UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ - UFPI

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO - PRPPG

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ALIMENTOS E NUTRIÇÃO -

MESTRADO

JOSYANNE ARAÚJO NEVES

INTERFERÊNCIA DA FARINHA DE TRIGO NA QUALIDADE MICOLÓGICA E

MICOTOXICOLÓGICA DO PÃO TIPO FRANCÊS

Teresina

2013

JOSYANNE ARAÚJO NEVES

INTERFERÊNCIA DA FARINHA DE TRIGO NA QUALIDADE MICOLÓGICA E

MICOTOXICOLÓGICA DO PÃO TIPO FRANCÊS

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição

da Universidade Federal do Piauí, como

requisito parcial para obtenção do título

de Mestre em Alimentos e Nutrição.

Área: Qualidade de Alimentos.

Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches

Muratori.

Teresina

2013

JOSYANNE ARAÚJO NEVES

INTERFERÊNCIA DA FARINHA DE TRIGO NA QUALIDADE MICOLÓGICA E

MICOTOXICOLÓGICA DO PÃO TIPO FRANCÊS

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição

do da Universidade Federal do Piauí,

como requisito parcial para obtenção do

título de Mestre em Alimentos e Nutrição.

Área: Qualidade de Alimentos.

Orientadora: Drª. Maria Christina Sanches

Muratori.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________________________

Profª. Drª. Maria Christina Sanches Muratori - UFPI

(Orientadora/Presidente)

___________________________________________________________________

Prof. Dr. Carlos Alberto da Rocha Rosa - UFRRJ

1º Examinador

___________________________________________________________________

Profª. Drª. Lidiana de Siqueira Nunes Ramos – IFPI

2º Examinador

DEDICATÓRIA

Dedico esta conquista

a minha amada mãe Osmarina Araújo, por seu imenso amor e apoio a todo instante.

Ao meu querido e admirado pai Juarez Barros (in memoriam), por seu exemplo de

obstinação e esforços desprendidos para proporcionar-me educação sólida.

A minha irmã Josynaria Araújo, companheira de muitas alegrias,

tristezas e superações. Ao meu amado Thyago Camelo, por

seu companheirismo, apoio, compreensão, preocupação

e amor em todos os momentos desse percurso.

AGRADECIMENTOS

Poucas tarefas são tão agradáveis como o reconhecimento de minha

gratidão a todos que colaboraram neste trabalho de formas tão diferentes e tornaram

essa etapa menos árdua. Entre esses quero agradecer:

À DEUS, por ter derramado sobre mim as bênçãos necessárias para que

pudesse concluir está etapa de minha jornada.

À Universidade Federal do Piauí, por meio do Programa de Pós-graduação

em Alimentos e Nutrição, em especial a coordenação do mestrado pelo trabalho que

executam.

Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Alimentos e Nutrição,

pelo conhecimento transmitido.

Especialmente, à Prof. Drª. Maria Christina Sanches Muratori, por ter

conduzido a minha orientação, pela transferência de saberes, confiança,

acolhimento e ensinamentos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),

pela bolsa de estudos concedida.

À todas as companheiras do Programa de Pós-Graduação, com os quais

compartilhei experiências e incentivo, pois não poderia deixar de expressar o meu

carinho por vocês e em especial: Ana Paula, Amanda Romero, Érika Pinheiro,

Janice Lustosa, Mariana de Morais e Rosália Torres, que habitam meu coração!

Ao professor Dr. João Batista, membro da banca examinadora da

qualificação do projeto, por sua solicitude e gentileza, além das preciosas

contribuições oferecidas. E aos professores da banca examinadora da dissertação:

Dr. Carlos Alberto da Rocha Rosa, Drª. Lidiana de Siqueira Nunes Ramos,

Drª. Maria Marlúcia Gomes Pereira, pessoas que respeito e admiro pela

competência profissional que possuem, por terem contribuído com meu

conhecimento técnico-científico, pela atenção dispensada e valiosas sugestões

apresentadas.

À Profª. Drª. Waleska Albuquerque por ter contribuído com a realização

desta pesquisa ao ceder gentilmente o laboratório para execução das análises.

À amigas para vida toda que conquistei nessa jornada: Julliet Texeira,

Raizza Escórcio, Verbena Alves e Cristiane Evangelista, pelo apoio e inestimável

colaboração na realização das análises laboratoriais. Sinto-me abençoada por ter a

preciosa e imprescindível amizade de todas!!!

À toda família NUEPPA (Núcleo de Estudos, Pesquisas e Processamento de

Alimentos), especialmente aos amigos: Rodrigo Calvet e Cecília Guimarães pelos

ensinamentos, solicitude e atenção sempre.

Aos meus amigos, pelo incentivo e pela paciência com as minhas ausências.

Aos proprietários e funcionários das panificadoras onde foram realizadas as

coletas amostrais pela contribuição para que o trabalho fosse concretizado.

À todos vocês, e àqueles que eu possa ter deixado de nomear, muito

obrigada!

“Compreendi que tudo em nossas vidas,

todas as coisas que gastam tanto do nosso

tempo e da nossa energia para construir,

tudo é passageiro, tudo é feito de areia; o

que permanece é só o relacionamento que

temos com as outras pessoas. Mais cedo ou

mais tarde, uma onda virá e destruirá ou

apagará o que levamos tanto tempo para

construir. E quando isso acontecer, somente

aquele que tiver as mãos de outro alguém

para segurar, será capaz de rir e recomeçar”.

William Shakespeare

RESUMO

O trigo é um cereal que compõe expressiva parte da dieta de aproximadamente um

terço da população mundial. Os grãos de cereais em função de suas características

estão sujeitos à contaminação por fungos, incluindo aqueles produtores de

micotoxinas. Essa contaminação pode ocorrer no campo, durante a colheita e no

armazenamento. As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos que podem

ocasionar efeitos adversos, como: carcinogênese, teratogênese, nefrotoxicidade e

imunossupressão. Aspergillus, Penicillium e Fusarium são os gêneros mais

frequentemente envolvidos em casos de micotoxicoses em humanos. Em geral, as

micotoxinas são compostos termoestáveis que permanecem viáveis mesmo quando

submetidas a elevadas temperaturas, o que justifica sua presença em alimentos

produzidos a partir de cereais contaminados. Objetivou-se por meio do presente

estudo verificar a interferência da farinha de trigo na qualidade micológica e

micotoxicológica do pão tipo francês. Para isso, foram efetuadas, uma vez por

semana, durante 15 semanas, em duas panificadoras de Teresina, PI, coletas de:

farinha de trigo e de pão tipo francês preparados a partir da farinha de trigo contida

na mesma embalagem coletada para análises. As variáveis avaliadas foram:

temperatura ambiental; umidade relativa do ar (URA); atividade de água (Aa);

contagem de fungos filamentosos e leveduras; isolamento e identificação de gêneros

micotoxigênicos; perfil toxígeno de espécies fúngicas por cromatografia de camada

delgada (CCD); e detecção de aflatoxina B1 e ochratoxina A por cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE). Os valores médios das contagens de fungos

filamentos e leveduras nas amostras de farinha de trigo e de pães tipo francês foram

inferiores a 3,00 UFC.g-1 em log10(x+1). Os gêneros fúngicos prevalentes foram:

Cladosporium, Aspergillus e seus teleomorfos, Penicillium e Mucor. No estudo foi

isolada uma cepa de A. niger, porém essa não apresentou potencial toxígeno. Na

totalidade amostral não foram detectadas aflatoxina B1 e ochratoxina A, o que pode

ser explicado pelas condições de URA e de Aa não favoráveis à síntese de

micotoxinas. Concluiu-se que a farinha de trigo empregada na fabricação de pães

tipo francês intervém na qualidade micológica e micotoxicológica dos pães

preparados; e que os produtos sob os aspectos micotoxicológicos averiguados são

seguros ao consumo.

Palavras-chaves: Fungos. Aflatoxina B1. Ochratoxina A.

ABSTRACT

Wheat is a cereal that composes a significant part of the diet of approximately one

third of the world population. Cereal grains due to its characteristics are exposed to

contamination by fungi, including those mycotoxins producers. This contamination

may occur in the field, during harvest and storage. Mycotoxins are toxic secondary

metabolites that can cause adverse effects, such as: carcinogenesis, teratogenesis,

nephrotoxicity and immunosuppression. Aspergillus, Penicillium and Fusarium are

the more frequently genres involved in cases of mycotoxicosis in humans. In general,

mycotoxins are thermostable compounds that remain viable even when exposed to

high temperatures, which justifies its presence in foods produced from contaminated

cereals. The objective of this study was to verify the interference of wheat flour in the

mycological and mycotoxicological quality of French type breads. For this, were

made, once a week, during 15 weeks, in two bakeries in Teresina, PI, collections of:

wheat flour and French type bread prepared from wheat flour contained in the same

package collected for analysis. The variables evaluated were: ambient temperature,

air relative humidity (RH), water activity (Aw); filamentous fungal and yeasts plate

counts; isolation and identification of mycotoxigenic genres; toxigenic profile of fungal

species by thin layer chromatography (TLC), and detection of aflatoxin B1 and

ochratoxin A by high performance liquid chromatography (HPLC). The mean values

of filamentous fungal counts and yeasts in samples of wheat flours and French type

breads were less than 3.00 CFU g-1 in log10(x+1). The prevalent fungal genres were

Cladosporium, Aspergillus and its teleomorphs, Penicillium and Mucor. One strain of

A. niger was isolated in the study, but these didn’t present toxigenic potential.

Aflatoxin B1 and ochratoxin A were not detected in total sample, which can be

explained by the RH and Aw conditions not favorable to the synthesis of mycotoxins.

It was concluded that the wheat flour used in the French type bread manufacturing

affects the mycological and mycotoxicological quality of breads made, and the

products under the mycotoxicological aspects analyzed are safe for consumption.

Keywords: Fungi. Aflatoxin B1. Ochratoxin A.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura da amilose e da amilopectina presentes no amido da

farinha de trigo..............................................................................

22

Figura 2 - Fluxograma resumido da produção de farinha de

trigo................................................................................................

23

Figura 3 - Estruturas químicas de micotoxinas encontradas em

alimentos.......................................................................................

31

Figura 4 - Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero

Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições

de temperaturas...........................................................................

39

Figura 5 - Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero

Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N

em três regimes de temperatura (5, 25 e 37 °C)...........................

39

Figura 6 - Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos

diferentes meios de cultivo até sua identificação final...................

40

LISTA DE TABELA

Tabela 1 - Fungos e micotoxinas de importância mundial............................. 30

Tabela 2 - Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pão

tipo francês produzidos em duas panificadoras

teresinenses.................................................................................

45

Tabela 3 - Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha

de trigo e pão tipo francês adquiridos em panificadoras de

Teresina, PI................................................................................

46

Tabela 4 - Gêneros de fungos filamentosos isolados em amostras de

farinha de trigo e pão tipo francês adquiridas em panificadoras

de Teresina, PI..............................................................................

48

Tabela 5 - Espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium

isoladas em amostras de farinha de trigo e pão tipo francês

adquiridos em panificadoras de Teresina, PI................................

