UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária

Dissertação

Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do

Rio Grande do Sul

Fábio da Silva e Silva

Pelotas, 2012

1

FÁBIO DA SILVA E SILVA

Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região do sul do Rio Grande do Sul

Orientador: Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner

Pelotas, 2012

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área de conhecimento: Veterinária Preventiva).

Dados de catalogação na fonte:

(Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744)

S587e Silva e Silva, Fábio da

Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da

imunodeficiência felina em gatos domésticos da

região sul do Rio Grande do Sul / Fábio da Silva e

Silva ; orientador Silvia de Oliveira Hübner.

Pelotas,2012.30f. : il..- Dissertação(Mestrado ) –

Programa de Pós-Graduação em Veterinária.Área de

conhecimento Veterinária Preventiva. Faculdade de

Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas,

2012.

1Gato 2.Epidemiologia 3.Subtipo 4.Vírus da

imunodeficiência felina 5.PCR I.Hübner, Silvia de

Oliveira(orientador) II. Título.

CDD 636.8089

Banca examinadora:

Profa. Dra. Silvia de Oliveira Hübner – Universidade Federal de Pelotas (orientadora) Prof. PhD. Geferson Fischer – Universidade Federal de Pelotas Prof. Dr. Marcelo de Lima – Universidade Federal de Pelotas

Profa. Dra. Márcia de Oliveira Nobre – Universidade Federal de Pelotas

Agradecimentos

Aos meus pais queridos, Edmundo e Nidelcina que partiram durante meu

período de mestrado, mas deixaram vivo o legado da busca pelo conhecimento, pois

sempre priorizaram a minha formação acadêmica e me incentivaram a evoluir como

indivíduo a partir do caminho da educação.

À minha amada esposa Débora, pelo carinho, companheirismo e

compreensão, além do suporte técnico prestado na língua portuguesa e inglesa.

À minha orientadora Silvia de Oliveira Hübner, pela amizade, paciência e pelo

apoio acadêmico na realização deste trabalho.

Ao Prof. João Pessoa da UNESP-Botucatu, por ter participado ativamente da

execução do meu projeto de pesquisa.

À equipe (professores, funcionários e colegas) do Laboratório de Virologia e

Imunologia Animal da UFPel que me acolheu e passou a fazer parte da minha

família.

Às minhas colegas e amigas Paula e Clarissa, que foram fundamentais na

execução das atividades de laboratório relativas ao mestrado.

À Universidade Federal de Pelotas que me proporcionou a realização do curso de

Pós-Graduação em Veterinária.

Muito obrigado!

“Gatos amam mais as pessoas do que elas permitiriam. Mas eles têm sabedoria

para manter isso em segredo”.

Mary Wilkins

RESUMO

SILVA, Fábio da Silva e. Estudo epidemiológico da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul. 2012. 30f. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em

Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientadora: Silvia de Oliveira Hübner. O vírus da imunodeficiência felina pertence à família Retroviridae, gênero Lentivirus e apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao vírus da imunodeficiência humana (HIV), entretanto não é transmissível ao homem, sendo suscetíveis somente os felinos domésticos e selvagens. O FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes de A a E, distribuídos mundialmente, além de cepas com recombinações entre os subtipos. Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o subtipo F identificado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv na Nova Zelândia. Considerando-se que os retrovírus têm a capacidade de integrar-se ao genoma celular, sob a forma de DNA de dupla fita, é possível a detecção do provírus em leucócitos infectados, através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). O presente trabalho investigou a ocorrência de infecção pelo vírus da imunodeficiência felina, entre os anos de 2010 e 2011, em gatos domésticos levados para atendimento médico no Hospital de Clínicas Veterinária da Universidade Federal de Pelotas e clínicas privadas da cidade de Pelotas, RS. Amostras de sangue de 70 animais, entre hígidos e doentes, foram colhidas e submetidas à técnica de nested-PCR. Os gatos testados foram classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi representado por 28 felinos suspeitos de FIV, diagnosticados com linfoadenomegalia, sinais neurológicos ou com infecções crônicas e recidivantes; o grupo 2 representado por 42 animais livres de sintomatologia relacionada a FIV. Os resultados apontaram uma frequência de infecção pelo FIV de 15,7% (11/70). Das amostras positivas, 8 foram submetidas à caracterização molecular, sendo todas alocadas dentro do subtipo B. As manifestações clínicas mais diagnosticadas nos felinos que desenvolveram doença relacionada a FIV, foram as infecções secundárias broncopulmonares (4/10) e cutâneas (3/10). Outras alterações clínicas identificadas em animais positivos foram gengivite, uveíte, anemia e icterícia. Os animais infectados por FIV apresentaram letalidade de 30% durante o período de estudo. Em relação à faixa etária a maior proporção de felinos infectados apresentava idade superior a 10 anos. Diante dos dados apresentados conclui-se que o subtipo B do vírus da imunodeficiência felina apresenta circulação na população de gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul, e que animais idosos acometidos por infecções crônicas ou recidivantes devem ser testados para esse agente. Palavras-chave: Gato. Epidemiologia. Subtipo. Vírus da imunodeficiência felina. PCR.

