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Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Heloísa Cristina França Cavallieri
ESTUDO DA BIODEGRADAÇÃO DE ÉTER-AMINAS
UTILIZADAS NA FLOTAÇÃO DO MINÉRIO DE FERRO
Dissertação apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Engenharia Ambiental da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para a obtenção do título de
Mestre, em Engenharia Ambiental, área de
concentração: Tecnologias Ambientais.
Orientador: Prof. Dr. Cornélio de Freitas Carvalho
Co-orientador: Profª. Drª. Silvana de Queiroz Silva
Ouro Preto, MG
2011
ii
Universidade Federal de Ouro Preto Programa de Pós-Graduação Engenharia Ambiental
Mestrado em Engenharia Ambiental
Heloísa Cristina França Cavallieri
ESTUDO DA BIODEGRADAÇÃO DE ÉTER-AMINAS
UTILIZADAS NA FLOTAÇÃO DO MINÉRIO DE FERRO
Dissertação de mestrado submetida à banca examinadora designada pelo Colegiado do
mestrado em Engenharia Ambiental, como parte integrante dos requisitos necessários para a
obtenção do grau em Mestre em Engenharia Ambiental.
Ouro Preto, 02 de março de 2011.
Banca examinadora:
Prof. Dr. Cornélio de Freitas Carvalho UFOP
Profª. Drª. Silvana de Queiroz Silva UFSJ
Prof. Dr. Luiz Henrique Rosa UFMG
Profª. Drª. Mônica Cristina Teixeira UFOP
iii
iv
v
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar. É melhor tentar, ainda que em
vão, que sentar-se, fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias frios
em casa me esconder. Prefiro ser feliz embora louco, que em conformidade viver.”
Martin Luther King
vi
À minha mãe, Marlene, pelo amor, apoio e incentivo
aos meus irmãos, Hugo e Salete, por, mesmo que à
distância, sempre acreditarem em mim.
vii
Dedico este trabalho aos professores Cornélio
Carvalho e Silvana Queiroz, meus orientadores, pela
paciência e competência. Pessoas incríveis, pelas
quais tenho muita admiração e alegria de ter tido a
oportunidade de conhecer e conviver.
viii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois me reservou uma família, amigos e oportunidades maravilhosas.
Ao Fabiano, pelo amor e compreensão em todos os momentos e por me fazer feliz.
A toda minha família, pelo interesse e incentivo durante todo o curso.
Aos professores do curso por todo o conhecimento compartilhado e amizade e aos colegas
do mestrado pelo companheirismo durante as disciplinas cursadas.
A Ludmila von Randow e Luiz Henrique por toda ajuda e incentivo inicial. Vocês foram
fundamentais para que tudo se tornasse realidade.
Aos parceiros de iniciação científica, Marcos, Kênia, Luiza e Wellington, pela boa
vontade, dedicação ao trabalho, pela perseverança diante dos desafios e pela amizade.
As amigas do Laboratório de Microbiologia, Débora e Keici, pelo companheirismo,
amizade, carinho e ajuda incondicional.
A todos os colegas do Laboratório de Resíduos e Efluentes, em especial, a Cris, pela
agradável convivência, auxílio e amizade.
Aos técnicos dos laboratórios, em especial à Marly, pelo apoio e amizade, e por tornar os
dias de trabalho mas descontraídos.
Ao Prof. Lydston, uma pessoa especial que esteve presente na hora de grandes desafios.
Sua participação foi muito importante para a conclusão deste trabalho.
Ao Prof. Luiz Henrique Rosa pela ajuda incondicional nos momentos mais difíceis.
A Prof. Eneida Eskinazi e Milene Mendes pela atenção e ajuda. Obrigada pela fotos.
A Prof. Maria Célia Lanna, pela disponibilização do Laboratório de
Microbiologia/DECBI/UFOP.
ix
A SAMARCO, especialmente ao Batisteli, pela confiança e atenção.
A Isabela França pela ajuda na hora certa.
Ao CETESC pela oportunidade e incentivo.
A CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
A todos que contribuíram de alguma maneira para a realização desse trabalho. Obrigada!
x
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................ xii
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................xv
LISTA DE NOTAÇÕES .......................................................................................................... xvii
RESUMO .................................................................................................................................. xix
ABSTRACT .............................................................................................................................. xxi
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO ................................................................................................. 1
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS ...................................................................................................... 4
2.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................................... 4
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................................... 4
CAPÍTULO 3 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................... 5
3.1. ASPECTOS GERAIS DA MINERAÇÃO .................................................................................. 5
3.2. BENEFICIAMENTO DO MINÉRIO DE FERRO ................................................................... 5
3.3. O PROCESSO DE FLOTAÇÃO ............................................................................................... 6
3.3.1. Reagentes utilizados na flotação de minério de ferro ..................................................... 10
3.3.1.1. Amido ................................................................................................................. 11
3.3.1.2. Amina ................................................................................................................. 12
3.3.2. Resíduos e efluentes gerados no processo de flotação de minério de ferro .................... 18
3.4. UTILIZAÇÃO E REAPROVEITAMENTO DAS AMINAS ................................................... 19
3.5. BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS ................................................................. 24
3.5.1. Modelos cinéticos de biodegradação de compostos orgânicos ........................................ 28
3.5.2. Microrganismos degradadores de aminas...........................................................................40
3.5.3. Metabolismo e bioquímica de degradação ...................................................................... 46
3.6. RISCOS AMBIENTAIS ASSOCIADOS ÀS AMINAS.................................................................53
CAPÍTULO 4 – MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................56
4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................................... 56
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS .......................................................................... 56
4.3. QUANTIFICAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS ............................................................................. 56
4.3.1. Método Verde de Bromocresol (ARAÚJO et al., 2009) ................................................... 56
4.3.2. Método do Orange II ...................................................................................................... 58
4.3.2.1. Validação do método químico do Orange II (INMETRO, 2003) ........................... 59
4.4. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS PELA SERRATIA
MARCESCENS..............................................................................................................................................61
4.5. COLETA DAS AMOSTRAS ..................................................................................................... 62
4.6. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS ISOLADAS
.......................................................................................................................................................... 64
4.6.1. Condições de isolamento e caracterização dos isolados .................................................. 64
xi
4.6.2. Identificação dos isolados................................................................................................ 65
4.6.2.1. Extração de DNA ................................................................................................ 65
4.6.2.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) .............................................................. 66
4.7. ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA PELA TÉCNICA DE PCR-DGGE ............... 67
4.8. TESTE DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS PELAS BACTÉRIAS
ISOLADAS ....................................................................................................................................... 68
4.9. CINÉTICA DE BIODEDEGRADAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS PELAS LINHAGENS
ISOLADAS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES E TEMPERATURAS ................................ 69
CAPÍTULO 5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................71
5.1. QUANTIFICAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS ............................................................................. 71
5.1.1. Método do Verde de Bromocresol .................................................................................. 71
5.1.2. Método do Orange II ...................................................................................................... 73
5.1.2.1. Faixa de Trabalho e Faixa Linear de Trabalho ...................................................... 73
5.1.2.2. Limite de Detecção................................................................................................. ...77
5.2. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS PELA BACTÉRIA Serratia
marcescens ....................................................................................................................................... 81
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................................................... 87
5.4. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS
PRESENTES NAS AMOSTRAS BRUTAS .................................................................................... 90
5.5. COMPARAÇÃO DA DIVERSIDADE BACTERIANA NAS AMOSTRAS DE REJEITO
COMPOSTO E DA BARRAGEM DE REJEITOS PELA TÉCNICA PCR-DGGE ................... 106
5.6. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS PELAS BACTÉRIAS
ISOLADAS .................................................................................................................................... 111
5.7. CINÉTICA DE BIODEGRADAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS PELAS LINHAGENS
ISOLADAS EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES E TEMPERATURAS..............................121
5.7.1. Aspectos Gerais....................................................................................................................121
5.7.2. Determinação do modelo cinético ................................................................................. 123
CAPÍTULO 6 - CONCLUSÕES .............................................................................................. 131
CAPÍTULO 7 - SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................... 132
CAPÍTULO 8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 133
CAPÍTULO 9 – ANEXOS ........................................................................................................ 147
ANEXO I - COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS MEIOS DE CULTURA ......................................... 147
ANEXO II - PROTOCOLO DE PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES............................................. 149
ANEXO III - BIODEGRADAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS ............................................................ 152
ANEXO IV - CURVAS TEÓRICAS............................................................................................... 157
ANEXO V - SOLUÇÕES PARA DGGE......................................................................................... 178
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1. Fórmula estrutural simplificada de uma amina graxa primária..........................13
Figura 3.2. Rota de produção de éter-monoamina e éter-diamina (NEDER, 2005)...........15
Figura 3.3. Espectro de massas com ionização por eletrospray da EDA 3B em modo
positivo (ARAÚJO et al., 2008)...........................................................................................17
Figura 3.4. Espectro de massas com ionização por eletrospray da F 2835 em modo positivo
(ARAÚJO et al., 2008).........................................................................................................17
Figura 3.5. Percentual de desembolso por insumo de uma grande mineradora de MG
(BATISTELI, 2007)..............................................................................................................20
Figura 3.6. Crescimento de P. aeruginosa, analisado pela densidade óptica, em relação ao
tempo, em diferentes concentrações iniciais de endosulfan (HUSSAIN et al., 2009)..........38
Figura 3.7. Proposta de degradação de sais de amônio por amostra de lodo ativado
(NISHIYAMA et al., 1995)..................................................................................................47
Figura 3.8. Esquema proposto para o metabolismo da metilamina, dimetilamina e
trimetilamina por Hyphomicrobium X (MEIBERG e HARDER, 1978)..............................49
Figura 3.9. A. Cultura mista de B. cepacia e S. maltophila crescendo em meio com
dodecildimetilamina como única fonte de carbono e energia em relação de comensalismo.
B. Relação de mutualismo em uma cultura mista de B. cepacia e S. maltophila sob
condições limitadas de nitrogênio (KROON e VAN GINKEL, 2001).................................51
Figura 3.10. Provável mecanismo de degradação de diaminas (DEO E NATARAJAN,
1998a)....................................................................................................................................52
Figura 3.11. Provável mecanismo de degradação de dodecilamina (DEO e NATARAJAN,
1998a)....................................................................................................................................53
Figura 4.1. Fluxograma evidenciando o delineamento experimental na fase do
desenvolvimento metodológico adotado...............................................................................57
Figura 4.2. Fluxo de rejeitos da empresa (Arquivo da empresa Samarco)...........................63
Figura 5.1. Curvas de calibração do método Verde de Bromocresol....................................72
xiii
Figura 5.2. Curvas de calibração do método Orange II........................................................75
Figura 5.3. Distribuição dos resíduos....................................................................................77
Figura 5.4. Limite de Detecção do Equipamento (LDE)......................................................79
Figura 5.5. Análise pelo método do Verde de Bromocresol da biodegradação das éter-
aminas, utilizando o meio Caldo Nutriente, pela bactéria Serratia marcescens...................81
Figura 5.6. Análise pelo método do Verde de Bromocresol da biodegradação das éter-
aminas, utilizando o meio Bromfield modificado, pela bactéria Serratia marcescens.........83
Figura 5.7. Degradação das éter-aminas nas amostras de rejeito..........................................88
Figura 5.8. Fotografias das placas de Petri mostrando crescimento bacteriano em ágar
nutriente (1, 2, 3, 4, 5) e Bromfield modificado sólido (6, 7, 8, 9).......................................91
Figuras 5.9. Fotografias dos tubos de ensaio contendo meio líquido para crescimento de
microrganismos................................................................................................................... ..94
Figura 5.10a. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração de
Gram dos 22 isolados, chamados de A à R, em aumento de 1.000x....................................95
Figura 5.10b. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração de
Gram dos 22 isolados, chamados de S à V, em aumento de 1.000x.....................................96
Figura 5.11a. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração
Verde de Malaquita dos 22 isolados, chamados de A à F, em aumento de 1.000x..............96
Figura 5.11b. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração
Verde de Malaquita dos 22 isolados, chamados de G à V, em aumento de 1.000x..............97
Figura 5.12. Gel de agarose 1,0%, corado com SyberSafe DNA Gel Stain (Invitrogen)......99
Figura 5.13. Árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S(~1.300pb)
construída pelo método Neighbor-Joining. Análise de Bootstrap com 1000 réplicas.
Números de referência no GenBank se encontram entre parênteses. Barra corresponde a
0,5%....................................................................................................................................100
Figura 5.14. Gel PCR do DGGE.........................................................................................106
xiv
Figura 5.15. Gel de DGGE corado com brometo contendo fragmentos de DNA ribossomal
16S amplificado com iniciadores universais para
Bacteria...............................................................................................................................108
Figura 5.16. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado A (a), B (b), C (c), J (d)
e N (e) através do Método do Orange II.............................................................................112
Figura 5.17. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado D (a), G (b), R (c) e , T
(d) através do Método do Orange II....................................................................................113
Figura 5.18a. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado F (a), H (b), I (c), K
(d), L (e), Q (f), R (g), U (h) e V (i) através do Método do Orange II................................114
Figura 5.18b. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado F (a), H (b), I (c), K
(d), L (e), Q (f), R (g), U (h) e V (i) através do Método do Orange II................................115
Figura 5.19. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado E (a) , M (b), O (c) e P
(d) através do Método do Orange II....................................................................................116
Figura 5.20. Análise da biodegradação das éter-aminas por todos os isolados através do
Método do Orange II...........................................................................................................117
Figura 5.21. Biodegradação das éter-aminas pelo isolado K - 3mL de inóculo, 50mg.L-1
de
éter-amina e diferentes temperaturas..................................................................................121
Figura 5.22. Curva teórica. (a) primeira ordem; (b) segunda ordem..................................125
Figura 5.23. Gráficos lnK x 1/tempo para cinética de primeira ordem (a, b, c) Todos
isolados, 1, 2 e 3mL, respectivamente; (d, e, f) Isolado K, 1, 2 e 3mL..............................129
xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1. Equações utilizadas para avaliar a biodegradação do endosulfan com e sem
crescimento...........................................................................................................................37
Tabela 3.2. Parâmetros dos modelos de cinética de degradação de substrato adequados para
as diferentes concentrações iniciais de endosulfan pela P. aeruginosa (HUSSAIN et al.,
2009)............................................................................................................................. ........38
Tabela 3.3. Classificação nutricional das bactérias (TORTORA, 2005)..............................41
Tabela 3.4. Valores de referência da concentração de aminas nas águas para consumo
humano e efluentes, de acordo com EPA/EUA (PERES et al., 2000)..................................55
Tabela 4.1. Soluções e volumes da extração de DNA pela técnica fenol/clorofórmio
(GRIFFITHS et al., 2000).....................................................................................................65
Tabela 4.2. Reagentes utilizados para a preparação da mistura de reação da PCR para a
amplificação do gene DNAr 16S. ........................................................................................66
Tabela 5.1. Valores das Variâncias (S2) utilizadas para calcular LDM................................80
Tabela 5.2. Limite de Detecção do Método Orange II..........................................................80
Tabela 5.3. Absorbâncias e concentrações encontradas nos testes sem a adição de éter-
aminas...................................................................................................................................85
Tabela 5.4. Varredura dos meios de cultura, de 450 à 550nm..............................................87
Tabela 5.5. Valores de pH das frações sólida e líquida das amostras de rejeito...................88
Tabela 5.6. Origem e características das 22 colônias isoladas..............................................93
Tabela 5.7. Concentrações iniciais e finais e taxas de biodegradação dos isolados
bacterianos durante 20 dias de monitoramento...................................................................118
xvi
Tabela 5.8. Coeficientes de determinação (R2) para o modelo de Monod aplicado ao isolado
K e aos isolados em conjunto..............................................................................................123
Tabela 5.9. Coeficientes de determinação (R2) encontrados para os modelos de primeira e
segunda ordens aplicado ao isolado K e aos isolados em conjunto....................................124
Tabela 5.10. Constantes de velocidades (K) para cinética de primeira ordem...................126
Tabela 5.11. Energia de Ativação (EA) e coeficiente de determinação (R2) para o modelo
de primeira ordem...............................................................................................................130
xvii
LISTA DE NOTAÇÕES
ATP Adenosina Trifosfato
BSA Soro Albumina Bovina
CL50 Concentração letal
CO Monóxido de carbono
CO2 Dióxido de carbono
CO32-
Carbonato
COS Sulfeto de carbonila
COV Composto orgânico volátil
CS2 Dissulfeto de carbono
DECBI Departamento de Ciências Biológicas
DEQUI Departamento de Química
DL50 Dose letal
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DNAr 16S Ácido Desoxirribonucléico da porção 16S ribossomal
DNPM Departamento Nacional de Produção Mineral
dNTP Desoxirribonucleotídeo
DQO Demanda Química de Oxigênio
EPA Agência de Proteção Ambiental Americana (USA)
HCO-3 Bicarbonato
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
LDE Limite de detecção do equipamento
LDM Limite de detecção do método
MBR Minerações Brasileiras Reunidas
MgCl2 Cloreto de magnésio
MIBK Metil iso-butil cetona
NaOH Hidróxido de Sódio
NCBI National Center of Biotechonogy Information
NH+
4 Íon amônio
NO-2 Nitrito
xviii
NO3- Nitrato
OD Oxigênio dissolvido
Pb Pares de bases
PBS Tampão fosfato salino
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PCR-DGGE Reação em Cadeia da Polimerase - Eletroforese em Gel de Gradiente
Desnaturante
pH Potencial Hidrogeniônico
PNP p-nitrofenol
PVPP Polivinilpolipirrolidona
RNAr16S Ácido Ribonucléico da porção 16S ribossomal
RC Rejeito Composto
RB Rejeito da Barragem
RPM Rotações por Minuto
SDS Dodecil sulfato de sódio
SO42-
Sulfato
TAE Solução Tampão com Tris-Acetato-EDTA
Taq Termophilus aquaticus (Taq DNA polimerase)
TNP 2,4,6-trinitrofenol
Tris Tris(hidroximetil)aminometano
UFOP Universidade Federal de Ouro Preto
UV Ultra-Violeta
xix
RESUMO
As éter-aminas são os coletores orgânicos mais utilizados na flotação do minério de ferro e
estão presentes no rejeito depositado nas barragens. Estas aminas podem ser biodegradadas
em poucos dias após chegarem às barragens e utilizadas como fonte de carbono e
nitrogênio para o metabolismo microbiano. A biodegradação é intensificada pela presença
do minério de ferro, o qual provavelmente fornece elementos essenciais para a
sobrevivência destes seres vivos. Este trabalho teve como objetivo isolar e identificar
culturas bacterianas a partir dos rejeitos contendo aminas bem como investigar a
capacidade de degradação das éter-aminas pelas bactérias isoladas e da bactéria Serratia
marcescens, previamente identificada na barragem de rejeitos. Além disso, realizou-se a
comparação da diversidade bacteriana nas duas amostras pela técnica PCR-DGGE. De
acordo com os resultados obtidos, os testes de biodegradação das éter-aminas, na presença
de minério de ferro e em meios de cultura diferentes, caldo nutriente e Bromfield
modificado, pela S. marcescens, não apresentaram perfil de degradação, sugerindo que essa
bactéria pode estar presente na barragem de rejeito, mas que não atua sozinha no processo
de degradação dos coletores. Das amostras brutas de rejeito composto da flotação e da
barragem de rejeitos foram obtidos 22 isolados, todos caracterizados como bacilos retos,
Gram-positivos e formadores de esporos. A comparação filogenética da sequência do
DNAr 16S do isolado K revelou alta similaridade com as espécies Bacillus
amyloliquefasciens e Bacillus subtilis. A utilização da técnica de PCR-DGGE permitiu
observar que a amostra da barragem de rejeitos possui uma menor diversidade, comparada
à amostra do rejeito composto do processo de flotação, porém nesta verificou-se a presença
do isolado K, indicando uma participação considerável desta bactéria na comunidade
bacteriana predominante nesta amostra. Os testes de degradação das aminas utilizando os
isolados bacterianos apresentaram resultados com baixos perfis de degradação (em torno de
20-25%), sendo que para alguns não houve consumo do coletor. No entanto, na presença
conjunta de todos os isolados a degradação das éter-aminas apresentou maior taxa (62%),
indicando que as espécies obtidas atuam em conjunto no consumo desse coletor. O isolado
K, que apresentou maior taxa de degradação, e todas as linhagens juntas, foram utilizados
para a realização do testes de cinética de degradação em diferentes concentrações de
xx
insumo, temperaturas e volume de inóculo. Pode-se observar que à temperatura de 45°C
não ocorreu consumo de substrato e que à 25mg.L-1
, para o isolado K, também não houve
degradação. A taxa de degradação foi maior na presença de maior volume de inóculo para o
isolado K, mas não sofreu alterações quando estes estiveram em conjunto. Foram testados
os modelos de Monod, primeira e segunda ordens para traduzir a cinética de degradação e o
modelo de primeira ordem se mostrou mais adequado.
Palavras-chave: biodegradação, éter-aminas, flotação, cinética, Bacillus
amyloliquefasciens, Bacillus subtilis.
xxi
ABSTRACT
The ether-amines are the most widely used organic collectors in the flotation of iron ore
and are present in the waste deposited in the dams. These amines can be biodegraded within
a few days after reaching the dams and are used with source of carbon and nitrogen for
microbial metabolism. Biodegradation is enhanced by the presence of iron ore, which
probably provides the essential elements for the survival of these living beings. This study
aimed to isolate and identify bacterial cultures from the tailings containing amines as well
as conduct experiments to investigate the ability of degradation of ether-amines by isolated
bacteria and the bacterium Serratia marcescens, previously identified in the tailings dam. In
addition there is the comparison of bacterial diversity in the two samples by PCR-
DGGE. According to the results obtained, the biodegradation tests of biodegradation of
ether-amines, in the presence of iron ore and in different culture media, nutrient broth and
Bromfield modified by S. marcescens, showed no degradation profile, suggesting that this
bacterium can be present in the tailings dam, but that does not act alone in the degradation
process of collectors. From raw samples of flotation tailings and composite tailings dam
were obtained 22 isolated, all characterized as straight rods, Gram-positive and spore
forming. The phylogenetic comparison of 16S rDNA sequence of strain K showed high
similarity with the species Bacillus amyloliquefasciens and Bacillus subtilis. The use of
PCR-DGGE allowed to observe that the sample from the tailings dam has a lower diversity,
compared to the sample of composite tailings from the flotation process, however in this
was verified the presence of strain K, indicating a considerable share of this predominant
bacterial community isolated in this sample. Degradation tests of amines with the bacterial
isolated showed results with low degradation profiles (around 20-25%), and for some there
was no consumption of the collector. However, in the joint presence of all isolated the
degradation of ether-amines showed higher degradation (62%), indicating that the species
obtained act together to degrade. The strain K, which had the highest rate of degradation,
and all strains together, were used to perform the tests decay kinetics at different
concentrations of input, temperature and inoculum volume. It can be observed that at the
temperature of 45°C substrate consumption did not occur and that at the 25mg.L-1
, for
strain K, there was also no degradation. The degradation rate was higher in the presence of
xxii
higher inoculum volume for strain K, but did not change when they were together. The
models of Monod, first and second order were tested to translate the degradation process
and the first order model was more appropriate.
Keywords: biodegradation, ether-amines, flotation, kinetics, Bacillus amyloliquefasciens,
Bacillus subtilis.
1
CAPÍTULO 1 - INTRODUÇÃO
O estilo de vida que se herda, pratica e que certamente se passa para as próximas gerações é
inegavelmente dependente do uso e de aplicações de recursos minerais. São muitos os
exemplos de situações cotidianas que viabilizam a base da extração de recursos minerais.
Basta olhar atentamente ao ambiente em que se está para identificar uma série de objetos
cuja fabricação envolve uma variedade de produtos derivados de bens minerais de todas as
classes como metais, não-metálicos, combustíveis fósseis, metais preciosos, gemas. As
atividades industriais modernas em diferentes áreas de metalurgia, química, fertilizantes,
cimentos, construção civil e elétrica usam e transformam bens minerais, gerando produtos
manufaturados, inimagináveis no passado, que permitem a execução das atividades com
eficiência e certo conforto.
O minério de ferro é um metal essencial na indústria extrativa no Brasil, tanto em relação
ao volume da produção quanto nos investimentos financeiros. É utilizado na fabricação de
aço e ferro fundido, possui aplicações nas indústrias de ferro-liga e de cimento, e também é
utilizado na construção e manutenção de estradas (DNMP, 2009). Ao se analisar os usos
que a humanidade faz dos diversos bens minerais, percebe-se a dependência que se tem
deles e, somando-se as quantidades utilizadas, pode-se chegar a números no mínimo
curiosos em termos do consumo per capita desses bens, em particular nos países altamente
industrializados.
Diferentemente dos outros recursos naturais, tais como os de origem vegetal ou animal, a
maioria dos recursos minerais não é renovável, e a extração se dá numa velocidade bem
maior do que aquela com que eles se formam (milhares ou mesmo milhões de anos). Uma
vez lavrados e utilizados, eles podem não mais se formar na escala de tempo da vida
humana. Decorre daí a disponibilidade finita de bens minerais, pelo menos em termos dos
tipos de depósitos que atualmente se conhece e que se está habituado a lavrar. Apesar de a
crosta terrestre dispor de gigantescas quantidades de substâncias minerais úteis não
renováveis, esses minerias ocorrem em concentrações menores do que aquelas atualmente
exigidas para que sejam lavradas. No entanto, a utilização de recursos minerais a teores
progressivamente decrescentes, implicando maiores custos energéticos, será viável somente
2
se dispuser de fontes abundantes e baratas de energia, pois esta é um insumo essencial na
extração e tratamento de bens minerais, assim como na fabricação de seus produtos
variados.
O ferro é um metal de grande incidência na crosta terrestre, representando 4,2% em massa
(DNPM, 2009). Os principais minerais que contêm ferro são hematita (Fe2O3), magnetita
(Fe3O4), goethita (FeO/OH) e siderita (FeCO3). As formações ferríferas compostas de
hematita e sílica, chamadas de itabiritos, estão presentes nos maiores depósitos de ferro
(DNPM, 2009). Devido à grande utilização dos depósitos de minérios de altos teores de
ferro (>64% Fe) (ROSIÈRE e CHEMALE JR., 2000) torna-se de fundamental importância
a extração de jazidas de minérios com teores de ferro cada vez mais baixos, os quais
contêm partículas de minério que não são de interesse, conhecidas como ganga (FARNESE
e BARROZO, 2006). O minério itabirito não era explorado há alguns anos devido ao baixo
teor de ferro (< 50-60%Fe), de acordo com os interres comerciais (ALVES, 2006) e
granulometria fina (BATISTELI, 2007), mas tornou-se alternativa para as explorações
atuais. As partículas de quartzo e sílica, presentes no minério itabirito, são indesejáveis e
devem ser retiradas durante o processo de concentração do minério (COSTA, 2009).
Nos dias atuais, o processo de concentração de minérios mais utilizado pela indústria
mineral, o qual torna possível o aproveitamento de minerais complexos e/ou com baixo teor
é a flotação catiônica reversa, metodologia esta na qual é utilizado um coletor e um
depressor dos óxidos de ferro (SILVA, 2004). Os principais reagentes utilizados processo
de flotação são as éter-aminas e o amido. O primeiro possui a função de coletor dos
minerais de quartzo e o segundo tem a função de deprimir os minerais de ferro, impedindo
que eles sejam flotados (SAMARCO MINERAÇÃO, 2009). Durante a flotação, a maior
parte das éter-aminas fica contida na polpa do rejeito, juntamente com a sílica. Esta polpa é
descartada para as barragens de rejeito, as quais são fontes potenciais de contaminação das
águas no meio ambiente.
Os reagentes orgânicos utilizados na concentração dos óxidos de ferro reduzem a taxa de
absorção de oxigênio no ambiente aquático, diminuindo a velocidade de autodepuração dos
rios (ARAÚJO, 2007). Diante da crescente preocupação com as condições ambientais, as
3
barragens de rejeito, contendo éter-aminas, merecem mais atenção devido às alterações que
podem causar no ambiente natural.
Não se sabe ao certo os produtos formados durante a decomposição das éter-aminas, mas
estudos indicam que não são formados compostos inorgânicos e que estas éter-aminas são
decompostas rapidamente na barragem de rejeitos (CHAVES, 2001). Os fatores que
influenciam as etapas de degradação das éter-aminas também não são bem definidos
(CHAVES, 2001).
O coletor orgânico possui elevado valor comercial e sua recuperação pode levar a uma
grande economia para a indústria de minério de ferro. A reciclagem das éter-aminas com
possível reutilização no processo de flotação do minério é uma das alternativas estudadas
para evitar o lançamento junto aos rejeitos do processo e reduzir custos operacionais
(BATISTELI, 2007). Estudos anteriores demostraram que a degradação das éter-aminas nas
barragens de rejeito ocorre rapidamente; em 12 dias a quantidade de éter-aminas pode ser
reduzida a menos da metade da quantidade inicial (CHAVES, 2001), o que dificulta o
processo de recuperação e reuso desse coletor. Diante dessas informações, o presente
trabalho foi proposto com o objetivo de estudar o processo de biodegradação das éter-
aminas, visando, futuramente, elucidar a recuperação desse coletor orgânico.
Este trabalho analisou o processo de biodegradação das éter-aminas isolando e
identificando bactérias potencialmente degradadoras, bem como a velocidade desta
degradação. Os procedimentos experimentais para isolamento e identificação das bactérias
foram realizados nos Laboratórios de Microbiologia do Departamento de Ciências
Biológicas (DECBI/UFOP); já os procedimentos de análise das éter-aminas e de
biodegradabilidade e cinética foram realizados no Laboratório de Resíduos e Efluentes do
Departamento de Química (DEQUI/UFOP).
Acredita-se que o conhecimento sobre o envolvimento de bactérias com capacidade de
degradação de éter-aminas pode contribuir para aplicações práticas na indústria, tais como
para promover a inibição do processo de biodegradação das éter-aminas na barragem de
rejeitos e também para futura identificação dos produtos formados durante o processo de
degradação.
4
CAPÍTULO 2 - OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Estudar os rejeitos da flotação do minério de ferro, buscando identificar as bactérias
responsáveis pela biodegradação do coletor orgânico.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Validar o método químico de quantificação das éter-aminas Orange II;
Realizar testes de biodegradação das éter-aminas pela bactéria Serratia marcescens;
Isolar bactérias em diferentes meios de cultura, caracterizá-las segundo suas
características morfológicas e identificá-las com base na sequência do gene RNA
ribossomal 16S;
Comparar a diversidade bacteriana presente nas amostras brutas do rejeito composto e
rejeito da barragem utilizando a técnica do PCR-DGGE;
Realizar testes de degradabilidade das éter-aminas pelos isolados bacterianos;
Estudar a cinética de degradação das éter-aminas pelas linhagens isoladas em
diferentes concentrações e temperaturas.
5
CAPÍTULO 3 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. ASPECTOS GERAIS DA MINERAÇÃO
A Crosta Terrestre é constituída principalmente por oxigênio, silício, alumínio e ferro,
sendo que este último é o quinto mais abundante, correspondendo a 4,2%. Os principais
minerais que possuem ferro são: hematita (Fe2O3), goethita (FeO.OH), magnetita (Fe3O4) e
siderita (FeCO3), sendo, portanto, o quarto mineral mais abundante da crosta terrestre
(DNPM, 2009). Os recursos brasileiros de minério de ferro, reconhecidos oficialmente pelo
Departamento Nacional de Produção Mineral (DNPM) são da ordem de 73,7 bilhões de
toneladas. As reservas brasileiras representam 7,2% das reservas mundiais, o que coloca o
Brasil em quinto lugar entre os países detentores das maiores quantidades de minério de
ferro, sendo que os altos teores de ferro nos minérios brasileiros levam o país a ocupar um
lugar de destaque no cenário mundial, em termos de ferro contido no minério (DNPM,
2009). No Brasil, as principais reservas de minério de ferro estão em Minas Gerais
(66,97%), Pará (15,97%) e Mato Grosso do Sul (15,47%) (DNPM,2009) e são
denominadas itabiritos, as quais compreendem formações ferríferas metamórficas e
fortemente oxidadas apresentando descontinuamente corpos de minério de alto teor de ferro
(>64% Fe), de morfologia mais ou menos lenticular e dimensões variáveis desde alguns
centímetros até centenas de metros (ROSIÈRE e CHEMALE JR., 2000). De acordo com o
DNPM, em 2008 o Brasil produziu 351,2 milhões de toneladas de minério de ferro, com
teor médio de 60,9% de Fe (DNPM, 2009), o que representou 61,2% do valor total da
produção mineral brasileira. Cerca de 66,0% da produção foram destinados ao mercado
externo (DNPM, 2009).
