UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS ... · que deu origem ao grupo dos arenavírus ( Rowe, Murphy & Bergold, 1970). Os principais reservatórios para os arenavírus

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO SOROLÓGICO E MOLECULAR PARA

PESQUISA DE ARENAVÍRUS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS DE ROEDORES

SILVESTRES DA AMAZÔNIA BRASILEIRA

ANA LETÍCIA SCALDELAI BERNARDI

Belém – Pará

2013

2


DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO SOROLÓGICO E MOLECULAR

PARA PESQUISA DE ARENAVÍRUS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS

DE ROEDORES SILVESTRES DA AMAZÔNIA BRASILEIRA

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do

Programa de Pós-Graduação em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal do

Pará como requisito para a obtenção do grau de

Mestre em Biologia dos Agentes Infecciosos e

Parasitários.

Orientador: Pedro Fernando da Costa Vasconcelos

Belém – Pará

2013

3

Bernardi, Ana Letícia Scaldelai, 1988

Desenvolvimento de método sorológico e molecular para pesquisa de

arenavírus em amostras biológicas de roedores silvestres da Amazônia

brasileira / Ana Letícia Scaldelai Bernardi. - 2013.

Orientador: Pedro Fernando da Costa Vasconcelos.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Instituto de

Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia de

Agentes Infecciosos e Parasitários, Belém, 2013.

1. Arenavírus. 2. Arenaviridae. 3. Roedor Amazônia. 4. Teste

imunoenzimático. I. Título.

CDD 22. ed. 579.256

2

FOLHA DE APROVAÇÃO


DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO SOROLÓGICO E MOLECULAR PARA

PESQUISA DE ARENAVÍRUS EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS DE ROEDORES

SILVESTRES DA AMAZÔNIA BRASILEIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós – Graduação em Biologia dos Agentes

Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade federal do

Pará, como requisito para a obtenção de grau de Mestre em Biologia dos Agentes Infecciosos

e Parasitários.

Orientador: Prof. Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos

Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, IEC.

Banca Examinadora: Dra. Elizabeth Salbé Travassos da Rosa


Dra. Daniele de Almeida Medeiros


Dra. Lívia Carício Martins


Dr. Márcio Teixeira Nunes (Suplente)

Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas, IEC

Belém, 26 de junho de 2013.

3

EPÍGRAFE

``Aprender é a única coisa de que a mente

nunca se cansa, nunca tem medo e nunca

se arrepende. ``

Leonardo da Vinci

4

DEDICATÓRIA

Aos meus pais e ao meu irmão,

para que cada minuto de saudade

não tenha sido em vão.

5

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente à minha mãe e ao meu pai, por sempre apoiarem as minhas

decisões e por acreditarem em mim. Sem eles minhas conquistas não seriam possíveis.

Ao meu irmão por mesmo distante estar sempre presente.

Ao Ramon Brito, amigo e companheiro incansável, sem o qual nenhuma das vitórias

aqui alcançadas teriam sentido.

À família Brito que me acolheu em Belém, me proporcionando toda a ajuda

necessária.

Ao Dr. Pedro Vasconcelos, por ter me aceitado como orientanda e por ter me

proporcionado o presente trabalho.

À Daniele Medeiros, pela ajuda providencial na parte molecular da dissertação.

À Dra. Elizabeth Salbé, por ceder o laboratório para a realização dos testes de ELISA.

À Darlene Simith, pelo treinamento das técnicas de ELISA e RT-PCR e, pela ajuda

prática durante a parte experimental.

Ao pessoal do IH, por disponibilizarem os antígenos necessários aos ensaios, em

especial o senhor Basílio.

Ao Samir Casseb, por ter ajudado no desenvolvimento dos iniciadores utilizados no

estudo, bem como pelos auxílios diários durante os testes.

A Maria Helena Mendonça, pelo auxílio imprescindível na área da clonagem.

Ao Bruno Tardelli, pelos ensinamentos e ajuda em horas precisas.

Ao pessoal da Biologia Molecular: Alice, Natália, Gregório e Natividade, pelo

companheirismo e ajuda nos momentos necessários.

Aos meus amigos, que mesmo distantes, estão sempre comigo: Juliane, Tamine, Kaoli,

Roger, Fábio, Samantha, Bruno, Daniele Carolina e Kristie.

Ao Instituto Evandro Chagas, por disponibilizar todos os recursos para o

desenvolvimento do projeto.

Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para este trabalho e às

amizades construídas aqui em Belém, muito obrigada.

6

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... 8

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 11

1.1 FAMÍLIA ARENAVIRIDAE................................................................................... 12

1.2 GÊNERO ARENAVÍRUS ..................................................................................... 16

1.2.1 Estrutura Viral ............................................................................................. 16

1.2.2 Ciclo Replicativo ........................................................................................... 17

1.3 ECOLOGIA E INFECÇÃO ................................................................................... 19

1.4 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DAS FEBRES HEMORRÁGICAS CAUSADAS

POR ARENAVÍRUS ..................................................................................................... 21

1.5 ARENAVÍRUS SUL AMERICANOS CAUSADORES DE FEBRES

HEMORRÁGICAS ........................................................................................................ 22

1.6 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DOS ARENAVÍRUS NO BRASIL .................. 24

1.7 PROPRIEDADES LABORATORIAIS DOS ARENAVÍRUS ............................... 25

1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ..................................................................... 26

1.9 TRATAMENTO .................................................................................................... 27

1.10 PREVENÇÃO E CONTROLE .............................................................................. 27

1.11 JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 28

2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 29

2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 29

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................. 29

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 30

3.1 AMOSTRAS ......................................................................................................... 30

3.2 TESTE DE ELISA IgG .......................................................................................... 31

3.2.1 Obtenção do antígeno pelo método da sucrose-acetona .............................. 32

3.2.2 Titulação........................................................................................................ 33

3.2.3 Sensibilização ................................................................................................ 33

3.2.4 Adição das amostras ..................................................................................... 34

3.2.5 Adição do conjugado..................................................................................... 35

7

3.2.6 Substrato ....................................................................................................... 35

3.2.7 Interpretação dos resultados ........................................................................ 35

3.3 TRANSCRIÇÃO REVERSA-REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE ... 36

3.3.1 Extração do RNA viral ................................................................................. 36

3.3.2 Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) seguida

da reação de Semi-Nested-PCR .................................................................................. 36

3.3.4 Produtos Obtidos .......................................................................................... 38

4. RESULTADOS ........................................................................................................... 39

4.1 ELISA IgG ............................................................................................................ 39

4.2 AMOSTRAS TESTADAS POR RT-PCR .............................................................. 40

4.3 RESULTADOS DO LIMITE DE DETECÇÃO ..................................................... 41

4.3.1 Vírus Amaparí .............................................................................................. 41

4.3.2 Vírus Flexal ................................................................................................... 42

4.3.3 Vírus Sabiá .................................................................................................... 43

4.3.4 Vírus Paraná ................................................................................................. 44

4.3.5 Vírus Junin .................................................................................................... 45

4.3.6 Vírus Guanarito ............................................................................................ 46

4.3.7 Vírus Machupo ............................................................................................. 48

4.3.8 Vírus Latino .................................................................................................. 48

4.3.9 Vírus Inespecíficos ........................................................................................ 49

4.3.10 Limite de detecção mínimo para os arenavírus ........................................... 50

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 51

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 57

REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 58

ANEXO 1............................................................................................................................ 65

8

LISTA DE FIGURAS

Página

Figura 1 - Estrutura dos arenavírus. ......................................................................... 13

Figura 2 - Classificação genética dos arenavírus. .................................................... 14

Figura 3 - Representação esquemática dos arenavírus. ........................................... 16

Figura 4 - Visão geral do ciclo replicativo dos arenavírus. ..................................... 17

Figura 5 - Mecanismos de replicação, transcrição e tradução do segmento S do

RNA de arenavírus. ................................................................................ 18

Figura 6 - Ciclo de transmissão dos arenavírus. ...................................................... 20

Figura 7 - Distribuição dos arenavírus Sul Americanos. ......................................... 23

Figura 8 - ELISA IgG indireto. ................................................................................. 32

Figura 9 - Placa de ELISA. ........................................................................................ 34

Figura 10 - Adição das amostras. ............................................................................. 34

Figura 11 - Placa de ELISA após a realização da leitura da densidade óptica do

teste. ....................................................................................................... 36

Figura 12 – RT-PCR para o AMV. ........................................................................... 42

Figura 13 – Semi-Nested-PCR do AMAV. .............................................................. 42

Figura 14 – RT-PCR para o FLEV. ........................................................................... 43

Figura 15 – Semi-Nested-PCR do FLEV. ................................................................. 43

Figura 16 – RT-PCR para o SABV. ........................................................................... 44

Figura 17 – Semi-Nested-PCR do SABV. ................................................................. 44

Figura 18 – PCR para o PARV. ................................................................................. 45

Figura 19 – Semi-Nested-PCR do PARV. ................................................................. 45

Figura 20 – PCR para o JUNV. .................................................................................. 46

Figura 21 – Semi-Nested-PCR do JUNV. .................................................................. 46

Figura 22 – PCR para o GTOV. ................................................................................. 47

Figura 23 – Semi-Nested-PCR do GTOV. ................................................................. 47

Figura 24 – PCR e Semi-Nested-PCR para o MACV ............................................... 48

Figura 25 – PCR e Semi-Nested-PCR para o LATV. ............................................... 49

Figura 26 – Semi – Nested-PCR para vírus inespecíficos aos iniciadores................. 49

9

RESUMO

Os arenavírus pertencem a família Arenaviridae, gênero Arenavirus, sendo o grupo do Novo

Mundo compreendido pelos arenavírus nativos das Américas, como os vírus Machupo

(MACV), Junin (JUNV), Guanarito (GTOV) e Sabiá (SABV), sendo estes, os vírus de maior

importância do grupo, pois são a causa de febres hemorrágicas em humanos. Os principais

reservatórios dos arenavírus são os roedores, que ao serem infectados podem desenvolver a

infecção de forma crônica, transmitindo os vírus aos humanos através de aerossóis

provenientes da urina e excretas. A análise de 1.395 amostras de sangue de roedores silvestres

da Amazônia brasileira através da adaptação do teste de ELISA IgG, demonstrou a presença

de arenavírus circulantes na região, indicando a susceptibilidade da população a infecções.

Paralelamente o desenvolvimento de uma técnica de RT-PCR para detecção de arenavírus do

grupo do Novo Mundo, mostrou boa sensibilidade e especificidade, realizadas a partir do

limite de detecção para oito arenavírus: o SABV, Amaparí (AMAV) e Flexal (FLEV), obtidos

a partir da extração de RNA de cérebros de camundongo infectados e, o JUNV, GTOV,

MACV, Paraná (PARV) e Latino (LATV), utilizando cDNA sintético (gBlocks) a partir de

sequências disponíveis no Genbank. Foram feitas diluições seriadas 1:2 e/ou 1:5 do cDNA

sintético e do RNA viral extraído. Orthobunyavírus, Hantavírus e Flavivírus foram utilizados

para verificar a especificidade do teste, demonstrando resultados negativos. Os limites

mínimos de detecção encontrados para os arenavírus foram 0,5pg (PARV), 0,012ng (AMAV),

0,062ng (SABV), 0,062ng (FLEV), 0,062ng (JUNV), 1,56ng (GTOV), 1,56ng (MACV) e

12,5ng (LATV). Considerando que pesquisas focadas em tais vírus no País são muito

precárias, as técnicas desenvolvidas tornam-se ferramentas úteis para futuros estudos sobre

diagnóstico e endemismo viral, os resultados obtidos poderão contribuir para estudos sobre a

circulação dos arenavírus não só no Brasil como em outros países das Américas.