50

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

a.C Antes de Cristo

Aa Atividade de Água

ABIP Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria

AF Aflatoxinas

AFB1 Aflatoxina B1

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BDA Ágar Dextrose Batata

°C Graus Celsius

CCD Cromatografia de Camada Delgada

CLA Ágar Carbation-Leaft

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CONAB Companhia Nacional de Abastecimento

CY20S Ágar Extrato de Levedura Czapek Sacarose 20%

CYA Ágar Extrato de Levedura Czapek

DON Deoxinivalenol

DRBC Dichloran Rose Bengal Cloranfenicol

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

g Grama

G25N Ágar Glicerol Nitrato 25%

IARC Agência Internacional Para Pesquisa Sobre o Câncer

ICMSF International Commission on Microbiological Specifications for

Foods

JECFA Joint FAO/WHO Expert Committee On Food Additives

Kg Quilograma

LMT Llimites Máximos Tolerados

MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento

MEA Ágar Extrato de Malte

mg Miligrama

mL Mililitro

ng Nanograma

nm Nanômetro

OTA Ochratoxina A

pH Potencial Hidrogeniônico

RDC Resolução de Diretoria Colegiada

SNA Ágar Spezieller Nalvistoffarmer

T2 Toxina T-2

UFC Unidade Formadora de Colônia

URA Umidade Relativa do Ar

USDA United States Department of Agriculture

UV Ultravioleta

WHO World Health Organization

ZEA Zearalenona

μL Microlitros

% Percentual

° Graus

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. 15

2 OBJETIVOS......................................................................................................

17

2.1 Objetivo Geral................................................................................................

2.2 Objetivos Específicos.....................................................................................

17

17

3 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................

18

3.1 Produção e Consumo do Trigo...................................................................... 19

3.2 Derivados do Trigo......................................................................................... 20

3.2.1 Farinha de Trigo.......................................................................................... 20

3.2.2 Pão.............................................................................................................. 24

3.3 Fungos e Micotoxinas em Alimentos.............................................................. 25

3.3.1 Aflatoxinas................................................................................................... 32

3.3.2 Ochratoxinas............................................................................................... 33

3.3.3 Legislação Brasileira para Micotoxinas....................................................... 35

4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................

36

4.1 Coleta das Amostras...................................................................................... 36

4.2 Temperatura Ambiental e Umidade Relativa do Ar (URA)............................. 37

4.3 Análise da Atividade de Água (Aa)................................................................. 37

4.4 Contagem de Fungos Filamentosos e Leveduras.......................................... 37

4.5 Isolamento e Identificação Fúngica................................................................ 38

4.6 Perfil Toxígeno das Espécies Isoladas.......................................................... 41

4.6.1 Produção de Aflatoxinas por Aspergillus da seção Flavi............................ 41

4.6.2 Produção de Ochratoxina A por Aspergillus da seção Nigri....................... 41

4.7 Detecção e Quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência (CLAE) em Amostras de Farinha de Trigo e Pães Tipo

Francês................................................................................................................

42

4.7.1 Extração e Purificação dos Extratos........................................................... 42

4.7.2 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de

Aflatoxina B1.........................................................................................................

43

4.7.3 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de

Ochratoxina A.......................................................................................................

43

4.8 Análise Estatística.......................................................................................... 44

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................

45

6 CONCLUSÃO...................................................................................................

54

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 55

15

1 INTRODUÇÃO

Os cereais desempenham papel fundamental na alimentação humana,

em âmbito de saúde, como fonte de nutrientes e fibras e, tecnologicamente, em

decorrência de suas múltiplas formas de consumo (SCHEUER et al., 2011;

PAÍGA et al., 2012). Dentre os cereais cultivados, o trigo

(Triticum aestivum L.) é um dos mais consumidos, juntamente com o milho e o

arroz, sendo considerado alimento básico de aproximadamente um terço da

população mundial, em virtude da sua diversidade de utilização, suas

características nutricionais e sua facilidade de armazenamento

(ZANÃO JÚNIOR et al., 2009; FIOREZE, 2011).

Dentre as farinhas dos distintos cereais, apenas a do trigo possui a

propriedade de formar uma massa viscoelástica que retém os gases liberados

durante a fermentação da massa e forneamento de produtos de panificação, e as

proteínas do glúten são as principais responsáveis por essa particularidade

(GALERA, 2006; KIRINUS et al., 2010). Isso permite que aproximadamente 70%

da produção mundial de trigo sejam utilizadas como alimento, predominantemente

na forma de farinha em massas alimentícias, cereais matinais, biscoitos, bolos e

pães (CARDOSO, 2007).

O pão constitui parte da cultura de muitos povos, exibindo significado

importante em distintas religiões, sendo um dos produtos mais consumidos no

mundo (SILVA; MADEIRA, 2011). Apresenta relevância por fornecer mais

nutrientes para a população global do que qualquer outra fonte única de

alimentação. É particularmente importante como fonte de carboidratos, proteínas

e vitaminas B e E. Esse alimento é um produto de consumo diário, altamente

demandado e, por vezes, de estocagem longa, o que pode propiciar o surgimento

de contaminações microbianas (JUAN et al., 2008).

Grãos de cereais, como o trigo, são facilmente colonizados por fungos

sintetizadores de micotoxinas, contaminando os grãos no campo, antes mesmo

da colheita ou durante o armazenamento, permanecendo nos alimentos e rações

destinados ao consumo humano e animal (RUPOLLO et al., 2006;

SIEGEL; BABUSCIO, 2011; ALBORCH et al., 2012).

16

As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos produzidos por

fungos filamentosos, predominantemente dos gêneros Aspergillus, Penicillium e

Fusarium, sob condições ambientais oportunas (OUESLATI et al., 2011).

Alimentos que repetidamente são associados à contaminação com micotoxinas

incluem: trigo, milho, arroz, cevada, leite, queijo, amendoim e algodão

(SOLEIMANY et al., 2011). Em geral, essas toxinas são compostos

termorresistentes (KABAK, 2009) que não se degradam completamente sob

temperaturas elevadas (MURPHY et al., 2006). Assim, as micotoxinas podem

contaminar diversos alimentos derivados de cereais e intoxicar os consumidores

desses gêneros (OERKE et al., 2010; IBÁÑEZ-VEA et al., 2011).

A Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer (IARC) cientifica

que a contaminação por micotoxinas é preocupante para a saúde humana e

animal, pelos efeitos: carcinogênicos, teratogênicos e mutagênicos (IARC, 2002).

Estima-se que 25 a 40% dos cereais consumidos mundialmente estão

contaminados por micotoxinas (RIBA et al., 2010), existindo, desse modo, uma

exigência permanente de se resguardar a saúde da população consumidora,

restringindo sua exposição a essas toxinas (RASCH et al., 2010).

O Brasil, por ser um país tropical, possui condições climáticas favoráveis

para a proliferação de fungos micotoxigênicos, além de, por vezes, apresentar

condições inadequadas de plantio, colheita, secagem, transporte e de

armazenamento de produtos agrícolas. Nos países tropicais, as perdas

acarretadas por fungos podem chegar até 30%, sobretudo, em decorrência das

elevadas temperaturas e umidades relativas (LOPES et al., 2005).

O trigo é um alimento que exerce significativa importância como

componente alimentar fazendo parte da alimentação humana diária, o que requer

um controle de qualidade eficiente quanto à presença de fungos e micotoxinas,

uma vez que esses podem estar presentes tanto na farinha de trigo, quanto em

seus derivados, mesmo quando submetidos a tratamentos térmicos, posto que as

micotoxinas são termorresistentes.

17

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Verificar a interferência da farinha de trigo na qualidade micológica e

micotoxicológica do pão tipo francês.

2.2 Objetivos Específicos

Efetuar a contagem dos fungos filamentosos e leveduras presentes

em farinhas de trigo e pães tipo francês;

Isolar e identificar espécies do gênero Aspergillus, Penicillium e

Fusarium presentes em farinhas de trigo e pães tipo francês;

Caracterizar o perfil toxígeno das espécies fúngicas isoladas por

cromatografia em camada delgada (CCD);

Detectar e quantificar aflatoxina B1 e ochratoxina A em farinhas de

trigo e pães tipo francês por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE).

18

3 REVISÃO DE LITERATURA

O trigo (Triticum aestivum L.) é considerado como um cereal básico para a

civilização e seu cultivo acompanha paralelamente à história da humanidade

(VALÉRIO et al., 2009). A planta trigo resultou do cruzamento de espécies

silvestres de gramíneas que existiam nas proximidades dos rios Tigre e Eufrates,

na Ásia, por volta de 10.000 a 15.000 a.C (BOSCHINI, 2010). Esse cereal foi um

dos primeiros vegetais cultivados pelo homem, entre 7.000 e 9.000 a.C.,

passando por amplo processo de expansão por todo o mundo, e por 8.000 anos

tem sido à base da alimentação das principais civilizações da Europa, Ásia e

África (VESOHOSKI et al., 2011).

Dentre as distintas espécies de trigo cultivadas, a de maior relevância é a

Triticum aestivum, ou trigo comum, que representa cerca de 90% do total do trigo

produzido nos Estados Unidos, um dos grandes produtores mundiais. As outras

espécies são Triticum durum, Triticum compactum, Triticum turgidum, Triticum

dicoccum, Triticum spelta e Triticum polonicum (CARDOSO, 2007).

O trigo exprime significativa importância para o mundo, havendo crescente

demanda da população por derivados desse cereal. Os principais fatores que

limitam ou comprometem a sua produtividade estão relacionados: às condições

climáticas das principais regiões produtoras, do Brasil e dos países

tradicionalmente fornecedores; e às várias doenças agressoras dessa cultura

(DEL PONTE et al., 2004; TANAKA et al., 2008).

Os danos acarretados por doenças na cultura do trigo são variados

notadamente porque múltiplos fatores interferem no estabelecimento e

desenvolvimento das epidemias, como as condições ambientais, a maior ou

menor suscetibilidade das cultivares, a agressividade dos patógenos, a época do

início da infecção, entre outros (MARINI et al., 2011).

As doenças bióticas do trigo podem ser distribuídas em quatro grandes

grupos: doenças causadas por fungos; por bactérias; por vírus e por nematoides

(GARCIA JÚNIOR, 2006). As doenças fúngicas que acometem a parte aérea

dessa cultura, como a ferrugem da folha e as manchas foliares, assim como as

19

que injuriam a espiga com os grãos, como a fusariose, podem ser responsáveis

pela redução da produtividade e aumento do custo de produção, em virtude da

necessidade contínua de utilização de fungicidas para o seu controle

(TANAKA et al., 2008; LENZ et al., 2011). As alterações causadas por fungos no

trigo, como: odor, descoloração, produção de toxinas, diminuição de peso,

aquecimento, mudanças bioquímicas e redução do poder germinativo da

semente; afetam substancialmente sua qualidade, contribuindo para a

desvalorização desse cereal e produtos derivados (ROCHA JÚNIOR, 2003).

O trigo, em condições inadequadas de secagem e armazenamento, pode

sofrer alterações enzimáticas e não enzimáticas, reológicas, físicas, químicas e

microbiológicas (DELIBERALI et al., 2010).