3.2. BENEFICIAMENTO DO MINÉRIO DE FERRO
Normalmente os minerais presentes na natureza apresentam-se numa forma diferente
daquelas utilizadas pela indústria, seja pela granulometria ou associação com outros
minerais, os quais não são de interesse ou são indesejáveis para o processo industrial ao
qual se destinam. É exatamente para a adequação dos minerais aos processos industriais
6
que se utiliza o beneficiamento dos minérios devido à escassez cada vez maior das reservas
de minérios de altos teores de ferro, visando concentrar os minérios com baixos teores.
A concentração mineral ocorre por meio da exploração das propriedades físicas ou físico-
químicas diferenciadoras, específicas dos minerais, que não alterem a estrutura química dos
minerais presentes, como cor, peso específico, densidade, forma, tamanho relativo das
partículas, susceptibilidade magnética, condutividade elétrica e características de superfície
(BATISTELI, 2007).
A flotação é o processo atualmente mais utilizado para o tratamento de quase todos os tipos
de minérios, devido á grande versatilidade e seletividade (PAVLOVIC e BRANDAO,
2003; HOUOT, 1983). Este processo permite a obtenção de um produto final com elevados
teores do mineral de importância e expressivas recuperações. A característica da superfície
do mineral é a propriedade determinante neste processo, que ocorre em suspensão aquosa.
Há utilização de reagentes químicos para que ocorra a recuperação seletiva dos minerais
por adsorção em bolhas de ar.
3.3. O PROCESSO DE FLOTAÇÃO
As primeiras patentes relacionadas ao método de flotação surgiram no século XIX na
Inglaterra e ocorreram três etapas de desenvolvimento: Flotação em óleo (bulk oil
flotation), Flotação pelicular (skin flotation) e Flotação em espuma (froth flotation)
(JAFELICCI JR et al., 2008; ATKINS e JONES, 2001). A flotação catiônica reversa
iniciou-se na década de 1960, empregando-se íons de cálcio para a ativação da sílica, que
era flotada em condições básicas por ácido graxo (REIS, 2004; HOUOT, 1983). No Brasil,
em 1977, a Samarco foi pioneira na implantação da flotação de minério de ferro, sendo esta
técnica empregada até os dias atuais, mesmo após ocorrem etapas de expansão da produção
de minério de ferro (BATISTELI, 2007). Atualmente, o Brasil é o país que possui maior
número de colunas de flotação de minério de ferro do mundo, as quais são indispensáveis
para o tratamento desse mineral, tendo em vista seu excelente desempenho com materiais
finos (ARAÚJO et al., 2005; MARTINS et al., 2002). Mas essa técnica também é utilizada
no tratamento de outros minerais como fosfato, nióbio, ouro, cobre, zinco oxidado,
7
chumbo-zinco, grafita, carvão, potássio, níquel, fluorita, magnesita, feldspato, barita, talco,
tungstênio e resíduo hidrometalúrgico contendo prata, sendo o processo mais indicado para
a produção de super-concentrados. (JAFELICCI JR. et al., 2008).
Desta forma, a flotação é uma técnica físico-química de separação de misturas baseada nas
diferenças das características da superfície dos vários minerais presentes na polpa. Essas
características estão relacionadas ao conceito de hidrofobicidade, que corresponde à
dificuldade das partículas em se interagir com a água, sendo que uma partícula hidrofóbica
tem aversão por água, e é pouco molhável, e uma partícula hidrofílica, é ávida por água,
sendo mais molhável (COSTA, 2009). Esta técnica consiste na introdução de bolhas de ar
produzidas, comumente, pela dispersão de ar comprimido (ENGLERT et al., 2009), a uma
suspensão de partículas, sendo que no caso do minério de ferro, os minerais mais
importantes são a hematita (Fe2O3), chamado underflow, e o quartzo (SiO2), considerado o
mineral de ganga, que é o overflow (COSTA, 2009; PERES et al., 2000). Assim, as
partículas se aderem às bolhas de ar formando uma espuma que deve ser removida da
solução para separar os componentes efetivamente. Esta técnica ocorre devido à tensão
superficial do meio de dispersão e ao ângulo de contato formado entre a bolha e as
partículas (DE SOUSA et al., 2003).
A seletividade no processo de flotação requer a adição de reagentes químicos para induzir a
propriedade diferencial. Na faixa de pH em que ocorre a flotação, próximo de 10, tanto as
partículas de hematita quanto as de quartzo são carregadas negativamente, apresentando
propriedades hidrofílicas, e poderiam adsorver a amina, embora a atração seja maior pelo
quartzo. Para evitar que a hematita seja flotada é adicionado o amido como depresssor, que
irá adsorver a superfície da hematita, tornando-as ainda mais carregadas negativamente e
consequentemente mais hidrofílicas. As partículas de quartzo tornam-se avessas pela água
após a adição da amina no sistema, quando esta se liga às partículas de quartzo. A amina
tem ainda, a função de estabilizar a espuma gerada pela adição de ar no sistema, facilitando
dessa forma, a cinética de interação entre as partículas de quartzo e as bolhas de ar. As
partículas de quartzo hidrofóbicas terão afinidade pelo ar e serão arrastadas juntamente com
a espuma, enquanto que as partículas hidrofílicas de hematita permanecerão em suspensão
8
na água. Assim, é possível a separação seletiva entre as espécies minerais, ocorrendo então,
a concentração do minério de ferro (PERES et al., 2000; HOUOT, 1983).
A interação entre a amina e a superfície negativa do quartzo ocorre por atração eletrostática
e com baixa transferência de calor (SMITH e AKHTAR (1976) apud BATISTELI, 2007;
FUERSTENAU, 1991). As espécies H+ e OH
- são íons determinantes do potencial para
silicatos. Desta forma, a carga elétrica, na superfície do quartzo, e, consequentemente, a
densidade de adsorção de amina dependem do pH do sistema. Em meio ácido, a espécie H+
é responsável pela redução de sítios negativos na superfície do quartzo, o que resulta na
dessorção da amina (BLEIER et al., 1976). Por estas características, este processo de
adsorção pode ser considerado reversível em condições alcalinas ou ácidas, não
necessitando de condições extremas (OLIVEIRA et al., 1996).
Devido ao elevado custo de alguns reagentes utilizados no processo de flotação ou por, às
vezes, não serem altamente eficazes na separação seletiva de minerais de baixo teor e
constituírem prováveis poluentes, novas pesquisas estão sendo realizadas para a produção
de novos reagentes de flotação, a fim de que estes apresentem maior seletividade de
separação, não sejam agressivos ao meio ambiente e não modifiquem o fluxograma do
processo (BOTERO et al., 2008).
Novas pesquisas introduziram uma técnica que remove seletivamente os componentes
minerais indesejáveis, a partir de um minério, por meio da interação com os
microrganismos (BOTERO et al., 2008; ANAND et al., 1996), os quais possuem paredes
com macromoléculas de polímeros, proteínas, enzimas e ácidos orgânicos. Tem-se
verificado que essas macromoléculas possuem afinidade com diferentes sistemas minerais,
modificando as propriedades químicas da superfície após a adesão microbiana e cumprindo
as mesmas funções dos reagentes convencionais de beneficiamento mineral (BOTERO et
al., 2008; SMITH e MIETTINEN, 2006; POORTIGA, 2002; SHASHIKALA e RAICHUR,
2002; DEO e NATARAJAN, 1999; NORDE et al., 1997). Este emprego de
microrganismos no processo de separação mineral é chamado de biobeneficiamento,
bioflotação ou biofloculação (FARAHATA et al., 2009; SHARMA e RAO, 2003,
SHASHIKALA e RAICHUR, 2002; ANAND et al., 1996; SMITH et al., 1993).
9
Muitos microrganismos estão associados naturalmente aos depósitos de minerais e podem
agir naturalmente sobre o processo de flotação, ou agentes floculantes, de maneira positiva
ou negativa. Para atuarem nos processos, há necessidade de que estejam presentes em
grandes quantidades (SMITH e MIETTINEN, 2006). Uma análise preliminar de amostras
de água de jazidas de bauxita na Índia mostrou a presença de bactérias heterotróficas
pertencentes ao gênero Bacillus (Bacillus polymyxa e Bacillus coagulans) (OGURTSOVA
et al., 1990). A presença desses microrganismos associados aos minerais é importante para
o processo de bioflotação, pois se sabe que, especialmente o B. polymyxa, remove tanto o
cálcio como o ferro do sistema de separação de partículas (VASAN et al., 2001; ANAND
et al., 1996).
DEO e NATARAJAN (1999, 1997) estudaram o comportamento dos polissacarídeos
extracelulares e das proteínas das células de B. polymyxa na presença dos minerais calcita,
hematita, coríndon e quartzo, e NATARAJAN e DEO (2001) e DEO e NATARAJAN
(1998b) estudaram esse comportamento nos mesmo minerais e também na caulinita, com o
mesmo microrganismo. A interação do B. polymyxa com os minerais levou a mudanças
significativas na superfície tanto dos minerais como no microrganismo devido às moléculas
presentes na parede celular bacteriana e produtos do metabolismo, o que facilitou o
processo de flotação (BOTERO et al., 2008; DEO e NATARAJAN, 1999 e 1997). Uma
característica importante, que auxiliou esse processo de separação é que uma maior
quantidade de células de B. polymyxa adsorve nas partículas de hematita do que no quartzo
(PATRA e NATARAJAN, 2003; SHASHIKALA e RAICHUR, 2002).
Para a flotação aniônica da apatita e dolomita foi demonstrado que Bacillus subtilis e
Bacillus lichenformis e seus produtos metabólicos agem com a função de depressores da
flotação (ZHENG e SMITH, 1997a,b apud SMITH e MIETTINEN, 2006). Staphylococcus
carnous, Bacillus firmus, Bacillus subtilis e Bacillus lichenformis por outro lado atuam
como agentes coletores no processo de flotação da apatita e calcita (MIETTINEN et al.,
2003a,b apud SMITH e MIETTINEN, 2006). Acidithiobacillus ferrooxidans e
Acidithiobacillus thiooxidans, quando cultivados na presença de sulfetos são capazes de
afetar as características da superfície dos minerais e, portanto, são capazes de afetar o
comportamento de flotação dos minerais (SANTHIYA et al., 2001). Os estudos utilizando
10
esses microrganismos para promover mudanças químicas na superfície da pirita e da
calcopirita demonstraram que após um pré-condicionamento dos minerais com as bactérias,
antes da adição do coletor, houve uma redução significativa na flotabilidade da pirita, mas
não afetou essa característica na calcopirita (HOSSEINI et al., 2005).
Desulfovibrio desulfuricans NCIM 2047, uma bactéria que está naturalmente associada aos
depósitos de minério de ferro e relacionada com a biomineralização de vários óxidos de
ferro, foi utilizada no sistema quartzo/hematita. A presença dos minerais foi importante
para a secreção de proteínas, que aumentaram a hidrofobicidade do quartzo, e de
polissacarídeos, que deprimiu a hematita (PRAKASAN e NATARAJAN, 2010).
Rhodococcus opacus foi utilizado como biocoletor de calcita e magnesita e foi observado
que a bioflotação desses minerais na presença do microrganismo apresentou valores em
torno de 93% utilizando 100mg.L-1
de R. opacus e 55% quando a concentração da bactéria
foi de 200mg.L-1
(BOTERO et al., 2007). No sistema de flotação de quartzo/hematita com
essa mesma bactéria, foi possível observar que os dois minerais apresentraram maior
flotabilidade (MESQUITA et al., 2003). A bactéria Escherichia coli também é utilizada
em processos de separação seletiva de minerais, atuando como agente coletor da flotação de
quartzo em condições ácidas (FARAHATA et al., 2009).
3.3.1. Reagentes utilizados na flotação de minério de ferro
Os reagentes utilizados na flotação do minério de ferro podem ser compostos orgânicos ou
inorgânicos, os quais são adicionados ao sistema com o objetivo de controlar as
características das interfaces envolvidas no processo. Dependendo da função específica que
a substância vai exercer no processo de flotação, o reagente pode ser classificado como
espumante, coletor, depressor e modificador (PERES, 2002). Os espumantes são moléculas
neutras com afinidade pela água e ar, mas a contribuição da característica hidrofóbica não é
tão forte quanto a conferida pelos coletores. Os grupos apolares desses compostos são
sempre uma hidroxila, normalmente na forma de álcool ou glicol. O principal mecanismo
de ação dos espumantes é reduzir a tensão interfacial entre a água e o ar, formando assim
uma espuma que detém o mineral flotado na superfície da polpa borbulhada, a qual é
posteriormente removida do sistema (PEARSE, 2005). Os espumantes também podem ter
11
outras interações durante o processo de flotação como co-adsorver com o coletor na
interface mineral/água, diminuindo a dosagem de coletor no sistema, pois ocorre a
formação de hemi-micelas que promovem a flotação, ou serem usados intencionalmente
para dissolver ou emulsificar alguns coletores insolúveis em água. O tipo e a dosagem de
espumantes adicionados ao sistema controlam o tamanho e a distribuição das bolhas de ar
na polpa (PEARSE, 2005).
3.3.1.1. Amido
Alguns coletores não são seletivos, tendendo a recobrir, indiferentemente, partículas de
todas as espécies minerais presentes. No entanto, adicionam-se substâncias auxiliares com
o objetivo de fazer com que a coleta torne-se seletiva, isto é, que o coletor escolha uma
delas sem modificar as demais. Assim é possível realizar a flotação das partículas de
determinada espécie e deixar todas as demais no interior da polpa. Esta substância auxiliar
é denominada depressora, pois, tem a função de deprimir a ação do coletor nas partículas
indesejadas. Na flotação catiônica reversa do minério de ferro é utilizado o amido de milho
como depressor, sendo utilizado largamente devido à sua disponibilidade em grandes
quantidades. O amido também pode ser extraído de outras espécies vegetais, como
mandioca, batata, trigo, arroz e araruta (ARAÚJO et al., 2005). Todos os tipos de amido
não modificados e de grande peso molecular podem ser utilizados para a flotação
(ARAÚJO et al., 2010).
O amido adsorve preferencialmente na superfície da hematita em relação ao quartzo
(PERES e CORREA, 1996; SCHULZ e COOKE, 1953) devido à melhor capacidade que a
superfície da hematita tem para formar pontes de hidrogênio com o depressor e também
porque a superfície do quartzo é mais negativa do que a da hematita (PERES e CORREA,
1996). O amido de milho é gelatinizado pela adição de NaOH (MONTE e PERES, 2002) e
essa solução auxilia também na flotação, pois eleva o pH do meio, uma vez que o pH ótimo
para o processo de flotação está na faixa de 9,5 a 10,5, no qual a superfície do quartzo é
altamente negativa e incide a maior diferença das cargas superficiais entre a hematita e o
quartzo (BATISTELI, 2007; PERES e CORREA, 1996; SCHULZ e COOKE, 1953). Dessa
12
forma o amido é fortemente adsorvido na hematita, impondo forte hidrofilicidade, e
também previne a adsorção das aminas nesse mineral (ARAÚJO et al., 2010).
3.3.1.2. Amina
Os coletores são compostos heterogêneos que contêm um grupo inorgânico ligado a uma
cadeia de hidrocarboneto. Geralmente, o grupo inorgânico é a porção da molécula que se
adsorve na superfície polar do mineral. A cadeia de hidrocarbonetos tem natureza não-
iônica e promove a hidrofobicidade da superfície do mineral depois da adsorção do coletor.
Existem vários coletores que são classificados pela composição, podendo existir em
solução como cátion, ânion ou molécula neutra.
A flotação é realizada em uma faixa de pH que estabiliza tanto as espécies catiônicas,
quanto as espécies moleculares de amina, tornando possível que as primeiras atuem como
coletoras e as segundas como espumantes (ARAÚJO et al., 2005). As aminas são
compostos orgânicos que reduzem a tensão superficial da água em função do número de
carbonos na cadeia e contém o grupo NH2 vinculado a uma radical alquil ou um radical
aromático, utilizadas em diversos setores industriais como aditivos de petróleo,
emulsificantes de asfalto, germicidas, anti-sépticos e agentes da mineração (ARAÚJO et
al., 2010), mas somente as alquilaminas são utilizadas na flotação de minérios (PERES et
al., 2000). Desde 1939, as aminas são o único coletor catiônico industrial utilizado na
flotação de minérios (NEDER, 2005). Sua ionização ocorre em solução aquosa por
protonação, conforme a equação 3.1:
OHRNHOHRNHaqaq )(32)(2 Equação 3.1
Equação de ionização da amina em água (FONTE: ARAÚJO, 2007).
Os coletores catiônicos são adsorvidos e dessorvidos de forma rápida e fácil. Em função
disso, são menos seletivos que os coletores aniônicos e mais afetados por modificadores de
coleta. Sua aplicação típica é na flotação de não-metálicos, tais como o quartzo no
beneficiamento do minério itabirito, silicatos, aluminosilicatos e vários óxidos, talcos e
micas (REIS, 2004).
13
As aminas graxas são compostos alifáticos derivados de amônia, cujas matérias primas
principais são óleos ou gorduras, saturadas ou não. Podem ser classificadas como primárias,
secundárias, terciárias ou sais quaternários e possuem uma cadeia carbônica com um
número par de carbonos variando entre 8 e 22. Apenas as aminas primárias são utilizadas
como coletores na flotação de minerais (PERES et al., 2000), sendo que quanto maior o
comprimento da cadeia de hidrocarboneto, menor a solubilidade em água.
As aminas primárias, secundárias e terciárias são bases fracas, enquanto os sais
quaternários são bases fortes. Esses são completamente ionizáveis em todos os valores de
pH, mas as primeiras possuem a solubilidade dependente do pH (FUERSTENAU, 1982,
apud ANDRADE et al., 2002). A fórmula estrutural simplificada de uma amina primária
está representada na Figura 3.2 e pode-se observar que ela possui uma porção polar e outra
apolar, caracterizando o caráter anfipático. A porção polar está relacionada ao nitrogênio, e
apresenta características iônicas e hidrofílicas, e o grupo R, cuja cadeia carbônica é apolar,
apresenta características hidrofóbicas (PERES, 2002).
Figura 3.1. Fórmula estrutural simplificada de uma amina graxa primária.
As características de polaridade e apolaridade, citadas anteriormente, são importantes para
a função de coletores no processo de flotação catiônica de minerais. O termo graxo
empregado na nomeação dessas aminas faz referência aos grupos alquil ligados ao átomo
de nitrogênio. Esses grupos têm origem nos óleos vegetais e gorduras animais. Os reagentes
da flotação que possuem o caráter anfipático são chamados de surfactantes e exercem dois
papéis principais na flotação. Primeiro, tornam hidrofóbica a superfície de certos minerais
após se adsorverem na interface sólido/líquido, agindo como coletores. Esses reagentes
também influenciam na cinética de ligação bolha/mineral, agindo como espumantes
(COELHO, 1980).
14
Existem diferentes rotas para a produção de variados tipos de aminas. A parte graxa das
aminas (cadeia carbônica longa), que tem origem nos óleos e gorduras, é encontrada na
natureza sob a forma de triglicerídeo. A partir da molécula do triglicerídeo é possível obter
ácidos graxos e álcoois graxos, os quais são utilizados, principalmente na produção de éter-
aminas (ARAÚJO, 2007). O ácido é obtido pela reação do triglicerídeo com a água
enquanto o álcool é oriundo da reação do triglicerídeo com o metanol ou hidróxido de
sódio. O radical de álcool graxo geralmente é constituído por 10 ou 12 átomos de carbono,
sendo mais comum 12 átomos. Essa cadeia tem que ser, obrigatoriamente, sem dupla
ligação e linear. Uma amima primária pode ser transformada em uma éter-amina através da
introdução, entre os radicais alquil e o átomo de hidrogênio, de um grupo O-(CH2)3,
conforme a equação 3.2. Para a flotação do minério de ferro, somente são utilizadas as éter-
aminas (PERES et al., 2000).
222 3)( NHCHORRNH Equação 3.2
Fórmula estrutural simplificada de uma éter-amina (Fonte: PERES et al., 2000).
A principal propriedade das éter-aminas utilizadas na flotação do minério de ferro, em
soluções aquosas, é a hidrólise ou dissociação da molécula, sendo que as espécies
moleculares são favorecidas pela acidez e estabilizadas pela alcalinidade (PERES et al.,
2000). A equação 3.3 apresenta a dissociação de uma éter-amina.
332232 )()( NHCHORHNHCHOR Equação 3.3
Dissociação de uma éter-amina (Fonte: PERES et al., 2000).
O equilíbrio nesta situação ocorre em pH 10,5, sendo que para um pH de 9,5, a
concentração de cátions se aproxima de 100% e o mesmo ocorre com a espécie molecular
para pH 11,5. A espécie iônica é solúvel em água e adsorve facilmente sobre a superfície do
quartzo através da atração eletrostática, pois, a superfície deste mineral é carregada
negativamente em valores de pH maiores que 2,5 (PERES et al., 2000).
As éter-monoaminas empregadas na flotação reversa de minério de ferro são obtidas
através de reações químicas, tendo como insumo os alcoóis graxos. O emprego de éter-
15
monoaminas na flotação é devido, principalmente, à presença da ligação covalente C-O.
Esse grupo hidrofílico aumenta a solubilidade do reagente, facilitando o seu acesso às
interfaces sólido-líquido e líquido-gás (PERES et al., 2004). Segundo NEDER (2005), as
éter-monoaminas são obtidas em duas etapas a partir da reação de um álcool graxo com a
acrilonitrila, conforme a reação de adição ilustrada na equação 3.4.
NCCHORNCHCHOHR 22 Equação 3.4
Reação de adição do álcool graxo com a acrilonitrila (NEDER, 2005).
Posteriormente, o produto dessa reação, chamada de éter-nitrila, é hidrogenado
cataliticamente a alta pressão, conforme a equação ilustrada na equação 3.5.
2222222 NHCHCHCHORHNCCHCHOR Equação 3.5
Hidrogenação catalítica de éter-nitrila (NEDER, 2005).
As éter-diaminas são fruto da reação das éter-monoaminas com a molécula de acrilonitrila,
formando uma éter-nitrila, posteriormente hidrogenada cataliticamente a alta pressão,
conforme reações 3.6 (I) e (II).
232322232 )()()( NHCHNHCHORNCCHCHCHNHCHOR
Equação 3.6(I)
2323222232 )()()()( NHCHNHCHORHNCCHNHCHOR
Equação 3.6(II)
(I): Reação de éter-monoamina com acrilonitrila. (II): Hidrogenação catalítica de éter-monoamina (NEDER,
2005).
Dessa forma, as rotas de produção da éter-monoamina e da éter-diamina podem ser
visualizadas na Figura 3.3.
Figura 3.2. Rota de produção de éter-monoamina e éter-diamina (NEDER, 2005).
16
As aminas coletoras são sempre adquiridas através de marcas comerciais, como a
distribuidora Akzo Nobel e a empresa Clariant®, que divulgou em seu boletim informativo
em 1999, segundo REIS (2004), que as éter-aminas são parcialmente neutralizadas para
aumentar a solubilidade em água, pois, elas são insolúveis em água. Em relação ao grau de
neutralização, a empresa divulgou que a éter-monoamina possui de 18 a 22% de
neutralização, enquanto que a éter-diamina possui de 48 a 56%. Quanto maior o grau de
neutralização maior a solubilidade da amina em água.
Dentre os compostos de amina utilizados na flotação do minério de ferro destacam-se as
éter-monoaminas e éter-diaminas. Neste trabalho foi utilizado a éter-monoamina Flotigan
EDA 3B e a éter-diamina Flotigam 2835, produzidas e distribuídas pela Empresa Clariant®
e que são utilizadas nos processos de flotação por várias empresas.
De acordo com o boletim informativo da empresa Clariant (1999), as éter-aminas supra-
citadas apresentam, respectivamente, as seguintes composições químicas:
COOCHNHCHOR 3332 ])([ éter-monoamina Flotigan EDA 3B
COOCHNHCHNHCHOR 333232 ])()([ éter-diamina Flotigam 2835
A diferença entre a éter-monoamina Flotigan EDA 3B e a éter-diamina Flotigam 2835 está
na cadeia carbônica R-, sendo que a primeira é composta por uma cadeia carbônica linear e
a segunda por uma cadeia carbônica ramificada, ambas saturadas. Com o aumento do
comprimento da cadeia carbônica de hidrocarboneto, a solubilidade da amina é reduzida.
ARAÚJO et al. (2008) realizaram a caracterização estrutural das aminas Flotigan EDA 3B
e Flotigam 2835 através da espectrometria de massas com ionização por eletrospray. O
espectro de massas da Flotigam EDA 3B, conforme Figura 3.4, mostrou a razão
massa/carga (m/z) em 216, o que mostra que o composto principal presente na amostra
analisada possui massa molar de 216.
17
Figura 3.3. Espectro de massas com ionização por eletrospray da EDA 3B em modo positivo. (Fonte:
ARAÚJO et al., 2008).
Segundo a empresa CLARIANT (1999), a éter-monoamina Flotigam EDA 3B teria o grupo
R composto de 10 a 14 átomos de carbono. Assim, de acordo com o espectro obtido por
ARAÚJO et al. (2008), o grupo R desta éter-amina possui predominantemente 10 átomos
de carbono, o que resulta na seguinte fórmula estrutural: H3C(CH2)9-O-(CH2)3-NH3+.
No espectro da Flotigam 2835, obtido também por ARAÚJO et al. (2008), Figura 3.5, a
razão massa/carga (m/z) em 315 é predominante. Assim, essa éter-amina possui o grupo R
composto predominantemente por 13 átomos de carbono. Mas há ainda cerca de 20% de
m/z em 301, o que corresponde ao grupo R com 12 átomos de carbono. Então a fórmula
estrutural da éter-diamina é: H3C(CH2)11-O-(CH2)3-NH3+ ou H3C(CH2)12-O-(CH2)3-NH3
+.
Figura 3.4. Espectro de massas com ionização por eletrospray da F 2835 em modo positivo. (Fonte: ARAÚJO
et al., 2008).
18
As demais razões m/z presentes nos espectros anteriores são devidas às impurezas e aos
produtos secundários presentes nas amostras, uma vez que estas amostras são amostras
comerciais e contêm impurezas.
3.3.2. Resíduos e efluentes gerados no processo de flotação de minério de ferro
A flotação do minério de ferro gera dois produtos, o concentrado contendo minério de
ferro, que é de interesse comercial, e o rejeito que é depositado em barragens. Na Samarco
Mineração, o rejeito é encaminhado através de canaletas desde a usina até a barragem de
Germano. A água, que carrega ainda algumas partículas sólidas, segue para a barragem de
Santarém. Nesta barragem grande parte das partículas sólidas se decanta. Parte da água é
reciclada pela empresa e a outra parte passa pelo vertedouro e deságua no Córrego
Santarém. Os efluentes e resíduos gerados contêm, basicamente, sílica, compostos
orgânicos constituídos de aminas alifáticas (primárias, secundárias e terciárias), e ainda
alguma concentração de minério de ferro, além de outros metais (ARAÚJO, 2007). De
acordo com REIS (2004), o rejeito da flotação que segue por gravidade para a barragem de
rejeito, na usina da Samarco, em Germano, possui ainda cerca de 13% de ferro.
CHAVES (2001) realizou um trabalho de quantificação de aminas em efluentes e rejeitos
gerados na Samarco Mineração e constatou que os resíduos coletados próximos à usina,
antes da barragem de Germano, apresentaram concentrações de éter-aminas de 31,5 a
22,2mg.L-1
. As amostras de resíduos coletadas na barragem de Germano não apresentaram
concentrações detectáveis pelo método utilizados, sendo que este resultado foi atribuído à
decomposição das aminas. As amostras de água parada na barragem apresentaram
concentrações de aproximadamente 12,2mg.L-1
. A água parada escoa da barragem de
Germano para a de Santarém, que também apresentou concentrações de éter-aminas da
mesma ordem. Mas a água coletada na saída da barragem de Santarém para o córrego de
Santarém, não apresentou concentrações de éter-aminas detectáveis pela metodologia usada
e esta ausência dos coletores orgânicos também foi atribuída à decomposição das éter-
aminas no sistema.
19
3.4. UTILIZAÇÃO E REAPROVEITAMENTO DAS AMINAS
As éter-aminas são reagentes de grande importância no processo de concentração mineral,
mas apresentam custo elevado. Estima-se que aproximadamente 6.000 toneladas de
derivados de amina sejam utilizadas anualmente no Brasil em processos de flotação de
minerais (NEDER, 2005). Segundo BATISTELI (2007), a mineradora Samarco utiliza,
aproximadamente, 1.500 toneladas de éter-aminas por ano, para uma produção de 16
milhões de toneladas de concentrado por ano, o que, de acordo com a Figura 3.6,
representou 48% dos gastos totais com reagentes da referida empresa em 2006
(BATISTELI e PERES, 2008; BATISTELI, 2007).
De acordo com PERES et al. (2000), dependendo da composição do minério e da qualidade
desejada do concentrado, geralmente são utilizados de 20 a 200g de éter-aminas por
tonelada de minério que alimenta o processo de flotação. Segundo BATISTELI (2007),
alguns fatores propiciaram a redução do consumo de aminas pela Empresa Samarco entre
os anos de 2005 e 2007, de 1.755 para 1.520t/ano, mesmo havendo um aumento nas metas
de produção de concentrado para o ano de 2007. Podem-se destacar os seguintes fatores:
• alterações de circuitos;
• aumento do volume de flotação com acréscimo de novas células mecânicas;
• alteração na relação éter-monoamina versus éter-diamina a partir de setembro de 2006,
sendo substituída a proporção de 75% de éter-monoamina e 25% de éter-diamina por 25% e
75% respectivamente;
• controle da dosagem a partir da análise da concentração de éter-amina residual presente
nos rejeitos da flotação;
• conhecimento dos valores de concentração de éter-amina residual presente na água em
cada ponto do rejeito a partir do início do trabalho realizado por BATISTELI (2007).
20
Figura 3.5. Percentual de desembolso por insumo de uma mineradora de MG. (Fonte: BATISTELI, 2007).
Outra alternativa para reduzir o custo com os coletores, bem como reduzir o descarte deste
composto no meio ambiente, é avaliar a possibilidade de reutilizar as éter-aminas contidas
na água do rejeito de flotação como coletor para nova flotação de minério de ferro.
Em 1977, BAHR estudou a concentração de aminas em efluentes provenientes da flotação.
Os estudos encontrados normalmente na literatura envolvem a reutilização das aminas em
solução para uma nova flotação de minério de ferro (REIS, O. B., 2004; STAPELFELDT et
al., 2002; OLIVEIRA et al.,1996).
OLIVEIRA et al. (1996) apresentaram o primeiro trabalho realizado no Brasil visando a
recuperação da amina residual adsorvida na sílica da polpa de rejeito ou contida na água
flotada. O trabalho foi realizado com a água do rejeito final rougher, da coluna de flotação
da planta industrial da Mina do Pico, em Itabirito - MG, pertencente à MBR. Testes
preliminares de flotação utilizando Amidex como depressor e a dodecil-amina contida nos
filtrados recuperados dos rejeitos como coletores, numa dosagem correspondente à
utilizada industrialmente, apresentaram baixa recuperação. Mas, os testes de flotação
utilizando os filtrados do rejeito final rougher como água de diluição para a preparação das
soluções de amina, apresentaram bons resultados. Após os testes de adsorção, realizados
com amostras de quartzo de elevada pureza, colocou-se esse mineral recuperado em contato
com 100ml de água sob agitação por 10 minutos, em duas diferentes condições de pH, 4,0 e
6,4. A suspensão foi filtrada e o filtrado analisado para a determinação da quantidade de
21
dodecil-amina dessorvida. Os resultados indicaram que mais de 60% da dodecil-amina
adicionada para recobrir o quartzo, pode ser recuperada.
Testes realizados internamente na Samarco Mineração com a água do rejeito de uma das
quatro linhas da flotação convencional, objetivando verificar a influência da amina contida
na água de rejeito no desempenho da flotação, concluíram que a água do rejeito não tem
influência nos teores de sílica do concentrado e que a amina presente nesta água não é
significativa para justificar o seu reaproveitamento na flotação convencional.
