Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
RAFAEL BARROS GOMES DA CÂMARA
EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E PROSPECÇÃO DE
ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS DA MACROALGA VERDE CAULERPA
PROLIFERA.
NATAL/RN
2015
RAFAEL BARROS GOMES DA CÂMARA
EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E PROSPECÇÃO DE
ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS DA MACROALGA VERDE CAULERPA
PROLIFERA.
NATAL
2015
Tese apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Doutor em Bioquímica.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de
Biociências
Câmara, Rafael Barros Gomes da.
Extração, caracterização e prospecção de atividades farmacológicas
de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera /
Rafael Barros Gomes da Câmara. – Natal, RN, 2015.
139 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.
1. Antioxidante. – Tese. 2. Antiproliferativo. – Tese. 3.
Imunomodulação. – Tese. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 577
FOLHA DE APROVAÇÃO
DEDICATÓRIA
Dedico esta obra
À Hugo Rocha pelo exemplo diário e por ter me conduzido com maestria ao
longo desses anos.
Aos meus pais (Macrino e Fátima), irmão (Bruno) e avó (Antônia) por todas as
formas de apoio ao longo desta jornada.
À Ruth por todo o companheirismo, paciência e por me reerguer nos meus
piores dias.
AGRADECIMENTOS
À Deus por me guiar por um caminho repleto de pessoas especiais.
À Hugo Rocha, grande amigo e orientador. Obrigado por ter creditado confiança em
meu trabalho, pela paciência e tempo dedicado ao repasse de conhecimentos, pelos
conselhos fundamentais nos momentos certos, pela compreensão nos momentos de
necessidade, e por participar de minhas muitas desconstruções/reconstruções ao
longo de todos esses anos.
Aos meus pais, Macrino e Fátima, pelo amor incondicional, pela dedicação e
esforços em me oferecer condições de estudo que não lhe puderam ser
oportunizadas, pelos inúmeros conselhos, pela paciência em entender os meus
muitos momentos de ausência e de nervosismo ao longo desta trajetória e pelo
exemplo diário de constituição familiar.
Ao meu irmão Bruno pelo companheirismo e pelo exemplo de caráter e retidão.
Obrigado pelos muitos momentos de motivação e aconselhamentos. Lhe terei
sempre como referência.
À minha avó Antônia, pela simplicidade, humildade, alegria e força. Uma história viva
e que Deus lhe conserve com esta saúde e lucidez por muitos anos.
À minha esposa Ruth, que sem dúvida alguma foi a pessoa que mais sofreu na pele
com este doutorado. Obrigado pelas muitas ajudas no laboratório, pelo amor,
companheirismo, paciência e por me reerguer inúmeras vezes ao longo dessa
trajetória. Usarei uma frase clichê, mas a verdade é que não teria chegado até aqui
sem você.
À Juliana, minha cunhada, que sempre procurou me motivar em meus piores dias e
pela sinceridade escancarada.
À Clovis, Mariquinha, mamãe Raquel, Dudu, Bia, Ingrid e Bruno, pelos momentos de
descontração e apoio.
Ao meu grande amigo Leonardo Camilo pelo apoio, por sempre estar presente,
mesmo na distância, e por sempre estar disposto a me ouvir.
À todos os grandes amigos da família BIOPOL, obrigado pela ajuda, companhia e
sobretudo pelas muitas risadas. É muito fácil trabalhar em um lugar como este e
seria impossível conseguir resultados sem a ajuda direta ou indireta de vocês.
Obrigado ao “fundador” do BIOPOL, Ivan, “bote pegado parêia!”, por compartilhar
suas experiências, pela companhia nos pedais e pelo bom humor que lhe é peculiar;
à Leandrozão, “e aí?!!!”, pelos pagodes da vida, conselhos e por ser um grande
referencial; à Super Jailma, pessoa sem igual e exemplo de dedicação e
companheirismo; à Raniere, grande guerreiro Selva, pelas discussões sérias e nem
tão sérias assim, estou na torcida porque “só a vitória interessa!”; à Cinthia pelo seu
jeito calmo de ser ; ). Calma que sua hora vai chegar!; à Marianinha “safadeza”, a
enciclopédia sindicalizada do laboratório, pelas muitas conversas, pelos momentos
de desespero compartilhados e por ser esse outro grande exemplo de dedicação; à
Day pelas organizações “eventualísticas” e pelas resenhas diárias; à Pablo, dos
Backyardigans, por estar sempre com essa motivação toda, pelos conselhos e pelas
muitas resenhas; à Karol “Piriii”, pela sua felicidade contagiante, pelas inúmeras
horas de ajuda na bancada e pelas muitas outras horas em que você atrapalha todo
mundo, brincadeira :P; à Gabriel “Marechal”, pelas Paturis e “Peladas” salvadoras e
pela disponibilidade em ajudar; à Almininho, pelas companhias noturnas no lab e no
saudoso Bar de mãe; à Monique pelos muitos pedidos atendidos de socorro; à
Momocito por essa sua tranquilidade toda e pelas ajudas tecnológicas; à ala Nutri do
Lab, Dani, Joana e Letícia pelas delícias experimentais, ou não; As grandes
figuraças “Maxatase”, Vinny, Rony e Arthur pela “zuêira” no lab e por se mostrarem
disponíveis em ajudar; à Fabiana pelos compartilhamentos dos momentos de
angústia do doutorado; à Jessyka pela seriedade no trabalho e pelo
comprometimento com os experimentos; à Marília, Mônica, Talita e Larisse que
apesar dos poucos momentos juntos, sempre estiveram dispostas a ajudar de
alguma forma. À todos aqueles que passaram de forma rápida pelo laboratório, e
que contribuíram com este trabalho, o meu muito obrigado. E aos novos que estão
chegando deixo a minha disponibilidade em ajudar no que for preciso.
Agradeço também aos grandes amigos de outros laboratórios que ajudaram de
alguma forma neste trabalho. À Leonardo, pelo suporte na UNIFESP e pela
companhia de jornada desde a graduação; À Fernanda “#Xatiada”, pela amizade e
pelas ajudas/perturbações na cultura; À Luciana pelo companheirismo e amizade,
pelas muitas ajudas na cultura e por ser essa pessoa totalmente “sem noção”! À
Anderson e Paulinha pelas muitas conversas de corredor e pelos desabafos de
nossas frustrações experimentais.
Agradeço aos alunos e professores do Departamento de Bioquímica que
disponibilizaram o acesso e o uso de equipamentos importantes para o
desenvolvimento de experimentos. Agradeço também ao Departamento, pela
oportunidade ofertada em compor temporariamente o quadro de docentes como
professor substituto. Essa sem dúvida foi uma das experiências fundamentais para
que alcançasse a aprovação em um concurso para docente efetivo.
Agradeço aos professores que compuseram as bancas de qualificação e de defesa,
por terem se mostrados disponíveis em ajudar na conclusão deste trabalho.
Por fim, agradeço a CAPES e a UFRN pelo apoio financeiro e estrutural.
RESUMO
O presente estudo teve como objetivo extrair, caracterizar e realizar uma análise prospectiva de atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados da macroalga verde Caulerpa prolifera. Sete frações (CP-0.3/CP-0.5/CP-0.7/CP-0.9/CP-1.1/CP-1.5/CP-2.0) foram obtidas de C. prolifera por proteólise alcalina seguida de precipitação sequencial em acetona. As análises físico-químicas indicaram que C. prolifera sintetiza uma homogalactana (CP-0.9) e diferentes populações de heteropolissacarídeos sulfatados. Na análise da atividade anticoagulante, todas as frações, exceto CP-0.3, apresentaram influência sobre a via intrínseca da coagulação. Todas as frações apresentaram atividade antioxidante em 6 ensaios diferentes, sendo mais pronunciadas no teste de sequestro de peróxido de hidrogênio, com destaque para CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 (quando se obteve até 61% de sequestro), no teste de quelação férrica (com destaque para CP-0.9, com 56% de quelação) e no teste de quelação cúprica (com destaque para CP-2.0, com quelação de 78%). Com relação a ação imunomoduladora, a presença de CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9 promoveu o aumento da produção de óxido nítrico (ON) em macrófagos em até 48, 142 e 163 vezes, respectivamente. De maneira oposta, a síntese de ON caiu em 73%, após a ativação de macrófagos por LPS, incubados concomitantemente com CP-2.0. A atividade anti-adipogênica das frações também foi avaliada e CP-1.5 foi capaz de reduzir a diferenciação de pré-adipócitos (3T3-L1) em adipócitos em 60% sem afetar a viabilidade das células. As frações CP-0.3, CP-0.5 e CP-0.9 reduziram a viabilidade da linhagem HeLa (adenocarcinoma uterino humano) em torno de 55% e CP-1.5 reduziu a viabilidade da linhagem 786-0 (adenocarcinoma renal humano) em torno de 75%. Não se identificou atividade leishmanicida ou microbicida contra Klebsiella pneumoniae resistente à Carbapenêmicos (KPC). No entanto, a viabilidade de Staphylococcus epidermidis foi reduzida em 23,8% na presença de CP-1.5. Outro resultado relevante foi a observação da formação de cristais de oxalato cálcio na presença das frações. CP-0.3, CP-0.5 e CP-1.1 promoveram a formação de cristais dihidratados de tamanho bastante reduzido (1 µm). A microscopia confocal e os dados do potencial zeta dos cristais formados na presença das amostras revelaram que os polissacarídeos presentes nas frações devem interagir com o cálcio da rede cristalina afetando o crescimento e a morfologia dos cristais. Os resultados aqui descritos indicam que as frações ricas em polissacarídeos obtidas da alga C. prolifera apresentam um potencial multiterapêutico, e que passos posteriores de purificação e a análise de seus mecanismos de ação devem ser investigados.