ABSTRACT

SILVA, Fábio da Silva e. Epidemiological study of the feline immunodeficiency virus infection in domestic cats of the south region of Rio Grande do Sul State.

2012. 30f. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Orientadora: Silvia de Oliveira Hübner. The feline immunodeficiency virus belongs to the Retroviridae family, Lentivirus gennus and presents molecular structure and pathogenicity similar to the human immunodeficiency virus (HIV), therefore it is not transmissible to humans, being susceptible only the domestic and feral cats. FIV is classified in five phylogenetically different subtypes from A to E spread worldwide, apart from recombinant strains among the subtypes. Recently, two new subtypes were described, the subtype F identified in the United States and Portugal, and the subtype U-NZenv in New Zealand. Considering that the retroviruses have the ability to integrate the cell genome, under double stranded DNA form, it is possible to detect the provirus in infected leucocytes through the polymerase chain reaction (PCR) technique. The present report investigated the occurrence of the feline immunodeficiency virus infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical treatment at the Hospital of Veterinary Clinics of the Federal University of Pelotas and private clinics from Pelotas, RS. Blood samples of seventy animals, healthy or sick, were collected and subjected to the nested-PCR technique. The tested cats were classified in two groups taking into account their clinical condition: the group 1 represented 28 FIV suspect cats with lymphadenomegaly, neurological disorders or chronic and recurring infections. The results pointed out a FIV infection frequency of 15,7% (11/70). Eight of the positive samples were subjected to molecular characterization, being all of them into the subtype B. The most diagnosed clinical manifestations in the cats that developed disease related to FIV were bronchopulmonar (4/10) and cutaneous (3/10) secondary infections. Another clinical disorders observed in the positive animals were gingivitis, uveitis, anemia and icterus. The FIV infected cats presented 30% of lethality during the period of study. Most of the infected cats were up to 10 years of age. Faced with the data shown in this report we could conclude that the subtype B of the feline immunodeficiency virus presents circulation in the domestic cat population of the south region of Rio Grande do Sul and elderly animals affected by chronic or recurring infections must be FIV tested. Keywords: Cat. Epidemiology. Subtype. Feline immunodeficiency virus. PCR

SUMÁRIO

RESUMO ..................................................................................................................... 6

ABSTRACT ................................................................................................................. 7

1. INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................... 8

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 9

3. ARTIGO ................................................................................................................ 13

Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em gatos

domésticos da região sul do Rio Grande do Sul .................................................... 14

3.1 RESUMO ......................................................................................................... 14

3.2 ABSTRACT ...................................................................................................... 14

3.3 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15

3.4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 16

3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 17

3.6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 19

3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 19

4. CONCLUSÃO GERAL........................................................................................... 23

5. REFERÊNCIAS GERAIS ...................................................................................... 24

6. ANEXO .................................................................................................................. 28

8

1. INTRODUÇÃO GERAL

Com população estimada de mais de 100 milhões de felinos domésticos em

todo o mundo, as infecções virais nessa espécie determinam uma casuística

relevante no exercício da medicina felina (BARR et al., 1997). Dentre as infecções

virais de importância destaca-se a infecção pelo vírus da imunodeficiência felina

(FIV). O FIV foi isolado em 1987 nos Estados Unidos por Niels Pedersen, e desde

então é reconhecido por determinar significativa imunossupressão em gatos

(MACLACHLAN & DUBOVI, 2011).

No Brasil em 2010 a população de gatos estimada foi de 18,5 millhões, um

crescimento de 9% em relação ao ano de 2009, em contrapartida a população de

cães cresceu apenas 3,9% no mesmo período (ANFALPET).1 Esses dados refletem

a crescente e significativa população de felinos no Brasil e a importância do

diagnóstico do FIV, pois esse agente atua como fator predisponente ao

desenvolvimento de infecções concomitantes.

O FIV é considerado um agente cosmopolita, e apresenta uma prevalência

mundial de 4 a 12%, embora os valores possam apresentar variabilidade de acordo

com a área geográfica. Nos Estados Unidos e Canadá a prevalência encontrada

variou entre 1 a 7% e, no Japão, onde a população de gatos errantes é alta, a

prevalência chegou a 44% (HAYWARD et al., 2009). No Brasil, anticorpos contra o

FIV foram detectados em 3,7% dos felinos assintomáticos e em 20,2% dos animais

doentes, em um levantamento realizado durante os anos de 1998 e 1999, na cidade

do Rio de Janeiro (SOUZA et al., 2002). Outro estudo realizado entre outubro de

2000 a outubro de 2002, incluindo 454 felinos oriundos de 13 cidades do estado de

São Paulo, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (LARA et

al., 2008). Já no Rio Grande do Sul, uma investigação epidemiológica referente à

infecção pelo FIV foi realizada na cidade de Porto Alegre no ano de 2007 aonde

constatou-se taxa de infecção de 21,5% (14/65) a partir de diagnóstico sorológico e

molecular (SILVA et al., 2007). Em Pelotas e região não há registros de estudos

epidemiológicos referentes à infecção pelo FIV.