(MANGABEIRA e TURRER, 2000)
Entretanto, resultados significativos foram obtidos por STAPELFELDT et al. (2002) que
realizou testes de flotação em bancada com várias dosagens de coletor e a água do rejeito
destes ensaios foi reutilizada em ensaios de flotação subseqüentes. Os resultados indicaram
que 50% da amina que é descartada junto ao rejeito podem ser reaproveitadas para outro
processo de flotação. Assim, as aminas que atualmente são descartadas nas barragens de
rejeitos, podem ser reaproveitadas, possibilitando uma redução significativa no consumo do
coletor sem que ocorram perdas na recuperação e na qualidade do concentrado final e
também menor dano ao meio ambiee.
BATISTELI (2007) mostrou que é possível reutilizar a amina residual do rejeito da flotação
catiônica reversa do minério de ferro através da recirculação da água. Mas, para que essa
reutilização seja otimizada, a água do rejeito não deve conter grandes quantidades de
partículas ultrafinas em suspensão, as quais podem prejudicar os resultados da flotação.
Segundo este autor, os ganhos relacionados ao reaproveitamento dependem da quantidade
de amina residual, da quantidade disponível de água e do volume a ser empregado para
alimentar o ponto onde se deseja recuperar a amina. Neste mesmo estudo, BATISTELI
(2007) não obteve resultados satisfatórios com os testes de dessorção das aminas, mesmo
trabalhando com faixas de pH semelhante ao da polpa de rejeito e em faixa ácida de pH.
Foi recomendado monitorar a concentração de amina residual presente na água do rejeito
para otimizar o consumo desse reagente, pois, elevadas concentrações de amina nessas
águas sugere uma dosagem excessiva de amina no início do processo de flotação.
22
Estudos realizados por TEODORO et al. (2004) mostraram a possibilidade de remoção das
aminas através da adsorção em zeólitas, seguidas da dessorção dos produtos adsorvidos e
seu possível reuso. Zeólitas são aluminosilicatos de metais alcalinos e alcalinos terrosos
que, devido ás suas características físicas, possuem propriedades ímpares como troca
iônica, adsorção e hidratação/desidratação.
A vermiculita expandida também é uma opção de material adsorvente que possui
propriedade de troca iônica, semelhante às zeólitas e algumas argilas, que pode se utilizada
para a remoção de compostos orgânicos poluentes e na purificação de águas residuárias
contendo sais dissolvidos (ANDRADE et al., 2002).
O caulim é o nome comercial da argila branca ou quase branca, constituída principalmente
de caolinita, sendo um material argiloso, com baixo teor de ferro e de cor branca. Mesmo
não possuindo histórico de aplicação como material adsorvente, este material apresenta
características que permitem testá-lo para esta finalidade como área superficial e
capacidade de troca catiônica (ANDRADE et al., 2002).
Diante das propriedades da zeólita, natural e modificada, vermiculita e do resíduo de
caulim, ANDRADE et al. (2002) testaram a capacidade de recuperação de aminas coletoras
e a percentagem de recuperação após 3 e 28 horas de contato com cada um dos sólidos,
para os valores de pH de 7,8 e 9,9, utilizando espectroscopia de infravermelho. A adsorção
de amina foi constada em todos os minerais e para todas as condições analisadas. Para o pH
de 7,8, a quantidade de amina adsorvida variou de 1,12 a 1,93x10-4
g.m-2
e a média de
recuperação, para os quatro minerais testados, foi de 60%. Entretanto, a elevação do pH
para 9,9, ampliou a recuperação e a quantidade de amina adsorvida para o mesmo tempo de
contato. A média dos valores de recuperação elevou-se para 74% e a quantidade adsorvida
da amina elevou-se para valores entre 1,41 e 2,59 x 10-4
g.m-2
. A caolinita foi o mineral que
apresentou a menor quantidade adsorvida e uma maior área superficial em ambos os testes,
quando comparada aos demais minerais. A diferença de recuperação entre os minerais não
é significativa para os testes com duração de 3 ou 28 horas para um mesmo pH, sendo que
o grande tempo de adsorção não favoreceu maior recuperação. Os valores de pH utilizados
no processo de adsorção são fundamentais para a eficiência da recuperação, pois definirão a
23
quantidade de cátions da amina em solução, já que a ionização da amina é dependente do
valor do pH da solução. Estes resultados são promissores, pois, estes coletores são
moléculas grandes e podem dificultar a atração eletrostática dos minerais com a parte
iônica da molécula, por isso não foi encontrado recuperação de 100% das aminas
(ANDRADE et al., 2002).
MAGRIOTIS et al. (2010) determinaram a influência de parâmetros físico-químicos na
adsorção de um acetato de éter-amina (Flotigam EDA – Clariant) contendo um radical
dodecil e neutralizada a 30% com ácido acético, na caulinita branca, rosa e amarela, sendo
que esse mineral já foi retratado na literatura como adsorvente na remoção de azo corantes,
polímeros, poluentes orgânicos e metais pesados. A caulinita foi selecionada como mineral
adsorvente devido ao baixo custo e sua ampla ocorrência natural. A adsorção foi favorecida
em pH10,0 para a concentração inicial de éter-amina de 200mg.L-1
, provavelmente devido
às formas iônica e molecular de éter-amina que ocorrem simultaneamente nesse pH, o que
permite a formação de complexos iônico-molecular, os quais são mais ativos na superfície
da caulinita. O equilíbrio da adsorção foi alcançado após 30 minutos e as eficiências de
remoção da éter-amina na caulinita branca, rosa e amarela foi, respectivamente, 77%,
80% e 69%. Dessa forma, sabe-se que as caulinitas oferecem um potencial significativo no
tratamento de efluentes provenientes do tratamento de ferro por flotação.
ARAÚJO et al. (2008) realizaram testes em bancada em pH10,5 utilizando o amido como
depressor dos óxidos de ferro e as éter-aminas Flotigam EDA 3B e F2835 como coletores
para a sílica, para avaliar a possibilidade de recuperação de aminas. Verificou-se através
dos testes de flotação em bancada que as amostras de rejeito contêm significativa
concentração de éter-amina e que essas podem ser reutilizadas, não sendo descartadas nas
barragens de rejeito. Ao utilizar a água contendo a amina residual, juntamente com
quantidades novas de éter-aminas, observaram que há possibilidade de diminuir o consumo
do coletor em até 50%, ocorrendo economia dos reagentes e menor degradação do meio
ambiente. Neste mesmo trabalho, após a realização de testes de dessorção das éter-aminas
contidas nos rejeitos sólidos, adicionando água ao resíduo em diferentes valores de pHs e
massa do resíduo, foi observado que mais de 95% da amina adicionada pode ser recuperada
quando os testes foram feitos em pH5 (ARAÚJO et al., 2008). O maior rendimento da
24
extração em pH de valor mais baixo que o do processo de flotação, pode ser devido ao fato
de que na faixa de pH5, os compostos das éter-aminas tornam-se mais solúveis em solução
aquosa, o que facilita a sua extração. A diluição das aminas resulta na quebra do equilíbrio
eletroquímico do sistema, tendendo à dessorção da amina, cujo processo é refletido na
brusca variação do potencial zeta do quartzo (OLIVEIRA et al., 1996).
Testes realizados por BATISTELI e PERES (2008) indicaram que quando a amina estiver
presente na fase líquida do rejeito da flotação, esta pode ser reutilizada para um segundo
processo de separação de quartzo e minério de ferro, necessitando da adição de uma menor
quantidade de amina nova. A eficiência dessa reutilização está diretamente relacionada com
a concentração da amina na água residual e o processo pode ser prejudicado caso partículas
ultrafinas estejam presentes (BATISTELI e PERES, 2008).
REIS (2004) estudou sobre a reciclagem das aminas utilizadas no processo de flotação
otimizando o uso da água do rejeito contendo aminas em uma segunda etapa de flotação.
Os resultados foram satisfatórios, indicando que há possibilidade de se recuperar até 50%
do reagente coletor. Desta forma, o uso da água contendo aminas junto a uma razão extra
de amina nova pode gerar uma redução de custos com o reagente e também uma grande
redução de descarte das aminas no meio ambiente.
No mesmo estudo, REIS (2004) observou que depois de 14 dias após a primeira extração de
amina, não foi encontrado mais coletor no líquido da flotação e em 6 dias, a concentração
de amina era de aproximadamente a metade da quantidade encontrada no primeiro dia de
extração. De acordo com os autores, as aminas estão sendo degradadas na água de rejeito,
por processos químicos ou biológicos ainda não conhecidos. Diante de tal resultado,
adimitiu-se que as aminas devem ser utilizadas em um curto espaço de tempo para a
segunda etapa de flotação, de forma a manter a eficiência do sistema de concentração do
minério de ferro.
3.5. BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS
Reações irreversíveis podem ocorrer com alguns compostos e resultar em produtos, a partir
do qual as aminas não são facilmente recuperadas. Este é o processo chamado de
25
degradação e no caso das aminas pode ocorrer seguindo algumas rotas diferenciadas, como
degradação térmica, degradação induzida por CO2, degradação causada pelo COS e CS2,
degradação pelo CO, oxidação ou degradação sulfídrica (ABDI, 2000). A taxa de
degradação das éter-aminas depende principalmente da estrutura destes compostos
(KENNARD e MEISEN, 1985). Alguns autores inferem que aminas aromáticas são
lentamente degradadas por evaporação e pela autoxidação na ausência de luz, enquanto que
a presença de substâncias húmicas aumenta a velocidade de degradação destes insumos
orgânicos (LYONS et al., 1984). Mas, segundo estudos de AFZAL KHAN et al. (2006),
que analisaram a autoxidação do 4-aminofenol, as propriedades de autoxidação até existem
para as aminas aromáticas, mas é muito pequena quando comparada à taxa de degradação
biológica por microrganismos. Da mesma forma, LYONS et al. (1984) observaram que a
remoção de anilinas por processos microbianos, foi de longe, o mecanismo de remoção
mais eficaz.
ANDRADE et al. (2002) que estudaram sobre a recuperação das aminas pela adsorção em
minerais industriais como a vermiculita e a zeólita, admitiram que as aminas presentes nas
barragens de rejeitos se degradam naturalmente, seja de forma biológica ou química, em
um período de 28 dias. Mas admitiram também que o assoreamento das barragens de
rejeitos diminui o tempo de residência do efluente contendo os coletores na barragem, o
que se torna insuficiente para que ocorra a completa degradação.
HONGWEI et al. (2006) estudaram sobre a biodegradabilidade anaeróbia de 23 compostos
derivados de nitrogênio, heterocíclicos ou não, entre eles algumas aminas. Os compostos
heterocíclicos aromáticos apresentaram certa dificuldade de biodegradação anaeróbia, mas
as aminas alifáticas não-aromáticas foram rapidamente ou parcialmente degradadas
anaerobicamente. Uma substituição etil também dificultou a biodegradação dos compostos
de nitrogênio em maior grau do que uma substituição metil, pois, a biodegradabilidade
anaeróbia da dietilamina foi menor do que a da dimetilamina. Quanto maior o número de
substituições na cadeia alquil, maior a biodegradabilidade dos compostos, sendo que a
trimetilamina foi mais facilmente biodegradada do que a dimetilamina, assim como a
dietilamina também apresentou taxas de degradação maiores que a etilamina.
26
Alguns pesquisadores sugerem que a completa degradação da maioria dos compostos
derivados de aminas graxas é atingida por grupos de microrganismos, nos quais um
determinado microrganismo depende ativamente dos subprodutos gerados pelo
metabolismo de uma espécie anterior (KROON e VAN GINKEL, 2001). Outros estudos
com culturas puras demonstram que a degradação dos derivados de aminas graxas é
iniciada por uma clivagem direta da ligação C-N, seguida pela utilização da cadeia de
carbono, que resulta na liberação de moléculas polares (KROON et al., 1994; VAN
GINKEL e KROON, 1993; VAN GINKEL et al, 1992). Assim, de acordo com estes
autores a completa mineralização dos derivados de aminas graxas só pode ocorrer através
da atividade de um consórcio de pelo menos dois microrganismos (VAN GINKEL, 1996).
Quando lançadas no meio ambiente, as aminas estão sujeitas à ação de diversos
microrganismos, pois os coletores são fonte de carbono e de nitrogênio. Esta biodegradação
pode ser benéfica se houver a remoção desses compostos por parte dos microrganismos,
gerando produtos menos tóxicos. Mas a biodegradação também pode gerar produtos mais
tóxicos que os compostos iniciais.
Segundo ARAÚJO et al. (2010), não se sabe quais são os produtos gerados pela
decomposição das éter-aminas nas barragens de rejeito. Análises in situ de nitrito, nitrato e
amônio foram realizadas para avaliar a conversão das éter-monoamina e éter-diamina
nesses compostos simples, mas os resultados mostraram baixas concentrações desses
prováveis produtos. Mas sabe-se que os coletores são degradados na presença de
microrganismos devido à redução da concentração encontrada após 40 dias de análise,
sendo que após 5 dias, 34% das éter-aminas já havia sido consumida, e após 10 dias de
observação, 75% da concentração inicial foi degradada (ARAÚJO et al., 2010).
De acordo com o monitoramento de degradabilidade das éter-aminas no resíduo da flotação
do minério de ferro da Samarco, sabe-se que o tempo de decomposição do coletor é
bastante curto. Em 12 dias de monitoramento, observou-se que a quantidade de amina
encontrada foi de 4,7mg.L-1
, menos da metade da quantidade inicial, quantificada como
31,7mg.L-1
. Após esse período, houve estabilização na quantidade da aminas, pois com 17
dias havia 2,8mg.L-1
e com 21 dias de monitoramento, foram encontrados 2,1mg.L-1
.
27
CHAVES (2001). Estes resultados são muito importante pois evidenciam a velocidade do
processo de degradação das aminas e que o reaproveitamento das mesmas, em um segundo
processo de flotação, só poderá apresentar resultados satisfatórios se utilizadas
imediatamente após a primeira etapa de flotação. Caso contrário, a quantidade de coletor
presente no efluente é muito baixa e torna-se inviável economicamente realizar a
reutilização na flotação.
ARAÚJO (2007) monitorou a biodegradabilidade das aminas e mostrou que em amostras
reais com concentrações de amina de aproximadamente 30mg.L-1
, após 5 dias de
monitoramento, 34% da amina foi consumida, e em 10 dias 75% havia sido consumida.
Para as amostras com aminas preparadas em laboratório, após 21 dias de monitoramento
não houve degradação. Os autores sugeriram que a diferença observada nos resultados
ocorreu pela presença de componentes provenientes do minério de ferro presentes nas
amostras reais, o que favoreceu o crescimento das bactérias responsáveis pela
biodegradação.
Os testes de biodegradação realizados por ARAÚJO (2007) com Serratia marcescens bizio
1823L nas concentrações de 10, 40 e 60mg.L
-1, e nas temperaturas de 25, 30, 35 e 38°C,
indicaram que as taxas de biodegradação são inicialmente lentas, especialmente em altas
concentrações de amina. A 38ºC, a reação acelerou ligeiramente, e após 16 horas de
monitoramento, 70,6% da amina havia sido degradada, enquanto que a 25ºC, apenas 45%
da amina havia sido consumida neste mesmo período de tempo. Após 24 horas, as
concentrações de amina eram praticamente as mesmas em todas as temperaturas testadas.
Para a menor concentração, as taxas de biodegradação foram muito próximas para todas as
temperaturas, o que significa que a temperatura teve baixa interferência nesses resultados.
Nas concentrações de 40 e 60mg.L-1
, a temperatura teve uma influência significativa
sobre as taxas de biodegradação, principalmente a 38°C, na qual após 36 horas de
observação, 93,80% do coletor havia sido degradado para a concentração inicial de
40mg.L-1
, enquanto que para 60mg.L-1
, a degradação atingiu 91,30%, após o mesmo
período de tempo. Dessa forma, esses dados revelaram uma grande influência da
temperatura e da concentração de insumo na velocidade de degradação da éter-amina EDA
3B.
28
Avaliando a biodegradação das éter-aminas em amostras provenientes do processo de
flotação de uma mineradora do Estado de Minas Gerais, SILVA (2009) observou a
velocidade de degradação dos compostos à 30ºC e 35ºC, na concentração de 10mg.L-1
e
também estudou sobre a degradação à 35ºC na presença de 10mg.L-1
e 25mg.L-1
, estando
sempre em agitação o sistema. Foi observado que para as temperaturas maiores, a reação
possui maior velocidade de degradação, uma vez que o tempo de decomposição foi de 3
horas para 35ºC e 6 horas para 30ºC. Já para as diferentes concentrações de éter-aminas em
uma mesma temperatura, a reação de degradação foi mais acelerada para os menores
valores, tendo observado um tempo de 7 horas para 25mg.L-1
e 3 horas para a
decomposição de 10mg.L-1
de coletor. Determinar a taxa de degradação de certo insumo,
assim como a taxa de crescimento microbiano na presença desse mesmo composto é de
suma importância para o modelamento da cinética de reação, que visa estabelecer, a
velocidade das reações químicas e os fatores que as influenciam.
3.5.1. Modelos cinéticos de biodegradação de compostos orgânicos
Como o crescimento microbiano é resultado das atividades enzimáticas catabólicas e
anabólicas, tais processos, ou seja, a utilização do substrato ou a formação do produto
associada ao crescimento, também podem ser descritos em termos quantitativos, com base
em modelos matemáticos de crescimento. Assim, a relação entre a taxa de crescimento
específico (µ) de uma população de microrganismos e a concentração de substrato (S) é
uma ferramenta valiosa nos processos de biodegradação (RAGHUVANSHI e BABU,
2010).
Esta relação é expressa por um conjunto de leis empíricas de velocidade que são
considerados como modelos teóricos. Vários modelos teóricos, como o modelo cinético de
Monod (MONOD, 1949), o modelo cinético Powell (POWELL, 1967), o modelo de
Haldane (ANDREWS, 1968), o modelo Luong (LUONG, 1986) e o modelo de Edwards
(EDWARDS, 1970) estão descritos na literatura e são frequentemente utilizados no
modelamento de cinéticas de crescimento versus concentração do substrato
(RAGHUVANSHI e BABU, 2010).
29
A cinética de Monod, um modelamento simples para o crescimento microbiano e adequado
para tratar dados de crescimento, mas não considera a inibição pelo substrato. É diferente
dos modelos clássicos na forma de introduzir o conceito de crescimento controlado pelo
substrato. Ele relaciona a taxa específica de crescimento (µ) com um único substrato
controlador do crescimento (S) através de dois parâmetros, a taxa máxima específica de
crescimento (µmax) e a constante de afinidade pelo substrato (Ks), conforme a equação 3.7
(RAGHUVANSHI e BABU, 2010):
SK
S
s max
Equação 3.7
mas essa equação apresenta dois parâmetros desconhecidos, µmax e Ks, e foi então
linearizada, sendo apresentada conforme a equação 3.8 (RAGHUVANSHI e BABU, 2010):
maxmax
111
S
Ks Equação 3.8
Assim, um gráfico de 1/µ versus 1/S tem como inclinação Ks/max e intercepto igual a
1/Max.
A presença de um composto facilmente metabolizável, misturado com alguns poluentes
orgânicos, pode aumentar a biodegradação do substrato secundário, o que é vantajoso tanto
no contexto ecológico, quanto na aplicação dos seres vivos no tratamento de resíduos, pois
alguns organismos têm a capacidade de degradar os poluentes. Isso ocorre com freqüência
em ecossistemas naturais, que geralmente são ambientes limitados de carbono e com uma
variedade de substâncias orgânicas presentes em baixas concentrações (SALEHI et al.,
2010). Nessa situação o modelo de Monod pode ser falho, pois, descreve apenas a
dependência da taxa de biodegradação sobre a concentração de biomassa. A limitação desse
modelo clássico é que a equação não leva em conta o fato de que células podem precisar de
outro substrato ou podem sintetizar um produto mesmo quando elas não crescem.
A equação original do modelo de Monod foi modificada por POWELL (1967),
introduzindo os termos de manutenção, expresso em termos da concentração de substrato
(Smin) e da taxa de manutenção (m). Essa alteração conduziu à equação 3.9:
30
m
SK
Sm
s
)( max
Equação 3.9
A relação entre o substrato e a taxa de crescimento microbiano (µ) durante a adaptação
biológica dos microrganismos, a partir de um poluente orgânico, pode ser quantificado
através da utilização de alguns modelos matemáticos que sofreram adaptações das equações
de derivadas, a partir de teorias sobre a inibição de um único substrato (SALEHI et al.,
2010).
A cinética de Haldane é outro modelo que trabalha com um crescimento indeterminado das
células, sendo que na realidade, uma concentração definida do substrato exerce um limite
acima do qual o crescimento microbiano cessa (SALEHI et al., 2010; LUONG, 1987).
O modelo de Haldane (ANDREWS, 1968) considera a inibição do crescimento pelo
substrato e é amplamente utilizado devido à simplicidade matemática (SHEN et al., 2009).
A taxa específica de crescimento (µ) é representada pela equação 3.10:
I
SK
SSK
S2
max
Equação 3.10
onde KI é a constante de inibição do substrato (mg.L-1
).
Para sistemas com altas concentrações do substrato inibitório, sendo S»Ks, a equação pode
ser simplificada conforme equação 3.11:
IK
SS
S2
max
Equação 3.11
Ou pode ser ainda linearizada, tornando-se a seguinte equação de Haldane, equação 3.12:
31
maxmax
11
Ig K
S Equação 3.12
Para os compostos auto-inibitórios, há também uma concentração crítica de substrato (Scrt)
acima da qual a taxa de remoção de substrato cai devido ao efeito de auto-inibição, que é
definida pela equação 3.13:
)( ISsrt KKS Equação 3.13
Outro modelo que considera o efeito inibitório do substato foi proposto por LUONG
(1987). Este modelo é baseado em certas suposições que incluem a fase lag e a de morte,
respiração endógena, substrato utilizado como fonte de energia, manutenção ou inibição
por produtos. Há incorporação da concentração crítica inibitória, Sm (mg.L-1
), conforme
equação 3.14:
n
mS S
S
SK
S
1max
Equação 3.14
onde n é o número inteiro positivo no modelo de Luong.
EWARDS (1970) estudou os motivos da inibição do substrato que podem ser a formação
de intermediários ou produtos, a atividade alterada de uma ou mais enzimas, a dissociação
de uma ou mais enzimas ou a formação de agregados metabólicos. Esse estudo também
focou no desenvolvimento de modelos de inibição que podem explicar a natureza altamente
complexa dos microrganismos que degradam compostos orgânicos e podem agir na
biodegradação de altas concentrações de substrato. Foram propostos modelos diferentes de
inibição que são derivados do modelo de Haldane, mas que descrevem os mecanismos que
causam a inibição do substrato em uma ampla gama de concentrações, conforme a equação
3.15:
K
S
K
SKS
S
I
S 12
Equação 3.15
32
onde Ks é a constante de afinidade do substrato, KI é a
constante de inibição do substrato (mg.L-1
) e K é uma constante positiva que aparece no
modelo de Edward.
ZISSI et al. (1999) utilizaram uma cultura pura de Stenotrophomonas maltophilia,
atualmente uma bactéria integrante do gênero Xanthomonas, capaz de utilizar a anilina
como única fonte de carbono, para a realização de experimentos cinéticos, com o objetivo
de desenvolver um modelo matemático que descrevesse, com precisão, as taxas de
crescimento e a utilização do insumo. Essas taxas foram bem descritas usando as
expressões de Monod, tendo o substrato como fator não limitante para o crescimento
microbiano, uma vez que a presença de uma fonte alternativa de carbono não reprimiu o
catabolismo da anilina, mas foi observada a utilização simultânea dos compostos.
SALEHI (2010) avaliou a taxa de degradação do p-nitrofenol (PNP), um composto muito
utilizado na produção de pesticidas, herbicidas e explosivos e que tem grandes impactos na
poluição ambiental, pela bactéria Rastonia eutropha. Considerando que o PNP na presença
do microrganismo forma produtos simples, uma reação autocatalítica foi assumida gerando
a equação 3.16:
cPP CkC
dt
dC
Equação 3.16
onde Cp e Cc são as concentrações de PNP e microrganismo, respectivamente, e k é um
coeficiente de segunda ordem. Aplicando a equação proposta por LUONG (1987),
µ=(µmS/Ks+S)(1−(S/Sm)n), mas considerando „n‟ igual a zero, esta equação foi reduzida,
sugerindo uma equação de Monod, como segue a equação 3.17:
pc
pcc
CK
CC
dt
dC
max Equação 3.17
onde Kc é a constante de Monod e µmax é a taxa máxima específica de crescimento. Ao
dividir a equação da reação catalítica (3.16) pela equação de Monod (3.17) e integrar os
termos, foi obtida a equação 3.18:
33
pc
pc
cc
c
CK
CK
KCC
C
0
0
max
0
ln1
Equação 3.18
onde Cc0 e Cp0 são as concentrações iniciais de bactérias e PNP, respectivamente.
Fazendo algumas substituições matemáticas nesta equação 3.18, foi encontrada a equação
3.19 para descrever a taxa de conversão do PNP em função apenas da concentração inicial
desse composto e da concentração inicial de células:
pc
pc
pc
p
pCKC
CK
CKC
dt
dC0
0
max ln
Equação 3.19
Nessa equação 3.19, os três parâmetros cinéticos, µmax, K, Kc, devem ser determinados
experimentalmente em função da concentração de PNP e do tempo. O coeficiente
de determinação (R2) deste modelo foi calculado como 98,3%, determinando que a
aplicabilidade deste modelo cinético de biodegradação de PNP foi razoavelmente bom.
RAGHUVANSHI e BABU (2010) estudaram sobre a biodegradação do metil iso-butil
cetona (MIBK), um solvente utilizado na fabricação de tintas e borrachas, considerado um
composto orgânico volátil (COV), que é altamente tóxico para a natureza e tem efeitos
adversos significativos em seres humanos e animais. Os microrganismos utilizados como
uma cultura mista foram amostrados em uma planta de tratamento de efluentes por lodos
ativados. Inicialmente foi observado que o aumento da concentração de MIBK, entre 200 e
700mg.L-1
, implicou em um aumento correspondente da fase lag dos microrganismos e,
consequentemente, a degradação ocorreu em um maior intervalo de tempo. Esse resultado
preliminar sugeriu que a concentração inicial de MIBK teve um efeito significativo sobre a
taxa de biodegradação. Observando o efeito do tempo na concentração da biomassa celular,
pode ser analisado que a concentração da biomassa apresentou um aumento exponencial até
que ocorresse total depleção de MIBK, mas esse aumento foi observado entre as
concentrações de 200 a 500mg.L-1
, não sofrendo efeitos inibitórios desse composto
orgânico. Mas, acima dessa concentração, o crescimento da biomassa não acompanhou a
34
tendência exponencial, indicando um aparente efeito inibitório do substrato sobre os
microrganismos.
Como a degradação do contaminante ocorreu por causa da atividade microbiana, sabe-se
que a cinética de degradação do MIBK está intimamente relacionada com a cinética do
crescimento microbiano. Assim, a concentração da biomassa obtida anteriormente e a
concentração do substrato nos diferentes intervalos para as várias concentrações iniciais de
MIBK, foram utilizados para calcular a taxa de crescimento específico (µ), determinada
pela equação 3.20:
dt
dx
x
1 Equação 3.20
onde µ representa a taxa de crescimento específico (h-1
), x é a concentração da biomassa
(g.L-1
) no tempo t (h), e dt é mudança no tempo (h) para a alteração da concentração da
biomassa, dx. Após a integração, a equação 3.20 pode ser apresentada pela equação 3.21,
onde, x0 é a concentração inicial de biomassa (g.L-1
) no t=0.
txx 0lnln Equação 3.21
Esses dados foram plotados em um gráfico de (1/µ) em função de (1/S), conforme o modelo
de Monod, e o coeficiente de determinação (R2) obtido foi de 49,7%. Para o modelo de
POWELL (1967), onde só foram analisados os dados da fase log através da regressão dos
dados, o R2 obtido foi 53,3%. Já o modelo de Haldane (ANDREWS, 1968), que foi
desenvolvido com os dados da fase log, o R2 encontrado foi de 70,2%. Utilizando os
mesmos dados da fase log, as constantes cinéticas para o modelo de LUONG (1987)
determinaram R2 de 90,4%, enquanto que para o modelo de EDWARD (1970), que possui
a vantagem de incorporar o termo [1+ (S/K)] no denominador e incluir uma constante
positiva K, o (R2) foi de 78,6%. Dessa forma o melhor modelo testado foi o de Luong, mas
não se ajustou completamente aos dados.
A taxa de desaparecimento do substrato foi dependente da sua concentração e a cinética de
segunda ordem depende tanto da concentração de substrato e da biomassa ou da
35
concentração de substrato e do tempo. Considerando que a biomassa é diretamente
proporcional ao tempo, tem-se a equação diferencial de ordem dois. Verificou-se então que
tanto a cinética de ordem um e a de ordem dois não foram suficientes para explicar a
cinética de biodegradação do MIBK. Estes conceitos e as dificuldades matemáticas levaram
à determinação de outro modelo de ordem três, conforme mostrado na equação 3.22
(BRUNNER e FOCHT, 1984):
aESkdt
dS 1
Equação 3.22
onde k1 é a constante de proporcionalidade (tempo-1
), E é a concentração de células e a é a
constante de proporcionalidade (biomassa/concentração-1
/tempo-1
). Depois da integração e
simplificação a equação 3.22 pode ser reduzida conforme equação 3.23:
2
21
tkkY Equação 3.23
onde t
aEk 2 ,
0
00ln1
S
kPS
tY t e
t
tktk
O keSP 0
2
22
1
1
.
P é a taxa de formação de produto (CO2), que está diretamente relacionada com a alteração
da concentração de biomassa. O modelo de ordem três incluiu o termo para explicar a
formação de biomassa, que pode ser medida em termos de P.k0 e S0, que são a taxa
constante de ordem zero e a concentração do substrato no tempo zero, respectivamente.
Assim, os valores obtidos dos R2 para a cinética de ordem três foi de 93,7-99,4%, indicando
que o modelo cinético de ordem três é o mais adequado para explicar a taxa de
biodegradação do MIBK (RAGHUVANSHI e BABU, 2010).
SHEN et al.(2009) investigaram sobre a degradação biológica do 2,4,6-trinitrofenol (TNP),
um composto de difícil degradação biológica e que é tóxico para plantas, microrganismos,
animais e humanos, causando sérios impactos ambientais, pela bactéria Rhodococcus sp.
NJUST16 em um meio mineral, contendo várias concentrações de TNP. Inicialmente
observaram que uma maior concentração de inóculo reduziu a fase lag e ajudou o sistema a
36
chegar na fase log mais rapidamente. Os resultados mostraram uma tendência de aumento
da taxa específica de crescimento (µ) como consequência do aumento da concentração de
TNP, mas isso ocorreu até 60mg.L-1
, pois a partir dessa concentração, até 800mg.L-1
, µ
diminuiu mesmo ocorrendo o aumento da concentração de substrato disponível. Essa
tendência de declínio do crescimento microbiano além de 60mg.L-1
de TNP indicou que
esse composto é um tipo de substrato inibidor. Assim, sabendo-se que o substrato em
questão tem efeito inibitório em determinadas concentrações, foi utilizado o modelo de
Haldane para encontrar os valores de µmax, Ks e Ki, estando esses de acordo com os
intervalos encontrados na literatura. O coeficiente de determinação (R2) encontrado foi
93,58%, indicando que os dados se enquadraram no referido modelo matemático.
COKGOR et al. (2009) analisaram as características da biodegradação aeróbia de um
efluente industrial contendo uma mistura de compostos orgânicos solúveis, os quais
apresentaram diferentes características de biodegradação. O sistema de tratamento aeróbio
era do tipo lodos ativados, sendo utilizadas as taxas de DQO para avaliação do sistema.
Foram identificados quatro tipos de compostos biodegradáveis, mas a cinética de
biodegradação encontrada para cada um deles foi significativamente diferentes, e, além
disso, a concentração inicial do substrato apresentou um efeito de inibição sobre o
crescimento da biomassa heterotrófica. Assim, o sistema foi modelado com base no modelo
de degradação de Haldane, que considera o efeito inibitório do substrato e no qual a fase
logarítmica de crescimento microbiano inicial foi seguida por etapas consecutivas de
degradação dos substratos.