PALAVRAS CHAVE: Urolitíase. Anti-adipogênica. Antioxidante. Antiproliferativo. Imunomodulação.
ABSTRACT
This study aimed to extract, characterize and conduct a prospective analysis of pharmacological activities of sulfated polysaccharides from green seaweed Caulerpa prolifera. Seven fractions (CP-0.3/CP-0.5/CP-0.7/CP-0.9/CP-1.1/CP-1.5/CP-2.0) were obtained from C. prolifera by alkaline proteolysis followed by sequential precipitation in acetone. The physicochemical analyzes indicated that C. prolifera synthesizes a homogalactan (CP-0.9) and different populations of sulfated heteropolysaccharides. In the analysis of anticoagulant activity, all fractions except CP-0.3, influenced the intrinsic coagulation pathway. All fractions showed antioxidant activity in six different assays being more pronounced in hydrogen peroxide scavenging assay, especially CP-0.3, CP-0.7 and CP-0.9 (which obtained 61% of hydrogen peroxide scavenging), in ferric chelation assay (especially CP-0.9 with 56% chelation) and cupric chelation assay (especially CP-2.0 with 78% chelation). With respect to immunomodulatory activity, the presence of CP-0.3, CP-0.7 and CP-0.9 showed an immunogenic potential, increasing the production of nitric oxide (NO) by 48, 142 and 163 times, respectively. Conversely, the NO synthesis fell 73% after the activation of macrophages by LPS, incubated concurrently with CP-2.0. The anti-adipogenic activity of the fractions was also evaluated and CP-1.5 was able to reduce the differentiation of pre-adipocytes (3T3-L1) into adipocytes by 60%, without affecting the cell viability. The fractions CP-0.3, CP-0.5 and CP-0.9 reduced the viability of the HeLa cells (human cervical adenocarcinoma) by 55% and CP-1.5 reduced the viability of the 786-0 cells (human renal adenocarcinoma) by 75%. Leishmanicidal activity and microbicide effect against Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (KPC) have not been identified. However, the viability of Staphylococcus epidermidis was reduced by 23.8% in the presence of CP -1.5. All fractions were able to change the formation of calcium oxalate crystals. CP-0.3, CP-0.5 and CP-1.1 only promoted the formation of COD type crystals with a very small size (1 µm). Confocal microscopy and zeta potential data of crystals formed in the presence of the samples showed that the polysaccharides present in the fractions must interact with calcium ions present throughout the crystal lattice, affecting the growth and morphology of crystals The results described herein indicate that the fractions rich in polysaccharides obtained from the green seaweed C. prolifera present a multi therapeutic potential, and subsequent purification steps, as well as research on the mechanisms of action by which these polymers act should be investigated. Keywords: Urolithiasis. Anti-adipogenic. Antioxidant. Antiproliferative. Immunomodulatory.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 01 Cladograma representando a nova hipótese de organização dos
eucariotos................................................................................
20
Figura 02 Produção mundial dos principais gêneros de macroalgas
comercialmente cultivadas em 2008.............................................
21
Figura 03 Modelo hipotético da organização das paredes celulares de algas
marrons da ordem Fucales..................................................
23
Figura 04 Estimativa das 10 principais causas de morte no mundo nos anos
de 2015 e 2030........................................................................
27
Figura 05 Esquema ilustrativo da progressão da aterosclerose em um vaso
sanguíneo, nos planos axial e sagital..................................
28
Figura 06 Mecanismo da coagulação sanguínea proposto na década de
60......................................................................................................
29
Figura 07 Representação esquemática dos complexos procoagulantes... 30
Figura 08 Mecanismos de ação dos anticoagulantes endógenos e do
sistema fibrinolítico........................................................................
31
Figura 09 Redução do oxigênio molecular (O2) na mitocôndria.................. 35
Figura 10 Reações de produção de radicais hidroxila................................. 36
Figura 11 Mecanismos de ação de alguns antioxidantes
endógenos.......................................................................................
37
Figura 12 Depósitos de tecido adiposo em humanos.................................. 40
Figura 13 Diferenciação de adipócitos.......................................................... 41
Figura 14 Papel dos macrófagos no desenvolvimento, homeostase e
doenças............................................................................................
44
Figura 15 Principais características das células cancerígenas.................. 47
Figura 16 Etapas da formação dos cristais urinários................................... 52
Figura 17 Imagens de microscopia eletrônica de varredura de cristais de
Oxalato de Cálcio.......................................................................
53
Figura 18 Faces dos cristais do tipo COM..................................................... 54
Figura 19 Modelo hipotético da representação da deposição/internalização
do cristal de oxalato de cálcio nas células renais por endocitose e
processo intracelular por oxalúria durante condições
hiperoxalúricas................................
55
Figura 20 Hipótese da patogênese das placas de Randall.......................... 57
Figura 21 Iamgem da alga verde Caulerpa prolifera..................................... 62
Figura 22 Obtenção das frações ricas em polissacarídeos sulfatados
extraídos da alga verde Caulerpa prolifera..................................
64
Figura 23 Esquema das trocas de meios durante a diferenciação
adipocitária......................................................................................
72
Figura 24 Eletroforese em gel de agarose das frações polissacarídicas
obtidas da alga marinha verde Caulerpa
prolifera............................................................................................
77
Figura 25 Capacidade antioxidante total (CAT) das frações polissacarídicas
obtidas da alga marinha verde Caulerpa
prolifera............................................................................................
81
Figura 26 Poder redutor das frações polissacarídicas de C.
prolifera............................................................................................
82
Figura 27 Sequestro de radicais hidroxila (OH·) pelas frações
polissacarídicas de C. prolifera.....................................................
83
Figura 28 Sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2) pelas frações
polissacarídicas de C. prolifera.....................................................
84
Figura 29 Quelação férrica pelas frações polissacarídicas de C.
prolifera............................................................................................
85
Figura 30 Quelação cúprica pelas frações polissacarídicas de C.
prolifera............................................................................................
86
Figura 31 Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
viabilidade de células da linhagem RAW 264.7 após 24
horas................................................................................................
87
Figura 32 Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
produção de óxido nítrico pela linhagem de macrófagos RAW
264.7 após 24...................................................................................
88
Figura 33 Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
produção de óxido nítrico pela linhagem de macrófagos RAW
264.7 estimulados por LPS de E. coli por 24 horas.....................
89
Figura 34 Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
viabilidade de células da linhagem 3T3-L1 após 24 horas.........
91
Figura 35 Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
diferenciação adipocitária de células da linhagem 3T3-L1.........
92
Figura 36 Células da linhagem 3T3-L1 visualizadas em microscopia óptica
de campo claro....................................................................
93
Figura 37 Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
viabilidade de células da linhagem HeLa (A) e 786-0 (B) após 24 e
48 horas de tratamento...........................................................
95
Figura 38 Efeito das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a
formação de cristais de oxalato de cálcio....................................
98
Figura 39 Microscopia confocal de cristais de oxalato de cálcio formados na
presença de frações polissacarídicas de C.
prolifera............................................................................................
101
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Algumas atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas.............................................................................................
24
Tabela 02 Algumas atividades antiproliferativas de polissacarídeos
sulfatados...........................................................................................
47
Tabela 03 Rendimento, dosagens químicas e composição monossacarídica
das frações polissacarídicas extraídas da alga verde
marinha.....................................................................................
78
Tabela 04 Espectro de infravermelho das frações polissacarídicas obtidas a
partir da alga Caulerpa prolifera...................................................
79
Tabela 05 Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga
marinha verde Caulerpa prolifera avaliada pelos ensaios de Tempo
de tromboplastina ativada (TTPa) e Tempo de protrombina
(PT)................................................................................
80
Tabela 06 Atividade microbicida das frações polissacarídicas obtidos a partir
de C. prolifera...........................................................................
97
Tabela 07 Potencial Zeta de cristais formados na presença das frações
polissacarídicas da alga C. prolifera à temperatura de 25 ° C.......