10

ABSTRACT

The arenaviruses belong to the Arenarividae family, genus Arenavirus, being the New

World group comprised by natives arenaviruses of the Americas as the viruses Machupo

(MACV), Junin (JUNV), Guanarito (GTOV) and Sabia (SABV), which are the most

important viruses from the group, they are the cause of hemorrhagic fever in humans. The

main reservoirs of arenaviruses are the rodents, which when infected may develop a chronic

form of the viral disease, transmitting the virus to humans through aerosols from urine and

excretes. Analysis of 1.395 samples from blood of wild rodents from Brazilian Amazon by

adapting an IgG ELISA test, demonstrated de presence of circulating arnaviruses in region,

indicating the susceptibility of local population to infections. At the same time the

development of an RT-PCR for arenaviruses of the New World group showed a good

sensitivity and specificity performed from the detection limit for eight arenaviruses: the

SABV, Amapari virus (AMAV) and Flexal virus (FLEV), followed by RNA genome

extraction from brains of infected mice and, the JUNV, GTOV, MACV, Parana virus (PARV)

and Latino virus (LATV), using synthetic cDNA (gBlocks) from sequences available in

Genbank. Serial dilutions were made in 1:2 and/or 1:5 from synthetic cDNA or viral RNA

extracted. Orthobunyaviruses, hantaviruses and flaviviruses were used to check the specificity

of the test, showing negative results. Minimum detection limits founded for the arenavirures

were 0,5pg (PARV), 0,012ng (AMAV), 0,062ng (SABV), 0,062ng (FLEV), 0,062ng (JUNV),

1,56ng (GTOV), 1,56ng (MACV) and 12,5ng (LATV). Considering that the researches

focuses in these viruses in country are very poor, the techniques employed here are useful

tools for futures studies on viral diagnosis and endemism, the results may contribute to studies

on the circulation of arenaviruses not only in Brazil as in other countries of the Americas.

11

1. INTRODUÇÃO

Os arenavírus foram descritos inicialmente em 1933, quando o vírus da

Coriomeningite Linfocítica (LCMV) foi isolado em amostras de um caso fatal em humano

suspeito de ter ido a óbito devido à encefalite de Saint Louis, vírus causador de grande

epidemia a época (Armstrong & Lillie, 1934). Vários estudos então começaram a ser

realizados com o LCMV. Por volta dos anos de 1960, novos vírus, como os do complexo

Tacaribe, mostraram ter semelhanças morfológicas e sorológicas com tal vírus (Pinheiro et al,

1967; Rowe, Pugh, Webb & Peters, 1970), além da dependência de infecção em roedores, o

que deu origem ao grupo dos arenavírus ( Rowe, Murphy & Bergold, 1970).

Os principais reservatórios para os arenavírus são os membros da ordem Rodentia,

roedores que ao serem infectados, quase sempre são assintomáticos, apresentando a infecção

na forma aguda ou crônica. Presume-se que tais vírus sejam transmitidos aos humanos através

da inalação de aerossóis provenientes das secreções ou excretas de roedores infectados

(Emonet et al., 2009). Enfermidades causadas por arenavírus são comuns em humanos, sendo

graves em alguns casos. Os arenavírus Lassa (LASV), Junín (JUNV), Machupo (MACV),

Guanarito (GTOV) e Sabiá (SABV) são conhecidos por causarem febre hemorrágica severa

na África Ocidental, Argentina, Bolívia, Venezuela e Brasil, respectivamente (Charrel &

Lambalerrie, 2010).

Alguns fatores têm sido associados à transmissão e emergência de novos vírus, tais

como o aumento populacional e a necessidade de expansão da agricultura, por exemplo, são

atividades que favorecem a dispersão dos agentes virais. A extensão do cultivo agrícola para

áreas de floresta pode alterar o ciclo de transmissão zoonótico de determinados vírus,

portanto, a remoção de florestas para o desenvolvimento agrícola torna-se um risco aos

agricultores que são expostos a artrópodes e roedores (Hui, 2006). Na maioria dos casos, a

transmissão de arenavírus aos humanos se dá após incursões de lazer ou atividades agrícolas,

situações em que o homem entra em contato direto com o habitat dos roedores hospedeiros.

Grandes modificações no ambiente ocasionadas por atividades humanas ou mudanças

ecológicas naturais têm implicado no aumento de infecções por arenavírus devido a mudanças

de comportamento dos hospedeiros primários (Charrel & Lambalerrie, 2010). A Febre

Hemorrágica Argentina, causada pelo JUNV, emergiu após a utilização da região dos pampas

para a agricultura, principalmente para a produção de grãos, como o milho, considerado o

fator que atraiu o roedor Calomys musculinus, reservatório natural do vírus (Hui, 2006).

12

A epidemiologia dos arenavírus em humanos é determinada pela distribuição dos

roedores infectados e seu contato com a população, embora em alguns casos infecções inter-

humanas possam ocorrer (Enria et al, 2005).

Além dos comportamentos peridomiciliares de determinados roedores serem uma

importante fonte de infecção, profissionais em constante contato com roedores infectados, no

campo ou em laboratórios, estão em maior risco de contaminação (Charrel & Lambalerrie,

2010). Casos de infecções adquiridas em laboratório, no Brasil, já foram registrados pelo

vírus Flexal (FLEV) e SABV em 1978 e 1992, respectivamente (Vasconcelos et al., 1993).

1.1 FAMÍLIA ARENAVIRIDAE

Segundo o Comitê Internacional para Taxonomia dos Vírus (International Committe

on Taxonomy of Virus - ICTV), a família Arenaviridae é constituída por um único gênero -

Arenavirus – que recebe este nome devido a aparência de areia (em Latim, arenous) vista nas

partículas virais em microscópio eletrônico. Os ribossomos do hospedeiro, abundantes nestes

vírus, é que conferem esta característica (Fig. 1) (ICTV, 2011; Buchmeier et al., 2007). A

família contém 24 espécies virais (ICTV, 2011) divididas em dois grupos de acordo com suas

propriedades antigênicas: o grupo do Velho Mundo (sorocomplexo Lassa – Coriomeningite

Linfocítica) que inclui vírus nativos da África e em regiões de distribuição do LCMV, e o

grupo do Novo Mundo (sorocomplexo Tacaribe) que inclui vírus nativos das Américas

(Charrel & Lambalerrie, 2010).

13

Figura 1: Estrutura dos arenavírus. (a) Microscopia eletrônica evidenciando partículas de

arenavírus em brotamento em células BHK-21 infectadas e (b) crio-microscopia eletrônica de vírions purificados. As setas indicam as espículas de glicoproteínas (GP1 e

GP2). (c) Representação da estrutura da partícula viral. Legenda: proteína L é a

polimerase viral; CI – corpúsculo de inclusão que podem ser ribossomos ou proteína Z resultante da montagem da partícula viral.

Fonte: ICTV, 2011; Buchmeier et al. (2007).

Classificações genéticas indicam que as 24 espécies de arenavírus descritas pertencem

a quatro linhagens filogenéticas (Fig. 2). O grupo do Velho Mundo compreende seis vírus:

LCMV, LASV, Mopeia (MOPV), Mobala (MOBV), Ippy (IPPYV) e Lujo (LUJV); Já o

grupo do Novo Mundo é dividido em três linhagens. A linhagem A inclui três vírus Norte

Americanos - Whitewater Arroyo (WWAV), Tamiami (TAMV) e Bear Canyon (BCNV) e

cinco vírus Sul Americanos - Pirital (PIRV), Pichinde (PICV), FLEV, Paraná (PARV) e

Allpahuayo (ALLV). A linhagem B inclui sete vírus Sul Americanos (SABV, JUNV, MACV,

GTOV, Amapari (AMAV), Tacaribe (TCRV) e Cupixi (CPXV). A linhagem C inclui outros

três vírus do cone Sul da América do Sul: Oliveros (OLVV), Latino (LATV) e Pampas

(PAMV) (Quadro 1) (ICTV, 2011; Charrel & Lambalerrie, 2003).

14

Figura 2: Classificação genética baseada na análise de sequências de aminoácidos da

proteína Z, codificada pelo segmento L dos arenavírus. Grupo do Velho Mundo e grupo do Novo Mundo (Linhagens A, B e C).

Fonte: Urata & Yasuda (2012).

15

Quadro 1 – Lista de espécies de arenavírus segundo o grupo, distribuição e seus respectivos

reservatórios.

Legenda: NM: Novo Mundo; VM: Velho Mundo. Linhagens: A, B, C.

FONTE: Charrel & Lambalerrie, 2003.

Vírus Acrônimo Grupo Distribuição Reservatório

Com

ple

xo L

ass

a –

Cori

om

enin

git

e

Lin

focí

tica

Vírus Lassa LASV VM Nigéria, Costa do Marfim, Guiné,

Serra Leoa Mastomys sp.

Vírus da

Coriomeningite

linfocítica

LCMV VM Distribuição mundial M. musculus

Vírus Mobala MOBV VM República Centro Africana Praomys sp.

Vírus Mopeia MOPV VM Moçambique Mastomys natalensis

Vírus Ippy IPPYV VM República Centro Africana Arvicanthus sp.

Vírus Lujo LUJV VM Sul da África Desconhecido

Com

ple

xo T

aca

rib

e – L

inh

agem

A

Vírus Flexal FLEV NM-A Brasil Oryzomys spp.

Vírus Pichinde PICV NM-A Colômbia O. albigularis

Vírus Paraná PARV NM-A Paraguai O. buccinatus

Vírus

Allpahuayo ALLV NM-A Peru Oecomys bicolor

Vírus Pirital PIRV NM-A Venezuela Sigmodon alstoni

Vírus

Whiterwater

Arroyo

WWAV NM-A Sudoeste dos EUA Neotoma albigula, N.

mexicana, N. micropus, N. cinerea

Vírus Tamiami TAMV NM-A Flórida, EUA Sigmodon hispidus

Vírus Bear

Canyon BCNV NM-A Califórnia, EUA Peromyscus sp.

Com

ple

xo T

aca

rib

e -

Lin

hagem

B Vírus Junín JUNV NM-B Argentina Calomys musculinus

Vírus Machupo MACV NM-B Bolívia C. callosus, C. laucha

Vírus Guanarito GTOV NM-B Venezuela Z. brevicauda

Vírus Sabiá SABV NM-B Brasil Desconhecido

Vírus Tacaribe TCRV NM-B Trindade e Tobago Artibeus spp. (morcego)

Vírus Cupixi CPXV NM-B Brasil Oryzomys capito

Vírus Amapari AMAV NM-B Brasil O. capito, Neacomys

guianae

Com

ple

xo

Taca

rib

e –

Lin

ha

gem

C Vírus Oliveros OLVV NM-C Argentina Bolomys obscurus

Vírus Pampa PAMV NM-C Argentina Bolomys sp.