HUSSAIN et al. (2009) estudaram sobre as taxas de degradação do endosulfan, um
inseticida organoclorado que é utilizado mundialmente na agricultura como parte do
controle de pragas, e é considerado um contaminante do solo, ar e ambientes aquáticos,
pela bactéria Pseudomonas aeruginosa. Foram testadas as concentrações de 50 à 250mg.L-1
do composto, variando a cada 50mg.L-1
. Os resultados revelaram que a cinética de
degradação variou de acordo com a concentração inicial do contaminante pois a curva de
degradação para 10, 200 e 250mg.L-1
foi quase linear, assim como a curva dos testes
controles sem inóculo. Mas para as concentrações de 50, 100 e 150mg.L-1
, a curva foi
côncava para baixo, apresentando uma degradação maior do que nos controles. Diante
37
dessas diferenças, foram testados os modelos cinéticos de ordem zero, Monod com e sem
crescimento, primeira ordem, logística e logarítmica, de acordo com as equações da Tabela
3.1.
Tabela 3.1. Equações utilizadas para avaliar a biodegradação do endosulfan com e sem crescimento
microbiano (Fonte: HUSSAIN et al., 2009).
Modelo Equação na forma integral
Ordem Zero tkSS 10 Equação 3.24
Monod, sem
crescimento tkSSSS
SKs 100
0
ln
Equação 3.25
Primeira Ordem tkeSS 3
0
Equação 3.26
Logística tXSk OOe
S
XXSS
4
0
000
1
Equação 3.27
Monod, com
crescimento tXSX
XKXS
S
SK Ss max00
0
00
0
lnln
Equação 3.28
Logarítmica teXSS max100
Equação 3.29
S = concentração de substrato; S0 = concentração inicial do substrato; Xo = quantidade de substrato necessário
para produzir a população inicial; X = quantidade de substrato para produzir a densidade populacional; Ks =
concentração de substrato na qual a taxa decrescimento é metade da taxa máxima; µmax = taxa máxima de
crescimento específico; k1 = µmaxXo; k3= µmaxXo/Ks; k4 µmax/Ks
A Tabela 3.2 apresenta os valores iniciais de concentração de endosulfan e o melhor
modelo ajustado para cada situação.
38
Tabela 3.2. Parâmetros dos modelos de cinética de degradação de substrato adequados para as diferentes
concentrações iniciais de endosulfan pela P. aeruginosa (Fonte: HUSSAIN et al., 2009)
Concentração
inicial de
endosulfan
(mg.L-1
)
Modelo
Taxa constante
Ks
Coeficiente de
determinação
para os dados
ajustados (R2)
10 Monod sem crescimento k1 = 0,37 ± 0,012a 4,9 ± 0,002 0,99
50 Monod com crescimento µmax = 14,83 ± 0,2b 10,2 ± 0,06 0,89
100 Monod com crescimento µmax = 17,50 ± 0,34b 11,5 ± 0,03 0,74
150 Monod com crescimento µmax = 14,40 ± 0,52b 10,9 ± 0,001 0,78
200 Ordem zero k1 = 4,03 ± 0,20a NAc 0,98
250 Ordem zero k1 = 4,10 ± 0,24a NAc 0,99
Neste mesmo trabalho foi monitorado o crescimento de P. aeruginosa MN2B14, através da
densidade óptica (DO). Os resultados revelaram que o crescimento das bactérias apresentou
um mesmo perfil em relação aos testes iniciais de degradação, pois para as concentrações
de 10, 200 e 250mg.L-1
não houve aumento significativo na DO com o tempo, mas um
aumento substancial na DO foi observado para as concentrações iniciais de 50, 100
e 150mg.L-1
, conforme ilustrado na Figura 3.7 (HUSSAIN et al., 2009).
Figura 3.6. Crescimento de P. aeruginosa, analisado pela densidade óptica, em relação ao tempo, em
diferentes concentrações iniciais de endosulfan (Fonte: HUSSAIN et al., 2009).
39
Esses resultados do crescimento microbiano sugerem que a concentração de insumo inibe o
crescimento das bactérias em determinadas concentrações (HUSSAIN et al., 2009).
STANCHEV et al. (2008) utilizaram o fungo Aspergillus awamori para estudar sobre a
biodegradação do catecol, um bezenodiol, como única fonte de carbono nos nutrientes do
sistema. Foram determinados os valores das constantes cinéticas dos modelos de Andrew e
Harris para as concentrações de 1,0, 2,0 e 3,0g.L-1
de substrato disponível. Os resultados
mostraram que para a concentração inicial de 1,0g.L-1
, a biodegradação ocorreu em
condições de limitação de substrato, mas para as concentrações de 2,0 e 3,0g.L-1
, processo
aconteceu na presença de inibição pelo substrato. Dessa forma, de acordo com a
concentração inicial de carbono disponível no meio, um determinado modelamento cinético
tornou-se mais ajustado aos dados.
CHEN et al.(2008) avaliaram a biodegradação de fenantreno, um hidrocarboneto aromático
policíclico, por uma cultura de Sphingomonas sp., isolado de um sedimento de manguezal.
Foram testadas diversas condições de temperatura (20, 25, 30 e 35°C), razão
carbono:nitrogênio (100:1, 60:1, 30:1 e 10:1), concentração de fenantreno (5, 25, 35,
55mg.kg-1
de sedimento), salinidade (5, 15, 25, 35ppt) e tamanho do inóculo (103, 10
4, 10
5,
106NMP.g
-1 de sedimento), e os dados foram utilizados para ajustar o modelo cinético de
Monod e também um modelo de primeira ordem. Os resultados dos parâmetros cinéticos
mostraram que o modelo de primeira ordem se ajustou melhor aos dados, sendo que os R2
estiveram entre 0,69 e 0,99.
PRIYA et al. (2009) avaliaram a biodegradação do formaldeído, uma substância química
fundamental para a produção de penta eritritol, etileno glicol , resinas sintéticas, produtos
de papel, processamento de madeira, tintas, remédios e drogas, além de ser usado como
desinfetante para matar alguns insetos, presente em águas residuárias, através de um reator
anaeróbio de leito fixo, e a eficiência do processo foi analisada através da DQO. Diferentes
modelos matemáticos foram aplicados aos dados do reator, sendo que o modelo de segunda
ordem, conforme Equação 3.30, se ajustou melhor aos dados, sendo que a taxa de remoção
do substrato (K2(s)) foi de 3,2h-1
.
40
2
0
2 .
S
SK
dt
dss
Equação 3.30
onde: ds/dt – taxa de remoção do substrato (g.L-1
.d-1
)
K2(s) – taxa constante de remoção de substrato (segunda ordem)
S e S0 – concentração do substrato no afluente e no efluente (mg.L-1
)
3.5.2. Microrganismos degradadores de aminas
As bactérias são microrganismos procariontes, não contendo membrana nuclear e sem
estruturas intercelulares comuns aos eucariotos. A reprodução bacteriana ocorre com
grande rapidez, dando origem a um número muito grande de descendentes em apenas
poucos minutos (TORTORA, 2005).
O metabolismo bacteriano pode ser caracterizado como todas as reações químicas que
ocorrem na célula, destinadas a atender as necessidades biológicas dos organismos vivos,
incluindo tanto as reações que produzem energia como as que utilizam a energia para a
biossíntese ou outras funções celulares. A célula transforma a energia existente em
compostos químicos ou na luz, em energia útil ao seu funcionamento, que é a energia
química presente em certos compostos, principalmente no ATP.
As bactérias possuem grande variedade de metabolismos, visto que podem utilizar vários
substratos ou compostos sob as mais variadas condições de ambiente. Os processos
metabólicos podem ser autotróficos, quando a fonte de carbono é o CO2, ou heterotróficos,
quando a fonte de carbono são compostos orgânicos. Estes dois grupos são divididos em
quatro grupos fisiológicos, tendo como base a fonte de energia utilizada na biossíntese,
conforme descrito na Tabela 3.3. Entre os grupos fisiológicos apresentados na Tabela 3.3,
os quimioheterotróficos são os mais abundantes na natureza, visto que a disponibilidade de
compostos orgânicos na natureza é maior.
41
Tabela 3.3. Classificação nutricional das bactérias (TORTORA, 2005).
Grupo nutricional Fonte de Carbono Fonte de Energia
Quimioautotrófico CO2 C inorgânico
Quimioheterotrófico C orgânico C orgânico
Fotoautotrófico CO2 Luz
Fotoheterotrófico C orgânico Luz
A respiração é um processo de geração de ATP em que as moléculas são oxidadas e o
aceptor final de elétrons é quase sempre uma molécula inorgânica. Quando o organismo é
aeróbio, há utilização de oxigênio no metabolismo, e o aceptor final de elétrons é o O2, mas
quando o organismo é anaeróbio, não há utilização de oxigênio na respiração, e o aceptor
final de elétrons é uma molécula inorgânica diferente do O2, como NO3-, SO4
2-, CO3
2-
(TORTORA, 2005). Quando o aceptor final de elétrons é uma molécula orgânica, o
processo metabólico é caracterizado como fermentação, o qual também não requer a
presença do oxigênio e não participa do ciclo de Krebs, ocorrendo a oxidação incompleta
da molécula de glicose.
A quantidade de ATP gerada na respiração anaeróbia varia com o microrganismo e a via,
mas devido à somente uma parte do ciclo de Krebs funcionar sob condições anaeróbias, e
desde que nem todos transportadores participam da cadeia de transporte de elétron nessa
respiração, o rendimento de ATP nunca é tão alto quanto na respiração aeróbia. Já para a
fermentação, somente uma ou duas moléculas de ATP, para cada molécula inicial é
formada, pois grande parte da energia inicial do composto permanece nas ligações químicas
dos produtos orgânicos finais (TORTORA, 2005).
Para a maioria das bactérias, o pH ótimo de crescimento se localiza entre 6,6 e 7,5.
Entretanto há bactérias que se desenvolvem em pH9,0 e outras bactérias que crescem em
pH 1 (PELCZAR, 1996). Os requisitos nutricionais das bactérias incluem nitrogênio,
enxofre, fósforo, vitaminas e elementos metálicos como sódio, potássio, cálcio, magnésio,
ferro, cobalto, cobre e níquel. Algumas espécies necessitam ainda de pequenas quantidades
adicionais de elementos como selênio, vanádio ou boro.
42
Dentre as bactérias já reportadas na literatura com capacidade de degradar aminas pode-se
citar Pseudomonas putida (VAN GINKEL et al. 1995; YOSHIMURA et al., 1980;),
Xanthomonas sp (DEAN-RAYMOND e ALEXANDER 1997), Bacillus polymyxa (DEO e
NATARAJAN 1998b), Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia (KROON e
VAN GINKEL, 2001). YOSHIMURA et al. (1980) estudaram a biodegradação de várias
aminas graxas utilizando a bactéria Gram negativa P. putida, através do monitoramento da
Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO). Observaram que essa bactéria pode degradar
amina primária n-C12H25NH2 e outras alquilaminas primárias, mas não alquilaminas
secundárias e terciárias e surfactantes catiônicos. Além disso, essa linhagem isolada pode
utilizar n-C12H25NH2 como única fonte de carbono e nitrogênio para o seu crescimento. A
biodegradação da dodecilamina pela Pseudomonas sp. foi estudada por VAN GINKEL et
al. (1995) através do monitoramento da DBO e observaram que em 7 dias houve a
degradação de cerca de 80% da amina pela referida bactéria. Em ambos os estudos não
foram investigados os possíveis intermediários ou produtos formados durante o processo de
degradação.
DEAN-RAYMOND e ALEXANDER (1997) utilizaram técnicas padrões de medidas de
oxigênio dissolvido no meio para avaliar a degradação de 10 compostos de amônio
quaternário, nas concentrações de 10, 25 e 100µg.mL-1
, sendo que as concentrações de
oxigênio foram medidas em intervalos de 5 a 8 dias, em um período de 60 dias. Os
compostos cloreto de benziltrimetilamônio, brometo de feniltrimetilamônio, brometo de
benziltrietilamôniocloreto, brometo de didodecildimetilamônio, brometo de
dioctadecildimetilamônio, cloreto de hexadecildimetilbenzilamônio, cloreto de
fenildimetilbenzilamônio e hyamine 10-X foram resistentes ao ataque dos microrganismos
inoculados. O composto brometo de deciltrimetilamônio (DTM) foi completamente
degradado dentro de 8 a 10 dias, para as três concentrações analisadas, mas, a degradação
do brometo de hexadeciltrimetilamônio foi evidente apenas nos níveis de 10 e 25µg.mL-1
de insumo, em um tempo de 15 a 43 dias de observação. Para este mesmo composto, a
ausência de biodegradação em 100µg.mL-1
foi associada à sua toxicidade. Os
microrganismos utilizados foram retirados de amostras do solo e também de efluente
doméstico, e foram posteriormente caracterizados, sendo que duas colônias apresentaram
crescimento satisfatório em placas contendo meio ágar nutriente, diferenciando-se pelas
43
colorações branca e amarelada. As colônias diferenciadas eram compostas por bacilos
Gram-negativos com flagelo polar, oxidase positivas e não produziam pigmentos
fluorescentes. Assim, essas culturas foram identificados como Pseudomonas e
Xanthomonas.
O Bacillus polymyxa, espécie de bactéria renomeada como Paenibacillus polymyxa após
uma análise comparativa da sequência do RNAr 16S (ASH et al.,1993), é uma bactéria
Gram positiva, quimiorganotrófica fixadora de nitrogênio e anaeróbia facultativa, que
produz diversos metabólitos como ácido acético, fórmico, lático e succínico, além de
etanol. Na presença de oxigênio esse microrganismo também produz polissacarídeos
extracelulares que formam sua cápsula celular. Além disso, seu metabolismo é dependente
de cálcio, pois esse íon é requerido durante a produção de enzimas, como as amilases e
proteases, e também para a síntese de dipicolinato de cálcio, um componente essencial para
a formação de endosporos (VASAN et al., 2001).
CHOCKALINGAM et al. (2003), a fim de avaliar se o crescimento da Bacillus polymyxa é
inibido ou não pela presença de coletores orgânicos, realizou estudos de crescimento
bacteriano em concentrações de 50, 100 e 200mg.L-1
de isopropil xantato de sódio, acetato
de dodecilamônio e oleato de sódio. Para o xantato não foi observada a fase lag,
caracterizada como fase de adaptação às condições estabelecidas, e a fase estacionária,
onde não ocorre crescimento microbiano e inicia uma competição por espaço e alimento,
foi alcançada após 3 horas para as concentrações de 50 e 100mg.L-1
, e após 5 horas quando
a concentração do coletor foi de 200 mg.L-1
. Foi encontrado pH final 3 para todas as
concentrações testadas desse coletor. Já para as análises com acetato de dodecilamônio, a
fase lag foi de 3 horas para todas as concentrações e a fase estacionária foi observada após
5 horas para 50mg.L-1
e 6 horas para 100 e 200mg.L-1
. Enquanto o pH final foi de 3,5 para
as duas primeiras concentrações, o valor para a concentração máxima foi igual a 4. Para o
oleato de sódio não houve fase lag na presença de qualquer concentração desse coletor,
enquanto que a fase estacionária foi de 3 horas para 50mg.L-1
e de 4 horas para as demais
concentrações. O pH3,5 foi encontrado em todos os testes com esse coletor. O número
máximo de células obtidas nestes testes foi de 109células/mL em todos os casos. Estes
resultados indicaram que o B. polymyxa, uma bactéria associada aos depósitos de minerais,
44
pode ser cultivada na presença destes coletores orgânicos e há indicação de esporulação das
células durante o crescimento na presença dos insumos. Foi observado também que a
biodegradação do acetato de dodecilamônio é bastante efetiva durante o crescimento
bacteriano do B. polymyxa.
KROON e VAN GINKEL (2001) isolaram grupos de bactérias utilizando compostos
derivados de aminas alifáticas, como dodecildimetilamina e dimetilamina, sendo que no
meio de cultura contendo o primeiro composto houve o crescimento de apenas um tipo de
colônia caracterizada como ADM12D e nas placas contendo o segundo insumo, foram
caracterizados os grupos DMA1, DMA2, DMA3 E DMA4. Todos estes grupos isolados
eram de bacilos Gram-negativos e oxidase e catalase positivos. Os grupos ADM12D, capaz
de degradar dodecildimetilamina, e DMA1, que apresentou maior taxa de crescimento e foi
capaz de degradar dimetilamina, foram selecionados e estudadas as seqüências do 16S
rDNA. A seqüência do grupo ADM12D apresentou similaridade de 99,6% com
Burkholderia cepacia, sendo que o perfil de ácidos graxos celulares foi característico para
esta espécie e a utilização nutricional e propriedades bioquímicas de B. cepacia são
similares para o isolado descrito por KROON et al. (1994). Já o grupo DMA1, identificado
também através da utilização nutricional e pelo conjunto de ácidos graxos celulares,
apresentou uma seqüência com similaridade de 99,3% com Stenotrophomonas maltophilia
(KROON e VAN GINKEL, 2001).
B. cepacia é capaz de degradar dodecilmetilamina liberando dimetilamina no sistema,
enquanto que S. maltophila degrada dimetilamina, formando amônio. Uma cultura mista
contendo estes microrganismos foi inoculada em um reator, contendo apenas
dodecildimetilamina como fonte de carbono e energia, e após duas semanas não foi
encontrado o insumo, nem dimetilamina, subproduto de degradação do primeiro. Esta
ausência de compostos derivados de aminas graxas sugeriu total mineralização e
caracterizou que B. cepacia e S. maltophila, presentes em uma cultura mista, são capazes de
mineralizar completamente dodecildimetilamina (KROON e VAN GINKEL, 2001).
Pesquisas realizadas por AFZAL KHAN et al. (2006) para analisar a eficiência de
degradação do para-diaminobenzeno pelo grupo Pseudomonas sp. ST-4 indicou que, para
45
um efluente com demanda bioquímica de oxigênio inicial de 470mg.L-1
, 84% do insumo foi
biodegradado.
Em outra pesquisa, WANG et al. (2007) isolaram um grupo de bactérias da planta de
tratamento por lodos ativados, de efluentes petroquímicos no nordeste da China, ricos em
pentil-amina, uma amina primária alifática, e anilina, uma amina aromática. De acordo com
as características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas, este grupo, chamado de
PN1001, foi identificado como membro da família Pseudomonas. A maior taxa de
biodegradação dessa mistura de aminas aromáticas foi encontrada para uma concentração
de 150 a 200mg.L-1
de insumo, em 24 horas de reação e com, no máximo, 6mgO2.L-1
de
oxigênio dissolvido, à 30°C e pH7,0. Dessa forma, a eficiência de remoção dos
contaminantes pode chegar a 91%.
Os testes realizados por ARAÚJO (2007), analisando amostras brutas provenientes da
barragem de rejeitos da flotação do minério de ferro, para identificação de microrganismos
responsáveis pela biodegradação das aminas, mostraram que nas amostras reais foi
identificada a Serratia marcescens bizio 1823AL
e nas amostras da flotação em bancada, foi
identificada a Enterobcter cloacae. Tanto a Serratia marcescens como a Enterobcter
cloacae são bactérias Gram-negativas, não esporuladas, móveis e anaeróbias facultativas.
Os estudos realizados sobre o crescimento dessas bactérias na presença e ausência de
minério de ferro, composto de 52,54% de Fe, 32,5% de SiO2, 0,026% de P, 0,012% de Ca,
0,21% de Al, 0,017% de Mn e 0,012% de Mg, demonstraram que o minério de ferro exerce
papel fundamental no metabolismo microbiano, fornecendo, provavelmente, os minerais
essenciais para o seu crescimento (ARAÚJO et al., 2010; ARAÚJO 2007).
Serratia marcescens ITRC S7, identificada por SINGH et al. (2007), é um potente isolado
bacteriano aeróbio, capaz de degradar pentaclorofenol (PCP), sendo passível a utilização
deste grupo de microrganismo para processos de bioremediação em ambientes
contaminados com este composto.
46
3.5.3. Metabolismo e bioquímica de degradação
Algumas bactérias possuem o metabolismo dependente da presença de um determinado
composto ou íon. Os testes realizados em bancada sobre o comportamento das bactérias, na
presença e ausência de minério de ferro, confirmam essa necessidade nutricional, sendo que
o metabolismo da Serratia marcescens é fundamentalmente dependente da presença do
minério de ferro, o qual fornece alguns minerais essenciais (SILVA, 2009; ARAÚJO,
2007).
Estudo realizado por SILVA (2009) mostrou que nas amostras contendo éter-amina e meio
de cultura líquido, houve biodegradação lenta, sendo que em 7 dias apenas 38% do insumo
havia sido degradado, mas quando adicionado minério de ferro e sulfato ferroso, a
biodegradação em 7 dias foi de 73% a 77%, respectivamente. Pode-se então concluir que a
degradação pela ação de microrganismos foi intensificada pela presença de sais de ferro e
minério de ferro, em relação à amostra com meio de cultura e éter-amina, pois, esses
minerais forneceram os elementos essenciais para o metabolismo microbiano.
YOSHIMURA et al. (1980) estudaram a biodegradação de várias aminas graxas pela
bactéria Pseudomonas putida. Após a constatação de que essa bactéria degrada
alquilaminas primárias, que são aminas alifáticas, mas não degrada outros derivados, foram
sugeridos duas prováveis vias de biodegradação, como: (1) ocorre desaminação oxidativa
pela enzima amina oxidase, formando ácidos graxos correspondentes e amoníaco, ou (2) ω-
oxidação do grupo metil terminal, resultando em ácido graxo ω-amino, seguido por β-
oxidação em qualquer caso.
Mais recentemente VAN GINKEL et al. (2005) investigaram a degradação de alquilaminas
por Pseudomonas sp e sugeriram que a bactéria inicia a degradação através da clivagem C-
N, seguida pela oxidação da amina para aldeído e por fim a formação de ácido graxo.
NISHIYAMA et al. (1995) utilizando uma amostra de lodo ativado de uma estação
municipal de tratamento de efluentes domésticos de uma cidade do Japão, estudaram sobre
a biodegradabilidade dos seguintes sais quarternátios de amônio: decil-, dodecil-, tetradecil-
, hexadecil- e octadeciltrimetilamônio, em 117 horas de incubação. Foi observado, em
47
todos os experimentos, a formação de trimeti-, dimetil- e metilamina durante o processo de
degradação, mas ao final das 117 horas, esses produtos não foram encontrados no meio,
assim como o substrato adicionado inicialmente. Diante desses dados, foi proposto que o
sal de trimetilamônio é inicialmente degradado em trimetilamina por N-dealquilação.
Seguindo a rota de degradação, esse produto é então degradado à dimetilamina por N-
dimetilação, a qual é metabolizada em metilamina pela mesma reação. Não foram
desenvolvidos estudos de biodegradação com os microrganismos isolados desta amostra de
lodo ativado, para observar quais são as etapas limitantes do processo de biodegradação
desses sais. A Figura 3.8 ilustra o processo de degradação dos sais de trimetilamônio pela
amostra de lodo ativado.
Figura 3.7. Proposta de degradação de sais de amônio por amostra de lodo ativado (Fonte: NISHIYAMA et
al., 1995).
Nos estudos de WANG et al. (2007) foi analisado a provável rota de degradação da anilina
presente em efluentes petroquímicos do nordeste da China, ricos em pentil-amina e anilina.
A presença de ambos os compostos foi importante no processo de degradação, sendo que
potencializou a quebra destes derivados de amina. A pentil-amina foi facilmente degradada
em derivados simples, como CO2 e NO-3. Durante o processo de degradação da anilina,
foram encontrados alguns produtos como p-aminofenol, m-aminofenol, o-aminofenol,
ácido oxálico, ácido malônico, ácido fórmico e outros produtos simples, como NH+
4 e NO-
2/NO-3. Com base nestes produtos, a via de degradação da anilina foi descrita da seguinte
forma: a anilina é desaminada, formando o p-aminofenol, que então é clivado em ácido
oxálico e malônico, e em seguida transformados em HCO-3. Depois da desaminação, NH
+4
é oxidado para NO-2 e NO
-3. Essa possível rota de degradação indica que o grupo, chamado
PN1001, caracterizado como membro da família Pseudomonas, possui um sistema multi-
enzimas capaz de clivar toda a estrutura química da anilina, uma molécula relativamente
resistente em sistemas de tratamento de efluentes.
48
O gênero Hyphomicrobium está amplamente distribuído na natureza pelo solo, água do
mar, água doce, águas frescas, água ácida de minas e esgoto. Muitas cepas foram isoladas
de habitats com deficiência de nutrientes, o que representa que são bons modelos para o
estudo da adaptação microbiana às condições de estresse. São organismos Gram-negativos
que são capazes de crescimento aeróbio, mas o crescimento em condições anaeróbias na
presença de nitrato também é observado. Algumas cepas são capazes de formar uma
ligação permanente às superfícies sólidas e têm sido observadas em seu habitat natural
acompanhadas de fungos e algas. A característica marcante desse gênero é a capacidade de
utilizar compostos de apenas um carbono, como metanol e metilamina, como a única fonte
de carbono e energia (MOORE, 1981).
MEIBERG e HARDER (1978) analisaram a degradação aeróbia da trimetilamina e
dimetilamina pela Hyphomicrobium, utilizadas como única fonte de carbono e energia.
Através da cinética de utilização da trimetilamina, foi observado que há uma conversão
estequiométrica desta amina em dimetilamina durante a fase exponencial de crescimento
microbiano, o que torna aparente que o microrganismo foi incapaz de metabolizar a
dimetilamina e o crescimento foi exclusivamente devido à conversão da trimetilamina em
dimetilamina. Após a diminuição da concentração de trimetilamina, o catabolismo da
dimetilamina foi estimulado. Assim, acredita-se que quando a trimetilamina era
indetectável, o crescimento exponencial microbiano ocorreu exclusivamente à custa da
dimetilamina. Esses resultados sugerem que a dimetilamina é um intermediário do
metabolismo da Hyphomicrobium, ao usar a trimetilamina. No mesmo trabalho, utilizando
dimetilamina e metilamina como fonte de carbono e energia, foi observado mesmo perfil de
acúmulo e degradação, sendo que a dimetilamina foi inicialmente degradada, transformada
em metilamina, e após o decaimento dos níveis da primeira, a metilamina foi consumida
pelo metabolismo bacteriano, o que afirma que a dimetilamina é um intermediário
metabólico.
MEIBERG e HARDER (1978) realizaram os mesmos testes citado acima, mas em
condições anaeróbias de crescimento. Foi observado um padrão complicado de utilização
da trimetilamina, mas da mesma forma, o crescimento inicial se deu exclusivamente pela
oxidação da trimetilamina em dimetilamina, e durante a oxidação desta, houve pequeno
49
acúmulo de metilamina no sistema, sendo utilizada concomitantemente à dimetilamina.
Nestas análises, foi observado também inibição do crescimento bacteriano quando o
aceptor de elétrons, o nitrato, havia esgotado, mesmo ainda havendo carbono suficiente
para suportar o crescimento e que a presença de nitrito inibiu completamente o crescimento
do Hyphomicrobium.
De acordo com os resultados encontrados para os metabolismos aeróbio e anaeróbio,
MEIBERG e HARDER (1978) propuseram um esquema para o metabolismo de trimetil-,
dimetil- e metilamina pelo Hyphomicrobium, conforme mostrado na Figura 3.9.
Figura 3.8. Esquema proposto para o metabolismo da metilamina, dimetilamina e trimetilamina por
Hyphomicrobium. As enzimas da via são: (l), trimetilamina desidrogenase; (2) dimetilamina desidrogenase;
(3) γ-glutamilmetilamida sintetase; (4) enzima ainda não caracterizada; (5) N-metilglutamato desidrogenase;
(6) formaldeído desidrogenase; (7) formato desidrogenase (Fonte MEIBERG e HARDER, 1978).
Segundo VAN GINKEL e KROON (2005) existe uma interação metabólica entre os
microrganismos que degradam compostos derivados de aminas graxas, sendo que esta
relação pode ser de comensalismo ou de mutualismo. A maioria dos consórcios de
50
microrganismos degradadores de surfactantes possui relação de comensalismo, sendo que
há produção e liberação no meio, por um microrganismo, de uma substância que outra
espécie utiliza como substrato de crescimento (VAN GINKEL, 1996; NISHIYAMA et al.,
1995). A relação de mutualismo foi encontrada entre comunidades microbianas em
ambientes naturais, após estudos sobre a mineralização do alquilbenzenosulfonato linear e
do cloreto de deciltrimetilamônio (HRSAK et al., 1982; DEAN-RAYMOND e
ALEXANDER, 1977).
Ao analisar o metabolismo aeróbio do brometo de deciltrimetilamônio (DTM) por
Pseudomonas e Xanthomonas, DEAN-RAYMOND e ALEXANDER (1977) observaram
que apenas a segunda bactéria cresceu sozinha na presença deste insumo. Então, por meio
de técnicas de cromatografia, avaliaram os subprodutos no substrato, uma vez que não
ocorria completa degradação de DTM. Foram encontrados picos nos espectros dos
substratos, que caracterizaram o 7-carboxiheptiltrimetilamônio e o 9-
carboxinoniltrimetilamônio. Assim, sugeriram que essa bactéria oxida o carbono terminal
da cadeia longa alquil do composto quaternário de amônio quebrando-o em unidades acetil
pela β-oxidação. Ácidos carboxílicos, em pequenas quantidades, também foram
encontrados no substrato. A presença destes compostos no substrato, liberados pelas
Xanthomonas, pode ser de grande importância como substrato para o crescimento das
Pseudomonas, pois, ambos os grupos de microrganismos em análise cresceram juntos na
presença de DTM. Provavelmente existe uma relação de mutualismo entre eles, sendo que
Pseudomonas fornece fatores de crescimento para Xanthomonas, e essas convertem o DTM
em compostos utilizados pelo metabolismo das outras.
A relação entre os microrganismos de uma cultura mista provavelmente depende das
condições ambientais. Por exemplo, em condições limitadas de fonte de carbono para uma
cultura mista de Burkholderia cepacia e Stenotrophomona maltophila, não há dependência
metabólica da primeira em relação à segunda, caracterizando uma relação comensal. Mas
em condições limitadas de nitrogênio, B.cepacia depende metabolicamente da produção de
amônio pelo metabolismo de S. maltophila, a qual é dependente da produção de
dimetilamina pela anterior. Neste caso, caracterizam uma relação de mutualismo, onde um
grupo dependente ativamente do outro (KROON e VAN GINKEL, 2001).
51
A Figura 3.10 ilustra as relações de comensalismo e mutualismo entre B. cepacia e S.
maltophila em condições limitante de carbono e excesso de nitrogênio (A) e em condições
limitantes de nitrogênio (B).
Figura 3.9. A. Cultura mista de B. cepacia e S. maltophila crescendo em meio com dodecildimetilamina como
única fonte de carbono e energia em relação de comensalismo. B. Relação de mutualismo em uma cultura
mista de B. cepacia e S. maltophila sob condições limitadas de nitrogênio. (Fonte: KROON e VAN GINKEL,
2001).
As bactérias são capazes de satisfazer suas necessidades de nitrogênio total, e também de
carbono, através da degradação de aminas e amônia presentes no meio. DEO e
NATARAJAN (1998) estudaram sobre a remoção biológica de coletores em partículas de
minerais e puderam observar que os coletores derivados de aminas, acetato de
dodecilamônio (DDA) e isododecil oxipropil aminopropil amina (DA16), foram removidos
do sistema e foram também degradados pelo Bacillus polymyxa, bactéria utilizada nos
experimentos. Há indícios que levam à conclusão que um aldeído é formado quando as
aminas são oxidadas. A degradação da maioria das aminas forma H2O2 como produto
metabólico e suspeita-se que este produto é destruído pela catalase endógena, uma enzima
específica, conforme a equação 3.31:
52
Equação 3.31
Destruição de H2O2 pela enzima catalase endógena (Fonte: DEO E NATARAJAN, 1998a).
Segundo os autores, a biodegradação destes coletores ocorre por meio de reações em
sequências de acordo com as condições ambientais, envolvendo descarboxilação,
desaminação, hidrólise e oxidação. No entanto, o primeiro passo é sempre a degradação de
um aminoácido e outros produtos formados a partir de aminoácidos. A Figura 3.11 ilustra
este provável mecanismo de degradação da diamina utilizada (DEO e NATARAJAN,
1998a).
Figura 3.10. Provável mecanismo de degradação de diaminas. (Fonte: DEO E NATARAJAN, 1998a).
O NH3, produto da última reação, pode ser utilizado pelas bactérias como fonte de
nitrogênio e o ácido acético (CH3COOH), também presente nesta reação, pode entrar
diretamente no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) como fonte de carbono (DEO e
NATARAJAN, 1998a).
2222 21 OOHOH catalase
53
Similarmente ao que foi apresentado para a diamina, a biodegradação da dodecilamina
segue o esquema proposto na Figura 3.12, sendo que neste caso, o ácido acético entra
diretamente no metabolismo bacteriano.
Figura 3.11. Provável mecanismo de degradação de dodecilamina (Fonte: DEO e NATARAJAN, 1998a).