100
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
º C Grau Celsius
µg Micrograma
µL Microlitro
µm Micrometro
3T3-L1 Linhagem celular de pré-adipócitos de
camundongos
786-0 Linhagem celular tumoral de células
renais humanas
AÇ Açúcares totais
Anfot. B Anfotericina B
ATCC American Type Culture Collection
AVC Acidente vascular cerebral
BHA Hidroxianilose butilado
BHT Hidroxitolueno butilado
BIOPOL Laboratório de biotecnologia de
polímeros naturais
C/EBP-β, -α, - δ Membros da família de proteínas de
ligação potencializadora
CaOx Oxalato de cálcio
CaP Fosfato de cálcio
CAT Capacidade antioxidante total
CATL Catalase
CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio
cm Centímetros
COD Cristal dihidratado
COM Cristal monohidratado
COMP. FEN Compostos fenólicos
COT Cristal trihidratado
CP-0.3/CP-0.5/CP-0.7/CP-0.9/CP-
1.1/CP-1.5/CP-2.0
Frações polissacarídicas de Caulerpa
prolifera
CTV Cloreto de Cetil Trimetil Amônio
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DNA Ácido desoxiribonucléico
DNTs Doenças não transmissíveis
DO Densidade óptica
EAA Equivalente de ácido ascórbico
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FDA Food and Drugs Administration
FITC Isotiocianato de fluoresceína
FT Fator tecidual
FUC Fucose
g Grama
G Gravidade
G6P Glicose-6-fosfato
G6PD Glciose-6-fosfato desidrogenase
GAL Galactose
GATA Família de fatores de transcrição
caracterizados pela ligação a sequência
“GATA” do DNA
GLIC Glicose
GPx Glutationa peroxidase
GRD Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
h Hora
HCII Cofator II da heparina
HCl Ácido clorídrico
HELA Linhagem celular tumoral de colo
uterino humano
HPLC Cromatografia líquida de alto
desempenho
HRPO Horseradish peroxidase
IBMX Isobutilmetilxantina
IC50 Concentração mínima inibitória capaz
de matar 50% dos organismos
ICAM1 Molécula de adesão intercelular 1
IL-1 Interleucina 1
IL-10 Interleucina10
IL-6 Interleucina 6
IMC Índice de massa corpórea
INCA Instituto Nacional de Câncer
IV Inibição da viabilidade
IV Infravermelho
KPC Klebsiella pneumoniae resistente a
carbapenêmicos
LDLs Lipoproteína de baixa densidade
LPS Lipopolissacarídeo
M Molar
MA Meio de manutenção adipocitária
MAN Manose
MCP-1 Proteína quimiotática de monócitos - 1
MDA Meio de diferenciação adipocitária
mg Miligrama
mM Milimolar
mm Milímetros
MMPs Metaloproteinases
MO Molibdênio
MTT brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-
difeniltetrazólio
N.D Não detectado
NDT Não determinado
NADP+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato oxidada
NADPH Nicotinamida adenina dinucleotídeo
fosfato reduzida
NBT Nitroblue tetrazolium
nm Nanômetros
OMS Organização Mundial de Saúde
PAI-1 Inibidor dos ativadores de
plasminogênio tipo 1
PAI-2 Inibidor dos ativadores de
plasminogênio tipo 2
PBS Tampão salino-fosfato
PDA 1,3-Diaminopropano acetato
PG Galato propil
PGE-2 Prostaglandia E2
PPAR-γ Receptor ativado por proliferadores de
peroxissoma
pH Potencial hidrogeniônico
Prot Proteína
Prx red e oxi Peroxiredoxina reduzida e oxidada
PT Tempo de protrombina
Raw 264.7 Linhagem celular de macrófago de
camundongos
RBP-4 Proteína ligadora de retinol
RCS Espécies reativas do cloro
RNS Espécies reativas de Nitrogênio
ROS Espécies reativas de Oxigênio
RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute
RSS Espécies reativas do enxofre
SDS Dodecil sulfato de sódio
SFB Soro fetal bovino
SOD Superóxido desmutase
SREBP-1c Elemento esterol responsivo a proteína
de ligação 1c
SULF Sulfato
TAFI Inibidor da fibrinólise ativado por
trombina
TBHQ tert-butilhidroquinona
TCA Ácido tricloroacético
TFPI Inibidor da via do fator tecidual
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TP Tempo de protrombina
t-PA Ativador do plasminogênio tecidual
Trx red e oxi Tioredoxina reduzida e oxidada
TrxR Tioredoxina redutase
TT Tempo de Trombina
TTPa Tempo de tromboplastina parcial
ativada
u-PA Ativador do plasminogênio do tipo
uroquinase
V/cm Volts/centímetro
VCAM1 Molécula de adesão celular 1
WHO World Health Organization
WNT Via de sinalização constituída por
proteínas envolvidas na embriogênese
XIL Xilose
δfosB Membro da família de fatores de
transcrição FOS
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 19
1.1 MACROALGAS MARINHAS .................................................................................. 19
1.2 PAREDE CELULAR DE MACROALGAS MARINHAS E POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS ................................................................................................................. 22
1.3 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE
ALGAS ............................................................................................................................. 24
1.4 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE .......................................................................... 26
1.4.1 Doenças cardiovasculares .............................................................................. 26
1.4.2 Sistema de coagulação sanguínea ................................................................. 29
1.4.3 Compostos anticoagulantes ............................................................................ 31
1.4.4 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas ... 33
1.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE................................................................................. 34
1.5.1 Radicais livres e antioxidantes ........................................................................ 34
1.5.2 Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas ....... 38
1.6 ATIVIDADE ANTIADIPOGÊNICA .......................................................................... 39
1.6.1 Obesidade, adipócitos e tecido adiposo .......................................................... 39
1.6.2 Mecanismo de diferenciação adipocitária ....................................................... 41
1.6.3 Atividade antiadipogênica de polissacarídeos sulfatados de algas ................. 42
1.7 ATIVIDADE IMUNOMODULATÓRIA ..................................................................... 43
1.7.1 Imunomodulação mediada por macrófagos .................................................... 43
1.7.2 Atividade imunomodulatória de polissacarídeos sulfatados de algas .............. 44
1.8 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA ....................................................................... 45
1.8.1 Câncer ............................................................................................................ 45
1.8.2 Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de algas .................. 46
1.9 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................................................................ 48
1.9.1 Leishmaniose e atividade leishmanicida de polissacarídeos sulfatados de
algas. 48
1.9.2 Infecções bacterianas e atividade antibiótica de polissacarídeos sulfatados de
algas. 49
1.10 INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE CRISTAIS ............................................................ 50
1.10.1 Urolitíase ........................................................................................................ 50
1.10.2 Atividade antiurolítica de polissacarídeos sulfatados ...................................... 58
2 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 60
2.1 REAGENTES ........................................................................................................ 60
2.2 APARELHOS ......................................................................................................... 61
2.3 ALGAS .................................................................................................................. 62
2.4 OBTENÇÃO DE FRAÇÕES RICAS EM POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA
MACROALGA VERDE CAULERPA PROLIFERA. ........................................................... 63
2.4.1 Despigmentação, delipidação e obtenção do pó cetônico .............................. 63
2.4.2 Proteólise ....................................................................................................... 63
2.4.3 Fracionamento ................................................................................................ 63
2.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS 65
2.5.1 Eletroforese em gel de agarose a 0,6 % ......................................................... 65
2.5.2 Dosagem de açúcares totais .......................................................................... 65
2.5.3 Dosagem de sulfato ........................................................................................ 65
2.5.4 Dosagem de proteínas ................................................................................... 66
2.5.5 Dosagem de compostos fenólicos .................................................................. 66
2.5.6 Composição monossacarídica ........................................................................ 66
2.5.7 Análise de espectroscopia de infravermelho ................................................... 66
2.6 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE IN VITRO .......................................................... 67
2.7 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES IN VITRO ............................................................ 67
2.7.1 Determinação da capacidade antioxidante total (CAT) ................................... 67
2.7.2 Avaliação do poder redutor ............................................................................. 68
2.7.3 Avaliação do sequestro do radical hidroxila (OH.) ........................................... 68
2.7.4 Avaliação do sequestro do radical superóxido (O2-•) ....................................... 68
2.7.5 Avaliação do sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2) .............................. 69
2.7.6 Avaliação da capacidade em quelar ferro ....................................................... 69
2.7.7 Determinação da capacidade em quelar cobre ............................................... 70
2.8 ENSAIO DO MTT .................................................................................................. 70
2.9 ATIVIDADE IMUNOMODULATÓRIA (DOSAGEM DO ÓXIDO NÍTRICO) ............. 71
2.10 ATIVIDADE ANTIADIPOGÊNICA .......................................................................... 72
2.11 ATIVIDADE MICROBICIDA. .................................................................................. 73
2.11.1 Atividades anti-Klebsiela pneumonia carbapenemases (KPC) e anti-
Staphylococcus epidermidis.......................................................................................... 73
2.11.2 Atividade anti-Leishmania amazonensis ......................................................... 73
2.12 EFEITO DOS POLISSACARÍDEOS SOBRE A FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE
OXALATO DE CÁLCIO. ................................................................................................... 74
2.12.1 Cristalização do oxalato de cálcio ................................................................... 74
2.12.2 Análise da morfologia dos cristais de CaOx por microscopia .......................... 74
2.12.3 Medida do potencial zeta (ζ) dos cristais de CaOx.......................................... 75
2.12.4 Análise da morfologia dos cristais de CaOx por microscopia confocal ............ 75
2.13 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ................................................................................... 75
3 RESULTADOS ......................................................................................................... 77
3.1 ANÁLISES QUÍMICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DAS FRAÇÕES OBTIDAS A PARTIR
DE C. PROLIFERA .......................................................................................................... 77
3.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA. .................................... 79
3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA. .................................... 80
3.2.1 Capacidade antioxidante total (CAT) .................................................................. 80
3.2.2 Poder redutor ..................................................................................................... 81
3.2.3 Sequestro do radical hidroxila (OH·) .................................................................. 82
3.2.4 Sequestro do radical superóxido (O2•–) ............................................................... 83
3.2.5 Sequestro do peroxido de hidrogênio (H2O2) ...................................................... 83
3.2.6 Quelação férrica. ................................................................................................ 84
3.2.7 Quelação cúprica. .............................................................................................. 85
3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA. .................................... 86
3.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-ADIPOGÊNICA DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA. .................................... 89
3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA. .................................... 94
3.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MICROBICIDA DE FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS
OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA. ........................................................................ 96