1 Associação Nacional dos Fabricantes de Produtos para Animais de Estimação- Disponível em: < http:

//anfalpet.org.br/portal/ >. Acesso: 25/02/2012.

9

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O vírus da imunodeficiência felina pertence à família Retroviridae, gênero

Lentivirus e apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao vírus da

imunodeficiência humana (HIV), entretanto, não é transmissível ao homem, sendo

suscetíveis somente os felinos domésticos e selvagens (HOSIE et al., 2009).

O genoma do FIV é composto de três grandes regiões denominadas de Gag,

Pol e Env. A região Gag codifica as proteínas estruturais internas, representadas

pela matriz (MA), capsídeo (CA) e nucleocapsídeo (NC). A porção Pol é responsável

pela síntese das enzimas transcriptase reversa (RT), integrase (IN) e protease (PR).

E a região Env codifica as proteínas do envelope viral, sendo elas a glicoproteína de

superfície (SU), gp120 e a glicoproteína de transmembrana (TM), gp41. Além das

três grandes regiões genômicas, o FIV também apresenta os genes acessórios Vif,

OrfA e Rev, responsáveis pela neutralização de citocinas da célula hospedeira,

ativação da transcrição e exportação do núcleo viral durante a replicação (KENYON

& LEVER, 2011).

A imunossupressão observada nos animais infectados pelo FIV é o resultado

da depleção dos linfócitos T auxiliares (CD4+), que leva a uma inversão da relação

CD4/CD8. Paralelo à diminuição da contagem de linfócitos T CD4+ o FIV determina

um quadro de hipergamaglobulinemia, decorrente da elevação de linfócitos B CD21-

(TAKANO et al., 2012). Atualmente há indícios de que a imunossupressão pelo FIV

pode ser exacerbada por disfunção na síntese de hormônios esteróides, a partir do

aumento na concentração de estradiol e testosterona. Estudos sugerem que essas

alterações hormonais possam agravar o quadro de imunossupressão de pacientes

positivos para FIV, diminuindo a expressão do MHC II, a apresentação de antígenos,

e a expressão de citocinas pelas células linfóides (TEJERIZO et al., 2012).

A disseminação do vírus no organismo ocorre principalmente pelos linfócitos

CD4+ infectados e, em escala menor, pelos monócitos e macrófagos. Estes últimos

relacionados com o vírus no estágio terminal da doença (RAVAZZOLLO & COSTA,

2007). O vírus também pode promover infecção de astrócitos e células da micróglia,

determinando sintomatologia neurológica (FERNÁNDEZ et al., 2007). Os gatos

infectados apresentam saliva com alta carga viral e o modo mais eficiente de

10

transmissão é a partir de mordedura, mas a transmissão também pode ocorrer

verticalmente, por infecção uterina, via colostro ou amamentação (ARJONA et al.,

2000).

A partir da análise da sequência de nucleotídeos do gene Env das regiões

variáveis 3-5, o FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes, de

A a E, além de cepas recombinantes. Os subtipos A, B e C estão mundialmente

distribuídos, sendo o subtipo D encontrado somente no Japão e Vietnã e o subtipo E

identificado na Argentina (PECORARO et al., 1996; BACHMANN et al., 1997;

TEIXEIRA et al., 2010). Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o

subtipo F identificado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv

encontrado na Nova Zelândia (HAYWARD et al., 2009; GRACE et al., 2011). No

Brasil pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento a

caracterização filogenética foi realizada nos estados de Minas Gerais, São Paulo e

Rio de Janeiro, identificando-se somente o subtipo B (CAXITO et al., 2006; LARA et

al., 2007 MARTINS et al., 2008).

O conhecimento da variabilidade genética do FIV é fundamental no

desenvolvimento de vacinas que promovam imunidade a cepas específicas de uma

determinada região. O sequenciamento do gene Env também possibilita a relação

dos subtipos do FIV com padrões clínicos específicos (TEIXEIRA et al., 2010). A

infecção pelo subtipo A está associada com o desenvolvimento de doença

neurológica, já o subtipo B determina a ocorrência de um quadro de baixa

morbidade, e o subtipo C pode causar enfermidade aguda, desencadeando severa

imunodeficiência com 60% de mortalidade 18 semanas pós infecção (ROZìERES et

al.,2008; HAYWARD et al., 2009).