As propostas apresentadas acima se referem à aplicação de culturas puras no processo de
degradação. Porém o processo de degradação das aminas nas barragens de rejeito da
flotação de minério de ferro, onde existe uma variedade de microrganismos, ainda não é
conhecido, assim como quais fatores, biológico e/ou químico que teriam maior influência
no processo, e, principalmente, quais produtos estariam sendo formados.
3.6. RISCOS AMBIENTAIS ASSOCIADOS ÀS AMINAS
A preocupação com o impacto ambiental das atividades de mineração sempre foi um tema
bastante debatido. O uso de produtos químicos em processos de flotação se insere nesse
contexto porque muitos dos compostos usados na etapa de concentração acabam de alguma
forma sendo carreados para uma unidade de tratamento ou para as barragens de rejeito. A
introdução de altos níveis de aminas graxas pode ser prejudicial aos organismos aquáticos
(PRADYOT, 2002; CHAVES et al., 2001; BELIN, 1983).
54
Muitas aminas de cadeia carbônica inferior possuem efeitos nocivos para os seres vivos. A
toxicidade das aminas pode ser considerada de baixa a moderada, exceto da aziridina
(PRADYOT, 2002). Todas as aminas alifáticas de pequena cadeia carbônica irritam
fortemente a pele, olhos, membranas mucosas e vias respiratórias (BELIN, 1983). As
nitrosaminas são fortes carcinogênicos para animais e seres humanos e há evidências
provas para relacioná-las com o desenvolvimento de câncer nas mucosas estomacais
(ARAÚJO, 2007). Elas podem ser formadas pela reação de uma amina com um nitrito ou
podem ser produzidas pela ação de uma bactéria redutora de nitrato (PRADYOT, 2002).
Isto tem levado a maioria dos países europeus a proibir o emprego de compostos
nitrosamínicos em aditivos alimentares (KROSS et al., 1993).
Trabalhos financiados pela Empresa Clariant, para a éter-monoamina EDA-3B, apresentou
Dose Letal (DL50) de 1.536 ± 186 mg.kg-1
para ratos machos albinos, linhagem Wistar, e
1.425 ± 179mg.kg-1
para ratos fêmeas albinos, linhagem Wistar. Como a ABNT NBR
10.004 (2006) normaliza que o resíduo é classificado como tóxico se apresentar DL50 via
oral para ratos menor que 50mg.kg-1
, sabe-se que essa éter-amina não é tóxica, mas
exposições contínuas podem ocasionar um acúmulo dessa substância química no organismo
(CHAVES, 2001). GARCÍA et al. (2007) avaliou a toxicidade de aminas em meio aquático
para a bactéria Photobacterium phosphoreum e para o crustáceo Daphnia magna e os
resultados provaram que a bactéria mostrou-se mais sensível aos efeitos tóxicos da amina
estudada, apresentando DL50 entre 0,11 e 11mg.L-1
, enquanto o crustáceo apresentou DL50
entre 6,8 e 45mg.L-1
. Estudos realizados por PERES et al. (2000) indicaram que o coletor
Flotigam EDA se adsorve fortemente às partículas de quartzo no estágio de
condicionamento do coletor com a polpa. Nas concentrações em que se encontra em
efluentes industriais, o reagente é biodegradável e não apresenta riscos a organismos
usualmente empregados em testes de toxicidade.
A maioria dos compostos nitrogenados em águas naturais tende a se converter em nitrato.
Assim, todas as fontes de nitrogênio combinado, particularmente nitrogênio orgânico e
amônia, devem ser considerados como fontes potenciais de nitrato. As fontes primárias de
nitratos orgânicos incluem esgotos humanos e estrume de gado. Já para os nitratos
inorgânicos, que podem contaminar a água potável, destaca-se o nitrato de potássio e o
55
nitrato de amônio, ambos largamente utilizados como fertilizantes. Os nitratos ocorrem
naturalmente na água, em baixas concentrações, como produtos de estabilização aeróbia de
matéria orgânica nitrogenada. As concentrações mais elevadas ocorrem por estabilização de
esgotos, ou drenagem de áreas fertilizadas, ou ainda, oxidação de amônia de origem
industrial (BRANCO et al., 1977). Uma intoxicação crônica devido a altos níveis de nitrato
pode causar outros problemas à saúde, como por exemplo, efeitos cancerígenos
(BRUNING-FANN e KANEENE, 1993).
Nos Estados Unidos da América existem normas para a concentração de determinadas
aminas consideradas tóxicas (PERES et al., 2000), diferentes das utilizadas como coletores
da flotação, estabelecidas pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA – EPA –
Qualidade da Água, conforme dados da Tabela 3.4.
Tabela 3.4 – Valores de referência da concentração de aminas nas águas para consumo humano e efluentes, de
acordo com EPA/EUA (Fonte: PERES et al., 2000).
Parâmetro Concentração ng/L em água para
consumo humano*
Concentração ng/L em
efluentes*
N-nitrosodimetilamina 14 160000
N-nitrosodietilamina 8 12400
N-nitrosodi-n-butilamina 64 5868
N-nitrosodifenilamina 49000 161000
*Os valores refere-se ao risco de câncer de 10E-5.
56
CAPÍTULO 4 – MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Com o objetivo de sintetizar todos os passos que foram seguidos durante a execução da
metodologia, optou-se por criar um fluxograma (Figura 4.1), de forma que se possa
visualizar de uma maneira ampla e geral, o delineamento experimental contido nas
metodologias adotadas neste trabalho.
4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS
Os coletores orgânicos utilizados no presente trabalho foram a éter-monoamina Flotigam
EDA 3B e a éter-diamina Flotigam 2835, ambas produzidas e distribuídas pela empresa
Clariant®.
4.3. QUANTIFICAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS
4.3.1. Método Verde de Bromocresol (ARAÚJO et al., 2009)
Os métodos colorimétricos que envolvem o uso de corantes orgânicos foram utilizados
intensamente para análise qualitativa e quantitativa de surfactantes e sais de amônio
(MUKERJEE, 1956; AUERBACH, 1943). Estes métodos consistem na formação de sais
coloridos de amina-corante orgânico que são extraídos com solventes orgânicos. Estes
corantes orgânicos são solúveis em solução aquosa e insolúveis em solventes orgânicos e,
após a reação com os sais de amina, o composto formado torna-se solúvel em solventes
orgânicos. O método do verde do bromocresol é caracterizado por uma satisfatória acurácia
e precisão, possuindo uma detecção limite abaixo de 1mg.L-1
. A recuperação dessa
metodologia é de 98,53% (ARAÚJO et al., 2009).
57
Figura 4.1. Fluxograma evidenciando o delineamento experimental na fase do desenvolvimento
metodológico adotado.
Coleta das amostras do rejeito composto (RC) e do rejeito da barragem (RB)
Aquisição da cultura de
Serratia marcescens
(ATCC 13880O)
Teste de bidegradabilidade
das éter-aminas por S.
marcescens ATCC 138800 Isolamento em cultura pura
Caracterização
morfológica
Extração de DNA
PCR-16S
Sequenciamento
Análise filogenética
Desenvolvimento e
Validação do Orange II
DGGE
Testes de
biodegradação
Análise da
diversidade bacteriana
Cinética de
biodegradação
58
A amina na presença de verde de bromocresol pode formar dois tipos de compostos: em
soluções alcalinas é formado um sal de diamina de coloração verde, enquanto que em
soluções ácidas é formado um sal de monoamina de coloração amarelada (MUKERJEE,
1956; AUERBACH, 1943).
O princípio do método verde de bromocresol consiste na formação de um sal de amônio
quartenário, entre a éter-amina e o corante, em clorofórmio, e através da colorimetria é
medida a intensidade da cor formada que está diretamente relacionada com a concentração
de amina presente na solução. Assim, se há um sistema de duas fases, clorofórmio e
solução aquosa de verde de bromocresol, tamponada em pH5, coloca-se uma solução
diluída de sal amínico e se agita, o clorofórmio se tinge de amarelo. Dessa forma, através
da comparação com as curvas padrões, é possível determinar fotometricamente a
intensidade da tonalidade de amarelo fazendo uma quantificação indireta da éter-amina
presente na amostra.
Foram utilizados padrões de 5, 10, 25, 40, 50, 80 e 100mg.L-1
de éter-monoamina Flotigam
EDA-3B), éter-diamina (Flotigam F 2835) e de uma solução de 25% e 75% em massa de
éter-onoamina e éter-diamina respectivamente, para a elaboração da curva de calibração.
Colocou-se em um funil de separação de 250mL, 25mL de clorofórmio, adicionou-se 10mL
de solução de verde de bromocresol, acrescentou 10mL da amostra a ser quantificada.
Agitou-se o funil. Retirou-se o solvente orgânico, já com coloração amarelada, para
posterior leitura da absorbância no espectrofotômetro Biospectro SP220, no comprimento
de onda de 405nm, em cubeta de vidro de 10mm. O branco utilizado para a leitura foi feito
com 10mL de água destilada, substituindo a amostra.
4.3.2. Método do Orange II
Este método de análise colorimétrica de éter-aminas foi desenvolvido no presente trabalho.
O processo de extração é semelhante ao método do Verde de Bromocresol, sendo utilizado
o Orange II como corante no sistema. A absorbância foi determinada no comprimento de
onda de 485nm.
59
4.3.2.1. Validação do método químico do Orange II (INMETRO, 2003)
É fundamental que os laboratórios demonstrem, através da validação, que os métodos de
ensaio que executam conduzem a resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida.
Se um método existente for modificado para atender aos requisitos específicos, ou um
método totalmente novo for desenvolvido, o laboratório deve se assegurar de que as
características de desempenho do método atendem aos requisitos para as operações
analíticas pretendidas. Para tanto, deve-se ser feita a validação, comprovação através do
fornecimento de evidências objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso
específicos pretendidos foram atendidos.
De acordo com as orientações do INMETRO, foram realizados testes para a padronização
do método de quantificação das éter-aminas utilizando o orange II como corante. Os testes
específicos para a validação foram faixa de trabalho e faixa linear de trabalho e limite de
detecção.
- Faixa de Trabalho e Faixa Linear de Trabalho: Para qualquer método quantitativo, existe
uma faixa de concentrações do analito ou valores da propriedade no qual o método pode ser
aplicado, chamada de faixa de trabalho. A faixa linear de trabalho de um método de ensaio
é o intervalo entre os níveis inferior e superior de concentração do analito no qual foi
demonstrado ser possível a determinação com a precisão, exatidão e linearidade exigidas,
sob as condições especificadas para o ensaio. Essa faixa linear de trabalho é definida como
a faixa de concentrações na qual a sensibilidade pode ser considerada constante e é
normalmente expressa nas mesmas unidades do trabalho obtido pelo método analítico.
Foram utilizadas soluções padrões nas concentrações de 5, 10, 20, 25, 30, 40, 60, 80 e
100mg.L-1
de éter-monoamina, éter-diamina e uma mistura de 25% de Flotigam EDA-3B e
75% de Flotigam F 2835 em massa, para a elaboração das curvas de calibração. A extração
foi realizada conforme procedimento descrito para o Método do Verde de Bromocresol,
mas utilizando o Orange II como corante. A leitura das absorbâncias foi realizada no
espectrofotômetro Biospectro SP220 no comprimento de onda de 485nm.
60
Verificou-se, visualmente, nos gráficos a existência de pontos dispersos que pudessem
interferir na regressão e esses foram removidos. Foi calculado então o coeficiente de
determinação (R2).
Calculou-se os resíduos, ou seja, a diferença entre o valor observado e o valor calculado
pela equação da reta de regressão para cada valor de x. Uma distribuição aleatória em torno
da linha reta confirmou a veracidade dos dados.
– Limite de Detecção: Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do
analito ou de uma propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber
qual o menor valor de concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado
pelo método.
O limite de detecção do equipamento (LDE) é definido como a concentração do analito que
produz um sinal de três a cinco vezes a razão ruído/sinal do equipamento e o limite de
detecção do método (LDM) é a menor concentração que o método pode detectar com
precisão nos resultados.
Foram feitas soluções padrões nas concentrações de 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 e 1,00mg.L-1
da
éter-monoamina, éter-diamina e da solução de 25% de éter-monoamina e 75% de éter-
diamina, e realizadas as extrações conforme descrito pra o Método do Verde de
Bromocresol, mas utilizando o Orange II como corante do sistema. A leitura da absorbância
foi realizada no espectrofotômetro Biospectro SP220 no comprimento de onda de 485nm.
Os resultados foram plotados em gráficos e utilizados para estabelecer o LDE. Para a
determinação do LDM, foram calculadas as variâncias (S2)de cada concentração, de acordo
com a equação 4.1:
1
02
n
XXS i Equação 4.1
onde: Xi – absorbância teórica
Xo – absorbância observada
n – número de análises
61
Para o cálculo da absorbância teórica foram utilizadas as equações de regressão linear
obtidas nos gráficos da curva de calibração, para cada concentração.
Em seguida foi calculado o desvio padrão (s) de cada concentração e esse valor utilizado
para calcular o LDM, segundo a equação 4.2:
stLDM n .1,1
Equação 4.2
onde: LDM = limite de detecção do método
t(n-1, 1-α) = valor da abscissa t (Student) para (1-α) x 100% nível de confiança e (n-1)
graus de liberdade.
s = desvio padrão das análises em replicata
Foram utilizados 6 graus de liberdade, pois foram realizadas 7 replicatas para cada
concentração trabalhada. O valor t unilateral, para 99% de confiança, foi de 3,707 de
acordo com a tabela de distribuição t (student test). Para encontrar a concentração do LDM,
foram utilizadas novamente as equações de regressão linear de cada curva de calibração.
4.4. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS
POR Serratia marcescens
De acordo com a literatura, a bactéria Serratia marcescens bizio 1823AL
é um
microrganismo degradador de éter-aminas, identificada em uma amostra da barragem de
rejeitos de uma mineradora de Minas Gerais (ARAÚJO, 2007). Testes iniciais para análise
da biodegradação das éter-aminas utilizadas no presente trabalho foram realizados com
uma cultura pura de Serratia marcescens (ATCC 13880O) adquirida da Coleção de Cultura
Tropical – Fundação André Tosello.
Foram utilizados o meio de cultura caldo nutriente e o meio Bromfield modificado
(BROMFIELD, 1954), na presença das éter-aminas, para observar o potencial degradador
desse microrganismo. A composição dos meios de cultura estão descritos no Anexo I.
Foram autoclavados tubos de ensaio contendo 15mL de meio de cultura à 120°C por 20
62
minutos. Após resfriamento foi adicionado 1mL de S. marcescens crescida no mesmo meio
de cultura e 1mL de solução 480mg.L-1
de éter-monoamina Flotigam EDA-3B, ou éter-
diamina Flotigam F 2835, ou em mistura de 25,0% e 75,0% em massa de éter-monoamina e
éter-diamina, respectivamente. Foi acrescido também 0,3g de resíduo de minério de ferro
autoclavado à 120° por 20 minutos.
Os tubos foram mantidos a 37°C ± 2°C na estufa de cultura 002CB Fanem e monitorados
por 20 dias. Foram realizadas quantificações das éter-aminas nos dias 0, 3, 7, 13, 15 e 20
após incubação na estufa através do Método do Verde de Bromocresol. Testes semelhantes,
mas sem a adição de éter-aminas, foram realizados para avaliar possíveis interferências do
meio de cultura nos resultados da quantificação de aminas. Foi realizada uma varredura dos
meios de cultura caldo nutriente e Bromfield modificado entre os comprimentos de onda de
450 e 550nm, para observar em qual faixa de leitura não haveria interferência nos
resultados.
4.5. COLETA DAS AMOSTRAS
As amostras de rejeitos utilizadas para os testes em laboratório foram coletadas na planta
industrial e na barragem de rejeitos de uma mineradora do Estado de Minas Gerais. Uma
amostra de rejeito, proveniente da planta industrial, foi coletada no ponto 6, que de acordo
com a Figura 4.2, é chamada de caixa de passagem, e nomeado de rejeito composto (RC)
por possuir diferentes rejeitos.
63
Figura 4.2. Fluxo de rejeitos da empresa (Fonte: Arquivo da empresa Samarco).
Uma segunda amostra, chamada RB, foi coletada na barragem de rejeitos em um ponto a
mais ou menos 100m à jusante do ponto de desaguamento do rejeito. No local da coleta, o
rejeito estava misturado à lama, que também deságua na barragem de rejeitos. Em
laboratório procedeu-se a centrifugação das amostras à 15.000rpm por 15 minutos, em
tubos de 15mL contendo 14 mL de amostra. As frações sólida e líquida foram utilizadas,
separadamente, para a leitura do pH e para a quantificação das éter-aminas. A extração das
éter-aminas nas frações líquidas ocorreu como mencionado anteriormente, pelo método do
Orange II. Para as quantificações do coletor orgânico nas frações sólidas foram pesados 10g
de amostra seca e adicionados 100mL de clorofórmio. Promoveu-se a agitação da solução
por 20 minutos em agitador magnético. 25 mL deste clorofórmio, juntamente com 10mL de
Orange II e 10mL de água destilada, foram utilizados para a extração das éter-aminas.
Todos os testes foram feitos em triplicata. Todas as frações foram acondicionadas em
frascos âmbar e monitoradas durante 20 dias para avaliar a degradação natural das éter-
aminas.
Outra sessão de centrifugação para recuperação da biomassa microbiana foi realizada com
as amostras brutas, à 15.000rpm por 15 minutos, em tubos contendo 14 mL de amostra.
Nesta etapa a fração líquida foi descartada e adicionados cerca de 8mL de tampão fosfato
64
salino (PBS 1X) (Anexo II). A fração sólida foi homogeneizada com o tampão e
centrifugada pelo mesmo tempo e velocidade. Novamente o sobrenadante foi descartado e
as frações sólidas armazenadas à -20°C, envolvidas por papel alumínio. Outros tubos foram
completados com PBS 1X, homogeneizados e conservados à mesma temperatura. Estas
amostras foram utilizadas para a análise da diversidade bacteriana pela técnica PCR-
DGGE, conforme descrito à frente.
4.6. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO
DAS BACTÉRIAS ISOLADAS
4.6.1. Condições de isolamento e caracterização dos isolados
O isolamento das bactérias presentes nas amostras brutas foi realizado em meio ágar
nutriente e meio Bromfield modificado (BROMFIELD, 1954) acrescido de 30g.L-1
de ágar
bacteriológico e 100mL de solução de 0,1g.L-1
de éter-monoamina Flotigam EDA-3B e
éter-diamina Flotigam F 2835 em mistura de 25,0% e 75,0% em massa, respectivamente.
Os meios de cultura, sem adição das éter-aminas, foram esterilizados em autoclave a 120ºC
por 20 minutos e só após o resfriamento a solução de aminas foi adicionada ao meio. Os
meios foram transferidos para placas de Petri descartáveis estéreis para posterior
inoculação.
Apenas a fração líquida das amostras de rejeitos foi utilizada no isolamento de
microrganismos cultiváveis. 1,0mL do sobrenadante foi transferido para um tubo de ensaio
contendo 9mL de solução salina 0,85%. Foram realizadas diluições seriadas para 10-1
e 10-2
e utilizados 0,5mL dessas diluições no paqueamento a fim de promover o crescimento das
colônias viáveis. As placas foram incubadas à 35°C ± 2°C por 24 horas na estufa de cultura
002CB Fanem.
As colônias isoladas crescidas nas placas de Petri foram transferidas para tubos de ensaio
individuais esterilizados contendo 4,0mL de meio de cultura líquido, previamente
autoclavado, correspondente ao meio utilizado no isolamento. As culturas foram incubadas
a 35°C ± 2°C por 48 horas e repicadas novamente em meios de cultura sólido, para
confirmar a presença de um único tipo de colônia Este procedimento foi realizado duas
65
vezes até que o isolamento estivesse confirmado. Ao final do isolamento, 1,0mL de isolado
crescido em meio líquido foi preservado à -20°C em microtubos de 1,5mL contendo 0,5mL
de glicerol 80% autoclavado.
Foram obtidas fotografias das placas de petri com crescimento bacteriano isolado, realizada
a caracterização morfológica das colônias, coloração de Gram das células isoladas para
diferenciação da estrutura da parede celular (RENDE e OKURA, 2008) e coloração de
esporos pelo Verde Malaquita (RENDE e OKURA, 2008).
Para identificação mais precisa dos isolados, foram utilizadas técnicas de biologia
molecular baseadas na extração de DNA genômico e amplificação do gene DNA
ribossomal 16S conforme descrito a seguir.
4.6.2. Identificação dos isolados
4.6.2.1 - Extração de DNA
As culturas obtidas foram utilizadas para extração de DNA pelo método fenol/clorofórmio
(GRIFFITHS et al., 2000), assim como as amostras brutas coletadas na etapa de
concentração do minério de ferro e na barragem de rejeitos. Para cada cultura isolada ou
amostra bruta foram adicionados os componentes de acordo com a Tabela 4.1, em
microtubos de 2,0mL
Tabela 4.1. Soluções e volumes da extração de DNA pela técnica fenol/clorofórmio (FONTE: GRIFFITHS et
al., 2000).
Componente Quantidade
Cultura isolada/amostra bruta 5 colônias/0,5g
Pérola de vidro estéril 0,5g
SDS10%* 10µL
Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico* (24:24:1) 0,3mL
PBS 1X* + PVPP* 1% 0,3mL
* Composição das soluções descritas no Anexo II
Promoveu-se 2 agitações de 30 segundos cada no vórtex, mantendo as amostras imersas no
gelo durante o intervalo entre as agitações. Centrifugou-se, utilizando a Microcentrífuga
Refrigerada Novatécnica NT805, por 5 minutos à 14.000rpm à 5°C e o sobrenadante foi
66
transferido para novo microtubo. Adicionou-se igual volume de clorofórmio/álcool
isoamílico (24:1) (Anexo II) e agitou-se manualmente. Nova centrifugação foi realizada por
5 minutos à 14.000rpm e 5°C. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo e
precipitado com 0,1V de acetato de sódio (3M, 5,2) (Anexo II) e 2V de etanol 100%. Os
microtubos foram incubados à -20°C por 1 hora e centrifugados por 10 minutos à
14.000rpm e 5°C. O sobrenadante foi então descartado e o pellet lavado com 200µL de
etanol 70%. Procedeu-se nova centrifugação por 3 minutos à 14.000rpm e 5°C e o
sobrenadante foi descartado. O pellet foi deixado à temperatura ambiente por 16 horas para
secagem, ressuspendido em 50µL de Tris (tris(hidroximetil)aminometano, 10mM e pH8) e
estocado à -20°C até a utilização para a amplificação do gene DNA ribssomal 16S.
4.6.2.2. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
As reações de amplificação por PCR a partir do DNA genômico extraído das cultura puras
ocorreram na presença dos reagentes descritos na Tabela 4.2 e dos iniciadores universais
para o domínio Bacteria 27F (5‟-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‟) e 1492R (5'-
TACGGYTACTTGTTACGACTT-3') (LANE,1991).
Tabela 4.2: Reagentes utilizados para a preparação da mistura de reação da PCR para a amplificação do gene
DNAr 16S. (*reagentes da marca Fermentas; **Sintetizados pela empresa Bioneer)
Componentes Concentração estoque Concentração por reação Volume por reação (µL)
Água Milli– Q ---- ---- 15,85
Tampão* 10x 1x 2,5
MgCl2* 25mM 2,0mM 2,0
Iniciador 1** 10pmol/µL 500nM 1,25
Iniciador 2** 10pmol/µL 500nM 1,25
dNTP‟s* 10mM total 0,2mM 0,5
BSA* 5mg/L 0,2mg/L 1,0
Taq polimerase* 5µ/µL 1,5u/µL 0,1
DNA template ---- ---- 0,5
VOLUME FINAL ---- ---- 25
Após a adição de todos os reagentes, estes foram transferidos para microtubos e em
seguida, foi adicionada à mistura de reação, 0,5µL da amostra a ser analisada.
67
A amplificação foi realizada no Termociclador Automático Biocycler TM
MJ96+, seguindo
o programa de 3 minutos a 94ºC (desnaturação inicial); 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC
(desnaturação), 1 minuto a 55ºC (ligação dos iniciadores) e 1 minuto a 72ºC (extensão); 7
minutos a 72º C (extensão final). Após a amplificação, as amostras foram armazenadas a
4°C. Os fragmentos amplificados foram analisados em gel de agarose 1% (p/v) em TAE
(tampão Tris-Acetato-EDTA, pH8) 1X (Anexo II), durante 30 minutos a uma voltagem de
100V, corados com SybrSafe DNA Gel Stain (Invitrogen), seguida de observação em um
transiluminador de luz UV.
O sequenciamento do DNA das culturas isoladas foi realizado a partir dos produtos das
amplificações (PCR) utilizando os iniciadores das extremidades 27f e 1492R, por serviço
terceirizado pela empresa Genomic Engenharia Molecular (São Paulo), assim como a
purificação e quantificação de DNA presente nos amplicons. As sequências obtidas foram
analisadas nos programas BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP X (Ribossomal
Database Project Release 10 – (COLE et al., 2009) para o alinhamento das mesmas com
sequências depositadas no seu banco de dados utilizando o modelo de Jukes-Cantor. A
árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S alinhados foi construída pelo
método Neighbor Joining modificado, disponível no RDP (BRUNO et al., 2000 ).
Para montagem da árvore filogenética foram reunidas as sequências de DNA que codificam
para o RNAr 16S do isolado K desse estudo e suas respectivas espécies de referência
obtidas no Bando de Dados RDB. Todas as sequências foram alinhadas usando esse
programa. Após a montagem, a árvore filogenética foi editada usando o software de edição
do MEGA 4.1, com o objetivo de formatação.
4.7. ANÁLISE DA DIVERSIDADE BACTERIANA PELA
TÉCNICA DE PCR-DGGE
Para análise da diversidade bacteriana utilizando a técnica PCR-DGGE (Eletroforese em
Gel de Gradiente Desnaturante) as amostras brutas foram inicialmente submetidas à
extração de DNA (item 4.6.2.1) e posterior amplificação do DNAr 16S utilizando os
iniciadores 357F-GC (5‟-CGC CCG CCG CGC GGC
68
GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3‟) e 907R (5‟-
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3‟) (MUYZER et al., 1995) e dos demais reagentes,
conforme apresentado na Tabela 4.2. A amplificação foi realizada em um termociclador
automático (BiocyclerTM
) seguindo o programa de 3 minutos a 94ºC (desnaturação inicial);
30 ciclos de 1 minuto a 94ºC (desnaturação), 2 minutos a 50ºC (ligação dos iniciadores) e 2
minutos a 72ºC (extensão); 20 minutos a 72º C (extensão final). Após a amplificação, as
amostras foram armazenadas a 4°C para posterior separação eletroforética por DGGE.
A separação eletroforética dos fragmentos de DNA com diferentes sequências ocorreu pela
técnica DGGE (MUYZER et al., 1995). Para os fragmentos originados com o par de
iniciadores 357F-GC 907R utilizou-se o gel de bis-acrilamida 6% com um gradiente
desnaturante de uréia-formamida compreendido entre 30 a 70% com 80μL de APS e 5μL
de TEMED (Anexo V). Em cada canaleta do gel, colocaram-se 20 μL de cada uma das
amostras. As corridas eletrofóreticas tiveram duração de 16 horas e foram realizadas a
100V à 60°C. Os géis foram corados em solução de brometo de etídio por 60 minutos e
visualizados sob luz ultravioleta em transiluminador.
4.8. TESTE DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS
PELAS BACTÉRIAS ISOLADAS
Foram autoclavados 50mL de meio líquido de cultura, caldo nutriente ou Bromfield
modificado, em cada Elenmeyer de 500mL à 120°C por 20 minutos e, após o resfriamento,
foi adicionada a cultura isolada, preservada à -0°C na presença de glicerol 80%, e levados
para a estufa à 37°C±2°C, onde permaneceram por 5 dias. Após esse tempo, foram
adicionados 250mL do mesmo meio de cultura já presente no crescimento bacteriano e 5g
de resíduo de minério de ferro, ambos previamente autoclavados à mesma temperatura e
tempo, e ainda 25mL de solução 480mg.L-1
de éter-aminas contendo 25% de éter-
monoamina Flotigam EDA-3B e 75% de éter-diamina Flotigam 2835 em massa.
Utilizando essa mesma metodologia, foi executado o teste de biodegradação das éter-
aminas contendo todas as culturas isoladas. O sistema foi então incubado na estufa à
37°C±2°C e a concentração de éter-amina foi monitorada nos tempos de 0, 3, 7, 14, 17 e 20
69
dias após a incubação, através da retirada de alíquotas de 30mL para a execução do Método
do Orange II. Os dados foram plotados em gráficos para análise do perfil de biodegradação
de cada cultura isolada, assim como o perfil de biodegradação das culturas em conjunto.
Esses dados foram utilizados também para selecionar as culturas com maior poder de
degradação e o meio de cultura em que ocorreu a maior taxa de degradação para que os
testes de cinética fossem executados.
4.9. CINÉTICA DE BIODEDEGRADAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS
PELAS LINHAGENS ISOLADAS EM DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES E TEMPERATURAS
Por meio dos resultados dos testes de biodegradabilidade foi selecionada a cultura que
apresentou maior perfil de degradação das éter-aminas e o meio de cultura no qual esse
perfil foi identificado. Foram autoclavados 50mL de caldo nutriente em cada Erlenmeyer
de 250mL, à 120°C por 20 minutos. Após o resfriamento na estufa à 37°C±2°C, foi
inoculada a cultura isolada, ou todas as culturas. Estes Erlenmeyers foram mantidos na
estufa à 37°C±2°C por 5 dias para crescimento microbiano. Após esse tempo, centrifugou-
se o volume em tubos de 50mL, à 15.000rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi
descartado, permanecendo um volume final de 5mL. Desse volume foram retiradas
alíquotas de 1, 2 ou 3mL para realização do teste de degradação de aminas. Em
Erlenmeyers contendo 200mL de caldo nutriente previamente autoclavados à 120°C por 20
minutos, foram adicionados 5g de resíduo de minério de ferro, uma alíquota de 1, 2 ou 3mL
de microrganismos crescidos e concentrados em 5mL, e 50mL de solução de 25% de éter-
monoamina e 75% de éter-diamina, nas concentrações de 500, 250 ou 125mg.L-1
, para
concentrações finais de 100, 50 ou 25mg.L-1
respectivamente. Os frascos foram incubados
em uma incubadora refrigerada com agitação Tecnal TE-424 sob agitação de 160rpm
durante 8 horas, nas temperaturas de 20, 30, 36,5, 40 e 45°, sendo que foram retiradas
alíquotas de 30mL para o monitoramento, através do método do Orange II, da
concentração das éter-aminas após 0, 1, 2, 4, 5, 6, 7 e 8 horas de incubação. Os dados dos
testes de biodegradação foram plotados em gráficos para análise do perfil de degradação
em diferentes concentrações de éter-aminas de microrganismos e em diferentes
70
temperaturas. Para modelamento da cinética, foram testados o modelo de Monod, primeira
e segunda ordem.
71
CAPÍTULO 5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. QUANTIFICAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS
5.1.1. Método do Verde de Bromocresol
As curvas de calibração, conforme Figura 5.1, foram realizadas por
espectrofotometria com uma correlação linear de 0,99125 para éter-monoamina, 0,9916 pra
éter-diamina e 0,99871 para a solução contendo 25% e 75% de éter-monoamina e éter-
diamina respectivamente. A curva de calibração é linear nas concentrações de 1 a 40mg.L-1
para a éter-monoamina e éter-diamina e de 1 a 100 mg.L-1
para a solução de 25% de éter-
monoamina e 75% de éter-diamina. Essas curvas foram utilizadas para a determinação de
todas as concentrações de aminas quando se utilizou o método do Verde de Bromocresol.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Curva de Calibração éter-monoamina
Método: Verde de Bromocresol
Comprimento de ondas:405nm/Cubeta 10mm
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,04331 0,01868
B 0,02274 7,57333E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99125 0,03787 18 <0.0001
Ab
so
rbân
cia
(n
m)
Concentração (mg.L-1)
(a)
72
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,04304 0,01443
B 0,01444 5,95517E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,9916 0,02825 12 <0.0001
Curva de Calibração éter-diamina
Método: Verde de Bromocresol
Comprimento de ondas:405nm/Cubeta 10mm
Ab
so
rbân
cia
(n
m)
Concentração (mg.L-1)
(b)
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
Y = A + B * X
Parameter Value Error
-----------------------------------------------------------
A 0,05192 0,00915
B 0,01423 1,65987E-4
-----------------------------------------------------------
R SD N P
-----------------------------------------------------------
0,99871 0,02493 21 <0.0001
-----------------------------------------------------------
Curva de Calibração éter-monoamina e éter-diamina
Método: Verde de Bromocresol
Comprimento de ondas:405nm/Cubeta 10mm
Ab
so
rbâ
nc
ia (
nm
)
Concentração (mg.L-1)
(c)
Figura 5.1. Curvas de calibração do método Verde de Bromocresol. (a) éter-monoamina Flotigam EDA-3B;
(b) éter-diamina Flotigam F 2835; (c) solução de éter-aminas, 25% Flotigam EDA-3B e 75% de Flotigam F
2835.