3.7 EFEITO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C.
PROLIFERA SOBRE A FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO. ........... 97
4 DISCUSSÃO ........................................................................................................... 103
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 117
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 MACROALGAS MARINHAS
Os oceanos cobrem cerca de 70% da superfície mundial, fazendo com que
aproximadamente metade da biodiversidade de todo planeta esteja presente nesse
ecossistema (YENDE et al., 2014). Desta forma, os oceanos são reservatórios de
uma ampla variedade e quantidade de organismos de onde se pode obter uma
miríade de componentes biofuncionais. Dentre esses organismos, pode-se citar as
algas marinhas como uma fonte rica de compostos de grande diversidade estrutural
e funcional (YENDE et al., 2014; WIJESEKARA et al., 2011).
As algas marinhas são comumente subdivididas em dois grandes grupos:
microalgas e macroalgas (CHEN et al., 2009). Essa classificação, como os prefixos
já sugerem, se baseia no tamanho e em outros aspectos morfológicos desses
organismos. As microalgas compõem um grupo de organismos microscópicos
fotossintéticos, muitos desses unicelulares e encontrados em uma grande
diversidade de ambientes. Já as macroalgas possuem uma organização multicelular
que costuma assumir estruturas semelhantes às raízes e folhas de plantas
superiores (CHEN et al., 2009).
As macroalgas marinhas são classificadas de acordo com a predominância de
pigmentos fotossintéticos ou acessórios presente nesses organismos, sendo assim
agrupadas em algas verdes (Chlorophyceae), que possuem as clorofilas “a” e “b”
como pigmentos predominantes; algas vermelhas (Rhodophyceae) cujos principais
pigmentos são a ficoeritrina e ficocianina; e algas marrons ou pardas
(Phaeophyceae) que apresentam o carotenóide fucoxantina como pigmento
característico (YENDE et al., 2014; O’SULLIVAN et al., 2010).
As macroalgas verdes são didaticamente incluídas no reino Plantae, enquanto
as marrons e vermelhas no reino Protista. Em 2005, no entanto, a Sociedade
Internacional de Protistologistas baseando-se em estudos de filogenia molecular,
propôs uma nova classificação dos seres vivos, transformando os antigos reinos
clássicos do domínio eucariota (Animalia, Plantae, Fungi e Protista) em seis novos
supergrupos (Opisthokonta, Amoebozoa, Plantae, Chromalveolata, Rhizaria e
Excavata) (ADL et al., 2005). No entanto, após alguns anos de críticas e de
20
desenvolvimento tecnológico, essa classificação foi recentemente revisada (ADL et
al., 2012). Agora os organismos estão distribuídos em cinco supergrupos
(Opisthokonta, Amoebozoa, Excavata, Archaeplastida e SAR) (Figura 01). Nessa
nova classificação, as macroalgas continuam em diferentes clados, estando às algas
verdes e vermelhas inseridas no supergrupo Archaeplastida, filos Chloroplastida e
Rhodophyceae, respectivamente, e as algas marrons no supergrupo SAR, filo
Stramenopiles).
Figura 01. Cladograma representando a nova hipótese de organização dos eucariotos. Os cinco supergrupos (Opisthokonta, Amoebozoa, Excavata, Archaeplastida e SAR) estão representados por diferentes cores. Os ramos menores do cladograma representam os filos que constituem os supergrupos. O filo Stramenopiles que abrange as algas marinhas marrons está destacado por um retângulo tracejado marrom, o filo Rhodophyceae por um retângulo tracejado vermelho e o filo Chloroplastida por um retângulo tracejado verde. Figura adaptada de ADL et al., 2012.
Vale salientar que essa classificação certamente sofrerá novas mudanças em
um futuro próximo, uma vez que muitos organismos não se encontram agrupados
em nenhum supergrupo (nomes em cor cinza na Figura 01), porém está cada vez
mais claro que as algas vermelhas e, principalmente, as verdes apresentam uma
maior semelhança filogenética com as plantas (inseridas dentro do clado
Chloroplastida) do que as algas marrons. Desta forma, deve-se ter ainda mais
21
cuidado ao generalizar e classificar algas como plantas, como ocorre diariamente
por muitas pessoas.
Apesar da maioria da população mundial estar alheia a essas discussões de
sistemática, as algas marinhas participam de alguma maneira em suas vidas. Do
ponto de vista ecológico, as algas marinhas são responsáveis por cerca de 50% da
taxa mundial de fotossíntese, além de serem as principais fontes primárias da cadeia
alimentar marinha (MORONEY et al., 2009). Do ponto de vista econômico, a
“indústria de macroalgas” tem como principais derivados os produtos alimentícios
voltados ao consumo humano, que representam cerca de 83-90% do valor
econômico das algas, estando o restante do valor associado principalmente a
hidrocolóides como os alginatos, os ágares e as carragenanas (WEI et al., 2013).
Atualmente a China é o líder mundial em produção de macroalgas, e juntamente
com outros países do leste e sudoeste asiático somam 99,6% da produção mundial.
Fora da Ásia, Chile e África do Sul destacam-se na produção de macroalgas. Dentre
as cerca de 200 espécies comerciais de macroalgas, 10 gêneros são intensamente
cultivados: as vermelhas dos gêneros Porphyra, Kappaphycus, Eucheuma e
Gracilaria; as marrons dos gêneros Saccharina, Undaria e Sargassum; e as verdes
dos gêneros Monostroma, Ulva e Caulerpa (Figura 02) (BAST, 2014).
Figura 02. Produção mundial dos principais gêneros de macroalgas comercialmente cultivadas em 2008. Figura adaptada de BAST, 2014.
As macroalgas possuem um alto valor nutricional e funcional, uma vez que
são ricas em vitaminas hidro e lipossolúveis, ácidos graxos, carboidratos, proteínas,
Saccharina 30%
Eucheuma 12%
Kappaphycus 11%
Undaria 11%
Gracilaria [PORCENTAGEM]
Porphyra [PORCENTAGEM]
Outros [PORCENTAGEM]
22
minerais, carotenóides e tocoferóis (VINAYAK et al., 2011; ORTIZ et al., 2009). Além
disso, as macroalgas ainda produzem outros metabólitos com potencial econômico e
biotecnológico, como polifenóis, lectinas, aminoácidos tipo-micosporinas, compostos
halogenados, policetídeos, e principalmente, polissacarídeos sulfatados, o que tem
atraído cada vez mais o foco de pesquisas biomédicas para esses organismos
(MAYER et al., 2013; CARDOZO et al., 2007).
1.2 PAREDE CELULAR DE MACROALGAS MARINHAS E
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS
Os componentes da parede celular de plantas e algas são alvo de grande
interesse econômico e biotecnológico. A celulose, por exemplo, é um dos principais
constituintes da parede celular desses organismos, e é comumente utilizada na
indústria têxtil, de papel e de biocombustíveis. No entanto, há diversos outros
componentes que apresentam grande importância alimentícia ou que podem ser
utilizados no desenvolvimento de produtos nutracêuticos e farmacêuticos (POPPER
et al., 2011).
A parede celular das algas marinhas, assim como a das plantas, possui em
sua constituição microfibras de celulose e hemicelulose, que variam em quantidade
de acordo com a classe da alga. As algas verdes podem conter até 70% de sua
parede celular constituída por esses polímeros (BALDAN et al., 2001), valor que
decai consideravelmente quando se fala em algas marrons que possuem valores
inferiores a 10% em detrimento dos polissacarídeos sulfatados e alginatos, que em
alguns casos podem vir a representar até 45% do peso seco da parede celular de
Phaeophyceae (DENIAUD-BOUET et al., 2014). Proteínas, compostos halogenados,
compostos fenólicos e minerais são outros componentes que podem ser
encontrados na parede celular de algas (Figura 03) (DENIAUD-BOUET et al., 2014).
