem estar com apresentação paisagem.

3. O artigo científico (Modelo .doc, .pdf) deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português

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Material e Métodos; Resultados e Discussão; Conclusão e Referências; Agradecimento(s) e

Apresentação; Fontes de Aquisição; Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança devem

aparecer antes das referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais obrigatoriamente

devem apresentar parecer de aprovação de um comitê de ética institucional já na submissão.

Alternativamente pode ser enviado um dos modelos ao lado (Declaração Modelo Humano,

Declaração Modelo Animal).

4. A revisão bibliográfica (Modelo .doc, .pdf) deverá conter os seguintes tópicos: Título

(Português e Inglês); Resumo; Palavras‐chave; Abstract; Key words; Introdução;

Desenvolvimento; Conclusão; e Referências. Agradecimento(s) e Apresentação; Fontes de

Aquisição e Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança devem aparecer antes das

referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais obrigatoriamente devem apresentar

parecer de aprovação de um comitê de ética institucional já na submissão. Alternativamente

pode ser enviado um dos modelos ao lado (Declaração Modelo Humano, Declaração Modelo

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Biossegurança devem aparecer antes das referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e

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a) Qual o problema científico estudado neste manuscrito?

b) Qual a abordagem empregada para resolver o problema estudado?

c) Quais os principais resultados/conclusões do estudo que possam encorajar ao editor enviar o

manuscrito para revisores?

d) Qual é a contribuição à ciência que justifica a publicação do manuscrito como artigo na Ciência

Rural?

Para maiores informações acesse o seguinte tutorial.

7. Não serão fornecidas separatas. Os artigos encontram‐se disponíveis no formato pdf no endereço

eletrônico da revista www.scielo.br/cr.

8. Descrever o título em português e inglês (caso o artigo seja em português) ‐ inglês e

português (caso o artigo seja em inglês). Somente a primeira letra do título do artigo deve ser

maiúscula exceto no caso de nomes próprios. Evitar abreviaturas e nomes científicos no título. O

nome científico só deve ser empregado quando estritamente necessário. Esses devem aparecer

nas palavras‐chave, resumo e demais seções quando necessários.

9. As citações dos autores, no texto, deverão ser feitas com letras maiúsculas seguidas do

ano de publicação, conforme exemplos: Esses resultados estão de acordo com os reportados

por MILLER & KIPLINGER (1966) e LEE et al. (1996), como uma má formação congênita

(MOULTON, 1978).

10. As Referências deverão ser efetuadas no estilo ABNT (NBR 6023/2000) conforme normas

próprias da revista.

10.1. Citação de livro:

JENNINGS, P.B. The practice of large animal surgery. Philadelphia : Saunders, 1985. 2v.

TOKARNIA, C.H. et al. (Mais de dois autores) Plantas tóxicas da Amazônia a bovinos e outros

herbívoros. Manaus : INPA, 1979. 95p.

10.2. Capítulo de livro com autoria:

GORBAMAN, A. A comparative pathology of thyroid. In: HAZARD, J.B.; SMITH, D.E. The thyroid.

Baltimore : Williams & Wilkins, 1964. Cap.2,

p.32‐48.

10.3. Capítulo de livro sem autoria:

COCHRAN, W.C. The estimation of sample size. In: . Sampling techniques. 3.ed. New York

: John Willey, 1977. Cap.4, p.72‐90.

TURNER, A.S.; McILWRAITH, C.W. Fluidoterapia. In: . Técnicas cirúrgicas em animais de

grande porte. São Paulo : Roca, 1985. p.29‐40

10.4. Artigo completo:

O autor deverá acrescentar a url para o artigo referenciado e o número de identificação DOI (Digital

Object Identifiers), conforme exemplos

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abaixo:

MEWIS, I.; ULRICHS, CH. Action of amorphous diatomaceous earth against different stages of

the stored product pests Tribolium confusum (Coleoptera: Tenebrionidae), Tenebrio molitor

(Coleoptera: Tenebrionidae), Sitophilus granarius (Coleoptera: Curculionidae) and Plodia

interpunctella (Lepidoptera: Pyralidae). Journal of Stored Product Research, Amsterdam

(Cidade opcional), v.37, p.153‐164, 2001. Disponível em:

<http://dx.doi.org/10.1016/S0022‐474X(00)00016‐3>. Acesso em: 20 nov. 2008. doi:

10.1016/S0022‐474X(00)00016‐3.

PINTO JUNIOR, A.R. et al (Mais de 2 autores). Resposta de Sitophilus oryzae (L.),

Cryptolestes ferrugineus (Stephens) e Oryzaephilus surinamensis (L.) a diferentes

concentrações de terra de diatomácea em trigo armazenado a granel. Ciência Rural , Santa

Maria (Cidade opcional), v. 38, n. 8, p.2103‐2108, nov. 2008 . Disponível em:

<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103‐

84782008000800002&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 25 nov. 2008. doi:

10.1590/S0103‐84782008000800002.