73
5.1.2. Método do Orange II
Este método de análise colorimétrica de éter-aminas foi desenvolvido no laboratório de
resíduos e efluentes, n° 62, do DEQUI/UFOP, com base no Método do Verde de
Bromocresol, mas utilizando o Orange II como corante no sistema. A absorbância é
determinada no comprimento de onda de 485nm, comprimento esse em que os meios de
cultura testados não interferem no valor final da concentração de éter-aminas.
Para que essa metodologia pudesse ser utilizada com confiança nos resultados, prosseguiu
os testes para a validação do método químico, de acordo com o manual elaborado pelo
INMETRO de Orientações Sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos.
5.1.2.1. Faixa de Trabalho e Faixa Linear de Trabalho
Para análise da faixa de concentrações do analito no qual o método do Orange II pode ser
aplicado foram utilizadas soluções padrões nas concentrações de 5, 10, 20, 25, 30, 40, 60,
80 e 100mg.L-1
de éter-monoamina, éter-diamina e da solução das éter-aminas, em mistura
de 25% de Flotigam EDA-3B e 75% de Flotigam F 2835 em massa, para a elaboração de
curvas de calibração. A extração foi realizada conforme procedimento descrito para o
Método do Verde de Bromocresol, mas utilizando o Orange II como corante. A leitura das
absorbâncias foi realizada no comprimento de onda de 485nm.
Os resultados das absorbâncias foram plotados nos gráficos, conforme Figuras 5.2, que
correspondem às curvas de calibração para éter-monoamina, éter-diamina e solução de
aminas, respectivamente.
74
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
CURVA DE CALIBRAÇÃO éter-monoamina
Método: Orange II
Comprimento de onda: 485nm/Cubeta 10mm
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,01568 0,00425
B 0,01081 8,2908E-5
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99927 0,01319 27 <0.0001
AB
SO
RB
ÂN
CIA
CONCENTRAÇÃO (mg.L-1)
(a)
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
CURVA DE CALIBRAÇÃO éter-diamina
Método: Orange II
Comprimento de onda: 485nm/Cubeta 10mm
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,00653 0,00942
B 0,01013 1,94631E-4
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,9956 0,02868 26 <0.0001
AB
SO
RB
ÂN
CIA
CONCENTRAÇÃO (mg.L-1)
(b)
75
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
CURVA DE CALIBRAÇÃO éter-monoamina e éter-diamina
Método: Orange II
Comprimento de onda: 485nm/Cubeta 10mm
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 0,0204 0,0116
B 0,01075 2,40437E-4
-------- ----------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,9943 0,0357 25 <0.0001
AB
SO
RB
ÂN
CIA
CONCENTRAÇÃO (mg.L-1)
(c)
Figura 5.2. Curvas de calibração do método Orange II. (a) éter-monoamina; (b) éter-diamina; (c) solução de
éter-aminas, 25% Flotigam EDA-3B e 75% de Flotigam F 2835.
Os resultados das curvas de calibração foram utilizados para se calcular os resíduos, os
quais consistem na diferença entre o valor da absorbância observado e o valor da
absorbância calculado pela equação da reta de regressão linear para cada valor de x, e esses
valores plotados em um gráfico conforme Figura 5.3.
76
0 20 40 60 80 100
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
RESÍDUO ÉTER-MONOAMINA
Resíd
uo
Concentração (mg.L-1)
(a)
0 20 40 60 80 100
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
RESÍDUO ÉTER-DIAMINA
Re
síd
uo
Concentração (mg.L-1)
(b)
77
0 20 40 60 80 100
-0,08
-0,06
-0,04
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
RESÍDUO SOLUÇÃO 25% ÉTER-MONOAMINA
E 75% ÉTER-DIAMINA
Re
síd
uo
Concentração (mg.L-1)
(c)
Figura 5.3. Distribuição dos resíduos. (a) éter-monoamina; (b) éter-diamina; (c) solução de 25% éter-
monoamina e 75% éter-diamina.
A distribuição aleatória dos resíduos em torno da linha de regressão linear confirmou a
veracidade dos dados, o que confirma que a faixa de concentrações utilizada, de 5 à
100mg.L-1
, é considerada válida para a aplicação do método do Orange II.
5.1.2.2. Limite de Detecção
Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito ou de uma
propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o menor valor de
concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado pelo método.
Foram feitas soluções padrões nas concentrações de 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 e 1,00mg.L-1
de
éter-monoamina, éter-diamina e das éter-aminas, em 25% de éter-monoamina e 75% de
éter-diamina, e realizadas as extrações seguindo a metodologia do Orange II, procedendo a
leitura das absorbâncias em 485nm. Para cada concentração trabalhada foram realizadas 7
replicatas. A Figura 5.4 apresenta os resultados das leituras para éter-monoamina, éter-
diamina e para a solução contendo as duas éter-aminas.
78
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,000
0,005
0,010
0,015
0,020
LIMITE DE DETECÇÃO: ÉTER-MONOAMINA
Ab
so
rbân
cia
Concentração (mg.L-1)
(a)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
LIMITE DE DETECÇÃO: ÉTER-DIAMINA
Ab
so
rbân
cia
Concentração (mg.L-1)
(b)
79
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
LIMITE DE DETECÇÃO: ÉTER-MONOAMINA E ÉTER-DIAMINA
Ab
so
rbân
cia
Concentração (mg.L-1)
(c)
Figura 5.4. Limite de Detecção do Equipamento (LDE). (a) éter-monoamina; (b) éter-diamina; (c) solução das
éter- aminas.
A análise dos gráficos permite inferir que para a éter-monoamina, não houve diferença
significativa entre as concentrações de 0,10, 0,25 e 0,50mg.L-1
, assim como para a éter-
diamina. Dessa forma, acredita-se que a concentração limite que o equipamento determina
(LDE) com precisão pelo método do Orange II é de 0,75mg.L-1
para as éter-aminas
separadamente.
Para a solução das éter-aminas, o LDE apresentou semelhança para as medidas de 0,10 e
0,25mg.L-1
, mas para a concentração de 0,50mg.L-1
houve diferença significativa, o que
indica que para a solução de aminas, a concentração limite precisa determinada pelo
equipamento é de 0,50mg.L-1
, menor do que a concentração encontrada quando as éter-
aminas encontraram-se separadas.
Para calcular o limite de detecção do método (LDM), os mesmos dados do LDE foram
utilizados para calculadar as variâncias (S2) para as éter-aminas separadas e também na
80
solução. A Tabela 5.1 apresenta os valores da variância para cada concentração em cada
condição de análise.
Tabela 5.1. Valores das Variâncias (S2) utilizadas para calcular LDM.
Concentração
(mg.L-1
)
Éter-monoamina Éter-diamina Éter-monoamina e
éter-diamina
0,10 0,000162 6,63797E-05 0,000296
0,25 0,000192 9,58171E-05 0,000341
0,50 0,000246 0,000156851 0,00034
0,75 0,000137 0,00015221 0,000369
1,0 0,000159 0,000129855 0,0003
Após o cálculo da variância, foi calculado o desvio padrão (s), que corresponde à raiz
quadrada da variância, e finalmente o LDM. Esses valores estão apresentados na Tabela
5.2.
Tabela 5.2. Limite de Detecção do Método Orange II.
Concentração
(mg.L-1
)
Éter-monoamina Éter-diamina Éter-monoamina e
éter-diamina
0,10 s – 0,0127
LDM(A) – 0,047
LDM(mg.L-1) – 2,91
s – 0,081
LDM(A) – 0,030
LDM(mg.L-1) – 2,34
s – 0,0172
LDM(A) – 0,064
LDM(mg.L-1) – 4,03
0,25 s – 0,0139
LDM(A) – 0,051
LDM(mg.L-1) – 3,31
s – 0,098
LDM(A) – 0,036
LDM(mg.L-1) – 2,94
s – 0,0185
LDM(A) – 0,068
LDM(mg.L-1) – 4,47
0,50 s – 0,0157
LDM(A) – 0,058
LDM(mg.L-1) – 3,93
s – 0,0125
LDM(A) – 0,046
LDM(mg.L-1) – 3,94
s – 0,0184
LDM(A) – 0,068
LDM(mg.L-1) – 4,46
0,75 s – 0,0117
LDM(A) – 0,043
LDM(mg.L-1) – 2,56
s – 0,0123
LDM(A) – 0,046
LDM(mg.L-1) – 3,87
s – 0,0192
LDM(A) – 0,071
LDM(mg.L-1) – 4,72
1,0 s – 0,0126
LDM(A) – 0,047
LDM(mg.L-1) – 2,87
s – 0,0114
LDM(A) – 0,042
LDM(mg.L-1) – 3,53
s – 0,0173
LDM(A) – 0,064
LDM(mg.L-1) – 4,07
Diante da análise dos valores encontrados para o LDM, pode-se dizer que o Método do
Orange II detecta com precisão as concentrações acima de 4,0mg.L-1
quando a análise é
81
realizada apenas com as éter-aminas separadamente, e acima de 5,0mg.L-1
quando as éter-
aminas estão em solução, na proporção de 25% de éter-monoamina e 75% éter-diamina em
massa.
5.2. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS
PELA BACTÉRIA Serratia marcescens
Os testes de biodegradação das éter-aminas foram realizados inicialmente para avaliar o
potencial degradador da bactéria Serratia marcescens, caracterizada na literatura como um
microrganismo presente na barragem de rejeito da flotação do minério de ferro de uma
mineradora de Minas Gerais (ARAÚJO, 2007). Os testes foram realizados com a éter-
monoamina e a éter-diamina separadamente e também em uma solução aquosa contendo
25% e 75% em massa, respectivamente. Todos os sistemas continham a concentração
inicial calculada de 28mg.L-1
. A quantificação do coletor orgânico presente nas amostras,
ao longo dos testes, foi realizada pelo Método do Verde de Bromocresol. A Figura 5.5
apresenta o perfil encontrado utilizando o meio de cultura caldo nutriente, durante os 20
dias de observação.
0 5 10 15 20
15
20
25
30
35
40
45
BIODEGRADAÇÃO - Caldo Nutriente
Serratia marcescens
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (dias)
Monoamina
Diamina
Solução
Figura 5.5. Análise pelo método do Verde de Bromocresol da biodegradação das éter-aminas, utilizando o
meio Caldo Nutriente, pela bactéria Serratia marcescens.
82
A concentração inicial de éter-monoamina foi de 38,3mg.L-1
, seguida de 37,1mg.L-1
após 3
dias de incubação. No 7° dia a concentração encontrada foi de 33mg.L-1
, e no 13° dia havia
31,2mg.L-1
. A quantificação no 15° dia não mostrou diferença significativa com a análise
anterior, sendo a concentração de 31,8mg.L-1
. Ao final dos 20 dias de observação foram
quantificados 30,7mg.L-1
de éter-monoamina. Já para a éter-diamina, a concentração inicial
foi de 39,0mg.L-1
, seguida de 37,1mg.L-1
após 3 dias de incubação. No 7° dia a
concentração encontrada foi de 32,6mg.L-1
, e no 13° dia havia 31,5mg.L-1
. A quantificação
no 15° apresentou a concentração de 32,5mg.L-1
. Ao final dos 20 dias de observação foram
quantificados 29,6mg.L-1
. Nas análises dos testes contendo a solução das aminas a
concentração inicial foi de 37,4mg.L-1
, seguida de 36,7mg.L-1
após 3 dias de incubação. No
7° dia a concentração encontrada foi de 32,1mg.L-1
, e no 13° dia havia 31,0mg.L-1
. A
quantificação no 15° apresentou a concentração de 31,8mg.L-1
. Ao final dos 20 dias de
observação foram quantificados 29,6mg.L-1
de éter-aminas.
As concentrações iniciais encontradas para todos os testes utilizando o caldo nutriente
apresentaram valores maiores do que o valor calculado, sendo de 38,3, 39,0 e 37,4mg.L-1
para éter-monoamina, éter-diamina e solução de aminas, respectivamente, permanecendo
maior que o valor calculado ao longo de todo o monitoramento.
A Figura 5.6 apresenta o perfil encontrado para os testes de degradabilidade das aminas
pela Serratia marcescens utilizando o meio de cultura Bromfield modificado, durante os 20
dias de observação. Neste meio de cultura a concentração inicial foi de 27,7mg.L-1
de éter-
monoamina. Houve um aumento da concentração para 31,3mg.L-1
após 3 dias de
observação e foram encontrados 30mg.L-1
em 7 dias. Após 13 dias, a concentração não
sofreu alteração, permanecendo em cerca de 30mg.L-1
, mas no 15° dia, foram encontrados
apenas 28,5mg.L-1
. No último dia de análise a concentração de éter-monoamina encontrada
foi de 30,2mg.L-1
.
83
0 5 10 15 20
15
20
25
30
35
40
45
BIODEGRADAÇÃO - Bromfield modificado
Serratia marcescens
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (dias)
Monoamina
Diamina
Solução
Figura 5.6. Análise pelo método do Verde de Bromocresol da biodegradação das éter-aminas, utilizando o
meio Bromfield modificado, pela bactéria Serratia marcescens.
A concentração inicial de éter-diamina foi de 28,7mg.L-1
. Houve um aumento da
concentração para 30,9mg.L-1
após 3 dias de observação e foram encontrados 30,1mg.L-1
em 7 dias. A quantificação no 13° dia resultou na concentração de 30,7mg.L-1
e no 15° dia,
foram encontrados apenas 28,8mg.L-1
. No último dia de análise a concentração de éter-
diamina encontrada foi de 29,8mg.L-1
. Para a solução das aminas a concentração inicial foi
de 29,1mg.L-1
, aumentando para 31,2mg.L-1
após 3 dias de observação. Foram encontrados
30,4mg.L-1
em 7 dias, 30,2mg.L-1
no 13° e no 15° dia, foram encontrados apenas
29,7mg.L-1
. No último dia de análise a concentração de éter-diamina encontrada foi de
31,6mg.L-1
.
As concentrações iniciais encontradas para todos os testes utilizando o meio Bromfield
modificado como meio de crescimento microbiano estão de acordo com a concentração
calculada, que foi de 28mg.L-1
. Já as quantidades de éter-aminas encontradas após 3, 7, 13,
15 e 20 dias de incubação são maiores do que a concentração calculada.
Era esperado que as concentrações iniciais de aminas fossem próximas à concentração
calculada e que ao longo do monitoramento esse valor fosse diminuindo independente do
84
meio de cultura utilizado, pois a bactéria S. marcescens é descrita na literatura como
degradadora desse coletor orgânico, estando presente nas barragens de rejeito da flotação
do minério de ferro (ARAÚJO, 2007), e que o período de degradação é relativamente
pequeno, como apontado por CHAVES (2001), que também analisou amostras de uma
barragem de rejeitos da flotação de minério de ferro e observou que o tempo de
decomposição da amina é bastante curto, sendo que em 12 dias de monitoramento a
quantidade de amina foi reduzida para menos da metade da quantidade inicial. Assim como
CHAVES (2001), REIS (2004) observou que depois de 14 dias após a primeira extração da
amina, não foram encontrados mais coletores no líquido da flotação e em 6 dias, a
concentração de amina era de aproximadamente a metade da quantidade encontrada no
primeiro dia de extração.
Ainda nos estudos conduzidos por ARAÚJO et al. (2010), foi avaliaada a biodegradação
das éter-aminas pela Serratia marcescens bizio 1823AL
, nas concentrações de 10, 40 e
60mg.L-1
, em diferentes temperaturas, (25, 30, 35 e 38°C) e os resultados mostraram,
inicialmente, lentas taxas de biodegradação, especialmente em altas concentrações de
amina. Para concentração de 10mg.L-1
, as taxas de biodegradação foram muito próximas
umas das outras em todas as temperaturas testadas, o que mostrou baixa interferência da
temperatura para este parâmetro. No entanto, para as concentrações de 40 e 60mg.L-1
, a
temperatura influenciou significativamente nas taxas de biodegradação das éter-aminas,
sendo a maior influência para a temperatura de 38°C.
Uma hipótese para a diferença na concentração inicial observada e a calculada, assim como
a concentração final acima da calculada para os dados com o caldo nutriente, e o aumento
da concentração durante os experimentos com o Bromfield modificado está nas colorações
encontradas para os meios de cultura testados. O meio de cultura Bromfield modificado,
após a autoclavação, apresenta coloração bastante transparente e depois da inoculação e
crescimento bacteriano, esse mesmo meio de cultura torna-se pouco turvo esbranquiçado.
Como inicialmente o meio não apresentou qualquer tipo de coloração, a metodologia de
quantificação utilizada foi eficaz para a análise da concentração de éter-aminas,
quantificando exatamente a quantidade de coletor presente no meio. Mas após alguns dias
de incubação, o meio Bromfield modificado sofreu alteração da cor e essa mudança pode
85
ter influenciado a metodologia de quantificação do coletor, alterando a concentração
encontrada ao longo do monitoramento.
O meio caldo nutriente apresenta coloração amarelada transparente após a autoclavação e,
assim como o meio Bromfield modificado, sofre alteração da cor após a inoculação e
crescimento de microrganismos, tornando-se amarelado opaco. A concentração inicial
observada pode ter sofrido interferência da cor inicial do meio de cultura e, como a
metodologia utilizada é colorimétrica, o resultado pode ter sofrido alguma alteração. As
concentrações observadas ao longo dos testes foram menores do que a inicial, mas ainda
maiores do que a inicial calculada, o que pode significar uma menor interferência da cor do
meio de cultura turvo ou ainda que a interferência tenha sido constante, mas as éter-aminas
tenham realmente sido degradadas pela Serratia marcescens.
Diante dos resultados encontrados para os dois meios de cultura testados e dos perfis de
degradação de éter-aminas discutidos na literatura, foram realizadas análises, em
duplicatas, sem a adição de aminas para observar a interferência que o meio de cultura
estaria provocando nos resultados. A Tabela 5.3 apresenta os valores das absorbâncias,
assim como as concentrações correspondentes.
Tabela 5.3. Absorbâncias e concentrações encontradas nos testes sem a adição de éter-aminas.
Bromfield modificado Caldo Nutriente
Tempo
(dias)
Absorbância Concentração (mg.L-1
) Absorbância Concentração (mg.L-1
)
Teste A Teste B Teste A Teste B Teste A Teste B Teste A Teste B
0 0,005 0,008 -1,68 -1,55 0,271 0,281 10,01 10,45
3 0,093 0,092 2,185 2,141 0,226 0,277 8,034 10,28
7 0,076 0,078 1,438 1,526 0,158 0,163 5,044 5,263
13 0,08 0,089 1,613 2,009 0,15 0,13 4,692 3,812
15 0,074 0,076 1,35 1,438 0,181 0,124 6,055 3,548
20 0,099 0,103 2,449 2,625 0,095 0,083 2,273 1,745
O meio Bromfield modificado apresentou pequenas absorbâncias nos testes com ausência
de éter-aminas, enquanto o meio caldo nutriente apresentou valores significativos durante
todo o período de observação. Os resultados encontrados inferem que os meios de cultura
utilizados, principalmente o caldo nutriente, interferem nos resultados, uma vez que suas
86
absorbâncias são diferentes de zero. Assim, para avaliar em qual faixa de comprimento de
onda esses meios de cultura não apresentam resultados que comprometem a metodologia de
quantificação de éter-aminas, foi realizada uma varredura no espectrofotômetro para os dois
meios, de 450 à 550nm. Os valores obtidos desse procedimento podem ser observados na
Tabela 5.4. Os resultados da varredura indicaram que para o Bromfield modificado,
comprimentos acima de 453nm não apresentaram absorbância suficiente para interferir no
resultado final de quantificação dos coletores e para o caldo nutriente, comprimentos de
onda acima de 470nm não interferem nos resultados. Os resultados da varredura indicaram
que para o meio Bromfield modificado, a existência de um perfil não degradador do coletor
encontrada não sofreu significativas interferências do meio de cultura, indicando que neste
meio a bactéria não degradou as aminas. Já no caldo nutriente, os resultados sofreram
interferência do meio, mas mesmo assim não foi detectado o perfil de degradação esperado.
Essas observações sugerem que na barragem de rejeito a S. marcescens pode estar presente,
mas associada a um grupo de microrganismos biodegradadores das éter-aminas.
A interferência do meio de cultura nos resultados finais foi eliminada uma vez que no
laboratório de resíduos e efluentes, n°62, do DEQUI/UFOP, foi desenvolvida uma nova
metodologia de quantificação de éter-aminas, utilizadas na flotação do minério de ferro, na
qual a leitura no espectrofotômetro era realizada no comprimento de onda de 485nm,
comprimento este no qual os meios de cultura não apresentaram valores de interferência
nos resultados finais.
87
Tabela 5.4. Varredura dos meios de cultura, de 450 à 550nm.
Bromfield modificado Caldo Nutriente
Comprimento
de onda (nm)
Absorbância
A
Absorbância
B
Absorbância
A
Absorbância
B
450 0,005 0,009 0,059 0,031
451 0,007 0,004 0,036 0,023
452 0,002 0,001 0,031 0,021
453 0 0 0,025 0,016
454 0 0 0,022 0,014
455 0 0 0,018 0,012
456 0 0,017 0,011
457 0 0 0,014 0,010
458 0 0 0,013 0,009
459 0 0 0,013 0,007
460 0 0 0,012 0,007
465 0 0 0,008 0,004
470 0 0 0,004 0,002
475 0 0 0,001 0,001
480 0 0 0,001 0
485 0 0 0,000 0
490 0 0 0 0
495 0 0 0 0
500 0 0 0 0
505 0 0 0 0
510 0 0 0 0
515 0 0 0 0
520 0 0 0 0
525 0 0 0 0
530 0 0 0 0
535 0 0 0 0
540 0 0 0 0
545 0 0 0 0
550 0 0 0 0
5.3. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
As análises do pH, no dia da coleta, das frações sólidas e líquidas das amostras brutas de
rejeito, após a centrifugação, estão indicadas na Tabela 5.5.
88
Tabela 5.5. Valores de pH das frações sólida e líquida das amostras de rejeito.
Rejeito Composto (RC) Rejeito da Barragem (RB)
Fração Sólida Fração Líquida Fração Sólida Fração Líquida
pH 9,7 10,1 9,7 10,1
As frações sólidas e líquidas apresentaram valores elevados de pH, mas estão de acordo
com os dados de pH mencionados na literatura, na faixa de 9,5 e 10,5 (ARAÚJO et al.,
2008; CHAVES, 2001). Esse valor elevado está relacionado à presença das aminas e outros
reagentes da flotação, que elevam o pH do sistema para que ocorra a maior taxa de flotação
das partículas de quartzo.
A concentração de aminas nas frações das amostras brutas foi determinada pelo método do
Orange II, no dia da coleta e monitorada durante os 20 dias seguintes. A Figura 5.7
apresenta o perfil da concentração das éter-aminas presente nas amostras brutas de rejeitos,
durante o monitoramento.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Degradação das éter-aminas nas amostras de rejeito
CO
CE
NT
RA
ÇÃ
O (
mg
.L-1)
TEMPO (dias)
Rejeito Líquido Barragem
Rejeito Líquido Composto
Rejeito Sólido Barragem
Rejeito Sólido Composto
Figura 5.7. Degradação das éter-aminas nas amostras de rejeito.
89
Pode-se observar que o rejeito líquido da barragem não apresentou éter-aminas desde o
início do monitoramento, enquanto a fração líquida do rejeito composto apresentou cerca
de 3,0mg.L-1
de éter-aminas, mas após o 6° dia de monitoramento não foram mais
encontradas éter-aminas nesta fração do rejeito composto. A fração sólida do rejeito da
barragem apresentou inicialmente 14,3mg.L-1
do coletor orgânico, mas seguiu a mesma
tendência de degradação, não sendo detectada mais aminas nesta amostra após o 6° dia de
análise. No entanto, a fração sólida do rejeito composto foi a amostra que apresentou maior
concentração inicial de éter-aminas, 19,3mg.L-1
, sendo que no 15° dia de monitoramento
essa fração ainda continha 1,3mg.L-1
. Apenas na quantificação do 20° dia, não foram
encontradas as éter-aminas na fração sólida do rejeito composto.
Ao estudar a biodegradabilidade das éter-aminas, CHAVES (2001) observou que após 21
dias de monitoramento, ainda existia acerca de 2,0mg.L-1
nos resíduos analisados. Essa
diferença nos valores encontrados por CHAVES (2001) e nas amostras do presente trabalho
pode ter ocorrido uma vez que as concentrações iniciais de éter-aminas das amostras desse
estudo eram menores do que as encontradas na literatura citada, e assim podem ter sido
degradadas em menor período de tempo conforme encontrado por SILVA (2009), que ao
analisar diferentes concentrações de aminas numa mesma temperatura e observou que as
menores concentrações estão sujeitas a um menor tempo de degradação.
As frações sólidas do rejeito composto e da barragem apresentaram maiores concentrações
de éter-aminas do que as frações líquidas dos mesmos rejeitos. Esses valores de
concentração encontrados estão divergentes dos resultados encontrados por CHAVES
(2001), que realizou a quantificação das éter-aminas em efluentes e rejeitos gerados na
Samarco Mineração. Nesse estudo, foi constatado que os resíduos coletados próximos à
usina, que correspondem ao rejeito composto do presente trabalho, apresentaram
concentrações de éter-aminas de a 22,2 a 31,5mg.L-1
. Já nas amostras de resíduos coletadas
na barragem de rejeitos de Germano, não foram encontradas concentrações detectáveis de
éter-aminas, o que foi atribuído à decomposição da amina. As amostras de água parada na
barragem apresentam concentrações de aproximadamente 12,2mg.L-1
, mas a água coletada
na saída da barragem de Santarém para o córrego Santarém, uma segunda barragem após a
90
barragem de Germano, não apresentou nenhuma quantidade de aminas, o que também foi
atribuído à decomposição do coletor no sistema.
No trabalho de CHAVES (2001), a quantificação das éter-aminas nas amostras de rejeito
foi realizada pelo método da ninidrina, um método colorimétrico considerado não
específico pois, a ninidrina reage com aminoácidos, peptídeos, aminas primárias e
secundárias, amônia ou amino álcool. Dessa forma, as concentrações de aminas
encontradas por CHAVES (2001) podem ter sofrido interferência de diversos outros
compostos que podem estar presentes nas amostras e serem quantificados pela metodologia
utilizada (ARAÚJO, 2007).
5.4. ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO
DAS BACTÉRIAS PRESENTES NAS AMOSTRAS BRUTAS
Os procedimentos para isolamento de bactérias foi realizado com a fração líquida das duas
amostras brutas, do composto (RC) e da barragem (RB). Os cultivos em meio sólido foram
realizados nos dois meios a saber: meio mínimo Bromfield acrescido de éter-aminas e ágar
e o meio rico ágar nutriente. Adicionou-se às placas 0,5mL de amostra bruta e submetida a
diluições seriadas, correspondendo a 10-1
e 10-2
a fim de permitir o crescimento do maior
número de colônias isoladas possível. Após 24 horas de incubação a 35°C±2, as placas
contendo meios de cultura sólidos foram analisadas. Imagens das colônias crescidas nas
placas estão apresentadas na Figura 5.8. Em geral, as placas que continham ágar nutriente
como meio de cultura apresentaram colônias maiores do que as placas que tinham meio
sólido Bromfield modificado acrescido de solução de éter-amina.
91
Figura 5.8. Fotografias das placas de Petri mostrando crescimento bacteriano em ágar nutriente (1, 2, 3, 4, 5) e
Bromfield modificado sólido (6, 7, 8, 9). 1: Colônias irregulares (nuvem) brancas; 2: Colônias transparentes
cremosas; 3: Colônias espaçadas, arredondadas brancas; 4: Colônias arredondadas transparentes; 5: Colônias
ramificadas e brancas; 6: Colônias ramificadas e esbranquiçadas; 7: Pequenas colônias transparentes; 8:
Colônias arredondadas e transparentes; 9: Grandes colônias transparentes.
92
As colônias que cresceram no meio Bromfield modificado apresentaram coloração
transparente ou esbranquiçada e espaçadas pelo meio sólido, enquanto as colônias crescidas
no ágar nutriente apresentaram coloração esbranquiçada, e algumas transparentes, bordas
regulares ou não, preenchendo grande parte da placa de cultivo. Isso indica que as
condições de crescimento no meio Bromfield modificado não são ideais para o crescimento
das bactérias, seja pela ausência de nutrientes importantes, seja pela incapacidade de usar a
amina como fonte de carbono, ou até pela condição adversa de pH neste meio (em torno de
10), decorrente da adição das aminas. No entanto, o isolamento neste meio foi importante
na tentativa de obter alguma bactéria que fosse incapaz de crescer no ágar nutriente.
Um total de 22 colônias foi selecionado, sendo que algumas apresentavam mesmas
características, mas eram de amostras de rejeito diferentes ou de diluições seriadas
diferentes. A Tabela 5.6 apresenta a origem e as características dessas colônias.
Todas as colônias selecionadas foram transferidas para os meios líquidos correspondentes e
seu crescimento analisado pela turvação do meio, no caso do caldo nutriente, e pela
transparência, no caso do meio Bromfield modificado, como pode ser visto na Figura 5.9.
Posteriormente estas culturas foram transferidas para meios sólidos para a confirmação e
obtenção das colônias isoladas. Observações microscópicas diretas das células presentes
nos cultivos revelaram que o número de células no cultivo com caldo nutriente foi maior do
que no cultivo em meio Bromfield modificado (resultados não mostrados).
93
Tabela 5.6. Origem e características das 22 colônias isoladas
Colônia Origem da amostra/diluição Meio de Isolamento Características da Colônia
A Rejeito Composto/ 100 Ágar nutriente Espaçadas, arredondadas e brancas
B Rejeito Composto/ 10-1 Ágar nutriente Isolada, arredondada e branca
C Rejeito Composto/ 10-2 Ágar nutriente Isoladas, irregulares e brancas
D Rejeito Composto/ 100 Bromfield modificado Pequenas, redondas e transparentes
E Rejeito Composto/ 100 Bromfield modificado Pequenas, redondas e transparentes
F Rejeito Composto/ 10-1 Ágar nutriente Pequenas, redondas e transparentes
G Rejeito Composto/ 10-1
Ágar nutriente Isoladas, irregulares e brancas
H Rejeito da Barragem/ 100 Ágar nutriente Ramificadas e brancas
I Rejeito da Barragem/ 10-1 Ágar nutriente Isoladas, redondas e transparentes
J Rejeito da Barragem/ 10-1 Ágar nutriente Isoladas, irregulares e brancas
K Rejeito Composto/ 100 Bromfield modificado Pequenas, redondas e transparentes
L Rejeito da Barragem/ 10-2 Ágar nutriente Pequenas, transparentes e cremosas
M Rejeito da Barragem/ 10-2 Ágar nutriente Isoladas, irregulares e brancas
N Rejeito Composto/ 10-2 Ágar nutriente Pequenas, transparentes e cremosas
O Rejeito Composto/ 10-1 Bromfield modificado Grandes, ramificadas e brancas
P Rejeito da Barragem/ 100 Bromfield modificado Pequenas, ramificadas e brancas
Q Rejeito da Barragem/ 10-1 Bromfield modificado Pequenas e transparentes
R Rejeito da Barragem/ 10-2
Bromfield modificado Grandes e transparentes
S Rejeito Composto/ 10-1 Bromfield modificado Grandes, ramificadas e brancas
T Rejeito da Barragem/ 100 Bromfield modificado Pequenas, ramificadas e brancas
U Rejeito da Barragem/ 10-1 Bromfield modificado Pequenas e transparentes
V Rejeito da Barragem/ 10-2 Bromfield modificado Grandes e transparentes
94
(a)
(c)
(b)
(d)
Figuras 5.9. Fotografias dos tubos de ensaio contendo meio líquido para crescimento de microrganismos. (a)
Tubos com coloração amarelada contêm caldo nutriente e tubo com coloração transparente contém meio
Bromfield modificado; (b, c, d) Tubos com caldo nutriente.
