UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE …‡ÃO... · Aos meus amigos do Grupo de Oração Sementes de Paz (em especial: Ivo e Irone, Paulo e Regi e Otávio Neto) por toda

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ALAN DIEGO DA CONCEIÇÃO SANTOS

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS POR HPLC-DAD-

ELSD PARA CONTROLE DE QUALIDADE QUÍMICO DO LÁTEX DO

CAULE E DO FRUTO DE MANGABA (Hancornia speciosa GOMES)

São Cristóvão – Sergipe

FEVEREIRO/2012

ALAN DIEGO DA CONCEIÇÃO SANTOS

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODOS POR HPLC-DAD-

ELSD PARA CONTROLE DE QUALIDADE QUÍMICO DO LÁTEX DO

CAULE E DO FRUTO DE MANGABA (Hancornia speciosa GOMES)

Orientador: Prof. Dr. Paulo Cesar de Lima Nogueira

Co-orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes

São Cristóvão – Sergipe

2012

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Química da

Universidade Federal de Sergipe como

parte dos requisitos para obtenção do

título de Mestre em Química.

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

S237d

Santos, Alan Diego da Conceição Desenvolvimento e validação de métodos por HPLC-DAD-

ELSD para controle de qualidade químico do látex do caule e do fruto de mangaba (Hancornia speciosa Gomes) / Alan Diego da Conceição Santos ; orientador Paulo Cesar de Lima Nogueira. – São Cristóvão, 2012.

152 f. : il.

Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2012.

1. Química vegetal. 2. Mangaba. 3. Látex. 4. Análise cromatográfica. I. Nogueira, Paulo Cesar de Lima, orient. II. Título.

CDU 547.9:581.192:582.923.5

Com amor e gratidão dedico este trabalho aos

meus pais, Juciara e Azequias, por

consumirem suas vidas em virtude do meu

crescimento e bem estar...

Agradecimentos especiais

A Jesus Sacramentado por todo amor misericordioso e amizade. Sem sua presença

silenciosa nada disso seria possível!

Aos meus pais, Juciara e Azequias, por todo amor incondicional e por me

ensinarem que a vida é um presente de valor inestimável do criador. Aos meus irmãos Wesley

e Taciara por construírem parte do que eu sou.

A minha namorada, Vanessa Ávila, por aceitar dividir comigo o lado árduo da

vida acadêmica. Obrigado pelo companheirismo, pela compreensão, pela paciência com

minha ausência e pensamentos distantes...

Aos meus avós, tios (as), primos (as), padrinhos e madrinhas por todo o incentivo

acompanhado de mimos inestimáveis. Vocês são lugar de repouso.

Aos meus amigos do Grupo de Oração Sementes de Paz (em especial: Ivo e Irone,

Paulo e Regi e Otávio Neto) por toda a acolhida, ensinamentos e oração. Vocês são prova que

o “ser irmão” vai além dos laços sanguíneos. A minha grande amiga "acadêmica” Thalita

Bispo, por abrir os meus olhos para a beleza da pesquisa, minha incentivadora!!! Ao meu

amigo Andryel Vilanova, pela presença dissimulada!

Agradecimentos

Agradeço ao Prof. Dr. Paulo Cesar de Lima Nogueira (amante da ciência) por me

inserir nesse universo intrigante que é a pesquisa, pelos ensinamentos e confiança.

A Universidade Federal de Sergipe e ao Departamento de Química pela

oportunidade de execução deste trabalho.

A todos os professores do Departamento de Química/UFS, em especial aos

professores, Valéria Regina de Souza Moraes, Emmanoel Vilaça Costa, Samísia Maria F.

Machado e Sandro Navickiene pela contribuição na minha formação.

Aos meus “parceiros” durante o curso de mestrado, Givanilton Brito e Vilma

Menezes, pelas horas de estudo e desabafos.

A geração antiga do LABORGANICS Daniele Santos, Sandra Ribeiro e Wesley

Gomes e a Adriano Aquino, hoje doutorandos, pela amizade e incentivo.

Aos meus amigos do LABORGANICS (Aline Menezes, Charlene Souza, Eraldo,

Iara Lisboa, Jemmyson Romário, Leociley Menezes, Lívia Dutra, Marília Sampaio, Pedro

Ernesto, Susy, Thanany Brasil e Valéria Santana) e do LPPN (Darlisson Alexandria,

Givanildo, Hugo Cesar, Paloma Prata e Rafaely Lima). Agradeço a todos pela amizade, apoio,

incentivo, colaboração e momentos descontraídos. Vocês tornaram meu caminho menos

árduo!!

Ao Prof. Dr. Antonio G. Ferreira do Departamento de Química da UFSCar, pela

colaboração e aquisição dos espectros de ressonância magnética nuclear.

A CNPq pela concessão da bolsa de estudo

A FAPITEC/SE, COPES/UFS, PAIRD/UFS e PROCAD/CAPES pelo apoio

financeiro que permitiu a realização desse trabalho.

Enfim, a todos que diretamente ou indiretamente que contribuíram para a

realização deste trabalho.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS................................................................................................................I

LISTA DE TABELAS..........................................................................................................VII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS...........................................................................IX

RESUMO...............................................................................................................................XII

ABSTRACT.........................................................................................................................XIII

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................01

1.1 - Látex.................................................................................................................................05

1.2 - Controle de qualidade de amostras vegetais.....................................................................06

1.3 - Arranjo de diodos (DAD) e Espalhamento de luz (ELSD) como detectores para análise

de amostras vegetais por HPLC................................................................................................07

1.4 - Perfil cromatográfico e quantificação de marcadores químicos para controle de qualidade

de amostras vegetais..................................................................................................................10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................11

2.1 - Aspectos botânicos...........................................................................................................12

2.2 - Aspectos químicos............................................................................................................14

2.3 - Aplicações terapêuticas e aspectos farmacológicos.........................................................18

2.4 - Propriedades tecnológicas do látex de H. speciosa Gomes..............................................20

3. OBJETIVOS........................................................................................................................21

3.1 – Objetivos Gerais...............................................................................................................22

3.2 – Objetivos Específicos.......................................................................................................22

4. PARTE EXPERIMENTAL...............................................................................................23

4.1 – Materiais e equipamentos.................................................................................................24

4.2 – Limpeza do material.........................................................................................................25

4.3 – Material vegetal................................................................................................................25

4.3.1 – Obtenção do látex do caule da mangabeira.........................................................25

4.3.2 – Obtenção do látex dos frutos da mangabeira.......................................................26

4.3.3 – Polpa comercial do fruto da mangabeira.............................................................26

4.4 – Preparo das amostras do látex de H. speciosa e dos marcadores

químicos....................................................................................................................................27

4.4.1 – Látex do caule......................................................................................................27

4.4.2 – Látex dos frutos...................................................................................................27

4.4.3 – Marcadores químicos do látex dos frutos............................................................27

4.5 – Condições cromatográficas de análise.............................................................................28

4.5.1 – Método qualitativo para o látex do caule da mangabeira....................................28

4.5.2 – Método qualitativo para o látex dos frutos da mangabeira..................................28

4.6 – Validação de métodos cromatográficos analíticos...........................................................29

4.6.1 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do látex do caule de

Hancornia speciosa...................................................................................................................29

4.6.1.1 – Teste da precisão de injeção....................................................................29

4.6.1.2 – Teste da repetibilidade............................................................................29

4.6.1.3 – Estabilidade da amostra do látex do caule..............................................30

4.6.1.3.1 – Estabilidade de curta duração.....................................................30

4.6.1.3.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e

congelamento............................................................................................................................30

4.6.1.4 – Robustez..................................................................................................30

4.6.2 – Validação do método cromatográfico para a quantificação de éster diidroxilado

de lupeol em látex do fruto de H. speciosa e polpa

comercial...................................................................................................................................31

4.6.2.1 – Condições analíticas do método quantitativo..........................................31

4.6.2.2 – Preparo da solução estoque, padrões de calibração e amostras controle de

qualidade...................................................................................................................................31

4.6.2.3 – Linearidade..............................................................................................32

4.6.2.4 – Seletividade.............................................................................................32

4.6.2.5 – Limite de detecção (LD) e quantificação (LQ).......................................32

4.6.2.6 – Precisão...................................................................................................33

4.6.2.7 – Exatidão...................................................................................................33

4.6.2.8 – Robustez..................................................................................................34

4.6.2.9 – Estabilidade.............................................................................................34

4.6.2.9.1 – Estabilidade de curta duração.....................................................34

4.6.2.9.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e

congelamento............................................................................................................................34

4.7 – Isolamento dos marcadores químicos do látex do caule de H. speciosa

Gomes.......................................................................................................................................35

4.8 – Identificação dos marcadores químicos...........................................................................35

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................36

5.1 – Otimização das condições cromatográficas de análise: látex do caule de H. specisoa

Gomes.......................................................................................................................................37

5.1.1 – Primeira etapa do processo de otimização: uso do gradiente

exploratório...............................................................................................................................38

5.1.2 – Segunda etapa do processo de otimização: avaliação dos parâmetros da eluição

gradiente....................................................................................................................................42

5.1.3 – Preparo da amostra do látex do caule..................................................................45

5.2 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do látex do caule de H.

speciosa.....................................................................................................................................52

5.3 – Aplicação do método analítico desenvolvido: análise das amostras comerciais do látex

do caule de H. speciosa.............................................................................................................56


Gomes.......................................................................................................................................61

5.5 – Identificação do marcadores químicos.............................................................................66

5.5.1 – Identificação e determinação estrutural HSG 2...................................................66



5.6 – Otimização das condições cromatográficas de análise: látex dos frutos de H.

speciosa.....................................................................................................................................89

5.7 – Validação do método cromatográfico para quantificação do marcador químico éster

diidroxilado 3-β-O-acil lupeol................................................................................................100

5.7.1 – Seletividade.......................................................................................................101

5.7.2 – Linearidade .......................................................................................................103

5.7.3 – Limite de detecção e limite de quantificação....................................................105

5.7.4 – Precisão e exatidão............................................................................................105

5.7.5 – Estabilidade ......................................................................................................107

5.7.6 – Robustez ...........................................................................................................108

5.8 – Aplicação do método.....................................................................................................108

6. CONCLUSÃO...................................................................................................................111

7. REFERÊNCIAS................................................................................................................114

I

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Foto de um espécime (1) e do fruto (2) de Hancornia speciosa Gomes..................13

Figura 2: Extração do látex do caule Harcornia speciosa Gomes...........................................26

Figura 3: Cromatogramas para a seleção de condições para o método em HPLC-DAD. Os

números correspondem às condições apresentadas na Tabela

1.................................................................................................................................................41

Figura 4: Cromatogramas (λ = 220 nm) para a seleção de condições para o método em

HPLC-DAD. Os números correspondem às condições apresentadas na Tabela

2.................................................................................................................................................44

Figura 5: Cromatogramas para a seleção do modo de preparo do látex do caule de H.

speciosa para análise em HPLC-DAD: (preto) látex tratado com ácido acético e secado em

centrifugador; (vermelho) látex sem ácido acético e secado em centrifugador e (azul) látex

secado em liofilizador. Os cromatogramas foram obtidos utilizando a condição 11 descrita na

Tabela 2....................................................................................................................................46

Figura 6: Perfil Cromatográfico do látex do caule de H. speciosa obtido com a eluição

gradiente: 5-50% H2O (A): ACN (B) em 50 min; vazão: 1,0 mL/min; λ= 220nm; Vinj = 20 µL;

coluna analítica Phenomenex LUNA®

5μm C18 (250 x 4,6 mm) adaptada a uma coluna guarda

C18 (4 x 3,0 mm, Phenomenex)...............................................................................................48

Figura 7: Espectros de absorção UV das bandas cromatográficas assinaladas na Figura 6

(apresentados de 1 a 7)..............................................................................................................49

Figura 8: Projeção tridimensional obtido por HPLC-DAD da amostra do látex do caule da H.

speciosa.....................................................................................................................................50

II

Figura 9: Perfil cromatográfico do látex do caule da H. speciosa por HPLC-ELSD obtido

com a eluição gradiente: 5-50% H2O (A): ACN (B) em 50 min; vazão: 1,0 mL/min; ELSD:

temperatura do tubo mantido em 70˚C e fluxo de N2 pressurizado em 353 KPa; Vinj = 20 µL;

coluna analítica Phenomenex LUNA®

5μm C18 (250 x 4,6 mm) adaptada a uma coluna guarda

C18 (4 x 3,0 mm, Phenomenex)...............................................................................................51

Figura 10: Perfil cromatográfico comparativo do látex do caule de H. speciosa por HPLC-

DAD-ELSD. (Preto) Cromatograma monitorado pelo DAD e (Vermelho) cromatograma

monitorado pelo ELSD.............................................................................................................52

Figura 11: Cromatogramas sobrepostos (n = 6) de amostras de látex do caule de H. speciosa

monitorados pelo DAD (220 nm). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido

em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU

(látex adquirido em Umbaúba).................................................................................................57


monitorados pelo ELSD. LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em

Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex

adquirido em Umbaúba)............................................................................................................58

Figura 13: Cromatogramas fingerprint das amostras de látex do caule de H. speciosa (HPLC-

DAD). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex

obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em

Umbaúba). Obs.: * Picos presentes em todas as amostras do látex do caule............................59

Figura 14: Cromatogramas fingerprint das amostras de látex do caule de H. speciosa (HPLC-

ELSD). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex

obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em

Umbaúba). Obs.: * Picos presentes em todas as amostras do látex do caule.......................................60

Figura 15: Cromatograma (λ = 220 nm) do látex do caule de H. speciosa em sistema semi-

preparativo. Condições cromatográficas: item 4.7. Os picos coletados estão indicados no

cromatograma............................................................................................................................62

Figura 16: Perfil cromatográfico do látex do caule de H. speciosa acompanhado dos

compostos isolados em escala analítica (λ = 220 nm)..............................................................63

III

Figura 17: Cromatogramas (λ = 220 nm) das bandas cromatográficas HSG 2, HSG 3, HSG 4

e HSG5 purificadas no sistema semi-preparativo, com seus respectivos espectros de absorção

UV no tempo de retenção em que eluem. Condições de análise: item 4.5.1............................64

Figura 18: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.........................66

Figura 19: Ampliação da região entre 6,98-7,06 ppm do espectro de RMN de 1H (400 MHz,

CD3OD) da amostra HSG 2......................................................................................................67






CD3OD) da amostra HSG 2. ....................................................................................................68

Figura 23: Ampliação da região entre 2,012-2,080 ppm do espectro de RMN de 1H (400

MHz, CD3OD) da amostra HSG 2. ..........................................................................................69

Figura 24: Espectro de RMN de 13

C (100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2........................69

Figura 25: Mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz, CD3OD) da amostra

HSG 2........................................................................................................................................70

Figura 26: Ampliações do mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz,


Figura 27: Mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz,


HSG 2........................................................................................................................................72

Figura 28: Ampliações do mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz,


Figura 29: Estrutura química do ciclohexiletanóide glicosilado cornosídeo (HSG 2)............73


IV







Figura 34: Mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,


HSG 3........................................................................................................................................80

Figura 35: Estrutura química do ciclohexiletanóide glicosilado dihidrocornosídeo (HSG

3)...............................................................................................................................................80










Figura 41: Ampliação da região entre 56,0 e 87,0 ppm do espectro de RMN de 13

C (100

MHz, CD3OD) da amostra HSG 6............................................................................................85

Figura 42: Mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz,


HSG 6........................................................................................................................................86


13C: 100 MHz,


Figura 44: Mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,


HSG 6........................................................................................................................................87

V

Figura 45: Ampliações do mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz,


Figura 46: Estrutura química da (7,8)-treo-4,7,9,9’-tetrahidroxi-3,3’-dimetoxi- 8-O-4’-

neolignana-7-O-β-D-glicopiranosídeo (HSG 6).......................................................................89

Figura 47: Cromatograma obtido a partir das seguintes condições: coluna Microsorb MV100-

5C18, modo isocrático 100% de ACN por 30 min em um fluxo de 0,8 mL/min, volume de

injeção 20µL.............................................................................................................................90

Figura 48: Cromatogramas (λ = 200 nm) obtidos a partir das seguintes condições: coluna

Microsorb MV100-5C18, fluxo de 0.8 mL/min, volume de injeção 20µL: (Análise 1) modo

isocrático 85% de ACN:H2O, (Análise 2) modo isocrático 80% de ACN:H2O ambos por 30

min............................................................................................................................................92


hexil-fenil LUNA, fluxo de 0.8mL/min, volume de injeção 20µL: (Análise 3) modo isocrático

100% de ACN:H2O, (Análise 4) modo isocrático 90% de ACN:H2O ambos por 30

min............................................................................................................................................93


hexil-fenil LUNA®, modo isocrático 90% de ACN:H2O, fluxo de 0,8 mL/min, volume de

injeção 20µL: (A) lupeol; (B) mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol; (C) éster diidroxilado 3-

β-O-acil lupeol e (D) extrato diclorometano do látex dos frutos de H.

speciosa.....................................................................................................................................94

Figura 51: Cromatogramas (λ = 200 nm) para a seleção de condições para análise do látex

dos frutos de H. speciosa Gomes em HPLC-DAD obtidos a partir das condições de análise (5-

7) descritas na Tabela 11...........................................................................................................95

Figura 52: Projeção tridimensional obtido por HPLC-DAD da amostra do látex dos frutos de

H. speciosa................................................................................................................................96

Figura 53: (A) Perfis cromatográficos monitorado com o DAD (200nm): extrato

diclorometano do látex dos frutos (preto); marcadores químicos: éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol (vermelho), mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol (azul), e lupeol (magenta); (B) Perfil

VI

cromatográfico do látex dos frutos de H. speciosa monitorado pelo DAD (preto) e pelo ELSD

(vermelho).................................................................................................................................97

Figura 54: (A) Cromatogramas obtidos por DAD (200 nm): extrato diclorometano do látex

dos frutos (preto), látex dos frutos liofilizado (vermelho) e polpa comercial (azul); (B)

Cromatogramas obtidos por ELSD: extrato diclorometano do látex dos frutos (magenta), látex

dos frutos liofilizado (verde) e polpa comercial (azul).............................................................98

Figura 55: Estrutura química do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol...................................100

Figura 56: Cromatograma típico: polpa da mangaba (vermelho), éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol (azul) e polpa da mangaba fortificada (preto); (A) obtido pelo DAD; (B) obtido pelo

ELSD. As condições experimentais para obtenção desses cromatogramas são descritos no

item 4.6.2.1..............................................................................................................................102

Figura 57: Curvas analíticas obtidas para a quantificação de éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol pelo DAD: padronização externa (A) e padronização por adição de padrão (B); e pelo

ELSD: padronização externa (C)............................................................................................104

Figura 58: Cromatograma representativo da polpa comercial de mangaba, obtido pelo DAD

(vermelho) e pelo ELSD (preto). Picos selecionados para quantificação: (1) éster diidroxilado

3-β-O-acil lupeol e (2-4) mistura de ésteres de lupeol............................................................109

VII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Condições cromatográficas avaliadas na primeira etapa da otimização do método

para análise do látex do caule de H. speciosa, com detecção em 220 nm................................40

Tabela 2: Condições cromatográficas avaliadas na segunda etapa da otimização do método

para análise do látex do caule de H. speciosa, com detecção em 220 nm................................43

Tabela 3: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e altura das

bandas cromatográficas avaliadas nas análises da amostra do látex do caule de H. speciosa

(precisão de injeção).................................................................................................................53


bandas cromatográficas avaliadas nas análises de amostra de H. speciosa

(repetibilidade)..........................................................................................................................53


bandas cromatográficas avaliadas nas análises de amostra de H. speciosa Gomes

(estabilidade).............................................................................................................................54


bandas cromatográficas avaliadas nas análises de amostra de H. speciosa

(robustez)..................................................................................................................................55

Tabela 7: Valores de massa e de rendimento obtido no isolamento dos marcadores

químicos....................................................................................................................................62

Tabela 8: Dados de RMN de 1H (400 MHz) e de

13C (100 MHz) em CD3OD da HSG-2

(cornosídeo) em comparação com dados da literatura..............................................................74



(dihidrocornosídeo) em comparação com dados da literatura..................................................79


13C (100 MHz) em CD3OD da HSG 6 em

comparação com dados da literatura.........................................................................................82

Tabela 11: Condições cromatográficas avaliadas na otimização do método para análise do

látex dos frutos da H. speciosa, com detecção em 220 nm, volume de injeção de 20 µL e

vazão de 0,8 mL/min.................................................................................................................91

VIII

Tabela 12: Parâmetros de linearidade usando as soluções padrões.......................................105

Tabela 13: Dados do estudo de precisão, intra- e inter-dias, do método para quantificação de

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol........................................................................................106

Tabela 14: Dados do estudo de exatidão, intra- e inter-dias, do método para quantificação de

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol........................................................................................107

Tabela 15: Teor de éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol de polpa e látex liofilizado utilizando

DAD e ELSD..........................................................................................................................109

Tabela 16: Teor dos ésteres de lupeol (indicados na figura 11) em polpa comercial de

mangaba por HPLC-DAD-ELSD...........................................................................................110

IX

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1D Unidimensional

2D Bidimensional

ACE Angiotensin Converting Enzyme (Enzima Conversora de Angiotensina)

