Embed Size (px)
Citation preview
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS DO SISTEMA ABO COM
NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES DE SEMICONDUTORES
ANTONIO TEIXEIRA DE SALES NETO
Recife-PE, Brasil
Fevereiro, 2012
Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS DO SISTEMA ABO COM
NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES DE SEMICONDUTORES
ANTONIO TEIXEIRA DE SALES NETO
(Bolsista CAPES)
Orientação: Profª Dra. Beate Saegesser Santos
Co-orientação: Profª Dra. Adriana Fontes
Recife-PE, Brasil
Fevereiro, 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFPE como parte dos requisitos necessários para a obtenção de título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Recife, 28 de fevereiro de 2012.
Defesa de Dissertação de Mestrado de Antonio Teixeira Sales Neto defendida e
APROVADA, por decisão unânime, em 28 de fevereiro de 2012 e cuja Banca
Examinadora foi constituída pelos seguintes professores:
PRESIDENTE E PRIMEIRA EXAMINADORA INTERNA: Beate Saegesser
Santos do Depto. de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de
Pernambuco - UFPE.
Assinatura:___________________________________
SEGUNDA EXAMINADORA INTERNA: Ana Cristina Lima Leite do Depto. de
Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE.
Assinatura: ___________________________________
PRIMEIRA EXAMINADORA EXTERNA: Norma Lucena Cavalcante Licínio da
Silva do Depto. De Imunologia do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães da
Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ.
Assinatura: __________________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Dedico este trabalho a minha mãe, Maria da Paz,
e minhas irmãs, Rosanny e Rosimery.
A todos que me ajudaram nesta empreitada...
... a equipe do laboratório de Citometria de Fluxo da Fundação Hemocentro de Ribeirão
Preto: Patrícia Palma, Daiane dos Santos, Camila Menezes e Carmen Simão que me
receberam com muito carinho e atenção;
...a Fundação HEMOPE Recife, pelas amostras fornecidas;
...Dra. Valéria Pereira, pelo auxílio nas análises em citometria de fluxo no Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães;
...do grupo de pesquisa NanoBio (Nanotecnologia Biomédica), que colaboraram
diretamente neste projeto pelo apoio essencial;
...minha co-orientadora, Profa . Dra. Adriana Fontes, pela valiosa contribuição e amizade;
...minha orientadora, Profa. Dra. Beate Saegesser Santos por ter aceitado me conduzir no
desenvolvimento deste trabalho e pelo conhecimento e disposição diante das minhas
limitações;
...e a todos que indiretamente contribuíram a cada dia...
...os meus fraternos agradecimentos.
Resumo
Os Quantum dots (QDs) ou ponto quânticos vem sendo cada vez mais aplicados na área
de diagnóstico por fluorescência como uma alternativa mais estável em comparação com
os corantes orgânicos usualmente aplicados. Em comparação a estes, os QDs têm
características ópticas peculiares que os dão vantagens como: resistência ao
fotoescurecimento, possuírem um estreito espectro de emissão e uma larga banda de
absorção. Uma vez recobertos, estas nanoestruturas podem ser bioconjugadas a alvos
biológicos ou mesmo a anticorpos tornando-se fluoroimunoensaios com grande
especificidade. Este foi o objetivo deste manuscrito, onde CdS/Cd(OH)2 - emissão no
verde - tendo como agente estabilizante o polifosfato de sódio ([(NaPO3)]n) e CdTe
sintetizados com telúrio metálico, Cd(ClO4)2, ácido mercaptosuccínico (AMS) - emissão
no laranja - e ácido mercaptopropiônico (AMP) - emissão no verde - como agentes
estabilizantes, foram bioconjugados por formação de bases de Shiff e por adsorção a
anticorpos do sistema sanguíneo ABO e, posteriormente, usados na marcação simples (A
e B) e dupla (AB) de eritrócitos previamente fenotipados sendo o tipo O foi usado como
controle negativo. Os QDs foram caracterizados opticamente através de espectroscopias
de absorção e emissão e estruturalmente através de técnicas de microscopias eletrônica
de transmissão, pela qual pode ser confirmada a sua cristalinidade, e também a difração
de raio-X, revelando diâmetros médios de ~3 nm para o QD-AMS, ~2 nm para o QD-AMP
e ~7,5 nm para o CdS/Cd(OH)2. Através da Citometria de Fluxo, os sistemas QDs-
anitocorpos demonstraram especificidade obtendo-se valores de 28,4% para os
bioconjugados com CdS/Cd(OH)2-anti-A, 70,64% para o tipo A com o sistema CdTe/CdS-
anti-A em FL2 (canal laranja), 37,73% para o tipo B com o sistema CdTe/CdS-anti-B em
FL1 (canal verde) e 58,24% de dupla marcação detectada em ambos os canais. Os
resultados dos QDs CdS/Cd(OH)2, QD-AMS e QD-AMP bioconjugados a anticorpos do
sistema ABO mostram especificidade da técnica e abrem a possibilidade de
determinação de fenótipos fracos desse sistema. Além disso, serve de modelo para a
bioconjugação com outros anticorpos e consequentemente, para o diagnóstico de várias
doenças.
Palavras-chave: Quantum dots, imunohematologia, bioconjugação, adsorção.
Abstract
The quantum dots (QD) or quantum point has been increasingly applied in the diagnostic
area fluorescence as a more stable in comparison with organic dyes is usually applied. In
comparison to these, QD have optical characteristics which provide unique advantages
such as resistance fotoescurecimento, having a narrow emission spectrum and a
broadband absorption. Once coated, these nanostructures to be bioconjugadas biological
targets or even becoming fluoroimunoensaios antibodies with high specificity. This was
the aim of this manuscript, where CdS/Cd(OH)2 - emission in the green - as having a
stabilizing agent sodium polyphosphate ([(NaPO 3)]n) and synthesized CdTe with tellurium
metal, Cd(ClO4)2, acid mercaptosuccínico (AMS) - emission in the orange -
mercaptopropionic acid (MPA) - emission in the green - as stabilizing agents, by formation
of bioconjugates were of Schiff bases and adsorption system ABO blood antibodies and
subsequently used in single marking ( A and B) and double (AB) of erythrocytes and the
type previously phenotyped O was used as negative control. The optically QD were
characterized by absorption and emission spectroscopies and structurally by techniques
of transmission electronic microscopy, in which can be confirmed its crystallinity, and also
the X-ray diffraction, showing an average diameter of ~3 nm to QD-AMS, ~2 nm for the
QD-AMP and ~ 7.5 nm for the CdS/Cd(OH)2. By Flow Cytometry, QD-anitocorpos
systems showed specificity to yield values of 28.4% for the bioconjugate with
CdS/Cd(OH)2 anti-a, 70.64% type A with the system CdTe-anti-A FL2 (channel orange),
37.73% type B with the system CdTe-anti-B-FL1 (green) and 58.24% of double labeling
found in both channels . The results of the QDs CdS/Cd(OH)2, QD-AMS and QD-AMP
bioconjugates to antibodies of the ABO system show specificity of the technique and open
the possibility of determining weak phenotypes of the system. Moreover, it serves as a
model for bioconjugation with other antibodies and hence for the diagnosis of various
diseases.
Keywords: Quantum dots, immunohematology, bioconjugation, adsorption.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
[(NaPO3)]n Polifosfato de Sódio
AMP Ácido Mercaptopropiônico
AMS Ácido Mercaptosuccínico
anti-A anticorpos anti-A
Anti-B anticorpos anti-B
Cd(ClO4)2 Perclorato de Cádmio
Cd(OH)2 Hidróxido de Cádmio
CdO Óxido de Cádmio
CdS Sulfeto de Cádmio
CdSe Seleneto de Cádmio
CdSe Seleneto de Cádmio
CdTe Telureto de Cádmio
EDC 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FSC "Forward Scatter" ou Ângulo de dispersão Frontal
Fuc L-Fucose
G Guanina
g/mL Gramas por militro
Gal D-Galactose
GalNAc N-acetilgalactosamina
GlcNAc N-acetilglucosamina
Glut Glutaraldeído
HCl Ácido Clorídrico
HClO4 Ácido Perclórico
He Hemácias
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoblobulina M
ISBT International Society of Blood Transfusion
˗N=C= carbodiimida
NaOH Hidróxido de Sódio
nm Nanômetro
PBS 1X Tampão Fosfato
QD Quantum dots
SSC "Side Scatter" ou Ângulo de Dispersão Lateral
sulfo-NHS N-hidroxi-sulfo-sucinamida
TPSA Antígeno Prostático Específico Total
ua Unidades Arbitrárias
UV Ultra Violeta
ZnS Sulfeto de Zinco
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Emissão de suspensões contendo nanocristais de CdSe/ZnS de diferentes
diâmetros, excitadas com lâmpada na região do UV.
Figura 2: Esquema de um quantum dot (QD) passivado (camada cinza) e
funcionalizada com Glutaraldeído.
Figura 3: Fotodegradação em função do tempo. Linha superior: antígenos nucleares
marcados com CdSe 630 estreptavidina (vermelho) e microtúbulos
marcados com Alexa Fluor 488 (verde), simultaneamente. Linha inferior:
microtúbulos foram marcados com quantum dots 630-estreptavidina
(vermelho), e antígenos nucleares foram corados com Alexa 488 (verde). O
tempo de exposição é indicado em segundos.
Figura 4: Comparação dos perfis de emissão e excitação entre a Rodamina 6G e
CdSe (ua: unidades arbitrárias)
Figura 5: Comparação entre diferentes quantum dots e fluoróforos utilizados em
análises
Figura 6: Estruturas químicas dos Ácidos mercaptopropiônico AMP (superior) e
mercaptosuccínico AMS (inferior).
Figura 7: Bioconjugação de quantum dot (funcionalizado com terminações
carboxílicas) a anticorpos mostrando dois tipos de ligação, covalente e
sufidril-amina.
Figura 8: Modelo da membrana eritrocitária que carrega os grupos sangüíneos.
Figura 9: Síntese dos antígenos ABO.
Figura 10: Configuração de filtros e espelhos para compor 5 parâmetros específicos:
FSC, SSC e fluorescências verde, laranja e infravermelho (> 650nm).
Figura 11: Perfis de dot-plots de sangue total características das populações celulares
nos parâmetros FSC x SSC e posterior separação em Gates para análise
das populações mais homogêneas separadamente.
Figura 12: Exemplo de gráfico de citometria de fluxo mostrando em seus quatro
quadrantes a positividade e negatividade de marcação para dois antígenos
celulares numa população celular sendo analizados por fluoróforo
detectados nos filtros FL1 e FL2 (verde e laranja, respectivamente).
Figura 13: Esquematização da bioconjugação QDs-anti-A e sua ligação aos antígenos
eritrocitários (1) e imagens de microscopia de fluorescência de hemácias
(2).
Figura 14: Esquema de síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 (1) (CHAVES, 2006,
adaptada); Aspecto final da suspensão (2) e a mesma sob UV (3).
Figura 15: Monitoramento visual das fases da redução do telúrio. A coloração violeta
refere-se à presença da espécie Na-Te-Te-Na(aq).
Figura 16: Solução precursora de cádmio (1) e a mesma após injeção de solução
contendo íons Te2- (2).
Figura 17: Aspecto final da suspensão de CdTe - AMS (1); Suspensões de AMS
(esquerda) e AMP (direita) (2) e as mesmas sob UV (3).
Figura 18: Da esquerda para direita tobserva-se as proporções de bioconjugados 50:1,
25:1 e 12,5:1 (v/v) do AMP (amareladas) e as mesmas proporções de
bioconjugados para o AMS ( esverdeadas).
Figura 19: Difratograma de raios-X de pó representativo de amostra de CdS/Cd(OH)2.
Figura 20: Espectros de Absorção e emissão normalizada do CdS/Cd(OH)2 (excitado
em 337 nm).
Figura 21: Difratograma de Raios-X de pó do CdTe - AMS.
Figura 22: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe -
AMS sintetizada.
Figura 23: Imagem HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMS. Barra: 5 nm.
Figura 24: Difratograma de Raios X de pó de CdTe - AMP.
Figura 25: Imagens HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMP. Barra: 2 nm.
Figura 26: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe -
AMP sintetizada.
Figura 27: Dot-plots obtidos na citometria de fluxo na marcação com CdS/Cd(OH)2. 1:
Células tipo A não marcadas; 2: Células tipo A incubadas com
CdS/Cd(OH)2-Glut; 3: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-
A 100:1; 4: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 20:1; 5:
Células tipo O incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 100:1.
Figura 28: Histogramas de hemácias marcadas com CdTe - AMS - anti-A. 1: hemácias
tipo A com QD; 2: hemácias tipo A com QD-anti-A; 3: hemácias tipo O com
QD-anti-A.
Figura 29: Gráfico que demonstra a diferença percentual da marcação de hemácias
em duas concentrações diferentes quantificadas através de citometria de
fluxo.
Figura 30: Gráfico evidenciando a diferença percentual da marcação com a variação
de bioconjugado em cada amostra observada através de citometria de fluxo.
Figura 31: Dot-plots de hemácias duplo marcadas com QD - AMS e Glicoforina - FITC.
Em (1) hemácias tipo A evidenciando a dupla marcação e em (2) hemácias
tipo O demonstrando marcação apenas da glicoforina.
Figura 32: Gráfico dos percentuais de hemácias marcadas com bioconjugados após 2
h, 24 h e formalizados, observados através de citometria de fluxo.
Figura 33: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe
- AMS - anti-A foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%.
Figura 34: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe
- AMP - anti-B foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%.