As infecções crônicas, secundárias ou associadas, causadas por agentes

infecciosos comensais ou patogênicos são frequentes em felinos com FIV, levando a

complicações representadas por quadros de enterite, dermatite, gengivite e doença

respiratória crônica (ZANUTTO et al., 2011). Gatos FIV positivos também

apresentam cinco vezes mais chance de desenvolver linfoma ou leucemia do que

gatos não infectados e os pacientes em viremia podem apresentar uveíte e

glomerulonefrite por deposição de imunocomplexos (HARTMANN et al., 2011).

Aproximadamente 5% dos felinos infectados por FIV apresentam encefalite,

podendo desenvolver distúrbios de comportamento, demência, convulsão e déficit

motor (MURPHY et al., 1999).

11

Os sinais clínicos de gatos com FIV não são suficientes para confirmar a

infecção. Portanto, o diagnóstico deve ser realizado pela detecção de anticorpos

pelo teste de imunoabsorção enzimática (ELISA) e confirmado pela técnica de

reação em cadeia da polimerase (PCR) ou Western blotting (TIZARD, 2009), pois

reações positivas falsas são comuns no teste de ELISA (NELSON & COUTO, 2006;

VEIR et al., 2010).Considerando-se que os retrovírus têm a capacidade de integrar-

se ao genoma celular sob a forma de DNA de dupla fita, é possível a detecção do

provírus em leucócitos infectados pela técnica de PCR (CALDAS et al., 2000). Essa

técnica apresenta como vantagem alta sensibilidade e especificidade, custo

acessível e fácil reprodução (VEIR et al, 2010). Entretanto, a variabilidade genética

do vírus e a baixa carga proviral em linfócitos de pacientes assintomáticos crônicos,

podem determinar um resultado falso negativo (CRAWFORD et al., 2007;

AMMERSBACH et al., 2011).

O tratamento, na maioria das vezes, é de suporte e dirigido contra as

condições mórbidas relacionadas, sendo os antivirais também utilizados, porém

apresentam potencial tóxico para os felinos (TEIXEIRA et al., 2010). A zidovudina

(AZT) é uma droga antiviral amplamente utilizada no tratamento de gatos

acometidos por FIV, é um fármaco análogo da timidina que bloqueia a DNA

polimerase viral (transcriptase reversa) inibindo a replicação dos retrovírus (BOTHE

et al., 2001). À semelhança do que ocorre no tratamento do HIV, o uso do AZT em

felinos resulta no aparecimento de cepas mutantes ao fármaco. Um estudo realizado

na cidade de Botucatu/SP no ano de 2007 demonstrou que o uso do AZT (10mg/ Kg/

dia) por 96 dias, em gatos positivos para FIV, não diminuiu a carga viral. Além disso,

o sequenciamento genético da região codificadora da transcriptase reversa,

constatou a presença de lisina na posição 41 que é relacionada ao fenótipo de

resistência ao AZT (FIGUEIREDO et al., 2007). Outro medicamento também

utilizado no tratamento da FIV é o interferon recombinante, pois apresenta atividade

antiviral e imunomoduladora. O uso do inteferon-alfa humano em felinos é altamente

questionável, pois essa droga é espécie-específica e pode induzir o

desenvolvimento de anticorpos neutralizantes ao fármaco. Recentemente foi

desenvolvido o interferon-ômega recombinante felino, essa molécula tem mostrado-

se bastante promissora, pois tem determinado, em pacientes infectados por FIV,

melhora da condição clínica e normalização dos valores hematológicos

(DOMÉNECH et al., 2011).

12

Um grande número de vacinas experimentais contra FIV tem sido testado,

incluindo imunógenos de vírus inativado, células infectadas, vacinas de DNA e

recombinantes, mas a alta capacidade do lentívirus de evadir a resposta imune do

hospedeiro torna-se um fator limitante na indução de imunidade frente ao FIV

(DUNHAM et al., 2008). Uma vacina com preparados de vírus inativado, contendo o

subtipo APetaluma e o subtipo DShizuoka ( Fel-O-Vax; Fort Dodge®; USA), foi licenciada

para comercialização nos Estados Unidos em 2002. Essa vacina apresenta eficácia

comprovada contra subtipos homólogos e o subtipo heterólogo B, com um índice de

proteção superior a 70% em animais desafiados (HUANG et al., 2009).

Devido à ausência de estudos epidemiológicos referentes à ocorrência do FIV

na região sul do Rio Grande do Sul, o presente trabalho teve como objetivo

diagnosticar o agente etiológico da imunodeficiência viral felina no município de

Pelotas e região, a partir da reação em cadeia da polimerase, bem como realizar a

caracterização molecular dos isolados obtidos para identificação do(s) subtipo(s) de

FIV prevalente(s) na região.