ACN Acetonitrila

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

C18 Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octadecil

C8 Fase sólida à base de sílica modificada com grupos octil

CQA Controle de Qualidade de Alta Concentração

CQB Controle de Qualidade de Baixa Concentração

CQM Controle de Qualidade de Média Concentração

d Dupleto

DAD Diode array detector (Detector de arranjo de diodos)

dd Dupleto duplo

ddd Duplo dupleto duplo

DPR Desvio padrão relativo

ELSD Evaporative light scattering detector (Detector evaporativo por espalhamento de luz)

F Fluxo

UFSCar Universidade Federal de São Carlos

GC Gas Chromatography (Cromatografia em fase gasosa)

HCOOH Ácido fórmico

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência)

HPLC-DAD-ELSD High Performance Liquid Chromatography coupled with diode array

detection and evaporative light scattering detector (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

com detectores de arranjo de diodos e evaporativo por espalhamento de luz)

X

HSQC Heteronuclear single quantum coherence

Hz Hertz

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

J Constante de acoplamento escalar

LA Comprimento da coluna analítica

LABORGANICS Laboratório de Pesquisa em Química Orgânica de Sergipe

LCA Látex do caule de Aracaju

LCB Látex do caule de Boquim

LCI Látex do caule de Itabaiana

LCP Látex do caule de Pontal

LCU Látex do caule de Umbaúba

LD Limite de Detecção

LP Comprimento da coluna semi-preparativa

LQ Limite de Quantificação

m Mutipleto

MeOH Metanol

MHz Mega Hertz

NO Óxido nítrico

OMS Organização Mundial da Saúde

PF Porcentagem final

PI Porcentagem inicial

ppm Partes por milhão

q Quadrupleto

quintl Quintupleto largo

RA Diâmetro da coluna analítica

RMN 13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

XI

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RP Diâmetro da coluna semi-preparativa

S Fator de escalonamento

s Simpleto

t Tripleto

THF Tetrahidrofurano

tl Tripleto largo

TPA Tissue Plasminogen Activator (Ativador de Plasminogênio)

tR Tempo de retenção

UFS Universidade Federal de Sergipe

UV Ultravioleta

Vinj. Volume de injeção

WHA World Health Assembly (Assembleia Mundial da Saúde)

δ Deslocamento Químico

λ Comprimento de onda

XII

RESUMO

O presente trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de métodos analíticos para o

controle de qualidade do látex do fruto e do caule de H. speciosa Gomes utilizando

cromatografia líquida de alta eficiência com os detectores de arranjo de diodos e evaporativo

por espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD). No primeiro momento, um método analítico

para a obtenção do perfil cromatográfico foi desenvolvido e validado para a análise de uma

amostra autêntica do látex do caule de H. speciosa; em seguida foi utilizado o método

otimizado para a análise de amostras do látex do caule comercializadas em feiras livres do

Estado de Sergipe. A comparação visual dos perfis cromatográficos das diferentes amostras

do látex do caule permitiu averiguar a autenticidade e as dissimilaridades dos perfis químicos

dessas amostras. Utilizando uma coluna semi-preparativa, sete marcadores químicos foram

purificados a partir do látex do caule de H. speciosa; a caracterização por RMN 1H,

13C

possibilitou a identificação das seguintes substâncias: ciclohexiletanóide glicosilado

cornosídeo, ciclohexiletanóide glicosilado dihidrocornosídeo e (7,8)-treo-4,7,9,9’-

tetrahidroxi-3,3’-dimetoxi- 8-O-4’-neolignana-7-O-β-D-glicopiranosídeo. No segundo

momento, um método cromatográfico para análise qualitativa dos marcadores químicos

lupeol, α-amirina, β-amirina e ésteres 3- β-O-acil lupeol no látex dos frutos de H. speciosa e

em polpa comercial de mangaba foi desenvolvido. Por fim, um método analítico para a

quantificação do teor de ésteres de lupeol em látex dos frutos de H. speciosa e em polpa

comercial foi desenvolvido e validado utilizando HPLC-DAD-ELSD. No estudo da validação

foram avaliadas as figuras de mérito seletividade, linearidade, limite de quantificação e

detecção, precisão, exatidão, estabilidade e robustez conforme as normas descritas na RE nº

899/03 (ANVISA). A quantificação do teor de ésteres de lupeol por ambos os detectores se

mostraram significativamente similares (259,44 µg/mg para o DAD e 269,58 µg/mg para o

ELSD) com coeficiente de variação de 2,7 %. Este trabalho apresenta uma contribuição ao

controle de qualidade de amostras de H. speciosa.

Palavras-chave: Hancornia speciosa Gomes, látex, perfil cromatográfico, marcadores

químicos, quantificação, HPLC-DAD-ELSD, mangaba.

XIII

ABSTRACT

This work describes the development and application of analytical methods to establish

parameters to the quality control of fruit and trunk latex of H. speciosa using High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) with diode array detect and evaporative light

scattering detector (ELSD). As a first step chromatographic profile analytical method was

developed and validated for the analysis of authentic sample of trunk latex of H. speciosa, and

then the optimized method was used for the analysis of commercial samples of trunk latex

sold in open markets from Sergipe, Brazil. The visual comparison of the chromatographic

profiles of different samples of trunk latex allowed checking the authenticity and

dissimilarities of chemical profiles of these samples. Seven chemical markers were purified

by semi-preparative HPLC-DAD from the trunk latex of H. speciosa, the characterization by

1H,

13C NMR allowed the identification of the following substances cyclohexylethanoid

glucoside cornoside, cyclohexylethanoid glucoside dihydrocornoside and (7,8)-treo-4,7,9,9’-

tetrahydroxy-3,3’-dimethoxy-8-O-4’-neolignan-7-O-β-D-glucopyranoside. As a second step

of our work chromatographic method for qualitative analysis of chemical markers lupeol, α-

amyrin, β-amyrin e 3- β-O-acyl lupeol esters in the fruit latex of H. speciosa and in the

mangaba commercial pulp was developed, the optimized method showed itself appropriate to

the identification of such substances with adequate separation. In the end one analytical

method for the quantification of the lupeol ester content in fruit latex and commercial pulp

was developed and validated using the HPLC-DAD-ELSD. In the validation study were

evaluated the figures of merit selectivity, linearity, limit of quantification and detection,

precision, accuracy, stability and robustness according to the standards described in RE nº

899/03 (ANVISA). The quantification of lupeol ester by both detectors was significantly

similar (259.44 µg/mg DAD and 269.58 µg/mg ELSD) with one coefficient of variation of

2.7%. This paper presents a contribution to the quality control of H. speciosa samples.

Keywords: Hancornia speciosa Gomes, latex, chromatographic profile, chemical markers,

quantification, HPLC-DAD-ELSD, mangaba.

1

Introdução

2

1 – INTRODUÇÃO

O consumo mundial de frutas tem aumentado em decorrência das evidências

científicas sobre os seus efeitos benéficos para a saúde humana. [1-3]

Juntamente com

outras partes dos vegetais, as frutas são uma excelente fonte de nutrientes vitais e de

compostos que são biologicamente ativos, tais como aqueles que são capazes de agir

como antioxidante celular ou como agente anti-inflamatório.[3-6]

Dentro desse contexto,

as plantas em geral podem ser consideradas um laboratório biossintético não só ao que

se refere aos compostos químicos utilizados como alimentos pelos seres humanos e

pelos animais, mas também no que se refere a uma infinidade de compostos que

exercem os mais diversos efeitos fisiológicos.[7,8]

Os compostos bioativos que não estão relacionados às funções básicas das

plantas são chamados de metabólitos secundários, os quais ocorrem com fantástica

variedade e complexidade e são biossintetizadas como mecanismo de defesa dos

vegetais às condições ambientes.[8,9]

Alguns metabólitos secundários são responsáveis pelos efeitos benéficos e

toxicológicos encontrados em plantas medicinais. Portanto, o uso seguro destas espécies

requer estudos que avaliem os seus aspectos químicos, farmacológico e toxicológico. [10]

A utilização da maioria das plantas medicinais cultivadas em nosso país está

fundamentada somente no seu uso popular sem nenhuma comprovação pré-clínica nem

clínica.[11]

As razões para falta de pesquisa nesta área são, em parte, pela escassez de

políticas de saúde pública, mas também pela ausência de metodologias de pesquisas

adequadas ou aceitas para a avaliação do uso da medicina tradicional. Mediante a

importância do tema, um processo coordenado de todos os atores (fitoquímicos,

químicos sintéticos, farmacólogos, farmacêuticos, médicos etc.) precisa ser realizado a

fim de descobrir metodologias efetivas para o controle de qualidade. [12,13]

3

Entre as metodologias disponíveis para o controle de qualidade de amostras

vegetais, o uso de perfis cromatográficos (fingerprint) tem ganhado bastante atenção.

Como uma ferramenta analítica, o fingerprint cromatográfico representa as

características químicas da planta. Em uma abordagem tradicional deste conceito, o

cromatograma padrão é construído a partir da relação entre os múltiplos compostos

presentes na amostra da planta. Nesse contexto, o perfil cromatográfico tem potencial

para determinar a identidade, autenticidade das plantas medicinais partindo-se do

princípio de que amostras com fingerprint similares têm propriedades similares.[14-15]

A cromatografia, com destaque para a cromatografia líquida de alta

eficiência (sigla HPLC, do inglês, high performance liquid chromatography) e

cromatografia a gás (sigla GC, do inglês, gás chromatography), é a técnica mais

utilizada na obtenção de fingerprints. Com rápida separação, o HPLC apresenta

eficiência e sensibilidade similar a GC. No entanto, sua aplicação é mais abrangente

visto que é capaz de analisar a maior parte dos compostos presentes em plantas, uma

vez que não está limitada a volatilidade ou estabilidade térmica das substâncias na

amostra.[13,16]

Normalmente, a análise química de amostras de origem vegetal é realizada

por meio da investigação qualitativa e quantitativa dos padrões de referência

(marcadores químicos). A quantificação de substâncias marcadoras em plantas

medicinais comumente apresenta os seguintes desafios: teor desconhecido das

moléculas de interesse na amostra, alta variabilidade do teor o que demanda métodos

que cubram um grande faixa e pequeno número de substâncias padrão disponível no

mercado. Faz-se necessário considerar que dificilmente os compostos quantificados

sejam, isoladamente, responsáveis pela atividade biológica ou pela eficácia terapêutica,

uma vez que plantas constituem matrizes complexas onde a sua totalidade química pode

ser considerada o “princípio ativo”.[13,17-19]

No Brasil pode ser encontrada uma grande variedade de fruteiras com

potencial para o mercado agroindustrial e que podem tornar-se uma fonte de renda para

a população local.[7]

Nesse contexto, a biodiversidade brasileira constitui um fascinante

tema de pesquisa acadêmica, visto que muitas espécies utilizadas na medicina

tradicional (entre elas as fruteiras) não têm sido devidamente estudadas quanto a suas

4

propriedades e atividades benéficas à saúde. Neste cenário, encontra-se a mangabeira

(Hancornia speciosa Gomes), uma fruteira de expressão regional e o objeto de estudo

deste trabalho.

A mangabeira é uma planta tipicamente tropical, nativa do Brasil, que

possui grande potencial para exploração econômica. O mercado para esta fruta

encontra-se, principalmente, nas regiões Norte e Nordeste do Brasil. Em Sergipe, a

mangaba é uma das frutas mais abundantes e procuradas nas feiras livres, atingindo um

preço superior ao da uva e de outras frutas nobres. Além do consumo in natura, o maior

aproveitamento da mangaba se dá na forma de sucos, doces e sorvetes, sendo esse

processamento feito, na maioria das vezes, por pequenas empresas produtoras de

sorvete da região Nordeste. Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e

Estatística (IBGE) referentes ao ano de 2009 o valor da produção sergipana da

mangaba, que corresponde a 55,3% da produção nacional, foi de R$ 705 mil, quase

65% do R$ 1,09 milhão produzidos nacionalmente pela extração do fruto.[20-22]

A mangabeira, como outras espécies pertencentes à família Apocynaceae é

produtora de látex. Quimicamente, o látex em geral é uma mistura complexa de

proteínas, carboidratos, óleo, metabólitos secundários e borracha tendo a função de

proteger a planta contra herbivoria, microorganismos e também selar ferimentos. Na H.

speciosa, o látex pode ser encontrado em diversas partes principalmente no tronco e nos

frutos. Apesar de seu potencial comercial devido algumas propriedades similares ao

látex da seringueira (Hevea brasiliensis), o látex da mangabeira encontra maior

utilização na medicina popular contra tuberculose, úlcera, fungos e certos tipos de

inflamações.[23-27]

Uma das principais preocupações dos produtores de frutas da região

Nordeste do Brasil é a agregação de valor às fruteiras regionais, as quais são geralmente

produzidas em regime extrativista. Dessa forma, o conhecimento químico da H.

speciosa e seu emprego como insumo para as indústrias farmacêutica, de alimentos e/ou

cosméticos poderia ser uma alternativa para agregar valor ao fruto, melhorar a renda dos

produtores da região e contribuir para diminuição da devastação desta espécie.

5

1.1 – Látex

O látex ocorre no reino das plantas em mais de 12.000 espécies pertencentes

a 900 gêneros.[28]

As estruturas vegetais denominadas de laticíferos são responsáveis

pela produção do “leite vegetal” podendo ser localizados em todos os tecidos epiteliais

da planta, sendo a ocorrência mais frequente na casca do tronco. Quando seccionados,

os vegetais laticíferos deixam fluir o látex, que coagula e veda o corte feito na planta

por reações enzimáticas.[ 29,30]

Do ponto de vista funcional, não há conhecimento de

qualquer influência do látex no metabolismo primário, por outro lado, sua função tem

sido frequentemente relacionada a defesa contra herbívoros.[31]

De forma geral, o látex natural apresenta-se com um sistema bifásico, no

qual a fase polimérica está na forma de emulsão. O látex é normalmente composto por

uma complexa mistura de diferentes componentes, incluindo macromoléculas. O

poliisopreno está presente em todas as espécies laticíferas e é um dos componentes

majoritários podendo ser encontrado na forma cis e/ou trans. Outros constituintes

presentes em látex e relatados em estudos fitoquímicos são: polissacarídeos,

flavonóides, lipídeos, fosfolipídios, proteínas, alcanos, triterpenóides, alcalóides,

taninos.[29,30,32]

Alguns destes compostos fornecem resistência contra herbívoros por

meio de efeitos antinutritivos e tóxicos, enquanto que outros estão envolvidos na

viscosidade que podem capturar diferentes insetos. Em geral os compostos encontrados

no látex estão diretamente relacionados com o metabolismo, defesa e interações

ecológicas das plantas.[32]

No contexto humano, o látex pode ser ingerido a partir do consumo das

frutas frescas (e seus derivados) ou como bebida.[33]

A ingestão de látex deve ser bem

avaliada, uma vez que propriedades corrosivas e queratolíticas são conhecidas nesse

tipo de matriz.[31-32]

Por outro lado, o reconhecimento do efeito benéfico das substâncias

presentes em látex na saúde humana tem sido relatado.[34-36]

Nesse sentido, a caracterização química de látices de diferentes espécies

vegetais tem sido realizada permitindo o conhecimento de diferentes substâncias que

por sua vez viabiliza o entendimento da funcionalidade do látex para plantas, bem como

assegura o emprego do mesmo na medicina popular. A cromatografia líquida de alta

6

eficiência é uma das técnicas empregadas para o isolamento e identificação de

compostos nesse tipo de matriz.[37-39]

1.2 – Controle de qualidade de amostras vegetais

A Organização Mundial da Saúde (OMS) através das resoluções WHA

31.33 (1978) e 40.33 (1987) afirmou a importância do uso de plantas medicinais nos

cuidados da saúde e a necessidade da criação de programas globais para a identificação,

validação, preparação, cultivo e conservação das plantas medicinais utilizadas na

medicina tradicional, bem como certificar o controle de qualidade delas.[40]

Assegurar a qualidade do material vegetal é um dos fatores que contribui

para o uso eficaz e seguro do produto. A eficácia é dada pela comprovação, por meio de

ensaios farmacológicos pré-clínicos e clínicos, dos efeitos biológicos preconizados para

esses recursos terapêuticos, e a segurança é determinada pelos ensaios que comprovam

a ausência de efeitos tóxicos. [40-41]

A avaliação da qualidade dos produtos de origem

vegetal pode ser feita através de procedimentos de análises químicas, físicas, físico-

químicas e microbiológicas.[42]

O controle de qualidade químico de plantas torna-se uma tarefa difícil

devido a variabilidade e a complexidade dos compostos presente nos vegetais. Em

muitos casos os princípios ativos não estão suficientemente estabelecidos ou ainda a

atividade biológica é atribuída aos efeitos sinérgicos das substâncias. Esses fatores

tornam as metodologias para o controle de qualidade laboriosas e limitadas.[13,43]

Convencionalmente, um dos primeiros e imprescindíveis passos para o

controle de qualidade é a verificação da autenticidade da matéria-prima vegetal, que

pode ser feita através da identificação botânica (análise macro e microscópica) e através

de métodos químicos, baseados na presença de substâncias que, preferencialmente,

possuam relação com a atividade terapêutica e/ou com a identificação das espécies, os

chamados marcadores químicos e/ou quimiotaxonômicos.[17]

7

Marcadores químicos são substâncias de referência que podem ser

considerados a base para estabelecer a qualidade de medidas analíticas e,

consequentemente, do material vegetal. Qualquer substância química com estrutura

conhecida pode ser usada como um padrão para teste de identidade (análise

qualitativa).[44]

Com o avanço das técnicas cromatográficas, os métodos químicos clássicos

de caracterização baseados na presença de grupos funcionais têm caído em desuso, uma

vez que são pouco sensíveis e inespecíficos. Paralelo a esse fato, a cromatografia líquida

de alta eficiência tem possibilitado a caracterização de amostras vegetais a partir de

análises qualitativas de padrões conhecidos na matriz e do isolamento em escala semi

ou preparativa de substâncias, de forma rápida, eficaz e economicamente viável.[45-47]

1.3 – Arranjo de diodos (DAD) e Evaporativo por

espalhamento de luz (ELSD) como detectores para análise de amostras

vegetais por HPLC

Para a detecção dos compostos presente em extratos brutos de planta,

eficientes métodos de separação são requeridos. Nesse sentido, a cromatografia líquida

de alta eficiência tem sido reconhecida como a mais versátil técnica, dispensando, em

muitos casos, métodos complexos de preparação da amostra. O HPLC tem se

desenvolvido ao longo dos anos em termos de conveniência, velocidade, opções de fase

estacionária, alta sensibilidade, aplicabilidade e habilidade para hifenação com

detectores espectrométricos e espectroscópicos.[48]

A diversidade estrutural das substâncias presentes nos produtos naturais

resulta na alta variabilidade das propriedades físico-químicas destes compostos, o que

torna a detecção universal um desafio. Nenhum dos detectores disponíveis para o HPLC

é capaz de detectar todas as substâncias, em um dado extrato, dentro de uma única

análise. Nesse contexto, a escolha apropriada do detector é de grande relevância e

conduz para a obtenção dos dados químicos apropriados, tendo em vista a classe de

metabólitos secundários que será analisada.[17,48]

8

Na tentativa de se ter uma visão mais ampla da composição química das

plantas, métodos cromatográficos têm sido desenvolvidos com o uso de diferentes

detectores o que possibilita a determinação simultânea de compostos com propriedades

diferentes. Por exemplo, o detector de arranjo de diodos (DAD – do inglês, diode array

detector) juntamente com o detector evaporativo por espalhamento de luz (ELSD – do

inglês, evaporative light scattering detector) podem ser empregados para determinar

simultaneamente compostos que apresentam pouca ou nenhum absorção na região do

ultravioleta (UV).[16,49-51]

Entre os detectores utilizados no HPLC o mais simples e largamente

empregado é o UV. Três tipos de detectores de UV estão disponíveis: os fotômetros de

comprimento de onda fixo, os espectrofotômetros e os detectores por arranjo de

fotodiodos. O detector de comprimento de onda fixo é o mais barato e apresenta alta

sensibilidade visto que a luz é emitida em um específico comprimento de onda através

de uma dada lâmpada. No entanto, o detector de múltiplos comprimentos de onda é

mais versátil, através da escolha de um comprimento de onda adequado para o analito, a

baixa sensibilidade do mesmo pode ser compensada. Já o detector de arranjo de diodos

oferece completo espectro de UV o que permite verificar a pureza dos picos resultantes

da separação.[48,52]

Embora tenha algumas limitações, particularmente para compostos que não

possuem grupos cromóforos, a detecção por UV possui a melhor combinação de

sensibilidade, linearidade, versatilidade e confiabilidade. A maior parte dos compostos

encontrados em plantas absorve no UV (200-400) devido à presença de substâncias com

uma ou mais ligações duplas ou elétrons desemparelhados. Esse fato torna o DAD o

detector espectrofotométrico mais frequentemente usado para análise de vegetais. [48,52]

O ELSD é considerado um detector quasi-universal, com ele pode ser

detectado qualquer analito menos volátil que a fase móvel, independente de qualquer

outro tipo de propriedade (ótica, eletroquímica etc.). Uma vantagem particular desse

tipo de detecção é a possibilidade de se usar a eluição no modo isocrático ou gradiente.