Figura 35: Dot-plots da dupla marcação com os sistemas CdTe - AMS - anti-A e CdTe -
AMP - anti-B em hemácias tipo AB a 1% nas proporções 1,5:1 (1) e 3:1 (2)
bioconjugado:células.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Descrição dos componentes da síntese com seus respectivos valores para
cada QD preparado.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ......................................................................................... 16
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS .............................................................................................. 19
2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................................... 19
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 19
CAPÍTULO 3: REFERENCIAL TEÓRICO .................................................................. 20
3.1 NANOESTRUTURAS ................................................................................................ 20
3.2 QUANTUM DOTS ....................................................................................................... 21
3.2.1 Aplicações Biológicas ............................................................................................. 23
3.3 SISTEMA ABO ............................................................................................................. 30
3.3.1 Grupos Sanguíneos ................................................................................................ 30
3.3.2 Sistema ABO ............................................................................................................. 31
3.3.3 Estrutura e Biossíntese do Sistema ABO......................................................... 33
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO ......................................................................................... 35
3.4.1 Fundamentos ............................................................................................................ 35
3.4.2 Aplicações em Eritrócitos ...................................................................................... 40
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA EXPERIMENTAL ................................................... 42
4.1 QUANTUM DOTS DO TIPO CdS/Cd(OH)2 ......................................................... 42
4.1.1 Síntese e Passivação ............................................................................................. 42
4.1.2 Funcionalização ....................................................................................................... 43
4.1.3 Bioconjugação .......................................................................................................... 44
4.1.4 Imunomarcação Simples com CdS/Cd(OH)2 .................................................. 44
4.2 QUANTUM DOTS DO TIPO CdTe - AMS e CdTe - AMP ............................. 45
4.2.1 Síntese e Funcionalização .................................................................................... 45
4.2.2 Bioconjugação QDs - anticorpos ........................................................................ 48
4.2.3 Imunomarcação Simples com CdTe - AMS e CdTe - AMP ........................ 49
4.2.3.1 Formalização (Fixação da Fluorescência) ................................................... 50
4.2.3.2 Imunomarcação Dupla com CdTe - AMS e CdTe - AMP ........................ 50
4.3. CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ESTRUTURAL DOS QDs ......................... 51
4.3.1 Caracterização Estrutural ...................................................................................... 51
4.3.2 Caracterização Óptica ............................................................................................ 52
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 54
5.1 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ÓPTICA DOS QDs .......................... 54
5.1.1 Caracterização Óptica e Estrutural do CdS/Cd(OH)2 ................................... 54
5.1.2 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMS ..................................... 56
5.1.3 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMP ..................................... 58
5.2 ANÁLISES DE CITOMETRIA DE FLUXO ........................................................... 60
5.2.1 Imunomarcação Simples de Eritrócitos com CdS/Cd(OH)2........................ 60
5.2.2 Imunomarcações Simples com CdTe ................................................................ 62
5.2.2.1 Otimização parâmetros da marcação ............................................................ 63
Variação do Hematócrito .................................................................................................. 64
Avaliação da Concentração do Bioconjugado ........................................................... 65
5.2.2.2 Dupla Marcação QD e Glicoforina .................................................................. 65
5.2.2.3 Estabilidade do Bioconjugado após 24 horas e Formalização .............. 67
5.2.2.4 Imunomarcações Simples ................................................................................. 68
Hemácias tipo A com CdTe - AMS - anti-A ................................................................ 68
Hemácias tipo B com CdTe - AMP - anti-B ................................................................ 69
5.2.2.5 Imunomarcações Duplas ................................................................................... 70
5.2.2.6 Discussão ............................................................................................................... 71
CAPÍTULO 6: CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ................................................. 73
CAPÍTULO 7: REFERÊNCIAS ....................................................................................... 75
APÊNDICE I ......................................................................................................................... 80
16
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO
Uma ferramenta muito útil como método de diagnóstico é a
imunofluorescência. Essa técnica baseia-se em uma reação imunológica revelada
com um corante fluorescente, ou fluorocromos, que conjugado a um anticorpo,
favorece a localização da reação entre os antígenos e os anticorpos conjugados.
Estas reações antígeno-anticorpo podem ser visualizadas por microscopias
adequadas ou outras técnicas como a citometria de fluxo e desta forma, o padrão
da fluorescência da sonda ou mesmo sua ausência podem ser utilizados na
obtenção de diagnósticos confiáveis e importantes para a clínica médica.
Na maioria dos casos, os marcadores fluorescentes empregados nesta, e
em outras técnicas de fluorescência, são corantes orgânicos com características
limitantes como a fotodegradação e a citotoxicidade. No campo de novos classes
de fluorocromos os quantum dots (QD), ou pontos quânticos, surgem como
alternativas viáveis e seguras com algumas características superiores aos
corantes orgânicos mais utilizados. Entre essas características podem ser citadas:
elevada fotoestabilidade; largo espectro de absorção; estreito espectro de
emissão; marcação de estruturas biológicas em células ou fixadas ou em
suspensão; emissão em diversos comprimentos de onda para um mesmo
material; obtenção de resultados com tempos de incubação da ordem de alguns
minutos e baixa citotoxicidade (SANTOS, 2008).
Foi publicado em 1982 por Henglein e colaboradores um dos primeiros
trabalhos sobre síntese e caracterização óptica de QDs de Sulfeto de Cádmio
(CdS) e co-colóides de Sulfeto de Cádmio e Zinco (CdS-ZnS) obtidos em meio
coloidal aquoso (HENGLEIN, 1982). Porém, apenas em 1998 é que essa nova
classe de materiais passou a ser utilizada com finalidades para análises
biológicas (ALIVISATOS, 1998; CHAN, 1998). Desde então, inúmeras aplicações
vem surgindo em diversos campos das ciências da saúde como no diagnóstico de
câncer (NIDA et al, 2005), em métodos microbiológicos (XUE, 2009) e em
imunohematologia (LIRA, 2010).
A aplicação biológica dos QDs é possível através da funcionalização das
nanopartículas onde os nanocristais inorgânicos são recobertos com moléculas,
geralmente orgânicas, que farão o elo entre estes e os alvos biológicos que se
pretendem marcar. Podendo ser efetuadas funcionalizações com estruturas
complexas usando, por exemplo, concanavalina (SANTOS et al., 2006) ou
imunoglobulinas (FARIAS et al., 2005). A funcionalização com imunoglobulinas,
por exemplo, permite a marcação de antígenos específicos, tais como os do
sistema ABO, importantes para a classificação sangüínea.
O sistema ABO norteia transfusões sangüíneas e, até mesmo, transplantes
de órgãos, visto a distribuição destes antígenos em várias células do corpo.
Dependendo da tipagem sangüínea de um indivíduo, a imunoglobulina anti-A e/ou
anti-B presentes no soro do indivíduo naturalmente podem constituir uma barreira
para as transfusões de sangue e para o transplante de órgãos ABO incompatíveis
(BATISSOCO & NOVARETT, 2003). Desta forma, transfusões de sangue com
antígenos não compatíveis podem levar a graves reações imunológicas
chamadas reações ou incidentes transfusionais que podem ocorrer com o
paciente durante ou após a transfusão sangüínea podendo levá-lo a morte
(LUDWIG & ZILLY, 2011).
Apesar dos anticorpos monoclonais anti-A e/ou anti-B reconhecerem e
aglutinarem a maioria dos grupos do sistema ABO, a determinação daqueles que
apresentam baixa expressão de antígenos é laboratorialmente trabalhosa, tendo
que algumas vezes utilizar protocolos morosos e até mesmo técnicas de biologia
molecular. Além disso, nos subgrupos ou variantes, há uma distinção na
quantidade de antígenos e consequentemente também no padrão de distribuição
destes nos eritrócitos A, B e O (H) (HOSOI, 2008) o que pode dificultar o método
de hemaglutinação utilizado comumente.
Desta forma, a imunofluorescência com fluorocromos mais estáveis e
versáteis, seja avaliada por microscopias ou pela citometria de fluxo, apresenta-se
como uma ferramenta útil para as análises imunohematológicas, e diagnósticas,
através da verificação dos padrões e perfis de intensidade de fluorescência
característicos de cada tipo celular analisado. Por conseguinte, estes aspectos
motivaram a realização deste trabalho onde QDs foram preparados,
caracterizados e bioconjugados a anticorpos do sistema ABO para a fenotipagem
de eritrócitos através da citometria de fluxo. Foram realizadas marcações com
QDs com emissões no verde e no laranja, além de duplas marcações simultâneas
com corantes orgânicos e QDs, e com dois QDs distintos.
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Marcação de antígenos eritrocitários do sistema ABO com QDs do tipo
CdS/Cd(OH)2 e CdTe conjugados a anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente,
para imunofenotipagem do sistema ABO usando quantificação por citometria de
fluxo como metodologia de avaliação.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Síntese de QDs do tipo CdS/Cd(OH)2 em meio aquoso e
funcionalizados com glutaraldeído;
2. Síntese de QDs do tipo CdTe em meio aquoso e funcionalizados com
ácido mercaptosuccínico (AMS) ou ácido mercaptopropiônico (AMP);
3. Caracterização óptica e estrutural dos nanocristais obtidos;
4. Bioconjugação dos nanocristais aos anticorpos anti-A e anti-B;
5. Imunomarcação, com os bioconjugados, eritrócitos do tipo A e do tipo B
usando o tipo O como controle negativo;
6. Quantificação das células marcadas por citometria de fluxo.
CAPÍTULO 3: REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 NANOESTRUTURAS
Nos últimos anos, pesquisas em química e física têm focado em grande
parte na síntese de nanopartículas de semicondutores, metálicas e/ou
magnéticas, tais como: nanofios, pontos quânticos (quantum dots), nanotubos e
nanobastões.
As razões para isso são as novas propriedades que esses materiais
apresentam por estarem em escala nanométrica, as quais geram novas
aplicações em vários campos extremamente importantes, como, por exemplo, em
catálise, revestimentos, têxteis, armazenamento de dados, biotecnologia e
indústrias biomédicas e farmacêuticas (DRBOHLAVOVA et al., 2009).
A utilização de nanopartículas, com ênfase na química coloidal, aliada às
técnicas microscópicas, eletroquímicas e espectroscópicas, tem gerado grande
contribuição para a melhoria da visualização e caracterização de materiais
biológicos nas últimas décadas. O uso de diferentes sondas nanoestruturadas
(como, por exemplo, nanopartículas de metais e óxidos, nanotubos de carbono e
nanoestruturas poliméricas) associadas a biomoléculas vem sendo utilizadas
tanto em técnicas físico-químicas que auxiliam uma melhor compreensão de
sistemas biológicos bem como em ferramentas terapêuticas. A síntese de novos
marcadores fluorescentes, como os QDs, tem possibilitado o aumento da
capacidade de visualização, manipulação, caracterização de sistemas biológicos
e no desenvolvimento de aplicações médicas (CHAVES, 2006).
3.2 QUANTUM DOTS
Quantum dots, ou nanocristais de semicondutores, são uma nova classe de
marcadores fluorescentes de tamanhos nanométricos constituídos de poucas
centenas a poucos milhares de átomos que exibem propriedades ópticas
diferentes dos cristais macroscópicos do mesmo material, conhecidos como
“bulks”. (MICHALET, 2008).
Eles são geralmente formados de materiais binários de átomos dos grupos
II - VI, III - V ou IV - VI da tabela periódica e possuem propriedades ópticas
diferenciadas dos materiais originais macroscópicos (devido aos efeitos de
quantização dos estados eletrônicos que descrevem o material) as quais podem
superar as apresentadas pelos corantes orgânicos convencionais (MEDINTZ,
2005; MICHALET, 2008). Controlando-se o tamanho dos quantum dots, pode-se
conseguir a sintonização do comprimento de onda de emissão para um mesmo
material. As partículas menores tendem a emitir em regiões próximas ao azul,
enquanto que as maiores devem apresentar luminescência em regiões mais
próximas ao vermelho chegando ao infravermelho (CHAVES, 2006;
DRBOHLAVOVA, 2009).
A Figura 1 mostra dez diferentes emissões de cor do quantum dot
CdSe/ZnS excitado com uma lâmpada próxima ao UV (Ultravioleta). Da esquerda
para a direita, do azul ao vermelho, a emissão máxima é localizada em 443, 473,
481, 500, 518, 543, 565, 587, 610 e 655 nm.
Figura 1: Emissão de suspensões contendo nanocristais de CdSe/ZnS de diferentes diâmetros, excitadas com lâmpada na região do UV. (FORTINA, 2005)
A síntese das nanopartículas pode ser feita basicamente de duas formas:
“top-down” e “bottom-up”. No caso do “top-down”, se constrói um material
macroscópico e esse vai sendo desgastado, por um laser, até se chegar à
estrutura e no tamanho desejado. Já no “bottom-up”, o material é construído
juntando-se átomos e/ou moléculas através de reações químicas (SCHMID,
2004).
A síntese coloidal, um exemplo de síntese bottom up, ocorre por reações
que permitem relativo controle da nucleação e crescimento dos nanocristais. O
precursor é uma molécula, ou um complexo, que contem um ou mais átomos
necessários para o crescimento do nanocristal que uma vez introduzidos na
reação, se decompõem, dando forma a uma nova espécie reativa (os
monômeros). Estes irão causar a nucleação e o crescimento dos nanocristais
suspensos em meio líquido (CHAVES, 2004).
A síntese coloidal de QDs pode ser realizada em meio orgânico ou aquoso.