A técnica de coloração diferencial de Gram é muito utilizada na microbiologia para
diferenciar a estrutura da parede celular, classificando os organismos em Gram negativos,
quando a parede celular é constituída por estruturas de múltiplas camadas de
peptidoglicano, lipoproteínas e lipopolissacarídeo bastantes complexas, ou Gram positivos,
quando a parede celular consiste de única camada de peptidoglicano, característica essa que
auxilia o processo de identificação de microrganismos. Foram confeccionadas lâminas de
Gram das 22 culturas isoladas crescidas em meio sólido, como pode ser observado na
Figura 5.10 (a e b).
95
Figura 5.10a. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração de Gram dos 22
isolados, chamados de A à R, em aumento de 1.000x..
A B C
D E F
G H I
J K L
M N O
P Q R
96
Figura 5.10b. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração de Gram dos 22
isolados, chamados de S à V, em aumento de 1.000x..
Todos os isolados apresentaram forma bacilar e classificados como Gram positivos, pois
apresentaram coloração roxa. As lâminas de Gram apresentaram uma estrutura não
diferenciada ao fundo e, então foi testada a capacidade de produção de esporos através da
coloração específica de esporos, chamada Verde de Malaquita. As imagens das lâminas
coradas pela coloração de esporos estão nas Figura 5.11 (a e b).
Figura 5.11a. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração Verde de Malaquita
dos 22 isolados, chamados de A à F, em aumento de 1.000x.
S T U
V
A B C
D E F
97
Figura 5.11b. Imagens de microscopia óptica das lâminas confeccionadas com coloração Verde de Malaquita
dos 22 isolados, chamados de A à V, em aumento de 1.000x.
G H I
J K L
M N O
P Q R
S T U
V
98
Pode-se observar que todos os isolados apresentaram grande número de esporos, corados
em verde pelo corente verde de malaquita. Essas imagens confirmaram a capacidade dos
isolados em produzir esporos. A capacidade de produzir esporos é uma característica
comum dentro do grupo das bactérias Gram-positivas. Dentre elas destacam-se dois
gêneros: Clostridium e Bacillus.
Quando os nutrientes essenciais se esgotam, bactérias dos gêneros Clostridium e Bacillus
formam células especializadas de “repouso”, chamadas de endosporos. Exclusivo das
bactérias, esses endosporos são células desidratadas altamente duráveis, com paredes
espessas e camadas adicionais, formados dentro da membrana celular bacteriana. Quando
liberados no ambiente, podem sobreviver a temperaturas extremas, falta de água e
exposição a muitas substâncias químicas tóxicas e radiação. Os endosporos podem
permanecer dormentes por milhares de anos e então retornar ao seu estado vegetativo pelo
processo de germinação, formando uma célula (TORTORA, 2005).
Os indivíduos do gênero Clostridium são anaeróbios obrigatórios e não conseguiriam
crescer nas condições aeróbias das amostras analisadas. Assim, de acordo com os
resultados, pode-se supor que os isolados obtidos a partir dos cultivos das amostras da
barragem e a do rejeito composto sejam bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, pois
apresentaram a forma de bastonetes, foram caracterizados como Gram- positivos e são
microrganismos aeróbios, características essas presentes nos indivíduos do referido gênero
(SLEPECKY et al., 2006).
O procedimento de extração do DNA bacteriano foi realizado para todas as culturas
isoladas, mas provavelmente a qualidade dos extratos eram ruins (resultado não mostrado).
Todos os extratos genômicos foram submetidos ao procedimento de amplificação da região
DNAr 16S do domínio Bacteria, com os iniciadores 27F e 1492R, porém o resultado só foi
positivo para o isolado K. A presença do fragmento de DNA de interesse foi confirmada
após eletroforesse em gel de agarose 1% corado com SyberSafe DNA Gel Stain (Invitrogen)
(Figura 5.12).
De acordo com os resultados de diversas tentativas de amplificação dos produtos da
extração de DNA dos isolados das amostras de rejeito, apenas o isolado K foi amplificado e
99
esse amplicon foi enviado para o sequenciamento genético. Foram obtidas as sequências do
DNA com ambos os iniciadores a fim de obter a totalidade do fragmento que corresponde
ao gene DNAr 16S. De posse das duas sequências, a sequência consenso foi obtida, de
ótima qualidade, que permitiu a realização das comparações no banco de dados do
GenBank e obtenção da árvore filogenética utilizando as ferramentas disponíveis no site
“Ribossomal Data Base 10” (COLE et al., 2009).
Figura 5.12. Gel de agarose 1,0%, corado com SyberSafe DNA Gel Stain (Invitrogen). As bandas fluorescente
indicam o resultado positivo da reação de amplificação dos fragmentos do DNA ribossomal 16S dos isolados
A à V e a amostra controle “branco”.
Os resultados da comparação da sequência do isolado K com outras bactérias cultiváveis e
não cultiváveis resultou em níveis de similaridade superiores a 98% com espécies do
gênero Bacillus, chegando a 99% de similaridade com as espécies B. amyloliquefaciens e B.
subtilis. A Figura 5.13 mostra a árvore filogenética gerada com as sequências relacionadas,
onde é possível visualizar uma maior proximidade do isolado K com a espécie B.
amyloliquefaciens cultura Ba-B128, uma bactéria associada a corais.
100
Bacillus amyloliquefaciens| Ba-B128 AY620954
cultura K
Bacillus subtilis subsp. subtilis MO4 AY553097
Bacillus subtilis DSM10 AJ276351
Bacillus licheniformis DSM13 X68416
Bacillus cohnii DSM6307 X76437
Bacillus gibsonii DSM8722 X76446
Bacillus sp. DSM 8724 X76448
Bacillus thuringiensis ATCC33679 AF290549
Bacillus cereus ATCC 27877 Z84581
Enterococcus faecium DSM20477 AJ276355
93
77
74
91
100
47
32
83
100
0.005
Figura 5.13. Árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S (~ 1.300 pb) construída pelo
método Neighbor-Joining. Análise de Bootstrap com 1000 réplicas. Barra corresponde a 0,5%.
Dessa forma, de acordo com os resultados morfológicos e moleculares, pode-se considerar
o isolado K pertencente ao gênero Bacillus, com alta similaridade com a espécie B.
amyloliquefaciens.
Os membros do gênero Bacillus são organismos onipresentes, em forma de bastão, Gram
positivos e catalase positivos. Esse é um dos gêneros com maior diversidade 16S e
diversidade ambiental. Os indivíduos desse grupo têm a capacidade de formar um duro e
protetor endósporo, que é formado em épocas de estresse nutricional, permitindo que o
organismo persista no ambiente até que as condições se tornem favoráveis.
Apesar de não plenamente identificados, os isolados obtidos em ambos os meios a partir
dos cultivos das amostras da barragem de rejeitos e do rejeito composto parecem pertencer
ao gênero Bacillus, porém provavelmente há diferentes espécies, visto as diferenças
observadas no crescimento das colônias (Figura 5.15) e dos esporos (Figura 5.18).
O isolamento exclusivo de Bacillus a partir da metodologia empregada sugere que este
gênero bacteriano seja um membro dominante na comunidade bacteriana aeróbia presente
nas amostras. Sua característica de esporulação provavelmente o torna um genêro adaptado
às condições adversas presentes nas barragens e rejeitos da flotação, principalmente pela
101
elevada alcalinidade do meio (pH~10, subitem 5.3). Desta forma, bactérias esporulantes
teriam vantagem seletiva frente a outras bactérias e dominariam o ambiente.
Especificamente Bacillus amyloliquefaciens é uma bactéria aeróbia, encontrados em
amostras de solo na natureza. Esse microrganismo é conhecido por sua capacidade de
degradar algumas proteínas extracelulares, por produzir algumas proteínas como o
antibiótico natural, a proteína rionuclease barnase, alfa-amilase utilizada na hidrólise do
amido, protease subtilisina, uma enzima que catalisa a quebra de proteínas de forma
semelhante à tripsina, usada em detergentes, cosméticos e processamento de alimentos
(SLEPECKY et al., 2006; TORTORA, 2005). A capacidade de hidrolisar o amido pode ser
considerada uma característica importante para as bactérias presentes nos rejeitos de
flotação, uma vez que o amido é utilizado no processo de flotação como depressor dos
óxidos de ferro, sendo constituído basicamente pela condensação de moléculas de glicose,
além de proteínas, fibras, material mineral e óleos (PERES E CORREA, 1996). O amido
poderia ser, portanto, também um substrato para o crescimento destas bactérias no
ambiente.
Bacillus subtilis, conhecido também como o bacilo de feno ou bacilo de grama, é também
uma bactéria flagelada comumente encontrada no solo, aeróbia estrita, catalase positivos e
produtora da enzima proteolítica subtilisina. São indivíduos mesofílicos, que vivem à
temperatura média de 25-35°C (SLEPECKY et al., 2006; TORTORA, 2005).
Na literatura não há registros sobre a presença de Bacillus subtilis e Bacillus
amyloliquefaciens em barragem de rejeitos da flotação do minério de ferro, mas sabe-se que
esse gênero possui vários representantes associados aos depósitos de minerais (DEO e
NATARAJAN, 1998a), os quais estão sendo utilizados como “reagentes” em processo de
separação de determinados minerais, com resultados satisfatórios, como é o caso do
biobeneficiamento da bauxita, para a remoção de sílica, utilizando bactérias heterotróficas,
como Bacillus circulans e Bacillus mucilaginous (OGURTSOVA et al., 1990).
DEO e NATARAJAN (1998) estudaram o processo de biodegradação das aminas graxas
pela bactéria Bacillus polymyxa, a qual está associada a vários depósitos do minério de
ferro. Foi observado que essa bactéria é capaz de degradar acetato de dodecilamônio para
102
retirar carbono e nitrogênio requeridos para o seu crescimento, gerando, no meio, produtos
como polissacarídeos, aminoácidos e ácidos graxos como produto do metabolismo.
CHOCKALINGAM et al. (2003), a fim de avaliar se o crescimento da Bacillus polymyxa é
inibido ou não pela presença de coletores orgânicos, realizaram estudos de crescimento
bacteriano em concentrações de 50, 100 e 200mg.L-1
de isopropil xantato de sódio, acetato
de dodecilamônio e oleato de sódio. Os resultados indicaram que o B. polymyxa, uma
bactéria associada aos depósitos de minerais, pode ser cultivada na presença destes
coletores orgânicos e há indicação de esporulação das células durante o crescimento na
presença dos insumos. Foi observado também que a biodegradação do acetato de
dodecilamônio é bastante efetiva durante o crescimento bacteriano do B. polymyxa.
DEO e NATARAJAN (1998b) estudaram sobre a remoção biológica de coletores em
partículas de minerais e puderam observar que os coletores derivados de aminas, acetato de
dodecilamônio (DDA) e isododecil oxipropil aminopropil amina (DA16), foram removidos
do sistema e foram também degradados pelo Bacillus polymyxa. Há indícios que levam à
conclusão que um aldeído é formado quando as aminas são oxidadas. A degradação da
maioria das aminas forma H2O2 como produto metabólico e suspeita-se que este produto é
destruído pela catalase endógena, uma enzima específica.
Uma análise preliminar de amostras de água de jazidas de bauxita na Índia mostrou a
presença de um número de bactérias heterotróficas pertencentes ao gênero Bacillus, como
Bacillus polymyxa e Bacillus coagulans. Entre as várias espécies, Bacillus polymyxa, uma
bactéria anaeróbia facultativa, é um organismo interessante, pois remove tanto o cálcio
como o ferro do sistema de separação de partículas (ANAND et al., 1996).
DEO e NATARAJAN (1999, 1997) estudaram o comportamento dos polissacarídeos
extracelulares e das proteínas das células de Bacillus polymyxa na presença dos minerais
calcita, hematita, coríndon e quartzo, e observou que a interação do B. polymyxa com os
minerais levou a mudanças significativas tanto na superfície dos minerais como no
microrganismo, sendo que o quartzo tornou-se mais hidrofóbico e a calcita, a hematita, o
coríndon tornaram-se mais hidrofílicos. Assim, uma eficiente remoção da sílica de outros
103
minerais pode ser alcançada através do processo de bioflotação (BOTERO et al., 2008;
DEO e NATARAJAN, 1999 e 1997).
NATARAJAN e DEO (2001, 1998b) estudando sobre a interação das proteínas e
metabólitos do Bacillus polymyxa com a hematita, coríndon, calcita, quartzo e caulinita,
observaram novamente significativas mudanças da superfície química dos minerais e da
bactéria, comprovando maior hidrofobicidade do quartzo e da caulinita, e maior
hidrofilicidade da hematita, coríndon e da calcita.Foi observado também que a presença de
determinado mineral influencia o crescimento microbiano e, consequentemente, a produção
de proteínas, na presença de caulinita e quartzo, ou de polissacarídeos, na presença de
calcita, hematita e coríndon. Os testes de flotação realizados com os minerais, após um
tratamento preliminar com os metabólitos bacterianos, indicaram que as taxas de
sedimentação da calcita, hematita e coríndon aumentaram, assim como as taxas da caulinita
e quartzo diminuíram, facilitando o processo de flotação e viabilizando o
biobeneficiamento.
Analisando a adsorção do Bacillus polymyxa às partículas de hematita e quartzo,
SHASHIKALA e RAICHUR (2002) observaram que uma maior quantidade de células é
adsorvida na superfície da hematita do que na do quartzo. Essa diferença foi atribuída,
também, à hidrofobicidade, pois, a hematita e as bactérias possuem cargas opostas, o que
provavelmente leva a uma maior atração e adsorção, ao contrário do quartzo, que é
hidrofílico, não atraindo intensamente as células microbianas.
PATRA e NATARAJAN (2003) também utilizaram o Bacillus polymyxa para analisar a
interferência dessa bactéria nas taxas de sedimentação do quartzo, pirita e calcita.
Observaram que as células de B. polymyxa apresentaram maior afinidade pela pirita do que
pelas partículas de quartzo e de calcita, mas significativas alterações na composição
química da superfície foram encontradas para esses últimos após a interação bacteriana. A
separação da pirita do quartzo, após o tratamento com células ou produtos metabólicos
extracelulares, foi eficiente através da flotação. Assim, a remoção da pirita das pilhas de
rejeitos da flotação convencional pode ser realizada pelo biobeneficiamento.
104
Muitos microrganismos precisam de determinados elementos químicos como importante
mineral biológico para seus processos metabólicos. Nos estudos realizados por ANAND et
al (1996), utilizando uma cultura pura de Bacillus polymyxa NCIM 2539, foi observado
que estes microrganismos apresentam um metabolismo dependente de cálcio, uma vez que
houve crescimento reduzido quando na ausência desse composto. O número de células
bacterianas presentes nestes experimentos foram compatíveis com a presença de CaCO3 ou
de minério bauxita, o que sugeriu que o Bacillus polymyxa é capaz de utilizar o cálcio
presente na bauxita para o seu crescimento e metabolismo. A fonte e a quantidade de
carbono presente no meio determinaram a geração de polissacarídeos extracelulares, sendo
que a maior taxa de crescimento e de produção de metabólitos ocorreram na presença de
2% de sacarose. Além disso, essa bactéria gerou produtos metabólicos secundários, como
os ácidos acético, nítrico e oxálico, o que foi evidenciado pela diminuição significativa do
pH durante o crescimento microbiano (VASAN et al., 2001; ANAND et al., 1996;
MANKAD e NAUMAN, 1992).
Para a flotação aniônica da apatita e dolomita, já foi demonstrado que Bacillus subtilis e
Bacillus lichenformis e seus produtos metabólicos agem com a função de depressores da
flotação (ZHENG e SMITH, 1997a,b apud SMITH e MIETTINEN, 2006). Staphylococcus
carnous, Bacillus firmus, B. subtilis e B. lichenformis também atuam como agentes
coletores no processo de flotação da apatita e calcita (MIETTINEN et al., 2003a,b apud
SMITH e MIETTINEN, 2006).
Além de indivíduos do gênero Bacillus, na literatura há registros de outras bactérias que
também podem interferir no processo de separação de minerais, como o Acidithiobacillus
ferrooxidans e o Acidithiobacillus thiooxidans, que são capazes de afetar as características
da superfície dos minerais e afetar o comportamento de flotação dos minerais (HOSSEINI
et al., 2005; SANTHIYA et al., 2001).
PRAKASAN e NATARAJAN (2010) estudaram sobre a separação do quartzo e da
hematita utilizando Desulfovibrio desulfuricans NCIM 2047, uma bactéria Gram-negativa,
redutora de sulfato, anaeróbia facultativa, que está naturalmente associada aos depósitos de
minério de ferro e está relacionada com a biomineralização de vários óxidos de ferro. A
105
adaptação do microrganismo ao mineral influenciou a produção de proteínas e
polissacarídeos, que adsorveram nos minerais, sendo que a superfície do quartzo tem alta
afinidade pelos compostos protéicos e a hematita pelos polissacarídeos. Assim, foi possível
separar os minerais, uma vez que as proteínas bacterianas aumentaram a hidrofobicidade do
quartzo, e a adsorção dos polissacarídeos deprimiu a hematita.
MESQUITA et al. (2003) avaliaram a interação de Rhodococcus opacus no sistema de
flotação de quartzo/hematita e observaram que os dois minerais apresentraram maior
flotabilidade na presença desta bactéria. Cerca de 90% da hemaita pode ser flotada para o
pH em torno de 4,0, e 72% para pH entre 6 e 12. Em contrapartida, o quartzo apresentou
maior flotabilidade em pH em torno de 3, alcançando 42%, e para valores de pH maiores
que 4, este mineral praticamente não apresentou flotabilidade. Apesar de as partículas de
hematita e quartzo apresentarem superfícies polares, dando carácter hidrofílico à estes
minerais, o mecanismo de interação entre as células bacterianas e as partículas minerais
pareceram ser diferentes e por isso a separação seletiva entre hematita e quartzo, utilizando
apenas R. opacus como reagente em pH7, foi alcançada nos testes de microflotação.
A bactéria Escherichia coli também é utilizada em processos de separação seletiva de
minerais, atuando como agente coletor da flotação de quartzo em condições ácidas
(FARAHATA et al., 2009).
Os estudos a respeito do biobeneficiamento estão em períodos de aprofundamento e análise
uma vez que se sabe do potencial da utilização de bactérias e outros microrganismos, e seus
produtos metabólicos, na flotação e floculação (SMITH e MIETTINEN, 2006), sendo que o
uso de seres vivos naturalmente presentes no ambiente torna o processo não oneroso e
também diminui os impactos ambientais causados pelos coletores químicos, mesmo
sabendo que para atuarem nos processos esses microrganismos, ou derivados metabólicos,
devem estar presentes em grandes quantidades (SMITH e MIETTINEN, 2006).
Dessa forma, sabendo do potencial do biobeneficiamento, pode-se avaliar o grau de
interferência natural do Bacillus identificado neste estudo no processo de flotação do
minério de ferro, de maneira positiva ou negativa.
106
5.5. COMPARAÇÃO DA DIVERSIDADE BACTERIANA NAS
AMOSTRAS DE REJEITO COMPOSTO E DA BARRAGEM DE
REJEITOS PELA TÉCNICA PCR-DGGE
O mesmo procedimento de extração de DNA dos isolados foi aplicada à fração sólida das
amostras brutas do rejeito composto (RC) e da barragem (RB), sendo possível obter o DNA
genômico total extraído dos microrganismos presentes nas amostras. A partir destes
extratos, realizou-se o procedimento de amplificação do gene DNAr 16S utilizando
iniciadores específicos para análise de bactérias por DGGE (357F-GC e 907R).
Simultaneamente foram realizadas amplificações com estes iniciadores a partir dos extratos
genômicos das culturas isoladas (Figura 5.14).
(a)
(b)
Figura 5.14. Gel PCR do DGGE. (a) Amostras brutas; (b) culturas puras.
107
Para o estudo de ecologia microbiana, a DGGE oferece um caminho rápido, pois independe
do cultivo dos microrganismos ela possibilita a identificação de populações predominantes
no ambiente. A DGGE é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de mesmo
comprimento, mas de diferentes sequências de pares de bases. Pelos fragmentos de RNAr
16S amplificados, diferentes perfis de banda podem ser visualizados representando a
diversidade filogenética de uma comunidade.
A análise por DGGE requer uma quantidade significativa de DNA e por isso, a necessidade
de uma amplificação por PCR antes da técnica. Uma amplificação completa do gene pode
ser obtida usando-se iniciadores universais para os domínios Bacteria. Depois da reação de
amplificação tem-se uma mistura dos genes rRNA 16S de todas as bactérias presentes nas
amostras.
A DGGE tem sido usada para caracterizar populações microbianas complexas em
ambientes naturais. Usando DGGE pode-se obter informações qualitativas sobre a
diversidade presente nas amostras, mas essas metodologias não fornecem dados
quantitativos, informação chave para a ecologia microbiana.
No geral, essas técnicas de eletroforese somente indicam as espécies predominantes na
comunidade. Vários estudos revelaram que populações bacterianas de 1% ou mais podem
ser detectadas por PCR-DGGE (MUYZER e WAAL, 1993). Um valor similar também foi
encontrado por LEE et al. (1996) usando PCR para caracterizar estruturas de comunidades
microbianas. No entanto, assim como todos os métodos, a DGGE possui suas limitações
sendo necessária a busca de novas estratégias para o isolamento e a caracterização
fisiológica de microrganismos a fim de revelar o papel da diversidade microbiana no
funcionamento dos ecossistemas.
Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida com
gradiente desnaturante de 30-70% a fim de separar os diferentes fragmentos de DNA
presentes nas amostras brutas. A Figura 5.15 (a) apresenta uma imagem do gel ilustrando o
perfil de bandas encontradas para as amostras RC e RB, observadas em duplicata.
108
(a) (b)
Figura 5.15. Gel de DGGE corado com brometo contendo fragmentos de DNA ribossomal 16S amplificado
com primers universais para Bacteria. (K e K‟) Isolado K; (RC e RC‟) Amostra bruta do rejeito composto;
(RB e RB‟) Amostra bruta do rejeito da barragem.
Por meio da caracterização microbiana presente nas amostras pela técnica de PCR-DGGE,
se obteve em geral, um pequeno número de bandas para as duas amostras envolvidas neste
trabalho. Como o perfil de bandas gerado pela técnica PCR-DGGE representa a diversidade
de bactérias dominante presente nas amostras, pode-se supor que poucas espécies compõem
a comunidade bacteriana nas amostras de rejeito composto e da barragem.
109
Uma das hipóteses para explicar essa baixa diversidade pode ser o fato de que as espécies
pobremente representadas não foram amplificadas ou foram amplificadas, mas foram
mascaradas por bandas mais intensas provenientes das espécies predominantes. Há de se
considerar ainda que o ambiente físico das amostras é bastante extremo considerando os
valores de pH medidos (~10), que certamente tem um impacto na diversidade bacteriana
presente.
YANG et al. (2010) analisaram a diversidade bacteriana no efluente alcalino de celulose,
chamado de licor negro, o qual é gerado a partir da tecnologia de extração alcalina. As
amostras foram coletadas no verão, outono, inverno e primavera e os valores de pH foram
de aproximadamente 8,5 no verão e outono, mas acima de 10 no inverno e na primavera.
Através da técnica PCR-DGGE foi observado que a diversidade bacteriana sofreu
alterações de acordo com as condições da amostra, sendo encontrada maior diversidade nas
amostras do verão e do outono, as quais apresentaram menor pH e temperatura entre 20 e
40°C. Nas amostras do inverno e da primavera foi observado uma menor diversidade
bacteriana, sendo essa justificada pelo alto valor de pH e, também, pela temperatura
extrema de -15°C.
Aparentemente a abundância de algumas bactérias presentes no resíduo composto diminui
na barragem uma vez que algumas bandas presentes na amostra RC não apareceram na
amostra RB. Este resultado pode ser visto nas réplicas das corridas do DGGE mostradas na
Figura 5.15 (a). A barragem recebe, além dos resíduos provenientes da flotação do minério,
águas residuárias de outros processos, permanecendo neste ambiente por longo período de
detenção. Apesar desta diferença, os motivos que explicam o resultado comparativo entre
os dois pontos de amostragem permanece desconhecido, uma vez que somente com uma
plena caracterização dos ambientes de coleta poderia mostrar o que de fato difere entre eles.
Infelizmente não foi possível comparar o perfil de bandas das amostras brutas com todos os
isolados obtidos, pois, mesmo após várias tentativas a qualidade dos produtos de PCR
gerados não foram suficientemente bons para serem detectados pela técnica DGGE. Porém
foi possível comparar o perfil de bandas das amostras brutas com o fragmento
correspondente ao isolado K, identificado como pertencente ao gênero Bacillus.
110
O produto da PCR obtido do isolado K foi comparado com produtos das amostras brutas
RC e RB, conforme Figura 5.15 (b), onde pode ser confirmada a presença considerável do
isolado K nas amostras do rejeito composto. A elevada intensidade correspondente à banda
do isolado K na amostra RC indica que esta bactéria é de fato um membro bacteriano
dominante no ambiente, o que justifica a obtenção de isolados similares, provavelmente
pertencentes ao gênero Bacillus, tal como o isolado K.
YANG et al. (2010) estudaram sobre a diversidade bacteriana no licor negro da celulose e
identificaram os principais grupos bacterianos em amostras coletadas no verão, outono,
inverno e primavera, sendo que essas amostras apresentaram variados valores de pH e
temperatura e diferente diversidade bacteriana. Foram encontrados 10 gêneros nessas
amostas, como Alkalibacterium, Atopostipes, Bacillus, Halolactibacillus, Amphibacillus,
Clostridium, Actinobacuus, Halomonas, Desulfobacterium e Aquabacterium, sendo a maior
a parte deles pertencentes ao filo Firmicutes, no qual a grande maioria dos indivíduos é
formadora de esporos, o que justifica então a diversidade bacteriana encontrada. Cerca de
50% dos indivíduos nas amostras da primavera e do inverno pertenceram ao gênero
Alkalibacterium, o qual apresenta capacidade de crescimento em temperaturas abaixo de
45ºC e pH entre 9 a 12. A espécie anaeróbia Clostridium apareceu com proporções elevadas
nas amostras do verão e do outono e representou menor proporção nas demais amostras, o
que pode ser justificado pelas temperaturas mais elevadas no verão e outono, o que fez com
que muitas bactérias aeróbias consumissem mais oxigênio dissolvido e, em seguida,
formou-se um melhor ambiente anaeróbico para o crescimento de espécies de Clostridium.
Mas, diferente da variação encontrada nesses grupos, o gênero Bacillus apareceu em todas
as amostras e apresentou uma pequena variação, sendo considerado o grupo mais estável
encontrado nas amostras. Por ser este um gênero com capacidade de esporulação, foi
sugerido que as condições alcalinas extremas e a grande variação da temperatura não
afetaram esse grupo de microrganismos.
Tentou-se realizar a purificação das bandas obtidas no gel de poliacrilamida das amostras
brutas para posterior sequenciamento e identificação por meio de análises comparativas em
bancos de dados. No entanto as amplificações não apresentaram resultados satisfatórios,
não sendo possível realizar a identificação desse material.
111
Cabe ressaltar que a técnica PCR-DGGE aplicada à este estudo, utilizou apenas iniciadores
para o domínio Bacteria, e que portanto possui amplitude restrita ao grupo das bactérias.
Outros microrganismos podem estar presentes nas amostras isoladas, tais como fungos
filamentosos, leveduras e arquéias, e que ainda podem ter alguma participação no processo
de biodegradação in situ das aminas, porém ainda é um campo para ser investigado,
5.6. TESTES DE BIODEGRADABILIDADE DAS ÉTER-AMINAS
PELAS BACTÉRIAS ISOLADAS
Os microrganismos isolados foram utilizados nos testes de biodegradação das éter-aminas
para análise do potencial degradador de cada um, e também para análise da degradação de
todos esses isolados em conjunto. Os sistemas contendo microrganismo, éter-aminas,
resíduo de ferro e meio de cultura foram incubados na estufa à 35°C±2°C e a concentração
de éter-aminas foi monitorada nos tempos de 0, 3, 7, 14, 17 e 20 dias após a incubação,
através da retirada de alíquotas de 30mL para a execução do Método do Orange II. Os
resultados foram plotados em gráficos, conforme as Figuras 5.16. 5.17, 5.18(a e b), 5.19 e
5.20. As análises dos testes com os isolados permite observar que há uma tendência à
inibição da degradação em torno de 25mg.L-1
, sendo que nos testes em que a concentração
atinge esse valor, não se observa mais consumo do coletor.
112
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO A
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55BIODEGRADAÇÃO ISOLADO B
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo Nutriente
Bromfield modificado
(a) (b)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO C
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO J
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (c) (d)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO N
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (e)
Figura 5.16. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado A (a), B (b), C (c), J (d) e N (e) através do
Método do Orange II.
113
Os isolados A, B, C, J e N apresentaram rápida degradação dos coletores nos três dias
inciais do experimento, para o caldo nutriente, e ao longo do monitoramento a concentração
de éter-amina se manteve quase constante. Para as análises com o meio Bromfield
modificado, a concentração de amina se manteve constante em alguns casos e em outros a
degradação ocorreu lentamente ao longo dos 20 dias de monitoramento.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO D
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo Nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55BIODEGRADAÇÃO ISOLADO G
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (a) (b)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO R
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO T
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (c) (d)
Figura 5.17. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado D (a), G (b), R (c) e , T (d) através do
Método do Orange II.
Os testes com os isolados D, G, R e T apresentaram taxas de degradação pouco acentuadas
para os testes realizados com o caldo nutriente nos dia iniciais e mantendo-se pequenas ao
longo de todo o monitoramento. Quando utilizou-se o meio mínino, as taxas de degradação
114
também mantiveram-se baixas em todo o experimento, mantendo-se constante apenas para
o isolado G.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO F
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO H
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (a) (b)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55BIODEGRADAÇÃO ISOLADO I
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (c) (d)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO L
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO Q
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (e) (f)
Figura 5.18a. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado F (a), H (b), I (c), K (d), L (e), Q (f), R
(g), U (h) e V (i) através do Método do Orange II.
115
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO SC
ON
CE
NT
RA
ÇÃ
O (
mg
.L-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO U
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
(g) (h)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO V
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (i)
Figura 5.18b. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado F (a), H (b), I (c), K (d), L (e), Q (f), R
(g), U (h) e V (i) através do Método do Orange II.
A taxa de degradação das éter-aminas no caldo nutriente, para os isolados F, H, I, K, L, Q,
R, U e V, foram pequenas, mas constante, ao longo de todo período de observação,
enquanto que para os testes utilizando o meio Bromfield modificado, o consumo do coletor
foi muito baixo, mas também constante durante os 20 dias. O isolado K apresentou uma
grande diferença entre as concentrações iniciais e finais, mostrando-se como um potencial
degradador desses coletores orgânicos.
116
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO E
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55 BIODEGRADAÇÃO ISOLADO M
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nitriente
Bromfield modificado
(a) (b)
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO O
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
20
25
30
35
40
45
50
55
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO P
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
DIAS Caldo nutriente
Bromfield modificado (c) (d)
Figura 5.19. Análise da biodegradação das éter-aminas pelo isolado E (a) , M (b), O (c) e P (d) através do
Método do Orange II.
Para os isolados E, M, O e P as concentrações de éter-aminas mantiveram-se praticamente
constante durante todo o monitoramento, apresentando taxas degradação do insumo muito
pequenas para os dois meios de cultura testados.
117
0 100 200 300 400 500
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
BIODEGRADAÇÃO TODOS OS ISOLADOS
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (HORAS) Caldo nutriente
Bromfield modificado
Figura 5.20. Análise da biodegradação das éter-aminas por todos os isolados através do Método do Orange II.
O testes de biodegradabilidade das éter-aminas realizados com todos os isolados juntos,
mostrou uma elevada taxa de degradação, independente do meio de cultura utilizado. O
perfil de degradação foi bastante diferente, sendo que a degradação ocorre até cerca de
10mg.L-1
durante os 20 dias de observação.
Os testes realizados anteriormente para avaliar a degradação das éter-aminas utilizando
uma cultura pura de Serratia marccescens mostraram que essa bactéria sozinha não
apresentou perfil de degradação dos coletores. Quando se analisa as variações nas
concentrações iniciais e finais de amina nos testes com os isolados, pode-se perceber que
alguns isolados apresentaram taxas muito baixas de degradação, hipotetizando que,
sozinhos, esses isolados também não têm a capacidade de degradar a amina. Mas os
resultados do teste com todos os isolados juntos permitem inferir que a presença desses
microrganismos é indispensável para que o substrato seja consumido.