Estima-se que 1,5 % dos trabalhos que envolvem o HPLC na análise de produtos

naturais empregam o detector evaporativo por espalhamento de luz.[48,52]

9

O detector evaporativo por espalhamento de luz tem como princípio a

nebulização da fase móvel com um gás inerte e evaporação do solvente para produzir

pequenas partículas que serão detectadas em uma cela de espalhamento de luz. A

intensidade da luz espalhada depende do tamanho, da forma e das propriedades

superficiais das partículas formadas durante o processo de nebulização. Os principais

parâmetros que afetam a resposta do ELSD são o fluxo do gás nebulizador e a

temperatura utilizada no tubo.[48]

Diferente do DAD, a resposta gerada pelo ELSD depende da massa do

analito, ou seja, não tem nenhuma relação com as propriedades espectrais ou físico-

químicas da substância de interesse. Em teoria, isso significa que o ELSD gera uma

resposta similar para quantidades iguais de massa gerando assim um fator de resposta

universal. Contudo, a resposta do ELSD depende também da volatilidade do composto e

da composição da fase móvel o que faz com que tais procedimentos de quantificação

sejam experimentalmente inacessíveis. A soma desses fatores leva a uma resposta não

linear do ELSD, em outras palavras, a relação entre a concentração do analito e o sinal

produzido pelo detector de espalhamento de luz não obedece a Lei de Beer, mas sim

uma equação exponencial, I = kmb, onde I é a intensidade da luz, m a massa da partícula

espalhada, k e b são constantes determinadas principalmente pela natureza da fase

móvel e parâmetros do detector. Para facilitar o uso do detector, a equação torna-se

linear na forma logarítmica: log I = log k + b x log m.[48,53-55]

Várias são as aplicações, incluindo a determinação de resinas, polímeros,

polietilenoglicóis, carboidratos, lipídios, triglicerídeos, fosfolipídeos, esteróides,

adoçantes, aditivos de petróleo, agentes surfactantes, entre outras com o uso deste.[56]

10

1.4 – Perfil Cromatográfico e Quantificação de marcadores

químicos para controle de qualidade de amostras vegetais

As abordagens qualitativas (perfis cromatográficos) e quantitativas

(quantificação de marcadores químicos) têm sido utilizadas para estabelecer parâmetros

de autenticidade e qualidade de amostras vegetais.[17,57,58]

Os perfis cromatográficos (ou fingerprints) possibilitam a formação de um

padrão de reconhecimento específico dos múltiplos compostos presentes na amostra,

permitindo o reconhecimento de semelhanças e diferenças entre extratos submetidos às

mesmas condições de análise. Dessa forma, a qualidade química é avaliada baseada na

complexidade característica das plantas, uma vez que considera a ausência e presença

de marcadores químicos e a proporcionalidade existente entre os analitos detectados. O

conceito de fingerprint tem sido empregado em diferentes aplicações: (1) determinação

de autenticidade e identificação de espécies, (2) avaliação da qualidade química e da

fitoequivalência, (3) análise de estabilidade entre diferentes extratos, (4) análise de

consistência (variação lote-a-lote) de matérias-primas e de fitoterápicos e (5) estudos de

variabilidade sazonal e acompanhamento de cultivares.[15-17]

Embora a quantificação de marcadores químicos não seja suficiente para

assegurar a qualidade de uma amostra vegetal devido à presença metabólitos

secundários comuns a diferentes espécies, esta abordagem é bastante utilizada pela

pesquisa acadêmica e pela indústria.[17]

Na literatura, estão disponíveis diversos

exemplos de métodos cromatográficos por HPLC para a quantificação de substâncias de

referência em amostras vegetais.[59-61]

Nesse contexto, o presente trabalho apresenta o desenvolvimento, validação

e aplicação de métodos analíticos para estabelecer parâmetros para o controle de

qualidade do látex do fruto e do caule de H. speciosa Gomes utilizando cromatografia

líquida de alta eficiência com os detectores de arranjo de diodos e evaporativo por

espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD).

11

Revisão

Bibliográfica

12

2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 – Aspectos botânicos

Apocynaceae é uma das maiores e mais representativas famílias de

Angiospermas, contendo em seus limites cerca de 400-480 gêneros e 4.300-4.800

espécies com variados hábitos, como árvores, arbustos, subarbustos, lianas e ervas.

Dentre estas espécies algumas se destacam pelo grande potencial econômico (como por

exemplo, a Funtumia elastica Stapf. usada para produção de borracha); outras

apresentam grande importância medicinal (a citar: Catharantus roseus L. e

Vincetoxicum officinale Moench); outras ainda são cultivadas como ornamentais devido

ao seu valor paisagístico, como Mandevilla Lindl. e Nerium oleander L. Além destas

existem diversas espécies como o amapazeiro (Parahancornia amapa (Huber) Ducke),

a sorva (Couma utilis (Mart.) Müll. Arg.) e a mangaba (Hancornia speciosa Gomes),

cujos frutos são comestíveis e usados na fabricação de sucos, compotas e licores.[62]

Hancornia speciosa Gomes, a mangabeira, pertence à classe Equisetopsida

C. Agardh, subclasse Magnoliidae Novák ex Takht, superordem Asteranea Takht.,

ordem Gentianales Juss. Ex Bercht. & J. Presl., família Apocynaceae Juss., subfamília

Rauvolfioideae, tribo Willughbeieae. Hancornia é um gênero de única espécie

possuindo 11 sinônimos, compreendendo duas variedades que se diferenciam por

algumas características morfológicas, principalmente da folha e da flor: H. speciosa var.

speciosa e H. speciosa var. pubescens (Nees & Mart.) Mull. Arg.[63]

A mangabeira é uma planta arbórea de porte médio, possuindo de 2 a 10 m

de altura, podendo chegar a até 15 m, dotada de copa irregular, tronco tortuoso, bastante

ramificado e áspero; ramos lisos e avermelhados, exsudando látex em toda a sua

extensão (Figura 1). A casca da árvore é escura e fendilhada. Suas folhas são elípticas

de 5 a 6 cm de comprimento e 2 cm de largura. Sua inflorescência possui de 1 a 7 flores

perfumadas e de coloração branca. O fruto é uma baga ovóide e globosa, verde

amarelada ou verde rosada. Alguns autores classificam os frutos como baga piriforme,

que apresenta na sua superfície manchas encarnadas e encerram sementes comprimidas

e de forma triangular. As sementes são do tipo recalcitrante, isto é, não suportam

ressecamento, perdendo rapidamente o poder germinativo assim que são retiradas do

fruto.[64-66]

13

(1) (2)

Figura 1: Foto de um espécime (1) e do fruto (2) de Hancornia speciosa Gomes.

Fonte: (1) NOGUEIRA, P. C. L. (2009) e (2) SANTOS, A. D. C. (2011).

Embora a mangabeira também seja produtora de látex, o fruto, denominado

“mangaba” é o seu principal produto; este nome tem origem na língua tupi-guarani e

significa “coisa boa de comer”. A mangaba apresenta ótimo sabor e aroma o que leva a

ter uma excelente aceitação no mercado; com teor de proteína de 1,3 a 3,0%, podendo

ser indicada para alimentação de pessoas doentes e convalescentes, em função da sua

alta digestibilidade, valor nutricional e propriedades medicinais.[66,67]

No cenário atual, tem-se verificado uma crescente valorização da mangaba

pelos consumidores, o que tem estimulado a demanda, porém, paralelamente, tem-se

observado uma grande ameaça de diminuição da oferta, tendo em vista a crescente

devastação da vegetação nativa na qual a espécie está inserida, motivada pelo

crescimento das zonas urbanas, pela implantação da monocultura e pela falta de

conhecimento dos agricultores dos poucos saberes técnico disponível a respeito do

cultivo de mangaba. [66,68]

14

Neste sentido, há estudos promissores visando gerar conhecimentos e

tecnologias sobre a cultura da mangabeira, bem como o desenvolvimento dessa fruteira

em bases sustentáveis e competitivas, tornando a sua exploração sistemática e

superando as barreiras do extrativismo. Entre os aspectos agronômicos pesquisados

podemos citar: influência de substrato[69]

, organogênese[70]

, germinação in vitro[71]

,

influência da profundidade de semeadura e luminosidade[72]

, irrigação [73,74]

, avaliação

dos frutos pós-colheita[75,76]

e parâmetros genéticos em progênies.[77]

.

2.2 – Aspectos químicos

Embora possam ser encontrados diversos trabalhos de isolamento e

identificação de metabólitos secundários em outros gêneros de Apocynaceae, existem

poucos trabalhos a respeito dos aspectos químicos (isolamento e identificação de

substâncias) da H. speciosa.[78]

O nosso grupo de pesquisa (LABORGANICS) tem sido o pioneiro no

isolamento e identificação das substâncias presentes na mangabeira. O estudo

fitoquímico do látex dos frutos realizado por Sampaio (2008) permitiu o isolamento de

doze substâncias, sendo elas sete ésteres 3-β-O-acil lupeol : 3-β-O-hexadecanoato de

lupeoíla (2), 3-β-O-9-octadecenoato de lupeoíla (3), 3-β-O-octadecanoato de lupeoíla

(4), 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla (8), 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de

lupeoíla (9), 3-β-O-3’-hidroxiicosanoato de lupeoíla (10), 3-β-O-3’- hidroxidocosanoato

de lupeoíla (11), uma mistura contendo os triterpenos α-amirina (12), β-amirina (13),

lupeol (14), um 3-β-O-3’,5’-diidroxiicosanoato de lupeolíla (15), além da sacarose na

sua forma peracetilada (16).[86]

Esses triterpenos pentacíclicos são uma classe de

substâncias caracterizada por apresentar uma grande variedade de atividade

biológica.[79-82]

15

+

9'( )

7

1

3 45

10

25

9

O

O

( )5

26

827

1417

18

1928

20

29

30

2423

1'

3'

1'

2423

30

29

2028

19

18

1714

278

26

n O

OR1

)(

925

10

54

3

1

17

20

30 29

3 27

28

23

26

HO

1

4 5

8

9

10

1213

14

18

25

24

(13)

23

261

4 5

8

9

10

13

14

18

25

24

HO

273

28

29

192030

17

(14)

29

14

5'1' O

OOHOH

3'

3

20

4 5

30 19

28

1718

13

14

27

26

8

9

10

251

23 24

30

3

23

17

20

28

18

19

24

27

26

HO

1

4 5

8

9

10

1213

14

29

25

(12)

1'

2'O

CH2OAc

AcO

OAcCH2OAc

3'4'

5'6'

1

O

23

45

6

OCH2OAc

AcOAcO

AcO

(3)

(15)

(16)

R1= H, n= 10 (1), 12 (2), 14 (4), 16 (5), 18 (6), 20 (7)

R1=OH, n= 12 (8), 14 (9), 16 (10), 18 (11)

16

n = 22 - docosano (17)

23 - tricosano (18)

24 - tetracosano (19)

25 - pentacosano (20)

26 - hexacosano (21)

27 - heptacosano (22)

Já o estudo fitoquímico das folhas e ramos desta espécie proporcionou a

identificação de 22 substâncias. Novamente a mistura de triterpenos α-amirina, β-

amirina e lupeol e uma mistura de ésteres 3- β-O acil lupeol (1, 2, 4, 5, 6, 7, 8-11), além

de uma mistura de n-alcanos C22-C33 (17-28). Estes triterpenos pentacíclicos isolados da

H. speciosa são semelhantes aos que foram isolados por Carvalho et al. (2001) da casca,

látex e raiz da Parahancornia amapa, gênero quimiotaxinomicamente mais próximo da

Hancornia.[83,84]

A avaliação fitoquímica do extrato etanólico das folhas realizados por

Endringer et al. (2010) permitiu o isolamento do ácido quínico (29), do L-(+)-

bornesitol (30) e da rutina (31).[85]

CH3n

n

n = 28 - octacosano (23)

29 - nonacosano (24)

30 - triacontano (25)

31 - hentriacontano (26)

32 - dotriacontano (27)

33 - titriacontano (28)

OH OH

HO

HO

O

OH

(29)

HOHO

HO

O

OH

OH

(30)

17

Quanto à composição dos voláteis, há dois trabalhos na literatura: um que

trata da identificação dos voláteis da mangaba nos três estádios de maturação (verde,

“de vez” e maduro)[86]

e o outro que estuda os voláteis presentes nas folhas da

mangabeira variando-se o tempo de secagem e a época de colheita.[83]

Em ambos os

trabalhos, foi possível verificar a ocorrência da variação quantitativa e qualitativa dos

compostos.

Honda et al. (1990) apud Moraes et al. (2008), relataram a presença de

flavonóides e taninos na casca da mangabeira, bem como esteróides, triterpenos e

taninos nas folhas.[87]

A proantocianidina do tipo B epicatequina-(4β → 8) catequina

(32) e sua forma C-glicosilada (33) foram determinadas na infusão da casca da H.

speciosa por meio de injeção em fluxo direto em espectrômetro de massas seqüencial,

equipado com sistema de ionização por eletronebulização e analisador por armadilha de

íons. A atividade anti-úlcera atribuída à mangabeira pode estar relacionada à alta

concentração de proantocianidinas, uma vez que esses compostos são reconhecidos

como antioxidantes.[88]

O

OH

OHHO

OH O

O

O

OOOH

OH OH OH

OH

OH

(31)

18

2.3 – Aplicações terapêuticas e aspectos farmacológicos

Além da exploração econômica dos frutos e do potencial agroindustrial do

látex, as diversas partes da mangabeira encontram apreço na medicina popular. Em

algumas regiões, por exemplo, a casca possui propriedades adstringentes, e são

comumente utilizadas para o tratamento de dermatites, diabetes, doenças hepáticas,

como também usadas como anti-inflamatório. Já o látex é empregado contra a

tuberculose, úlceras, herpes, pancadas, inflamações, dermatoses e verrugas. O chá das

folhas é usado para cólica menstrual, reumatismo e hipertensão sendo as duas últimas

aplicações também atribuídas ao decocto da raiz.[64,65,89,90]

Recentemente, há trabalhos publicados ressaltando os aspectos

farmacológicos desta espécie. Serra et al. (2005) demonstraram que o extrato etanólico

das folhas de H. speciosa inibi a enzima conversora de angiotensina I (ACE); Ferreira et

al. (2007b) mostraram que estes extratos induzem uma potente vasodilatação em

artéria de ratos através de um mecanismo dependente da produção de NO; além desses

resultados, estes autores demonstraram também que o flavonóide rutina contribui para o

efeito vasodilatador da H. speciosa. Os resultados obtidos por Ferreira et al. (2007a)

corroboraram o uso popular desta planta para o tratamento de hipertensão. A atividade

antimicrobiana do extrato etanólico das folhas foi avaliado por Costa et al. (2008) que

observou o efeito inibitório para os microorganismos gram-positivos e gram-negativos.

[90-93]

O

OH

HO

OH

OH

OH

OHO

OH

OH

OH

OH

(32)

OHO

OH

OH

OH

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

oHO

HO

OH

OH

(33)

19

A avaliação de atividade antiinflamatória e quimiopreventiva do extrato

etanólico bruto das folhas de H. speciosa e sua fração metanólica foi realizada por

Endringer et al. (2009), neste estudo ambas atividades foram confirmadas pelo ensaio

de inibição NF-kB induzido por TPA em células HepG2-Luc ( que avalia a

quimioprevenção) e ensaio de inibição da enzima cicloxigenase-2, que avalia a ação

inflamatória.[85]

Moraes et al. (2008) reportaram que a casca da H. speciosa tem eficácia no

combate a úlcera e sugeriram que esta eficácia está baseada na habilidade do extrato

hidroalcólico de H. speciosa em estimular a síntese de muco e de produzir efeito anti-

secretor. Associado com esse efeito, o extrato hidroalcólico também tem propriedade

anti-Helicobacter pylori com ausência de efeito toxicológico. Segundo os autores essas

ações estariam relacionadas à presença de ácidos fenólicos e proantocianidinas,

previamente identificados nessa espécie. [87]

Em contraposição ao uso popular, o látex da mangabeira não apresentou

atividade microbiana frente às condições de análise realizada por Santos et al. (2007).[94]

Por outro lado, Marinho et al. (2011) demonstrou que o látex da H. speciosa apresentou

atividade anti-inflamatória confirmando o seu uso popular.[95]

Ainda no que se diz

respeito ao látex da mangabeira, Sampaio (2008) realizou testes bioquímicos para

avaliação da atividade antioxidante do látex dos frutos verdes, que apresentou efeito

hepatoprotetor significativo.[86]

Foi possível encontrar na literatura dois estudos relacionados à polpa da

mangaba. Trindade et al. (2002) investigaram a biodiversidade de leveduras em polpas

de frutas maduras e congeladas[96]

, enquanto Araújo et al. (2004) averiguaram a

atividade biológica das proteínas provenientes de frutas tropicais, sendo a mangaba uma

das frutas que apresentou atividade inibitória elevada.[97]

Um registro de patente feito por Endringer et al. (2010) descreveu a

obtenção de um extrato padronizado de folhas de H. speciosa e de uma fração

padronizada com atividade inibidora da enzima conversora de angiotensina (ACE),

vasodilatadora, anti-hipertensiva e antioxidante. O registro compreende ainda a

obtenção de composições farmacêuticas que contêm o extrato ou frações derivadas do

20

extrato de folhas da espécie H. speciosa ricas em ciclitóis e flavonóides, bem como sua

utilização para o tratamento de distúrbios cardiovasculares como hipertensão arterial,

aterosclerose, restenose, isquemia cardíaca ou cerebral não limitantes.[98]

2.4 – Propriedades tecnológicas do látex de H. speciosa

Gomes

Devido ao aumento das pesquisas em busca de fontes alternativas de

borracha natural com propriedades similares ao da Hevea brasiliensis, diversas fontes

têm sido estudadas nos últimos anos entre elas a mangabeira. Recentemente, Malmonge

et al. (2008) avaliaram as propriedades tecnológicas do látex da mangabeira, as quais se

mostraram bastante similar a da H. brasiliensis, tais resultados mostram que o látex da

H. speciosa é adequado para o uso em aplicações industriais. O baixo teor de proteína

da Hancornia, quando comparado com o látex da Hevea, sugere que o látex pode ter

importante aplicação em situações que necessitem do uso de borracha antialérgica.[99]

Já o comportamento térmico do látex da mangabeira foi avaliado por

Medeiros et al. (2010). O estudo indicou que a borracha extraída da H. brasiliensis é um

pouco mais estável termicamente que aquela extraída da H. speciosa. Ambos os

trabalhos mostram o potencial da Hancornia como fonte alternativa para a produção da

borracha natural.[100]

21

Objetivos

22

3 – OBJETIVOS

3.1 – Geral

Desenvolver e validar métodos analíticos em cromatografia líquida de alta

eficiência com os detectores de arranjo de diodos e evaporativo por

espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD) para controle de qualidade do látex

do caule e dos frutos de Hancornia speciosa Gomes.

3.2 – Específicos

Desenvolver e validar métodos analíticos utilizando HPLC-DAD-ELSD para a

caracterização química do látex do caule e dos frutos de H. speciosa;

Aplicar o método analítico para determinar a autenticidade de amostras

comerciais do látex do caule da mangabeira;

Isolar marcadores químicos a partir do látex do caule de H. speciosa e

caracterizar quimicamente sua estrutura por RMN de 1H e de

13C em uma e duas

dimensões;

Desenvolver e validar método por HPLC-DAD-ELSD para a quantificação de

marcadores químicos em amostras de látex dos frutos de H. speciosa Gomes.

23

Parte Experimental

24

4 – PARTE EXPERIMENTAL

4.1 – Materiais e equipamentos

As análises por cromatografia líquida foram realizadas em equipamento da

marca SHIMADZU (Kyoto, Japão), modelo Prominence, constituídos pelos seguintes

módulos: duas bombas LC-6A, desgaseificador DGU-20A3, auto-injetor SIL-10A,

detector de UV com arranjo de diodos SPD-M20Avp, detector evaporativo de

espalhamento de luz (ELSD-LT II); ambos os detectores conectado a uma interface

CBM 20A. O equipamento foi gerenciado pelo software LC solution. Diferentes

colunas analíticas foram utilizadas na otimização das condições cromatográficas, sendo

elas: coluna C18 (5µm; 25,0 x 1,0 cm, Varian), coluna Hexil-fenil LUNA®

(10 µm, 15,0

x 0,46 cm, Phenomenex) e coluna C18 LUNA® (5 µm, 25,0 x 0,46 cm, Phenomenex).

Os solventes grau HPLC utilizados nas análises cromatográficas foram

adquiridos da JT BAKER (Phillipsburg, NJ, USA) e TEDIA (Fairfield, OH, USA).

Antes do uso, os solventes foram filtrados através de uma membrana filtrante de Nylon

de 47 mm (diâmetro da membrana) e 0,45 μm (diâmetro dos poros) da marca MFS.

A água desionizada utilizada na composição da fase móvel e no preparo das

amostras foi obtida em um sistema MILLI-Q (Millipore, São Paulo, Brasil). A retirada

do solvente das diferentes amostras foi realizada em evaporador rotatório da marca

HEIDOLPH®.