A síntese em solvente orgânico envolve tipicamente três principais componentes:
um ou vários precursores organometálicos, algum surfactante orgânico e um
solvente, todos misturados juntos no mesmo recipiente (MICHALET, 2008). Neste
caso o crescimento dos cristais é controlado pela reação a temperaturas altas
(200 - 300oC). Recentemente QDs fluorescentes usados para imagem biológica
tem sido obtidos através de reações químicas de precursores inorgânicos a
temperaturas relativamente baixas (80-90oC). De uma forma geral a síntese dos
QDs envolve duas etapas principais, a formação do núcleo (core) e a passivação,
que é a formação de uma casca de algumas monocamadas de átomos
(conhecida por shell). A função desta nova camada é reduzir a quantidade de
defeitos presentes na superfície dos nanocristais, que surgem a partir de ligações
não compartilhadas. A nova camada balanceia o equilíbrio iônico destas ligações
aumentando a eficiência da emissão original do cristal através da formação de
uma camada fina de um novo semicondutor com melhor fluorescência. A
formação da casca pode ser induzida pela deposição de outro composto numa
etapa posterior á formação do core ou pela reação de hidrólise dos agentes
estabilizantes a base de tióis, os quais acabam sendo incorporados na estrutura
externa das partículas. Esta deposição de certa forma ocorre de forma não
controlada e contínua.
A ligação com sistemas biológicos se dá através da funcionalização dos
nanocristais, uma etapa na qual pequenas moléculas orgânicas, capazes de
formar interações químicas com a superfície dos quantum dots, introduzem novos
grupos funcionais a estes para que possam se complexar com diferentes
componentes biológicos (CHAVES, 2006). A Figura 2 mostra o esquema de um
quantum dot passivado e funcionalizado, pronto para a bioconjugação.
Figura 2: Esquema de um quantum dot (QD) passivado (camada cinza) e funcionalizada com Glutaraldeído.
3.2.1 Aplicações Biológicas
Os QDs são nanopartículas com notáveis propriedades ópticas com
aplicações in vivo, in vitro e in situ (CHAN, 2002; SUKHANOVA & NABIEV, 2008).
Quando conjugados à biomoléculas específicas QDs tem sido utilizados em
hibridização de DNA, imunoensaios e imagens fluorescentes de cortes
histológicos com tempo limitado. Podemos dividir suas aplicações em dois
principais grupos, a saber: biosensores e marcadores para imagens biológicas
(DRBOHLAVOVA, 2008).
Diferentes cristais apresentando diferentes cores de emissão podem ser
usados para imagens simultâneas em marcações internas e/ou de superfícies de
células vivas. Além disso, com uma camada inerte recobrindo-os acredita-se que
os nanocristais adquirem menor toxicidade em relação a alguns corantes
orgânicos. Outra importante vantagem é a alta fotoestabilidade que permite o
monitoramento em tempo real de caminhos/processos intracelulares por longos
períodos, minutos ou até horas (CHAN, 2002). Segundo Chan & Nie (1998), a
emissão do CdSe (t1/2= 960 s) é quase 100 vezes maior que a da rodamina 6G
(t1/2= 10 s). A Figura 3 mostra o efeito do fotoescurecimento em uma marcação de
fibroblastos com CdSe- estreptavidina e AlexaFluor 488 (CHAN, 1998).
Figura 3: Fotodegradação em função do tempo. Linha superior: antígenos nucleares marcados com CdSe 630 estreptavidina (vermelho) e microtúbulos marcados com Alexa Fluor 488 (verde), simultaneamente. Linha inferior: microtúbulos foram marcados com quantum dots 630-estreptavidina (vermelho), e antígenos nucleares foram corados com Alexa 488 (verde). O tempo de exposição é indicado em segundos (MEDINTZ, 2005).
Os quantum dots são altamente luminescentes (a intensidade de
fluorescência de um único CdSe é de aproximadamente 20 moléculas de
rodamina 6G) (CHAN, 1998) e apresentam larga faixa de comprimento de onda
para excitação com picos de fluorescência simétricos e larguras relativamente
estreitas (20 - 50 nm). A Figura 4 ilustra o exemplo comparativo entre os perfis de
absorção e emissão do CdSe e da Rodamina 6G.
Figura 4: Comparação dos perfis de emissão e excitação entre a Rodamina 6G e CdSe (ua: unidades arbitrárias) (CHAN, 2002).
Eles possuem comprimento de fluorescência ajustável pelo tamanho da
partícula. Sob circunstâncias ideais, estes nanocristais podem ter um elevado
rendimento quântico, elevada absorbância e faixas estreitas de emissão podendo
também fornecer diferentes emissões (mudando o tamanho dos nanocristais)
usando um único comprimento de onda para excitação. O que significa que com
diferentes composições químicas e diâmetros eles podem substituir todos os
corantes orgânicos conhecidos utilizados nas suas atuais áreas de aplicação para
detecção e diagnóstico médico (SUKHANOVA & NABIEV, 2008), como
demonstrado na Figura 5. Teoricamente, com o uso de seis cores e dez níveis de
intensidade, pode-se marcar um milhão de proteínas ou seqüências de ácidos
nucléicos (CHAN, 2002).
Figura 5: Comparação entre diferentes quantum dots e fluoróforos utilizados em análises (SUKHANOVA & NABIEV, 2008, adaptada)
Para que os QDs tenham especificidade por células e tecidos é necessário
fazer a suas conjugações com biomoléculas que sejam capazes de reconhecer
moléculas alvo nas células ou tecidos, como por exemplo, as imunoglobulinas.
Uma boa conjugação é aquela onde o sistema resultante tem compatibilidade
com os sistemas biológicos, como: pH fisiológico, baixa toxicidade, isotonicidade,
hidrofilicidade e que as propriedades fluorescentes das sondas e das
biomoléculas conjugadas sejam mantidas.
Os tipos de conjugações de QD com biomoléculas mais conhecidos são:
(1) utilização de um agente de acoplamento, como por exemplo, o EDC, 1-etil-3-
(3-dimetilaminopropil) carbodiimida; (2) ligação direta da superfície do QD com
proteínas que tenham grupamentos tiol ou resíduos de polihistidina; (3) utilizando
o glutaraldeído formando bases de Schiff com a superfície do QD a qual contenha
grupamento amina, e após redução do glutaraldeído forma-se uma amina
secundária estável, e; (4) adsorção ou ligação não covalente (HERMANSON,
2008).
Especificamente para a conjugação de pontos quânticos funcionalizados
com moléculas que possuam grupamento carboxilatos como o ácido
mercaptopropiônico (AMP) ou o ácido mercaptosuccínico (AMS), pode-se utilizar
os agentes de acoplamento o 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC) e o
N-hidroxi-sulfo-sucinamida (sulfo-NHS) para ativar esse carboxilatos e possibilitar
a formação de ligações amidas entre o QD e a proteína que se deseja conjugar. O
sulfo-NHS por meio de formação de seu intermediário (éster), que apresenta
maior estabilidade frente ao formado pelo EDC, ao interagir com uma amina
primária oriunda da proteína, promove a formação da ligação amida pela
conjugação. Isso ocorre via formação do intermediário reativo instável o-
acilisouréia, produto de um carbono do grupamento ˗N=C= (carbodiimida) da
molécula do EDC e o grupamento carboxilato dos QDs (HERMANSON, 2008). A
Figura 6 ilustra a estrutura do AMP e AMS.
Figura 6: Estruturas químicas dos Ácidos mercaptopropiônico AMP (superior) e
mercaptosuccínico AMS (inferior).
O glutaraldeído é uma molécula que contém dois grupamentos aldeídicos,
sendo um em cada uma de suas extremidades, esse fato possibilita a ligação
dessa molécula à porção amina das proteínas, formando bases de Schiff. Por
possuir essa afinidade por aminas o glutaraldeído pode ser usado como agente
funcionalizante inespecífico para qualquer tipo de proteínas ou como agente de
ligação entre os QDs e biomoléculas capazes de se ligar especificamente a certas
estruturas biológicas, como os anticorpos. Para estas finalidades o glutaraldeído
deve ser utilizado em concentrações menores que 0,1%, pois em concentrações
maiores pode causar fixação de estruturas biológicas, bem como fazer ligações
indesejáveis ou inativar biomoléculas (MENEZES, 2006).
Um outro mecanismo de conjugação que pode ser feito como
anteriormente citado é a adsorção. Este é um termo utilizado para descrever o
fenômeno no qual moléculas que estão presentes em um líquido ou gás,
concentram-se espontaneamente sobre uma superfície sólida. O mecanismo de
adsorção é baseado em atrações hidrofóbicas (Van der Waals do tipo London) ou
por interação eletrostática, sendo, portanto, um método simples e flexível,
largamente utilizado atualmente e será o método adotado nesta monografia. Na
adsorção não há desnaturação do anticorpo como pode acontecer quando se usa
o EDC, sendo esta um método economicamente satisfatório pois dispensa o uso
de outras substâncias.
A adsorção de proteínas é um processo que tem um papel fundamental na
área de biomateriais. Na verdade, superfícies de biomateriais em contato com o
meio biológico, como sangue ou soro, são imediatamente revestidos por
proteínas. A adsorção passiva tem sido estudada extensivamente para
imobilização de imunoglobulinas em microplacas de poliestireno e em
microesferas (HERMANSON, 2008).
Independentemente do tipo de conjugação utilizado, três fatores são
crucias para o resultado final do conjugado: (1) o planejamento estratégico da
conjugação; (2) a capacidade de controlar com precisão as proporções de
QD/proteína; (3) resultados homogêneos com orientação homogênea das
proteínas na superfície do QD. No entanto, quando um desses três fatores não é
seguido criteriosamente podem ser produzidos conjugados de proteínas que não
são funcionais (MEDINTZ, 2005)
É grande o número de trabalhos de marcação de diversos antígenos como
proteínas e carboidratos, em vários imunoensaios (DRBOHLAVOVA, 2009).
Kerman et al. (2007) estudou a aplicação dos quantum dots em imunoensaio tipo
sanduíche para detecção de antígeno prostático específico total (TPSA), um
importante marcador tumoral (KERMAN, 2007). Yang et al. (2004) desenvolveu
um imunoensaio para detecção de traços abaixo de 0,1 ng/mL de antígenos de
Hepatite B com sucesso (YANG, 2004; SEYDACK, 2005). Já Goldman et al.
(2004), desenvolveu vários trabalhos com anticorpos IgG para marcação de
diversos antígenos como, por exemplo, toxina colérica e enterotoxina
estafilocócica B (GOLDMAN, 2004; HUANG, 2005). A Figura 7 ilustra um exemplo
de duas possíveis ligações dos quantum dots a anticorpos.
Figura 7: Bioconjugação de quantum dot (funcionalizado com terminações carboxílicas) a anticorpos mostrando dois tipos de ligação, covalente e sufidril-amina (GAO, 2005, adaptada).
Alguns passos para o uso de anticorpos conjugados a quantum dots são
descritos por Zhang et al. (2003) onde a imunoreação ocorre no mesmo meio em
que o antígeno está disperso. Inicialmente os anticorpos são ligados a partículas.
Então esta suspensão é incubada com o meio contendo antígenos. Considerando
que uma molécula de antígeno pode ligar-se a dois anticorpos (e, portanto, a
nanocristais bioconjugados a eles), a imunoreação resulta, assim, em um
processo de agregação. A detecção é tipicamente baseada nas mudanças das
propriedades ópticas, uma vez que duas ou mais partículas estão em íntima
proximidade (ZHANG, 2003; SEYDACK, 2005).
No campo da hematologia, podemos citar alguns trabalhos publicados que
descrevem o uso dos quantum dots CdSe/ZnS para marcação fixa de eritrócitos
humanos (TOKUMASU, 2003), linfomas de células T (HOSHINO, 2004) e
aplicações em citometria de fluxo (LIRA, 2010).
3.3 SISTEMA ABO
3.3.1 Grupos Sanguíneos
O mosaico fluido no qual constitui a membrana eritrocitária e os sistemas
de grupos sanguíneos são testemunhos inequívocos da hereditariedade onde a
diversidade expressa na membrana eritrocitária define a identidade biológica de
cada indivíduo (MURADOR, 2007).
O significado biológico da grande variedade de antígenos eritrocitários
ainda é pouco compreendido. E é possível que vários destes antígenos devem ter
proporcionado uma vantagem seletiva no passado para terem alcançado uma
freqüência maior que 1% na população humana. Algumas das funções atribuídas
a esses antígenos na superfície das hemácias incluem: transporte de membrana,
adesão celular, atividade enzimática e participação na eritropoiese (DANIELS,
2001).
A maioria dos antígenos eritrocitários corresponde a moléculas de
carboidratos associadas a proteínas da membrana plasmática, formando as
glicoproteínas, ou a moléculas de fosfolipídios da membrana, que forma os
glicolipídios (SAMPEDRO, 1998). A Figura 8 mostra um esquema de membrana
eritrocitária na qual estão representados alguns antígenos de grupos sangüíneos.
Figura 8 - Modelo da membrana eritrocitária que carrega os grupos sangüíneos. (HOSOI,
2008, adaptada)
De acordo com International Society of Blood Transfusion (ISBT), existem
308 antígenos reconhecidos, dos quais 270 estão descritos em 30 sistemas de
grupos sanguíneos (DANIELS, 2001). O conhecimento destes tem contribuído
para o entendimento de alguns dos mecanismos básicos da herança genética e a
mais de um século de sua descoberta continua sendo de grande interesse prático
e conceitual (DEL PEON-HIDALGO, 2002).
3.3.2 Sistema ABO
Em 1900 o cientista austríaco Karl Landsteiner encontrou, através de
diferenças sorológicas no sangue de diferentes pacientes, três diferentes tipos
sangüíneos (A, B, e O) (LANDSTEINER, 1900). Dois anos depois, em 1902, von
DeCastello e Stürli, seus colaboradores, descobriram um quarto tipo, o AB (VON
DECASTELLO & STÜRLI, 1902). Estava formado assim o primeiro grupo
sanguíneo da história.