13

3. ARTIGO 1

2

3

4

5

6

7

8

9

Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em 10

gatos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul 11

12

(Artigo científico a ser submetido ao periódico Arquivo Brasileiro de Medicina 13

Veterinária e Zootecnia) 14

15

14

Infecção e caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina em gatos 16

domésticos da região sul do Rio Grande do Sul, Brasil 17

18

[Infection and molecular characterization of the feline immunodeficiency virus in domestic 19

cats from the south of Rio Grande do Sul state, Brazil] 20

21

F.S. Silva1*

, J.P. Araújo Jr2, G. Fischer

1, G.D. Vargas

1, P.F. Finger

1, S.O. Hübner

1 22

23

¹ Laboratório de Virologia e Imunologia Animal, Faculdade de Veterinária, Universidade 24

Federal de Pelotas, Capão do Leão, RS 96010-900, Brasil; 25

² Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade 26

Estadual Paulista, Botucatu, SP 18618-000, Brasil. 27

28

3.1 RESUMO 29

30

O presente trabalho investigou a frequência de infecção pelo vírus da 31

imunodeficiência felina (FIV), entre os anos de 2010 e 2011, em gatos domésticos submetidos 32

a atendimento clínico na cidade de Pelotas. Amostras de sangue de 70 animais, entre hígidos 33

(42) e doentes (28), foram colhidas e submetidas à técnica de reação em cadeia pela 34

polimerase (PCR), para diagnóstico da FIV. Os resultados apontaram uma frequência de 35

infecção pelo FIV de 15,7% (11/70) e a análise dos fatores associados a infecção pelo FIV 36

(sexo, idade e condição clínica) evidenciou que gatos com idade superior a 10 anos e 37

acometidos por infecções crônicas e recidivantes foram os mais suscetíveis. Oito das amostras 38

positivas foram submetidas à caracterização molecular, sendo todas alocadas dentro do 39

subtipo B. 40

41

Palavras-chave: gato, epidemiologia, subtipo, vírus da imunodeficiência felina, PCR 42

43

3.2 ABSTRACT 44

45

The present study investigated the frequency of the feline immunodeficiency virus 46

(FIV) infection between 2010 and 2011, in domestic cats submitted to medical attendance in 47

15

the city of Pelotas. Blood samples of seventy healthy (42) or sick (28) animals were obtained 48

and analyzed by the polymerase chain reaction (PCR) technique to diagnose FIV. The results 49

pointed out a FIV infection frequency of 15,7% (11/70) and the analysis of the factors (sex, 50

age and clinical condition) evidenced that cats up to 10 years of age attacked by chronic and 51

recurring infections were the most susceptible. Eight of the positive samples were submitted 52

to molecular characterization and all of them were placed into the subtype B. 53

54

Keywords: cat, epidemiology, subtype, feline immunodeficiency virus, PCR 55

56

3.3 INTRODUÇÃO 57

58

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um retrovírus do gênero Lentivirus, que 59

apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao HIV (Hosie et al., 2009). Os gatos 60

infectados pelo FIV podem desenvolver disfunção imunológica caracterizada por 61

hipergamaglobulinemia, elevação de linfócitos B CD21- e depleção de linfócitos T CD4

+ 62

(Takano et al., 2012). Os sinais clínicos observados são variáveis e inespecíficos. Em geral os 63

pacientes podem manifestar gengivite, emaciação, linfoadenomegalia, insuficiência renal 64

crônica, complicações neurológicas, diarréia crônica e infecções bacterianas (Zanutto et al., 65

2011), além de alterações hematológicas como anemia, leucopenia e linfopenia (Arjona et al., 66

2000). Entretanto, em relação ao HIV, o vírus da imunodeficiência felina apresenta menor 67

potencial de virulência, sendo que a maioria dos gatos infectados apresenta-se assintomático 68

por um longo período da vida, mesmo na ausência de tratamento antiretroviral (Hartmann, 69

2011; White e Norris, 2011). 70

O FIV é classificado em cinco subtipos filogeneticamente diferentes. Os subtipos A, B 71

e C estão mundialmente distribuídos, sendo o subtipo D encontrado somente no Japão e 72

Vietnã, e o subtipo E identificado na Argentina (Pecoraro et al., 1996; Teixeira et al., 2010). 73

Recentemente dois novos subtipos foram descritos, o subtipo F identificado nos Estados 74

Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv encontrado na Nova Zelândia (Hayward et al., 2009; 75

Teixeira 2010). Além disso, recombinações entre os subtipos têm sido descritas (Bachmann et 76

al., 1997). No Brasil, pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento a 77

caracterização molecular foi realizada somente nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio 78

de Janeiro, identificando-se somente o subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara et al., 2007; 79