Vírus Latino LATV NM-C Bolívia Calomys callosus

16

1.2 GÊNERO ARENAVÍRUS

1.2.1 Estrutura Viral

Os arenavírus são envelopados, possuem estrutura pleomórfica e vírions com tamanho

de 40 a mais de 200 nm de diâmetro (Buchmeier et al., 2007). Seu genoma consiste em dois

segmentos de RNA de fita simples senso negativo, um de tamanho menor (S) e outro maior

(L) (Gómez et al,, 2011). As projeções presentes no envelope dos vírus são complexos

compostos pelas glicoproteínas virais GP1, GP2 e o peptídeo de sinal estável (PSE). As

glicoproteínas de superfície estão alinhadas com proteínas Z subjacentes e

ribonucleoprotéinas (RNP) que formam uma parede bidimensional na membrana interna dos

vírus (Fig. 3) (Buchmeier et al., 2007).

Figura 3: Representação esquemática dos arenavírus. Corte

lateral evidenciando os segmentos genômicos RNA S e RNA L,

glicoproteínas GP1 e GP2, peptídeo de sinal estável (PSE), nucleoproteínas (N), polimerase (L), proteínas Z e ribossomos.

Fonte: Gómez et al. (2011).

A infectividade dos arenavírus é nula quando seu RNA é purificado, sendo a presença

da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), a proteína L, essencial para a replicação de

seu genoma. Diferentes arenavírus apresentam variabilidade no tamanho dos dois segmentos

de RNA, L e S, porém preservam sua estrutura organizacional dentro da família. O ciclo

desses vírus é restrito ao citoplasma da célula hospedeira e, diferente de outros vírus de RNA

de senso negativo, os arenavírus usam uma estratégia de codificação ambisenso que dirige a

síntese de duas proteínas em orientações opostas. As regiões codificantes são separadas por

regiões intergênicas não codificantes (RINC) que formam um grampo estável. O RNA S

17

codifica o precursor do complexo das glicoproteínas virais (GPC) e a nucleoproteína NP,

enquanto o RNA L codifica a RdRp ou L polimerase e a proteína Z (Buchmeier et al., 2007).

Por serem vírus envelopados, os arenavírus tornam-se suscetíveis a solventes

orgânicos e detergentes. Sua infectividade pode ainda ser inativada por temperaturas

superiores a 55oC, luz ultravioleta e radiação gama (Enria et al, 2005).

1.2.2 Ciclo Replicativo

A interação específica com os receptores celulares leva a subsequente entrada do vírus

na célula hospedeira, sendo os receptores celulares determinantes para a infecção e

patogênese. Os arenavírus do Velho Mundo utilizam o receptor α – distroglicana para a

adsorção nas células, já alguns vírus do Novo Mundo do grupo B utilizam como receptor a

transferrina 1 (TfR 1), tais como o JUNV, GTOV, MACV e SABV (Gómez et al., 2011). A

entrada do vírus na célula é feita por endocitose, a posterior fusão entre as membranas viral e

celular é desencadeada pelo meio ácido do endossomo maduro, liberando o material genético

viral no citoplasma celular (Figura 5) (Emonet et al., 2009).

Figura 4: Visão geral do ciclo replicativo dos arenavírus. Entrada por

endocitose através dos receptores α – distroglicana (α –DG) e transferrina

(TrR-1) pelos vírus Lassa (LASV) e Junín (JUNV), respectivamente. EE: Endossomo precoce; LE: Endossomo maduro; mRNA: RNA mensageiro; ER:

retículo endoplasmático; GPC: complexo glicoproteico; vRNA: RNA viral; L:

polimerase; NP: nucleoproteína; Z: proteína estrutural. Fonte: Urata & Yasuda (2012).

18

As sequências terminais 3` e 5`, de 19 nucleotídeos, dos segmentos de RNA S e L são

extremamente conservadas, bem como complementares nos arenavírus, sugerindo que

hibridizações possam ocorrer entre esses segmentos. Acredita-se que essas terminações sejam

essenciais para a replicação e transcrição viral, atuando como sítio de ligação para a

polimerase (Gómez et al., 2011). Assim que a RNP é liberada no citoplasma, a polimerase L

inicia a transcrição do promotor localizado na região terminal 3` do RNA. A transcrição

primária resulta na síntese dos mRNA da NP e L dos segmentos S e L, respectivamente. Em

seguida, a polimerase viral adota a função de replicase e se move através da RINC para gerar

uma nova cópia de toda a extensão do RNA, dando origem a um RNA antigenômico

(agRNA). O novo agRNA servirá de molde para a transcrição dos mRNAs de GP (agS) e Z

(agL). O termo ambisenso se refere a esta situação, onde uma região do segmento S e L é

transcrita em sentido negativo – proteínas NP e L - e outra região transcrita em sentido

positivo a partir do novo RNA – proteínas GP e Z. A fita antigenômica ainda servirá como

molde para a amplificação do RNA genômico correspondente, que dará origem a novas

partículas infecciosas (Fig. 5) (Buchmeier et al., 2007).

Figura 5: Mecanismos de replicação, transcrição e tradução do segmento S do RNA de arenavírus. GP: Glicoproteína; RINC: Região

intergênica não codificante; NP: Nucleoproteína; L: Polimerase;

mRNA: RNA mensageiro.

Fonte: Adapatção de Emonet et al. (2009).

RINC

RINC

19

O complexo GPC origina três proteínas: G1, G2 e o peptídeo de sinal estável (SSP). O

SSP é necessário ao transporte da GPC do retículo endoplasmático (RE) para o complexo de

Golgi, onde a GPC é clivada pela protease celular SKI-1/S1P para formar as subunidades

maduras G1 e G2. Foi demonstrado que a interação entre as proteínas N e Z é necessária para

a montagem dos nucleocapsídeos e glicoproteínas em partículas infecciosas, sendo a proteína

Z de grande importância no brotamento das mesmas (Gómez et al., 2011).

1.3 ECOLOGIA E INFECÇÃO

Os roedores são os reservatórios naturais dos arenavírus, cada espécie viral tem maior

afinidade por determinada espécie de roedor, exceto o vírus Tacaribe, que é associado a uma

espécie de morcego. O LCMV, LASV e vírus relacionados ao grupo do Velho Mundo são

associados aos roedores da família Muridae, subfamília Murinae. Os arenavírus do Novo

Mundo são associados aos roedores da família Cricetidae, subfamília Sigmodontinae (Charrel

& Lambalerrie, 2010; Milazzo et al, 2011).

Atualmente acredita-se que a diversidade dos arenavírus se dá devido ao resultado de

uma longa relação co-evolutiva entre os vírus da família Arenaviridae e os roedores da

família Muridae ou Cricetidae. A infecção crônica do hospedeiro, acompanhada de viremia ou

virúria, aparenta ser crucial para a persistência dos arenavírus em natureza (Charrel &

Lambalerrie, 2003).

A continuidade da infecção entre populações de roedores hospedeiros pode ser por

transmissão horizontal ou vertical. Animais cronicamente infectados geralmente apresentam

crescimento, comportamento e interação intraespecífica normal. Os hospedeiros infectados

podem disseminar grandes quantidades de vírus através da urina, fezes e saliva, o que leva a

contaminação de outros animais, mais comumente por aerossóis (Sabattini et al, 1977). A

transmissão horizontal entre roedores pode ser facilitada por agressões intraespecíficas,

acasalamento e outras atividades que impliquem contato físico. Em algumas associações do

vírus com seu hospedeiro, a transmissão vertical parece ter papel bastante relevante, como

acontece com o PIRV, onde há alta prevalência de espécimes de Sigmodon alstoni infectadas

em idade jovem, sugerindo transmissão uterina ou imediatamente após o parto (Milazzo et al,

2011).

O contato com roedores infectados pode levar a infecção humana através de abrasões

na pele e inalação dos aerossóis de secreções ou excretas desses hospedeiros, uma vez que os

vírus são frequentemente encontrados em amostras de urina e rim (Pinheiro et al, 1977.

20

Milazzo et al, 2011) (Fig. 6). Desse modo, a dinâmica de populações de roedores é

provavelmente a maior determinante para a epidemiologia das infecções humanas. A área

geográfica onde uma doença causada por arenavírus é encontrada, é limitada pela distribuição

do seu roedor hospedeiro correspondente (Mercado, 1975).

A infecção por aerossóis é a maior suspeita quando não há possibilidade de contato

direto entre o doente e os roedores, ou quando um grande número de pessoas é infectado por

estarem em um espaço fechado. Infecções causadas pelo JUNV afetam principalmente,

motoristas de máquinas colheitadeiras de milho, situação em que não há contato direto com os

roedores, portanto a via de transmissão evidente é por meio de aerossóis (Charrel &

Lambalerrie, 2003). Outras vias de transmissão têm sido encontradas, o vírus Lassa mostrou

ser adquirido por indivíduos durante a prática da caça, pela ingestão de carne de roedores e de

comida infectada, esta, devido ao seu mau armazenamento (McCormick et al, 1987).

Figura 6: Ciclo de transmissão dos arenavírus. Fonte: Enria et al.(2005).

21

Embora a maioria dos casos de doenças causadas por arenavírus descritos na literatura

sejam por infecção a partir de roedores, a transmissão destes vírus entre humanos já foi

evidenciada. A Febre Hemorrágica Argentina, por exemplo, em geral não é contagiosa, porém

acredita-se que algumas mulheres foram infectadas por seus maridos durante a fase de

convalescência através do contato sexual (Briggiler et al, 1987).

O MACV pode ser transmitido pessoa a pessoa através de fluidos corporais em

pessoas da mesma família ou em infecções hospitalares. Cinco profissionais de saúde que

foram expostos ao caso primário ou a um caso secundário de Febre Hemorrágica Boliviana

(FHB), em um hospital em Cochabamba em 1971, contraíram o MACV (Peters et al, 1974).

Já em 1994, houve seis casos de infecção secundária fatal em seis membros de uma mesma

família, adquiridos a partir de um único caso natural (Kilgore et al, 1995).

O LASV causou infecções hospitalares graves na Nigéria, a disseminação viral foi

atribuída a formação de aerossóis ou a falta de esterilização de equipamentos de injeção

parenteral (Fisher-Hoch et al, 1995).

Os surtos hospitalares, embora raros, possuem a rota parenteral como a mais perigosa

devido à exposição a agulhas contaminadas ou acidentes técnicos e de autópsia. A partir

desses dados, precauções de bio-contenção mostraram-se ser indispensáveis quando se lida

com pacientes e materiais infectados pelos arenavírus (Charrel & Lambalerrie, 2003).

1.4 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DAS FEBRES HEMORRÁGICAS CAUSADAS

POR ARENAVÍRUS

O período de incubação da doença dura de quatro a 21 dias, com variação média de

seis a 14 dias. Em seguida vem a fase prodrômica, iniciando-se com calafrios, mal-estar,

dores de cabeça, anorexia, mialgias e febre moderada entre 38 e 39° C. Nos dias seguintes, os

pacientes podem apresentar sintomas gastrointestinais, cardiológicos e neurológicos.

Sintomas comuns incluem dor lombar, dor retroorbital, náuseas ou vômitos, dor epigástrica,

fotofobia, tonturas e constipação ou diarréia. Exames físicos demonstraram durante a primeira

semana da doença, a presença de rubores na face, pescoço e parte superior do tórax; congestão

conjuntival com edema periorbital; sangramento espontâneo das gengivas; enantemas no

palato mole com petéquias e pequenas vesículas; petéquias cutâneas nas regiões axilares,

parte superior do tórax e braços; aumento dos linfonodos das regiões cervicais laterais;

irritabilidade, letargia, leves tremores na língua e mãos, ataxia moderada, diminuição nos

22

reflexos musculares e em mulheres, metrorragias leves ou moderadas (Enria & Pinheiro,

2000). Ainda na primeira semana, exames laboratoriais mostram progressiva leucopenia

(1000 a 2000 leucócitos/ mm³) e trombocitopenia (50.000 a 100.000 plaquetas/ mm³), além de

proteinúria e hematúria. Na segunda semana da doença 70 a 80% dos pacientes começam a

melhorar, o restante (20 a 30%) inicia uma fase hemorrágica neurológica. Tais pacientes

podem apresentar sangramento profuso, marcada ataxia, irritabilidade acentuada, intensos

tremores, delírios, convulsões e entrar em coma (Enria & Pinheiro, 2000).