O sistema de grupo sangüíneo ABO é até hoje considerado o mais
importante sistema de grupo sangüíneos na medicina clínica transfusional e é
caracterizado pela expressão de dois antígenos carboidratos (A e B) expressados
na membrana das hemácias. Não estando restritos apenas à membrana dos
eritrócitos, podendo ser encontrados também em uma grande variedade de
células como linfócitos, plaquetas, endotélio capilar venoso e arterial, células
sinusoidais do baço, medula óssea, mucosa gástrica, além de secreções e outros
fluidos como saliva, urina e leite (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003). Possui
também dois anticorpos plasmáticos (anti-A e anti-B) que aparecem após o
nascimento (MATTOS & MOREIRA, 2004; HOSOI, 2008).
Indivíduos que não apresentam um antígeno particular de grupo sangüíneo
podem produzir anticorpos naturais contra aquele antígeno ausente. Quando os
eritrócitos do indivíduo possuem antígeno A e/ou B, os anticorpos
correspondentes, anti-A e/ou anti-B, estão ausentes no soro. Por outro lado, se o
indivíduo carece de antígenos A e/ou B, o plasma contém o anticorpo contra
ambos os antígenos ausentes. Por conseguinte, o indivíduo do tipo A terá
anticorpos anti-B no soro; o indivíduo do tipo B terá anticorpos anti-A no soro; o
indivíduo do tipo O terá isoanticorpos anti-A e anti-B no soro e, o indivíduo AB não
apresentará isoanticorpos no soro (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003; HOSOI,
2008).
As imunoglobulinas anti-A e anti-B podem ser IgM, IgG ou IgA e alguns
soros podem conter as três classes. Indivíduos não imunizados possuem,
predominantemente IgM, embora, IgG e IgA também possam estar presentes.
Estes anticorpos não estão presentes em recém nascidos, mas aparecem no
primeiro ano de vida. Os anticorpos detectados no soro de neonatos são
usualmente IgG de origem materna, porém podem ocasionalmente ser IgM
produzidas pelo feto. Geralmente, aglutininas são detectadas primeiro aos três
meses de idade e continuam aumentando em título até alcançar níveis adultos
entre 5 e 10 anos (DANIELS, 2001).
Ainda não está totalmente esclarecida a razão pela qual o organismo é
estimulado a produzir anticorpos contra os antígenos A ou B ausentes, todavia,
aparentemente existem antígenos semelhantes às estruturas ABO na natureza
que de algum modo produzem sensibilização natural. A hipótese mais
disseminada é a de uma reação cruzada com epítopos de antígenos expressos
em bactérias, vírus, plantas e até mesmo em alimentos que possuem estrutura
similar a dos antígenos A e B levando a produção destes anticorpos (DANIELS,
2001; HOLSOI, 2008).
Esse perfil que o sistema ABO apresenta quanto a distribuição de
antígenos e presença de anticorpos naturais circulantes contra o antígeno
ausente gera um grande obstáculo para a transfusão sangüínea podendo resultar
em respostas imunológicas expressivas entre os anticorpos preexistentes que se
ligam às células transfundidas, ou os anticorpos do sangue transfundido se ligam
às células do paciente (WITTIG, 2006).
Estas reações podem provocar: hemólise imediata, mediada pelo sistema
complemento; fagocitose extensiva das hemácias revestidas por anticorpos e
complemento; liberação exacerbada de hemoglobina que pode chegar a níveis
tóxicos para células renais; febre alta; choque; coagulação intravascular
disseminada, etc. (LUDWIG & ZILLY, 2007).
3.3.3 Estrutura e Biossíntese do Sistema ABO
Os alelos responsáveis por esses antígenos não os codificam diretamente,
pois são carboidratos, e não proteínas. Eles codificam enzimas chamadas
glicosiltransferases, que adicionam moléculas de carboidrato às moléculas de
proteína ou de lipídio presentes na membrana celular da hemácia anticorpos
(DANIELS, 2001). No caso do sistema ABO elas são responsáveis pela
transferência de resíduos específicos de açúcar. Estas enzimas catalisam as
reações de transglicolização entre o substrato aceptor e o açúcar receptor
(BATISSOCO & NOVARETTI, 2003).
A transferase A, a α1→3-N-acetilgalactosamina transferase, e a transferase
B, a α1→3-N-galactosil transferase, têm estruturas similares, sendo que sua
especificidade será determinada pelos aminoácidos localizados próximos ao sítio
de ligação da enzima com seu respectivo açúcar resultando na adição dos
resíduos de N-acetilgalactosamina (GalNAc), transferase A, e Galactose (Gal),
transferase B, na ligação α1→3 da galactose terminal do antígeno H. O grupo
sangüíneo AB apresenta a atividade das duas transferases (A e B), enquanto o
grupo O não possui as transferases A e B, mas apresenta o antígeno H em
grande quantidade na superfície das hemácias tipo O pela ação da transferase H.
O primeiro passo para síntese dos antígenos ABO é a adição da L-fucose
na ligação α1→2 no terminal galactose (Gal) de um precursor comum ligado a
lipídeos ou proteínas pela α1,2-fucosiltransferase (H transferase), resultando no
antígeno H ou O. Seis diferentes tipos de precursores são conhecidos, sendo o
Tipo 1 (Galβ1→3GlcNAcβ-R) e o Tipo 2 (Galβ1→4GlcNAcβ-R) as estruturas mais
freqüentes. O Tipo 1 é a substância em secreções e tecidos e o Tipo 2 é o
antígeno da superfície da hemácias. Os antígenos A, B, O (H) na superfície dos
eritrócitos são definidos por carboidratos determinantes,
GalNAcα1→(Fucα1→2)3Galβ1→ 4GlcNAcβ-R, Galα1→(Fucα1→
2)3Galβ1→4GlcNAcβ-R e (Fucα1→ 2)Galβ1→ 4GlcNAcβ-R, respectivamente, os
quais são sintetizados a partir da estrutura do antígeno H pela ação das
glicosiltransferases específicas produtos dos genes ABO (PORETZ, 1972;
SHACHTER, 1973; HAKOMORI, 1984).
A Figura 9 esquematiza a biossíntese dos antígenos ABO a partir do
precursor tipo 2 que está na superfície dos eritrócitos.
Figura 9: Síntese dos antígenos ABO. (HOSOI, 2008, adaptada)
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO
3.4.1 Fundamentos
A citometria de fluxo é um recurso emergente na medicina que permite
uma rápida análise qualitativa e quantitativa de células em suspensão (NAKAGE,
2005). Por meio desta técnica, propriedades físicas e biológicas de uma célula
podem ser estudadas. População e subpopulações celulares em uma amostra
podem ser determinadas pelo número e tipo de antígeno da membrana celular,
citoplasma ou mesmo do núcleo, propiciando a sua quantificação e classificação
imunológica (imunofenótipo) (GUILHERME, 2008). Ela também possibilita a
análise multiparamétrica, fornecendo informações adicionais tais como análise
simultânea de dois ou mais antígenos, e informações morfológicas (CAVALCANTI
JÚNIOR, 2004).
O citômetro de fluxo é o aparelho utilizado para avaliação da emissão de
fluorescência das células (FACS – “Fluorescence Activated Cell Sorter”) podendo
alguns aparelhos serem capazes de separar fisicamente as células, de acordo
com as características citométricas estabelecidas.
Sua estrutura é composta basicamete de três diferentes sistemas físicos
complementares:
1. de fluxo: onde com o auxílio de um líquido isotônico as células são
transportadas, uma a uma, na câmara de fluxo ou “flow cell” para que
sejam posicionadas no centro de um feixe de laser;
2. óptico: que consiste em um feixe de laser que ao interagir com a célula
sofre espalhamento e pode gerar fluorescência, que é captada por um
conjunto de filtros ópticos que separam estas pelos seus comprimentos de
onda para detecção;
3. eletrônico: responsável pela conversão dos sinais de luz detectados em
sinais eletrônicos que são processados e analisados por sistema
computacional.
A Figura 10 mostra uma representação de um citômetro FACScalibur
(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) para leitura de cinco parâmetros.
Figura 10: Configuração de filtros e espelhos para compor 5 parâmetros específicos: FSC, SSC e fluorescências verde, laranja e infravermelho (> 650nm) (BD Bioscience, 2000, adaptada).
A suspensão é introduzida por aspiração no citômetro, e conduzida através
de um fluxo de líquido isotônico até a câmara de fluxo. Nesse compartimento, o
laser incide sobre cada célula, sendo uma parte, bloqueada frontalmente
("Forward Scatter" ou FSC) e outra parte dispersada lateralmente ("Side Scatter"
ou SSC). A fração FSC é relativa ao tamanho da célula e a SSC representa a
complexidade intracitoplasmática, que nas células sangüíneas caracteriza a
granulosidade interna (CAVALCANTI JÚNIOR, 2004). Correlacionando as
medidas FSC e SSC é possível diferenciar grupos celulares em uma população
de células heterogêneas. Na Figura 11 são representadas diferentes populações
celulares onde o eixo X do gráfico representa a complexidade e granulosidade da
célula (SSC) e o eixo Y representa o tamanho da célula (FSC).
Figura 11: Perfis de dot-plots de sangue total características das populações celulares nos parâmetros FSC x SSC e posterior separação em Gates para análise das populações mais homogêneas separadamente. (http://www.dpmdiagnostica.com.br/produtos_infinicyt.html, 2012)
Uma vez que uma célula ou partícula passa através da luz laser, os sinais
de SSC, FSC e os sinais de fluorescência, são encaminhados para
fotomultiplicadoras (detectores) através de um sistema de espelhos e filtros
ópticos. A detecção da fluorescência de um corante particular é otimizada através
da presença de um filtro na frente da fotomultiplicadora, o qual permite que
apenas uma faixa estreita de comprimento de onda atinja o detector. Esta faixa
espectral de luz está perto do pico máximo de emissão do corante fluorescente.
Esses filtros são chamados bandpass (passa banda). Por exemplo, o filtro
utilizado para o FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) é rotulado 530/30. Este
número dá as características da banda espectral transmitida: 530 ± 15 nm. Outros
filtros utilizados no citômetro de fluxo são tipo shortpass (filtros que transmitem
comprimentos de onda da luz igual ou inferior a um determinado comprimento de
onda), e o filtro tipo longpass, (o qual transmitem comprimentos de onda igual ou
superior a um determinado comprimento de onda) (BD Biosciences, 2000).
A incidência do laser sobre fluoróforos causará a emissão de luz de
diferentes comprimentos de onda (por exemplo: FITC - verde; Ficoeritrina -
laranja) que será captada pelos detectores/filtros (FL1, FL2), cujo número e
quantidade será dependente de cada aparelho (CAVALCANTI JUNIOR, 2004),
gerando o gráfico de resultados do tipo histogramas ou dot plot (Figura 11). Caso
as células expressem o antígeno em estudo, elas serão detectadas pelo citômetro
através da fluorescência emitida pelo marcador ligado ao anticorpo.
No caso da expressão de mais que um antígeno de interesse, pode-se
efetuar marcação múltipla e as células mostrarão diferentes combinações de
anticorpos - fluoróforos, dando o perfil multiparamétrico que a técnica possui, ou
seja, várias avaliações podem ser feitas ao mesmo tempo.
A imunofenotipagem consiste na identificação de populações de células
distintas com diferentes antígenos marcados com anticorpos fluorescentes
específicos (ROITT, 1999). Caso as células expressem o antígeno em estudo, ela
será detectada pelo citômetro, pois estarão marcadas com um anticorpo
conjugado a um fluorocromo. No caso das mesmas expressarem outros
antígenos para os quais se inclui a incubação com diferentes anticorpos
específicos, as células mostrarão diferentes combinações de anticorpos-
fluoróforos.
A Figura 12 mostra um exemplo de gráfico gerado para análise de
fluorescência.
Figura 12: Exemplo de gráfico de citometria de fluxo mostrando em seus quatro quadrantes a positividade e negatividade de marcação para dois antígenos celulares numa população celular sendo analizados por fluoróforo detectados nos filtros FL1 e FL2 (verde e laranja, respectivamente).
3.4.2 Aplicações em Eritrócitos
Segundo Weiss (2002) a análise dos eritrócitos pode ser realizada usando
sangue total com anticoagulante ou com hemácias isoladas da camada
eritrocitária após a centrifugação. As aplicações da citometria de fluxo na
avaliação dos eritrócitos geralmente consiste na quantificação de reticulócitos,
pesquisa de eritroparasitas e detecção de anticorpos anti-eritrocitários (WEISS,
2000; NAKAGE, 2005). Além de detecção e quantificação de pequenas
populações de eritrócitos com alterações genéticas, de hemácias transfundidas e
de hemácias fetais em sangue materno (GARRATTY & ARNDT, 1999) e também
registros de trabalhos com imunofenotipagem do sitema ABO.
Farias e col. (2005) mostraram um novo capítulo nesse campo da
imunohematologia, bioconjugando QDs a anticorpos anti-A na marcação de
eritrócitos humanos e sua avaliação por microscopia de fluorescência Figura 13.
Outro trabalho utilizando QDs em células sanguíneas humanas foi o realizado por
Lira e cols. (2010) no qual análises por citometria de fluxo foram realizadas.
Figura 13: Esquematização da bioconjugação QDs-anti-A e sua ligação aos antígenos eritrocitários (1) e imagens de microscopia de fluorescência de hemácias (2).
1 2
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA EXPERIMENTAL
4.1 QUANTUM DOTS DO TIPO CdS/Cd(OH)2
4.1.1 Síntese e Passivação
A síntese do CdS seguida da sua passivação com Cd(OH)2 foi realizada
segundo metodologia Weller e colaboradores (FOJTIK, 1984). A funcionalização
com Glutaraldeído (Glut) seguiu o trabalho de Menezes (2006).