Martins et al., 2008). 80

16

O FIV é considerado um agente cosmopolita e apresenta uma prevalência variável de 81

acordo com a área geográfica. Nos Estados Unidos e Canadá valores de prevalência de 1 a 7% 82

foram encontrados, enquanto que no Japão a taxa de prevalência reportada foi de 44% 83

(Hayward et al., 2009). Um estudo realizado no estado de São Paulo, incluindo 454 felinos 84

oriundos de 13 cidades, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (Lara 85

et al., 2008). No Rio Grande do Sul uma investigação epidemiológica referente à infecção 86

pelo FIV realizada na cidade de Porto Alegre constatou uma taxa de infecção de 21,5% 87

(14/65) a partir de diagnóstico sorológico e molecular (Silva, 2007). 88

O presente trabalho teve como objetivo determinar a frequência de infecção do FIV na 89

região sul do Rio Grande do Sul, mediante a detecção de DNA proviral por nested-PCR, 90

caracterização molecular dos isolados obtidos e análise dos fatores associados à infecção pelo 91

FIV. 92

93

3.4 MATERIAL E MÉTODOS 94

95

Durante o período de agosto de 2010 a agosto de 2011 foram colhidas 70 amostras de 96

sangue de gatos submetidos a atendimento médico no Hospital de Clínicas Veterinária da 97

UFPel e Clínicas Veterinárias privadas, localizadas na cidade de Pelotas, RS. Os animais 98

testados foram classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi 99

representado por 28 gatos suspeitos de imunodeficiência viral felina, diagnosticados com 100

linfoadenomegalia, sinais neurológicos ou com infecções crônicas e recidivantes; o grupo 2 101

representado por 42 animais livres de sintomatologia relacionada a FIV. Sendo que todos os 102

pacientes positivos receberam acompanhamento médico de no mínimo 6 meses após o 103

diagnóstico, com objetivo de avaliar a evolução clínica dos pacientes e estabelecer a taxa de 104

letalidade. 105

As amostras sanguíneas foram obtidas por punção venosa, acondicionadas em frascos 106

contendo anticoagulante EDTA e armazenadas a 4°C. A extração do DNA proviral foi obtida 107

utilizando-se o Kit QIAamp (QIAGEN®), conforme especificações do fabricante em até 30 108

dias após a colheita das amostras. 109

Posteriormente, as amostras foram submetidas à reação de nested-PCR utilizando – se 110

primers correspondentes à região p17 e p24 do gene gag. As sequências dos primers externos 111

utilizados foram 5’ AAT ATG ACT GTA TCT ACT GC 3’ (sense) e 5’ TTT TCT TCT AGA 112

GTA CTT TCT GG 3’ (anti-sense) e a dos primers internos 5’ TAT TCA AAC AGT AAA 113

TGG AG 3’ (sense) e 5’ CTG CTT GTT GTT CTT GAG TT 3’ (anti-sense). A primeira 114

17

reação amplifica uma sequência de nucleotídeos de 658 pares de base (pb) de DNA e a 115

segunda reação uma sequência de 329 pb (Hodatsu et al., 1998). 116

Cada reação foi executada em um volume total de 25µl contendo: 1.25U de Taq DNA 117

Polimerase, 2.5μl de tampão de PCR 10X, 1.75mM de MgCl2, 0.25mM de cada dNTP, 1µl de 118

cada primer a 10pmol/µl, 7.5μl de Betaine 5M (Sigma-Aldrich®) e 5μl do DNA extraído. Os 119

ciclos padronizados para a amplificação do DNA foram: uma incubação inicial a 96°C por 7 120

minutos, seguida de 45 ciclos, cada um consistindo de desnaturação a 94°C por 60 segundos, 121

anelamento a 45°C por 60 segundos, extensão pela polimerase a 72°C por 90 segundos e 122

extensão final a 72°C por 5 minutos. Ao final da reação, os produtos foram submetidos à 123

eletroforese e logo analisados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (0,5 124

mg/ml) e comparados com marcadores de peso molecular de 100 pb. Em todas as reações 125

foram incluídas amostras contendo água ultra-pura como controle negativo e uma amostra 126

com células infectadas por FIV (gentilmente cedida pelo Laboratório de Virologia e 127

Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de 128

Biociências da UNESP/Botucatu-SP) como controle positivo. 129

Para sequenciamento, as amostras positivas no nested PCR foram submetidas a uma 130

segunda reação para amplificação de um segmento da região Env. Em seguida os produtos 131

tiveram suas bandas extraídas do gel e purificacadas com o Kit SV Gel and PCR Clean-up 132

System Promega (Wizard®). Os fragmentos purificados foram submetidos a sequenciamento 133

direto utilizando-se o Big Dye® Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied 134

Biosystems) e o aparelho de sequenciamento automático ABI 3500 (Applied Biosystems). 135

Todo o procedimento de caracterização molecular foi realizado no Laboratório de Virologia e 136

Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de 137

Biociências da UNESP, Campus de Botucatu, SP. 138

Variáveis como condição clínica, faixa etária e sexo foram analisadas como possíveis 139

fatores de associação a infecção pelo FIV, mediante o tratamento estatístico do Qui-quadrado 140

(x2), fixando-se o valor de 1% para o nível de rejeição da hipótese de nulidade. 141

142

3.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 143

144

Das 70 amostras submetidas ao nested-PCR 11 apresentaram-se positivas, 145

determinando uma taxa de frequência de infecção pelo FIV, na população estudada, de 146

15,7%. O valor encontrado está próximo às prevalências relatadas no Rio de Janeiro de 147

16,7% e São Paulo com 14,7% (Souza et al., 2002; Lara et al., 2008). Na América do Norte, a 148

18

prevalência relatada foi de 1% em gatos hígidos e de 7% em animais doentes, dados esses 149

inferiores ao do presente estudo. Contrastando com os valores dos Estados Unidos e Canadá, 150

a prevalência encontrada no Japão, onde a população de gatos errantes é alta, foi de 44%, 151

(Hayward et al., 2009), valor esse bem superior ao dos levantamentos epidemiológicos 152

realizados no Brasil até o presente momento. 153

Em relação ao estado de higidez dos pacientes (Tab. 1), foi observado que a proporção 154

de felinos positivos com sinais clínicos associados a FIV (10/28) foi estatisticamente maior 155

(p<0,01) do que a proporção de felinos assintomáticos (1/42), estando de acordo com os 156

levantamentos epidemiológicos encontrados na literatura (Caldas et al., 2000; Souza et al., 157

2002; Lara et al., 2008; Murray et al., 2008). Dos felinos positivos para FIV 90,9% (10/11) 158

desenvolveram doença relacionada, apresentando principalmente infecções broncopulmonares 159

(4/10) e cutâneas (3/10) secundárias. Outras alterações clínicas associadas à infecção por FIV, 160

como gengivite, uveíte, anemia e icterícia, também foram detectadas em animais positivos. 161

O presente estudo foi realizado no estado do Rio Grande do Sul, em região 162

relativamente próxima à Argentina, onde foi identificado o subtipo E (Pecoraro et al., 1996). 163

Contudo, todas as amostras submetidas à caracterização molecular foram alocadas dentro do 164

subtipo B, sugerindo ser este o subtipo predominante nessa região. O conhecimento da 165

variabilidade genética do FIV é fundamental no desenvolvimento de vacinas que promovam 166

imunidade a cepas específicas de uma determinada área. Além disso, também possibilita a 167

associação de subtipos do FIV com padrões clínicos específicos (Teixeira et al., 2010). No 168

Brasil, até o momento, foi descrita a ocorrência única do subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara 169

et al., 2007; Martins et al., 2008). 170

Somente 30% (3/10) dos felinos com sinais clínicos de FIV vieram a óbito durante o 171

período de 6 meses de observação após o diagnóstico. Possivelmente a baixa letalidade 172

verificada no estudo está relacionada ao subtipo B, que apresenta como característica a baixa 173

virulência (Bachmann et al., 1997), ao contrário do subtipo C, que está associado à 174

enfermidade aguda e de acentuada imunodeficiência, com 60% de mortalidade 18 semanas 175

pós infecção (de Rozìeres et al.,2008). 176

Como esperado, a categoria sênior (Tab. 1) apresentou de maneira significativa (p<0,01) 177

a maior proporção de felinos infectados (6/9). Esse resultado pode ser explicado pelo fato do 178

FIV apresentar um grande período de latência, determinando o aparecimento tardio dos sinais 179

clínicos, mesmo que a transmissão do vírus tenha ocorrido em idade jovem (Hartmann, 2011; 180

White e Norris, 2011). Contudo, diferentemente de outros estudos que apontam os machos 181

inteiros como os mais suscetíveis à infecção pelo FIV (Lara et al., 2008; Murray et al., 2008; 182

19

Samman et al., 2011), não foi observada diferença estatística entre sexos. Provavelmente isso 183

se deve ao fato de que 32,4% (12/37) dos gatos machos analisados eram castrados. Sabe-se 184

que a forma de transmissão mais comum é por meio de mordeduras, com ocorrência mais 185

frequente em gatos machos inteiros devido aos conflitos por acasalamento e territoriais 186

(Souza et al., 2002). 187

188

Tabela 1. Análise dos fatores associados à infecção pelo FIV nos 70 gatos oriundos da região 189

sul do Rio Grande do Sul, segundo sua positividade ao nested-PCR 190

Fatores de risco Total de amostras Amostras Positivas p/ FIV (%)

Condição clínica

Assintomático 42 1 (2,4%)

Suspeito de FIV 28 10 (35,7%)*

Condição sexual

Macho 25 3 (12%)