Os extratos comerciais do látex do caule da mangabeira foram secos em um

liofilizador LIOTOP® modelo L101 (Liobrás, São Carlos-SP, Brasil) e em concentrador

e centrifugador CENTRIVAP (LABCONCO®). As pesagens foram realizadas em

balança analítica (DENVER INSTRUMENT®) com precisão de 0,1 mg. As amostras

foram homogeneizadas em agitador do tipo Vortex (QL-901) da BIOMIXER®. No

preparo das soluções, usaram-se micropipetas de marca LAB MATE - HIGH TECH

LAB®.

25

4.2 – Limpeza do material

As vidrarias utilizadas durante o trabalho foram enxaguadas com água

corrente por várias vezes, ensaboadas com detergente, enxaguadas novamente,

sonicadas por 30 min em uma solução de água destilada e isopropanol (50:50 v/v) e por

fim levadas a estufa a 120 ˚C. As vidrarias volumétricas foram secas a temperatura

ambiente . Em seguida, o material foi coberto com papel filme e guardado em armário

fechado.

4.3 – Material Vegetal

4.3.1 – Obtenção do látex do caule da mangabeira

Uma amostra do látex do caule da H. speciosa foi adquirida no povoado de

Pontal, município de Indiaroba-SE (LCP). A extração foi realizada no dia 13 de janeiro

de 2011 às 5h e 45min com auxílio da Sra. Ednalva Tavares dos Santos, uma das

participantes do projeto “Catadoras de Mangaba”. Neste processo, pequenas incisões

foram feitas no caule da mangabeira e a seiva branca e leitosa oriunda de vários táxons

foi coletada em recipientes de plástico (Figura 2). O látex obtido (~100 mL) foi diluído

com 700 mL de água destilada e filtrado com auxílio de um pano fino. O volume

utilizado para a diluição está de acordo com aquele empregado no uso popular daquela

região. Um frasco âmbar revestido com papel alumínio foi utilizado para armazenar

esse material vegetal (“leite de mangabeira”), o qual foi mantido sob refrigeração

durante o transporte e em freezer até as análises por cromatografia líquida. Para a

identificação taxonômica da espécie, uma exsicata (#20.585) do material botânico foi

depositada no Herbário da Universidade Federal de Sergipe (ASE/UFS).

O estudo do látex do caule consistiu também na análise de amostras

comercializadas em feiras livres de diferentes cidades do Estado de Sergipe: Aracaju

(LCA), Itabaiana (LCI), Umbaúba (LCU) e Boquim (LCB). Tais amostras foram

adquiridas ao longo do desenvolvimento da pesquisa.

26

Figura 2: Extração do látex do caule Harcornia speciosa Gomes

Fonte: SANTOS, A. D. C. (2011)

4.3.2 – Obtenção do látex dos frutos da mangabeira

O látex da mangaba foi obtido a partir dos frutos verdes adquiridos na feira

livre de Pedrinhas-SE. A extração do látex foi feita por meio de diversos cortes nos

frutos (229 g), seguida da coleta do líquido branco em um béquer, o qual foi diluído em

água e, em seguida, extraído com diclorometano (6 x 50 mL). Após a remoção do

solvente em evaporador rotatório, obteve-se 480 mg do extrato diclorometânico.[86]

Um segundo extrato do látex dos frutos verdes foi preparado usando frutos

da mangabeira coletados no Bairro Augusto Franco, Aracaju-SE. Para a obtenção desse

extrato foram feitos diversos cortes nos frutos coletando-se o suco leitoso, o qual em

seguida foi liofilizado até completa remoção da água.

4.3.3 – Polpa comercial do fruto da mangabeira

As polpas de mangaba da marca VIP® (100 g) foram adquiridas em

supermercado da cidade de Aracaju-SE e posteriormente liofilizadas para a remoção da

água.

27

4.4 – Preparo das amostras do látex de Hancornia speciosa e dos

marcadores químicos

4.4.1 – Látex do caule

Para a análise cromatográfica, 3 mL das amostras do látex do caule foram

liofilizados. Após a completa retirada da água, foram adicionados 3 mL de metanol e

sonicados por 20 min. Em seguida, a parte insolúvel (borracha) foi retirada, a solução

resultante foi seca e a massa residual determinada. Sete miligramas desta amostra foi

pesada e dissolvida em 1 mL da solução aquosa de acetonitrila a 5% em volume; a qual

foi filtrada em uma membrana de nylon 0,45µm antes da análise por HPLC.

4.4.2 – Látex dos frutos

O látex dos frutos e a polpa comercial ambos liofilizados foram

solubilizados em uma mistura de hexano:metanol (7:1 v/v). Após filtração simples, o

sobrenadante foi secado e diluído em uma solução de 10% tetrahidrofurano:isopropanol.

Já para a análise do extrato diclorometano do látex dos frutos foi realizada a dissolução

direta em isopropanol. As amostras foram filtradas em uma membrana de nylon 0,45

µm e então analisadas por cromatografia líquida.

4.4.3 – Marcadores químicos do látex dos frutos

Os padrões utilizados nesse trabalho foram dissolvidos em isopropanol,

filtrados em membrana de nylon 0,45 µm e analisados por cromatografia líquida. Uma

amostra do triterpeno lupeol foi gentilmente cedida pela Profa. Dra. Valéria Regina de

Souza Moraes (DQI/UFS). Os demais marcadores químicos: uma mistura contendo os

triterpenos α-amirina, β-amirina e lupeol; uma mistura contendo sete (07) ésteres 3-β-O-

acil lupeol; e um éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foram isolados do extrato

clorofórmio do látex dos frutos previamente pela MSc. Taís Santos Sampaio.[86]

28

4.5 – Condições cromatográficas de análise

4.5.1 – Método qualitativo para o látex do caule da mangabeira

Para as análises cromatográficas do látex do caule foi empregada uma coluna

analítica C18 LUNA®

(5 μm, 250 x 4,6 mm, Phenomenex) adaptada a uma coluna de guarda

C18 (4,0 x 3,0 mm, Phenomenex). A separação dos compostos se deu por meio da eluição

gradiente no modo reverso, com fase móvel constituída por água (A) e acetonitrila (B) na

seguinte proporção: 5-40% de (B) em 50 min; 40-100% de (B) em 5 min; 100% de (B) por 5

min. Ao término da corrida empregou-se um gradiente de retorno de 100-5% por 5 min com

tempo de espera para o recondicionamento da coluna de 10 min. Nos experimentos, utilizou-

se vazão de 1,0 mL/min e volume de injeção de 20 µL. Os cromatogramas foram monitorados

pelo DAD (λ= 220 nm) e pelo ELSD (temperatura do tubo mantido em 70˚C e fluxo de N2

pressurizado em 353 KPa).

4.5.2 – Método qualitativo para o látex dos frutos da mangabeira

As amostras obtidas conforme os itens 4.3.2 e 4.3.3 e preparadas conforme

procedimentos descritos nos itens 4.4.2 e 4.4.3 foram analisadas empregando-se uma

coluna analítica Hexil-fenil LUNA® (10 μm, 150 x 4,6 mm, Phenomenex). Uma vazão

de 0,8 mL/min foi utilizada e volume de injeção foi de 20 µL.

As análises cromatográficas foram realizadas em eluição gradiente no modo

reverso, com fase móvel constituída por água (A) e acetonitrila (B), seguindo a

programação: 86-90% (B) por 10 min; 90-100% (B) por 30 min; 100-86% (B) por 5

min para o retorno do gradiente, finalizando com 86% (B) por 15 min.

Os cromatogramas foram registrados com detector de arranjo de diodos em

varredura de 190-450 nm, sendo 200 nm o comprimento de onda escolhido para a

obtenção dos cromatogramas.

Depois do DAD, o efluente da coluna cromatográfica foi submetido ao

detector ELSD. A nebulização foi proporcionada por um fluxo de N2 pressurizado (351

KPa) e o efluente nebulizado foi evaporado a 50˚C.

29

4.6 – Validação de métodos cromatográficos analíticos

4.6.1 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do

látex do caule de Hancornia speciosa

Para a validação do método analítico utilizou-se o látex do caule coletado

em Indiaroba. O tempo de retenção juntamente com a área e a altura foram utilizados

como parâmetros no processo de validação.

4.6.1.1 – Teste da precisão de injeção

A precisão na injeção dos extratos foi determinada pela análise da amostra

do látex ao longo de um dia de trabalho. As amostras foram preparadas

independentemente em triplicata e analisadas em quintuplicata. A precisão foi avaliada

através do desvio padrão relativo (DPR), utilizando a Equação 1.

Onde:

S = Desvio padrão experimental

X = Média das medições

4.6.1.2 – Teste da repetibilidade

A repetibilidade foi avaliada pela análise das amostras do látex do caule

preparadas por três vezes independentemente em três dias diferentes e analisadas em

quintuplicata. O DPR foi tomado como parâmetro para a avaliação da repetibilidade.

Equação 1:

30

4.6.1.3 – Estabilidade da amostra do látex do caule

A estabilidade foi avaliada em duas formas: após ciclos de congelamento e

descongelamento e a estabilidade de curta duração.

4.6.1.3.1 – Estabilidade de curta duração

As amostras do látex do caule permaneceram no autoinjetor do

cromatógrafo um período total de 48h, sendo analisadas ao completar períodos de 24 e

48 h. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos nas análises das amostras

recém-preparadas.

4.6.1.3.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e congelamento

As amostras foram congeladas por 24h em freezer, sendo então submetidas

ao descongelamento à temperatura ambiente. Quando completamente descongeladas, as

amostras foram congeladas novamente por 12h e assim sucessivamente até completar os

três ciclos. Os resultados foram comparados com aqueles obtidos da análise das

amostras recém-preparadas.

4.6.1.4 – Robustez

Para avaliar a robustez do método foram feitas as seguintes alterações:

Fluxo da fase móvel: 0,8 - 1,2 mL/min;

Proporção da fase móvel inicial: 3 - 7% de ACN:H2O;

Proporção da fase móvel final: 38 - 42% de ACN:H2O;

Lote da coluna C18 (Phenomenex) : 423579-1 e 416537-1.

A avaliação das diferentes condições se deu em triplicata e separadamente,

ou seja, para averiguar um parâmetro, mantiveram-se os demais fixos.

31

4.6.2 – Validação do método cromatográfico para a quantificação do

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol em látex do fruto de H. speciosa e na polpa

comercial

4.6.2.1 – Condições analíticas do método quantitativo

A separação cromatográfica foi realizada utilizando coluna analítica Hexil-

fenil LUNA® (10 μm, 150 x 4,6 mm, Phenomenex) e fase móvel constituída de água

(A) e acetonitrila (B). As análises foram feitas em eluição isocrática no modo reverso

utilizando 95% de B por 40 min. Uma vazão de 0,8 mL/min foi utilizado e volume de

injeção de 20 µL. Os cromatogramas foram registrados com detector de arranjo de

diodos em 200 nm e com ELSD usando as mesmas condições descritas em 4.5.2. O pico

cromatográfico referente ao éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foi determinado na

amostra real pela comparação do tempo de retenção do pico gerado pela análise da

solução padrão. A pureza do éster diidroxilado foi verificada por normalização

utilizando o ELSD o que resultou em uma pureza de 97,13%.

4.6.2.2 – Preparo da solução estoque, padrões de calibração e amostras

controle de qualidade

A solução estoque do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foi preparada em

isopropanol na concentração de 2 mg/mL. A partir desta foram preparadas soluções de

trabalho nas concentrações: 19,4; 38,8; 77,7; 155,4; 310,8 e 466,2 µg/mL.

Da solução estoque foram preparadas soluções de controle de qualidade nas

seguintes concentrações: CQB - Controle de Qualidade Baixo: 43,7 µg/mL; CQM -

Controle de Qualidade Médio: 207,9 µg/mL e CQA – Controle de Qualidade Alta:

372,9 µg/mL. Tais soluções foram utilizadas nos experimentos de precisão (item

4.6.2.6) e exatidão (item 4.6.2.7). Os valores de concentração dos controles de

qualidade do método foram definidos baseados na ANVISA. Segundo esta agência o

controle de qualidade de baixa concentração deve ser menor ou igual três vezes o limite

inferior de quantificação, já o controle de qualidade de média concentração deve ser

aproximadamente a média entre CQB e CQA, enquanto que o controle de qualidade de

alta concentração deve corresponder de 75 a 90% da maior concentração usada na curva

32

de calibração.As soluções estoque, de calibração e de controle de qualidade foram

mantidas em refrigerador a zero graus Celsius.

4.6.2.3 – Linearidade

A faixa de linearidade foi avaliada de acordo com os níveis de éster

diidroxilado esperados nas matrizes (polpa comercial e látex liofilizado). O estudo da

linearidade se deu pelo método do padrão externo e por adição de padrão.

No método do padrão externo os seis níveis de concentração (mostrados no

item 4.6.2.2) foram avaliados em triplicata. Para o método da adição de padrão duzentos

microlitros das soluções de calibração foram pipetados. Após a completa evaporação do

isopropanol, duzentos microlitros da polpa (preparado conforme o item 4.4.2) foi

adicionado e misturados por 30 segundos usando agitador tipo vortex. Da mesma forma

que no método do padrão externo, as soluções de calibração da adição de padrão foram

avaliadas em triplicata. As curvas de calibração foram obtidas por regressão linear, a

partir da relação entre as áreas dos picos e as concentrações das amostras para ambos os

métodos.

4.6.2.4 – Seletividade

A seletividade do método foi avaliada de duas formas: adicionando o éster

diidroxilado 3-β-O-acil lupeol na polpa comercial de mangaba e comparando-se o

espectro de UV do padrão com o pico correspondente obtido na análise do extrato da

matriz. Além disso, a pureza do pico cromatográfico referente ao analito foi avaliada

usando o DAD.

4.6.2.5 – Limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)

O limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ) foram estimados

com base na relação de três vezes o ruído da linha de base e dez vezes a relação sinal-

ruído, respectivamente.

33

4.6.2.6 – Precisão

A repetibilidade e precisão intermediária foram determinadas pela análise

das soluções de controle de qualidade em três diferentes dias. Para cada uma das três

concentrações, as amostras foram preparadas independentemente por três vezes e

analisadas em quintuplicata. O DPR foi tomado como medida de precisão.

4.6.2.7 – Exatidão

A exatidão foi determinada pelo teste de recuperação. A amostra da polpa

comercial de mangaba preparada conforme o item 4.4.2 foi fortificada com o composto

de referência em três níveis de concentração (as mesmas usadas no estudo da precisão).

Duzentos microlitros da amostra da polpa foram pipetados e colocados em tubos de

ensaio; após a retirada do solvente foram adicionados 200 µL da solução de controle de

qualidade, por fim a amostra foi homogeneizada usando agitador tipo vortex por 30

segundos. Para cada concentração, as amostras foram independentemente preparadas e

fortificadas em triplicata. As amostras foram analisadas em quintuplicata em três dias

diferentes. A exatidão foi determinada através da concentração média experimental em

relação à concentração teórica, em valores percentuais (Equação 2).

Equação 2:

34

4.6.2.8 – Robustez

A robustez do método foi avaliada por meio das seguintes alterações:

Fluxo da fase móvel: 1,0 – 0,6 mL/min.

Proporção da fase móvel: 93 – 97% ACN:H2O.

Lote da coluna Hexil-fenil LUNA®

: 423579-1 e 416537-1.

A análise cromatográfica das diferentes condições analíticas foi analisada

em triplicata e separadamente, ou seja, para avaliação de um parâmetro, mantiveram-se

os demais fixos.

4.6.2.9 – Estabilidade

A estabilidade foi avaliada de duas formas: após ciclos de congelamento e

descongelamento e a estabilidade de curta duração.

4.6.2.9.1 – Estabilidade de curta duração

Os resultados das amostras de controle de qualidade recém-preparadas

foram comparados com aqueles obtidos na análise de tais amostras após permanecerem

no autoinjetor por 24h.

4.6.2.9.2– Estabilidade após ciclos de descongelamento e congelamento

As amostras do controle de qualidade foram congeladas por um período de

24 h no freezer, sendo então submetida ao descongelamento à temperatura ambiente.

Quando completamente descongeladas, as amostras foram congeladas novamente por

12h e assim sucessivamente até completar os três ciclos. Os resultados foram

comparados com aqueles obtidos na análise das amostras recém-preparadas.

35

4.7 – Isolamento dos marcadores químicos do látex do caule de

Hancornia speciosa Gomes

O látex do caule, preparado conforme o item 4.4.1, foi utilizado para o

isolamento dos marcadores químicos por HPLC em escala semi-preparativa. Para tanto

empregou-se uma coluna Hexil-fenil LUNA®

(250 x 10 mm; Phenomenex), vazão de

4,5 mL/min e detecção em 220 nm. A fase móvel constituída por H2O (A) e ACN (B)

variou na seguinte proporção: 5-40% de (B) em 50 min. Antes de uma nova injeção, foi

feita a limpeza da coluna com 100% de ACN seguida do recondicionamento em 5% de

(B) por 10 min. As bandas cromatográficas coletadas em erlenmeyer foram

centrifugadas. Em seguida, os compostos isolados foram transferidos para frascos

âmbar, identificados e pesados.

4.8 – Identificação dos marcadores químicos por RMN de 1H e de

13C

Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) foram adquiridos

utilizando aparelho Bruker Avance DRX-400 (9,4 Tesla) operando a 400 MHz para

RMN 1H e 100 MHz para RMN

13C. As amostras foram solubilizadas em metanol

deuterado (CD3OD) e os deslocamentos químicos estão expressos em ppm (δ) e as

multiplicidades dos sinais estão indicadas conforme convenção: s (simpleto), sl

(simpleto largo), d (dupleto), dd (duplo dupleto), ddd (duplo duplo dupleto), ddl (duplo

dupleto largo), t (tripleto), tl (tripleto largo), dt (duplo tripleto), dtd (duplo tripleto

duplo) e td (tripleto duplo), q (quadrupleto), quintl (quintupleto largo). As constantes de

acoplamento (J) foram registradas em Hertz (Hz). Estes experimentos foram realizados

no Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear do Departamento de Química da

Universidade Federal de São Carlos (DQ/UFSCar) sob a responsabilidade do Prof. Dr.

Antonio Gilberto Ferreira.

36

Resultados e

discussão

37

5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 – Otimização das condições cromatográficas de análise: látex do

caule de H. speciosa Gomes

O objetivo do processo de otimização é definir as melhores condições

cromatográficas para resultar em alta qualidade da separação dos compostos no menor

tempo possível. Não existe uma metodologia ou conjunto de regras que definam

exatamente o caminho a se percorrer durante o estudo de otimização, o que exige do

analista bom senso e criatividade. Na literatura são poucos os artigos que discutem

plausivelmente as estratégias de otimização, normalmente os autores se restringem a

citar as melhores condições cromatográficas sem nenhum tipo de discussão sobre os

parâmetros avaliados.[101]

Neste trabalho, o processo de otimização do método consistiu na avaliação

da influência de diferentes fatores na separação cromatográfica, entre eles: fase

estacionária, natureza do modificador orgânico (solvente B) e proporção da fase móvel.

A condição cromatográfica escolhida foi estabelecida por comparação da resolução,

linha de base, tempo de eluição e número de picos no cromatograma.

A avaliação dos parâmetros em busca da melhor separação cromatográfica

se deu em duas etapas. Na primeira, foi possível selecionar a fase estacionária e o

modificador orgânico por meio de experimentos utilizando um gradiente exploratório.

Na segunda fase, os parâmetros da eluição gradiente foram devidamente ajustados,

baseado nos dados adquiridos na etapa anterior.[101]

38

5.1.1 – Primeira etapa do processo de otimização: uso do gradiente

exploratório

O gradiente exploratório, proposto por Snyder e Dolan (1996), consiste na

variação do modificador orgânico de 5 a 100% por 60 min a um fluxo de 2 mL/min. Os

autores sugerem ainda que as análises sejam feitas inicialmente em uma coluna C8 ou

C18 de 15 x 0,46 cm.[102]

O uso do gradiente exploratório permite conhecer a

complexidade da amostra fornecendo um importante indicativo de qual fase móvel e

fase estacionária podem resultar em separação mais adequada.

Durante esta etapa, optou-se por fazer adaptações no método sugerido por

Snyder e Dolan (1997). Variando-se amplamente a força do solvente orgânico e usando

diferentes fases estacionárias foram testadas diversas combinações modificando os

seguintes fatores:

Fase estacionária: hexil-fenil LUNA® (10 µm, 150 x 4,6 mm,

Phenomenex) e C18 LUNA® (5 µm, 250 x 4,6 mm, Phenomenex);

Solvente (A): H2O e solução aquosa de ácido fórmico (HCOOH) 0,5%

(v/v);

Solvente (B): metanol (MeOH) e acetonitrila (ACN).

A cromatografia em fase reversa é a mais utilizada em HPLC, uma vez que

permite a separação de uma grande variedade de solutos e o uso de fase móvel aquosa.