23
Figura 03. Modelo hipotético da organização das paredes celulares de algas marrons da ordem
Fucales. As esferas azuis e as alaranjadas representam íons de cálcio e iodo, respectivamente.
Figura adaptada de DENIAUD-BOUET et al., 2014.
Os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas estão localizados em sua
parede celular formando uma matriz mucilaginosa, que apesar de não ter sua função
totalmente compreendida, parece estar relacionada à proteção contra desidratação
nos longos períodos de maré baixa, à promoção de rigidez e flexibilidade da alga
permitindo que esta permaneça estendida mesmo sob a ação das ondas e assim
capte luz e nutrientes de uma maneira mais eficiente, além de servirem como
reserva energética e agirem na manutenção do equilíbrio iônico (COSTA et al.,
2014; O’SULLIVAN et al., 2010).
Os tipos de polissacarídeos sulfatados presentes na parede celular das algas
variam de acordo com a estação do ano, idade, localização geográfica, espécie
(O’SULLIVAN et al., 2010) e até mesmo entre diferentes tecidos de uma mesma
alga (COSTA et al., 2014; DIETRICH et al., 1995). Apesar desses vários fatores, os
trabalhos têm demonstrado que há uma predominância em certos tipos de
polissacarídeos sulfatados de acordo com o grupo de macroalgas (verdes, marrons
ou vermelhas). Desta forma, as algas marrons apresentam como polissacarídeos
sulfatados predominantes as fucanas, que têm como característica principal a
presença de α-L-fucose sulfatada. Esses polissacarídeos podem se apresentar sobre
a forma de homopolímeros (homofucanas) ou heteropolímeros (heterofucanas ou
fucoidans). Já as algas vermelhas possuem como principais polissacarídeos
sulfatados as galactanas sulfatadas e as verdes um número variável de
24
heteropolissacarídeos sulfatados, apesar de homopolissacarídeos já terem sido
descritos em Chlorophyceae (COSTA et al., 2014).
1.3 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DE POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS DE ALGAS
Os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas vêm sendo descritos como
possuidores das mais diversas atividades farmacológicas (NGO et al., 2013;
WIJESEKARA et al., 2011; JIAO et al., 2011). A Tabela 01 resume algumas dessas
atividades.
Tabela 01. Algumas atividades farmacológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas. Fonte: Autoria própria.
ATIVIDADE
ALGA
REFERÊNCIA
Antiadesiva Ulva rotundata
Spatoglossum schröederi
GADENNE et al., 2013
ROCHA et al., 2001
Antiadipogênica Fucus vesiculosos KIM et al., 2010
Antiangiogênica Sargassum vulgare
Codium cylindricum
DORE et al., 2013
MATSUBARA et al., 2003
Anticoagulante Caulerpa cupressoides
Dictyopteris justii
COSTA et al., 2012
MAGALHAES et al. 2010
Anti-inflamatória C. cupressoides
Dictyota menstrualis
RODRIGUES et al., 2012b
ALBUQUERQUE et al., 2013
Antimicrobiana Caulerpa racemosa
Kappaphycus alvarezii
PIRES et al., 2013a
KUMARAN et al., 2010
Antinociceptiva C. cupressoides
Dictyota menstrualis
RODRIGUES et al., 2012b
ALBUQUERQUE et al., 2013
Antioxidante C. cupressoides
D. justii
COSTA et al., 2012
MAGALHAES et al. 2010
Antitrombótica S. schröederi
Caulerpa okamurai
ALMEIDA-LIMA et al., 2010
HAYAKAWA et al., 2000
25
Antitumoral D. delicatula
C. racemosa
MAGALHAES et al., 2010
JI et al., 2008
Antiúlcera Cladosiphon okamuranus
F. vesiculosos SHIBATA et al., 2003
Antiviral Sphaerococcus coronopifolius
C. racemosa
BOUHLAL et al., 2011
PUJOL et al., 2012
O gênero Caulerpa possui um grande valor econômico e um elevado número
de espécies, no entanto, poucas algas desse gênero tiveram seus polissacarídeos
sulfatados extraídos, purificados, caracterizados e avaliados quanto ao seu potencial
biotecnológico. Dentre as algas verdes, o gênero Caulerpa possui cerca de 371
espécies (incluindo isoformas e variedades), mas apenas 92 dessas são aceitas
taxonomicamente (GUIRY et al., 2014).
As atividades econômicas com algas do gênero Caulerpa movimentam cerca
de 3 bilhões de euros, anualmente (KRAAN, 2012). Dentro desse contexto, a alga
comestível Caulerpa racemosa é a mais bem estudada. Alguns trabalhos relatam a
extração, caracterização (CHATTOPADHYAY et al., 2007) e detecção de atividades
farmacológicas inerentes aos seus polissacarídeos sulfatados, tais como:
anticoagulante (RODRIGUES et al., 2012a), anti-inflamatória e antinociceptiva
(RIBEIRO et al., 2014), antiviral (PUJOL et al., 2012; GHOSH et al., 2009),
antitumoral (JI et al., 2008), leishmanicida (PIRES et al., 2013a), além de exibir uma
ação sinérgica junto a fosfolipase sPLA2 extraída do veneno de Crotalus durissus
terrificus, potencializando a ação bactericida dessa enzima (PIRES et al., 2013b).
Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade anticoagulante,
cujas estruturas ainda não foram caracterizadas, foram extraídos das algas Caulerpa
cupressoides var. lycopodium, Caulerpa prolifera (RODRIGUES et al., 2012a),
Caulerpa taxifolia, Caulerpa scalpelliformis, Caulerpa veravalensis e Caulerpa
peltata (SHANMUGAM et al., 2001). Relatos de atividades anti-inflamatória e
antinociceptiva atribuídas a polissacarídeos sulfatados extraídos de Caulerpa
cupressoides var. lycopodium (RODRIGUES et al., 2012b) e Caulerpa mexicana
(CARNEIRO et al., 2014) foram recentemente publicados. Polissacarídeos
sulfatados com atividade antitrombótica foram identificados em Caulerpa okamurai e
26
Caulerpa brachypus (HAYAKAWA et al., 2000) e imunoestimulatórios em Caulerpa
lentillifera (MAEDA et al., 2012). Além desses trabalhos mencionados anteriormente,
o grupo de pesquisa em que está inserido esta tese, ao realizar uma análise
prospectiva de 11 algas diferentes, obteve extratos ricos em polissacarídeos
sulfatados de 3 algas do gênero Caulerpa (Caulerpa cupressoides var. flabellata,
Caulerpa prolifera e Caulerpa sertularioides) que apresentaram atividades
anticoagulante, antioxidante e antitumoral (COSTA et al, 2010). Dando continuidade
a esse trabalho, Costa e colaboradores, a partir do extrato rico em polissacarídeos
sulfatados da alga C. cupressoides obtiveram quatro diferentes polissacarídeos
sulfatados (CCB-0.3; CCB-0.5; CCB-1.0; CCB-2.0), e esses apresentaram atividade
antioxidante em diversos ensaios in vitro e atividade anticoagulante (COSTA et al.,
2012).
Com o objetivo de dar continuidade ao trabalho publicado em 2010 por Costa
e colaboradores, selecionou-se a alga C. prolifera para melhor caracterizar e avaliar
farmacologicamente os polissacarídeos sulfatados presentes no extrato obtido
previamente. Dentro desse contexto, descreve-se abaixo com maiores detalhes,
temas relacionados com as atividades farmacológicas estudadas nesta tese.
1.4 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE
1.4.1 Doenças cardiovasculares
As doenças cardiovasculares compreendem condições como infarto do
miocárdio, acidente vascular cerebral (AVC), hipertensão e angina, e representam
cerca de 31% dos óbitos anuais, figurando entre as 10 maiores causas de morte em
projeções entre 2015-2030 (WHO, 2013) (Figura 04).
27
Figura 04. Estimativa das 10 principais causas de morte no mundo entre os anos de 2015 e 2030. Adaptado de WHO, 2013.
O principal processo patológico responsável pelo infarto do miocárdio e AVCs
é conhecido como aterosclerose, que se desenvolve desde a infância progredindo
gradualmente ao longo da vida por influência de fatores como: tabagismo,
sedentarismo, dieta não saudável, obesidade e predisposições genéticas (WHO,
2011). O desenvolvimento da aterosclerose e suas consequências estão ilustradas
na Figura 05.