Macho castrado 12 1 (8,3%)

Fêmea 21 4 (19,1%)

Fêmea castrada 12 3 (25%)

Faixa etária

< 1ano (jovem) 21 0 (0%)

1-4 anos (adulto jovem) 18 3 (16,6%)

5-10 anos (adulto) 15 2 (13,3%)

>10 anos (sênior) 9 6 (66,6%)*

Idade desconhecida 7 0 (0%)

* Estatisticamente significativo no nível de 1% 191

192

3.6 CONCLUSÃO 193

194

Os resultados apontam uma frequência de infecção de 15,7% e permitem afirmar que o 195

subtipo B do FIV circula na população de felinos domésticos da região sul do Rio Grande do 196

Sul. Os dados ainda sugerem que gatos com idade superior a 10 anos acometidos por 197

infecções crônicas ou recidivantes apresentaram a maior proporção de animais positivos para 198

FIV. 199

200

201

3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 202

20

203

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2000. 207

208

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recombination, and distinct evolutionary rates among envelope sequence clades. J. Virol., 211

p.4241-4252, 1997 212

CALDAS, A. P. F.; LEAL, E. S.; SILVA, E. F. A.; RAVAZZOLO, A. P. Detecção do 213

provírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos pela técnica de reação em cadeia da 214

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HODATSU, T.; MOTOKAWA, K.; USAMI, M.; MIDORI, A.; OKADA, S.; KOYAMA, H. 226

Genetic subtyping and epidemiological study of feline immunodeficiency virus by neste 227

polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analyses of the gag 228

gene. J. Virol. Methods, v.70, p. 107-111, 1998. 229

21

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gag, pol and env genes from domestic cats undergoing nucleoside reverse transcriptase 240

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SAMMAN, A.; MCMONAGLE, E.L.; LOGAN, N.; WILLET, B.J.; BIEK, R.; HOSIE, M.J. 247

Phylogenetic characterization of naturally occurring feline immunodeficiency virus in the 248

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em Ciências Veterinárias) – Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Rio 252

Grande do Sul, Porto Alegre. 253

SOUZA, H.J.M.; TEIXEIRA, C.H.R.; GRAÇA, R.F.S. Estudo epidemiológico de infecções 254

pelo vírus da leucemia e/ou imunodeficiência felina, em gatos domésticos do município do 255

Rio de Janeiro. Clin. Vet., n. 36, p.14-21, 2002. 256

22

TAKANO, T.; HOSOYA, S.; SHIBAO, A.; NAGASI, B.; YOSHIOKA, H. et al. 257

Comparative study of the plasma globulin level, CD21- B-cell counts and FOXP3 mRNA 258

expression level in CD4+ T-cells for different clinical stages of feline immunodeficiency virus 259

infected cats. Res. Vet. Sci., n.92, p.157-161, 2012. 260

TEIXEIRA, B. M.; LOGAN, N.; CRUZ, J.C.M.; REIS, J.K.P.; BRANDÃO, P.E.; 261

RICHTZENHAIN, L.J.; HAGIWARA, M.K.; WILLETT, B.J.; HOSIE, M.J. Genetic 262

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2010. 264

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uma atualização. Clin. Vet., n. 88, p. 54-66, 2010. 266

WHITE, J.; NORRIS, J.M. Feline immunodeficiency virus: disease association versus 267

causation in domestic and nondomestic felids. Vet. Clin. Small Anim., v.41, p. 1197-1208, 268

2011. 269

ZANUTTO, M.S.; FROES, T.R.; TEIXEIRA, A.L.; HAGIWARA, M.K. Características 270

clínicas da fase aguda da infecção experimental de felinos pelo vírus da imunodeficiência 271

felina. Pesq. Vet. Bras., v.31, n. 3, p. 255-260, 2011.272

23

4. CONCLUSÃO GERAL

- A frequência de infecção para FIV em gatos domésticos da região sul do Rio

Grande do Sul foi de 15,7%.

- As amostras positivas submetidas à caracterização molecular foram alocadas

dentro do subtipo B, sendo esse o único subtipo identificado no país até o presente

momento.

- Os felinos domésticos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções

crônicas e recidivantes apresentaram a maior proporção de animais positivos para

FIV.

24

5. REFERÊNCIAS GERAIS

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2011.

28

6. ANEXO

FIGURA 1.

Figura 1. Eletroforese em gel de agarose mostrando produtos da amplificação

da nested-PCR para FIV. Canaleta 1: marcador de peso molecular de 100 pb; Canaletas 6-7-

10: amostras positivas. Canaleta 11: controle positivo. Canaleta 12: controle negativo. Seta

indica 329 pb.

29

FIGURA 2.

Figura 2. Felino, macho, 10 anos e sem raça definida, positivo para FIV e

com dermatite profunda por Sporothrix schenkii.

30