A fase estacionária quimicamente ligada ao grupo octadecilsilano (C18) é, em geral, a

primeira opção de escolha em análises realizadas no modo reverso. Esse fato pode ser

justificado pela baixa polaridade e pelas interações hidrofóbicas que ocorrem entre a

parte não polar das substâncias a serem separadas e as cadeias hidrocarbônicas da fase

estacionária.[103]

Além da coluna C18 utilizou-se a fase estacionária hexil-fenil, pois além de

interações hidrofóbicas, inerentes ao modo reverso, nesta coluna ocorrem interações do

tipo π-π, o que diferencia sua seletividade na análise de substâncias com anéis

benzênicos e duplas ligações em sistema conjugados como taninos, flavonóides etc.[104]

39

A escolha do tipo de solvente no modo reverso é comumente o mais

significativo procedimento para alterar a seletividade e alcançar a separação dos

múltiplos compostos presente na amostra. Usualmente três solventes são recomendados

para a investigação da seletividade, são eles: metanol (MeOH), acetonitrila (ACN) e

tetrahidrofurano (THF). Obviamente que são as propriedades desses solventes, como

miscibilidade em água, compatibilidade com absorção no UV e viscosidade, que

permitem o amplo uso em cromatografia de fase reversa.[105]

Um importante ponto a ser observado na otimização da separação

cromatográfica é o efeito causado pela diminuição do pH da fase móvel pela adição de

ácidos fracos.[106]

Essa medida possibilita a supressão da ionização de algumas

substâncias que em solução aquosa podem estar parcial ou totalmente ionizadas, como

por exemplo, compostos fenólicos e ácidos carboxílicos. A supressão da ionização é

uma condição muitas vezes desejável, pois torna as substâncias mais hidrofóbicas,

aumentando sua retenção.[107]

As condições cromatográficas de análise testadas na primeira etapa da

otimização são demonstradas, com seus respectivos perfis cromatográficos, na Tabela 1

e na Figura 3.

40

Tabela 1: Condições cromatográficas avaliadas na primeira etapa da

otimização do método para análise do látex do caule de H.speciosa com detecção em

220 nm.

Fase Estacionária Análise Condição Cromatográfica

C18 Luna

(5 µm, 250 x 4,6 mm)

1

Fase Móvel: ACN: H2O

Gradiente: 5-100% ACN por 60 min

Vazão: 1,0 mL/min

Volume de injeção: 20 µL

2

Fase Móvel: ACN: solução aquosa de HCOOH a

0,5%


Vazão: 1,0 mL/min


3

Fase Móvel: MeOH: H2O

Gradiente: 5-100% MeOH por 60 min

Vazão: 1,0 mL/min


4

Fase Móvel: MeOH: solução aquosa de HCOOH a

0,5%


Vazão: 1,0 mL/min


Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6

mm)

5

Fase Móvel: ACN: H2O


Vazão: 1,0 mL/min


6

Fase Móvel: MeOH: H2O


Vazão: 1,0 mL/min


41

0 10 20 30 40 50 60 70

-2,0x106

-1,5x106

-1,0x106

-5,0x105

0,0

5,0x105

Absorb

ância

(m

Abs)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

2,0x105

2,5x105

Absorb

ância

(m

Abs)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70

-2,0x106

-1,5x106

-1,0x106

-5,0x105

0,0

Absorb

ância

(m

Abs)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

Absorb

ância

(m

Abs)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

Absorb

ância

(m

Abs)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60

0

1x105

2x105

3x105

Absorb

ância

(m

Abs)

Tempo (min)

Figura 3: Cromatogramas para a seleção de condições para o método em HPLC-DAD. Os

números correspondem às condições apresentadas na Tabela 1.

1 2

3

4

5 6

42

Observando os cromatogramas da Figura 3 algumas considerações podem ser

feitas. A solução aquosa de ácido fórmico pode ser retirada do método, uma vez que

desestabiliza a linha de base. A interferência do ácido fórmico na detecção se dá por

apresentar valores de cut-off (210 nm) próximos ao utilizado nos registros dos

cromatogramas, 220 nm.[108]

Com a percepção deste fenômeno tornou-se desnecessário fazer

a combinação da solução aquosa de ácido fórmico com metanol.

Dentre as condições de análise testadas, a condição 6, a priori, foi a mais

adequada; uma vez que resultou no aparecimento de um maior número de picos e melhor

separação. Dessa forma, a fase estacionária hexil-fenil e o metanol foram selecionados para os

experimentos da segunda etapa.

5.1.2 – Segunda etapa do processo de otimização: avaliação dos

parâmetros da eluição gradiente

O objetivo dessa etapa foi aperfeiçoar a seletividade do método, ou seja, melhorar

a separação entre os picos. Para tanto, o procedimento mais eficaz e conveniente é a mudança

da proporção e da composição da fase móvel.

Embora haja ferramentas computacionais que determinam a porcentagem de B

mais precisamente e com o mínimo de experimentos, o gradiente foi definido através de

experimentos de tentativa e erro. [109]

O início e o fim da porcentagem do solvente orgânico no método cromatográfico

foram ajustados a partir do perfil cromatográfico 6. Devido à ampla faixa de retenção em que

os compostos foram registrados no cromatograma 6, a separação mais adequada deve ser

alcançada por meio da eluição gradiente. As condições de análise testadas nesta fase são

mostradas na Tabela 2 e os respectivos cromatogramas na Figura 4.

43

Tabela 2: Condições cromatográficas avaliadas na segunda etapa da otimização

do método para análise do látex do caule de H.speciosa com detecção em 220 nm.

Análise Gradiente de eluição Fase móvel Fase estacionária

7

5% (B) por 10 min; 5-30% (B) por 5 min;

30-70% (B) por 30 min; 70-100% (B) por

10 min; isocrático em 100% de B por 5

min.

MeOH:H2O

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

8

5-35% (B) por 10 min; 35-70% (B) por

40 min; 70-100% (B); isocrático em

100% (B) por 5 min.

MeOH:H2O

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

9

5-25% (B) por 15 min; 25-45% (B) por

25 min; 45-100% (B) por 10 min;

isocrático em 100% (B) por 5 min.

ACN: H2O

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

10

5-40% (B) por 50 min; 40-100% (B) por

5 min; isocrático 100% (B) por 5 min.

ACN: H2O

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

11

5-40% (B) por 50 min; 40-100% (B) por


ACN: H2O

C18 Luna

(5 µm, 250 x 4,6 mm)

12

5-40% (B) por 70 min; 40-100% (B) por


ACN: H2O

C18 Luna

(5 µm, 250 x 4,6 mm)

44

0 10 20 30 40 50 60

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

2,0x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

2,0x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0

1x105

2x105

3x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70

0

1x105

2x105

3x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

Figura 4: Cromatogramas (λ = 220 nm) para a seleção de condições para o método em

HPLC-DAD. Os números correspondem às condições apresentadas na Tabela 2.

7 8

9 10

11 12

45

Foi verificado que não houve melhora significativa nas condições de análise 7 e 8.

Nesses experimentos foram utilizadas diferentes rampas de eluição gradiente. Em vista dos

resultados insatisfatórios foi alterado o modificador orgânico de metanol para acetonitrila e

foi testado a condição 9. Os picos permaneceram sem a devida resolução apresentando o

mesmo perfil observado nas tentativas anteriores. Dessa forma, a condição 9 apresentou uma

separação inadequada dos picos. Na condição 10, novas rampas de eluição gradiente foram

empregadas sem ocasionar nenhuma alteração satisfatória na resolução.

A estratégia seguinte consistiu em utilizar o melhor gradiente observado

utilizando uma fase estacionária C18. O resultado, apresentado no cromatograma 11, mostra

que a décima primeira condição permitiu uma melhor resolução dos picos iniciais (com

tempos de retenção entre 0 e 10 minutos) e uma significativa abertura na segunda parte do

cromatograma (no intervalo de 20 a 45 minutos).

Por fim, testou-se a condição 12, na qual foi alterada a inclinação do gradiente

mudando o tempo de análise de 50 para 70 min. Com essa mudança a inclinação do gradiente

variou de 0,7 (condição 11) para 0,5 %B/min. No entanto, nenhuma alteração significativa

pôde ser notada. Dessa forma, a condição 11 foi a mais adequada. A descrição completa está

descrita no item 4.5.1.

5.1.3 – Preparo da amostra do látex do caule

Até o presente momento nenhuma averiguação da influência do preparo da

amostra tinha sido realizada neste trabalho. Nos experimentos acima descritos foi feita a

retirada da água por centrifugação e para facilitar a coagulação da borracha foi utilizado 150

µL de ácido acético no preparo da amostra de 3 mL de látex.[110]

Sendo assim, avaliar

pequenas alterações no modo de preparo tornou-se indispensável.

O látex do caule da H. speciosa apresentou algumas características que torna o seu

manuseio trabalhoso, como por exemplo, fotossensibilidade e fácil polimerização.

Normalmente, a extração do látex da mangabeira acontece nas primeiras horas do dia e este é

logo diluído em água, permitindo assim a sua conservação.

46

Nesse caso, o preparo da amostra do látex do caule para a análise em HPLC

consistiu na retirada da água e da borracha, bem como na seleção do solvente (ou mistura de

solventes) mais compatível com a fase móvel. Sendo assim, a necessidade do uso do ácido

acético[120]

no processo de coagulação da borracha e o processo de retirada de água da amostra

é mais eficiente (centrifugação ou liofilização) foram avaliados.

Assim experimentos foram realizados, sendo um por liofilização sem o uso de

ácido acético e outros dois fazendo-se uso de uma centrifuga à vácuo (CENTRIVAP),

avaliando-se o uso do ácido acético. O resultado são apresentados na Figura 5.

Figura 5: Cromatogramas para a seleção do modo de preparo do látex do caule de H.

speciosa para análise em HPLC-DAD: (preto) látex tratado com ácido acético e seco em

centrifugador; (vermelho) látex sem ácido acético e seco em centrifugador e (azul) látex seco

em liofilizador. Os cromatogramas foram obtidos utilizando a condição 11 descrita na Tabela

2.

0 20 40

0

1x101

Ab

sorb

ân

cia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

47

Nos perfis cromatográficos apresentados na Figura 5 não se observou mudança

significativa nas condições testadas. O processo de liofilização foi escolhido pela

simplicidade e por possibilitar o menor manuseio da amostra, o que consequentemente

permitiu preservar os compostos na matriz. Uma vez definida a porcentagem inicial da fase

móvel da corrida cromatográfica (discutido no item 5.1.2), uma solução aquosa a 5% de ACN

foi preparada para dissolver o material resultante do processo da retirada da água. As

condições finais podem ser vistas no procedimento experimental item 4.4.1.

Aplicando o preparo da amostra otimizado, foi obtido o perfil cromatográfico

ilustrado na Figura 6, o qual apresentou bons valores de tempo de retenção e adequada

separação entre os picos. A avaliação efetuada com o DAD mostrou um alto grau de pureza

dos picos, acima de 0,99999. Os espectros de UV dos picos assinalados na Figura 6

(apresentados de 1 a 7) podem ser vistos na Figura 7.

48

Figura 6: Perfil Cromatográfico do látex do caule de H. speciosa obtido com a eluição gradiente: 5-50% H2O (A): ACN (B) em 50 min; vazão: 1,0

mL/min; λ= 220nm; Vinj = 20 µL; coluna analítica C18 LUNA®

(5μm ,250 x 4,6 mm, Phenomenex) adaptada a uma coluna guarda C18 (4 x 3,0 mm,

Phenomenex). Condição cromatográfica 11.

0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

1

2

3

4

5

6

7

49

Figura 7: Espectros de absorção UV das bandas cromatográficas dos picos assinaladas de 1 à 7 na Figura 6.

200 300 400 500 600 700 nm

0

500

1000

1500

2000mAU

195

323

492

393

200 300 400 500 600 700 nm

0

100

200

mAU

230

400

200 300 400 500 600 700 nm

0

250

500

mAU

220

317

200 300 400 500 600 700 nm

0

250

mAU

198

279

395

648

200 300 400 500 600 700 nm

0

250

500

750

mAU

197

279

343

494

616

200 300 400 500 600 700 nm

0

250

500mAU

199

228

279

616

726

200 300 400 500 600 700 nm

0

50

100

150

mAU

279

494

547

617

647

(1) (2) (3)

(4) (5) (6)

(7)

50

Com auxílio da projeção tridimensional da amostra do látex do caule de H.

speciosa obtido por HPLC-DAD (Figura 8), o comprimento de onda em 220 nm foi o

selecionado, pois neste valor se observou a máxima absorção dos compostos.

Figura 8: Projeção tridimensional obtido por HPLC-DAD da amostra do látex do

caule da H. speciosa.

Após a conclusão dos trabalhos com o uso do DAD, novas análises foram

realizadas utilizando o detector ELSD. A análise da amostra do látex do caule por HPLC-

ELSD (Figura 9) permitiu verificar a presença de um pico não detectado pelo DAD (tR= 6,7

min). A comparação entre os perfis cromatográficos obtidos por ambos os detectores pode ser

visto na Figura 10. Portanto, o uso dos detectores DAD-ELSD em série permitiu uma visão

mais completa da amostra tornando o método mais seguro e confiável.

51

Figura 9: Perfil cromatográfico do látex do caule da H. speciosa por HPLC-ELSD obtido com a eluição gradiente: 5-50% H2O (A): ACN (B) em 50

min; vazão: 1,0 mL/min; ELSD: temperatura do tubo mantido em 70˚C e fluxo de N2 pressurizado em 353 KPa; Vinj = 20 µL; coluna analítica C18

LUNA®

(5μm ,250 x 4,6 mm, Phenomenex) adaptada a uma coluna guarda C18 (4 x 3,0 mm, Phenomenex). Condição cromatográfica 11.

. (Alan inclua as condições do ELSD aqui e indique na figura o numero dos picos como feito anteriormente...

1

3

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

mV

Tempo (min)

Pico registrado somente pelo ELSD

2

4

5

6

52

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

uV(x1,000,000)

Figura 10: Perfil cromatográfico comparativo do látex do caule de H. speciosa por HPLC-

DAD-ELSD. (Preto) Cromatograma monitorado pelo DAD e (Vermelho) cromatograma

monitorado pelo ELSD.

5.2 – Validação do método analítico para o perfil cromatográfico do látex

do caule de H. speciosa

Após a otimização das condições cromatográficas, o método qualitativo foi

validado por meio da averiguação das seguintes figuras de mérito: precisão de injeção,

repetibilidade, estabilidade e robustez.[111,112]

A avaliação destes parâmetros foram baseadas

nos valores de tempo de retenção (tR), área e altura de bandas cromatográficas que

apresentaram boa resolução e intensidade. Nos experimentos do estudo da validação foi

utilizada a amostra do látex do caule (LCP) adquirida em Pontal município de Indiaroba-SE, a

qual foi preparada conforme o item 4.4.1. A Figura 6 mostra as bandas cromatográficas

selecionadas para a validação (bandas cromatográficas de 1 a 7).

Em todos os parâmetros um valor de desvio padrão relativo (DPR) menor ou igual

a 15 % foi aceito como preconiza o Guia da ANVISA[113]

para quantificação em métodos

bioanalíticos. A Tabela 3 mostra os valores de DPR da precisão instrumental que variou de

0,01 – 0,42 %; 5,2 – 7,4 % e 5,1 – 7,1 % para os valores de tempo de retenção, área e altura,

respectivamente.

53

Tabela 3: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e

altura das bandas cromatográficas avaliadas nas análises da amostra do látex do caule de H.

speciosa (precisão de injeção).

De acordo com a Tabela 4, os valores de DPR médios entre as análises do estudo

de repetibilidade foram de 0,04 a 0,28 % para o tempo de retenção; de 5,1 a 7,0 % para os

valores de área e por fim de 3,4 a 6,5 % para os valores de altura. Os valores obtidos na

avaliação da repetibilidade e precisão de injeção demonstraram que a variabilidade

instrumental e preparo de amostra apresentaram boa reprodutibilidade.


altura das bandas cromatográficas avaliadas nas análises de amostra de H. speciosa

(repetibilidade).

Banda 1º dia 2º dia 3º dia Média

DRP (%)

Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura

1 0,38 2,8 1,8 0,28 8,8 7,8 0,19 6,3 5,5 0,28 5,9 5,0

2 0,27 2,7 2,2 0,19 10,7 10,1 0,14 7,7 7,2 0,2 7,0 6,5

3 0,24 2,8 2,4 0,17 9,3 8,9 0,12 6,6 6,3 0,18 6,2 5,9

4 0,14 2,9 2,6 0,16 8,1 3,8 0,12 5,7 3,8 0,14 5,6 3,4

5 0,14 2,7 2,9 0,17 8,5 7,8 0,12 6,0 5,5 0,14 5,7 5,4

6 0,06 2,7 2,6 0,10 8,9 9,1 0,07 6,4 6,5 0,08 6,0 6,1

7 0,01 2,4 2,0 0,06 7,6 9,5 0,04 5,4 6,7 0,04 5,1 6,1

Banda Precisão da injeção

DPR (%)

Tr Área Altura

1 0,42 6,0 7,1

2 0,19 7,4 6,9

3 0,21 5,8 5,7

4 0,13 5,2 5,2

5 0,13 5,8 5,1

6 0,04 5,7 5,6

7 0,01 5,6 6,2

54

Para verificar a estabilidade das amostras do látex em termos de tempo (período

de permanência no auto-injetor) e temperatura (após ciclos de congelamento e

descongelamento), os resultados das soluções recém-preparadas foram comparados com os

resultados adquiridos após 24 e 48 h de permanência no auto-injetor bem como após três

ciclos de congelamento e descongelamento. A Tabela 5 sumariza os valores de DPR

encontrados. Como pode ser observado, somente as amostras que passaram por ciclos de

congelamento e descongelamento apresentaram valores de DPR maior que 15 % para os

valores de área e altura. Sendo assim, as soluções das amostras do látex do caule não foram

estocadas no congelador, sempre que preparadas eram colocadas no auto-injetor do

equipamento por um tempo de permanência máximo de 48 horas.


altura das bandas cromatográficas avaliadas nas análises de amostra de H. speciosa Gomes

(estabilidade).

Através dos experimentos de robustez, foram avaliados a influência da variação

do fluxo (0,8 e 1,2 mL/min), da porcentagem inicial do método cromatográfico (3 e 7 % de

acetonitrila), da porcentagem final do método cromatográfico (38 e 42 % de acetonitrila) e do

lote da fase estacionária, cujo resultados estão mostrados na Tabela 6. Admitiu-se que o

método se mantinha robusto para variação de DRP igual ou menor a 15% para cada parâmetro

avaliado. Dentro desse contexto o método se mostrou robusto frente à variação do fluxo de

1,2 mL/min, à variação na porcentagem final do método cromatográfico e à variação do lote

da coluna. Sendo assim, os demais parâmetros devem ser mantidos para o bom desempenho

do método desenvolvido.

Banda Estabilidade (24 h) Estabilidade (48 h) Estabilidade (Congelamento)

DPR (%)

Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura

1 0,0 3,7 5,5 0,7 5,8 0,5 0,5 27,5 34,8

2 0,2 7,4 5,2 1,0 9,8 8,9 1,1 29,9 32,1

3 0,2 5,1 8,0 0,8 7,3 8,2 0,8 28,3 27,1

4 0,1 5,5 4,7 0,5 6,0 5,6 0,6 29,1 29,0

5 0,1 6,4 5,9 0,5 9,1 7,7 0,6 25,6 27,2

6 0,0 5,9 5,0 0,1 7,1 6,4 0,1 29,0 29,6

7 0,0 13,0 8,3 0,2 6,8 8,7 0,3 28,7 27,7

55

Tabela 6: Valores de desvio padrão relativo entre os tempos de retenção, área e altura das bandas cromatográficas avaliadas nas

análises de amostra de H. speciosa (robustez).

* F = Fluxo, ** PI = Porcentagem inicial e *** PF = Porcentagem final

Banda *F (0,8 mL/min) *F (1,2 mL/min) **PI (3%) **PI (7%) ***PF (38%) ***PF(42%) LOTE

DPR (%)

Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura Tr Área Altura

1 15,7 23,9 11,0 13,3 4,4 10,0 22,8 8,5 13,8 16,5 8,3 14,3 0,17 8,3 10,5 0,4 10,2 10,2 2,2 8,3 4,4

2 15,1 26,3 18,5 12,3 1,8 0,1 19,9 12,7 14,7 18,5 3,4 8,9 0,17 11,8 9,9 0,0 12,2 13,8 1,5 2,3 14,1

3 14,8 23,6 15,1 12,1 4,6 2,4 19,7 8,8 7,4 18,7 4,1 4,3 0,27 8,3 6,6 0,1 8,5 8,1 1,6 5,4 12,1

4 8,8 18,2 20,0 6,8 3,6 3,3 9,7 7,4 8,9 11,5 5,1 6,2 1,9 8,2 5,4 1,6 6,3 9,5 1,0 0,3 15,0

5 8,5 23,4 21,8 6,6 6,4 5,4 9,3 7,6 9,0 11,1 8,5 7,2 1,9 7,2 5,0 1,7 7,6 10,2 0,9 1,6 14,8

6 5,6 22,8 20,3 4,3 2,3 1,6 5,4 10,0 10,3 6,6 10,8 7,1 9,8 9,8 6,3 2,5 9,4 10,2 0,5 7,3 12,7

7 3,9 25,0 21,3 3,0 2,7 3,9 2,8 8,7 10,6 3,4 7,4 5,4 8,9 8,9 4,9 2,9 10,3 10,9 0,3 8,0 6,3

56

5.3 – Aplicação do método analítico desenvolvido: análise das amostras

comerciais do látex do caule de H. speciosa

O método desenvolvido e validado foi utilizado para a obtenção de perfis

cromatográficos das amostras de látex de caule comercializados em feiras livres do estado de

Sergipe. As amostras foram denominadas com os seguintes códigos: LCA (látex proveniente

de Aracaju), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU

(látex adquirido em Umbaúba). Nas Figuras 11 e 12 estão apresentados os cromatogramas do

látex do caule da H. speciosa realizados em sextuplicata por DAD e pelo ELSD,

respectivamente. As sobreposições dos cromatogramas (n = 6), para cada amostra do látex do

caule, mostraram a adequada separação e a boa reprodutibilidade do método o que corrobora a

sua eficiência para a obtenção de fingerprint cromatográfico.