A microbiota dos grãos de cereais, como o trigo, é formada

majoritariamente por micro-organismos oriundos do solo, que podem ser

classificados em dois tipos: os que, por vezes, desaparecem depois da colheita, e

os que persistem nos grãos durante o armazenamento (MOLARD;

GAHAGNIER, 1993). Outros micro-organismos contaminam os grãos durante o

processamento, por falhas de higiene durante o processo de fabricação da farinha

(ICMSF, 2005).

Grãos de cereais íntegros comumente possuem reduzida carga

microbiana, contudo, em consequência da umidade ambiental e ineficientes

procedimentos de limpeza dos equipamentos, tal carga pode aumentar com

destaque para os fungos, principalmente dos gêneros Aspergillus, Eurotium e

Penicillium (LOPES; FRANCO, 2006). Conídios de fungos existentes em farinhas

podem resistir por diversos anos, e, portanto, cuidados devem ser tomados no

armazenamento da farinha (GASHGARI et al., 2010). O controle da umidade é

particularmente importante, visto que farinhas com umidade inferior a 12% não

permitem a multiplicação microbiana (ICMSF, 2005).

3.1 Produção e Consumo do Trigo

O trigo é o segundo alimento mais produzido, em volume, no mundo,

superado apenas pelo milho. Na safra de 2012/2013, a produção mundial de trigo

20

foi de 655,110 milhões de toneladas e os maiores países produtores foram: China

(17,77%), Índia (12,46%) e os Estados Unidos (9,27%). A produção do Brasil foi

de 4,8 milhões de toneladas (0,73% da produção mundial) (USDA, 2013), sendo

que os Estados do Paraná, Rio Grande do Sul e Santa Catarina responderam por

90% da produção total (CONAB, 2012; EMBRAPA, 2013).

Conforme a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), em 2012, o

Brasil consumiu 10,4 milhões de toneladas desse cereal, importando grande parte

da Argentina e dos Estados Unidos. No entanto, a produção brasileira não tem

sido suficiente para atender à demanda interna, situação essa agravada pela

elevada quantidade de grãos perdidos ou colhidos com qualidade inferior por

causa do ataque de pragas, germinação na espiga e redução de matéria seca que

acontecem pelo retardo na colheita (GUTKOSKI et al., 2008). A falta de incentivo

à produção, a pequena área cultivada e os baixos tetos de produtividade também

cooperam para o déficit anual na produção brasileira de trigo. Contudo, a cultura

do trigo no Brasil vem alcançando, a cada dia, maior importância frente aos

países produtores e exportadores, alicerçada nos ganhos de produtividade, na

rentabilidade e na melhoria da qualidade industrial (TIBOLA et al., 2008;

BOSCHINI, 2010).

O consumo de trigo nos países tropicais tem aumentado de 2,0 a 5,0% ao

ano (COSTA et al., 2008). No Brasil, o consumo da farinha de trigo distribui-se

entre padarias (47%), consumo doméstico (20%), indústria de massas (14%),

indústria de biscoitos (8,0%), indústria de pães (5,0%) e outros segmentos (6,0%)

(COSTA, 2009).

3.2 Derivados do Trigo

3.2.1 Farinha de Trigo

A Instrução Normativa Nº 8, de dois de junho de 2005 do MAPA, define

farinha de trigo como: produto elaborado com grãos de trigo (Triticum aestivum L.)

ou outras espécies de trigo do gênero Triticum, ou combinações por meio de

trituração ou moagem e outras tecnologias ou processos (BRASIL, 2005).

21

A farinha de trigo, em base seca, é composta por aproximadamente 12%

de proteínas, 72 a 78% de carboidratos, 2,5% de lipídios e menos de 0,5% de

cinzas (SINGER, 2006). No entanto, essa composição pode ser modificada de

acordo com a variedade do trigo e o grau de extração (MATUDA, 2008).

As proteínas totais do trigo dividem-se em solúveis e insolúveis do glúten

(FONSECA, 2006). As solúveis (albumina e globulina) representam 15% do total e

são classificadas em razão da funcionalidade como proteínas não formadoras do

glúten. E as insolúveis do glúten (gliadina e gluteína) constituem 85% das

proteínas e conferem as propriedades de panificação da farinha. Quando

completamente hidratada, a gliadina produz uma massa fluida e viscosa,

enquanto que a gluteína forma uma massa extremamente rígida e elástica. A

gliadina (com pontes dissulfeto intramoleculares) é coesiva e apresenta alta

extensibilidade e baixa elasticidade. Em outras palavras, é altamente capaz de

ser esticada com a aplicação de uma força, todavia apresenta capacidade

limitada de retornar à forma inicial após a supressão dessa força. A gluteína (com

pontes de dissulfeto inter e intramoleculares), por outro lado, apesar de também

ser coesiva, apresenta uma baixa extensibilidade e alta elasticidade. É capaz de

ser esticada até certo limite, mas retrocede velozmente à sua forma original com a

remoção da força empregada. O glúten, por conseguinte, possui propriedades

viscoelásticas que combinam os dois componentes

(EL-DASH, 1990; ESTELLER, 2004; MATUDA, 2008).

As características principais do glúten que afetam sua qualidade de

panificação são: tipo de proteínas presentes; quantidade e proporção dos grupos

proteicos. Farinhas com quantidades idênticas de proteína podem diferir em

qualidade, em função de diferenças nas proporções e nas características das

frações da proteína do glúten (CARDOSO, 2007).

O principal carboidrato componente da farinha de trigo é o amido,

responsável por aproximadamente 65% da sua composição. O amido apresenta-

se em forma de grânulos, sendo seu tamanho e formato característicos de sua

origem botânica. A Figura 1 evidencia os maiores componentes do amido:

amilose (23%) e amilopectina (73%). A amilose é um polímero de cadeia linear

com ligações glicosídicas α-1,4, enquanto que a amilopectina é uma estrutura

22

altamente ramificada formada por ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6

(STAUFFER, 1998).

Fonte: MATUDA (2008).

Figura 1 - Estrutura da amilose e da amilopectina presentes no amido da

farinha de trigo.

Da farinha de trigo consumida no Brasil, apenas pode-se considerar

genuinamente nacional aquela farinha proveniente dos grãos de trigo cultivados

nesse país. Assim, no Brasil, consomem-se farinhas obtidas de grãos de trigo de

origem nacional, farinhas obtidas de grãos de trigo importados processadas no

país de origem, bem como farinhas produzidas a partir de grãos de trigo

importados processadas no território brasileiro (COSTA et al., 2008). O

fluxograma simplificado da produção da farinha de trigo encontra-se na Figura 2.

23

Fonte: LOPES e FRANCO (2006).

Figura 2 - Fluxograma resumido da produção de farinha de trigo.

A farinha de trigo, por ser um produto resultante do beneficiamento de uma

matéria-prima alimentar em estado bruto, constitui um alimento passível de sofrer

alterações na sua qualidade nutricional e tecnológica durante a operação de

transporte envolvida no processo de importação. O ágio e deságio na avaliação

do mercado do trigo, seja ele na forma de grãos ou na forma já processada de

farinha, são determinados por diferenças de peso hectolitro, força geral do glúten,

tempo de mistura, estabilidade da massa, porcentagem de mistura de grãos

danificados, presença de resíduos de agrotóxicos, além da quantidade de

micotoxinas (COSTA et al., 2008).

Os grãos de trigo armazenados com teor de atividade de água igual ou

menor que 0,70 (<14,5% de umidade em peso), comumente, não estão sujeitos à

deterioração por fungos e a síntese de micotoxinas. O trigo sofre sua primeira

transformação em processos de moagem para a fabricação de farinha. A farinha

de trigo apresenta características que podem promover o desenvolvimento de

RECEPÇÃO DOS GRÃOS

ESTOCAGEM

LIMPEZA

MOLHAGEM

MOAGEM

ESTOCAGEM DA FARINHA

ENSACAMENTO

ESTOCAGEM

EXPEDIÇÃO

24

fungos e a produção de micotoxinas (ALDRED; MAGAN, 2004). Sendo que

farinhas de trigo com micotoxinas podem transferir sua contaminação para seus

produtos derivados, como o pão. A fonte de contaminação do pão por micotoxinas

pode ser direta, uma vez que possíveis micotoxinas na farinha de trigo não são

suficientemente eliminadas durante a fermentação e o cozimento

(VALLE-ALGARRA et al., 2009), ou indireta, visto que a farinha pode contaminar

o ar do local de sua manipulação, e esse os pães cozidos ali presentes

(DUARTE, 2010b).

3.2.2 Pão

A Resolução RDC nº 263, de 22 de setembro de 2005, define pão como o

produto obtido da farinha de trigo e/ou outras farinhas, adicionado de líquido,

resultante do processo de fermentação ou não e cocção, podendo conter outros

ingredientes, desde que não descaracterizem o produto. Pode apresentar

cobertura, recheio, formato e textura diversos (BRASIL, 2005).

O pão é composto de farinha de trigo, água, fermento biológico e sal

(cloreto de sódio). Entretanto, outros componentes podem ser adicionados como

gorduras, açúcares, ovos, leite, aditivos, entre outros (CANELLA-RAWLS, 2005;

GANDRA et al., 2008). Esses ingredientes apresentam maior ou menor nível de

importância em função do tipo de pão que se deseja fabricar. Contudo, de

maneira geral, os ingredientes complementares melhoram aspectos de maciez e

textura dos produtos, aumentam a vida de prateleira dos pães, bem como

modificam o sabor e o valor nutricional (PIMENTEL et al., 2011).

Cada vez mais pesquisas relacionadas ao pão vêm sendo desenvolvidas,

sobretudo sob o aspecto nutricional. Esse alimento possui elevado valor calórico,

fornecendo, em média, 19% das necessidades energéticas diárias, além de

conter ácidos graxos, aminoácidos, elementos minerais e as vitaminas A, B1, B2,

C, D, E e K (GUTKOSKI et al., 2007).

O pão é considerado um produto popular, podendo ser consumido na

forma de lanches ou junto com refeições (BORGES et al., 2011). No Brasil, o pão

tipo francês é o mais consumido (ABIP, 2012), sendo definido como produto

25

fermentado, preparado, obrigatoriamente, com farinha de trigo, sal (cloreto de

sódio) e água, que se caracteriza por apresentar casca crocante de cor uniforme

castanho-dourada e miolo de cor branco-creme de textura e granulação fina não

uniforme (BRASIL, 2000).

O consumo de pão pela população brasileira é de 33,5 Kg.habitante-1.ano-1,

quantidade inferior à recomendada por órgãos mundiais de alimentação como a

WHO (World Health Organization), cuja recomendação é de

60,0 Kg.habitante-1.ano-1 e à sugerida pela FAO (Food and Agriculture

Organization of the United Nations) (50,0 Kg.habitante-1.ano-1). Em relação a

outros países, o consumo no Brasil também é baixo, por exemplo, na Argentina,

são consumidos 82,5 Kg.habitante-1.ano-1 e, no Chile, 98,0 Kg.habitante-1.ano-1

(ABIP, 2012).