28
Figura 05. Esquema ilustrativo da progressão da aterosclerose em um vaso sanguíneo, nos planos axial e sagital. (a) O processo tem início quando lipoproteínas aterogênicas (LDLs) ultrapassam a camada íntima e sofrem oxidação subendotelial, agregando-se. Ao mesmo tempo, moléculas de adesão (VCAM1, ICAM1 e selectinas), em decorrência da oxidação subendotelial de LDLs ou por sinalização de citocinas, são expostas no endotélio, aumentando a diapedese de leucócitos. Os macrófagos subendoteliais captam intensamente moléculas de LDL modificadas e ficam repletos de lipídeos, passando a ser denominados de células espumosas. As primeiras lesões detectáveis desse processo são as estrias ateroscleróticas que podem ser observadas em aortas de crianças e posteriormente em outras artérias de adolescentes, e resultam do acúmulo dessas células espumosas. (b) Leucócitos, como as células T, são recrutados para o local da lesão e perpetuam um estado crônico de inflamação que é intensificado pela secreção de grandes quantidades de componentes da matriz extracelular, como o colágeno e por células musculares lisas, que aumentam a retenção e agregação de lipoproteínas aterogênicas. (c) Com a morte de células espumosas, ocorre um aumento da quantidade de restos celulares e cristais de colesterol livres. Além disso, as células musculares lisas formam uma capa fibrosa, formando uma espécie de cerne necrótico rico em lipídeos. Essa placa aterosclerótica não-obstrutiva pode se romper ou a região subendotelial pode erodir em decorrência da atividade excessiva de Metaloproteinases (MMPs), resultando na exposição de materiais potencialmente trombogênicos, como o fator tecidual, resultando na formação de um trombo no lúmen do vaso. Se esse trombo for grande o suficiente, ocorre o bloqueio do vaso, provocando o infarto do miocárdio, por exemplo. (d) Por fim, se a placa não se romper, a lesão continua a crescer e pode obstruir o lúmen do vaso, causando uma doença obstrutiva. Figuras adaptadas de RADER; DAUGHTRY, 2008 e SANZ; FAYAD, 2008.
Sangue
VCAM1, ICAM1
xe selectinas
Célula endotelial
Recrutamento de
monócito
Capa fibrosa
Fibrina
Plaquetas
a b c d
Endotélio
Célula
espumosa
Linfócito T
Célula muscular
lisa
Matriz extracelular
xxTromboxx
xCapaxx
fibrosa
Cerne necrótico
(debris celulares) xColesterolx
xFatorx
Tecidual
xTrombo
LDL
LDL
Lúmen
Média
Íntima
xCélulax
muscular
lisa
Tecido
↓ Produção de
óxido nítrico
xFibrila dex
colágeno Linfócito T
xCélulax
espumosa
Célula
xapoptóticax
Fator Tecidual
Colesterol
Cerne necrótico rico
em lipídeos
Lâmina elástica interna
29
1.4.2 Sistema de coagulação sanguínea
O processo de coagulação envolve elementos próximos às lesões como as
paredes endoteliais, plaquetas e proteínas solúveis. O modelo clássico da
coagulação foi proposto em meados dos anos 60 por MacFarlane, Davie e Ratnoff
(DAVIE; RATNOFF, 1964; MACFARLANE, 1964). Tal mecanismo encontra-se
ilustrado na Figura 06.
Figura 06. Mecanismo da coagulação sanguínea proposto na década de 60. Este modelo divide a cascata de coagulação em três vias (intrínseca, extrínseca e comum) que resultam na formação da Fibrina por meio da ativação sequencial de zimogênios. A via extrínseca é desencadeada pela exposição, após um trauma, do Fator Tecidual (FT), uma molécula transmembrana expressa por diversas células localizadas fora dos vasos sanguíneos, como macrófagos de placas ateroscleróticas e fibroblastos subendoteliais. O FT é o cofator de ativação do Fator VII, em VIIa, que por sua vez ativa o Fator X, em Xa. A via intrínseca é iniciada pela ativação do Fator XII, em XIIa pelo simples contato do sangue com qualquer superfície diferente do endotélio normal e das células sanguíneas, como uma superfície negativamente carregada como a membrana de uma plaqueta ativada ou colágeno. Tal processo é denominado de “ativação por contato”. A ativação do Fator XII desencadeia uma série de ativações proteicas culminando, da mesma forma, na ativação do Fator X, em Xa. A ativação do Fator X é o ponto de convergência entre as vias que continuam de forma comum a ambas. Essa via comum é caracterizada pela ativação de fibrinogênio (ou Fator I) à fibrina (Fator Ia), pela trombina (ou Fator IIa), que se polimeriza formando uma malha densa, na forma de coágulo, que vai ser estabilizada pelo fator XIIIa. TP: Tempo de protrombina (Teste laboratorial para avaliação da via extrínseca da coagulação); TTPa: Tempo de tromboplastina parcial ativada (Teste laboratorial para avaliação da via intrínseca da coagulação); FT: Fator tecidual. Fonte: Autoria própria.
No entanto, tal modelo é inadequado já que esta divisão em vias intrínseca e
extrínseca não ocorre in vivo. Com base nisso, um novo modelo constituído por 3
complexos procoagulantes (complexo tenase extrínseco, complexo tenase intrínseco
30
e complexo protrombinase) foi proposto e é atualmente aceito pela comunidade
científica (Figura 07) (ADAMS; BIRD, 2009).
Figura 07. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. (a) O Fator VII encontra-se ativado em concentrações muito baixas no sangue. (b) O Fator VIIa tem grande afinidade pelo FT exposto em membranas celulares, inclusive de plaquetas. O complexo FT/VIIa formado é capaz de ativar uma quantidade consideravelmente maior de Fator VII. (c) O principal papel de FT/VIIa, no entanto, é formar um complexo com os Fatores X e IX (Complexo tenase extrínseco), que promove a ativação desses dois fatores. Uma vez ativado, o Fator Xa, leva a formação de pequenas concentrações de trombina, que por sua vez ativam os cofatores V e VIII. (d) Tanto o fator VIIIa quanto fator IXa se complexam ao Fator X (Complexo tenase intrínseco) ativando-o, o que por conseguinte leva a ativação de mais moléculas de trombina. (e) Os Fatores Va e Xa se complexam ao Fator II, formando o Complexo protrombinase, que aumenta significativamente sua conversão em trombina (a formação de trombina por este complexo é 50 vezes maior do que pelos demais). Por fim, a ativação da trombina irá gerar a conversão de fibrinogênio em fibrina. FT: Fator tecidual. Fonte: Autoria própria.
Em condições fisiológicas, a coagulação sanguínea é estritamente regulada
por anticoagulantes endógenos para que não haja uma ativação indesejada, o que
levaria a uma coagulação intravascular disseminada, resultando na formação
excessiva de trombos (Figura 08). As principais proteínas regulatórias que
funcionam como anticoagulantes naturais são: o TFPI (Inibidor da via do fator
tecidual), a proteína C e a proteína S (KUBIER et al., 2012).
31
Figura 08. Mecanismos de ação dos anticoagulantes endógenos e do sistema fibrinolítico. As elipses verdes representam os anticoagulantes endógenos. As setas verdes pontilhadas representam os fatores de coagulação inibidos pela ação dos anticoagulantes endógenos. As elipses em roxo representam os componentes do sistema fibrinolítico e as elipses em amarelo os inibidores e/ou moduladores deste sistema. As setas amarelas pontilhadas representam os alvos de ação dos inibidores fibrinolíticos. A seta preta pontilhada representa a modulação do TAFI (Inibidor da fibrinólise ativado por trombina) por alteração na estrutura da fibrina, impedindo que a plasmina atue. Fonte: Autoria própria.
Após o processo de coagulação, entra em cena o sistema fibrinolítico, que
tem como função degradar a rede de fibrina formada para que não ocorra a
obstrução do fluxo sanguíneo (Figura 08). O principal componente desse sistema é a
plasmina, gerada a partir do plasminogênio. Sua conversão ocorre via ação de
proteases conhecidas como t-PA (ativador do plasminogênio tecidual) e u-PA
(ativador do plasminogênio do tipo uroquinase). A inibição deste sistema fibrinolítico
ocorre via inibidores de proteases como o PAI-1 e PAI-2 (inibidores dos ativadores
de plasminogênio) e a α2-antiplasmina, e de moduladores como o TAFI (Inibidor da
fibrinólise ativado por trombina) (NORDEHEM, 2006; DOBROVOLSKY et al., 2002).
1.4.3 Compostos anticoagulantes
Os anticoagulantes são o principal grupo de fármacos utilizados no tratamento
de doenças cardiovasculares, sendo a heparina não-fracionada e seus derivados de
baixo peso molecular os fármacos mais utilizados na terapêutica (DE CATERINA et
al., 2013).
32
A heparina é um heteropolissacarídeo sulfatado constituído por repetições de
um dissacarídeo trisulfatado contendo ácido idurônico 2-O-sulfatado e glucosamina
N-6-disulfatada (LIMA et al., 2011). Esse dissacarídeo compreende entre 75-90% da
estrutura da heparina, estando o restante do percentual atribuído principalmente à
presença de ácido glucurônico N-acetilado. Vale ressaltar, que podem haver
algumas pequenas variações conforme a fonte da qual houve a extração da
heparina (CASU et al., 2014). A descoberta da heparina ocorreu há quase um século
a partir de estudos com preparações de fígado canino (MCLEAN, 1916), no entanto,
atualmente, as preparações comerciais de heparina são obtidas principalmente a
partir da mucosa intestinal de porcos (CASU et al., 2015; LIMA et al., 2011).