O látex do caule da mangabeira (LCP) adquirido em Pontal município de

Indiaroba-SE foi considerado padrão, uma vez que se tem convicção da sua originalidade. A

comparação visual do látex LCP com as amostras de látex comercializados (LCA, LCI, LCB

e LCU) permitiu a identificação de picos comuns em todas as amostras. No entanto, com

diferentes intensidades (Figura 13 e Figura 14). As diferenças entre os perfis

cromatográficos das amostras de látex do caule ficam mais acentuadas quando se observa pelo

DAD do que quando analisada pelo ELSD.

Embora haja diferença entre os perfis cromatográficos dos látex comercializados

e do látex considerado padrão, pode-se concluir que tais amostras são de fato provenientes da

mangabeira uma vez que possuem os picos majoritários encontrados no látex LCP.

57

LCI LCU

0 10 20 30 40 50

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

2,0x105

2,5x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

Figura 11: Cromatogramas sobrepostos (n = 6) de amostras de látex do caule de H. speciosa monitorados

pelo DAD (220 nm). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI (látex

obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba).

LCA LCB

LCP

57

58

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

mV

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

mV

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

mV

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

mV

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

mV

Tempo (min)


monitorados pelo ELSD. LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex adquirido em Pontal), LCI

(látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba).

LCA LCB

LCI LCU

LCP

58

59

LCB

0 10 20 30 40 50

0

1x105

2x105

3x105

4x105

5x105

6x105

7x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

LCP

LCI

LCU

LCA

Figura 13: Cromatogramas fingerprint das amostras de látex do caule de H. speciosa (HPLC-DAD). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex

adquirido em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba). Obs.: * Picos

presentes em todas as amostras do látex do caule.

*

*

*

*

*

59

60

LCB

Figura 14: Cromatogramas fingerprint das amostras de látex do caule de H. speciosa (HPLC-ELSD). LCA (látex proveniente de Aracaju), LCP (látex

adquirido em Pontal), LCI (látex obtido em Itabaiana), LCB (látex proveniente de Boquim) e LCU (látex adquirido em Umbaúba). Obs.: * Picos

presentes em todas as amostras do látex do caule.

0 10 20 30 40 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

1,2x106

mV

Tempo (min)

LCP

LCI

LCU

LCA

*

*

* *

61


Gomes

Uma vez obtido os cromatogramas fingerprint foi feito o isolamento dos

marcadores químicos do látex do caule da H. speciosa. Até o presente momento não há relatos

na literatura a respeito do isolamento de substâncias no látex do caule da mangabeira.

Para o isolamento empregou-se as condições cromatográficas baseadas naquelas

usadas para os cromatogramas fingerprint em escala semi-preparativa. A transferência do

método analítico para o semi-preparativo requereu o ajuste de alguns parâmetros. Esta

adaptação que tem por finalidade reproduzir em escala preparativa ou semi-preparativa os

resultados obtidos em escala analítica é chamada de escalonamento.[58]

Para o isolamento das bandas cromatográficas a amostra do látex do caule obtida

do município de Pontal foi selecionada. Nas análises em escala semi-preparativa utilizou-se

uma coluna com fase estacionária hexil-fenil LUNA®

(250 x 10 mm; Phenomenex) diferente

daquela empregada nas análises em escala analítica. A vazão utilizada foi 4,5 mL/min; este

valor foi encontrado aplicando a Equação 3. A Figura 15 mostra o cromatograma do látex

do caule em sistema semi-preparativo.

Equação 3:

Onde: S = fator de escalonamento, RP e RA são os diâmetros e LP e LA são os

comprimentos das colunas preparativa e analítica, respectivamente.

62

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

Ab

so

rbâ

ncia

(m

Ab

s)

Tempo (min)

Figura 15: Cromatograma (λ = 220 nm) do látex do caule de H. speciosa em

sistema semi-preparativo. Condições cromatográficas: item 4.7. Os picos coletados estão

indicados no cromatograma com as siglas HSG2 a HSG8.

As bandas cromatográficas coletadas durante o isolamento foram denominadas

HSG2 a HSG8 (conforme pode ser vista na Figura 15). No isolamento foi coletada a parte

central das bandas cromatográficas para aumentar o grau de pureza dos compostos isolados.

Os rendimentos para cada banda, após 11 injeções (1,120 g da amostra de látex), pode ser

visualizado na Tabela 7.

Tabela 7: Valores de massa e de rendimento obtido no isolamento dos

marcadores químicos usando 1,120 g do látex de caule.

Banda Cromatográfica Massa obtida (mg) Rendimento (% m/m)

HSG 2 8,0 0,7

HSG 3 17,6 1,6

HSG 4 3,6 0,32

HSG 5 8,9 0,8

HSG 6 5,3 0,5

HSG 7 0,7 0,06

HSG 8 0,7 0,06

HSG 2

HSG 3

HSG 4

HSG 5

HSG 6 HSG 7 HSG 8

63

Os compostos HSG 2 a HSG 8 foram reanalisados em escala analítica com o

objetivo de verificar o grau de pureza. Na Figura 16 pode-se observar a comparação entre os

tempos de retenção dos compostos isolados e do perfil cromatográfico do látex do caule de H.

speciosa enquanto que na Figura 17 os compostos purificados estão acompanhados com o

espectro de UV. Verificou-se um grau de pureza superior a 0,9999 para todos os compostos

isolados. Devido a baixa quantidade das amostras HSG 7 e HSG 8 somente as amostras HSG

2, HSG 3, HSG 4, HSG 5 e HSG 6 foram enviadas para análise por ressonância magnética

nuclear.

Figura 16: Perfil cromatográfico do látex do caule de H. speciosa acompanhado

dos compostos isolados em escala analítica (λ = 220 nm).

0 10 20 30 40 min0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

uV(x1,000,000)

Látex do caule

HSG 2

HSG 3

HSG 4

HSG 5

HSG 6

HSG 7

HSG 8

64

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

200 300 400 500 600 700 nm

0

500

1000

1500

2000mAU

230

324

623

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

2,0x106

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

200 300 400 500 600 700 nm

0

1000

2000

mAU

194

279

657

617

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

8,0x105

1,0x106

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

200 300 400 500 600 700 nm

0

500

1000

1500

2000mAU

217

315

492

718

200 300 400 500 600 700 nm

0

1000

2000

mAU

195

279

636

680

727

HSG 2 HSG 3

HSG 4 HSG 5

Figura 17: Cromatogramas (λ = 220 nm) das bandas cromatográficas HSG 2, HSG 3, HSG 4 e HSG5 purificadas no sistema semi-preparativo,

com seus respectivos espectros de absorção UV no tempo de retenção em que eluem. Condições de análise: item 4.5.1.

64

65

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

5,0x104

1,0x105

1,5x105

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

200 300 400 500 600 700 nm

0

50

100

150

200

mAU

206

281

512

617

727

200 300 400 500 600 700 nm

0

100

200

300

mAU

202

280

616

726

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0,0

2,0x105

4,0x105

6,0x105

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

0,0

2,0x104

4,0x104

6,0x104

Abso

rbânci

a (

mA

bs)

Tempo (min)

200 300 400 500 600 700 nm

0

500

1000

1500

mAU

196

228

279

366

476

HSG 6 HSG 7

HSG 8

Continuação da Figura 17

Figura 17: Cromatogramas (λ = 220 nm) das bandas cromatográficas HSG 6, HSG 7 e HSG 8 purificadas no sistema semi-preparativo, com

seus respectivos espectros de absorção UV no tempo de retenção em que eluem. Condições de análise: item 4.5.1.

65

66 ppm (t1)

0.01.73.35.06.78.310.0

7.0

37

2

7.0

32

8

7.0

28

1

7.0

12

2

7.0

07

4

7.0

02

8

6.1

36

1

6.1

33

8

6.1

29

0

6.1

23

9

6.1

22

6

6.1

13

7

6.1

12

3

6.1

08

4

6.1

03

5

6.1

01

4

6.0

98

7

4.9

05

5

4.2

22

6

4.2

03

1

4.0

23

7

4.0

07

3

3.9

98

5

3.9

90

8

3.9

82

0

3.9

65

5

3.8

63

5

3.8

58

9

3.8

32

1

3.8

29

8

3.6

65

7

3.6

53

0

3.6

37

4

3.6

28

5

3.6

22

0

3.6

12

3

3.5

96

1

3.3

25

5

3.3

12

9

3.3

08

9

3.3

04

8

3.3

00

8

3.2

96

7

3.2

80

1

3.2

56

6

3.2

50

7

3.2

40

3

3.2

38

0

3.2

34

5

3.1

54

4

3.1

34

7

3.1

32

03

.11

23

2.0

60

92

.04

46

2.0

28

30

.00

00

2.0

0

2.1

9

1.0

1

1.0

51

.36

2.8

3

1.5

62

.87

2.3

7

5.5 – Identificação dos marcadores químicos

A partir das análises por HPLC-DAD semi-preparativo foi possível o isolamento

de 5 bandas cromatográficas denominadas (HSG 2, HSG 3, HSG 4, HSG 5 e HSG 6). Até o

momento, foram identificados dois ciclohexiletanóides glicosilados cornosídeo (HSG 2) e

dihidrocornosídeo (HSG 3) e uma 8-O-4’-neolignana glicosilada (HSG 6). A determinação

estrutural das substâncias foram baseadas nos dados espectrais de RMN 1D (1H e

13C ) e 2D

(HMBC e HSQC).

5.5.1 – Identificação e determinação estrutural HSG 2

A banda cromatográfica HSG 2 (tR = 6,8 min ; 8,0 mg) apresentou-se como óleo

marrom. Pela análise do espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) (Figuras 18-24),

verificou-se a presença de sinais de olefina em δ 7,01 (2H, d) e δ 6,11 (2H, d). A porção

glicose foi confirmada pelo sinal relativo à posição anomérica em δ 4,21 (1H, d), além de

outros sinais relativos aos grupos metinos e metilenos oxigenados em δ 3,92- δ 3,53. Além

destes, um sinal de grupo metileno oxigenado em δ 3,99 (1H, dt) e δ 3,63 (1H, dt) e um sinal

de grupo metileno em δ 2,04 (2H, t) também foram observados indicando a presença de um

grupo etila oxigenado.

ppm (f1)

6.9907.0007.0107.0207.0307.0407.0507.060

7.0

37

2

7.0

32

8

7.0

28

1

7.0

12

2

7.0

07

4

7.0

02

8

2.0

0

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

Figura 18: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

67

ppm (f1)

6.1006.150

6.1

36

1

6.1

33

8

6.1

29

0

6.1

23

9

6.1

22

6

6.1

13

7

6.1

12

3

6.1

08

4

6.1

03

5

6.1

01

4

6.0

98

7

2.1

9


MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

ppm (f1)

6.9907.0007.0107.0207.0307.0407.0507.060

7.0

37

2

7.0

32

8

7.0

28

1

7.0

12

2

7.0

07

4

7.0

02

8

2.0

0



O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

68

ppm (f1)

3.9504.0004.0504.1004.1504.2004.250

4.2

22

6

4.2

03

1

4.0

23

7

4.0

07

3

3.9

98

5

3.9

90

8

3.9

82

0

3.9

65

5

1.0

1

1.0

5

ppm (f1)

3.6003.6503.7003.7503.8003.8503.900

3.8

63

5

3.8

58

9

3.8

32

1

3.8

29

8

3.6

65

7

3.6

53

0

3.6

37

4

3.6

28

5

3.6

22

0

3.6

12

3

3.5

96

1

1.3

6

2.8

3




CD3OD) da amostra HSG 2.

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

69

A análise do espectro de RMN 13

C (100 MHz, CD3OD) (Figura 24) mostrou a

presença de 14 sinais, consistindo de um sinal em δ 186,6 típico de cetona α, β -insaturada

confirmado pelos sinais das duas olefinas em δ 153,1 e δ 153,0 e δ 126,6 e δ 126,5, além de

seis sinais característicos de unidade de glicose (δ 104,33, 75,09, 78,00, 71,64, 78,12 e 62,77).

ppm (t1)

2.0202.0302.0402.0502.0602.070

2.0

60

9

2.0

44

6

2.0

28

3

2.3

7

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

Figura 23: Ampliação da região entre 2,012-2,080 ppm do espectro de RMN de 1H

(400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

70

As corretas atribuições dos sinais relativos à unidade glicose e a posição da ligação

glicosídica foram feitas através dos mapas de correlação HMBC e HSQC (Figuras 25-28),

sendo que a posição anomérica δ 4,21 (H-1’) correlaciona a 3J com o sinal do carbono em δ

65,75 e a 2J com o sinal do carbono em δ 75,09 (C-2’).

ppm (f1)

0255075100125150175200

18

8.0

28

15

4.5

73

15

4.4

76

12

8.0

03

12

7.9

54

10

4.3

31

78

.12

3

77

.99

9

75

.09

3

71

.64

0

69

.32

7

65

.75

1

62

.77

5

49

.47

6

49

.26

3

49

.05

0

48

.83

7

48

.62

4

41

.06

9

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6


C (100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

Figura 25: Mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

71

Figura 26: Ampliações do mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

72

Figura 27: Mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 2.

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

Figura 28: Ampliações do mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD)

da amostra HSG 2.

73

A substância AHS-2 foi, portanto, identificada como sendo o ciclohexiletanóide

glicosilado cornosídeo (Figura 29) através de comparação com os dados espectrais da

literatura Tabela 8.[114]

Este é o primeiro relato do isolamento deste composto em H. speciosa

e, em Apocynaceae, foi encontrado apenas no látex de Parahancornia amapa.[115]

Figura 28: Ampliações do mapa de correlação HMQC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD)

da amostra HSG 2. (continuação)

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

34

7

8

1' 2'3'

4'5'

6'

5

6

Figura 29: Estrutura química do ciclohexiletanóide glicosilado cornosídeo (HSG 2)

74



(cornosídeo) em comparação com dados da literatura[114]

.

Posição AHS-2

Cornosídeo114

1H δ (mult., J em Hz)

13C δ


13C δ

1 - 69,33 (C0) - 69,2

2 7,02 (1H, dt, 10,2 e 1,8) 154,57 (CH) 7,01 (1H, d, 9,6Hz) 154,4

3 6,12 (1H, dtl, 8,2 e 1,9) 128,00 (CH) 6,11 (1H, d, 9,6Hz) 127,8

4 - 188, 03 (C0) - 187,8

5 6,12 (1H, dtl, 8,2) 127,95 (CH) 6,11 (1H, d, 9,6Hz) 127,8

6 7,02 (1H, dt, 10,2 e 1,8) 154,48 (CH) 7,01 (1H, d, 9,6 Hz) 154,3

7 2,04 (2H, t, 6,5) 41,07 (CH2) 2,04 (2H, t, 6,4 Hz) 41,0

8 3,99 (1H, dt, 10,1 e 6,4) e

3,60-3,67 (1H, m)

65,75 (CH2) 3,99 (1H, dt, 10,0 e 6,4 Hz) e

3,63 (1H, dt, 10,0 e 6,4Hz)

65,7

1’ 4,21 (1H, d, 7,8) 104,33 (CH) 4,21 (1H, d, 7,6 Hz) 104,2

2’ 3,13 (1H, dd, 9,0 e 7,9) 75,09 (CH) - 75,0

3’

3,24-3,33 (3H, m)

78,00 (CH) - 77,9

4’ 71,64 (CH) - 71,6

5’ 78,12 (CH) - 78,0

6’ 3,85 (1H, ddl, 12,1 e 1,4)

e 3,64 (1H, m)

62,77 (CH2) - 62,7

* sinais em sobreposição com sinal do solvente (CD3OD).

75

5.5.2 – Identificação e determinação estrutural HSG-3

A banda cromatográfica HSG 3 (tR= 7,5 min ; 17,6 mg) apresentou-se como óleo marrom. A

análise do espectro de RMN 13

C (100 MHz, CD3OD) mostrou 14 sinais, consistindo de um sinal em

δ 188,03 típico de cetona α, β-insaturada confirmado pelos sinais da olefina em δ 154,57 e δ 128,0

ppm.

A comparação dos dados de RMN com aqueles de HSG 2 (Figuras 30-33, Tabela 9) sugere

que HSG-3 possui estrutura similar, com a principal diferença sendo a observação de sinais de dois

CH2 a mais (δ C 35, 43 (CH2-5) e 36,21 ppm (CH2-6). Além disso, pela análise HMBC (Figura 34)

foi visível as correlações entre H-1” com C-8 e entre C-4 com H-7 confirmando a posição dos

substituintes no ciclohexiletanóide.

ppm (f1)

0.01.73.35.06.78.310.0

6.9

80

96

.97

90

6.9

55

36

.95

34

5.8

74

25

.84

87

4.2

89

24

.26

97

4.1

77

74

.16

13

4.1

52

6

4.1

45

44

.13

62

4.1

20

3

3.8

86

9

3.8

83

63

.85

80

3.8

53

7

3.8

01

03

.79

33

3.7

85

1

3.7

75

9

3.7

68

9

3.7

60

0

3.7

43

8

3.6

72

8

3.6

66

0

3.6

58

9

3.6

43

1

3.6

34

1

3.6

29

4

3.3

77

4

3.3

68

9

3.3

65

3

3.3

46

6

3.3

44

5

3.3

24

0

3.3

13

6

3.3

09

5

3.3

05

4

3.3

01

3

3.2

97

3

3.2

72

7

3.2

67

9

3.2

61

4

3.2

56

4

3.2

53

0

3.1

75

7

3.1

56

1

3.1

53

0

3.1

33

4

2.5

89

4

2.5

75

3

2.5

59

5

2.5

46

1

2.5

31

2

2.5

16

5

2.5

04

2

2.4

92

5

2.4

80

0

2.4

73

6

2.4

60

7

2.4

49

1

2.4

36

7

2.2

66

1

2.2

63

5

2.2

53

92

.25

06

2.2

47

22

.23

33

2.2

30

12

.22

01

2.2

17

12

.20

42

2.2

01

52

.10

37

2.0

87

82

.07

32

2.0

67

42

.06

43

2.0

51

52

.04

10

2.0

35

82

.03

07

2.0

16

31

.99

99

1.9

83

61

.98

06

1.9

63

81

.94

76

1.9

21

81

.90

53

1.8

88

80

.00

00

1.0

0

0.9

5

1.2

71

.37

1.5

61

.63

1.5

9

8.6

71

.60

2.7

8

1.5

0

5.2

7

Figura 30: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 3.

1 2

345

6

7

8

1'2'

3'

4'5'

6'

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

76

ppm (f1)

6.9406.9506.9606.9706.9806.990

6.9

80

9

6.9

79

0

6.9

55

3

6.9

53

4

1.0

0

ppm (f1)

5.8505.900

5.8

74

2

5.8

48

7

0.9

5

ppm (f1)

4.1004.1504.2004.2504.300

4.2

89

2

4.2

69

7

4.1

77

7

4.1

61

3

4.1

52

6

4.1

45

4

4.1

36

2

4.1

20

3

1.2

7

1.3

7



77

ppm (f1)

3.6003.6503.7003.7503.8003.8503.900

3.8

86

9

3.8

83

6

3.8

58

0

3.8

53

7

3.8

01

0

3.7

93

3

3.7

85

1

3.7

75

9

3.7

68

9

3.7

60

0

3.7

43

8

3.6

72

8

3.6

66

0

3.6

58

9

3.6

43

1

3.6

34

1

3.6

29

4

1.5

6

1.6

3

1.5

9

ppm (f1)

3.1003.1503.2003.2503.3003.3503.400

3.3

77

4

3.3

68

9

3.3

65

3

3.3

46

6

3.3

44

5

3.3

24

0

3.3

13

6

3.3

09

5

3.3

05

4

3.3

01

3

3.2

97

3

3.2

72

7

3.2

67

9

3.2

61

4

3.2

56

4

3.2

53

0

3.1

75

7

3.1

56

1

3.1

53

0

3.1

33

4

8.6

7

1.6

0

ppm (f1)

2.4502.5002.5502.600

2.5

89

4

2.5

75

3

2.5

59

5

2.5

46

1

2.5

31

2

2.5

16

5

2.5

04

2

2.4

92

5

2.4

80

0

2.4

73

6

2.4

60

7

2.4

49

1

2.4

36

7

2.7

8



78

ppm (t1)

050100150200

20

1.9

8

15

7.1

4

12

8.5

0

10

4.3

6

78

.15

78

.02

75

.10

71

.69

70

.36

66

.38

62

.81

49

.69

49

.48

49

.26

49

.05

48

.84

48

.62

48

.41

40

.09

36

.21

35

.43



1 2

345

6

7

8

1'2'

3'

4'5'

6'

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

1 2

345

6

7

8

1'2'

3'

4'5'

6'

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

Figura 34: Mapa de correlação HMBC (1H a 400 MHz;

13C a 100 MHz, CD3OD) da amostra

HSG 3.