Acredita-se que febre hemorrágica causada por arenavírus ocorre através de um efeito

sobre os macrófagos que induzem a ativação de citocinas. O Interferon – α (IFN-α) e o Fator

de Necrose Tumoral α (TNF-α) são abundantes no soro do paciente e, seus níveis estão

correlacionados com a gravidade da doença. A taxa de letalidade das febres hemorrágicas Sul

Americanas varia entre 15 e 30% dos pacientes dentro de dois a 14 dias após hospitalização.

Anticorpos aparecem de dez a doze dias após a doença instalada, coincidindo com a melhora

clínica, o que sugere que a resposta humoral tem papel importante ao lado da resposta celular

para a recuperação do enfermo. Os sobreviventes passam por uma melhora gradual e lenta,

com perda de cabelo e presença de sulcos transversais nas unhas, características comuns da

recuperação. Não há sequelas a longo prazo, mas a recuperação pode estender-se durante

vários meses (Doyle et al., 1998).

1.5 ARENAVÍRUS SUL AMERICANOS CAUSADORES DE FEBRES

HEMORRÁGICAS

Os arenavírus Sul Americanos (Fig.7) foram identificados na metade do século XX.

Entretanto, acredita-se que os arenavírus circulem silenciosamente em natureza há séculos e

que pelo menos uma das doenças epidêmicas que causaram um colapso na população

mexicana durante o século XVI tenha sido causada por arenavírus (Marrs & Kiracofe, 2000).

23

Figura 7: Distribuição dos arenavírus Sul Americanos. Em destaque, os vírus causadores de febre hemorrágica (GTOV, MOCV, JUNV e

SABV).

Fonte: Instituto Nacional de Enfermidades Virais Humanas - INEVH, Argentina.

Em 1950, foi reconhecida em Buenos Aires, Argentina, uma nova doença hemorrágica

severa, denominada Febre Hemorrágica Argentina (FHA), causada pelo JUNV. A maioria dos

pacientes que apresentaram infecção eram trabalhadores rurais (Greenway et al, 1959). Os

hospedeiros do JUNV são os roedores da espécie Calomys musculinus, amplamente

encontrados na região. A FHA caracteriza-se como uma doença sazonal, apresentando picos

de frequência nos períodos de colheita do milho, com maior incidência no mês de maio (Enria

et al, 2005). A taxa de letalidade dos casos de FHA é de aproximadamente 20% na ausência

de tratamento específico. Estima-se que desde 1950 houve aproximadamente 30.000 casos da

doença sintomática. Durante o período de colheita, 75% dos doentes são agricultores do sexo

masculino, infectados por meio de aerossóis (Charrel & Lambalerrie, 2003). A incidência

anual da doença foi relacionada positivamente com a quantidade populacional de roedores por

região afetada (Mills et al, 1992). Após a introdução da vacina atenuada testada em

24

agricultores em meados de 1980, a epidemiologia da FHA tem sofrido alterações

significativas com drástica redução no número de casos (Enria et al, 2005).

O agente causador da Febre Hemorrágica Boliviana (FHB) foi isolado em 1963, a

partir de cinco amostras de pacientes da cidade de San Joaquim, identificado como MACV

(JOHNSON et al, 1965). Seu reservatório natural é o roedor Calomys callosus, sendo este

arenavírus responsável por grandes surtos de doença hemorrágica grave, com letalidade média

de 20%. Entre os anos de 1962 e 1964, vários surtos de FHB envolveram mais de 1000

pacientes, resultando em 180 mortes. Os picos de incidência ocorreram nas estações de

outono e inverno, correspondente a estação seca (Doyle et al., 1998). Infecções hospitalares

causadas pelo MACV já foram claramente demonstradas, embora a maioria dos casos de FHB

seja pelo contato direto com excretas do C. callosus ou por aerossóis (Charrel & Lambalerrie,

2003).

O GTOV foi originalmente isolado em 1989, quando houve um surto de doença

hemorrágica grave no município de Guanarito, Venezuela. A doença foi designada como

Febre Hemorrágica Venezuelana (FHV) (SALAS et al, 1991). Os roedores Zygodontomys

brevicauda e Sigmodon alstoni são seus hospedeiros principais. Até 2002 cerca de 200

pessoas foram diagnosticadas com a FHV. Neste mesmo ano 18 casos foram registrados,

constatando-se duas mortes (Charrel & Lambalerrie, 2003).

O SABV foi isolado em 1990, mediante de um caso fatal de febre hemorrágica

(Coimbra et al., 1994). Após o isolamento foram relatados dois casos de infecção laboratorial

(Vasconcelos et al., 1993). O reservatório deste vírus ainda não foi identificado, mas

presume-se que seja um roedor encontrado nas proximidades da pequena comunidade de

Sabiá, município de Cotia, estado de São Paulo, onde a única infecção natural conhecida

ocorreu (Buchmeier et al., 2007).

1.6 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DOS ARENAVÍRUS NO BRASIL

O primeiro arenavírus encontrado no Brasil foi o AMAV isolado em amostras de

roedores capturados na região de Serra do Navio, Amapá, próximo ao Rio Amaparí (Fig.7).

As amostras foram coletadas entre os anos de 1964 e 1966 das espécies de roedores da

espécie Neacomys guinae e Oryzomys capito, reservatórios naturais do AMAV (Pinheiro et

al., 1966; 1967). A presença do vírus foi detectada em amostras de urina dos roedores, o que

evidencia o mecanismo de transmissão a hospedeiros suscetíveis, no entanto, casos de

infecção pelo AMAV em humanos ainda não foram diagnosticados (Pinheiro et al., 1967).

25

O FLEV foi isolado em 1975 a partir de amostras de roedores do gênero Oryzomys

(Pinheiro et al, 1977). Os roedores foram capturados em matas do trecho Itaituba-

Jacareacanga na rodovia Transamazônica, Estado do Pará. Ainda não foi detectada infecção

natural do homem, porém ocorreu um caso de infecção em laboratório, em que o paciente

apresentou sintomas clínicos de febre, calafrios, forte cefaléia, mialgia generalizada, queda de

cabelos, vômitos e diarréia. A doença persistiu por um mês sem alterações nos sintomas

(Pinheiro et al., 1986).

Outro arenavírus também encontrado na região de Serra do Navio no Norte do País na

década de 70 foi o vírus Cupixi, isolado de espécimes de Oryzomys capito. Não há

informações sobre transmissão do vírus para humanos (Charrel et al., 2002).

O arenavírus de maior relevância até o momento para o território nacional é o SABV,

causador de febre hemorrágica severa em humanos. Houve apenas um caso de infecção

natural pelo SABV ocorrido no Estado de São Paulo, em que a paciente apresentou um

quadro grave de febre hemorrágica e veio a óbito no quarto dia após sua internação (Coimbra

et al., 1994). Dois outros casos descritos na literatura derivam de acidentes laboratoriais e,

apesar de terem causado doenças graves não resultaram em morte (Vasconcelos et al., 1993;

Enria & Pinheiro, 2000).

1.7 PROPRIEDADES LABORATORIAIS DOS ARENAVÍRUS

Os arenavírus crescem em várias culturas celulares de vertebrados, como as linhagens

de células VERO E6, BHK-21, de rim de porco, rim de coelho e HeLa. Os arenavírus

apresentam crescimento lento em cultura e, em ensaios de formação de placas levam de

quatro a nove dias em meio semi-sólido para o aparecimento das placas (Enria et al, 2005).

Entre os animais de laboratórios suscetíveis aos arenavírus estão os camundongos,

hamsters e cobaias. A idade do animal hospedeiro, o genótipo do hospedeiro e a via de

inoculação são fatores que interferem no resultado da infecção, os arenavírus do Novo Mundo

em geral não são patogênicos para camundongos adultos, porém a inoculação intracraniana

em camundongos recém-nascidos leva a encefalite (Borden & Nathanson, 1974).

Relações antigênicas entre os arenavírus podem ser evidenciadas através de ensaios

sorológicos. Os testes de fixação do complemento (FC) e de imunofluorescência indireta

(IFI), que reconhecem principalmente epítopos da NP, diferenciaram os arenavírus nos grupos

do Velho e Novo Mundo, mostrando a baixa relação antigênica entre eles (Rowe, Pugh, Webb

& Peters, 1970; Wolff et al, 1978). Por outro lado, ensaios imunoenzimáticos (ELISA), IFI e

26

testes de neutralização (TN), demonstraram fortes relações antigênicas entre os AMAV,

JUNV, MACV e TCRV, além da proximidade entre os vírus PICV, PARV e TAMV

(SANCHEZ et al, 1989; HOWARD et al, 1985).

1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O isolamento dos arenavírus a partir do soro ou sangue do paciente durante a fase

aguda da doença pode ser feito por inoculação em hamsters ou camundongos recém-nascidos.

Culturas de células Vero também são frequentemente usadas para o isolamento viral. As

técnicas de IFI e FC têm sido pouco utilizadas para diagnóstico, sendo substituídas

principalmente pelo teste de ELISA, devido sua alta sensibilidade (Enria et al, 2005). Vários

ensaios de ELISA foram desenvolvidos, como o ELISA IgG direto para identificação de

arenavírus do Novo mundo como MACV, JUNV, TCRV, AMAV e TAMV, feito em 1981 a

partir da sensibilização de cobaias e o ELISA IgG indireto desenvolvido para a detecção de

anticorpos em roedores infectados (Ivanov et al, 1981; Morales et al, 2002). Mais

recentemente as técnicas de ELISA têm sido aprimoradas, como a técnica de ELISA IgG

indireto a partir de nucleoproteínas recombinantes do JUNV, que mostrou ser eficaz na

detecção de anticorpos de outros arenavírus além do JUNV (Machado et al, 2010). Ensaios

imunoenzimáticos para IgM e IgG são utilizados no diagnóstico das febres hemorrágicas

causadas pelos LASV e MACV (Peters et al, 1973; Branco et al, 2011).

A transcrição reversa seguida da reação em cadeia mediada pela polimerase (Reverse

Transcription Polymerase Chain Reaction- RT-PCR) tem sido aplicada com sucesso e pode

ter papel importante quando há necessidade de diagnóstico etiológico devido à morte do

paciente antes do aparecimento de anticorpos (Enria et al, 2005). A RT-PCR é o método de

escolha para detecção rápida do LASV em amostras de sangue (Demby at al, 1994). Outros

protocolos de RT-PCR convencional já foram desenvolvidos para outros vírus, como o JUNV

e LCMV (Lozano et al, 1995; PARK et al, 1997), além do RT-PCR em tempo real para os

TCRV e LASV (Grajkowska et al, 2009, Branco et al, 2011).

Recentemente, em Serra Leoa, África, foram desenvolvidos testes sorológicos rápidos

para o diagnóstico de infecções pelo LASV. Baseados em dois anticorpos monoclonais para a

proteína NP, os testes podem apresentar o resultado em apenas 20 minutos (Branco et al,

2011).