O primeiro passo é a preparação das nanopartículas de sulfeto de cádmio
(CdS). Em um balão contendo água deionizada (95,5 mL) são adicionados
estabilizante polifosfato de sódio [(NaPO3)]n 0,0051 g/mL (com n igual à 9) (2,0
mL) e uma solução 0,01 molL-1 perclorato de cádmio Cd(ClO4)2 (2,5 mL)
preparado a partir de óxido de cádmio (CdO) (0,642 g) e ácido perclórico (HClO4)
(1,44 mL), também com água deionizada, e sob agitação. Para 0,005 mols de
CdO, foi utilizado 0,01 mol de HClO4.
Em seguida, o pH da solução é elevado com NaOH até o valor de 8,5;
(valor necessário para uma luminescência no comprimento de onda de 500nm
após passivação). O balão é vedado com um septum de borracha.
Com auxílio de uma seringa é adicionado à solução gás sulfídrico H2S (750
μl). A solução resultante é agitada continuamente durante 10 min, na qual após
este tempo observamos a mudança da coloração de incolor para amarelo.
Através desta observação, verificamos a formação das nanopartículas de sulfeto
de cádmio. A solução é mantida à temperatura de aproximadamente 10o C até a
passivação realizada aproximadamente após 24 h de preparação das
nanopartículas de sulfeto de cádmio.
Para esta etapa o pH da suspensão é novamente ajustado com solução de
NaOH, elevando-o para 10,5. Em seguida, é adicionado lentamente perclorato de
cádmio Cd(ClO4)2 à 0,01 molL-1 (6 mL), sob agitação constante. A adição lenta do
Cd(ClO4)2 evita a formação de grandes aglomerados de hidróxido de cádmio.
O esquema geral da síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 está
demonstrado na Figura 14.
Figura 14: Esquema de síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 (1) (CHAVES, 2006, adaptada); Aspecto final da suspensão (2) e a mesma sob UV (3).
4.1.2 Funcionalização
Finda a etapa de passivação, segue-se a funcionalização do CdS/Cd(OH)2,
neste caso com Glutaraldeído (Glut), um agente bidentado utilizado para fixação
de células em microscopia, mas quando utilizado em pequenas quantidades,
pode ter outra função como a interação com as nanopartículas de CdS e dar a
estas a possibilidade de ligação a materiais biológicos (SALES-NETO, 2009).
A funcionalização dos nanocristais foi realizada usando-se Glut a 0,01% do
volume de suspensão de QD, deixando-os por 2 horas ao abrigo da luz antes da
bioconjugação. O pH foi corrigido para um valor próximo ao fisiológico usando-se
NaOH e HCl (pH ~ 8.0), e após esta etapa, 14 mL de suspensão de QDs foram
funcionalizados utilizando-se 1,4 mL de Glut a 0,01%.
4.1.3 Bioconjugação
A partir da etapa de funcionalização, os QDs funcionalizados com Glut
foram incubados em duas proporções com anticorpos anti-A sendo elas: 100:1 e
20:1 QD-anti-A (v/v). Os sistemas ficaram overnight (tempo de 24 h) a
temperatura ambiente para a formação do bioconjugado CdS/Cd(OH)2 - Glut -
anti-A.
4.1.4 Imunomarcação Simples com CdS/Cd(OH)2
O sangue utilizado foi coletado a partir de vasos periféricos em tubo de
EDTA e posteriormente lavado, com PBS 1X ou solução salina (NaCl) a 0,9%,
para serem obtidos hematócritos a 5% suspensos no mesmo fluido isotônico
utilizado na lavagem. Os seguintes sistemas foram incubados na marcação sendo
a concentração CdS/Cd(OH)2 - Glut - anti-A:células, de 3:1 (v/v):
1. Suspensão de hemácias tipo A com QDs não funcionalizados (controle
negativo 1);
2. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut (controle negativo 2);
3. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 100:1;
4. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 20:1;
5. Suspensão de hemácias tipo O com QDs-Glut-anti-A 100:1.
Após a incubação, o material foi submetido à centrifugação (rpm: 1800;
145 g) por 30 s e após este procedimento, o sobrenadante foi desprezado sendo
adicionado ao pellet de hemácias 500 µL por amostra teste.
4.2 QUANTUM DOTS DO TIPO CdTe - AMS e CdTe - AMP
4.2.1 Síntese e Funcionalização
QDs de CdTe em meio aquoso foram sintetizados a partir de uma
adaptação de metodologia publicada anteriormente Santos et. al, 2007 (SANTOS,
2007). A síntese é realizada usando-se dois balões nos quais segue-se o seguinte
procedimento para síntese de 100 mL de QD:
1. Em um balão (1) adiciona-se 0,013 g de telúrio (Te0) (Sigma Aldrich),
100 µL de NaOH a 2 M (ou 100 µL a 1 M) e 0,144 g de Boridreto de
Sódio (NaBH4) (Sigma Aldrich). Em atmosfera inerte, contendo
Nitrogênio (White Martins), necessária para a redução do Telúrio, a
reação seguirá sob aquecimento em temperatura controlada de 70 - 80°
C e sob agitação constante até a completa redução do telúrio. A
coloração desta reação passará de grafite inicialmente, passando por
um roxo vívido característico da espécie química Na-Te-Te-Na, até a
incolor (Te2-) que indicará o fim da redução; A Figura 15 ilustra as
etapas da redução do telúrio visivelmente notada através da variação
de coloração da solução. A formação de Te2- (incolor) passa pelo
intermediário Na-Te-Te-Na de coloração lilás.
Figura 15: Monitoramento visual das fases da redução do telúrio. A coloração violeta refere-se à presença da espécie Na-Te-Te-Na(aq).
2. Em um segundo balão (2), o precursor de cádmio (Cd2+), 20 mL de
Cd(ClO4)2 (Sigma Aldrich) em solução aquosa de concentração 0,01 M
e o estabilizante escolhido, o ácido mercaptosuccínico (AMS) (Sigma
Aldrich), 0,3603 g em 5 mL de H2O, ou ácido mercaptosuccínico (AMP)
(Sigma Aldrich), 1,2 mL (4,9% (m/v) a pH 2,5), são adicionados. O pH
desta solução é ajustado para aproximadamente 10,5 sob a
temperatura ambiente;
3. O conteúdo do balão 1 é transferido com o auxílio de uma seringa para
o balão 2 e a reação prosseguirá sob agitação e refluxo com a
temperatura controlada entre 80 - 90° C por 4 h no caso do uso de AMP
como estabilizante e 8 h no caso do AMS. A Figura 16 mostra a solução
precursora de cádmio e o momento da injeção do telúrio reduzido.
Figura 16: Solução precursora de cádmio (1) e a mesma após injeção de solução contendo íons Te2- (2).
Ao final do processo de síntese, as suspensões apresentaram-se límpidas
e com colorações acastanhadas para o AMS e laranja para o AMP, indicativo da
formação dos QD. A Figura 17 ilustra o aspecto da suspensão de QDs ao término
da síntese.
Figura 17: Aspecto final da suspensão de CdTe - AMS (1); Suspensões de AMS (esquerda) e AMP (direita) (2) e as mesmas sob UV (3).
A proporção molar de síntese utilizada de Cd:Te:AMS e Cd:Te:AMP foram
2:1:2,4 e 2:1:5,7, respectivamente. A Tabela 1 descreve os volumes de cada
componente da síntese de 100 mL de QD.
Tabela 1: Descrição dos componentes da síntese com seus respectivos valores para
cada QD preparado.
Volume/Massa de
Estabilizante
(g/mL)
Volume de
Cd(ClO4)2
(mL)
Massa do
Telúrio
(g)
Massa de
NaBH4
(g)
CdTe - AMS 0,3603 g
(em 5 mL de H2O)
20,00 0,0130 0,1440
CdTe - AMP 1,2 mL a 4,9 % 20,00 0,0130 0,1440
4.2.2 Bioconjugação QDs - anticorpos
No caso deste QD, não há a etapa de funcionalização visto que os
estabilizantes já cumprem também esta função. Ao final da síntese, o CdTe já
está recoberto por AMS, ou AMP, que fará a ligação com a molécula alvo, neste
caso, anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente.
O CdTe - AMS e CdTe - AMP foram bioconjugados com as biomoléculas, o
anticorpo monoclonal anti-A e anti-B (Fresenius Kabi e Lorne), respectivamente,
por adsorção (SHI, 2009). Foi realizado o ajuste do pH dos QDs para 8,0 e os
anticorpos ficaram em contato com os QDs por 2 horas a 25 ºC e ao abrigo da luz.
As proporções entre QD-AMS:anti-A e QD-AMP:anti-B foram de 50:1, 25:1 e
12,5:1 (v/v). A estabilidade dos bioconjugados também foi testada após 24 horas
de preparados. A Figura 18 ilustra os bioconjugados citados.
Figura 18: Da esquerda para direita observa-se as proporções de bioconjugados 50:1, 25:1 e 12,5:1 (v/v) do AMP (amareladas) e as mesmas proporções de bioconjugados para o AMS ( esverdeadas).
4.2.3 Imunomarcação Simples com CdTe - AMS e CdTe - AMP
Dois hematócritos foram feitos a 5% e 1% com hemácias previamente
lavadas e ressuspensas no mesmo fluido isotônico utilizado na lavagem.
Os bioconjugados foram colocados em contato com uma suspensão a 5%
e 1% na proporção de bioconjugado:células de 3:1 (v/v) seguido de uma
incubação a temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse tempo, o material
incubado foi submetido a uma lavagem com o tampão escolhido, sob
centrifugação (rpm: 1800; g: 652) por 30 segundos.
O pellet foi ressuspenso com 300 µL no mesmo tampão utilizado na
lavagem e posteriormente, foi analisado em um citômetro de fluxo FACScalibur
(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) e as análises foram realizadas com
aquisição de 10.000 eventos/células para os filtros FL1 (λ = 515 - 530 nm)
emissão correspondente a cor verde do CdTe - AMP, e FL2 (λ = 560 - 580 nm)
emissão correspondente ao alaranjado emitido pelo CdTe - AMS. Para fins de
comparação, todos os experimentos foram realizados nestas condições.
O software utilizado para o tratamento dos dados foi o Cell Pro (Cell Quest
TM Software, Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).
4.2.3.1 Formalização (Fixação da Fluorescência)
A tentativa de formalização foi realizada colocando-se um pool de
hemácias incubadas junto com 500 µL de PBS - Formol que consiste numa
solução de PBS 1X a 1% de formol. Esta solução é utilizada na rotina laboratorial
para fixação de fluorescência em amostras que não serão processadas na
citometria em um breve espaço de tempo logo após a incubação.
No momento da leitura, a amostra é centrifugadas nas mesmas condições
já citadas e o pellet formado é ressuspenso em 300 µL de PBS 1X ou salina 0,9%.
4.2.3.2 Imunomarcação Dupla com CdTe - AMS e CdTe - AMP
Os mesmos passos iniciais da marcação simples foram aplicados neste
experimento, porém as proporções de bioconjugados diferiram.
Na primeira situação 150 µL de cada QDs, CdTe - AMS e CdTe - AMP,
bioconjugados a anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente, foram incubados
com uma suspensão de eritrócitos a 1% ficando em uma proporção final de 3:1
bioconjugado:células (150 µL de CdTe - AMS - anti-A + 150 µL CdTe - AMP - anti-
B: 100 µL de células tipo AB).
Já na segunda, 300 µL de cada bioconjugado supracitado foi colocado para
incubação com a suspensão de eritrócitos (300 µL de CdTe - AMS - anti-A + 300
µL CdTe - AMP - anti-B: 100 µL de células tipo AB).
Em resumo, duas proporções de bioconjugados foram aplicados nas
hemácias sendo estes 1,5:1 e 3:1 (v/v), de cada sistema (CdTe - AMS - anti-A e
CdTe - AMP - anti-B), para cada incubação.
Posteriormente as mesmas condições de lavagem e centrifugação citadas
para a simples marcação foram realizadas como procedimento pré-analítico da
citometria.
4.3. CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ESTRUTURAL DOS QDs
Para confirmar a formação dos QDs, bem como a sua qualidade, é
necessário caracterizá-las óptica e estruturalmente.
4.3.1 Caracterização Estrutural
Para confirmar a cristalinidade, a distribuição de tamanho e a geometria
desses QDs, é necessário caracterizá-las estruturalmente. Para esta finalidade
duas técnicas foram aplicadas: Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e
Difração do Raio-X em pó (DRX).
A microscopia foi realizada através de MET de alta resolução em
Microscópio Eletrônico de Transmissão Tecnai - G2 - 20 - FEI 2006, 200 KV no
Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS). É indicado que as amostras
tenham uma espessura de 500 a 5000 Å e estas são depositadas em um suporte
de carbono apoiados em pequenas grades de níquel e cobre. A amostra é diluída
em água deionizada na diluição 1:5 e deixada em ultra-som por 15 minutos para
redispersão. Após este passo, 12 µL são pingados nas grades e espera-se secar
após 24 h em dessecador.
Os difratogramas foram obtidos no difratômetro da Siemens Nixford D5000
digital (com biblioteca cristalográfica), com radiação incidente Kα(Cu) = 1,542 Å,
voltagem de 40 KV e corrente de 40 mV. Os difratogramas de Raios-X foram
obtidos entre 2 = 10 e 60º.
A preparação das amostras para esta técnica foi processada com a
precipitação dos nanocristais utilizando isopropanol na proporção 3:2 -
isopropanol:QD - (v/v) seguido de centrifugação por 15 minutos e g = 1585.
Posteriormente o sobrenadante é desprezado direto do tubo centrifugado
vertendo-o e o pellet foi ressuspenso no volume residual. O material ressuspenso
é então gotejado em uma lâmina fosca e é deixando secar lentamente dentro de
um dessecador para minimizar processos oxidativos das partículas.