O segmento da panificação é um dos que mais se desenvolvem na

economia brasileira, estando entre os seis maiores segmentos industriais. Sua

participação no setor industrial de produtos alimentícios é de 36,2%, e na indústria

de transformação é igual a 7,0%; incorporando em torno de 63,2 mil empresas em

todo o país, onde por volta de 60,0 mil são de micro ou pequeno porte. Essas

recebem cerca de 43,23 milhões de clientes, gerando 780 mil empregos diretos e

1,8 milhões indiretos. No ano de 2011, o faturamento do segmento de panificação

atingiu, aproximadamente, 62,99 bilhões de reais (ABIP, 2012).

Porém, gêneros de panificação são facilmente contaminados por micro-

organismos, sendo esses tidos como os principais causadores de deteriorações, o

que gera prejuízos econômicos. Degradações ocasionadas por fungos

representam perdas entre 1,0 e 5,0% da produção, dependendo da estação do

ano, do tipo de produto a ser produzido e do método de transformação

empregado (GUYNOT et al., 2002; OSNAYA et al., 2006).

3.3 Fungos e Micotoxinas em Alimentos

Os micro-organismos de interesse em alimentos são distribuídos em três

grandes grupos: bactérias, leveduras e fungos. Certos vírus e parasitas são,

26

também, geradores de problemas de saúde pública, podendo ser veiculados por

alimentos (ANDRADE, 2006).

Os fungos são organismos eucarióticos cujos núcleos são dispersos em um

micélio continuo ou septado e a sua nutrição é obtida por absorção. São

organismos saprofíticos, parasitas facultativos ou biotróficos. Crescem como

célula única (leveduras) ou como colônias filamentosas multicelulares (fungos

filamentosos). Localizam-se em abundância no solo, no água e nos vegetais e se

reproduzem por meios de ciclos telemorfos e anamorfos (TRABULSI et al., 2008).

Os fungos constituem um grupo diversificado de organismos que

apresentam significância ecológica e econômica. Cerca de 70 mil espécies de

fungos já foram descritas, entretanto, estima-se que o número total seja de

aproximadamente 1,5 milhão. Esses organismos são importantes por múltiplas

razões: são os decompositores primários em todos os ecossistemas terrestres,

constituem associações simbióticas com plantas vasculares (micorrizas),

compõem a maioria dos patógenos de plantas, oferecem sistemas genéticos para

os biologistas moleculares, e são cruciais para a biotecnologia industrial

(LI et al., 2000).

Amplamente distribuídos na natureza, os fungos necessitam de substratos

para o seu crescimento. Por isso são contaminantes corriqueiros de alimentos,

grãos e rações, os quais contêm nutrientes como carboidratos, proteínas e

lipídeos, constituintes apropriados para o pleno desenvolvimento desses micro-

organismos (GOURAMA; BULLERMAN, 1995; MEIRELLES et al., 2006).

O homem tem conhecimento dos fungos que crescem em alimentos desde

a antiguidade, e os tem utilizado em seu benefício próprio como alimento direto,

para melhorar alimentos e notadamente para fins terapêuticos (antibióticos). Mas,

em decorrência de espécies de fungos contaminarem alimentos, ocasionando

degradações e produção de micotoxinas, esses são responsáveis por perdas

econômicas relevantes em todo o mundo (SILVA et al., 2008;

AMORIM et al., 2010).

A palavra micotoxina deriva do grego mikes (fungo) e do latim toxicum

(veneno), ou seja, toxina produzida por fungos em condições específicas

27

(SCUSSEL, 1998). Os fungos produtores de micotoxinas são conhecidos como

micotoxigênicos, podendo sintetizar uma ou mais micotoxinas (RAUBER, 2006).

A produção de micotoxinas depende do crescimento fúngico, por

conseguinte pode ocorrer em qualquer época de cultivo, colheita ou estocagem

dos alimentos, e essas podem permanecer nos grãos mesmo após o

desaparecimento de seus fungos produtores; porém, o desenvolvimento fúngico e

a produção de toxinas não são sinônimos, visto que nem sempre as melhores

condições de crescimento coincidem com as de síntese

(TANIWAKI; SILVA, 2001; KAWASHIMA, 2004). Os fungos micotoxigênicos

podem crescer em vários substratos, mas as condições em que micotoxinas são

formadas são específicas de um gênero ou até mesmo de uma espécie fúngica

(COPPOCK; JACOBSEN, 2009).

O crescimento de fungos em alimentos e a produção de micotoxinas são

influenciados por fatores abióticos e bióticos e suas complexas interações. Dentre

esses fatores destacam-se: pH, atividade de água (Aa), concentração de soluto,

temperatura, umidade, composição química do alimento e tempo de

armazenamento. Todavia, Aa e temperatura são os principais determinantes do

crescimento fúngico (BOURAS et al., 2009; GARCIA et al., 2011).

Embora não haja correlação direta entre o crescimento fúngico e a síntese

de micotoxinas, a prevenção do crescimento de fungos conduz eficazmente a

prevenção do acúmulo de micotoxinas (GARCIA et al., 2009).

As micotoxinas são substâncias de ocorrência universal, mas preponderam

em regiões de climas tropicais e subtropicais, onde o desenvolvimento fúngico é

beneficiado pela umidade e temperatura. Os grãos, por exemplo, quando

inadequadamente armazenados, sob condições de elevadas umidade e

temperatura, oferecem condições ideais para o desenvolvimento fúngico e para a

formação de micotoxinas (MALLMANN et al., 2007; TORRADO et al., 2010).

A síntese dessas substâncias é favorecida em teores de umidade relativa do ar

acima de 80% e temperatura ambiental superior a 20 °C (SANTOS et al., 2001).

Os gêneros fúngicos mais associados à produção de micotoxinas

compreendem: Aspergillus, Penicillium e Fusarium (SKRBIC et al., 2011).

28

Os gêneros Aspergillus e Penicillium são comumente deparados como

contaminantes de produtos durante a secagem e o armazenamento, sendo

encontrados numerosamente em armazéns, moinhos, silos, moendas,

elevadores, equipamentos e nos lugares onde são processados produtos

agrícolas (ALHADAS et al., 2004). Já Fusarium são patógenos de plantas e

produzem micotoxinas antes da colheita ou imediatamente após ela

(HERMANNS et al., 2006).

A identificação das espécies fúngicas contaminantes de alimentos é um

sinalizador essencial quanto à presença de micotoxinas nos substratos, e indica o

caminho para precaver a sua síntese. Apesar disso, o isolamento e a identificação

desses fungos não implicam na detecção de micotoxinas em produtos

investigados. Mesmo dentro de um gênero potencialmente toxígeno, nem todas

as espécies produzem toxinas considerando que existem cepas dentro de uma

mesma espécie que não possuem a capacidade para síntese de micotoxinas

(CASTRO et al., 1995; FARIAS et al., 2000).

As micotoxinas são metabólitos secundários tóxicos de fungos filamentosos

e os mecanismos que iniciam sua síntese e deflagram sua súbita interrupção são

desconhecidos. Essas promovem efeitos adversos em seres humanos e animais

(ZARZUELA et al., 2002; RAHMANI et al., 2011) e são encontradas em ampla

escala de produtos agrícolas, como: produtos crus, condimentos, cereais e

alimentos processados fabricados a partir de ingredientes contaminados

(TRUCKSESS; SCOTT, 2008; BERTUZZI et al., 2011;

FREITAS-SILVA; VENÂNCIO, 2011). Dentre os alimentos frequentemente

contaminados com essas toxinas, sobressaem-se: trigo, milho, arroz, aveia,

nozes, leite, queijo, amendoim e algodão (SOLEIMANY et al., 2011;

SIEGEL; BABUSCIO, 2011).

De acordo com a FAO, estima-se que até 25% das culturas alimentares do

mundo, incluindo alimentos básicos, são afetadas por fungos micotoxigênicos e

as perdas globais de alimentos por causa das micotoxinas situam-se na faixa de

1,0 bilhão de toneladas por ano. Apesar dos anos de pesquisa, bem como da

introdução de boas práticas na cadeia de produção, armazenamento e

distribuição de alimentos, essas toxinas continuam a ser um problema, havendo

29

necessidade constante de se proteger a saúde dos suscetíveis, ao limitar sua

exposição à micotoxinas (DUARTE et al., 2010a; FAO, 2013).

A exposição humana à micotoxinas pode acontecer de forma direta, pela

ingestão de alimentos vegetais, e indiretamente por meio de alimentos de origem

animal, quando os animais consomem rações contaminadas (SILVA, 2005).

As micotoxinas, em geral, não são produtos voláteis e permanecem

associados à estrutura dos fungos, conídios ou no substrato em que crescem

(FERNANDES, 2004). Estudos diversos têm demonstrado que as micotoxinas

não são destruídas durante a maioria dos procedimentos de processamento de

alimentos (BULLERMAN; BIANCHINI, 2007; SCUDAMORE et al., 2008;

ALBORCH et al., 2012). Isso significa que os produtos infestados devem ser

destruídos. O problema não pode ser solucionado, por exemplo, misturando

produtos contaminados a grãos sadios ou ainda, dando-os aos animais, posto que

as toxinas acumuladas nesses, podem ser veiculadas ao homem por meio do leite

ou da carne (FAO, 1997a).

O consumo de alimentos contaminados com micotoxinas tem sido

associado a casos de intoxicação humana ou micotoxicoses, resultando até em

morte (GARCIA et al., 2011). Dado que são altamente tóxicas, apresentando

propriedades imunossupressoras, alergênicas, teratogênicas, mutagênicas e/ou

carcinogênicas (GARCIA et al., 2009; KHOMUTOV et al., 2011). Sendo capazes

de desencadear amplos efeitos biológicos em concentrações relativamente

baixas, na faixa de miligrama por quilo a micrograma por quilo (ONO et al., 2004).

Pitt (2012) relata que é importante distinguir-se os efeitos das toxinas

bacterianas em relação ao efeito das micotoxinas. As clássicas toxinas

bacterianas são proteínas que produzem sintomas característicos algumas horas

depois que o corpo as reconhece, com produção de antígenos. Micotoxinas, por

outro lado, são quase todas combinações químicas de baixo peso molecular, que

não são detectadas por antígenos e consequentemente não produzem nenhum

sintoma óbvio. Micotoxinas são venenos insidiosos.

Mais de 500 tipos de micotoxinas são conhecidos, com ampla diversidade

estrutural, o que resulta em diferentes propriedades químicas e físico-químicas

30

(KÖPPEN et al., 2010). As importantes por sua ocorrência e toxicidade são:

aflatoxinas (AF), ochratoxina A (OTA), deoxinivalenol (DON), fumonisinas,

zearalenona (ZEA) e toxina T-2 (T2) (ORTIZ et al., 2006;

LAZICKA; ORZECHOWSKI, 2010).

Espécies de fungos micotoxigênicos pertencentes aos gêneros Aspergillus,

Penicillium e Fusarium que têm importância mundial devido à capacidade de

causar enfermidades e reduzir a produtividade animal foram listadas pela FAO

(2003) e podem ser observadas na Tabela 1.