27

1.9 TRATAMENTO

Em doenças causadas pelo JUNV, na Argentina, o tratamento utilizado até o oitavo dia

após início da infecção é a transfusão de plasma imune. O tratamento diminui a taxa de

mortalidade de 15% a 30% para menos de 1%, porém não possui eficácia quando iniciado

após o oitavo dia da doença instalada (Enria et al, 2005).

O tratamento indicado para outras Febres Hemorrágicas Sul Americanas, tem sido a

ribavirina intravenosa, que tem demonstrado um bom prognóstico em relação aos pacientes

infectados (BARRY et al, 1995, Kilgore et al,1997). A ribavirina é ainda utilizada no

tratamento da Febre Hemorrágica causada pelo LASV (Jahrling et al, 1980) e mostrou ser útil

no tratamento de casos de Febre Hemorrágica Argentina (Enria et al, 2005).

1.10 PREVENÇÃO E CONTROLE

Uma das formas de prevenção da infecção por arenavírus encontrada na Bolívia foi

através de um programa de controle no Departamento de Beni em 1964. A eliminação em

massa de roedores Calomys callosus levou a significante diminuição dos casos de Febre

Hemorrágica Boliviana nas áreas endêmicas (Mercado, 1975). Embora esta forma de controle

tenha sido eficiente, em alguns casos ela torna-se difícil, como em infecções pelo LCMV, em

que seu hospedeiro natural - Mus musculus - tem distribuição mundial, bem como em áreas

onde os reservatórios distribuem-se em campos ou matas próximas a plantações.

A vacina Candid#1, feita a partir de partículas virais do JUNV inativadas, começou a

ser produzida em meados da década de 90, mostrando novos caminhos para a prevenção da

FHA. A eficácia da vacina foi testada em 15.000 trabalhadores rurais que viviam em

constante risco de infecção natural. Posteriormente, mais de 100.000 pessoas foram

imunizadas na Argentina. Um estudo prospectivo mostrou que a vacina teve eficácia igual ou

maior que 84%, apresentando efeitos adversos mínimos. A vacina foi licenciada em 2006 para

uso exclusivo na Argentina (Charrel et al., 2011).

Atualmente não há estudos definitivos comprovando a eficácia da Candid#1 para

outras febres hemorrágicas causadas por arenavírus Sul Americanos. Apesar de esforços para

o desenvolvimento de novas vacinas seguras, ainda não há nenhuma outra disponível e

aprovada pela Organização Mundial de Saúde (Charrel et al., 2011).

28

Pesquisas para o desenvolvimento de outras vacinas para diferentes arenavírus estão

sendo realizadas, porém ainda não existem resultados conclusivos (Geisbert et al, 2005;

Bergthaler et al, 2006).

1.11 JUSTIFICATIVA

Informações sobre o panorama epidemiológico incluindo a circulação dos arenavírus

no Brasil são muito escassas. Poucos estudos têm sido realizados para avaliar áreas

endêmicas desses vírus e quais os riscos que oferecem à população. Devido à gravidade

das infecções causadas por alguns arenavírus incidentes em territórios próximos como o

JUNV, GTOV, MACV e, ainda ao SABV presente no País, pesquisas tornam-se

necessárias para que haja maior segurança e conhecimento que possam subsidiar

providências a serem tomadas em possíveis epidemias.

29

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver testes de ELISA e RT-PCR, visando a detecção da circulação de arenavírus

em amostras de roedores silvestres capturados na Amazônia brasileira.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Desenvolver um ensaio imuno-enzimático (ELISA) para detecção de anticorpos da

classe IgG em amostras de roedores silvestres, utilizando antígenos de sucrose-acetona do

SABV (arenavírus brasileiro);

- Detectar anticorpos da classe IgG para arenavírus em amostras de sangue de roedores

capturados na área de abrangência da Amazônia brasileira, pelo ensaio de ELISA;

- Desenvolver a técnica de RT-PCR e Semi-Nested-PCR para a detecção do genoma

viral de arenavírus do complexo Tacaribe;

- Tentativa de detecção do genoma viral pela técnica de RT-PCR em vísceras de

roedores sorologicamente positivas pelo teste de ELISA IgG.

30

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 AMOSTRAS

As amostras de sangue de roedores silvestres utilizadas neste estudo pertencem a

Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas (IEC), e foram

coletadas durante estudos ecoepidemiológicos para a investigação de hantavirose realizados

pelo Serviço de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde (MS), com a participação

do IEC e das secretarias de saúde dos estados e/ou municípios em questão. Foram analisadas

1.395 amostras de sangue de roedores capturados entre os anos de 2001 e 2010 através do

método de ELISA (Quadro 2). Posteriormente, as vísceras dos roedores soropositivos para

arenavírus foram submetidas à técnica de RT-PCR. O estudo foi autorizado pela Direção do

IEC (Anexo 1).

Quadro 2 – Amostras de sangue de roedores silvestres analisadas pela técnica de

ELISA IgG.

Município UF Número de amostras Data de Coleta

Tangará da Serra MT 106 Nov/ 2001

Anajatuba MA 92 Mai/ 2003

Itacoatiara AM 7 Ago/ 2004

Anajatuba MA 119 Mai/ 2005

Alto Paraíso RO 120 Jul/ 2005

Altamira PA 28 Nov/2005

Campo Novo do Parecis MT 105 Dez/2005

Campo Novo do Parecis MT 48 Set/2006

Campo Novo do Parecis MT 166 Out/ 2006

Campo Novo do Parecis MT 29 Nov/2006

Campo Novo do Parecis MT 41 Fev/2007

31

Quadro 2 – Amostras de sangue de roedores silvestres analisadas pela técnica de

ELISA IgG.(continuação).

Município UF Número de

amostras Data de Coleta

Campo Novo do Parecis MT 80 Abr/ 2007

Campo Novo do Parecis MT 86 Jul/2007

Campo Novo do Parecis MT 7 Fev/ 2008

Campo Novo do Parecis MT 12 Mai/2008

Campo Novo do Parecis MT 30 Set/2008

Rondonópolis MT 82 Jul/2008

Capixaba AC 87 Ago/2009

Rurópolis PA 9 Out/ 2009

Alta Floresta MT 112 Set/2010

Feliz Natal MT 29 Mar/2010

3.2 TESTE DE ELISA IgG

O ensaio imunoenzimático para detecção de anticorpos IgG anti-arenavírus foi adaptado do

protocolo descrito por Morales et al (2002). A técnica baseia-se na detecção de anticorpos da classe

IgG anti-arenavírus através da sensibilização da placa com o antígeno viral, onde anticorpos

específicos presentes no sangue dos animais se ligarão ao antígeno e, em seguida, anticorpos

específicos anti-anticorpos de roedores silvestres revelarão o resultado do teste (Fig. 8).

O antígeno específico para arenavírus utilizado, produzido pelo IEC, foi preparado a partir

cérebros de camundongos infectados com a cepa SP H 114202 (SABV) e inativado pelo método de

sucrose-acetona (Clarke & Casals, 1958). O antígeno inespecífico utilizado foi o de cérebros de

camundongo normal (CCN), não infectado e também extraído pelo método de sucrose-acetona.

Como controle positivo do teste foi produzido um fluido ascítico imune (FAI) para o SABV;

como controle negativo, três amostras de sangue de roedores negativos para arenavírus foram

empregadas.

32

Figura 8: ELISA IgG indireto. Na placa de ELISA (1) é feita a sensibilização com o antígeno (2), em seguida, a

amostra de sangue é colocada e se esta contiver anticorpos

específicos IgG, os mesmos se ligarão ao antígeno formando um complexo antígeno-anticorpo (3). Para a

detecção da reação, um anti- anticorpo de roedor

conjugado com a enzima peroxidase é adicionado ligando-

se ao complexo (4), a revelação é feita pela adição do substrato da enzima (peróxido de hidrogênio e

cromógeno), que ao se ligar a peroxidase forma um

produto colorido (5). Fonte: Adaptação de http:.. www.leinco.com.indirect_elisa.

3.2.1 Obtenção do antígeno pelo método da sucrose-acetona

Camundongos albinos suíços recém-nascidos foram inoculados intra-cranialmente com

0,02mL de uma suspensão de cérebro de camundongo infectado com o SABV. Os

camundongos inoculados foram examinados duas vezes ao dia para observar sinais de doença

e, quando apresentaram estes sinais foram levados para o laboratório, onde os cérebros foram

removidos assepticamente, colocados em uma placa de Petri, pesados e guardados à

temperatura de –70 °C, até o preparo do antígeno.

33

Para a extração do antígeno, os cérebros já pesados foram macerados e, em seguida, foram

adicionados quatro volumes de solução aquosa de sucrose a 8,5 %, a qual foi colocada aos

poucos, misturando bem até que a suspensão ficasse homogênea. Foram colocados lentamente

junto ao homogeneizado vinte volumes de acetona pura gelada, sendo agitado e deixado em

repouso durante cinco minutos a 4 °C. Em seguida a decantação, o sobrenadante foi

desprezado e foi reposto o mesmo volume de acetona. Após agitação vigorosa, a mistura foi

deixada uma hora em repouso a 4°C. A seguir foi feita a decantação e descarte do

sobrenadante. O precipitado foi seco durante uma hora em bomba para vácuo. Em seguida foi

hidratado com solução de cloreto de sódio a 0,85 %, em volume igual a duas vezes o peso

inicial dos cérebros. Foi deixado overnight a 4°C para completa hidratação do sedimento.

Após isso, a solução foi centrifugada a 8.000 rpm durante quinze minutos a 4 °C, sendo o

sobrenadante decantado, obtendo dessa forma, o antígeno que foi mantido à temperatura de

-70 °C até o seu uso.

3.2.2 Titulação

Para definir as concentrações utilizadas no teste, foi previamente realizada uma titulação com

diferentes concentrações dos antígenos e do conjugado, sendo os soros mantidos na

concentração de 1:100. As concentrações testadas para o antígeno foram 1:50, 1:100, 1:200,

1:400, 1:800 e 1:1600, já as concentrações para o conjugado foram 1:400, 1:800, 1:1000,

1:2000 e 1:4000. A partir desta diluição definiu-se como título padrão para os antígenos

(específico e inespecífico) a concentração de 1:200 e, como título para o conjugado definiu-se

a concentração de 1:1000. O controle positivo para o teste apresentou absorbância de 0,904 e

os controles negativos em torno de 0,006, após a correção óptica.

3.2.3 Sensibilização

Em uma placa de ELISA foram adicionados 100µL do antígeno específico em cada

poço, em fileiras alternadas. Do mesmo modo foram colocados 100µL do antígeno

inespecífico em cada poço das fileiras alternadas vazias. Para o teste, os antígenos foram

diluídos 1:200 em solução salina tamponada (PBS) pH 7,4 e a placa incubada overnight a 4°C

em câmara úmida (Fig. 9).

34

Figura 9: Placa de ELISA. Sensibilização com o antígeno do

arenavírus Sabiá (A) e com o antígeno inespecífico CCN (I).

3.2.4 Adição das amostras

A placa de ELISA sensibilizada foi lavada seis vezes com PBS contendo Tween 20

(0,1%) - tampão de lavagem. Posteriormente, foram colocados os controles positivo e

negativos e as amostras de sangue de roedores, todos diluídos a 1:100 em solução de PBS

contendo Tween 20 (0,1%) com leite desnatado a 5%. Foram adicionados 100 µL dos

controles positivo e negativo e, igual volume das amostras de roedores em dois poços, um

sensibilizado com o antígeno do SABV (específico) e outro com o antígeno inespecífico

(CCN). Após a adição dos soros a placa foi incubada em câmara úmida, em estufa a 37°C por

60 minutos.