Os difratogramas foram utilizados para calcular o diâmetro médio das
partículas a partir da largura da linha mais intensa dos difratogramas através da
fórmula de Scherrer (WEST, 1997)
0,9. = d.B.cos
onde:
d = diâmetro médio das partículas (em nm)
= comprimento de onda utilizado pelo instrumento ( = 0,1542 nm)
B = largura de linha do pico de difração na metade da intensidade máxima
(em radianos)
= ângulo de incidência do feixe de raios-X no pico do difratograma de
máxima intensidade
4.3.2 Caracterização Óptica
Através de espectroscopias de absorção e emissão, as nanopartículas
foram caracterizadas química, física e estruturalmente. Estas medidas foram
realizadas utilizando o instrumento UV/VIS Spectrophotometer, Perkin-Elmer,
modelo LLS 55, e o espectrofotômetro Ocean Optics, modelo HR4000, utilizando
a água ultra-pura como referência. Uma estimativa de tamanho das partículas
pode ser realizada através da interpolação com dados empíricos de outras
sínteses descritas na literatura. Para o tamanho das nanoestruturas de CdS foi
utilizada a relação experimental feita por Vossmeyer et al. (1994) enquanto que
para CdTe foi utilizada a relação empírica de Dagtepe et al. (2007).
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ÓPTICA DOS QDs
Para calcular o tamanho médio das nanopartículas sintetizadas através da
Difração de Raios - X foi aplicada a fórmula de Scherrer e em
complementaridade, a análise morfológica através da Microscopia Eletrônica de
Transmissão.
5.1.1 Caracterização Óptica e Estrutural do CdS/Cd(OH)2
A Figura 19 mostra um difratograma representativo das amostras
sintetizadas. Comparando os dados de difração com o banco de dados
internacional, JCPDS nº 75 – 2086 observou-se que a estrutura cristalina é cúbica
tipo blenda de zinco com picos de difração intensos em 2: 26,5; 32,29; 44,09;
52,16, correspondendo, respectivamente, aos planos cristalinos (111), (200),
(220) e (311) do semicondutor CdS (CHAVES, 2011).
O plano (111) foi utilizado para estimar o tamanho médio dos cristais
utilizando-se a equação de Debye-Scherrer resultando em um tamanho médio (d)
das partículas de d = 7,5 nm. Os picos alargados são característicos de amostra
de dimensões nanométricas.
10 20 30 40 50 60
0
10
20
30
40
(311)(220)
(200)
Inte
nsid
ade
2(Graus)
(111)
Figura 19: Difratograma de raios-X de pó representativo de amostra de CdS/Cd(OH)2.
A Figura 20 mostra os espectros de absorção e emissão da suspensão de
CdS/Cd(OH)2-Glut utilizada nas marcações. Os espectros de absorção
concordam com dados anteriores obtidos na literatura para partículas com
diâmetro médio em torno de d = 6 nm (SANTOS, 2002). Observa-se que a banda
de emissão apresenta um máximo em = 493 nm, mas com um comportamento
log normal estendendo sua banda de emissão até a região do vermelho distante.
400 450 500 550 600400 600
Absorç
ao
Comprimento de Onda (nm)
Inte
nsid
ade N
orm
aliz
ada
Figura 20: Espectros de Absorção e emissão normalizada do CdS/Cd(OH)2 (excitado em 337 nm) .
O espectro de emissão mostra emissão com coloração azul turqueza, com
uma largura de banda em torno de FWFH = 29 nm.
5.1.2 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMS
A Figura 21 mostra o difratograma das amostras sintetizadas de
CdTe- AMS cujo pico mais intenso encontra-se em 2 = 23,8o.
20 30 40 50 60
0
5
10
15
20
25
30
35
2 (Graus)
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
(111)
(220)
(311)
Figura 21: Difratograma de Raios-X de pó do CdTe - AMS.
Aplicando-se a equação de Scherrer, obteve-se o tamanho médio das
partículas de d = 3 nm. E através da equação de Dagtepe et al, (2007) cuja
estimativa é obtida empregando o valor do primeiro máximo de absorção, o
diâmetro estimado foi de d = 3,2 nm, em concordância com o resultado obtido
através de DRX.
A Figura 22 mostra os espectros de absorção e emissão representativos de
uma suspensão de CdTe - AMS sintetizada.
0.0
0.5
1.0
1.5
450 500 550 600 650 700 7500.0
0.5
1.0
1.5
Absorb
ância
Inte
nsid
ade N
orm
aliz
ada
Comprimento de Onda (nm)
Figura 22: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - AMS sintetizada.
Tomando como base o primeiro máximo de absorção em 551nm essas
nanopartículas apresentam um diâmetro aproximado de d = 3,2 nm (DAGTEPE,
2007; ROGACH, 2007) em concordância com as técnicas anteriores. O espectro
de emissão mostra emissão de coloração vermelho alaranjado e com largura de
banda FWHM = 49 nm.
Após análise das imagens obtidas a partir de MET das suspensões de QDs
(Figura 23) foi estimado uma faixa de dimensão de partículas d = 3 - 5 nm apesar
do difícil contraste e grande superposição das partículas.
Figura 23: Imagem HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMS. Barra: 5 nm.
Nas imagens observadas na Figura 23 podemos notar, apesar dos
aglomerados mais escurecidos, que existem arranjos definidos e lineares de
átomos em alguns pontos (círculos vermelhos denotando planos cristalinos
regulares) diferente das regiões mais claras e sem organização do fundo da
imagem que corresponde ao suporte usado para a análise. O arranjo de
pequenos pontos ordenados é indicativo da presença de planos cristalinos e
consequentemente, da presença de cristais bem definidos na amostra de CdTe -
AMS.
5.1.3 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMP
Através da Figura 24, que representa o difratograma dos nanocristais de
CdTe - AMP sintetizados, obtivemos os dados estruturais dessa amostra: fase
cúbica, tipo blenda de zinco e com planos (111), (220) e (311)) característicos do
semicondutor CdTe.
20 30 40 50 60
0
5
10
15
20
25
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
2 (Graus)
(111)
(220)
(311)
Figura 24: Difratograma de Raios X de pó de CdTe - AMP.
Aplicando-se a equação de Scherrer, obteve-se um diâmetro médio das
partículas em torno de d = 2,6 nm. As imagens obtidas através de HR-MET
evidenciam partículas cristalinas e com dimensão nanométrica (Figura 25).
Figura 25: Imagens HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMP. Os círculos verdes
delimitam o diâmetro das nanopartículas evidenciando os planos cristalinos. Barra: 2 nm.
Em ambas as imagens da Figura 25 os planos cristalinos são melhor
visualizados em contraste com o padrão do suporte (mais claro). Podem ser
observados nitidamente vários planos cristalinos se sobrepondo em diferentes
sentidos (horizontais, verticais, inclinados) confirmando a presença dos cristais de
CdTe - AMP.
A análise aproximada de estimativa de tamanho evidencia partículas entre
2 - 5 nm concordando assim com os dados empíricos para o tamanho das
nanopartículas obtidos pela análise de DRX.
A Figura 26 mostra os espectros de absorção e de emissão representativos
das suspensões de CdTe - AMP preparadas neste trabalho. Tomando como base
o primeiro máximo de absorção verificado nos espectros ( = 486 nm) e
aplicando-se a equação de Dagtepe et al (2007) o diâmetro estimado também foi
de d = 2,6 nm. As caracterizações estrutural e óptica confirmaram o tamanho
nanométrico para o CdTe - AMP.
400 450 500 550 600 650 700
Inte
nsid
ade N
orm
aliz
ada
Comprimento de Onda (nm)
Absorb
ância
Figura 26: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - AMP sintetizada
O espectro de emissão mostra emissão de coloração verde e com largura
de banda FWHM = 49 nm.
5.2 ANÁLISES DE CITOMETRIA DE FLUXO
5.2.1 Imunomarcação Simples de Eritrócitos com CdS/Cd(OH)2
Os primeiros experimentos realizados com os QDs marcando eritrócitos
foram obtidos utilizando-se nanocristais de CdS/Cd(OH)2 funcionalizados com
glutaraldeído (Glut). A capacidade de conjugação do glutaraldeído a proteínas e
outras estruturas que possuam grupamentos amino já é bastante conhecida e
utilizada em bioensaios. Neste caso o glutaraldeído pode ser então utilizado como
agente funcionalizante inespecífico, permitindo a ligação de QDs, por exemplo, a
qualquer estrutura protéica; ou como agente intercalante entre QDs e
biomoléculas capazes de se ligar especificamente a certas estruturas biológicas
(MENEZES, 2006).
Nos presentes testes, uma suspensão de hemácias a 5%, previamente
lavada, foi incubada da seguinte forma:
1. Suspensão de hemácias tipo A com QDs não funcionalizados (controle
negativo 1);
2. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut (controle negativo 2);
3. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 100:1;
4. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 20:1;
5. Suspensão de hemácias tipo O com QDs-Glut-anti-A 100:1.
A Figura 27 ilustra o panorama obtido na citometria de fluxo para as
hemácias marcadas.
Figura 27: Dot-plots obtidos na citometria de fluxo na marcação com CdS/Cd(OH)2. 1: Células tipo A não marcadas; 2: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut; 3: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 100:1; 4: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 20:1; 5: Células tipo O incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 100:1.
Neste experimento foram aplicados controles negativos para averiguação
de autofluorescência e quanto à inespecificidade do QD funcionalizado. Observa-
se, através da análise destes controles que, no dot-plot 1 que não houve detecção
de auto-fluorescência e no dot-plot 2, houve uma pequena marcação inespecífica
do QD-Glut que pode ser notada através da análise do dot-plot.
O dot-plot 3 (Figura 27) é o primeiro sistema teste. Observa-se a marcação
parcial das hemácias com o bioconjugado CdS/CdS(OH)2-Glut-anti-A num total de
28,40% da população. Já no dot-plot 4, que também apresentou marcação parcial
em FL1, a população marcada foi de 19,30%. O dot-plot 5 mostra a marcação das
hemácias tipo O (controle negativo papa o antígeno A) incubadas com o sistema
CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 100:1 na qual não houve detecção de sinal de
fluorescência comprovando a especificidade do complexo aplicado.
De uma forma geral as marcações com CdS/Cd(OH)2 não foram muito
eficazes em termos quantitativos. Nestas pode ser observada muita marcação
inespecífica pela afinidade do Glutaraldeído com proteínas da superfície dos
eritrócitos e conseqüente inespecificidade da marcação (Figura 27). Isto fica
evidenciado quando é analisado o tipo A incubado com QD - Glut no qual
apresenta certa fração de marcação na ausência de anticorpos anti-A.
Porém há especificidade da técnica quando comparamos com os
resultados da incubação do QD-Glut-anti-A com o tipo O, o que alavanca a
possibilidade de expansão do uso de outros QDs na imunofenotipagem.
5.2.2 Imunomarcações Simples com CdTe
Depois do uso do CdS/Cd(OH)2, um segundo QD foi aplicado na busca de
melhores resultados. O CdTe estabilizado com AMS (emissão no laranja) foi
utilizado com anti-A para a marcação de hemácias tipo A obtendo-se os
resultados mostrados nos histogramas de citometria de fluxo (Figura 28).
Figura 28: Histogramas de hemácias marcadas com CdTe - AMS - anti-A. 1: hemácias tipo A com QD; 2: hemácias tipo A com QD-anti-A; 3: hemácias tipo O com QD-anti-A.
Nestes resultados observa-se a especificidade esperada do bioconjugado
QD-anti-A para as hemácias tipo A em uma suspensão a 5%. No histograma 1,
7,24% da população apresentou marcação inespecífica. Já no dot-plot 2, 25,47%
da população apresentaram marcação, sendo 18,23% o valor sem
inespecificidade (valor descontado da fração relacionada à marcação in
específica). O dot-plot 3 não apresentou marcação das hemácias tipo O com o
bioconjugado QD-anti-A.
5.2.2.1 Otimização parâmetros da marcação
Dois parâmetros foram variados de forma a testar a eficiência da
bioconjugação de QDs de CdTe a hemácias: (i) variação da concentração de
hemácias (hematócrito) e (ii) variação da concentração relativa do bioconjugado
CdTe/Anti A. Nestes experimentos foram utilizados os QDs CdTe - AMS, anti-A e
eritrócitos do tipo A para todas as proporções de bioconjugados aplicadas.
Variação do Hematócrito
Os testes realizados foram ordenados em busca do melhor protocolo para
o modelo experimental por adsorção proposto neste trabalho.
O primeiro teste foi uma rápida análise com a variação da concentração da
suspensão de hemácias. A concentração usual nos experimentos iniciais, e
também comumente aplicada nos bancos de sangue e laboratórios de análises
clínicas, é de 5% de hemácias lavadas em PBS 1X ou solução salina 0,9%
suspensas na mesma solução isosmótica da lavagem. Neste caso, foi utilizada
uma segunda concentração a 1% obtendo-se os resultados expressados no
gráfico comparativo da Figura 29.
Figura 29: Gráfico que demonstra a diferença percentual da marcação de hemácias em duas concentrações diferentes quantificadas através de citometria de fluxo.
Foi observado que na proporção inicial de QD:anticorpos, utilizada até
então de 50:1, a mudança da concentração da suspensão de hemácias de 5%
para 1% teve significativa relevância, aumentando a concentração de células
marcadas de 12,58%, na concentração a 5%, para 43,99% na concentração de
1% de hemácias. A concentração da suspensão de hemácias a 1% ficou
estabelecida como sendo a melhor para os experimentos.
Estes experimentos foram realizados com o QD CdTe - AMS - anti-A em
eritrócitos do tipo A com relação bioconjugado:células de 3:1.