Tabela 1 - Fungos e micotoxinas de importância mundial.

Espécie de fungo Micotoxinas producidas

Aspergillus parasiticus Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2

Aspergillus flavus Aflatoxinas B1 e B2

Aspergillus ochraceus Ochratoxina A

Penicillium verrucosum Ochratoxina A

Fusarium sporotrichioides Toxina T-2

Fusarium graminearum Deoxinivalenol, Zearalenona

Fusarium moniliforme Fumonisina B1

Fonte: FAO (2003).

As estruturas químicas das micotoxinas produzidas por fungos são

diversas (Figura 3), assim como as características das micotoxicoses causadas

por esses (ICMSF, 1996).

Com relação à sua carcinogenicidade, as micotoxinas foram classificadas

como: Grupo 1 - carcinogênica para humanos: Aflatoxina B1 (AFB1); Grupo 2 -

possivelmente carcinogênicas: ochratoxina A (OTA) e a fumonisinas; e Grupo 3 -

não carcinogênicas para humanos: tricotecenos e zearalenona

(IARC, 1993, 2002).

31

As técnicas rotineiramente empregadas para a determinação de

micotoxinas são, principalmente: cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),

cromatografia em camada delgada (CCD) e imunoensaio enzimático

(ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay). Todavia, qualquer que seja a

técnica escolhida, essa deve ser reprodutível e apresentar baixo limite de

detecção, posto que os limites máximos permitidos para tais compostos são

baixos (ROCHA et al., 2008).

Fonte: MURPHY et al. (2006).

Figura 3 - Estruturas químicas de micotoxinas encontradas em alimentos.

32

3.3.1 Aflatoxinas

As aflatoxinas começaram a ser estudadas em 1960 quando ocorreu um

surto de uma doença denominada Doença "X" dos perus, na Inglaterra, matando

cerca de 100 mil perus e outros animais do campo (CHEN et al., 2001). Essa

doença foi causada por um componente da ração, o farelo de amendoim

proveniente do Brasil, que estava fortemente mofado por Aspergillus flavus. Na

análise química da ração foi descoberta uma série de compostos fluorescentes,

mais tarde denominados aflatoxinas, responsáveis pelo surto

(ZOVICO et al., 1999).

As aflatoxinas são furocumarinas complexas que apresentam intensa

fluorescência quando expostas à luz ultravioleta em ondas longas. São

classificadas de acordo com a cor da fluorescência, em B (blue-azul) ou

G (green-verde), sendo essa propriedade importante para sua identificação em

diversos tipos de alimentos. Essas substâncias são instáveis à luz, porém

estáveis a temperaturas acima de 100 ºC (YOUSEF; MARTH, 1985).

As aflatoxinas são micotoxinas produzidas por linhagens de fungos do

gênero Aspergillus, sobretudo pelas espécies A. flavus e A. parasiticus, as quais

naturalmente podem se desenvolver em alimentos. Essas micotoxinas têm sido

detectadas em sementes de culturas com importância mundial, como: milho,

amendoim, feijão, arroz, trigo, algodão, sorgo, frutas (FACCA; DALZOTO, 2010).

Aflatoxinas possuem elevada toxicidade aguda e crônica, devido à

capacidade de ligar-se a ácidos nucleicos e nucleoproteínas celulares, resultando

em efeitos deletérios sobre a síntese de proteína celular. Todas as aflatoxinas

produzem efeitos adversos e a aflatoxina B1 exprime maior toxidade, seguida

pelas aflatoxinas G1, B2 e G2. Aflatoxina B1 é uma das substâncias mais tóxicas

que ocorrem naturalmente, relatadas até agora. Ingestão de AFB1 por humanos e

animais pode causar hepatite tóxica, hemorragia, edema, imunossupressão,

carcinoma hepático e consequente morte (NAKAI et al., 2008; IDRIS et al., 2010;

ORZETE et al., 2011). Em alimentos contaminados com aflatoxinas, a AFB1,

geralmente, corresponde a 75% dessas (AYUB et al., 1997).

33

Aydin et al. (2008) analisando 100 amostras de farinha de trigo,

encontraram contaminação por AFB1 em 45% das amostras, com teores entre

0,05 µg.kg-1 e 14,01 µg.kg-1. Zinedine et al. (2007) relataram que a incidência de

AFB1 em farinha de trigo comercializada em Marrocos foi de cerca de 17,6%, e

que os níveis de contaminação variaram entre 0,03 µg.kg-1 a 15 µg.kg-1.

Ibáñez-vea et al. (2011) analisando 24 amostras de cereais matinais a base de

trigo quanto à presença de aflatoxinas verificaram ausência de aflatoxinas na

totalidade amostral

3.3.2 Ochratoxinas

As ochratoxinas são micotoxinas encontradas em alimentos, naturalmente

produzidas por fungos das espécies Aspergillus ochraceus, Aspergillus

carbonarius e Penicillium verrucosum. Existem sete tipos de ochratoxinas, e

dentre elas a ochratoxina A (OTA) é a mais abundante e tóxica

(MAGNOLI et al., 2004; WELKE et al., 2009; MARZIERO; BERSOT, 2010).

A OTA foi originalmente descrita como um metabólito secundário de

A. ochraceus, e posteriormente como um metabólito secundário de outros

Aspergillus spp. e Penicillium spp. (CABAÑES et al., 2002; GARCIA et al., 2011).

É caracterizada como um composto formado por uma β-fenilalanina ligada a uma

isocumarina (RUPOLLO et al., 2006).

A ochratoxina A tem sido extensivamente documentada como

contaminante de ampla variedade de alimentos, incluindo: trigo, cevada, milho,

aveia, pão, café, especiarias, nozes, frutas secas, cerveja, vinho, uvas e suco de

uva (KHOURY et al., 2008; KAPETANAKOU et al., 2011). Aproximadamente, 50%

das amostras de trigo, arroz, feijão e milho, analisadas no Brasil, apresentaram

níveis de ochratoxina A (CALDAS et al., 2002).

Estudos têm demonstrado que essa molécula pode ter múltiplos efeitos

toxicológicos, tais como: nefrotóxico, hepatotóxico, neurotóxico, citotóxico,

cancerígeno, teratogênico e imunossupressor. E pode provocar mutações

gênicas, embora o mecanismo de genotoxicidade ainda não tenha sido elucidado

(ALMELA et al., 2007; DUARTE et al., 2010a; EL KHOURY; ATOUI, 2010;

34

LLORENT-MARTÍNEZ et al., 2013), representando risco para a saúde humana e

animal (JECFA, 2001; GIROLAMO et al., 2011). A Agência Internacional para a

Pesquisa sobre o Câncer classificou a ochratoxina A como um possível

cancerígeno humano (categoria 2B) (IARC, 1993).

Com base na avaliação de risco realizada pelo Joint FAO/WHO Expert

Committee on Food Additives (JECFA), cereais e seus subprodutos contribuem

com mais de 50% da exposição de humanos à OTA (JECFA, 2001).

Conforme Duarte et al. (2010b) essa micotoxina termoestável resiste aos

processos alimentares mais tecnológicos, permitindo sua presença em produtos

fabricados a partir de matérias-primas contaminadas. Desse modo, os fatores que

determinam o nível de incidência e contaminação de grãos de cereais são

ecoados em maior ou menor medida no teor de OTA em produtos derivados.

Esse também é o caso da tecnologia de fabricação de pães, que não é suficiente

para reduzir os níveis de OTA pré-existentes na farinha de trigo

(VALLE-ALGARRA et al., 2009).

Ochratoxina A foi detectada em baixas concentrações no trigo (ARAGUA'S

et al., 2003) e produtos derivados, tal como o pão (LEGARDA; BURDASPAL,

2001). Zinedine et al. (2007) avaliaram 100 amostras de pão vendidos a varejo

em Marrocos e detectaram a presença de OTA em 48% dessas, e os níveis

encontrados variaram entre 0,14 ng.g-1 a 149 ng.g-1. Juan et al. (2008)

examinando os níveis de ochratoxina A em 31 amostras de pão de trigo em

Portugal, encontraram OTA em quatro amostras (12,9%), e a concentração média

foi de 0,02 ng.g-1. Osnaya et al. (2007) encontraram níveis entre 0,04 ng.g-1 e

19,61 ng.g-1 em pão convencional espanhol. Outro estudo espanhol níveis

relatados OTA em pão inferiores a 0,25 ng.g-1 (BLESA et al., 2004).

Embora seja impossível eliminar totalmente a presença de substâncias

indesejáveis como micotoxinas, o monitoramento dessas é importante para

reduzir o seu teor na alimentação humana e animal. O conhecimento e controle

da contaminação por micotoxinas e sua distribuição é objetivo mundial de

produtores, fabricantes e órgãos investigadores e regulamentadores, devido ao

35

impacto econômico e à necessidade de se elevar a segurança alimentar e a

saúde humana (CHELI et al., 2008).

3.3.3 Legislação Brasileira para Micotoxinas

Com o intuito de proteger a saúde dos consumidores contra os efeitos

nocivos das micotoxinas, as legislações têm sido aplicadas em variados países,

estabelecendo os níveis máximos de tolerância, em alimentos in natura e

processados e também em rações para animais de abate e de estimação.

Diversos são os fatores que influenciam o estabelecimento de limites de

tolerância das micotoxinas, como: a) disponibilidade de dados toxicológicos; b)

distribuição das micotoxinas no alimento; c) ocorrência de micotoxinas no

alimento; d) disponibilidade de métodos analíticos; e) proporção de consumo do

alimento na dieta; e f) relações comerciais com outros países. Regulamentos

desnecessariamente restritivos provocam dificuldades aos países importadores

para obter os suprimentos alimentares para a sua população e aos países

exportadores, que terão problemas em encontrar compradores para seus

produtos (CAST, 2003).

Informações coligidas até o ano de 2003 demonstram que cerca de 100

países já dispõem de legislação para regulamentar os limites de micotoxinas em

alimentos e rações. Isso representa um acréscimo de 30% em relação ao ano de

1995. Os países cobertos por essas legislações englobam aproximadamente 90%

da população mundial (FAO, 2003).

Em 2011, foi publicada no Brasil a RDC nº 7 pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA) que dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT)

para micotoxinas em alimentos. Segundo essa legislação, em cereais e produtos

de cereais, como é o caso da farinha de trigo e do pão tipo francês, o limite

máximo tolerado de aflatoxina B1, B2, G1 e G2, é de 5,0 g.Kg-1. Concernente a

ochratoxina A, esse limite corresponde a 10,0 g.Kg-1 (BRASIL, 2011).

36

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Coleta das Amostras

As amostras (farinha de trigo e pão tipo francês) foram adquiridas em duas

panificadoras (“A” e “B”) localizadas no município de Teresina, PI. Esses

estabelecimentos foram selecionados aleatoriamente a partir do grupo de

panificadoras de médio porte da referida cidade, cujos proprietários assinaram

termo de aceite para participação da pesquisa em questão.