Figura 10: Adição das amostras. Na placa, primeiramente coloca-se o

controle positivo (C+) e os três controles negativos (C-), em seguida inicia-se a adição das amostras de sangue a serem analisadas (S1-S44).

35

3.2.5 Adição do conjugado

Após a incubação a placa foi novamente lavada seis vezes com o tampão de lavagem

para retirada dos anticorpos não ligados e, em seguida 100µL do conjugado Anti-IgG de

Peromyscus leucopus (Kirkegaard and Perry Laboratories -KPL) foram adicionados a cada

poço da placa na diluição de 1:1000. O conjugado foi diluído em PBS contendo Tween 20

(0,1%) com leite desnatado a 5%. A placa foi incubada em câmara úmida a 37°C durante 60

minutos.

3.2.6 Substrato

Após uma hora a placa foi lavada seis vezes com o tampão de lavagem e, em seguida,

100µL de substrato ABTS (2,2´ azino- di[ 3- ethyl-benzothiazoline sulfonate (6)] – KPL) e

peróxido de hidrogênio foram adicionados em cada poço da placa e esta, foi incubada por 30

minutos a 37°C. Em seguida, foi realizada a leitura da densidade óptica em comprimento de

onda usando filtro de 405 nm e a placa colocada novamente na estufa a 37°C. Passados 15

minutos nova leitura foi realizada.

3.2.7 Interpretação dos resultados

A análise dos resultados foi realizada através da diferença entre as densidades ópticas

(DO) obtidas nos poços sensibilizados com o antígeno viral e com o antígeno inespecífico

(Fig. 11). As amostras que apresentaram valores iguais ou acima de 0,200 foram considerados

positivos, entre 0,100 e 0,200, limítrofes e menores que 0,100, negativos (Rodrigues et al,

2002).

36

Figura 11: Placa de ELISA após a realização da leitura da densidade óptica do teste.

3.3 TRANSCRIÇÃO REVERSA-REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

3.3.1 Extração do RNA viral

As amostras das vísceras dos roedores silvestres que apresentaram positividade no

teste de ELISA IgG foram maceradas e as suspensões obtidas , submetidas à extração de RNA

pelo kit Pure Link RNA Mini Kit, InvitrogenTM

, seguindo as recomendações do fabricante. Os

procedimentos foram realizados dentro do Laboratório de Nível de Biossegurança 3 (NB3).

3.3.2 Transcrição Reversa – Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) seguida

da reação de Semi-Nested-PCR

As amostras biológicas passaram por dois processos para a detecção do genoma viral.

A primeira etapa foi a produção de um DNA complementar (cDNA) ao RNA viral através da

Transcrição Reversa (RT) seguida da amplificação do cDNA gerado pela PCR. Objetivando

aumentar a sensibilidade do teste, foi realizado um Semi-Nested-PCR. Os iniciadores

necessários aos procedimentos foram desenhados com base em sequências genômicas

completas do segmento S, gene N, de arenavírus do grupo Tacaribe disponíveis na base de

dados do GenBank (Quadro 3).

Como controle positivo do teste utilizou-se o genoma do SABV e para o controle

negativo o RNA total extraído de cérebros de camundongos normais (CCN).

37

Quadro 3 – Iniciadores utilizados nas etapas de RT-PCR e Semi-Nested-PCR.

Iniciador Sequência Posição

genômica Sentido Etapa Produto

RT-PCR. F1*

GGTTKCCTGTAACAGTGGAYRTA 2104

2126 Senso

RT-PCR e Semi-

Nested

RT-PCR. R1

AACATGTTRGARACCAT

2538

2554 Reverso PCR 450 pb

NESTED. R1

GGKTGGCCWTACATTGG

2379

2395 Reverso

Semi-

Nested 291pb

*Iniciador conservado nas etapas RT-PCR e Semi-Nested.

A técnica utilizada foi adaptada de Lanciotti et al (1991), onde a transcrição reversa

(RT) do RNA viral e a PCR são feitas em uma única etapa. Primeiramente, foi feita a

otimização da técnica, testando-se diferentes concentrações para os primers (10 µM, 25 µM e

50 µM), cloreto de magnésio (1 mM, 1,5 mM, 2,0 mM, 2,5 mM, e 3,0 mM) e números de

ciclos para a RT-PCR (28, 30, 32, 35, 38 e 40).

A primeira etapa do teste consistiu na desnaturação de 5 µL do RNA viral a 94°C

durante cinco minutos. Em seguida, foram adicionados os reagentes para a reação da RT-

PCR, ajustada para o volume final de 50µL, constituída de tampão para PCR (1x – 250 mM

Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 0,1 mM EDTA), DTT (0,1 mM), dNTPs (200µM), inibidor

de RNase (5 U, Invitrogen), cloreto de magnésio (1,5 mM), iniciador senso RT-PCR.F1 (25

µM), iniciador reverso RT-PCR.R1 (25 µM), transcriptase reversa (200 U – Superscript III,

Invitrogen), enzima Platinum TAQ (1,2 U, Invitrogen) e água livre de DNase e RNase. O

termociclador automático (Mastercycler gradient, Eppendorf) foi programado para proceder

uma incubação de 60 minutos a 42°C e em seguida 35 ciclos de desnaturação (94°C, 1

minuto), anelamento de iniciadores (50°, 2 minutos) e extensão dos iniciadores (3 minutos),

havendo finalização da extensão a 72°C durante 10 minutos.

A segunda amplificação iniciou-se a partir do uso de 5 µL do produto da RT-PCR

diluídos 1:100 em água livre de RNAse e DNAse. Em seguida houve a adição de tampão para

PCR (1x – 250 mM Tris-HCl pH 8,3; 100mM NaCl; 0,1 mM EDTA), dNTPs (200µM),

inibidor de RNase (5 U., Invitrogen), cloreto de magnésio (1,5 mM), iniciador senso RT-

PCR.F1 (25 µM), iniciador reverso NESTED.R1 (25 µM), enzima Platinum TAQ (1,2 U,

Invitrogen) e água livre de DNase e RNase. A reação consistiu em 20 ciclos de desnaturação

(94°C, 30 segundos), anelamento dos iniciadores (50°C, 1 minuto), extensão dos iniciadores

38

(72°C, 2 minutos), além da finalização da extensão (72°C, 10 minutos). Esta etapa também foi

realizada com volume final da reação ajustado para 50 µL.

3.3.3 Sensibilidade e especificidade

A sensibilidade RT-PCR seguida da Semi-Nested-PCR foi determinada através das

diluições seriadas em base 2 e 5, sendo o procedimento realizado em duplicata.

Para a avaliação da especificidade dos iniciadores da técnica, foram utilizados os

genomas de oito arenavírus pertencentes ao grupo Tacaribe. O limite de detecção foi

verificado através do teste com o SABV, AMAV e FLEV extraídos de amostras de cérebro de

camundongo infectado, e com os vírus Junín, Paraná, Latino, Guanarito, e Machupo, estes

com genomas sintéticos na forma de cDNA (gBlocksTM

, IDT). Tais genomas foram

desenhados com base no GenBank e suas sequências construídas a partir das regiões que os

iniciadores desenvolvidos se anelam, tal estratégia foi utilizada devido a indisponibilidade de

tais materiais genéticos no laboratório. Como os vírus sintetizados são fitas de DNA, estes

não passaram pelo processo da RT, apenas pela PCR. Para a determinação da especificidade

ainda foram paralelamente testados os Dengue-1, Febre Amarela, Bussuquara, Hantavírus –

Castelo dos Sonhos, Bushbush, Benfica, Apeu, Icoaraci e Belterra.

As concentrações finais utilizadas para o limite de detecção foram de 200ng, 100ng,

50ng, 25ng, 12,5ng, 6,25ng, 3,125ng, 1,56ng, 0,312 ng, 0,062ng, 0,012ng, 0,002ng, 0,5pg e

0,09pg. As concentrações finais do SABV, AMAV, e FLEV foram medidas a partir do RNA

total extraído, já as dos arenavírus sintetizados foram medidas a partir do cDNA puro. A

quantificação do material genético foi feita pelo aparelho Qubit® 2.0 Fluorometer,

InvitrogenTM.

3.3.4 Produtos Obtidos

Os produtos obtidos na Semi-Nested-PCR foram submetidos a análise por eletroforese

em gel de agarose 1,5%, imerso em tampão TAE (1x) e corado com SYBR safe DNA gel

stain, Invitrogen. Os amplicons foram comparados ao padrão do peso molecular 100 bp DNA

Mass Leader (Invitrogen), visualizados em transluminador com emissão de raios UV e

fotografados para documentação.

39

4. RESULTADOS

4.1 ELISA IgG

Dentre as 1.395 amostras de soro de roedores testadas pela técnica de ELISA IgG, 31

amostras foram positivas, representando 2,2% do total analisado. As amostras positivas

pertencentes ao Estado do Mato Grosso representaram 96,77%, sendo apenas uma dessas

amostras proveniente do Estado de Rondônia (Quadro 4).

Qu

ad

ro 4

– A

most

ras

posi

tivas

par

a ar

enav

írus

atra

vés

do t

este

de

EL

ISA

IgG

.

40

4.2 AMOSTRAS TESTADAS POR RT-PCR

A partir do resultado do teste de ELISA IgG, as vísceras disponíveis dos roedores

positivos para arenavírus, que totalizaram 60 amostras, foram analisadas (Quadro 5). As

amostras RO 20386 e RO 22390 não foram incluídas, pois não haviam fragmentos de vísceras

disponíveis.

A análise das vísceras pelo método da RT-PCR seguida da Semi-Nested-PCR não

apresentou positividade para nenhuma das amostras testadas.

Quadro 5 – Amostras viscerais analisadas pelo método da RT-PCR e Semi-Nested-PCR.

10 RIM AN 6500131

RO19000

11 CORAÇÃO AN 6500132

12 PULMÃO AN 650139

13 RIM AN 6500161

RO19003



16 RIM AN 6500311

RO19018



19 RIM AN 6500581

RO19045



22 RIM AN 6500821

RO19069



25 RIM AN 6501031

RO19090



28 FÍGADO AN 693239 RO19672


30 FÍGADO AN 700774

RO19860 31 BAÇO AN 700896

32 RIM AN 701018


N° Víscera Amostra N° Campo

1 RIM AN 649982 RO 18969

2 PULMÃO AN 650108

3 RIM AN 649984 RO18971

4 PULMÃO AN 650110

5 RIM AN 6499881

RO18975


7 PULMÃO AN 650114

8 RIM AN 640007 RO18994

9 PULMÃO AN 650133

41

Quadro 5 – Amostras viscerais analisadas pelo método da RT-PCR e Semi-Nested-PCR

(Continuação).