Avaliação da Concentração do Bioconjugado
O segundo teste realizado visou chegar a uma relação ideal da proporção
bioconjugado:suspensão de hemácias (1%). Neste caso as proporções de
QD:anticorpos foram 50:1, 25:1 e 12,5:1, chamadas de bioconjugado 1,
bioconjugado 2 e bioconjugado 3, respectivamente. Estas foram testadas e na
Figura 30 através do gráfico comparativo 2 podemos ver os resultados.
Figura 30: Gráfico evidenciando a diferença percentual da marcação com a variação de bioconjugado em cada amostra observada através de citometria de fluxo.
Nesse teste observa-se que a proporção mais relevante foi a de 25:1 com
76,87% de marcação das hemácias, em comparação com 50,22% de marcação
no caso de 50:1. A proporção de 12,5:1 não apresentou marcação. A hipótese
para este fenômeno é que uma maior quantidade de anticorpos nesta proporção
dificulta a interação do bioconjugado com o antígeno tanto pela maior oferta de
anticorpos não conjugados como pela maior formação de hemaglutinados.
5.2.2.2 Dupla Marcação QD e Glicoforina
A Glicoforina é uma proteína específica da membrana dos eritrócitos com a
função de transporte de açúcares e que confere um caráter hidrofílico às
hemácias permitindo que estas circulem sem aderir a outras células ou aos vasos.
As glicoforinas podem ser subdivididas em três tipos: Glicoforina A, a mais
abundante, B e C e está presente em todos os eritrócitos independente da
tipagem ABO.
Esta proteína foi utilizada como marcador para a confirmação de que a
população marcada nos experimentos era essencialmente de hemácias e assim
comprovar que o procedimento de preparo da suspensão de eritrócitos é eficaz.
A Figura 31 ilustra os dot-plots com hemácias A e O, marcadas com
QD:anti-A na proporção 25:1 com a relação bioconjugado:células de 3:1.
Figura 31: Dot-plots de hemácias duplo marcadas com QD - AMS e Glicoforina - FITC. Em (1) hemácias tipo A evidenciando a dupla marcação e em (2) hemácias tipo O demonstrando marcação apenas da glicoforina.
No dot-plot 1 (Figura 31), onde foram marcadas hemácias tipo A, observa-
se que houve significativa contagem de eventos no quadrante superior direito com
93,36% de marcação dos eritrócitos. A dupla marcação foi efetuada com CdTe -
AMS:anti-A, captado em FL2 (laranja), e glicoforina - FITC, captado em FL1
(verde).
No dot-plot 2, com hemácias marcadas tipo O, observa-se que no
quadrante inferior direito houve a maior marcação de células, contabilizando
93,36% de eventos. Pode-se verificar também que o quadrante superior esquerdo
não apresentou células marcadas.
A análise destes dois dot-plots confirma que a população marcada nos
experimentos é essencialmente de eritrócitos. Outra observação relevante é a
constatação de que os bioconjugados têm especificidade, visto a não marcação
do tipo O no teste.
Por último, neste teste, fica evidenciado o potencial dos QDs para o uso em
marcações simultâneas com corantes orgânicos já usados em uma gama de
finalidades sem que haja a interposição de sinais e obtendo-se boa resolução.
5.2.2.3 Estabilidade do Bioconjugado após 24 horas e Formalização
Mesmo já sendo notada significativa queda do sinal após 24 h de
bioconjugação, a formalização, para aplicação em QD, não se mostra aplicável
resultando em significativa perda da detecção de fluorescência.
Outro teste realizado foi a verificação da estabilidade do bioconjugado após
24 h de sua formulação sendo este aplicado a eritrócitos nas mesmas condições
do teste realizado no dia da bioconjugação. O sistema aplicado neste caso foi o
CdTe - AMS - anti-B em eritrócitos tipo B na proporção bioconjugado:células de
3:1.
Os resultados dispostos na Figura 32 evidenciam que houve uma redução
no número de eventos contabilizados para o mesmo bioconjugado após 24 h da
sua formulação. Os testes foram realizados nas mesmas condições e o
bioconjugado ficou armazenado overnight sob refrigeração (2-8°C).
0,00%5,00%
10,00%15,00%20,00%25,00%30,00%35,00%40,00%45,00%50,00%
2h 24h Formol
47,75%
24,43%
6,74%
Percentual demarcação
Figura 32: Gráfico dos percentuais de hemácias marcadas com bioconjugados
após 2 h, 24 h e formalizados, observados através de citometria de fluxo.
A formalização é uma técnica usada para a fixação da fluorescência onde
uma solução de PBS 1X - formol é adicionada nas células marcadas para que
estas sejam observadas muito tempo depois da incubação sem que haja perdas
de detecção. A técnica é utilizada na rotina laboratorial sem que haja prejuízo na
leitura da amostra quando esta for analisada na citometria de fluxo.
Neste teste o sistema CdTe - AMS - anti-B foi aplicado em hemácias tipo
B. A mesma amostra de bioconjugado lida na citometria posteriormente foi
formalizada e lida após 24 h.
5.2.2.4 Imunomarcações Simples
Hemácias tipo A com CdTe - AMS - anti-A
Esta marcação foi realizada efetuando os mesmos passos anteriormente já
descritos e utilizando o Bioconjugado 2 (25:1 - QD:anti-A) e a proporção de
bioconjugado:células foi de 3:1. O QD utilizado foi o CdTe - AMS.
A Figura 33 mostra os histogramas obtidos nestes testes. Através do
histograma 1 notamos que a população celular que apresentou marcação foi de
70,64%. No histograma 2, onde o controle negativo é o tipo O, notamos quem não
há evidências de marcação.
Figura 33: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe - AMS - anti-A foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%.
Hemácias tipo B com CdTe - AMP - anti-B
Esta marcação foi realizada efetuando-se os mesmos passos
anteriormente já descritos e utilizando o Bioconjugado 2 (25:1 - QD:anti-A) e a
proporção de bioconjugado:células foi de 3:1. O QD utilizado foi o CdTe - AMP.
A Figura 34 mostra os histogramas obtidos nestes testes. Através do
histograma 1 notamos que a população celular que apresentou marcação foi de
37,73%. No histograma 2, controle negativo tipo O, nota-se que não há evidência
de eventos.
Figura 34: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe - AMP - anti-B foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%.
5.2.2.5 Imunomarcações Duplas
Neste teste a dupla marcação com QDs foi realizada sendo aplicados os
sistemas CdTe - AMS - anti-A e CdTe - AMP - anti-B em eritrócitos tipo AB a 1%
sendo o controle negativo o tipo O.
A Figura 35 mostra o panorama das marcações através dos dot-plots
obtidos por citometria de fluxo.
Figura 35: Dot-plots da dupla marcação com os sistemas CdTe - AMS - anti-A e CdTe - AMP - anti-B em hemácias tipo AB a 1% nas proporções 1,5:1 (1) e 3:1 (2) bioconjugado:células.
Através da imagem dos dot plots apresentados na Figura 36 fica
evidenciada a dupla marcação no quadrante superior direito dos dot-plots 1 e 2.
No dot-plot 1, com a proporção bioconjugado:células de 1,5:1 (metade do volume
aplicado nos testes de simples marcação) verificou-se que houve uma contagem
de 58,24% de eritrócitos duplo-marcados. No mesmo dot-plot, no quadrante
inferior direito, referente à detecção do CdTe - AMP, verificamos uma contagem
de 23,65%. No quadrante superior esquerdo não é observada a marcação que
seria correspondente ao CdTe - AMS.
No dot-plot 2 verificamos uma evolução no percentual de marcação
detectado. Neste, a contagem foi de 77,75% no quadrante superior direito. Os
volumes utilizados neste teste correspondem aos aplicados nas marcações
simples onde a proporção bioconjugado:células é de 3:1. No quadrante inferior
direito, referente à detecção do CdTe - AMP, 16,82% dos eritrócitos foram
marcados.
5.2.2.6 Discussão
A técnica de adsorção empregada para os QDs de CdTe, seja com AMS ou
AMP, evidencia melhor reprodutibilidade que a funcionalização realizada com Glut
apresentando o mínimo de marcação inespecífica. Relatos na literatura indicam
que o mecanismo de adsorção é baseado em ligações hidrofóbicas/hidrofílicas
através de forças de Van der Waals podendo também ocorrer por interações
eletrostáticas entre os grupos tióis disponíveis do CdTe - AMS/AMP e os
anticorpos (SHI, 2009).
Existem alguns pontos que ainda podem ser observados apontando para
possíveis melhorias: (i) ajuste da temperatura ideal para a bioconjugação, (ii)
osmolaridade da suspensão de hemácias e QDs, (iii) estabilidade e manutenção
das propriedade ópticas dos QDs na pós manipulação e (iv) outros fatores, como
amostras de sangue coletadas em outro anticoagulante, são variantes que podem
melhorar a eficiência da ligação entre o anticorpo e as nanopartículas.
Também observamos que aumentando a quantidade de anticorpo, há
aumento significativo da aglutinação dificultando a quantificação da marcação e
aumentando a quantidade de debris nas análises.
A utilização da adsorção como metodologia de conjugação por não ser tão
efetiva provavelmente leva a oferta de poucos conjugados por células justificando
o fato de não se conseguir a plena marcação em populações celulares 100%
positiva para o antígeno alvo. Neste ponto, vale ressaltar que quaisquer variações
de PI (Ponto Isoelétrico) da proteína e da carga do QD, podem mudar a sua
probabilidade de acontecer.
Nos experimentos de simples marcação nota-se que há um maior
percentual de eventos evidenciados quando foi utilizado CdTe - AMS comparado
ao CdTe - AMP. A explicação para essa evidência é a presença de dois tióis na
estrutura molecular do AMS que facilitam as interações dos QDs com os
anticorpos e assim proporcionam uma maior adsorção mais efetiva no sistema
CdTe - AMS - anticorpo.
Nos testes relativos à estabilidade do bioconjugado com o tempo e
tentativa de formalização observou-se através dos resultados que este só é
estável para algumas horas após a bioconjugação QD-anticorpo. Houve
significativas perdas de marcação com o tempo de 24 h provavelmente pela perda
da atividade da biomolécula visto que ainda houve detecção de sinal de
fluorescência mesmo que em menor número de eventos. Já a tentativa de
formalização não se mostrou aplicável possivelmente pela possibilidade de
reação das nanopartículas com o formol.
CAPÍTULO 6: CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
As sínteses dos QDs utilizados nesse experimento foram realizadas com
sucesso e os dados das caracterizações óptica e estrutural confirmaram o
tamanho nanométrico para as nanopartículas de CdS/Cd(OH)2 de 6 nm, CdTe -
AMS de 3 nm e CdTe - AMP de 2,6 nm. Todas fluorescências dos QDs foram
detectáveis na citometria de fluxo.
Os resultados obtidos na citometria de fluxo usando eritrócitos humanos
fenotipados quanto ao sistema ABO, mostraram que a técnica pode ser usada na
imunofenotipagem celular usando QDs como fluoróforos com excelente detecção.
Os QDs de CdTe com anti-A e anti-B, se mostraram eficazes e com alta
especificidade conseguindo-se até 70,64% de marcação com o CdTe - AMS e
37,73% com o CdTe - AMP nas marcações simples. Já em marcações duplas, os
QDs de CdTe se mostraram eficazes conseguindo-se até 77,75% de população
duplo-marcadas nos experimentos realizados. O controle negativo (tipo O) não
apresentou marcação em nenhum experimento comprovando assim, que os
anticorpos mantiveram a sua funcionalidade biológica.
O protocolo proposto neste trabalho pode ser considerado de baixo custo
visto que os equipamentos aplicados já são utilizados como rotina dos
hemocentros para imunofenotipagem e, além disso, as nanopartículas são
sintetizadas em meio aquoso com pouca quantidade de reagentes e volumes
muito pequenos são utilizados nos processos de bioconjugação.
A manipulação dos QDs é fácil e mais rápida quando comparada com as
técnicas de biologia molecular e possui grande sensibilidade quando comparada
com as reações de hemaglutinações, aplicadas rotineiramente na
imunofenotipagem dos grupos sanguíneos nos bancos de sangue, especialmente
quando se trata da investigação de subgrupos.
A técnica proposta demonstra grande potencial de inovação tecnológica na
complementaridade de testes de imunofenotipagem do sistema ABO e seus
subgrupos, apresentando-se também, como um modelo para outras aplicações na
imunofluorescência.
Como perspectivas para a continuidade deste trabalho tem-se:
(i) busca de uma bioconjugação por ligações covalentes que não desnature
os anticorpos;
(ii) bioconjugação com anticorpos para outros antígenos de detecção mais
laboriosa;
(iii) marcação e avaliação da distribuição de sub-grupos sanguíneos (A1,
A2, B1, B2, etc);
(iv) associação da citometria de fluxo com técnicas de microscopias de
fluorescência e;
(v) validação da técnica.