10.5. Resumos:

RIZZARDI, M.A.; MILGIORANÇA, M.E. Avaliação de cultivares do ensaio nacional de girassol,

Passo Fundo, RS, 1991/92. In: JORNADA DE

PESQUISA DA UFSM, 1., 1992, Santa Maria, RS. Anais... Santa Maria : Pró‐reitoria de

Pós‐graduação e Pesquisa, 1992. V.1. 420p. p.236.

10.6. Tese, dissertação:

COSTA, J.M.B. Estudo comparativo de algumas caracterísitcas digestivas entre bovinos (Charolês) e

bubalinos (Jafarabad). 1986. 132f.

Monografia/Dissertação/Tese (Especialização/ Mestrado/Doutorado em Zootecnia) ‐ Curso de

Pós‐graduação em Zootecnia, Universidade

Federal de Santa Maria.

10.7. Boletim:

ROGIK, F.A. Indústria da lactose. São Paulo : Departamento de Produção Animal, 1942. 20p.

(Boletim Técnico, 20).

10.8. Informação verbal:

Identificada no próprio texto logo após a informação, através da expressão entre parênteses. Exemplo:

... são achados descritos por Vieira

(1991 ‐ Informe verbal). Ao final do texto, antes das Referências Bibliográficas, citar o endereço

completo do autor (incluir E‐mail), e/ou local,

evento, data e tipo de apresentação na qual foi emitida a informação.

10.9. Documentos eletrônicos:

MATERA, J.M. Afecções cirúrgicas da coluna vertebral: análise sobre as possibilidades do

tratamento cirúrgico. São Paulo : Departamento de

Cirurgia, FMVZ‐USP, 1997. 1 CD.

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Disponível em: http://www. Medscape.com/server‐java/MedlineSearchForm

MARCHIONATTI, A.; PIPPI, N.L. Análise comparativa entre duas técnicas de recuperação de

úlcera de córnea não infectada em nível de estroma médio. In: SEMINARIO

LATINOAMERICANO DE CIRURGIA VETERINÁRIA, 3., 1997, Corrientes, Argentina.

Anais... Corrientes : Facultad de Ciencias Veterinarias ‐ UNNE, 1997. Disquete. 1 disquete de

31/2. Para uso em PC.

11. Desenhos, gráficos e fotografias serão denominados figuras e terão o número de ordem em

algarismos arábicos. A revista não usa a denominação quadro. As figuras devem ser

disponibilizadas individualmente por página. Os desenhos figuras e gráficos (com largura de no

máximo 16cm) devem ser feitos em editor gráfico sempre em qualidade máxima com pelo menos

300 dpi em extensão .tiff. As tabelas devem conter a palavra tabela, seguida do número de ordem

em algarismo arábico e não devem exceder uma lauda.

12. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos serão de inteira responsabilidade do(s) autor(es).

14. Será obrigatório o cadastro de todos autores nos metadados de submissão. O artigo não

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Editorial.

19. Todos os artigos encaminhados devem pagar a taxa de tramitação. Artigos reencaminhados (com

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Ciência Rural

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Manuscrito ID:

CR­2015­0582

Título: Ocorrência de Sarcocystis neurona e toxoplasma gondii em cães da região norte do Brasil.

Autores:

FREITAS, LEODIL Pacheco, Thabata Melo, Andréia Jaune, Felipe Vilas Boas, Ricardo Ramos, Dirceu Moura de Aguiar, Daniel Pacheco, Richard

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eview

Ciência Rural

Occurrence of sarcocystis neurona and toxoplasma gondii in dogs in the northern region of Brazil.

Journal: Ciência Rural

Manuscript ID: CR-2015-0582

Manuscript Type: Note

Keyword:

Sarcocystis neurona, Toxoplasma gondii, Ji-Paraná/Rondônia, Indirect immunofluorescence assay

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Occurrence of anti-Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii antibodies in dogs in the

northern region of Brazil.

Ocorrencia de aticorpos anti Sarcocystis neurona e Toxoplasma gondii em cães na região

norte do Brasil.

- NOTE –

ABSTRACT

This study aimed to evaluate the occurrence of anti-S. neurona and T. gondii antibodies in

dogs from family farming properties in the city of Ji-Paraná/Rondônia. We analyzed 181

samples of blood serum by means indirect fluorescent antibody test (IFAT). We observed the

occurrence of 57 (31.49%) and 20 (11.04%) positive serum samples for T. gondii for S.

neurona, respectively, featuring the wide distribution of agents in the region studied. The

kind of food provided to dogs was associated with occurrences of S. neurona antibodies.