De cada estabelecimento selecionado, foram realizadas, uma vez por

semana, durante 15 semanas, coletas de 300 g de farinha de trigo recolhidos

diretamente de uma embalagem em uso pelos panificadores e 300 g de pães tipo

francês, elaborados a partir de farinha do trigo presente no mesmo fardo que foi

coletada a amostra para as análises. O período total de coletas foi compreendido

entre os meses maio e agosto de 2012.

As farinhas de trigo empregadas pelas panificadoras para o preparo dos

pães tipo francês eram da mesma marca comercial e estavam acondicionadas em

suas embalagens de origem (25,0 Kg) dispostas sob estrados em local comum à

área de preparo dos pães. Os pães produzidos nas referidas panificadoras

apresentavam ingredientes equivalentes em suas formulações (farinha de trigo,

água, cloreto de sódio e fermento) em proporções diferenciadas.

As amostras foram recolhidas, individualmente, em sacos de polietileno de

uso alimentar e encaminhadas ao Laboratório de Análise de Alimentos, do

Departamento de Farmacologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade

Federal do Piauí, para realização das posteriores análises.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente ao acaso, com dois

tratamentos e 15 repetições. Os tratamentos foram constituídos pela farinha de

trigo e pelo pão tipo francês.

37

4.2 Temperatura Ambiental e Umidade Relativa do Ar (URA)

No momento das coletas amostrais nos estabelecimentos supracitados, em

pontos próximos às amostras foram efetuadas medições, em duplicata, da

temperatura ambiental e da umidade relativa do ar (URA), por meio de um

termohigrômetro digital Inconterm®.

4.3 Análise da Atividade de Água (Aa)

A análise da atividade de água (Aa) da farinha de trigo e do pão tipo

francês foi efetuada em triplicata por meio de equipamento portátil, modelo PawKit

digital, marca Decagon®, previamente calibrado, conforme metodologia

recomendada pelo fabricante.

4.4 Contagem de Fungos Filamentosos e Leveduras

A contagem de fungos filamentosos e de leveduras em unidades

formadoras de colônias por grama de alimento (UFC.g-1) foi realizada segundo

metodologia de diluição decimal seriada em placas descrita por Pitt e Hocking

(2009).

Foram homogeneizados 25,0 g de cada amostra em 225,0 mL de água

peptonada a 0,1% esterilizada. A partir dessa diluição inicial (10-1) foram

preparadas diluições decimais seriadas até 10-3. A inoculação de cada uma das

diluições foi efetuada em duplicata com alíquotas de 0,1 mL por placa de Petri, na

superfície do meio de cultivo dichloran rose bengal cloranfenicol (DRBC) com

auxílio de alça de Drigalski esterilizada (KING; HOCKING; PITT, 1979). As placas

com DRBC foram incubadas a 25 °C durante sete dias em estufas microbiológicas

com controle eletrônico de temperatura. Transcorrido tal período, todas as placas

foram observadas, sendo selecionadas para contagem aquelas que continham de

10 a 100 UFC.g-1 (DALCERO et al., 1997; DALCERO et al., 1998).

38

4.5 Isolamento e Identificação Fúngica

A identificação, em nível de gênero, de todas as colônias consideradas

como diferentes foi realizada segundo Samson et al. (2000), de acordo com suas

características macro e microscópicas. As colônias fúngicas identificadas como

Aspergillus e Penicillium foram subcultivadas em tubos inclinados de ágar extrato

de malte (MEA) e as de Fusarium utilizaram ágar Spezieller Nalvistoffarmer (SNA)

para a posterior identificação em espécies.

As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Aspergillus spp. foram

identificadas utilizando as chaves de identificação descritas por Klich (2002)

baseada na semeadura padrão em três meios básicos (Figura 4): ágar extrato de

levedura Czapek (CYA); ágar extrato de levedura Czapek sacarose 20% (CY20S);

ágar extrato de malte (MEA). Em microtubos previamente esterilizados preparou-

se o inóculo das cepas isoladas, de acordo com a metodologia descrita por Pitt e

Hocking (1999). Preparou-se uma suspensão de conídios em 0,5 mL de meio

ágar semi-sólido constituído de 0,2% de ágar-ágar e 0,05% de Tween®80. A

suspensão de conídios foi inoculada por meio de alça de platina em forma de

agulha em placas de Petri contendo os meios de cultivo. A agulha foi introduzida

na suspensão e o inóculo foi distribuído para três pontos equidistantes nas placas

com os diferentes meios. Após a inoculação as placas foram incubadas a 25 ºC

por sete dias. Após a incubação, visando à identificação das espécies, foram

observadas suas estruturas micromorfológicas e as características macroscópicas

das colônias (diâmetro, textura, forma, aspecto da superfície e do reverso,

pigmentação dos conídios e pigmento solúvel, produção e cor de exsudado).

39

Fonte: Adaptado de KLICH (2002).

Figura 4 - Esquema de inoculação e incubação das cepas do gênero

Aspergillus nos meios CYA, MEA e CY20S em duas condições

de temperaturas.

As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Penicillium spp. foram

identificadas utilizando as chaves de identificação descritas por Pitt (1988),

baseadas na semeadura em três meios básicos: ágar extrato de levedura Czapek

(CYA); ágar extrato de malte (MEA); e ágar glicerol nitrato 25% (G25N) (Figura 5).

Para maior eficiência e aproveitamento do sistema, inoculou-se as placas de Petri

com duas cepas diferentes a serem testadas; a preparação do inóculo e

inoculação nos meios de cultivo foram igual à utilizada para Aspergillus spp.

Fonte: Adaptado de PITT (1988).

Figura 5 - Esquema de inoculação e incubação das duas cepas do gênero

Penicillium a serem identificadas nos meios CYA, MEA e G25N

em três regimes de temperatura (5, 25 e 37 °C).

37 ºC

1 1

1

1 1

1

1 1

1

1 1

1

CYA 25 ºC CYA 37 ºC MEA 25 ºC CY20S 25 ºC

CYA

25 ºC

1 1

1

CYA

25 ºC

1 1

1

MEA 5 ºC

CYA

1

2 2

1

2 2

2

MEA

2 2

2

G25N

1

2 2

1

CYA

1

2 2

1

40

As colônias fúngicas pertencentes ao gênero Fusarium sp. isoladas foram

identificadas pelo método de diluição em placa recomendado por Booth (1971). A

suspensão conidial de cada cepa de Fusarium sp. foi incubada em ágar-ágar

1,5% em placa de Petri em temperatura ambiente por 16 a 18 horas. Decorrido

esse tempo, os conídios foram identificados por microscopia (x 30) e transferidos

com uma agulha para o meio ágar dextrose batata (BDA) e também para o meio

ágar folhas de bananeira (BLA), modificando a metodologia original que emprega

o meio ágar folhas de cravo (CLA), alteração essa descrita por Keller (2009).

Após incubação por 7 a 14 dias (Figura 6), as colônias foram identificadas usando

critérios microscópicos e macroscópicos segundo a chave taxonômica de

Nelson et al. (1983).

Fonte: Adaptado de NELSON et al. (1983) e Keller (2009).

Figura 6 - Esquema de incubação das cepas de gênero Fusarium nos

diferentes meios de cultivo até sua identificação final.

Colônia crescida NSA

Subcultivo em meio BDA

Cultivo Monospórico

BLA BDA

Classificação

Incubação: 7 dias a 24 ºC Luz branca 12h Luz negra 12h

41

4.6 Perfil Toxígeno das Espécies Isoladas

4.6.1 Produção de Aflatoxinas por Aspergillus da seção Flavi

Para provar a capacidade de produzir aflatoxinas pelas espécies de

Aspergillus da seção Flavi foi utilizada a metodologia descrita por Geisen (1996).

As cepas foram cultivadas em placas de MEA a 25 ºC por sete dias. O micélio foi

transferido para um microtubo tipo Eppendorf e foram adicionados 1000 μL de

clorofórmio. A mistura foi agitada a 4000 rpm por 20 min em temperatura

ambiente, o micélio foi removido e o extrato clorofórmico evaporado. O resíduo foi

re-dissolvido em 200 μL de clorofórmio. Os extratos foram analisados por

cromatografia em camada delgada (CCD) em cromatofolha de sílica gel 60 G de

20 x 20 cm, 0,25 mm de espessura (Merk®, Alemanha). Foram aplicados na

cromatofolha 20 µL de cada extrato e do padrão em pontos equidistantes. A fase

móvel utilizada foi clorofórmio: acetona (90:10, v/v). Após o desenvolvimento por

50 minutos em cromatotanque (cuba) saturado, a cromatofolha foi observada em

cromatovisor sob radiação UV de λ = 365 nm, para evidenciação das manchas

fluorescentes características.

4.6.2 Produção de Ochratoxina A por Aspergillus da seção Nigri

Para provar a capacidade de produzir ochratoxina A pelas espécies de

Aspergillus da seção Nigri foi empregada a metodologia descrita por

Bragulat et al. (2001). As cepas foram cultivadas em ágar extrato de levedura

Czapek (CYA) a 28 ºC por sete dias no escuro. Três pedaços do ágar foram

retirados da área central da colônia, pesados e introduzidos em microtubo tipo

Eppendorf. Um volume de metanol (1000 μL) foi adicionado a cada microtubo, a

mistura de amostras e solvente foi centrifugada por 10 min a 14000 rpm, e o

sobrenadante foi filtrado e evaporado até secagem. O resíduo foi re-dissolvido em

200 μL de metanol. Os extratos foram analisados por cromatografia em camada

delgada (CCD) em cromatofolha de sílica gel 60 G de 20 x 20 cm, 0,25 mm de

espessura, sem indicador de fluorescência (Merk®, Alemanha), segundo a

metodologia da AOAC (Official Method 973.37) (NESHEIM et al., 1973).

42

A cromatografia foi desenvolvida em uma cuba, cujo solvente de corrida foi

composto de tolueno: metanol: ácido acético (90:5:5 v/v). Em seguida, a

cromatofolha foi observada em cromatovisor sob radiação UV de λ = 365 nm.

4.7 Detecção e Quantificação de AFB1 e OTA por Cromatografia Líquida de

Alta Eficiência (CLAE) em Amostras de Farinha de Trigo e Pães Tipo

Francês

4.7.1 Extração e Purificação dos Extratos

A extração e purificação dos extratos foram realizadas de acordo com a

metodologia descrita por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) e modificada por

Teixeira et al. (2008). Para extração foram utilizados 25 g de amostra, na qual

adicionaram-se 70,0 mL de metanol e 10,0 mL de solução de cloreto de potássio

4,0%. Em seguida a amostra foi submetida a agitação em liquidificador doméstico

por cinco minutos. Após a homogeneização foram adicionados 75,0 mL de

solução clarificante (sulfato de amônio 30%) e 7,5 g de celite. Posteriormente, a

amostra foi submetida novamente a agitação por cinco minutos, seguido de

repouso de 20 minutos. Em seguida, o extrato resultante foi filtrado com auxílio de

papel de filtro Whatman n° 4 (Whatman, Inc., Clifton, New Jersey, E.U.A.).