79



(dihidrocornosídeo) em comparação com dados da literatura.[116,117]

Posição AHS-3

Dihidrocornosídeo116,117


13C δ


13C δ

1 - 70,36 (C0) - 68,9

2 6,97 (1H, dd, 9,5 e 0,8) 157,14 (CH) 6,96 (1H, dd, 10,0 e 1,0) 155,9

3 5,86 (1H, d, 10,2) 128,50 (CH) 5,86 (1H, d, 10,0) 127,6

4 - 201,98 (C0) - 198,8

5 2,52 (2H, m) 35,43 (CH2) 2,47 (1H, ddd, 17,0, 11,5 e 5,0) e

2,55 (1H, ddd, 17,0 , 6,5 e 5,0)

35,1

6 2,20-2,27 (1H, m) e 2,03-

2,10 (1H, m)

36,21 (CH2) 2,19-2,26 (1H, m) e 1,95-2,05

(1H, m)

36,2

7 1,89-2,10 (2H, m) 40,09 (CH2) 2,025-2,103 (2H, m) 40,0

8 4,15 (1H, dt, 10,0 e 6,6) e

3,77 (1H, dt, 10,0 e 6,6)

66,38 (CH2) 4,14 (1H, dt, 10,0 e 6,0) e 3,77

(1H, dt, 10,0 e 6,0)

65,9

1’ 4,28 (1H, d, 7,8) 104,36 (CH) 4,28 (1H, d, 7,5) 104,6

2’ 3,15 (1H, dd, 9,1 e 7,8) 75,10 (CH) 3,15 (1H, dd, 9,0 e 7,5) 75,0

3’ 3,25-3,38 (3H, m) 78,15 (CH) - 78,5

4’ 71,69 (CH) - 71,6

5’ 78,02 (CH) 3,64 (3H, m, H-5’ e H-6’a) 78,4

6’ 3,87 (1H, dd, 11,8 e 1,5) e

3,65 (1H, m)

62,81 (CH2) 3,86 (2H, ddl, 12,0 e ca. 1,0) e

3,64 (3H, m)

62,6

* sinais em sobreposição com sinais do solvente (CD3OD).

80

A substância HSG-3 foi, portanto, identificada como sendo o ciclohexiletanóide

glicosilado dihidrocornosídeo (Figura 35) através de comparação com os dados espectrais da

literatura.[116,117]

Este é o primeiro relato do isolamento deste composto em Apocynaceae.

Figura 35: Estrutura química do ciclohexiletanóide glicosilado dihidrocornosídeo (HSG 3)

5.5.3 – Identificação e determinação estrutural HSG 6

A banda cromatográfica HSG 6 (tR = 30,2 min, 5,3 mg) apresentou-se como óleo marrom. A

análise do espectro de RMN de 1H (CD3OD) de HSG 6 ( Figuras 36-39) mostrou a presença de seis

hidrogênios aromáticos [δ 7,08 (1H, d, 1,7), 6,89 (1H, d, 8,1), 6,74 (1H, d, 8,1), 6,84 (1H, d, 1,7),

6,90 (1H, d, 8,2), 6,69 (1H, dd, 8,2 e 1,8)] revelando dois sistemas de hidrogênios 1,3,4-

trissubstituídos de dois anéis aromáticos. Além destes, foi possível verificar a presença de duas

metoxilas em δ 3,85 (s) e 3,82 (s), dois hidrogênios metilênicos [δ 1,80 (quintl, 7,1 Hz), 2,61 (tl,

7,7Hz, H-7’)], dois hidrogênios metínicos [δ 5,05 (1H, d, 5,4), 4,42 (1H, q, 5,0)], além de um

hidrogênio anomérico referente à glicose em δ 4,55 (d, 7,7 Hz, H-1”).

1 2

345

6

7

8

1'2'

3'

4'5'

6'

O

HO OO

HO

OH

OH

OH

81

ppm (f1)

0.01.73.35.06.78.310.0

7.0

80

57

.07

63

6.9

10

7

6.9

04

4

6.8

90

2

6.8

84

2

6.8

40

9

6.8

36

6

6.7

50

9

6.7

30

6

6.7

00

7

6.6

96

3

6.6

80

2

6.6

75

9

5.0

55

7

5.0

42

2

4.5

64

0

4.5

44

8

4.4

43

4

4.4

30

9

4.4

18

3

4.4

05

8

3.8

48

6

3.8

24

2

3.7

99

8

3.7

88

7

3.7

70

3

3.7

59

1

3.7

23

5

3.7

17

6

3.6

93

7

3.6

88

0

3.5

96

8

3.5

83

8

3.5

66

9

3.5

50

7

3.5

34

4

3.4

46

9

3.4

33

9

3.4

17

2

3.4

04

3

3.3

85

1

3.3

62

9

3.3

45

5

3.3

40

7

3.3

14

7

3.3

10

9

3.3

06

8

3.3

02

8

3.2

98

8

3.2

90

5

3.2

77

7

3.2

68

0

3.2

55

1

3.1

81

2

3.1

75

4

3.1

68

33

.16

22

3.1

58

13

.15

17

3.1

44

53

.13

86

2.6

31

32

.61

26

2.5

93

01

.83

74

1.8

21

21

.80

13

1.7

83

11

.76

67

0.0

00

0

1.0

0

2.0

10

.97

1.0

20

.97

0.8

1

0.9

10

.94

6.1

71

.25

1.1

13

.19

2.4

91

.03

0.9

7

2.0

3

2.0

7

Figura 36: Espectro de RMN de 1H (400 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6

ppm (f1)

6.7006.7506.8006.8506.9006.9507.0007.0507.100

7.0

80

5

7.0

76

3

6.9

10

7

6.9

04

4

6.8

90

2

6.8

84

2

6.8

40

9

6.8

36

6

6.7

50

9

6.7

30

6

6.7

00

7

6.6

96

3

6.6

80

2

6.6

75

9

1.0

0

2.0

1

0.9

7

1.0

2

0.9

7



O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

82

ppm (f1)

4.404.504.604.704.804.905.00

5.0

55

7

5.0

42

2

4.5

64

0

4.5

44

8

4.4

43

4

4.4

30

9

4.4

18

3

4.4

05

8

0.8

1

0.9

1

0.9

4


MHz, CD3OD) da amostra HSG 6

ppm (f1)

3.203.303.403.503.603.703.80

3.8

48

6

3.8

24

2

3.7

99

8

3.7

88

7

3.7

70

3

3.7

59

1

3.7

23

5

3.7

17

6

3.6

93

7

3.6

88

0

3.5

96

8

3.5

83

8

3.5

66

9

3.5

50

7

3.5

34

4

3.4

46

9

3.4

33

9

3.4

17

2

3.4

04

3

3.3

85

1

3.3

62

9

3.3

45

5

3.3

40

7

3.3

14

7

3.3

10

9

3.3

06

8

3.3

02

8

3.2

98

8

3.2

90

5

3.2

77

7

3.2

68

0

3.2

55

1

3.1

81

2

3.1

75

4

3.1

68

3

3.1

62

2

3.1

58

1

3.1

51

7

3.1

44

53

.13

86

6.1

7

1.2

5

1.1

1

3.1

9

2.4

9

1.0

3

0.9

7


MHz, CD3OD) da amostra HSG 6

O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

83

Com a observação do espectro de RMN de 13

C (CD3OD) de HSG 6 (Figuras 40 e

41) foi possível verificar 26 sinais de carbono, incluindo dois carbonos de metoxila em δ

56,48 e 56,44, 18 carbonos das duas unidades fenilpropanóide (um grupo guaiacil e outro

dihidroconiferil) formando a neolignana, além de seis carbonos da porção O-glicose (δ

104,80, 77,75, 77,87, 71,47, 78,02 e 62,59).

ppm (f1)

050100150200

15

1.4

8

14

8.6

5

14

7.2

5

14

7.2

3

13

7.9

4

13

1.9

0

12

1.8

9

12

1.3

8

11

8.6

9

11

5.6

5

11

3.9

1

11

2.6

3

10

4.8

0

85

.55

81

.46

78

.01

77

.87

75

.75

71

.47

62

.59

62

.23

61

.46

56

.48

56

.44

49

.69

49

.48

49

.26

49

.05

48

.84

48

.62

48

.41

35

.58

32

.72



O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

84

A partir do mapa de correlação HSQC (Figuras 42 e 43) obtido foi possível atribuir os

sinais de carbono ao sinal dos hidrogênios correspondentes. Posteriormente, a estrutura parcial de

HSG 6 foi confirmada a partir do mapa de correlação HMBC (Figuras 44 e 45). As correlações no

mapa de correlação HMBC de H-7 com C-1, C-2, C-6, C-8, C-9 e C-1”; de H-2’/6’ com C-1’, C-

3’/5’, C-4’ e C-7’; de OMe-3/3’ com C-3/3’, junto com seus deslocamentos, confirmaram a posição

dos substituintes e a ligação 8-O-4’em AHS 6. As correlações do hidrogênio anomérico H-1” com

C-7 em δ 81,46 ppm e H-7 com C-1” em δ 104.80 pelo HMBC, indicando a posição da ligação com

a unidade glicose em C-7. A ligação glicosídica foi determinada ser do tipo δ devido ao maior valor

da constante de acoplamento do dupleto referente H-1” em δ 4,55 (J=7,7 Hz).[118]

ppm (f1)

60.065.070.075.080.085.0

85

.55

81

.46

78

.01

77

.87

75

.75

71

.47

62

.59

62

.23

61

.46

56

.48

56

.44

Figura 41: Ampliação da região entre 56,0 e 87,0 ppm do espectro de RMN de 13

C (100


O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

85

Figura 42: Mapa de correlação HSQC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6.


13C: 100 MHz,


O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

86

Figura 44: Mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz, 13C: 100 MHz, CD3OD) da amostra HSG 6.

Figura 45: Ampliações do mapa de correlação HMBC (1H: 400 MHz,

13C: 100 MHz,


O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

87

A substância AHS 6 foi, portanto, identificada como sendo uma 8,4’-O-neolignana

(Figura 46) através de comparação com os dados espectrais da literatura (Tabela 10).[118,119]

Este é

o primeiro relato do isolamento deste composto em Apocynaceae.

O OH

O

OH

OCH3

CH3O

OH

O

OH

HOHO

OH

1

2

34

5

6

78

9

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

1"

2"

3"

4" 5"

6"

Figura 46: Estrutura química da (7,8)-treo-4,7,9,9’-tetrahidroxi-3,3’-dimetoxi- 8-O-4’-

neolignana-7-O-β-D-glicopiranosídeo (HSG 6)

88


13C (100 MHz) em CD3OD da HSG 6 em

comparação com dados da literatura.[118]

Posição AHS 6

(7,8)-treo-4,7,9,9’-tetrahidroxi-3,3’-

dimetoxi- 8-O-4’-neolignana-7-O-β-D-

glicopiranosídeo 118,119


13C δ


13C δ

1 - 131,90 (C0) - 131,9 (C-1)

2 7,08 (1H, d, 1,7) 112,63 (CH) 7,08 (1H, d, 1,8) 112,6 (C-2)

3 - 148,65 (C0) - 148,6 (C-3)

4 - 147,23 (C0) - 147,3 (C-4)

5 6,74 (1H, d, 8,1) 115,65(CH) 6,74 (1H, d, 8,0) 115,6 (C-5)

6 6,89 (1H, d, 8,1) 121,38 (CH) 6,89 (1H, dd, 8,0 e 1,8) 121,4 (C-6)

7 5,05 (1H, d, 5,4) 81,46 (CH) 5,05 (1H, d, 5,1) 81,5 (C-7)

8 4,42 (1H, q, 5,0) 85,55(CH) 4,42 (1H, m) 85,5 (C-8)

9 3,78 (1H, dd, 11,8 e 4,4)

e 3,43 (1H, dd, 11,9 e

5,2)

61,46(CH2) 3,87 (1H, dd, 13 e 6) e

3,55 (1H, dd, 13 e 6)[119]

61,5 (C-9)

1’ - 137,94 (C0) - 137,9 (C-1’)

2’ 6,84 (1H, d, 1,7) 113,91(CH) 6,84 (1H, d, 1,8) 113,9 (C-2’)

3’ - 151,48 (C0) - 151,5 (C-3’)

4’ - 147,25 (C0) - 147,3 (C-4’)

5’ 6,90 (1H, d, 8,2) 118,69 (CH) 6,90 (1H, d, 8,0) 118,7 (C-5’)

6’ 6,69 (1H, dd, 8,2 e 1,8) 121,89 (CH) 6,69 (1H, dd, 8,0 e 1,8) 121,9 (C-6’)

7’ 2,61 (2H, tl, 7,7) 32,72(CH2) 2,61 (2H, t) 32,7 (C-7’)

8’ 1,80 (2H, quintl, 7,1) 35,58 (CH2) 1,80 (2H, m) 35,6 (C-8’)

9’ 3,55 (2H, t, 6,5) 62,23 (CH2) 3,55 (2H, t) 62,2 (C-9’)

1” 4,55 (1H, d, 7,7) 104,80 (CH) 4,55 (1H, d, 7,6) 104,8 (C-1’’)

2” 3,26-3,32 (1H, m)* 75,75(CH) 3,21 (1H, dd, 9 e 8) [119]

75,7 (C-2”)

3” 3,26-3,39 (3H, m)* e

3,14-3,18 (1H, m)

77,87(CH)

3,35-3,10 (3H, m) [119]

77,9 (C-3”)

4” 3,26-3,39 (3H, m)* 71,47(CH) 71,5 (C-4”)

5” 3,26-3,39 (3H, m)* e

3,14-3,18 (1H, m)

78,02 (CH) 78.0 (C-5”)

6” 3,71 (1H, dd, 11,9 e 2,3)

e 3,59 (1H, d, 5,2)

62,59(CH2) 3,83 (1H, dd, 12 e 2) e

3,68(1H, dd, 12 e 6) [119]

62,6 (C-6”)

OCH3-3’ 3,85 (3H, s) 56,48 3,85 (3H, s) 56,5

OCH3-3 3,82 (3H, s) 56,44 3,82 (3H, s) 56,4

* sinais em sobreposição com sinais do solvente (CD3OD).

89

5.6 – Otimização das condições cromatográficas de análise: látex dos frutos

de H. speciosa

As substâncias isoladas do extrato clorofórmio do látex dos frutos da mangabeira

(mistura de ésteres 3-β-O-acil lupeol (2, 4, 8-11), lupeol (14) e éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol (15)) previamente isolados pela MSc. Taís Sampaio[86]

foram utilizadas como

marcadores químicos do látex dos frutos de H. speciosa. Um método cromatográfico foi

desenvolvido para a identificação destas substâncias nas diferentes amostras do látex desta

espécie.

A análise de triterpenos pentacíclicos por HPLC utilizando UV, DAD, ELSD e

MS como detector é descrito na literatura.[120-125]

Entre os métodos disponíveis foi

selecionado a metodologia proposta por Martelanc e colaboradores como base para o

desenvolvimento do método. No trabalho em questão, os pesquisadores avaliaram a presença

de lupeol, α-amirina e β-amirina por HPLC-UV. As condições utilizadas foram: coluna

Hypersil BDS C18 (250 mm x 3 mm, 3µm ), temperatura ambiente, 100% de acetonitrila

como fase móvel, volume de injeção: 20 µL, fluxo de 0,8 mL/min e o tempo da corrida de 30

min. O comprimento de onda escolhido para obtenção dos cromatogramas foi 200 nm. As

amostras foram dissolvidas em n-propanol.[121]

90

Baseado nas condições citadas acima foi feita análise da mistura de lupeol, α-

amirina e β-amirina. Como não se tinha disponível no laboratório a coluna Hypersil BDS

C18, foi realizada a análise com a coluna Microsorb MV100-5C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 µm,

(VARIAN); sendo que as demais condições foram mantidas. O cromatograma pode ser

visualizado na Figura 47.

Figura 47: Cromatograma obtido a partir das seguintes condições: coluna Microsorb MV100-

5C18, modo isocrático 100% de ACN por 30 min em um fluxo de 0,8mL/min, volume de

injeção 20µL, λ = 200 nm.

Com pode ser observado não houve reprodução do método[121]

, fato esse que pode

ser explicado em virtude das alterações realizadas no método. As substâncias apresentaram

bastante afinidade com a fase móvel eluindo na parte inicial do cromatograma. Para diminuir

tal afinidade a porcentagem do solvente orgânico foi reduzida, inicialmente, para 85%

(Análise 1 da Tabela 11) e em seguida para 80% (Análise 2 da Tabela 11). O resultado pode

ser visto na Figura 48.

91

Tabela 11: Condições cromatográficas avaliadas na otimização do método para análise do

látex dos frutos da H. speciosa, com detecção em 220 nm, volume de injeção de 20 µL e

vazão de 0,8 mL/min.

Análise Gradiente de eluição Fase móvel Fase estacionária

1

85% (B) por 30 min

H2O (A):ACN (B)

Microsorb MV100-5C18

(5 µm, 250 mm x 4,6 mm)

2

80 % (B) por 30 min

H2O (A):ACN (B)

Microsorb MV100-5C18

(5 µm, 250 mm x 4,6 mm)

3

100% (B) por 30 min

H2O (A):ACN (B)

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

4

90% (B) por 30 min

H2O (A):ACN (B)

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

5

86-90% (B) por 10 min; 90-100% (B)

por 30 min; 100-86% (B) por 5 min e

86% (B) por 15 min.

H2O (A):ACN (B)

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

6

80-90% (B) por 30 min; 90-100% (B)

por 30 min; 100-86% (B) por 5 min;

86% (B) por 15 min; 86-80% (B) por 5

min e 80% (B) por 5 min.

H2O (A):ACN (B)

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

7

70-90% (B) por 30 min; 90-100% (B)

por 30 min; 100-86% (B) por 15 min;

86-70% (B) por 10 min e 70% (B) por 5

min.

H2O (A):ACN (B)

Hexil-fenil Luna

(10 µm, 150 x 4,6 mm)

92


Microsorb MV100-5 C18, fluxo de 0,8 mL/min, volume de injeção 20 µL: (Análise 1) modo

isocrático 85% de ACN:H2O, (Análise 2) modo isocrático 80% de ACN:H2O ambos por 30

min.

A baixa seletividade e retenção observadas nas análises cromatográficas empregando a

coluna Microsorb MV100-5C18 nos levou a testar a fase estacionária hexil-fenil LUNA ®

(150

mm x 4,6 mm, 10 µm), mantendo em um primeiro momento a fase móvel 100 % de ACN

(Análise 3) e depois modificando para 90% de ACN:H2O (Análise 4). Os respectivos

cromatogramas podem ser vistos na Figura 49.

(A)

(B)

Análise 1

Análise 2

93


hexil-fenil LUNA, fluxo de 0,8 mL/min, volume de injeção 20µL: (Análise 3) modo

isocrático 100% de ACN:H2O, (Análise 4) modo isocrático 90 % de ACN:H2O ambos por 30

min.

Mediante a aparente separação da mistura de lupeol, α-amirina e β-amirina,

usando a fase estacionária hexil-fenil e fase móvel 90% de ACN:H2O, foi feita a injeção do

extrato diclorometano do látex dos frutos bem como dos demais marcadores químicos: lupeol,

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol e mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol. Os cromatogramas

podem ser visualizados na Figura 50.

Análise 3

Análise 4

94

O método se mostrou eficiente para a detecção do lupeol (Figura 50A). No

entanto, para os ésteres e o extrato do látex dos frutos, foi observado o alargamento dos picos

possivelmente em consequência da interação excessiva com a fase estacionária (Figura 50B-

D).


hexil-fenil LUNA®, modo isocrático 90 % de ACN:H2O, fluxo de 0,8mL/min, volume de

injeção 20µL: (A) lupeol; (B) mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol; (C) éster diidroxilado 3-

β-O-acil lupeol e (D) extrato diclorometano do látex dos frutos de H. speciosa.

(A) (B)

(C) (D)

95

A partir dos resultados discutidos acima foi feita a opção pelo método gradiente

ao invés do isocrático. Utilizando o extrato diclorometano do látex dos frutos foram testados

três sistemas (Análises 5 a 7) em gradiente conforme a descrição da Tabela 11. Os

cromatogramas destes experimentos são apresentados na Figura 51.

Figura 51: Cromatogramas (λ = 200 nm) para a seleção de condições para análise do látex

dos frutos de H. speciosa Gomes em HPLC-DAD obtidos a partir das condições de análise (5-

7) descritas na Tabela 11.