N° Víscera Amostra N° Campo


RO 19871 35 BAÇO AN 700907

36 RIM AN 701029



RO 19894 39 RIM AN 701052



RO 19905 42 RIM AN 701063


44 FÍGADO AN 700822 RO 19908

45 RIM AN 701066

46 FÍGADO AN 707784 RO 20423

47 FÍGADO AN 707789 RO 20428

48 FÍGADO AN 707798 RO 20437

49 FÍGADO AN 717819 RO 20458

50 FÍGADO AN 717882 RO 20521

51 FÍGADO AN 717922 RO 20561

52 RIM AN 727665 RO 20728


54 RIM AN 727669 RO 20732


56 RIM AN 729875 RO 20947

57 RIM AN 729880 RO 20952

58 RIM AN 729889 RO 20961

59 RIM AN 729913 RO 20985

60 PULMÃO AN 733238 RO 21172

4.3 RESULTADOS DO LIMITE DE DETECÇÃO

4.3.1 Vírus Amaparí

A RT-PCR realizada para o AMAV foi sensível para as concentrações de 200ng,

100ng, 50ng, 25ng, 12,5ng, 6,25ng, 3,125ng e 1,56ng. (Fig. 11). Quando submetido a Semi-

Nested- PCR, houve aumento na sensibilidade teste, detectando-se o vírus até a concentração

de 0,012ng (Fig. 12).

42

Figura 12: RT-PCR para o AMAV. Gel de agarose com as concentrações de 200ng a 0,0124ng (1-11) aplicando-se 8µL de amostra.

H2O: Controle da água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso

Molecular.

Figura 13: Semi-Nested-PCR do AMAV. Gel de

agarose com as concentrações de 1,56ng, 0,312ng, 0,064ng, 0,012ng e 0,002ng (1-5)

aplicando-se 8µL de amostra. H2O: Controle da

água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

4.3.2 Vírus Flexal

O teste de RT-PCR foi sensível para o FLEV nas concentrações de 200ng, 100ng,

50ng, 25ng e 12,5ng (Fig. 13). Para a Semi-Nested-PCR o limite de detecção mínimo foi

0,064ng (Fig. 14).

43

Figura 14: RT-PCR para o FLEV. Gel de agarose com as concentrações de 200ng a 0,064ng (1-10). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de SABV;

PM: Peso Molecular.

Figura 15: Semi-Nested-PCR do FLEV. Gel de

agarose com as concentrações de 6,25ng, 3,125ng, 1,56ng, 0,312ng, 0,064ng e 0,012ng

(1-6), aplicando-se 8µL de amostra. H2O:

controle da água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

4.3.3 Vírus Sabiá

O SABV foi detectado pela RT-PCR através do gel de agarose nas concentrações de

200ng, 100ng, 50ng, 25ng, 12,5ng, 6,25ng e 3,25ng (Fig. 15). Quando submetido a Semi-

Nested-PCR o nível de detecção foi aumentado para a concentração de 0,064ng (Fig. 16).

44

Figura 16: RT-PCR para o SABV. Gel de agarose com as concentrações de

200ng a 0,064ng (1-10). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

Figura 17: Semi-Nested-PCR do SABV. Gel de

agarose com as concentrações de 0,312ng, 0,064ng, 0,012ng e 0,002ng (1-4), aplicando-se

8µL de amostra. H2O: Controle da água; C:

Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

4.3.4 Vírus Paraná

O PARV foi detectado na PCR nas concentrações de 200ng, 100ng, 50ng, 25ng,

12,5ng, 6,25ng, 3,125ng, 1,56ng, 0,312ng e 0,064ng (Fig. 17). Já na Semi-Nested-PCR, a

detecção atingiu a concentração de 0,5pg (Fig. 18).

45

Figura 18: PCR para o PARV. Gel de agarose com as concentrações de 200ng a 0,002ng (1-10). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de

SABV; PM: Peso Molecular.

Figura 19: Semi-Nested-PCR do PARV. Gel de

agarose com as concentrações de 0,064ng, 0,012ng, 0,002ng , 0,5pg e 09pg (1-5),

aplicando-se 8µL de amostra. H2O: Controle da

água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

4.3.5 Vírus Junin

Quando submetido a PCR o JUNV apresentou sensibilidade para as concentrações de

200ng, 100ng, 50ng, 25ng, 12,5ng, 6,25ng e 3,25ng (Fig. 19), na Semi-Nested- PCR a menor

concentração detectável foi de 0,002ng (Fig. 20).

46

Figura 20: PCR para o JUNV. Gel de agarose com as concentrações de 200ng a 0,002ng (1-12). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de SABV; PM:

Peso Molecular.

Figura 21: Semi-Nested-PCR do JUNV. Gel de

agarose com as concentrações de 0,064ng, 0,012ng, 0,002ng e 0,5pg (1-4), aplicando-se 8µL

de amostra. H2O: Controle da água; C: Controle

positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

4.3.6 Vírus Guanarito

A PCR do GTOV detectou quantidades de material genético nas concentrações de

200ng, 100ng, 50ng, 25ng e 12,5ng (Fig. 21). A Semi-Nested-PCR detectou o vírus até a

concentração de 1,56ng (Fig. 22).

47

Figura 22: PCR para o GTOV. Gel de agarose com as concentrações de

200ng a 0,012ng (1-11). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de

SABV; PM: Peso Molecular.

Figura 23: Semi-Nested-PCR do GTOV. Gel de agarose com as concentrações de 1,56ng,

0,312ng, 0,064ng e 0,012ng (1-4), aplicando-se

8µL de amostra. H2O: Controle da água; C:

Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

48

4.3.7 Vírus Machupo

Quando feita a PCR para o MACV, não foi possível a sua detecção, porém quando

submetido a Semi-Nested-PCR, o vírus pode ser detectado até a concentração de 1,56ng (Fig.

23).

Figura 24: PCR e Semi-Nested-PCR para o MACV. Em a: PCR das concentrações de 200ng a 1,56ng (1-8); b: Semi-Nested-PCR com as concentrações de 6,25ng, 3,12ng, 1,56ng e

0,064ng (1-5). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso Molecular.

4.3.8 Vírus Latino

Bandas fracas apareceram na PCR do LATV, aparecendo apenas nas concentrações de

200ng e 100ng. A Semi-Nested- PCR detectou o material genético até a concentração de

12,5ng (Fig. 24).

49

Figura 25: PCR e Semi-Nested-PCR para o LATV. Em a: PCR das concentrações de

200ng a 1,56ng (1-8); b: Semi-Nested-PCR com as concentrações de 25ng, 12,5ng, 6,25ng 3,25ng e 1,56ng (1-5). H2O: Controle da água; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso

Molecular.

4.3.9 Vírus Inespecíficos

A RT-PCR e Semi-Nested- PCR não detectaram os vírus Dengue-1, Febre Amarela, Bussuquara,

Hantavírus – Castelo dos Sonhos, Bushbush, Benfica, Apeu, Icoaraci e Belterra (Fig. 25).

Figura 26: Semi – Nested-PCR para vírus inespecíficos aos iniciadores. 1- Hantarívus

– Castelo dos Sonhos; 2- Febre Amarela; 3- Dengue – 1; 4- Icoaraci; 5- Belterra; 6-

Benfica; 7- Bussuquara; 8- Bushbush; 9- Apeu. H2O: Controle da água; CCN: Controle de camundongo normal; C: Controle positivo de SABV; PM: Peso

Molecular.

50

4.3.10 Limite de detecção mínimo para os arenavírus

Os limites de detecção mínimos para os arenavírus do complexo Tacaribe testados

foram 0,5pg (PARV), 0,002ng (JUNV), 0,012ng (AMAV), 0,062ng (SABV e FLEV), 1,56ng

(GTOV e MACV) e 12,5ng (LATV) (Gráfico 1).

Gráfico 1- Limite de detecção mínimo para os arenavírus do complexo Tacaribe, dado

através das concentrações em nanogramas (ng).

51

5. DISCUSSÃO

Estudos anteriores demonstraram que as características antigênicas dos arenavírus

permitem seu agrupamento em vírus do Novo Mundo e do Velho Mundo (Rowe, Pugh, Webb

& Peters, 1970). Testes de IFI, FC e ELISA já demonstraram serem eficazes para a

identificação cruzada entre arenavírus do Grupo Tacaribe (Sanchez et al, 1989; Casals et al,

1975; Rowe, Pugh, Webb & Peters, 1970). Antígenos tratados pelo método de sucrose-

acetona (Kuno et al, 1991; Clarke e Casals, 1958), foram utilizados por Vasconcelos et al

(1993) para o diagnóstico específico do soro de paciente infectado com o SABV através dos

métodos de FC e pela detecção de anticorpos IgM pelo Ensaio Imunoenzimático de Captura

(MAC – ELISA). Outros testes de ELISA baseados no uso de antígenos tratados pelo método

de sucrose- acetona são muito utilizados no diagnóstico de enfermidades virais, como as

causadas pelos vírus Dengue (Nunes et al, 2011), Oropouche (Vasconcelos et al, 1989 e

Mayaro (Casseb, 2010).

Para o teste de ELISA, desenvolvido neste trabalho, não foi possível a formação de um

painel composto de amostras de roedores silvestres positivos para arenavírus. Para a melhor

avaliação do teste seria necessária uma quantidade considerável dessas amostras que

permitiriam a análise da sensibilidade e especificidade do ensaio. Além das dificuldades para

dispor de amostras de roedores silvestres positivas, a captura de tais roedores e manejo de

colônias também tornaram-se inviáveis para este projeto devido a necessidade de autorização

do Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) e o curto

tempo após o desenvolvimento do teste para a defesa desta dissertação. Além disso, a maioria

das amostras testadas pertencem ao gênero Calomys sp., roedores não característicos da

região Norte do Pará.

Morales et al (2002) realizou a captura de Calomys musculinus e Calomys laucha para

avaliar um teste de ELISA IgG indireto para roedores infectados com o vírus Junin, , que após

submetidos a testes para arenavírus e mantidos em quarentena foram utilizados como modelo

para a inoculação do vírus e empregados como um painel com soro e sangue positivos. O teste

de ELISA desenvolvido apresentou sensibilidade e especificidade de 100% e

reprodutibilidade de 87,9% em comparação a IFI, que apresentou sensibilidade de apenas

53%. O teste realizado a partir de antígenos do JUNV também mostrou sensibilidade em

reações cruzadas quando testado com o soro do roedor Neacromys benefactus, reservatório

natural dos vírus Oliveros e Pampas. Os autores ainda comprovaram que não há diferenças

52

estatísticas significantes entre os resultados obtidos pelo teste de ELISA IgG realizado com

soro ou com o sangue total dos roedores, o que facilita o trabalho de campo, já que a obtenção

do sangue total dos animais é mais fácil. Esses resultados reforçam os obtidos no teste de

ELISA desenvolvido no presente estudo, com o antígeno do SABV, pois, apenas o sangue

total dos roedores estava disponível para a avaliação do teste.

A realização de testes sorológicos adicionais FC e TN para comparação com os

resultados obtidos no ELISA desenvolvido neste estudo, ficaram impossibilitados devido à

não disponibilidade de soros nas amostras testadas. Testes de neutralização utilizados na

avaliação do vírus Amaparí realizados por Pinheiro et al. (1966), apresentaram resultados

insatisfatórios quando feitos a partir de vírus coletados de cérebros de camundongos devido a

mortes irregulares dos animais. Vários camundongos sobreviveram às inoculações

intracranianas iniciais do vírus e apenas na sétima passagem, a dose de letalidade (LD50)

chegou a 2,5 log, indicando que, a presença de baixos títulos de anticorpos para arenavírus

podem influenciar no resultado do teste. A maior sensibilidade do ELISA já foi evidenciada

em relação a outros ensaios, como a FC (Ivanov et al, 1981) e, tem sido utilizada como

padrão para a detecção de infecções causadas por arenavírus (Morales et al, 2002).