Do filtrado foi retirada uma alíquota de 50 mL para um frasco tipo Becker, seguida

de adição de 50 mL de água destilada, essa mistura foi transferida para um balão

de decantação de 500 mL, no qual foram adicionados 20 mL de clorofórmio e

agitou-se manualmente por cinco minutos. Decorrido esse tempo, foi aberta a

torneira do balão para retirada do líquido decantado que foi recolhido para um

frasco tipo Erlenmeyer com capacidade para 50 mL, depois foram adicionados

20 mL de clorofórmio ao balão e procedeu-se mais uma agitação manual com

posterior retirada do líquido decantado, de forma a obter 35 mL da fase

clorofórmica no frasco tipo Erlenmeyer. Em seguida, o solvente foi evaporado em

banho-maria a 60 °C por aproximadamente 15 minutos. O extrato seco resultante

foi suspenso em 1,0 mL de clorofórmio e em seguida homogeneizado em agitador

tipo Vortex. Após a suspensão, foi acondicionado em frasco âmbar com

capacidade de 4,0 mL para posterior evaporação do solvente em capela de fluxo

43

laminar. O extrato seco resultante foi armazenado em freezer até o momento da

análise de aflatoxina B1 e ochratoxina A.

4.7.2 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de

Aflatoxina B1

Para determinação e quantificação de AFB1 foi utilizado um cromatógrafo

líquido de alta eficiência (CLAE) SHIMADZU modelo Prominence com detector de

fluorescência (excitação: 360 nm e emissão: 460 nm) modelo RF-10AXL SUPER,

loop de 20 µL, de acordo com a metodologia proposta por Trucksess et al. (1994).

As separações cromatográficas foram realizadas por uma coluna de fase reversa

de sílica gel (150 x 4,6 mm id., 5,0 μm de tamanho de partículas, VARIAN®,

Inc. Palo Alto, EUA).

Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 uL de acetonitrila,

homogeneizado em agitador tipo Vortex, e filtrado com filtro Millex em polietileno

com membrana PTFE 0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). Em

seguida, foi retirada uma alíquota de 200 µL do extrato filtrado e acrescido de

700 µL de solução derivatizante composta de ácido trifluoracético: ácido acético

glacial: água (20:10:70 v/v). A fase móvel utilizada foi acetonitrila: metanol: água

(17:17:66 v/v) a uma vazão de 1,5 mL.min-1. Foram feitas diluições seriadas do

padrão de AFB1 (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO USA, purity > 99%) e análise

no cromatógrafo líquido de alta eficiência para obtenção da curva de calibração,

de onde foram extraídos os limites de detecção e quantificação da técnica.

O limite de detecção do método analítico foi de 0,4 ng.g-1.

4.7.3 Condições Cromatográficas para Determinação e Quantificação de

Ochratoxina A

Para determinação e quantificação de ochratoxina A foi utilizado um

cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) SHIMADZU®, modelo Prominence

com detector de fluorescência (excitação: 330 nm e emissão: 440 nm) modelo

44

RF-10AXL SUPER, loop de 20 µL, conforme metodologia proposta por

Scudamore e Mcdonald (1998). As separações cromatográficas foram realizadas

por uma coluna de fase reversa de sílica gel (150 x 4,6 mm id., 5,0 μm de

tamanho de partículas, VARIAN®, Inc. Palo Alto, EUA).

Inicialmente o extrato seco foi ressuspendido com 1000 uL de metanol,

agitado em Vortex e filtrado com filtros Millex em polietileno com membrana PTFE

0,22 µm de poro e 13 mm de diâmetro (MILLIPORE®). A fase móvel utilizada foi

acetonitrila: água: ácido acético (99:99:2 v/v) a uma vazão de 1,0 mL.min-1. Foram

feitas diluições seriadas do padrão de OTA (Sigma Aldrich® Co., St. Louis, MO

USA, purity > 99%) e análise no cromatógrafo líquido de alta eficiência para

obtenção da curva de calibração, de onde foram extraídos os limites de detecção

e quantificação da técnica. O limite de detecção do método foi de 0,02 ng.g-1.

4.8 Análise Estatística

Os dados da análise de atividade de água foram submetidos a cálculo de

média ± DP. Os dados das contagens de fungos filamentosos e leveduras foram

transformados em log10(x+1), realizou-se o teste da normalidade e em seguida a

análise de variância e teste U de Wilcoxon Mann-Whitney para comparação das

médias pelo pacote estatístico SigmaStat® v.3,5 (Systat Software, San Jose, CA,

2005) com significância de 5,0%.

45

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os valores médios e desvio padrão da temperatura ambiental e da

umidade relativa do ar das panificadoras “A” e “B” foram respectivamente: 32,6 °C

± 2,9 e 43,6% ±17,6; 31,1 °C ±2,7 e 44,3% ±11,4. Segundo Fonseca (2006)

temperaturas maiores que 25 ºC e teores de umidade entre 70 a 100% são

propícios à rápida proliferação de fungos. Desse modo, a temperatura média

verificada nas duas panificadoras proporcionou condições favoráveis à

multiplicação fúngica nas amostras analisadas, no entanto, a umidade relativa do

ar média registrada nas mesmas, apresentou-se como fator limitante.

Os valores médios obtidos de atividade de água em farinha de trigo e pão

tipo francês encontram-se listados na Tabela 2.

Tabela 2 - Valores médios de atividade de água em farinha de trigo e pão

tipo francês produzidos em duas panificadoras teresinenses

Segundo Franco e Landgraf (2008) o valor de atividade de água de 0,60 é

limitante para a multiplicação dos micro-organismos, onde fungos filamentosos

xerofílicos e leveduras osmofílicas desenvolvem-se em Aa com valores mínimos

de 0,65 e 0,60, respectivamente. Assim, o teor médio de atividade de água

determinado em farinha de trigo das panificadoras A e B de respectivamente 0,52

e 0,50 (Tabela 2) situou-se abaixo do limite de multiplicação microbiana, porém,

segundo Gashgari et al. (2010), conídios de fungos podem estar presentes em

farinhas, podendo sobreviver por vários anos.

Embora a atividade de água da farinha de trigo seja baixa para propiciar o

crescimento microbiano em farinhas contaminadas, mudanças no teor de

umidade de 1% ou 2% podem ser suficientes para promover o crescimento de

Panificadoras/

Amostras

Atividade de água (Aa)

Farinha de trigo Pão francês

A 0,52 ± 0,04 0,85 ± 0,02

B 0,50 ± 0,03 0,85 ± 0,03

46

fungos e a produção de micotoxinas (WEIDENBÖRNER et al., 2000;

CABAÑAS et al., 2008; GASHGARI et al., 2010).

Concernente à análise de atividade de água em pães tipo francês, o teor

médio obtido de 0,85 nas panificadoras A e B (Tabela 2) demonstrou-se favorável

ao crescimento de micro-organismos.

Os valores médios das contagens de fungos filamentosos e leveduras em

farinha de trigo e pão tipo francês estão apresentados na Tabela 3.

Tabela 3 - Contagem média de fungos filamentosos e leveduras em farinha

de trigo e pão tipo francês adquiridos em panificadoras de

Teresina, PI

Panificadoras/

Amostras

Contagem média de fungos filamentosos e leveduras

(UFC.g-1 em log10(x+1))

Farinha de

trigo CV% Pão francês CV%

A 2,34a ± 1,15 0,5 2,23a ± 1,00 0,4

B 2,14a ± 1,24 0,6 2,90a ± 1,53 0,5

a letras iguais em coluna e linhas, resultados semelhantes (P>0,05) pelo teste de

Mann-Whitney. UFC.g-1 em log10(x+1) = unidades formadoras de colônias por

grama, em logaritmos da base dez, acrescentados de uma unidade.

As panificadoras pesquisadas apresentaram resultados similares em

relação às contagens de fungos filamentosos e de leveduras (P>0,05) nas

amostras de farinha de trigo e de pão tipo francês (Tabela 3). Pode-se constatar

também que a quantidade de fungos isolada na farinha de trigo foi semelhante à

encontrada no pão tipo francês nos dois estabelecimentos analisados, refletindo

que a contaminação pré-existente pode estar presente no produto final, podendo

posteriormente promover alterações organolépticas como sugerem Weidenbörner

et al. (2000) e Berghofer et al. (2003).

47

Ressalta-se que embora tenha níveis baixos de atividade de água, a

farinha de trigo pode conter micro-organismos (BERGHOFER et al., 2003;

CABAÑAS et al., 2008) que, por sua vez, podem contaminam o ambiente. Essa

contaminação ambiental provavelmente foi responsável (WEIDENBÖRNER et al.,

2000) pelas contagens de fungos filamentosos e de leveduras obtidas nos pães

tipo francês analisados que apesar de processado em temperaturas que levam à

inativação fúngica, ainda apresentaram presença de fungos. Ademais, os pães

tipo francês analisados estavam expostos, em ambas as panificadoras, à

temperatura ambiente em prateleiras confeccionadas de aço e vidro, onde foi

possível constatar acesso de insetos voadores, como moscas, aos produtos. Esse

fato também pode ter favorecido a contaminação fúngica, em virtude de tais

insetos poderem atuar como veículos transmissores de conídios.

Os valores médios das contagens de fungos filamentos e leveduras nas

amostras de farinha de trigo e de pães do tipo francês foram inferiores a

3,00 UFC.g-1 em log10(x+1) (Tabela 3). Resultados semelhantes foram obtidos por

Riba et al. (2010) e Berghofer et al. (2003), e valores superiores por

Abdullah et al. (1998), Potus e Suchet (1989) e Spicher (1986) em amostras de

farinha de trigo analisadas em diversos países. Apesar da legislação vigente

(BRASIL, 2001) não dispor de parâmetros para contagens fúngicas em farinha de

trigo e pães tipo francês, Cast (2003) considera que valores superiores a

3,00 UFC.g-1 em log10 em alimentos são considerados elevados. Caso ocorra um

aumento da umidade, os fungos filamentosos e leveduras presentes nos pães

podem se desenvolver alterando as características organolépticas do produto e se

for o caso, produzir micotoxinas. Desse modo, a síntese dessas substâncias na

farinha de trigo é preocupante, pois pode representar risco da presença em seus

derivados, mesmo quando esses são submetidos a tratamento térmico.

Os gêneros de fungos filamentosos isolados em amostras de farinha de

trigo e pão tipo francês encontram-se expressos na Tabela 4.

48

Tabela 4 – Gêneros de fungos filamentosos isolados em amostras de

farinha de trigo e pão tipo francês adquiridas em panificadoras

de Teresina, PI

Farinha de trigo Pão francês

Gêneros fúngicos

Números

de

isolados

Ocorrência

(%)

Números

de

isolados

Ocorrência

(%)

Cladosporium spp. 14 31,8 23 76,6

Aspergillus spp. e

teleomorfos 13 29,5 3 10

Penicillium spp. 12 27,3 1 3,3

Fusarium spp. 2 4,5 1 3,3

Mucor spp. 1 2,3 2 6,7

Byssoclamys spp. 1 2,3 - -

Chrysonilia spp. 1 2,3 - -

Total 44 100 30 100

Foram isoladas 74 cepas pertencentes a sete gêneros fúngicos na farinha

de trigo e no pão tipo francês (Tabela 4). Os gêneros prevalentes nas amostras

de farinha de trigo foram: Cladosporium 31,8%, Aspergillus e seus teleomorfos

29,5% e Penicillium 27,3%; e nas de pão tipo francês foram: Cladosporium 76,6%,

Aspergillus 10% e Mucor 6,7%. Os gêneros Cladosporium, Aspergillus e

Penicillium também foram registrados entre os predominantes em farinhas de

trigo por Gashgari et al. (2010), Cabañas et al. (2008) e Berghofer et al. (2003).