While, dog age and access to bovine carcass were the variables that showed as risk factors for

the presence of T. gondii.

Key Words: Antibodies; Sarcocystis neurona; Toxoplasma gondii; Ji-Paraná/Rondônia;

Indirect immunofluorescence assay.

RESUMO

Neste estudo objetivou-se avaliar a ocorrência de anticorpos anti-S. neurona e T. gondii em

cães de propriedades de agricultura familiar do município de Ji-Paraná/Rondônia. Foram

analisadas 181 amostras de soro sanguíneo por meio da reação de imunofluorescência indireta

(RIFI). Observou-se ocorrência de 57 (31,49%) e 20 (11,04%) amostras de soro positivas para

T. gondii e S. neurona, respectivamente, caracterizando a ampla distribuição dos agentes na

região estudada. O tipo de alimento fornecido aos cães foi associada com a ocorrência de

anticorpos para S. neurona. Enquanto, a idade do cão e o acesso à carcaça de bovinos foram

as variáveis que se mostraram como fatores de risco para a presença de T. gondii.

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Palavras Chaves: Anticorpos; Sarcocystis neurona; Toxoplasma gondii; Ji-

Paraná/Rondônia; Imunofluorescência Indireta

Sarcocystis neurona and Toxoplasma gondii are related apicomplexans that can cause

systemic illness in many species of animals, including dogs (DUBEY et al., 2006). Equine

protozoal myeloencephalitis (EPM), due to the protozoan parasite S. neurona, continues to be

a serious neurological disease of horses in the Americas (DUBEY et al., 2015). Toxoplasma

gondii is a widespread zoonotic protozoan that infects most, if not all, species of birds and

mammals, including dogs (DUBEY, 2010). Dogs have been used as sentinel animal for T.

gondii infection because of their close contact with people and cats (SALB et al., 2008). The

present study aimed to carry out a serological-epidemiological study on S. neurona and T.

gondii infection among dogs of dairy cattle and evaluate risk factors for this infection in rural

areas in the municipality of Ji-Paraná, Rondônia, in the western Brazilian Amazon region.

This study sampled dogs living in farms (i.e., population of dairy cows on family

farms). Dogs were sampled primarily for another project on the epidemiology of neosporosis

(VILAS BOAS et al., 2015) between September 2012 and November 2013. Blood was

collected from all the dogs (n=181) present on 61 of the 63 farms. The responsible for each

farm answered a questionnaire addressing epidemiological factors relating to handling of

animals in each farm.

The levels of S. neurona and T. gondii antibodies were measured by means of the

indirect fluorescent antibody test (IFAT) using the following antigens: T. gondii RH strain

tachyzoites, as described by CAMARGO (1964) and S. neurona SN37R strain (SOFALY et

al., 2002), as described by DUARTE et al. (2003). The cut-offs adopted were dilutions of 1:16

for T. gondii and 1:25 for S. neurona, respectively (RIVETTI el al., 2008; ANDRÉ et al.,

2010). Positive and negative control samples were included on each slide, and a goat anti-cat

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immunoglobulin G (anti-IgG) labeled with fluorescein isothiocyanate was used as conjugate.

Samples considered positive were subjected to a two-fold serial dilution to obtain the final

titer.

Statistical analyses were performed using the statistical software EPIINFO 7.0. The

associations between dogs positive (S. neurona and/or T. gondii) and the variables were

analyzed by means of the chi-square (χ2) and Fisher exact tests, with significance of 5%. The

covariate variables analyzed were: presence of dogs; dogs positive for S. neurona and/or T.

gondii on farm; occurrence of abortion; wild canids nearby; dogs with access to cattle food;

dogs with access to water for cattle; presence of felids; presence of equidae; dogs with access

to remains of dead cattle carcasses; dogs fed with heat-treated food or foodstuffs scrapped

(with uncooked or undercooked meat); cattle grazing with dogs present; destination of the

dead animals; destination of fetuses, when observed; dogs that get stuck or loose; farming

system (extensive or intensive); has recently acquired dog; farrowing of dogs on the property;

age and sex of dogs. Statistical analyses were performed comparing these covariates and

farms with presence of seropositive dogs for S. neurona and T. gondii using the methodology

of generalized linear models (GLM).

Antibodies to S. neurona (titers ≥ 25) were found 11.04% (20/181), with titers ranging

from 25 to 800, while antibodies to T. gondii (titers ≥ 16) were found 31.49% (57/181), with

titers ranging from 16 to 2,048 (Table 1).

Univariate correlations between examined variables and the presence of seropositive

dogs showed that the kind of food provided to dogs is associated with occurrences of S.

neurona antibodies in the farms studied (p=0,021).