O desenvolvimento do ensaio de ELISA IgG deste estudo mostrou a presença de

arenavírus circulantes na Amazônia Brasileira. Dentre as 1.395 amostras analisadas, 31

(2,2%) apresentaram positividade. Dados comparativos sobre a pesquisa epidemiológica de

roedores infectados com arenavírus no Brasil são inexistentes, porém os resultados obtidos

entram em consenso com o estudo realizado na Argentina por Mills et al.(1991), que, através

dos testes de ELISA e isolamento viral, analisou a prevalência do JUNV em roedores de áreas

endêmicas e não endêmicas do país. A prevalência do estudo variou de 0,4% a 3,7%, sendo

que, as áreas endêmicas para o JUNV apresentaram de duas a três vezes maior positividade do

que as áreas não endêmicas. Esses resultados corroboram com os obtidos no presente trabalho

e mesmo não havendo no Brasil áreas consideradas endêmicas para arenavírus acredita-se

que, há a circulação de tais vírus, sendo de primordial atenção áreas próximas a plantações.

Para uma melhor avaliação do teste de ELISA IgG desenvolvido, a adaptação de

outros antígenos de arenavírus se faz necessária. Antígenos produzidos em cultura de células

(Mattar et al, 2011) e antígenos de proteínas recombinantes (Machado et al, 2010) poderiam

ser utilizados na sensibilização da placa para posterior comparação com os resultados obtidos

pelas diferentes metodologias. Outra alternativa seria levar a técnica desenvolvida para ser

53

testada em centros de referência para a avaliação de amostras disponíveis de roedores

silvestres sabidamente positivas.

A confirmação do teste de ELISA IgG seria realizada pela técnica de RT-PCR

desenvolvida para os arenavírus sul americanos, porém, todos os testes realizados foram

negativos. Padrões de infecção persistente nos hospedeiros ainda não são bem definidos. Em

Calomys musculinus, a resposta pelo JUNV é dividida, sendo que a metade dos hospedeiros

silvestres torna-se crônica, com viremia persistente e, a outra metade elimina a infecção (Mills

et al, 1992). Porém, mesmo quando existe a cronicidade da infecção, há períodos em que a

excreção do vírus não é detectada (Pinheiro et al, 1977). A ausência de material genético viral

pode ter ocorrido devido a não cronicidade nos roedores estudados, ou mesmo pela baixa

carga viral presente nos tecidos desses roedores. Outro ponto a ser levado em consideração é

o armazenamento das amostras, que podem resultar em variações de temperatura durante os

anos de estocagem e, como os arenavírus são vírus de RNA, estes se degradam facilmente

com o acondicionamento inadequado, o que pode justificar os resultados negativos pela RT-

PCR. Por outro lado, a ausência de detecção do genoma pela RT- Semi- Nested – PCR

desenvolvida pode ser devido ao cruzamento sorológico por ELISA entre diferentes

arenavírus, o que não se observa por RT-PCR. Assim, é possível que os soros positivos por

ELISA IgG sejam devidos a um arenavírus ainda não isolado, e portanto, por RT-PCR o

resultado negativo para esses arenavírus desconhecidos é esperado.

Os arenavírus apresentam uma grande variabilidade genética entre si devido a vários

fatores, dentre eles, a alta taxa de mutação da polimerase RdRp, o rearranjo genético e

possivelmente as recombinações ocorridas durante a evolução desses vírus, contribuindo para

sua grande diversidade. Acredita-se que, a alta frequência de erros de transcrição seja a

principal razão para a diversidade evolutiva dos arenavírus (Zapata & Salvato, 2013). A

análise filogenética a partir de sequências parciais da NP dividiram as linhagens A, B e C dos

arenavírus do Novo Mundo, que apresentaram divergências de 61% entre as linhagens A e B,

39% entre B e C, e 55% entre A e C (Archer & Rico-Hesser, 2002).

Apesar de todos os arenavírus do complexo do Novo Mundo apresentarem

divergências, eles continuam no mesmo sorocomplexo quando classificados através de soros

imunes, isso significa que, embora haja grande divergência genética entre as linhagens virais,

existem sítios antigênicos comuns que podem ser detectados por ensaios sorológicos (Archer

& Rico-Hesser, 2002). As variabilidades genéticas são obstáculos quando se busca

desenvolver iniciadores para vários tipos de arenavírus. Na literatura é rara a descrição de

54

técnicas de RT-PCR sensíveis a mais de um tipo viral e geralmente os iniciadores são

desenvolvidos para diagnósticos de arenavírus endêmicos, como ocorre com os vírus Lassa e

Junin (Demby, 1994; Lozano, 1995). Uma técnica de RT- PCR para detecção do gênero

Arenavírus foi desenvolvida com base em regiões conservadas das extremidades do segmento

S do RNA genômico, porém o teste codifica todo o segmento S (3,4 Kb), o que acaba

dificultando o diagnóstico viral (Gunther et al, 2000).

Os iniciadores desenvolvidos neste trabalho apresentaram uma boa sensibilidade para

os vírus avaliados. Os menores limites de detecção foram obtidos com os vírus Amaparí,

Junin e Paraná, apresentando valores de 0,012ng, 0,002ng e 0,5pg, respectivamente. Para o

FLEV e SABV a RT-PCR seguida da Semi-Nested detectou até 0,062ng a partir do RNA

total. Menor sensibilidade foi encontrada para os vírus MACV e GTOV, com detecção de

1,56ng e para o LATV, onde a Semi-Nested detectou até a 12,5ng de material genético. Como

os vírus Sabiá, Flexal e Amaparí foram obtidos de amostras de RNA total, a quantidade real

de detecção para o genoma de tais vírus é possivelmente menor do que o estipulado no estudo,

o que indica que a técnica tem boa sensibilidade para os arenavírus brasileiros.

Os outros cinco arenavírus analisados a partir dos cDNAs sintetizados apresentaram

quantidades da sequência alvo puras, sendo possível uma análise mais fidedigna da

quantidade de material genético detectável no teste, porém, para a melhor validação da técnica

a reprodutibilidade do teste deve ser avaliada, sendo necessária, para isto, a análise das

amostras a partir do RNA. Como a aquisição de amostras de arenavírus provenientes de

outros países é difícil, sendo necessários rigorosos critérios de biossegurança, uma alternativa

para a obtenção dos RNAs de tais vírus seria a clonagem das sequências de cDNA alvo e sua

posterior transformação em RNA pela enzima transcriptase reversa.

Estudos com iniciadores degenerados demonstraram sensibilidade de até 1ng de

material genético viral para os Orthopoxvirus a Parapoxvírus, desenvolvidos para Nested-

Multiplex PCR (Abrahão et al, 2009), demonstrando que, os valores obtidos para os

arenavírus deste trabalho estão dentro dos valores sensíveis admissíveis. O resultado da

detecção molecular do LATV foi consideravelmente inferior aos outros arenavírus, contudo,

quando se trabalha com degeneração de iniciadores, principalmente no caso desses vírus, é

esperado que a sensibilidade seja discrepante entre eles. Como a técnica desenvolvida neste

trabalho tem o objetivo de identificar arenavírus sul americanos em geral, o limite de detecção

mínimo para o LATV ainda é aceitável.

55

A especificidade da técnica molecular empregada foi avaliada a partir do teste com os

vírus inespecíficos Dengue-1, Febre Amarela, Bussuquara, Hantavírus (Castelo dos Sonhos),

Bushbush, Benfica, Apeu, Icoaraci e Belterra. Nenhum dos vírus foi detectado, o que

evidencia a qualidade dos iniciadores utilizados para evitar resultados falso-positivos.

A maioria das amostras positivas no teste de ELISA IgG indireto foram provenientes

do Estado do Mato Grosso. Acredita-se, desta forma, na hipótese de que os vírus circulantes

na região sejam o Machupo e Latino ou outro a eles relacionado, já que o estado faz fronteira

com a Bolívia, país endêmico para estes arenavírus. Além disso, quase todos os hospedeiros

da amostragem deste trabalho são do gênero Calomys sp., reservatório do MACV e LATV.

Considerando-se que, todas as amostras analisadas pela RT- PCR foram negativas,

pode-se correlacionar a menor eficiência dos iniciadores para estes dois vírus, que poderiam

não ter sido detectados devido a quantidade de material genético presente nas amostras ser

inferior aos limites detectáveis, ou a um vírus relacionado e ainda não isolado.

Das amostras positivas obtidas, 30 são oriundas de Campo Novo do Parecis, Mato

Grosso, um dos estados que apresentam alto índice de produção agropecuária no Brasil. Nos

últimos quarenta anos, o Brasil desenvolveu diversos núcleos de ocupação e modernização de

fronteiras agrícolas, sendo o município de Campo Novo do Parecis/MT um núcleo de alta

produção agrícola, especializado na produção de grãos, como arroz, milho e soja. O rápido

desenvolvimento agrícola desta região transformou drasticamente a paisagem, substituindo o

cerrado por pastos e plantações. (Portela, 2009). A rápida modificação do cenário é um fator

determinante para a adaptação de roedores que antes habitavam apenas as matas, o que

culmina na transmissão para o homem de doenças antes deconhecidas, como é o caso dos

arenavírus (Hui, 2006). Com todas as condições favoráveis para emergirem na população de

regiões com características como essas, os arenavírus tornam-se grandes candidatos a

possíveis epidemias, por isso, a vigilância em regiões onde há abundância de alimento para

roedores silvestres são de grande relevância.

A RT-PCR realizada com iniciadores degenerados para os arenavírus sul americanos é

uma ferramenta bastante útil para estudos sobre a circulação dos mesmos em determinadas

regiões e até mesmo para a descoberta de novos arenavírus circulantes. Como a técnica nos

permite a detecção de vários arenavírus, uma análise sobre a dispersão de tais vírus entre os

diferentes países sul americanos pode ser feita através dela. No Brasil, não existem

publicações concisas sobre o panorama da prevalência de roedores infectados com arenavírus,

os iniciadores degenerados desenvolvidos neste trabalho serão de grande auxílio para futuros

56

estudos sobre o endemismo dos arenavírus em diferentes regiões do País, sendo um

instrumento efetivo para a coleta de dados que poderão dar suporte a criação de políticas de

prevenção e controle de doenças causadas por esses vírus.

57

6. CONCLUSÃO

- O teste de ELISA IgG indireto desenvolvido para a análise das amostras dos roedores

silvestres da Amazônia Brasileira mostrou capacidade de detectar anticorpos para arenavírus

brasileiros;

- Foi desenvolvido um protocolo para detecção de genomas de arenavírus do Novo

Mundo usando a técnica de RT-PCR seguida da Semi-Nested – PCR.;

- A técnica de RT-Semi-Nested-PCR desenvolvida apresentou alta sensibilidade, tendo

detectado genoma de arenavírus do Novo Mundo até valores de 0,5pg de material genético

dependendo da espécie viral;

- Todos os arenavírus testados foram detectados, sendo o vírus Latino o que apresentou

níveis menores de sensibilidade;

- A especificidade da RT-PCR foi comprovada para diferentes vírus inespecíficos (não

arenavírus), demonstrando que, os iniciadores específicos desenvolvidos não produzem

resultados falso-positivos.

- Os resultados preliminares obtidos neste trabalho servirão como referência para outros

estudos no Brasil, visando o diagnóstico e o esclarecimento sobre a circulação dos arenavírus

no País.

58

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ANEXO 1

Documents

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS ... · que deu origem ao grupo dos arenavírus ( Rowe, Murphy & Bergold, 1970). Os principais reservatórios para os arenavírus