A Tabela 5.7 apresenta as concentrações iniciais e finais desses testes de biodegradação e a
taxa de degradação para cada teste.
Pode-se observar que para os isolados, a concentração final não foi menor do que 25mg.L-1
em nenhum teste, enfatizando que há uma inibição da degradação do coletor, independente
do meio de cultura utilizado, mas para todos os isolados juntos, observa-se uma
118
concentração final de 12,20mg.L-1
para o caldo nutriente e 15,20mg.L-1
para o Bromfield
modificado.
Apesar de não mensurado, é de se esperar que a quantidade de bactérias adicionadas nos
testes com isolados separados e misturados seja a mesma uma vez que foi preparada
utilizando as mesmas condições e volumes para produção do inóculo de 50mL de cada
experimento. Sendo assim, a diferença observada no ensaio com a cultura mista de
bactérias pode se referir a diferenças metabólicas das bactérias no consumo das aminas,
sendo algumas toleráveis a concentrações maiores, outras menores, e mesmo diferentes
graus de tolerância aos produtos de sua degradação. No entanto mais estudos necessitam ser
conduzidos para elucidar este mecanismo conjunto de biodegradação.
Tabela 5.7. Concentrações iniciais e finais e taxas de biodegradação dos isolados durante monitoramento.
CALDO NUTRIENTE BROMFIELD MODIFICADO
Concentrações Inicial
(mg.L-1
)
Final
(mg.L-1
)
Taxa de
degradação (%)
Inicial
(mg.L-1
)
Final
(mg.L-1
)
Taxa de
degradação (%)
Isolado A 42,00 31,5 25,00 42,20 42,40 0,00
Isolado B 49,60 36,60 26,21 46,10 40,90 11,28
Isolado C 52,1 37,80 27,45 45,00 40,80 9,33
Isolado D 41,60 33,80 18,75 41,40 39,50 4,59
Isolado E 30,30 26,90 11,22 37,30 35,00 6,17
Isolado F 36,50 29,90 18,08 40,20 40,70 0,00
Isolado G 37,50 27,30 27,20 41,80 39,70 5,02
Isolado H 37,70 31,30 16,98 43,60 39,20 10,09
Isolado I 36,50 25,20 30,96 33,30 30,90 7,21
Isolado J 36,50 29,00 20,55 34,90 24,90 28,65
Isolado K 41,30 26,40 36,07 43,50 31,30 28,05
Isolado L 38,90 29,00 25,45 36,60 34,70 5,19
Isolado M 32,10 28,10 12,46 31,00 28,20 9,03
Isolado N 31,40 22,70 26,75 30.40 29,20 3,95
Isolado O 33,00 30,20 8,48 36,20 33,10 8,56
Isolado P 34,70 31,50 9,22 33,6 32,50 3,27
Isolado Q 31,50 23,40 25,71 38,10 33,30 12,60
Isolado R 36,40 28,70 21,15 38,60 33,70 12,69
Isolado S 30,80 27,10 12,01 29,80 25,90 13,09
Isolado T 33,30 28,10 15,62 38,20 32,10 15,97
Isolado U 35,80 25,70 28,21 34,10 29,60 15,20
Isolado V 38,50 33,90 11,95 34,90 26,20 24,93
Todos isolados 32,60 12,20 62,58 32,80 15,20 53,66
119
Para os isolados O e T as taxas de biodegradação não sofreram interferência da composição
dos diferentes meios de cultura, pois foram encontradas taxas de biodegradação
significativamente iguais. Para os isolados J, S, V as taxas foram maiores para os testes
realizados com o meio Bromfield modificado, enquanto que para todos os outros 18 testes,
com os isolados A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, U e com todos os
isolados, as taxas de biodegradação foram maiores utilizando o caldo nutriente.
Nos testes realizados com S. marcescens, utilizando o verde de bromocresol para
quantificar as aminas, os resultados também não sofreram interferência do meio de cultura
utilizado, mas sim da metodologia de quantificação.
Na literatura há registros de vias de degradação de alguns compostos orgânicos pela ação
de microrganismos em conjunto, como o estudo que utilizou uma amostra de lodo ativado
de uma estação municipal de tratamento de efluentes domésticos de uma cidade do Japão,
para observar a biodegradabilidade de alguns sais quaternários de amônio. Durante as
análises foi observada a formação de alguns compostos durante o processo de
biodegradação, como trimeti-, dimetil- e metilamina, mas ao final das 117 horas de análise,
esses produtos não foram encontrados no meio, assim como o substrato adicionado
inicialmente. Assim, foi proposta uma rota de degradação, no qual o sal é inicialmente
degradado em trimetilamina, seguida pela degradação à dimetilamina, a qual é
metabolizada em metilamina pela mesma reação (NISHIYAMA et al., 1995).
Segundo VAN GINKEL e KROON (2007) existe uma relação de comensalismo ou
mutualismo entre os microrganismos que degradam compostos derivados de aminas graxas.
A maioria dos consórcios de microrganismos degradadores de surfactantes possui relação
de comensalismo, sendo que há produção e liberação no meio, por um microrganismo, de
uma substância que outra espécie utiliza como substrato de crescimento (VAN GINKEL,
1996; NISHIYAMA et al., 1995). Já a relação de mutualismo pode ser encontrada entre
comunidades microbianas em ambientes naturais, após estudos sobre a mineralização do
alquilbenzenosulfonato linear e do cloreto de deciltrimetilamônio (HRSAK et al., 1982;
DEAN-RAYMOND e ALEXANDER, 1977).
120
Outro consórcio microbiano foi representado por Pseudomonas e Xanthomonas, ao serem
analisadas através do metabolismo aeróbio do brometo de deciltrimetilamônio (DTM). Foi
observado que apenas a segunda bactéria cresceu sozinha na presença do insumo. Então,
através de técnicas de cromatografia, os subprodutos foram avaliados, uma vez que a não
ocorria completa degradação de DTM. Foram encontrados picos nos espectros dos
substratos, o que sugeriu que Xanthomonas oxida o carbono terminal da cadeia longa alquil
do composto quaternário de amônio quebrando-o em unidades acetil pela β-oxidação. A
presença de ácidos carboxílicos, liberados pelas Xanthomonas, pode ser de grande
importância como substrato para o crescimento das Pseudomonas, pois, os dois grupos de
microrganismos cresceram juntos na presença de DTM. Assim, provavelmente existe uma
relação de mutualismo entre os grupos, sendo que Pseudomonas fornece fatores de
crescimento para Xanthomonas, e essas convertem o DTM em compostos utilizados pelo
metabolismo das outras (DEAN-RAYMOND e ALEXANDER (1977).
Sabe-se também que a relação entre os microrganismos de uma cultura mista
provavelmente depende das condições ambientais. Em condições limitadas de fonte de
carbono para uma cultura mista de Burkholderia cepacia e Stenotrophomona maltophila,
não há dependência metabólica da primeira em relação à segunda, caracterizando uma
relação comensal. Mas em condições limitadas de nitrogênio, B.cepacia depende
metabolicamente da produção de amônio pelo metabolismo de S. maltophila, a qual é
dependente da produção de dimetilamina pela anterior. Neste caso, caracteriza-se uma
relação de mutualismo, sendo que um grupo dependente ativamente do outro (KROON e
VAN GINKEL, 2001).
Diante dessas diferenças nas taxas de biodegradação, foi selecionado o meio de cultura
caldo nutriente para que os testes de cinética pudessem ser realizados, pois esse apresentou
maior taxa de degradação na maior parte dos testes.
Por fim, dentre os isolados testados, a cultura K foi a que apresentou maior capacidade de
degradação das aminas, e assim foi escolhida para a realização de testes mais detalhados a
fim de determinar a cinética do consumo de aminas sob diferentes condições ambientais,
cujos resultados estão apresentados no item a seguir.
121
5.7. CINÉTICA DE BIODEDEGRADAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS
PELAS LINHAGENS ISOLADAS EM DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES E TEMPERATURAS
5.7.1. Aspectos Gerais
Os testes de cinética de biodegradação foram realizados com o isolado K e também com
todos os isolados juntos, utilizando apenas o meio de cultura caldo nutriente. Foram
testadas condições variadas de temperatura, 45, 40, 36,5, 30 e 20°C, de concentração de
éter-aminas, 25, 50 e 100mg.L-1
, e também de volume de cultura inoculado após 5 dias de
crescimento bacteriano. As análises das concentrações de éter-aminas foram realizadas, em
triplicata, pelo método do Orange II.
Na temperatura de 45°C, em todos os testes realizados (Anexo III), não foi observada
degradação do coletor, conforme ilustra a Figura 5.21. Esse fato pode ser explicado pela
capacidade de formação de esporos presente no gênero Bacillus. A presença de algum
estresse no ambiente induz a formação de esporos e como a temperatura de 45°C é bastante
superior à temperatura ambiente, esses microrganismos podem ter sido induzidos a produzir
esporos e esporulado, pois estão adaptados à temperaturas menores uma vez que são
bactérias presentes no meio ambiente terrestre.
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (3mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
Figura 5.21. Biodegradação das éter-aminas pelo isolado K - 3mL de inóculo, 50mg.L-1 de éter-amina e
diferentes temperaturas.
122
O monitoramento das concentrações de éter-aminas durante 8 horas permitiu observar que a
temperatura influenciou a taxa de degradação, sendo que a temperatura de 40°C foi a que
apresentou maior taxa de degradação em todos os testes e a de 20°C a que apresentou a
menor taxa de redução da concentração. As temperaturas de 36,5 e 30°C apresentaram
taxas intermediárias às encontradas para 40 e 20°C.
Os testes que continham 3mL de inóculo apresentaram maior perfil de degradação, assim
como os testes com 1mL desse mesmo inóculo apresentaram a menor taxa de
biodegradação, característica essa observada para todas as condições de temperatura.
Não foram realizadas contagens do número de células, mas espera-se que para um mesmo
tempo de crescimento, às mesmas condições, o número de células presente no inóculo de
3mL foi maior que o número presente em 2mL e este maior que em 1mL. Dessa forma,
para um maior número de células presente em um mesmo sistema, a capacidade de
degradação é considerada maior do que quando a concentração de células é menor.
As concentrações de éter-aminas testadas não inibiram a atividade microbiana em nenhuma
condição analisada. Foi observado que em todas as condições houve degradação, sendo que
para os testes com todos os isolados à 25mg.L-1
, para 2 e 3mL, a concentração final, após 8
horas de observação foi próxima de zero. Mas nos testes realizados apenas com o isolado
K, a biodegradação das éter-aminas ocorreu até a concentração de 25mg.L-1
, nunca sendo
encontrada abaixo desse valor (Anexo III). Assim, devido à ausência de degradação após
25mg.L-1
, para o isolado K, parece haver uma inibição da atividade metabólica quando a
concentração chega nesse nível.
Não se sabe ao certo a rota de degradação das éter-aminas, mas esses resultados
encontrados para o isolado K são bastante curiosos e levantam a idéia de que os isolados
separadamente não apresentam o mesmo perfil de degradação de quando estão em conjunto
no meio ambiente, partindo para a idéia de que a presença de todos esses microrganismos
na barragem de rejeitos é de fundamental importância para que os coletores possam ser
completamente degradados.
123
A relação entre os microrganismos de uma cultura mista provavelmente depende das
condições ambientais, sendo que um determinado organismo possa depender
incondicionalmente da presença de um outro e de produtos metabólitos desse, como em
condições limitadas de nitrogênio, em que a B.cepacia depende metabolicamente da
produção de amônio pelo metabolismo de S. maltophila, a qual é dependente da produção
de dimetilamina pela anterior, como ilustrado na Figura 3.10 (B) (KROON e VAN
GINKEL, 2001).
5.7.2. Determinação do modelo cinético
Os resultados dos testes de cinética com as condições variadas de temperatura,
concentração de insumo e volume de inóculo foram utilizados para construção do
modelamento cinético da biodegradação das éter-aminas, no qual foram testados os
modelos de Monod, primeira e segunda ordens. O modelo de ordem zero não é adequado,
em virtude do gráfico concentração em função do tempo não ser uma reta.
A Tabela 5.8 contém os coeficientes de determinação (R2) encontrados para o modelo de
Monod, conforme equação 3.7, aplicado ao isolado K e aos isolados em conjunto.
Tabela 5.8: Coeficiente de determinação (R2) para o modelo de Monod aplicado ao isolado K e aos isolados
em conjunto.
Isolado K Todos os isolados
Volume de cultura
Temperatura (0C)
3mL 2mL 1mL 3mL 2mL 1mL
R2 R
2 R
2 R
2 R
2 R
2
20 0,9450 0,9465 -0,94307 -0,45758 0,94678 0,52829
30 0,9450 -0,8369 0,94621 0,18322 -0,94353 0,50597
36,5 0,9464 0,9496 -0,94332 -0,79162 0,94443 -0,66041
40 0,9534 0,9487 0,95088 -0,9128 0,94553 -0,85928
45 0,7656 -0,8567 -0,85449 0,76234 -0,85671 -0,80292
Pode-se observar que os coeficientes de determinação encontrados mostram que o modelo
de Monod não representa a cinética de biodegradação das éter-aminas.
Os modelos de cinética de primeira e segunda ordens (equações 3.26 e 3.30,
respectivamente) foram também aplicados para os mesmos testes de biodegradação. A
Tabela 5.9 apresenta o coeficiente de determinação para os dois modelamentos. No caso da
124
cultura K, na concentração de 25mg.L-1
, não foram testados os modelos, assim como para a
temperatura de 45°C em todos os testes, pois conforme discutido anteriormente, não ocorre
biodegradação nestes casos.
Tabela 5.9. Coeficientes de determinação (R2) encontrados para os modelos de primeira e segunda ordens
aplicado ao isolado K e aos isolados em conjunto.
Temperatura
(°C) / inóculo
Concentração inicial
de amina (mg/L)
100
(1°ordem) (2°ordem)
50
(1°ordem) (2°ordem)
25
(1°ordem) (2°ordem)
Volume de inóculo R2 R
2 R
2 R
2 R
2 R
2
20°C/
Isolados
1 mL 0,995 0,992 0,968 0,955 0,858 0,864
2 mL 0,993 0,989 0,982 0,994 0,989 0,984
3 mL 0,989 0,981 0,985 0,967 0,966 0,955
20°C/
Isolado K
1 mL 0,985 0,987 0,963 0,972 - -
2 mL 0,992 0,994 0,982 0,972 - -
3 mL 0,994 0,996 0,947 0,962 - -
30°C/
Isolados
1 mL 0,988 0,984 0,975 0,955 0,938 0,915
2 mL 0,996 0,984 0,993 0,989 -0,430 0,976
3 mL 0,992 0,983 0,978 0,940 0,97 0,950
30°C/
Isolado K
1 mL 0,986 0,989 0,986 0,981 - -
2 mL 0,996 0,992 0,993 0,987 - -
3 mL 0,994 0,997 0,953 0,971 - -
36,5°C/
Isolados
1 mL 0,990 0,985 0,987 0,976 0,968 0,944
2 mL 0,997 0,996 0,988 0,966 0,620 0,951
3 mL 0,992 0,978 0,969 0,893 0,974 0,896
36,5°C/
Isolado K
1 mL 0,981 0,986 0,975 0,974 - -
2 mL 0,997 0,998 0,988 0,992 - -
3 mL 0,984 0,994 0,951 0,976 - -
40°C/
Isolados
1 mL 0,995 0,988 0,989 0,978 0,985 0,967
2 mL 0,998 0,993 0,832 0,954 0,174 0,828
3 mL 0,989 0,955 0,947 0,817 0,977 0,835
40°C/
Isolado K
1 mL 0,995 0,990 0,974 0987 - -
2 mL 0,958 0,975 0,832 0,841 - -
3 mL 0,920 0,939 0,732 0,861 - -
De acordo com os coeficientes encontrados pode-se observar que os dados ajustam-se a
ambos os modelos. Mas, ao analisar as curvas teóricas tanto do modelo de primeira quanto
125
de segunda ordem, conforme ilustra a Figura 5.22, verificou-se que o modelo de primeira
ordem foi o mais adequado (Anexo IV).
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica (a) (b)
Figura 5.22. Curva teórica. (a) primeira ordem; (b) segunda ordem.
A Tabela 5.10 apresenta os valores da constante de velocidade (K) obtidos, para a
biodegradação, considerando o modelo de primeira ordem.
Os valores de K para os testes com todos os isolados permite observar que, para 1 e 3mL de
inóculo, a velocidade de degradação tende à aumentar. Se o volume de inóculo é maior, a
quantidade de células presente no meio também é maior, o que justifica uma aceleração no
consumo do coletor. Os dados para 2mL de microrganismos com 25mg.L-1
, e alguns com
50mg.L-1
de éter-aminas, apresentaram-se muito baixos, indicando que possa ter ocorrido
algum erro durante as análises experimentais.
Para os testes realizados apenas com o isolado K, para todos os volumes de
microrganismos, mostraram que a taxa de consumo é maior na presença de maior volume
de células, exceto para as análises realizadas á 40°C, nas quais as taxas de degradação
mostraram-se semelhantes, não ocorrendo interferência do volume de inóculo.
126
Tabela 5.10. Constantes de velocidades (K) para cinética de primeira ordem.
Concentração inicial de amina (mg.L-1
) 100 50 25
Temperatura(°C)/inóculo Volume de bactéria K (d-1) K (d-1) K (d-1)
20°C/Isolados 1 mL 0,027 0,029 0,025
2 mL 0,041 0,035 0,002
3 mL 0,058 0,094 0,058
20°C/Isolado K 1 mL 0,021 0,016 -
2 mL 0,041 0,035 -
3 mL 0,048 0,046 -
30°C/Isolados 1 mL 0,040 0,047 0,037
2 mL 0,056 0,052 0,003
3 mL 0,069 0,129 0,097
30°C/Isolado K 1 mL 0,034 0,030 -
2 mL 0,056 0,052 -
3 mL 0,070 0,066 -
36,5°C/Isolados 1 mL 0,051 0,069 0,066
2 mL 0,059 0,060 0,005
3 mL 0,094 0,175 0,186
36,5°C/Isolado K 1 mL 0,051 0,043 -
2 mL 0,075 0,060 -
3 mL 0,090 0,080 -
40°C/Isolados 1 mL 0,062 0,095 0,109
2 mL 0,074 0,067 0,001
3 mL 0,147 0,254 0,368
40°C/Isolado K 1 mL 0,178 0,085 -
2 mL 0,172 0,067 -
3 mL 0,162 0,061 -
Conforme modelo de Arrhenius, a constante de velocidade (K) de uma reação é expressa da
seguinte forma:
RT
EAK aexp0
Equação 5.1
Onde: K = constante de velocidade (d-1
)
A0 = fator-pré-exponencial
Ea = energia de ativação (J)
T = Temperatura absoluta (k)
R = constante dos gases ideais (8,314 J.K-1
.mol-1
)
127
Desta forma um gráfico de lnK, utilizando a média das concentrações iniciais, versus 1/T
fornece a energia de ativação da reação, ou seja, inclinação –Ea/RT, como mostrado na
Figura 5.23.
0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345
-3,8
-3,6
-3,4
-3,2
-3,0
-2,8
-2,6
-2,4
TODOS OS ISOLADOS (1mL)
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 14,25114 2,46969
B -5255,13293 751,98497
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
-0,98013 0,12491 4 0,01987
lnK
1/T (a)
0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345
-3,7
-3,6
-3,5
-3,4
-3,3
-3,2
-3,1
-3,0
TODOS OS ISOLADOS (2mL)
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 5,65187 0,56949
B -2730,24585 173,40115
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
-0,99599 0,0288 4 0,00401
lnK
1/T
(b)
128
0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345
-2,8
-2,6
-2,4
-2,2
-2,0
-1,8
-1,6
-1,4
TODOS OS ISOLADOS (3mL)
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 15,13701 3,53232
B -5244,16855 1075,53758
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
-0,96042 0,17865 4 0,03958
lnK
1/T (c)
0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345
-4,0
-3,5
-3,0
-2,5
-2,0
ISOLADO K (1mL)
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 22,52754 8,07867
B -7813,22375 2459,83583
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
-0,91354 0,40859 4 0,08646
lnK
1/T (d)
129
0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345
-3,4
-3,2
-3,0
-2,8
-2,6
-2,4
-2,2
-2,0
ISOLADO K (2mL)
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 12,57396 4,37269
B -4668,52983 1331,41925
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
-0,92741 0,22115 4 0,07259
lnK
1/T (e)
0,00320 0,00325 0,00330 0,00335 0,00340 0,00345
-3,2
-3,0
-2,8
-2,6
-2,4
-2,2
ISOLADO K (3mL)
Y = A + B * X
Parameter Value Error
------------------------------------------------------------
A 9,67957 1,4272
B -3740,22184 434,56059
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
-0,98677 0,07218 4 0,01323
lnK
1/T (f)
Figura 5.23. Gráficos lnK x 1/tempo para cinética de primeira ordem (a, b, c) Todos isolados, 1, 2 e 3mL,
respectivamente. (d, e, f) Isolado K, 1, 2 e 3mL.
130
Os coeficientes de determinação (R2) foram retirados destes gráficos e estão apresentados
na Tabela 5.11, juntamente às Ea (J) para cada sistema.
Tabela 5.11. Energia de Ativação (EA) e coeficiente de determinação (R2) para o modelo de primeira ordem.
Energia de Ativação (EA) (J) R2
Cultura mista (1mL) 43693,28 -0,98013
Cultura mista (2mL) 22700,36 -0,99599
Cultura mista (3mL 43602,11 -0,96042
Cultura K (1mL) 64962,27 -0,91354
Cultura K (2mL) 38816,02 -0,92741
Cultura K (3mL) 31097,70 -0,98677
Os cálculos das Ea do sistema permitem inferir que a concentração de inóculo do isolado K
está interferindo no processo de degradação do substrato, pois, quando havia apelas 1mL
dessa cultura crescida no sistema, a energia de ativação encontrada foi de 64.962,27J,
enquanto que para 2mL de microrganismos, a energia diminuiu para 38.816,02J e para 3mL
foi de 31.097,70J. Isso indica que quando mais células há no sistema, menor é a energia
necessária para que se inicie a degradação.
Quando se utilizou os isolados juntos, a energia de ativação encontrada para 1mL foi de
43.693,28J, enquanto para 2mL foi de 22.700,36J. Para 3mL de bactérias foram
encontrados 43.602,11J, valor muito semelhante ao encontrado para 1mL. A discrepância
encontrada para a Ea utilizando 2mL de inóculo pode indicar que esse modelo de primeira
ordem não está ajustando aos dados da biodegradação das éter-aminas para essas
condições, ou que possa ter ocorrido algum erro experimental. No entanto, encontrar
valores próximos para 1 e 3mL indica que o volume de microrganismos inoculados não
interferiu no proceso de degradação das aminas, sendo necessário uma mesma quantidade
de energia para iniciar o processo de degradação do coletor orgânico.
131
CAPÍTULO 6 – CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho pode-se concluir que:
O método do Verde de Bromocresol não foi adequado para a análises das éter-aminas
em cultivo e meio de cultura Caldo Nutriente e Bromfield modificado, porém a
interferência foi eliminada pela aplicação do método do Orange II para a
concentração das éter-monoamina e éter-diamina nos referidos meios de cultura.
A bactéria Serratia marcenscens não degrada as éter-monoamina e éter-diamina
quando presentes isoladamente em um sistema, mesmo na presença de minério de
ferro como substrato.
Um total de 22 isolados bacterianos foram obtidos das amostras brutas do rejeito
composto e da barragem de rejeitos da flotação do minério de ferro, sendo todos
caracterizados como indivíduos do gênero Bacillus, Gram-positivos e com
capacidade de produção de esporos. A identificação de um dos isolados, cultura K,
foi realizada com base na sequência do DNAr 16S como pertencente à espécie
Bacillus amyloliquefasciens.
Os testes de biodegradabilidade das éter-aminas pelos isolados mostraram que
separadamente o perfil de degradação é muito baixo, sendo que para alguns isolados
não foi encontrada nenhuma degradação do substrato. O isolado K foi o que
apresentou maior perfil de degradação individual das éter-aminas. Porém, quando
inoculados em conjunto, a cultura mista composta por todos os isolados apresentou
maior capacidade de degradação, e em alguns casos 100% da amina adicionada foi
degradada.
O estudo da cinética de degradação das éter-aminas mostrou que a temperatura
influencia a taxa de degradação, sendo que a 45°C não foi encontrada degradação
do coletor, a 40°C foi encontrada a maior taxa de degradação e a 20°C a menor taxa
de degradação do substrato.
O modelamento matemático da cinética de degradação mostrou que o modelo de
primeira ordem ajusta melhor aos dados, avaliado através dos coeficientes de
determinação encontrados, indicando que a velocidade de degradação das éter-
aminas é proporcional ao aumento do substrato.
132
CAPÍTULO 7 - SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Determinar e quantificar os possíveis produtos formados pela degradação das éter-
aminas;
Identificar as bactérias detectadas pela técnica PCR-DGGE a fim de se conhecer a
diversidade bacteriana presente nas amostras;
Identificar outros microrganismos, tais como arquéias e fungos, nas amostras de
rejeito e determinar seu potencial de degradação de éter-aminas.
Investigar mecanismos de inibição destes microrganismos in situ a fim de minimizar a
degradação de éter-aminas no ambiente, permitindo o reuso dos coletores no
processo de flotação.
133
CAPÍTULO 8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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147
CAPÍTULO 9 – ANEXOS
ANEXO I
COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS MEIOS DE CULTURA
148
CALDO NUTRIENTE
Peptona - 5 g
Extrato de Carne - 3 g
H2O destilada - 1000 ml
Ajustar o pH 7,0 antes de autoclavar.
* Para solidificar o meio, acrecentar 15g de ágar. O pH deve ser ajustado antes da adição.
BROMFIELD MODIFICADO
KH,PO4 – 0,5g
MgSO4. 7H2 - 0,2g
(NH4) 2SO4 – 1,0 g
Extrato de levedura – 0,15g
H2O destilada - 1000 ml
Ajustar o pH7,0 antes de autoclavar.
* Para solidificar o meio, acrecentar 15g de ágar. O pH deve ser ajustado antes da adição.
149
ANEXO II
PROTOCOLO DE PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES
150
TAMPÃO FOSFATO SALINO (PBS 10X)
NaCl - 80,0g; KCl - 2,0g; Na2HPO4 - 14,4g (Se dihidratado, usar 18g) (dissolver aos
poucos); KH2PO4 - 2,4g; 800 mL de água mili-Q para dissolver.
Completar o volume para 1000 mL e ajustar o pH7,2. Autoclavar e estocar em geladeira.
SDS10%
SDS (dodecil sulfato de sódio) – 10,0g; 100mL de água milli-Q.
Aquecer para dissolver. Acertar o pH7,2 e armazenar em temperatura ambiente.
FENOL/CLOROFÓRMIO/ÁLCOOL ISOAMÍLICO (24:24:1)
Fenol – 24mL; Clorofórmio – 24mL; Álcool isoamílico – 1mL).
Estocar à -20°C.
CLOROFÓRMIO/ÁLCOOL ISOAMÍLICO (24:1)
Clorofórmio – 24mL; Álcool isoamílico – 1mL).
Estocar à -20°C.
PBS 1X + PVPP 1%
PBS 10X – 2mL; Polivinilpolipirrolidona (PVPP) - 1g; Água mili-Q – 100mL
ACETATO DE SÓDIO (3M)
Acetato de sódio - 24,6g; H2O milli-Q – 100mL.
Filtrar em nitrocelulose
TRIS (tris(hiroximetil)aminometano) (2mM)
151
Tris – 24,225g; H2O milli-Q – 100mL
TAE (tampão Tris-Acetato-EDTA, pH7,5) 50X
Tris-Base – 121,0g; Ácido acético glacial – 28,55mL; EDTA 0,5M – 50mL.
Acertar o volume para 500mL. Ajustar o pH7,5.
EDTA 0,5M
EDTA – 93,06g; Água destilada – 500mL
Ajustar o pH8,0
152
ANEXO III
BIODEGRADAÇÃO DAS ÉTER-AMINAS
153
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (3mL)
ÉTER-AMINAS - 25mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (3mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(a) (b)
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (3mL)
ÉTER-AMINAS - 100mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (2mL)
ÉTER-AMINAS - 25mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(c) (d)
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (2mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (2mL)
ÉTER-AMINAS - 100mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(e) (f)
154
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (1mL)
ÉTER-AMINAS - 25mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (1mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(g) (h)
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO TODOS ISOLADOS (1mL)
ÉTER-AMINAS - 100mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(i)
Biodegradação das éter-aminas pelos isolados. (a, b,c) 3mL de cultura e 25, 50 e 100mg.L-1 de éter-aminas;
(d, e, f) 2mL de cultura e 25, 50 e 100mg.L-1 de éter-aminas; (g, h, i) 1mL de cultura e 25, 50 e 100mg.L-1 de
éter-aminas.
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (3mL)
ÉTER-AMINAS - 25mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (3mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(a) (b)
155
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (3mL)
ÉTER-AMINAS - 100mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (2mL)
ÉTER-AMINAS - 25mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (HORAS)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(c) (d)
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (2mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (2mL)
ÉTER-AMINAS - 100mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(e) (f)
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (1mL)
ÉTER-AMINAS - 25mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (1mL)
ÉTER-AMINAS - 50mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(g) (h)
156
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
BIODEGRADAÇÃO ISOLADO K (1mL)
ÉTER-AMINAS - 100mg.L-1
CO
NC
EN
TR
AÇ
ÃO
(m
g.L
-1)
TEMPO (horas)
45°C
40°C
36,5°C
30°C
20°C
(i)
Biodegradação das éter-aminas pelo isolado K. (a, b, c) 3mL de cultura e 25, 50 e 100mg.L-1 de éter-aminas;
(d, e, f) 2mL de cultura e 25, 50 e 100mg.L-1 de éter-aminas; (g, h, i) 1mL de cultura e 25, 50 e 100mg.L-1 de
éter-aminas.
157
ANEXO IV
CURVAS TEÓRICAS
158
CINÉTICA DE PRIMEIRA ORDEM – TODOS ISOLADOS
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
traç
ão
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
159
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/20°C)
Co
ncen
traç
ão
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
160
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
35
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
35
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
35
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
35
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
161
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
162
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
traç
ão
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
163
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
164
CINÉTICA DE PRIMEIRA ORDEM – ISOLADO K
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
165
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
166
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
167
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
168
CINÉTICA DE SEGUNDA ORDEM – TODOS ISOLADOS
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/25mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/50mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
169
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (3mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
170
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/25mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/50mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
171
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (2mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
172
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
5
10
15
20
25
30
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/25mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/40°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/50mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
173
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/30°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Todos isolados (1mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
174
CINÉTICA DE SEGUNDA ORDEM –ISOLADO K
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/50mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
175
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (3mL/100mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/50mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
176
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (2mL/100mg.L-1/20°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/36,5°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
177
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/50mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
çã
o (
mg
.L-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/40°C)
Co
ncen
tração
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/36,5°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/30°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
0 2 4 6 8
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
CURVA TEÓRICA
Isolado K (1mL/100mg.L-1/20°C)
Co
nc
en
tra
ção
(m
g.L
-1)
Tempo (horas) Dados experimentais
Curva teórica
178
ANEXO V
SOLUÇÕES PARA DGGE
179
SOLUÇÃO DE ACRILAMIDA 30%
Acrilamida - 58,0g; Bisacrilamida - 2,0g.
Adicionar água destilada, misturando-se com um agitador magnético até a completa
dissolução. Completar volume para 100 mL. Armazenar no escuro e a 4°C.
SOLUÇÃO 0% DESNATURANTE
Acrilaminda 30% - 40mL; TAE 50X – 1mL; Água mili-Q – 159mL.
Armazenar no escuro e a 4°C.
SOLUÇÃO 80% DESNATURANTE
Acrilamida 30% - 40mL; TAE 50X – 1mL; Uréia – 67,6g; Formamida – 64mL.
Dissolver com a ajuda de um agitador magnético. Acertar o volume para 200mL com água
mili-Q. Armazenar no escuro e a 4°C.
APS (Persulfato de Amônio) 10%
APS – 0,2g; Água mili-Q – 2mL.
Armazenar no escuro e a 4°C.
PREPARO DE GRADIENTE 30% – 70%
Gradiente 30% Gradiente 70%
Solução 0% 7,5mL 1,5mL
Soluçao 80% 4,5mL 10,5ml
APS 10% 80µL 80µL
TEMED 5µL 5µL