Segundo Weidenbörner et al. (2000), a população fúngica apresentada em

subprodutos do trigo, provavelmente, deve-se: a contágios posteriores

(recontaminações) ocorridos no ambiente de processamento, principalmente

pelos propágulos fúngicos presentes nas partículas de farinha suspensas no ar; e

em menor proporção por uma resistência ao tratamento térmico. Como pode ser

49

observado na Tabela 4, os números de isolados pertencentes aos gêneros

Cladosporium e Mucor obtidos a partir de amostras de pães tipo francês foram

superiores aos encontrados nas farinhas de trigo empregadas em seu preparo.

Essa diferenciação deve-se, possivelmente, a uma significativa contaminação

ambiental por propágulos desses gêneros, que por sua vez, contaminaram os

pães.

Apesar do Fusarium spp. ser um gênero com prevalência significativa em

pesquisas com trigo e seus derivados (BERGHOFER et al., 2003;

KOBAYASTI; PIRES, 2011), a detecção desse, no presente estudo, pode ter sido

prejudicada pela alta incidência de fungos saprofíticos (no caso Cladosporium

spp.) uma vez que esses organismos competem com o Fusarium pela superfície

do substrato a ser colonizado, pelo alimento e umidade do ar (GARCIA JUNIOR

et al., 2008).

O gênero Cladosporium presente nos isolados estudados, é um frequente

causador de alergias, sendo essas do Tipo I ou alergias comuns causando febre

do feno e asma; e do Tipo III que é agente de pneumonite por hipersensibilidade

(Testing Laboratory for Mold, 2012). Além disso, Cladosporium, presente em

grãos de trigo armazenados, podem produzir toxinas fusariais que quando

consumidas favorecem a ocorrência de aleucia tóxica alimentar (OLIVEIRA; LIMA,

2013). Essa enfermidade também pode ser aplicada ao consumo de subprodutos

do trigo, como farinha e pães, entretanto, essas toxinas não foram analisadas no

presente estudo, não sendo possível, portanto, avaliar esse risco nas amostras

pesquisadas.

A presença de fungos nos alimentos é indesejável, principalmente dos

gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium, pois compreendem espécies

capazes de produzir enzimas deteriorantes, bem como micotoxinas que

representam risco de contaminação ambiental, acarretando prejuízos à saúde

humana. As toxinas produzidas por espécies desses gêneros podem estar

presentes em alimentos, como os derivados do trigo, que constituem a principal

fonte de exposição para o homem (CORRÊA et al., 1997; BANDO et al., 2007).

50

As espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium isoladas em

amostras de farinha de trigo e pão tipo francês adquiridos em panificadoras de

Teresina, PI encontram-se listados na Tabela 5.

Tabela 5 - Espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium

isoladas em amostras de farinha de trigo e pão tipo francês

adquiridos em panificadoras de Teresina, PI

Espécies

Farinha de trigo Pão francês

Número de

isolados

Ocorrência

(%)

Número de

isolados

Ocorrência

(%)

A. candidus 3 12,5 - -

A. caespitosus 2 8,3 - -

A. oryzae 2 8,3 - -

A. japonicus 1 4,2 - -

A. terreus 1 4,2 - -

A. ostianus 1 4,2 1 20

A. niger agregados - - 1 20

A. versicolor - - 1 20

P. corylophilum 6 25 1 20

P. fellutanum 2 8,3 - -

P. lividum 2 8,3 - -

P. decumbens 1 4,2 - -

P. paxilli 1 4,2 - -

F. graminearum 2 8,3 1 20

Total 24 100 5 100

Dentre as espécies fúngicas identificadas na farinha de trigo, destacou-se o

P. corylophilum com 25% de ocorrência e no pão tipo francês foram encontrados:

A. ostianus, A. niger agregados, A. versicolor, P. corylophilum e F. graminearum

51

(Tabela 5). Excetuando A. ostianus, P. corylophilum e F. graminearum, os demais

fungos isolados na farinha de trigo não estavam presentes nos pães tipo francês,

provavelmente em decorrência da inativação pelo calor durante o processamento.

A ocorrência dos fungos principalmente A. niger agregados e A. versicolor

isolados nos pães pode ter sido proveniente de contaminações por propágulos

fúngicos presentes no ambiente, e pela presença de moscas que infestavam o

ambiente das panificadoras.

Weidenbörner et al. (2000), encontraram prevalência de Aspergillus spp.,

onde o A. candidus foi o fungo preponderante em farinha de trigo. Riba et al.

(2010) isolaram predominantemente espécies de Aspergillus da seção Flavi, em

especial: Aspergillus flavus e Aspergillus tamarii, em trigo e produtos derivados.

Cabañas et al. (2008), identificaram principalmente: Aspergillus flavus, Aspergillus

candidus e Aspergillus versicolor em farinha. Kobayasti e Pires (2011)

encontraram: Cladosporium cladosporioides, Bipolaris sorokiniana, Fusarium

graminearum e Pyricularia grisea em grãos de trigo.

Na presente pesquisa, foi detectado apenas um isolado (Aspergillus niger)

com possível capacidade toxígena, encontrado no pão tipo francês (Tabela 5). Tal

isolado foi submetido ao teste de perfil toxígeno, todavia o mesmo não apresentou

essa habilidade. Devido a não detecção de isolados de Aspergillus pertencentes à

seção Flavi, o teste de perfil toxígeno para aflatoxina não pode ser realizado no

presente estudo como se objetivou.

Cabañas et al. (2008) isolaram em farinha de trigo as espécies

potencialmente produtoras de OTA: A. niger, A. ochraceus e A. ostianus, que

foram testadas quanto ao perfil toxígeno, mas nenhuma demonstrou positividade.

Weidenbörner et al. (2000) constataram contagens baixas de espécies

potencialmente produtoras de micotoxinas, a citar: A. niger, A. petrakii e

P. verrucosum. No entanto, a capacidade toxígena dessas espécies não foi

testada no estudo desses pesquisadores.

A triagem da ocorrência de AFB1 e OTA em farinha de trigo e pães tipo

francês não evidenciou contaminação detectável na totalidade amostral na atual

pesquisa.

52

No presente estudo, como supracitado, foi isolada uma espécie

possivelmente toxígena. Porém, a presença do fungo no alimento não implica,

obrigatoriamente, em produção de micotoxinas (DINIZ, 2002;

PEREIRA et al., 2002; MURPHY et al. 2006; GARCIA et al., 2009), visto que as

condições ótimas de umidade, temperatura e Aa para a produção de micotoxinas

são mais restritivas do que aquelas para o crescimento de fungos (MAGNOLI

et al., 2007). Os teores médios de umidade relativa do ar registrados situaram-se

abaixo do teor favorável à síntese de micotoxinas (superior a 85%), como

reportam Queiroz et al. (2006). Os valores médios de atividade de água obtidos

para farinha de trigo e pão tipo francês (Tabela 2) também se encontraram abaixo

da faixa propícia para a produção de micotoxinas que, de acordo com

Northolt et al. (1979) situa-se entre 0,95 e 1,0. Referente ao pão tipo francês

deve-se considerar que esse também apresenta como fator limitante à produção

de micotoxinas, o fato de ser um produto de rápido consumo e elevada

rotatividade em panificadoras, onde após sua fabricação, o tempo de exposição

para venda não excede seis horas. Pereira (2001) reportou que a presença de

aflatoxina no pão tipo francês ocorreu após alguns dias de armazenamento e que

a micotoxina tende a migrar para o substrato adjacente, não permanecendo retida

no micélio dos fungos.

Segundo dados da FAO (1997b), micotoxinas não são produzidas em

alimentos devidamente secos, por isso a secagem eficiente dos produtos e a sua

conservação sem umidade é uma medida eficaz contra o crescimento de fungos e

a produção de toxinas, sendo que a quantidade crítica de água para o

armazenamento seguro corresponde à atividade da água próxima a 0,7.

A incidência de AFB1 em farinha de trigo e derivados (em pães) tem sido

relatada por autores em distintos países: Riba et al. (2010) detectaram

contaminação em 56,6% das amostras, com níveis de variando entre 0,13 µg.Kg-1

e 37,42 µg.Kg-1; Zinedine et al. (2007), encontraram em 17,6% de suas amostras,

com valores entre 0,03 µg.Kg-1 e 15 µg.Kg-1; Aydin et al. (2008), encontraram

contaminação em 45% das amostras, com teores entre 0,05 µg.Kg-1 e

14,01 µg.Kg-1; Abdullah et al. (1998) encontraram contaminação em 1,2% das

53

amostras, com concentração média de 25,6 µg.Kg-1. Porém, Behfar et al. (2008),

não detectaram essa aflatoxina em sua totalidade amostral.

A ocorrência da Ochratoxina A tem sido reportada em farinha de trigo e

derivados, como o pão, por vários pesquisadores: Juan et al. (2008) detectaram

OTA em 12,9% das amostras de pães e o com teor médio encontrado foi de

0,02 ng.g-1 em Portugal; Zinedine et al. (2007) constataram em 48% das

amostras com contaminação média de 13,0 ng.g-1 em Marrocos; Osnaya et al.

(2006) encontraram OTA em níveis entre 0,04 ng.g-1 e 19,61 ng.g-1 e Blesa et al.

(2004) em valores inferiores a 0,25 ng.g-1 em pão espanhol. Ibáñez-vea et al.

(2011) analisando cereais matinais a base de trigo quanto à presença de

aflatoxinas e OTA, verificaram ausência de aflatoxinas na totalidade amostral,

contudo, OTA, foi detectada em 67% das amostras, com níveis de contaminação

variando entre 0,15 μg.Kg-1 e 1,12 μg.Kg-1.

A não detecção desses metabólitos tóxicos, nas amostras estudadas pode

ser atribuída: às condições de armazenamento não favoráveis à multiplicação

fúngica e a produção de micotoxinas; bem como aos isolados fúngicos, por não

possuírem capacidade para síntese desses compostos. Dessa forma, tanto a

farinha de trigo quanto os pães tipo francês sob os pontos micotoxicológicos

analisados são seguros para consumo.

54

6 CONCLUSÃO

A farinha de trigo utilizada para preparo de pães tipo francês interfere na

qualidade micológica e micotoxicológica dos pães produzidos.

A quantidade de fungo encontrada no pão tipo francês é semelhante à

contaminação observada na farinha de trigo, ambos não apresentam fungos com

capacidade toxígena, nem para aflatoxina B1 e bem como para ochratoxina A.

A farinha de trigo e os pães tipo francês analisados são seguros para

consumo sob o aspecto micotoxicológico por não apresentarem aflatoxina B1 e

ochratoxina A.

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