A heparina possui diversos mecanismos de ação que favorecem sua ação
anticoagulante. O principal mecanismo de ação da heparina reside em sua
capacidade de se complexar com a antitrombina, aumentando a afinidade desse
inibidor pela trombina. Além disso, o complexo Heparina/Antitrombina é capaz de
interagir com os fatores IXa, Xa, XIa e XIIa, inativando-os. Por fim, a heparina ainda
é capaz de formar um complexo ternário com o cofator II da heparina (HCII) e a
trombina, o que resulta na inibição dessa última mediada por HCII, além de
aumentar a síntese de TFPI por células endoteliais (GRAY et al., 2012).
A heparina é o único polissacarídeo sulfatado utilizado comercialmente como
anticoagulante, entretanto sua utilização pode provocar reações adversas tais como:
trombocitopenia (mediada por anticorpos), osteopenia (devido à ligação da heparina
a osteoblastos que liberam fatores ativadores de osteoclastos) e efeito hemorrágico
residual (GRAY et al., 2008). Além disso, entre 2007 e 2008, uma série de mortes e
efeitos adversos severos foram associados a pacientes que receberam injeções de
heparina nos EUA e países europeus. Esse evento que ficou conhecido como “A
crise da heparina” ocorreu devido à contaminação de formulações chinesas do
fármaco contaminadas por condroitin sulfato. Tal evento chamou a atenção da
necessidade de desenvolvimento de métodos de controle mais eficazes que fossem
capazes de detectar tais contaminações (CASU et al., 2014; LIMA et al., 2011).
Tendo em vista este acontecimento e a perda de mercado frente aos chineses, a
FDA está tentando reintroduzir a heparina bovina no mercado americano, no entanto
ressalta que para tanto é necessário que as indústrias farmacêuticas realizem testes
de longa duração com modelos animais para provar que o risco de contaminação
33
por príons causadores da encefalopatia espongiforme bovina não existe (FDA,
2014).
Dentro deste contexto, a busca por novos compostos anticoagulantes tem se
intensificado e um dos principais alvos são os polissacarídeos sulfatados. Esses
polímeros podem ser encontrados em: vertebrados, invertebrados (NADER et al.,
2004); angiospermas marinhas (AQUINO et al., 2005; SILVA et al., 2012); plantas de
água doce (DANTAS-SANTOS et al., 2012); fungos (CHENG et al., 2009) e em
bactérias, como as Cianobactérias (VOLK et al., 2006). Contudo, é nas macroalgas
marinhas que eles são encontrados em maior quantidade (ROCHA et al., 2006).
1.4.4 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas
marinhas
A presença de atividade anticoagulante mediada por polissacarídeos
sulfatados de algas marinhas foi primeiramente relatada em 1936, quando se obteve
uma galactana sulfatada da alga marinha vermelha Irides laminarioides (CHARGAFF
et al., 1936). Atualmente, dentre as atividades farmacológicas atribuídas a
polissacarídeos sulfatados de algas marinhas, a atividade anticoagulante é a mais
amplamente relatada (NGO et al., 2013; WIJESEKARA et al., 2011). Dois grupos de
polissacarídeos sulfatados possuem a maior quantidade de estudos de atividades já
documentados, as galactanas de algas vermelhas e as fucanas de algas marrons,
existindo ainda poucos relatos de polissacarídeos sulfatados de algas verdes com
essa atividade (NGO et al., 2013; WIJESEKARA et al., 2011). No entanto, apesar
dos poucos relatos, os polissacarídeos de algas verdes têm se mostrado
importantes moléculas anticoagulantes, inclusive tendo uma atividade, por vezes,
superior as desempenhadas por polímeros de algas vermelhas e marrons (WANG et
al., 2014).
A atividade anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados tem sido
determinada principalmente pelos ensaios de TTPa (Tempo de tromboplastina
parcial ativada), que avalia a inibição de fatores da via intrínseca da coagulação; TP
(tempo de protrombina), que avalia a inibição de fatores da via extrínseca da
coagulação; e TT (Tempo de trombina), que avalia a inibição da trombina. A maioria
dos estudos tem relatado que a atividade anticoagulante de polissacarídeos de algas
ocorre principalmente por alterações nos ensaios de TTPa e TT. Apenas poucos
34
artigos reportam o prolongamento do tempo de TP, levando a crer que os principais
alvos desses polímeros estão na via intrínseca e comum da coagulação
(SHOBHARANI et al., 2013; NGO et al., 2013; WIJESEKARA et al., 2011).
A atividade anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados está diretamente
relacionada à sua estrutura. Desta forma, massa molecular, tipos de resíduos
monossacarídeos, grau e localização da sulfatação são os principais fatores
relacionados ao papel anticoagulante exercido (SHOBHARANI et al., 2013; NGO et
al., 2013; WIJESEKARA et al., 2011).
Assim, a diversidade estrutural apresentada pelos polissacarídeos sulfatados
de algas é um atrativo para a pesquisa e identificação de potenciais agentes
anticoagulantes com atividades, possivelmente, distintas das exibidas pelos
compostos já estudados e que possam ser mais seguros.
1.5 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
1.5.1 Radicais livres e antioxidantes
O termo radical livre costuma ser utilizado para designar qualquer espécie
química (átomo, íon ou molécula) que contenha um ou mais elétrons
desemparelhados, nos orbitais externos. Esse desemparelhamento confere alta
reatividade aos radicais fazendo com que reajam tão logo sejam formados (COSTA
et al., 2012; WICKENS, 2001).
Nos organismos, os radicais livres ao serem formados podem reagir com o
DNA modificando suas bases nitrogenadas, e caso não haja reparo, mutações
podem ser geradas. Ao reagir com proteínas, as espécies reativas oxidam grupos
sulfidrilas (-SH), alterando a conformação e consequentemente a função dessas
biomoléculas. Por fim, ainda podem iniciar a oxidação de ácidos graxos
poliinsaturados que constituem os lipídeos de membranas celulares
(lipoperoxidação), ocasionando mudanças estruturais e funcionais. Além disso, o
produto final da lipoperoxidação, o malondialdeído (MDA) é mutagênico (SOSA et
al., 2013; VALKO et al., 2007). Devido a essa alta reatividade, os radicais livres, de
maneira direta ou indireta, estão relacionados a doenças neurodegenerativas como
mal de Parkinson, mal de Alzheimer, doença de Huntington e esclerose amiotrófica
lateral (MELO et al., 2011; UTTARA et al., 2009), além de ter correlações com
35
diabetes tipo 2, aterosclerose (ALFADDA et al., 2012; KANETO et al., 2010),
doenças inflamatórias, envelhecimento e câncer (SOSA et al., 2013). Vale ressaltar
que os radicais livres não promovem apenas malefícios, uma vez que participam de
importantes eventos de sinalização celular, formação de pontes dissulfeto durante o
dobramento de proteínas e na defesa contra microrganismos (SOSA et al., 2013;
VALKO et al., 2007).
A fonte mais comum de radicais livres nos organismos aeróbios é o oxigênio,
sendo as espécies geradas denominadas de ROS (em português, Espécies reativas
do oxigênio). As principais fontes fisiológicas de produção dos ROS incluem a
mitocôndria (Figura 09), o metabolismo do citocromo P450 e a ação da enzima
xantina oxidase. A ativação de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos é a principal
fonte de RNS (em português, Espécies reativas do nitrogênio). Estas espécies
reativas, assim como os ROS, também são geradas por situações não fisiológicas,
tais como, pela exposição da célula a agentes xenobióticos (fármacos, poluentes,
íons metálicos, dentre outros) ou pela exposição a radiações eletromagnéticas de
alta frequência, como a radiação ultravioleta, gama e os raios X (SOSA et al., 2013;
VALKO et al., 2006). Outras espécies derivadas do enxofre (RSS) e do cloro (RCS)
também podem ser geradas pelo metabolismo celular (SOSA et al., 2013).
Figura 09. Redução do oxigênio molecular (O2) na mitocôndria. As espécies reativas do oxigênio (ROS) formadas pela redução incompleta do O2 estão destacadas em vermelho. Fonte: Autoria própria.
Dentre os ROS gerados pela redução incompleta do oxigênio a água
encontra-se o ânion superóxido (O2•-). O superóxido é considerado um ROS primário
e não reage diretamente com proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e lipídeos
(VALKO et al., 2006). Entretanto, sob condições de estresse, um excesso de ânions
superóxido pode levar esse ânion reagir e liberar o ferro associado a algumas
proteínas. Condições como hemocromatose, talassemias e hemodiálise são outras
condições que promovem a liberação de ferro livre (VALKO et al., 2007). Os íons de
36
ferro livre (Fe+3) podem participar da reação de Fenton (Figura 10a) gerando radicais
hidroxila. Além disso, os íons superóxido ainda podem participar da reação de
Haber-Weiss (Figura 10b) potencializando a geração de radicais hidroxila (JOMOVA
et al., 2010).