CAPÍTULO 7: REFERÊNCIAS
<http://www.dpmdiagnostica.com.br/produtos_infinicyt.html> acesso em 19/01/2012;
ALIVISATOS, P. et al. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science, v. 281, p. 2013 - 2016 (1998);
BATISSOCO, A. C. & NOVARETTI, M. C. Z. Aspectos moleculares do Sistema Sangüíneo ABO. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. v. 25, n. 1, p. 47 - 58 (2003);
BD Bioscience. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide, manual Part Number 11-11032-01, 2000;
BIRD, G.W. Relationship of the blood sub-groups A1, A2 and A1B, A2B to hawmagglutinis presente in the deeds of Dolichos biflorus. Nature. v. 170, p. 674 (1952);
CARTRON, J.P.; GERBAL, A.; HUGHES-JONES, N.C.; SALMON, C. Weak A phenotypes relationship between red cell agglutinability and antigen site density. Immunology. v. 27 (4), p. 723 - 727. (1974);
CAVALCANTI JÚNIOR, G. B.; SCHEINER, M. A. M.; VASCONCELOS, F. C.; DOBBIN, J. A.; KLUMB, C. E.; MAIA, R. C. Detecção da proteína p53 em células leucêmicas por citometriade fluxo e Western blot. Revista Brasileira de Cancerologia. v. 50, n. 3, p. 191-202, 2004;
CHAN, W. C. W. & NIE, S. Quantum Dot Bioconjugates for Ultrasensitive Nonisotopic Detection. Science. v. 281, p. 2016-2018, 1998;
CHAN, W. C. W.; MAXWELL, D. J.; GAO, X.; BAILEY, R. E.; HAN, M.; NIE, S. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Current Opinion in Biotechnology. v. 13, p. 40-46, 2002;
CHAVES, C. R. Síntese e caracterização de nanopartículas de sulfeto de cádmio: aplicações biomédicas. Recife, 2006. 111 folhas Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Pernambuco. CCEN. Ciência de materiais, (2006);
DAGTEPE, P.; CHIKAN, V.; JASINSKI, J.; LEPPERT, V. J.; Quantized Growth of CdTe Quantum Dots; Observation of Magic-Sized CdTe Quantum Dots. Journal of Physical. Chemistry., 111, p. 14977-14983 (2007);
DANIELS, G. A century of human blood groups. Wiener Klinische Wochenschrift. v. 113, p. 781 - 786 (2001);
DEL PEON-HIDALGO, L. et al. Frecuencias de grupos sanguíneos e incompatibilidades ABO y RhD, en La Paz, Baja California Sur, México. Salud pública México. v. 44, p.406 - 412 (2002);
DRBOHLAVOVA, J.; ADAM, V.; KIZEK, R,; HUBALEK, J. Quantum Dots - Characterization, Preparation and Usage in Biological Systems. Int. J. Mol. Sci. v.10, p. 656-673, (2009);
FARIAS, P. M. A.; SANTOS, B.S.; MENEZES, F.D.; FERREIRA, R. C.; BARJAS-CASTRO, M. L.; CASTRO, V.; LIMA, P. R. M.; FONTES, A.; CESAR, C. L. Core-
shell CdS/Cd(OH)2 quantum dots: synthesis and bioconjugation to target red cells antigens. Journal of microscopy. v. 209, p. 103 - 108 (2005);
FOJTIK , A.; WELLER, H.; KOCH, U.; HENGLEIN, A.; B ER. BUNSENGES. Phys. Chem., 88 , 969 – 977 ( 1984 );
FORTINA, P.; KRICKA L. J.; SURRE S.; GRODZINSKI, P.; Nanobiotechnology: the promise and reality of new approaches to molecular recognition. TRENDS in Biotechnology. v. 23, n. 4, 2005.;
GAO, X.; YANG, L.; PETROS, J. A.; MARSHALL, F. F.; SIMONS, J. W.; NIE, S. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current Opinion in Biotechnology. v. 16, p. 63-72, 2005;
GARRATTY, G. & ARNDT, P. A. Applications of Flow Cytofluorometry to Red Blood Cell Immunology. Cytometry (Communications in Clinical Cytometry). v. 38, p. 259-267, 1999;
GOLDMAN, E. R.; CLAPP, A. R.; ANDERSON, G. P.; UYEDA, H. T.; MAURO, J. M.; MEDINTZ, I. L.; MATTOUSSI, H. Multiplexed Toxin Analysis Using Four Colors of Quantum Dot Fluororeagents. Anal. Chem. v. 76, p. 684-688, 2004;
GOLDSTEIN, I.J.; HAYES, C.E. The lectins: Carbohydrate-binding proteins of plants and animals. Adv Carbohydr Chem Biochem, v. 35, p.127 (1978).
GUILHERME, R. S.; CAPUTTO, L. Z.; FONSECA, A. L. A.; PEREIRA, J; FONSECA, F. L. A. Exames laboratoriais complementares indicados no apoio ao diagnóstico do linfoma difuso de grandes células B (LDGCB). Arquivos Brasileiros de Ciências da Saúde, v.33, n. 3, p. 185-194, 2008;
HAKOMORI, S. Philip Levine award lecture: blood group glycolipid antigens and their modifications as human câncer antigens. Am. J. Clin. Pathol. v. 82 (6), p. 635 - 648, (1984);
HENGLEIN, A. Photochemistry of colloidal cadmium sulfide. 2. Effects of adsorbed methyl viologen and of colloidal platinum. Journal of Phyical Chemistry, v. 86, p. 2291 - 2293 (1982);
HERMANSON, G. T.; Bioconjugate Techniques. Pierce Biotechnology. In Thermo Fisher Scientifi c, Rockford, Illinois, USA, 2008, 1202p.
HOSHINO, A.; HANAKI, H. –I.; SUZUKI, K.; YAMAMOTO, K. Applications of Tlymphoma labeled with fluorescent quantum dots to cell tracing markers in mouse body. Biochem. Res. Commun. v. 314, p. 46-53, 2004;
HOSOI, E. Biological and clinical aspects of ABO blood group system. The Journal of Medical Investigation. v. 55, p 174 - 182 (2008);
HUANG, G. L.; LIU, T. C.; LIU, M. X.; MEI, X. Y. The application of quantum dots as Fluorescent label to glycoarray. Analytical Biochemistry. n. 340, p. 52-56, 2005;
KERMAN, K.; ENDO, T.; TSUKAMOTO, M.; CHIKAE, M.; TAKAMURA, Y.; TAMIYA, E. Quantum dotbased immunosensor for the detection of prostate-specific antigen using fluorescence microscopy. Talanta. v. 71, p. 1494-1499, 2007;
LANDSTEINER, K. Zur Kennetnis der antifermentative, lytischen und agglutinierenden wirkungen des blutserums und der lynphe. Zentralbl Bakteriol v. 27, p. 357 – 362, (1900);
LIRA, R. B. ; SALES NETO, A. T. ; CARVALHO, K. H. G. ; LEITE, E. S. ; B. JUNIOR, A. ; AZEVEDO, D. P. L. ; CABRAL FILHO, P. E. ; CAVALCANTI, B. M. ; MARAL, A. J. ; FARIAS, P. M. A. ; SANTOS, B. S. ; FONTES, A. Biocompatible Water Soluble Quantum Dots as New Biophotonic Tools for Hematologic Cells: Applications for Flow Cell Cytometry. Proceedings of SPIE, v. 7575, p. 75750P-1-75750P-5 (2010);
LUDWIG, L., ZILLY, A. Reações transfusionais ligadas ao sistema ABO. Newslab, v. 84, p. 102 (2007).
MATTOS, L. C.; MOREIRA, H. W.. Genetic of the ABO blood system and its link with the immune system. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia v. 26, n.1, p. 60 – 63 (2004);
MEDINTZ, I. L.; TETSUO UYEDA, H.; GOLDMAN, E. R.; MATTOUSSI, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing. Nature Materials. v. 4, 2005;
MICHALET, X.; BENTOLILA, L. A.; WEISS S. In: 8. MOLECULAR IMAGING: PHYSICS AND BIOAPPLICATIONS OF QUANTUM DOTS. Advances in Medical Physics. p. 122-125, (2008);
MURADOR, P. & DEFFUNE, E. Aspectos estruturais da membrana eritrocitária. Revista brasileira de hematologia e hemoterapia. v. 29, p. 168 - 178 (2007);
NAKAGE, A. P. M.; SANTANA, A. E.; CAPUA, M. L. B.; COELHO, P. S. Metodologia e aplicação da citometria de fluxo na hematologia veterinária. Cienc. Rural. v. 35, n. 4, p. 966-973, 2005;
NIDA, D.L.; RAHMAN, M.S.; CARLSON, K.D.; RICHARDS-KORTUM, R.; FOLLEN, M. Fluorescent nanocrystals for use in early cervical cancer detection. Original Research Article Gynecologic Oncology, Volume 99, v. 3, Supplement, p. 89 - 94, (2005);
PORETZ, R.D.; WATKINS, W.M. Galactosyltransferases in human submaxillary glands and stomach mucosa associated with the biosynthesis of blood B specific glycoproteins. Eur. J. Biochem. v. 25 (3), p. 455 - 462, (1972);
ROGACH, A. L.; FRANZI, T. A.; FELDMANN, J.; GAPONIK, K. N.; LESNYAK, V.; SHAVEL, A.; EYCHMULLER, A.; RAKOVICH, Y. P.; DONEGAN, J. F. Aqueous synthesis of thiol-capped CdTe nanocrystals: State-of-the-art., Journal of physics Chemistry, v. 111, p. 14628 - 14637 (2007);
ROITT, I. M.; BROSTOFF, J.; MALE, D. Imunologia. 5. ed. -. São Paulo: Manole, p. 423, 1999;
ROSASCO, M. G.; LIPPI, S.; VALVERDE, J. Frecuencia de los Grupos Sanguíneos A1, A2, Aint, B y O en Individuos Normales. Rev Cubana Hemato.l Inmunol. Hemoter. v.17, n. 3, p. 171-174, (2001);
SALES-NETO, A.T. Imunomarcação de Antígenos Eritrocitários do Tipo “A” com Nanopartículas Fluorescentes de Semicondutores CdS/Cd(OH)2. Monografia de Conclusão de Habilitação em Análises Clínicas, UFPE - 2009, 46p;
SAMPEDRO, R. G.; HERNÁNDEZ, A.B.; VALDÉS, Y. A.; SOLÍS, M. M.; JIMÉNEZ, R. R.; Fenotipos débiles del antígeno A (Sistema ABO de grupos sanguíneos) en donantes de sangre. Revista Cubana Hematologia Imunologia e Hemoterapia. v. 14, n. 2, p. 97 - 100 (1998);
SANTOS, B. S.; FARIAS, P. M. A.; FONTES, A.; BRASIL JR., A. G.; JOVINO, C.N.; NETO, A. G. C.; SILVA, D. C. N.; MENEZES, F. D.; Ferreira, R. Colloidal semiconductor quantum dots: Potencial tools for new diagnostics methods. Applied Surface Science, 255 (3) 796 - 798, (2008);
SANTOS, B.S.; FARIAS, P.M.A; MENEZES, F.D.; C. FERREIRA, R.; JÚNIOR, S.A.; FIGUEIREDO, R.C.B.Q.; CARVALHO JUNIOR, L.B; BELTRÃO, E.I.C. CdS-Cd(OH)2 core shell quantum dots functionalized with Concanavalin A lectin for recognition of mammary tumors. Current Topics in Solid State Physics. (c) 3, N. 11, p. 4017 - 4022 (2006);
SANTOS. B. S. Obtenção de nanopartículas de CdS em sistemas amorfos e a investigação de suas propriedades óptico não-lineares em meio aquoso. Tese de doutorado. UFPE, (2002);
SCHMID, G (Ed.). Nanoparticles From Theory to Application. Weinheim, WILEYVCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 2004;
SEYDACK, M. Nanoparticle labels in immunosensing using optical detection methods. Biosensors and Bioelectronics. v. 20, p. 2454-2469, 2005;
SHACHTER, H.; MICHAELS. M.A.; TILLEY, C.A.; CROOKSTON, J.H. Qualitative differences in the N-acetyl-D-galactosaminyl-transferases produced by human A1 e A2 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. v. 70 (1), p. 220 - 224. (1973);
SHI, C.; HUANG, X.Y.; DONG, C.Q.; CHEN, H.J; REN, J.C. Interaction of CdTe/CdS quantum dots with antibodies. Chinese Chemical Letters, v. 20, p. 1119 – 1122, (2009);
SUKHANOVA, A. & NABIEV, I. Fluorescent nanocrystal quantum dots as medical diagnostic tools. Expert Opin. Med. Diagn. v. 2, n. 4, p. 429-447, 2008;
TOKUMASU, F. & DVORAK, J. Development and application of quantum dots for immunocytochemistry of human erythrocytes. J. Microsc. v. 211, p. 256-261, 2003;
VON DECASTELLO, A.; STÜRLI, E. Ueber die isoagglutinine im serum gesunder und kranker menschen. Mfinch med Wschr. v. 49. p. 1090 - 1095 (1902);
VOSSMEYER, T.; KATSIKAS, L.; GIERSIG, M.; POPOVIC, I. G.; DIESNER, K.; CHEMSEDDINE, A.; EYCHMÜLLER, A.; WELLER, H., J.Phys.Chem., 98, 7665 (1994).
WEISS, D.J. et al. Flow cytometric evaluation of canine bone marrow differential cell counts. Veterinary Clinical Pathology, Baton Rouge, v.29, n.3, p.97-104, 2000;
WEST, A. “Solid State Chemistry ans its Aplications” John Wiley&Sons, 1987;
WITTIG, O. L.; ALONSO, J. A.; ROMANO, E. L.; MONTAÑO, R. F. Producción de anticuerpos monoclonales con especificidad por los grupos sanguíneos A y B. Evaluación de su uso como reactivos hemoclasificadores. Investigation Clinical. v. 47, p. 253 - 264 (2006);
XUE, X; PAN, J; XIEA, H; WANG, J; ZHANG, S. Fluorescence detection of total count of Escherichia coli and Staphylococcus aureus on water-soluble CdSe quantum dots coupled with bacteria. Talanta 77, p. 1808 - 181, 3(2009);
YANG, W., ZHANG, C.G., QU, H.Y., YANG, H.H., XU, J.G. Novel fluorescent silica nanoparticle probe for ultrasensitive immunoassays. Anal. Chim. Acta. v. 503, p. 163–169, 2004;
ZHANG, C.X., ZHANG, Y., WANG, X., TANG, Z.M., LU, Z.H. Hyper-Rayleigh scattering of protein-modified gold nanoparticles. Anal. Biochem. v. 320, p. 136–140, 2003;
APÊNDICE I