Statistical analysis using the chi-square test for linear tendency was significantly

associated to T. gondii among seropositive dogs and the variable dog age resulting in χ2 =

5.990 and p = 0.014. The odds ratio analysis (OR) obtained, considering the results by age

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group, was 0-12 months OR = 1.000; 12-24 months OR = 0.96; 24-36 months OR = 1.56; 36-

48 months OR = 3.44 and above 48 months OR = 2,342. The GLM analyses showed that

farms with positive dogs to S. neurona and T. gondii were associated with kind of food

provided to dogs (heat-treated food or foodstuffs scrapped with uncooked or undercooked

meat; F-test <0,001) and with dogs that have had access to bovine carcass (F-test=0,003),

respectively.

Serological surveys indicate that T. gondii are prevalent worldwide. Approximately

30% of cats and dogs in the United States have T. gondii antibodies (DUBEY et al., 2009).

The occurrence of seropositive dogs (57%) in the study showed wide e high incidence of the

infectious agent in the rural area of municipality, possibly with the human and livestock

exposure to the disease. High seroprevalence in dogs may reflect the magnitude of parasite

contamination in their environment (SALB et al., 2008). Anti-T. gondii antibodies and dog

age revealed statistically difference by the qui-square test, with a significant increase in the

number of positive animals with age. Group of dogs at 36 to 48 months age had 3.44 times

more the chance to be exposed to T. gondii infection. The magnitude of titer is not associated

with clinical signs, and this occurs because seroprevalence increases with age due to chance

of agent exposure during the lifetime rather than disease susceptibility (DUBEY et al., 2009).

Dogs that have had access to bovine carcass showed significant (F-test=0,003)

differences of infection by T. gondii, suggesting the possible participation of cattle in the

transmission of the parasite. Among livestock, bovines seem to be more resistant to infection

by T. gondii than other animals; however, cysts of T. gondii may remain viable in their

tissues until slaughtering age and, possibly serving as a source of infection (DUBEY, 2010).

Despite S. neurona is an apicomplexan that can cause systemic illness in dogs

(DUBEY et al., 2006) there is no serological survey in dogs in Brazil. Antibodies to S.

neurona detected (11.04%), for the first time, suggest the exposure of farm dogs and,

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possibly, other animals, as well as environmental contamination with the parasite. Therefore,

EPM due to the protozoan parasite, S. neurona should be considered in case of neurological

disease of horses in the study area, since in all farms (n=20) with positive dogs had the

presence of equine.

Dogs fed with foodstuffs scrapped showed significant differences of infection by S.

neurona. Sarcocystis species are intracellular protozoan parasites with a requisite two-host

life cycle based on a prey-predator (intermediate-definitive), therefore the transmission of

Sarcocystis species could be related with ingestion of undercooked meat. Despite antibody

titers to the parasite (up to 800) were found in dogs, which is suggestive of true exposure to S.

neurona (MENESES et al., 2014), a problem to research Sarcocystis species is immunologic

cross-reactivity amongst these parasites (HAMIR et al., 1993). So, should be considered an

occurrence of infection in farm dogs for others species than S. neurona.

This study observed the infection and distribution of T. gondii and S. neurona in farm

dogs in the municipality of Ji-Paraná, Rondônia. In addition, kind of food provided to dogs is

associated with occurrences of S. neurona, while dogs with access to bovine carcass and

older are associate with the occurrence of T. gondii.

ACKNOWLEDGEMENTS

ETHICS COMMITTEE AND BIOSAFETY

The Bioethical Committee for Animal Research of the Federal University of XXX

approved the present study, under protocol no. 23108.015662/12-5.

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8 19 20 21 9 22 23 10 24 25 11 26 27 12 28 29 30 13 31 32 14 33 34 15 35 36 16 37 38

17 39 40 41 18 42 43 19 44 45 20 46 47 21 48 49 50 22 51 52 23

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10 Toxoplasma gondii Sarcocystis neurona

11 12 Titer Positive sample (%) Titer Positive sample (%)

13 14 16 2 (3,51) 25 1 (5) 15 16 17

32 8 (14,03) 50 2 (10)

18 19

64

14 (24,56)

100

5 (25)

20 21

128

17 (29,82)

200

6 (30)

23

256

6 (10,53)

400

5 (25) 24 25 512 5 (8,77) 800 1 (5) 26 27 28

1024 2 (3,51)

29 30

2048

3 (5,27)

31 32

Total

57 (100)

Total

20 (100) 33 34 4 35 36 37 5

1 2 3 1 Table 1. Titers frequencies of antibodies against Toxoplasma gondii and Sarcocystis neurona 4 5 2 in dogs by means of the indirect fluorescent antibody test (IFAT) of the

63 farms in the 6 7 3 municipality of Ji-Paraná, Rondônia, collected from September 2012 to

November 2013. 8 9

22

38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52