Análise 5 Análise 6

Análise 7

96

Tendo em vista os objetivos do presente trabalho, a condição de análise 5

proporcionou a melhor resposta com uma boa separação entre os picos de interesse em menor

tempo. O comprimento de onda foi escolhido baseado na projeção tridimensional obtido por

HPLC-DAD da amostra do látex dos frutos (Figura 52). A análise do cromatograma 3D

mostrou que 200 nm proporcionou a detecção adequada da maioria dos picos de interesse.

Figura 52: Projeção tridimensional obtido por HPLC-DAD da amostra do látex dos frutos de

H. speciosa.

Para avaliar a presença das substâncias de interesse no látex dos frutos, os

marcadores químicos foram analisados na condição de análise 5. Como pode ser visto na

Figura 53A, os tempos de retenção dos triterpenos são compatíveis com os picos do

cromatograma do extrato do látex dos frutos da mangabeira. Além das análises por DAD, o

extrato do látex dos frutos verdes de H. speciosa também foi analisado por ELSD. Ao se

comparar os cromatogramas obtidos com os dois detectores, foi observado um perfil

cromatográfico similar, destacando-se a maior sensibilidade do detector ELSD para a amostra

analisada (Figura 53B).

97

0 10 20 30 40 50 min0

250000

500000

750000

1000000

1250000

uV

Figura 53: (A) Perfis cromatográficos monitorado com o DAD (λ = 200 nm): extrato

diclorometano do látex dos frutos (preto); marcadores químicos: éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol (vermelho), mistura de ésteres 3- β-O-acil lupeol (azul), e lupeol (magenta); (B) Perfil

cromatográfico do látex dos frutos de H. speciosa monitorado pelo DAD (preto) e pelo ELSD

(vermelho)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

450000

500000

550000

600000

uV

(A)

(B)

98

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

225000

250000

uV

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min0

25000

50000

75000

100000

125000

uV

Além da análise do extrato diclorometano, foram investigadas as amostras do látex

liofilizado e de uma polpa comercial. Os cromatogramas monitorados pelo DAD e pelo ELSD

são mostrados na Figura 54. Os picos característicos dos marcadores químicos podem ser

notados tanto na polpa quanto no látex liofilizado.

Figura 54: Cromatogramas obtidos por DAD (λ = 200 nm): (A) extrato diclorometano do

látex dos frutos de mangaba (preto), látex dos frutos de mangaba liofilizado (vermelho) e

polpa de mangaba comercial (azul); (B) Cromatogramas obtidos por ELSD: extrato

diclorometano do látex dos frutos (magenta), látex dos frutos liofilizado (verde) e polpa

comercial (azul).

(A)

(B)

99

A identificação dos marcadores químicos nas amostras de H. speciosa através das

condições otimizadas corrobora a seletividade do método para estes compostos. Dessa forma,

as melhores condições foram: coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 150 mm x 4,6 mm,

Phenomenex), fase móvel ACN:H2O em eluição gradiente 86-90% (B) por 10 min; 90-100%

(B) por 30 min; 100-86% (B) por 5 min e 86% (B) por 15 min, volume de injeção de 20 µL e

vazão de 0,8 mL/min. O uso da ACN como modificador orgânico possibilitou a seleção de

200 nm como comprimento de onda para o registro dos cromatogramas.

No entanto, a presença de compostos de baixa polaridade nas amostras de H.

speciosa torna pouco apropriado o uso de ACN como solvente de diluição. Com o intuito de

aumentar a compatibilidade entre o solvente usado no preparo das amostras de látex dos

frutos e a fase móvel, foi utilizado a metodologia mostrada no item 4.4.2. Os marcadores

químicos, por sua vez, foram dissolvidos em isopropanol[121]

. A diferença entre a fase móvel e

o solvente utilizado na solubilização das amostras ocasiona uma distorção (pico do solvente)

que pode ser observado no início do cromatograma (54 A).

100

5.7 – Validação do método cromatográfico para quantificação do marcador

químico éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol

A confiabilidade do método foi avaliada pelo estudo da seletividade, linearidade,

sensibilidade, precisão, exatidão, estabilidade e robustez. Todos os experimentos realizados

no estudo de validação seguiram as normas estabelecidas na RE 899/03 (ANVISA).[113]

O objetivo dessa etapa do trabalho consistiu em quantificar o éster diidroxilado 3-

β-O-acil lupeol na polpa comercial de mangaba e no látex liofilizado bem como estimar a

quantidade de ésteres de lupeol na polpa comercial de mangaba usando o éster diidroxilado

como padrão. A estrutura do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol pode ser vista na Figura 55.

A validação foi acompanhada pelo DAD em série ao ELSD, ou seja, depois do DAD, o

efluente da coluna cromatográfico foi submetido à detecção por ELSD. O grau de pureza do

padrão de éster diidroxilado foi verificado por normalização, este se mostrou igual a 97,13%.

Figura 55: Estrutura química do éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol.

Para a quantificação dos triterpenos pentacíclicos um novo método, baseado nas

condições anteriores (item 5.2), foi desenvolvido. As condições do método quantitativo estão

descritas no item 4.6.2.1. O uso da eluição isocrática permitiu a diminuição do tempo de

análise sem comprometer a separação dos picos referentes aos ésteres de lupeol; tais

características fizeram o novo método mais conveniente para a quantificação, uma vez que

diminuiu drasticamente o tempo de análise.

O

OOHOH

14

(15)

101

5.7.1 - Seletividade:

No processo de validação de um método a seletividade é o primeiro passo a ser

avaliado. A possível existência de substâncias que podem sofrer degradação requer a

freqüente reavaliação deste parâmetro durante a validação, uma vez que a seletividade não

esteja assegurada, outros parâmetros como a linearidade, exatidão e precisão, estarão

seriamente comprometidos. [126,127]

Nesse trabalho a seletividade foi avaliada pelo grau de pureza do pico de interesse

e pela adição do padrão na amostra. A Figura 56 mostra um típico cromatograma do éster

diidroxilado 3-β-O-acil lupeol, da polpa da mangaba e da polpa da mangaba fortificada

monitorado pelo DAD e pelo ELSD. Os cromatogramas mostram que o método desenvolvido

separou o éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol na amostra de tal forma que nenhum pico

interferente eluiu na região de interesse. Este fato foi confirmado pelas medidas da pureza do

pico adquirido pelo DAD que mostrou alta pureza espectral. Essas análises evidenciaram a

seletividade do método.[126]

102

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0uV(x100,000)

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 min

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

uV(x100,000)

Figura 56: Cromatograma típico: polpa da mangaba (vermelho), éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol (azul) e polpa da mangaba fortificada (preto); (A) obtido pelo DAD; (B) obtido pelo

ELSD. As condições experimentais para obtenção desses cromatogramas são descritos no

item 4.6.2.1.

(A)

(B)

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol

103

5.7.2 - Linearidade:

A linearidade foi avaliada por dois métodos de calibração: padronização externa e

padronização por adição de padrão. Embora não exista uma regra específica para escolha do

método de quantificação este deve ser selecionado para fornecer a melhor exatidão possível e

um alto nível de precisão. Normalmente, a padronização externa é utilizada para amostras que

não precisam de pré-tratamento extenso enquanto que a padronização por adição de padrão é

empregada nas seguintes situações: quando não é possível obter a matriz isenta do analito; em

matrizes muito complexas; quando há fortes interações entre o analito e a matriz e quando é

difícil encontrar um padrão interno adequado.[126,127]

O uso das curvas analíticas obtidas pelos métodos descritos acima resulta em uma

importante informação sobre a seletividade do método. Uma vez que as curvas de calibração,

quando comparadas, apresentem-se paralelas a seletividade do método é garantida e não há

interferência da matriz na quantificação. Dessa forma, a quantificação do analito em

diferentes amostras pode ser obtida usando a regressão oriunda da padronização externa.[17]

A Figura 57 mostra as curvas analíticas resultantes do nosso estudo de

linearidade. Para a construção destas curvas seis concentrações conhecidas do éster

diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foram preparadas e analisadas em triplicata. O preparo das

soluções estoque e padrões de calibração estão descrito no item 4.5.1. Para a detecção por

DAD, a equação de regressão foi calculada na forma de Y = A.X + B, onde Y e X são área do

pico e a correspondente concentração, respectivamente. Por outro lado, a curva de calibração

do ELSD foi construída usando a conversão logarítmica tanto da área do pico (Y) quanto da

concentração (X). Este específico tratamento é devido ao comportamento não linear do ELSD

que tem sido descrito pelo modelo empírico Y=amb onde b é o slope, m é a massa do

composto injetado e a o intercepto da regressão linear.[53, 128]

A similaridade entre os coeficientes angulares das curvas de calibração adquiridas

pela padronização externa e padronização por adição de padrão monitorados pelo DAD

(coeficiente de variação de 0,2%) corroboram a seletividade do método e a não influência da

matriz na quantificação. Dessa forma, a quantificação dos ésteres nas amostras de H. speciosa

pode ser realizada pela padronização externa.

104

Y= 7367,95179X - 22369,23508

r2 = 0,996

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

Are

a

Concentraçao ( g/mL)

Figura 57: Curvas analíticas obtidas para a quantificação de éster diidroxilado 3-β-O-acil

lupeol pelo DAD: padronização externa (A) e padronização por adição de padrão (B); e pelo

ELSD: padronização externa (C).

As equações de regressão linear e os valores de coeficientes de correlação, obtidas

pela padronização externa com o DAD e o ELSD são mostradas na Tabela 12. Ambos os

detectores apresentaram coeficientes de relação acima do valor mínimo preconizado pela

ANVISA (r2= 0,98). A partir destes resultados é possível concluir que dentro da faixa

estudada há uma boa correlação entre a concentração do composto de interesse e a área

obtida. O coeficiente de variação referente às replicatas (n = 3) das concentrações das duas

curvas não ultrapassou 5%.

(A)

Y= 7387,16845X + 770488,94322

r2 = 0,998

(B)

0 100 200 300 400 500

0,0

5,0x106

1,0x107

1,5x107

2,0x107

2,5x107

3,0x107

3,5x107

Áre

a

Concentração ( g/mL)

0 100 200 300 400 500

0,0

5,0x106

1,0x107

1,5x107

2,0x107

2,5x107

3,0x107

3,5x107

4,0x107

4,5x107

Áre

a

Concentração ( g/mL)

(C)

Y= 1,85731x+ 5,45295

r2 = 0,999

105

Tabela 12: Parâmetros de linearidade usando as soluções padrões.

Detecção

Faixa de Linearidade

(µg/mL)

Equação da reta

r2

LD

(µg/mL)

LQ

(µg/mL)

DAD 19,4 - 466,2 y= 7367,95x – 22369,23 0,996 14,5 41,2

ELSD 19,4 - 466,2 y= 1,85x + 5,47 0,999 8,3 15,8

5.7.3 – Limite de detecção e limite de quantificação:

A habilidade de um método em quantificar e detectar baixas concentrações é

comprovada em termos de limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ). O LD é

definido como a menor concentração de um analito que o método é capaz de diferenciar,

confiavelmente, do ruído de fundo. O LQ, por sua vez, representa a menor concentração do

composto de interesse em uma amostra, que pode ser quantitativamente determinado com

valores aceitáveis de precisão e exatidão.[113,126]

Os valores de LD e LQ são reportados na

Tabela 12 para ambos os detectores. O ELSD apresentou valores de LD e LQ mais baixos

que o DAD.

5.7.4 – Precisão e exatidão:

A precisão juntamente com a exatidão determinam erros de uma medida analítica e

são os principais critérios usados para julgar a qualidade de um método. Enquanto a precisão

avalia os resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma

mesma amostra, a exatidão pondera a proximidade dos resultados obtidos pelo método em

estudo em relação ao valor verdadeiro.[125,126]

A avaliação da precisão e da exatidão foi realizada em três dias diferentes a partir

de três concentrações denominadas soluções de controle de qualidade. Tais concentrações

contemplam a faixa de linearidade do método e são designadas pelas siglas CQB (controle de

qualidade de baixa concentração, CQM (controle de qualidade de média concentração) e CQA

(controle de qualidade de alta concentração).

106

O DPR foi tomado como medida de precisão. Os resultados do estudo de precisão

são mostrados na Tabela 13. Como pode ser notado, o valor médio de DPR variou entre 0,8 e

5,5% quando o experimento foi avaliado pelo DAD, enquanto que para a detecção por ELSD,

o valor de DPR variou entre 1,1 e 10,0%.

Tabela 13: Dados do estudo de precisão, intra- e inter-dias, do método para quantificação de

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol.

Concentração

1º Dia

2º Dia

3ºDia

Média

DPR(%)a

DPR(%)a

ELSD DAD ELSD DAD ELSD DAD ELSD DAD

CQB* 8,7 5,3 10,0 5,5 5,5 3,0 8,0 4,6

CQM** 4,8 3,7 5,3 4,1 2,9 1,5 4,3 3,1

CQA*** 1,1 2,4 5,5 2,2 2,9 0,8 3,1 1,8

a Desvio padrão relativo (DPR%), para n =5

* CQB (43,7 µg/mL),

** CQM (207,9 µg/mL) e

*** CQA (372,9 µg/mL)

A exatidão do método foi calculada como percentagem de recuperação de uma

quantidade conhecida do analito adicionada na amostra. A recuperação média foi estimada

pela razão entre a concentração experimental e a quantidade adicionada na matriz. Os

resultados mostraram que as amostras fortificadas variaram entre 97,1 e 109,7% quando

detectados pelo DAD; e entre 81,5 e 112,5% quando os experimentos foram monitorados pelo

ELSD. A Tabela 14 sumariza os resultados obtidos no estudo da exatidão.

A comparação dos valores de DPR e de recuperação percentual obtido pelos

detectores mostrou melhores resultados com o uso de DAD. No entanto, os valores do ELSD

podem ser melhorados pelo ajuste de condições experimentais como, por exemplo, o fluxo do

gás nebulizante.[55]

107

Tabela 14: Dados do estudo de exatidão, intra- e inter-dias do método para quantificação de

éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol.

Concentração

1º Dia

2º Dia

3º Dia

Média

Recuperação (%)a

Recuperação (%)

ELSD DAD ELSD DAD ELSD DAD ELSD DAD

CQB* 97.4 97.1 81.5 104.6 93.8 100.8 90.9 100.8

CQM** 112.5 98.5 107.4 107.6 110.9 101.7 110.2 102.6

CQA*** 90.3 108.7 100.4 109.7 98.3 98.0 96.3 105.5

a Percentagem de recuperação, para n =5

* CQB (43,7 µg/mL),

** CQM (207,9 µg/mL) e

*** CQA (372,9 µg/mL)

Segundo a ANVISA, são aceitos desvios de até 15% para a precisão e exatidão nas

concentrações acima do limite de quantificação (LQ). Uma vez que os valores médios obtidos

na avaliação da precisão e exatidão estão dentro dos limites aceitáveis pela ANVISA. Os

resultados de precisão e exatidão foram considerados satisfatórios para subseqüente

determinação dos ésteres em amostras de mangaba.

5.7.5 – Estabilidade:

O grande número de experimentos a serem realizados durante o processo de

validação exige, na maioria das vezes, a realização de análises durante a noite por meio de

equipamentos automatizados. Nesse sentido, a estabilidade das amostras e dos padrões é um

importante ponto a ser averiguado. Aqui, a estabilidade foi verificada em termos de

temperatura (estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento) e tempo

(estabilidade de curta duração).

A comparação entre as áreas do pico do analito nas soluções recém-preparadas

com soluções depois de 24 h (em temperatura ambiente) e após três ciclos de congelamentos e

descongelamento resultou em um desvio menor que 12%. Esse fato mostrou que o éster

diidroxilado 3-β-O-acil lupeol foi estável em ambas as condições.

108

5.7.6 – Robustez:

A robustez de um método mede a sensibilidade que este apresenta em relação a

pequenas variações, ou seja, o método se mostra robusto quando não há variações

significativas na resposta do equipamento por uma pequena modificação nos parâmetros. Os

testes de robustez são de fundamental importância para que o analista conheça quais fatores

devem ser controlados na execução de uma metodologia.[113,126,129]

O método desenvolvido se mostrou robusto com relação à variação na

porcentagem do modificador orgânico da fase móvel, bem como a diferentes lotes da coluna

analítica. Contudo, a mudança no fluxo da fase móvel causou uma significativa alteração.

Este fato mostra que o controle do fluxo da fase móvel é um ponto crítico na execução do

método.

5.8 – Aplicação do método

Embora significativas diferenças entre as respostas dos dois detectores possam ser

percebidas, ambos podem ser usados para quantificar o éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol

em amostras de látex de mangaba, uma vez que os valores obtidos no processo da validação

estão dentro do limite aceitável pela ANVISA.

Dessa forma, o método desenvolvido foi empregado para a quantificação do éster

diidroxilado 3-β-O-acil lupeol em polpa de mangaba e no látex dos frutos liofilizado

(preparados conforme o item 4.4.2). A Tabela 15 mostra os teores do éster diidroxilado 3-β-

O-acil lupeol nas amostras de H. speciosa . Como pode ser notado, os detectores apresentaram

diferentes teores de éster diidroxilado, com variação de 1,5% na polpa e 2,4% no látex

liofilizado.

109

Tabela 15: Teor de éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol de polpa e látex liofilizado utilizando

DAD e ELSD.

É possível quantificar os demais ésteres de lupeol presente nas amostras de H.

speciosa utilizando o éster diidroxilado como padrão devido à similaridade estrutural entre

estes compostos.[18]

Logo, foi viável estimar a quantidade de ésteres de lupeol, até o momento

conhecidos, presente na polpa comercial de mangaba por meio da soma do teor de cada éster.

Na Figura 58 pode-se verificar os picos referentes ao éster diidroxilado (1) e a mistura de

ésteres (2-4) em um típico cromatograma da polpa de mangaba. A Tabela 16 mostra a

contribuição de cada substância para o teor total do éster quando monitorado pelo DAD e pelo

ELSD. A comparação do teor dos ésteres de lupeol em polpa comercial de mangaba entre os

dois detectores resultou na variação de 2,7%.

Figura 58: Cromatograma representativo da polpa comercial de mangaba, obtido pelo DAD

(vermelho) e pelo ELSD (preto). Picos selecionados para quantificação: (1) éster diidroxilado

3-β-O-acil lupeol e (2-4) mistura de ésteres de lupeol.

Detector Polpa

(µg/mg)

Látex liofilizado

(µg/mg)

DAD 99,3 295,00

ELSD 101,49 284,81

110

Tabela 16: Teor dos ésteres de lupeol (indicados na figura 11) em polpa comercial de

mangaba por HPLC-DAD-ELSD.

Composto Concentração (µg/mg)a

Detector

DAD ELSD

1 99,34 101,49

2 99,93 99,62

3 20,39 31,17

4 39,78 37,30

Total 259,44 269,58 a

Média da triplicata

111

Conclusão

112

6 – CONCLUSÃO

Por meio das análises por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao

detector de arranjo de diodos e evaporativo por espalhamento de luz (HPLC-DAD-ELSD), foi

possível obter pela primeira vez os cromatogramas fingerprint inéditas do látex do caule de H.

speciosa. O método desenvolvido mostrou-se representativo para as amostras submetidas ao

estudo, com separação de bandas cromatográficas capazes de caracterizar quimicamente o

látex do caule da mangabeira. O procedimento de validação do método apresentou boa

precisão e excelente desempenho analítico; o mesmo permitiu também garantir a estabilidade

das soluções das amostras de látex por 48 h a temperatura ambiente, além de demonstrar os

parâmetros que precisam ser mantidos para o bom funcionamento do método.

O presente trabalho demonstrou que é possível averiguar a autenticidade das

amostras de látex do caule comercializados pela inspeção visual das características químicas

peculiares apresentadas nos cromatogramas fingerprint. Foi possível também perceber as

diferenças entre os perfis químicos das amostras analisadas provenientes dos diferentes

localidades.

A utilização da cromatografia líquida em escala semi-preparativa permitiu o

isolamento de sete compostos (HSG 2-8) com elevado grau de pureza a partir do látex do

caule. Três destes compostos tiveram suas estruturas elucidadas: ciclohexiletanóide

glicosilado cornosídeo (HSG 2), ciclohexiletanóide glicosilado dihidrocornosídeo (HSG 3) e

(7,8)-treo-4,7,9,9’-tetrahidroxi-3,3’-dimetoxi- 8-O-4’-neolignana-7-O-β-D-glicopiranosídeo

(HSG 6).

O método cromatográfico desenvolvido para a análise qualitativa dos marcadores

químicos lupeol, α-amirina, β-amirina e ésteres 3- β-O-acil lupeol no látex dos frutos de H.

speciosa e em polpa comercial de mangaba apresentou-se apropriado com adequada

separação.

Um método analítico baseado na detecção por DAD e ELSD em série foi

desenvolvido e validado para a quantificação de ésteres de lupeol em látex dos frutos e em

polpa comercial de H. speciosa utilizando o éster diidroxilado 3-β-O-acil lupeol como padrão.

Embora, uma diferença no teor de ésteres de lupeol tenha sido verificada, os resultados se

mostraram dentro da faixa aceita pela ANVISA para ambos os detectores.

113

Dessa forma, os métodos cromatográficos qualitativos e quantitativos

desenvolvidos neste trabalho podem ser usados como uma ferramenta de controle de

qualidade para amostras de H. speciosa.

114

Referências

115

7 – REFERÊNCIAS

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