Figura 10. Reações de produção de radicais hidroxila. (a) Reação de Fenton em duas etapas (b) Reação de Haber-Weiss. As espécies reativas do oxigênio (ROS) estão destacadas em vermelho. Fonte: Autoria própria.
O radical hidroxila (•OH) é a mais reativa e danosa das ROS. A sua principal
fonte de produção ocorre pela reação de Fenton (VALKO et al. 2006).
Os efeitos deletérios dos radicais livres são minimizados pela ação de
antioxidantes não-enzimáticos e enzimáticos (Figura 11) (SOSA et al., 2013; BARTZ
et al., 2010). Um antioxidante ideal deve ser capaz de sequestrar radicais livres,
quelar metais de transição, interagir com outros antioxidantes, ser prontamente
absolvido, ter uma concentração relevante em tecidos e biofluídos e trabalhar tanto
em soluções aquosas como em domínios de membrana celular. No entanto, os
antioxidantes existentes apresentam uma ou algumas destas características
(VALKO et al., 2007). Como exemplos de antioxidantes enzimáticos pode-se citar a
superóxido desmutase (SOD), a catalase (CATL) e a glutationa peroxidase (GPX).
Os não enzimáticos compreendem o ácido ascórbico (vitamina C), o α-tocoferol
(vitamina E), β-caroteno (vitamina A), antioxidantes tióis (glutationa, tioredoxina e
ácido lipóico), melatonina, dentre outros (BARTZ et al., 2010; KARLENIUS et al.,
2010; VALKO et al., 2007).
37
Figura 11. Mecanismos de ação de alguns antioxidantes endógenos. SOD: Superóxido dismutase; CATL: Catalase; GPX: Glutationa Peroxidase; GSH: Glutationa reduzida; GSSG: Glutationa oxidada; GRD: Glutationa redutase; NADPH: Nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato reduzida; NADP
+: Nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato oxidada; G6P: Glicose-6-fosfato; G6PD:
Glicose-6-fosfato desidrogenase; 6-P-gluconato: 6-fosfo Glutonato; Prx Red e Oxi: Peroxiredoxina oxidada e reduzida; Trx Red e Oxi: Tioredoxina oxidada e reduzida; TrxR: Tioredoxina redutase. Fonte: Autoria própria.
A indústria alimentícia faz uso de antioxidantes sintéticos como aditivos
alimentares para garantir um maior tempo de prateleira dos seus produtos (QI et al.,
2005a). Nesse grupo de antioxidantes destacam-se pelo amplo uso devido ao baixo
custo de produção o hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), tert-
butilhidroquinona (TBHQ), o galato propil (PG) e os ésteres de ácido gálico. A
utilização desses aditivos é altamente regulada devido ao perigo a saúde que os
mesmos apresentam (COSTA et al., 2014; WIJESEKARA et al., 2011). Danos
hepáticos e desenvolvimento da carcinogênese são alguns possíveis efeitos
adversos atribuídos ao BHA e o BHT (ITO et al., 1985; QI et al., 2005b).
Com base nesse contexto, tem se intensificado a busca por antioxidantes
naturais que possam ser utilizados na indústria alimentícia de forma segura, bem
como que venham a desempenhar uma proteção ao organismo, retardando e/ou
prevenindo a progressão de muitas doenças crônicas ou de efeitos do
envelhecimento. Dentre os compostos com potencial antioxidante, os
polissacarídeos sulfatados de algas marinhas vêm ganhando grande destaque nos
últimos anos (COSTA et al., 2014).
38
1.5.2 Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de algas
marinhas
O principal habitat das algas marinhas são as zonas intertidais, ambientes
adversos que estão sujeitos as variações da maré (CONTRERAS-PORCIA et al.,
2011). Desta forma, ao menos uma vez por dia as algas ficam submetidas a um
estresse ambiental rigoroso com mudanças bruscas de temperatura, exposição
intensa e direta de radiação ultravioleta, estresse osmótico e dessecação (BURRITT
et al., 2002). Alguns desses fatores favorecem a formação e o acúmulo de radicais
livres. No entanto, mesmo apresentando mais de 30% dos seus ácidos graxos sob a
forma poliinsaturada, as algas não apresentam danos oxidativos severos, nem
mesmo quando estocadas durante grandes períodos (ROCHA et al., 2007),
indicando que elas possuem mecanismos protetores mediados por enzimas e/ou
compostos antioxidantes não-enzimáticos (COSTA et al., 2014; CONTRERAS-
PORCIA et al., 2011).
Dentre os antioxidantes não enzimáticos de algas, os polissacarídeos
sulfatados têm ganhado destaque. Esses polímeros foram descritos pela primeira
vez como agentes antioxidantes por Xue e colaboradores no ano de 2001 (XUE et
al., 2001) e ao longo dos últimos 14 anos têm sido amplamente descritos como
potenciais agentes antioxidantes (COSTA et al., 2014; WIJESEKARA et al., 2011).
No entanto, ainda há poucos relatos sobre polissacarídeos de algas verdes com
potencial antioxidante.
Existem diversas metodologias para a avaliação do potencial antioxidante
exercido pelos polissacarídeos sulfatados de algas marinhas (BARAHONA et al.,
2011). Tais ensaios podem ser agrupados em quatro grupos de acordo com o
mecanismo de ação avaliado. Desta forma há ensaios que avaliam a habilidade
desses polímeros em reduzir moléculas reativas, os que determinam a capacidade
dos polissacarídeos em sequestrar radicais livres, os que analisam o potencial em
quelar íons metálicos e os que determinam a capacidade em reduzir ou inibir a
lipoperoxidação (COSTA et al., 2014). Ao analisar os dados disponíveis na literatura,
percebe-se que os polissacarídeos sulfatados de algas têm apresentado potencial
antioxidante em todos esses mecanismos de ação (COSTA et al., 2014).
Essa diversidade de mecanismo de ação está relacionada à variedade
estrutural desses polímeros. Desta forma, aspectos estruturais como grau e
39
distribuição de sulfatação, tipos de grupamentos ao longo do esqueleto
polissacarídico, massa molecular, composição monossacarídica e esterioquímica
influenciam no tipo e magnitude de efeito antioxidante exercido por esses polímeros
(NGO et al., 2013).
1.6 ATIVIDADE ANTIADIPOGÊNICA
1.6.1 Obesidade, adipócitos e tecido adiposo
A medicina preventiva considera a obesidade como uma importante doença,
uma vez que é um fator de risco primordial para um amplo espectro de distúrbios
cardiometabólicos, tais como dislipidemia, aterosclerose, hipertensão, diabetes
mellitus tipo 2 e doenças cardiovasculares (LAVIE et al., 2009; OUCHI et al., 2011).
Do ponto de vista clínico, a obesidade é definida com base no índice de massa
corpórea (IMC) do indivíduo. Desta forma, indivíduos com o IMC acima de 30 kg/m2
são considerados obesos, já se o índice estiver entre 25 e 30 kg/m2 considera-se
que ele está com sobrepeso (WHO, 2011).
Segundo dados recentes da Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se
que anualmente, 2,8 milhões de pessoas morram devido a problemas associados ao
sobrepeso e obesidade. Dados indicam que 35% da população adulta mundial se
encontra em sobrepeso e que a obesidade já afeta 7% de toda a população mundial.
Com relação à distribuição mundial, o sobrepeso e obesidade são maiores no
continente americano (62% com sobrepeso e 26% com obesidade) e menor no
Sudeste asiático (14% com sobrepeso e 3% com obesidade). Em relação à
prevalência nos gêneros, em todas as regiões, as mulheres são mais propensas à
obesidade do que os homens (WHO, 2011).
A obesidade está intimamente relacionada a mudanças no número de
adipócitos (hiperplasia) e no tamanho dessas células (hipertrofia) (SPALDING et al.,
2008). Apesar de muitas células conterem lipídeos esterificados, os adipócitos são
as únicas capazes de armazená-los em grande quantidade e liberá-los para outros
órgãos. Isto fez com que por décadas, o tecido adiposo fosse considerado apenas
uma massa inerte de reserva energética com algumas propriedades mecânicas de
suporte. Entretanto, a descoberta da leptina em 1994 mostrou que os adipócitos são,
40
também, reguladores essenciais da homeostase energética do corpo (ZHANG et al.,
1994; MANTZOROS et al., 2011). Atualmente sabe-se que diversas moléculas
fisiologicamente importantes, conhecidas por adipocinas, são secretadas pelos
adipócitos e regulam processos como a homeostase, pressão sanguínea, função
imune, processos inflamatórios, angiogênese e balanço energético (LAU et al., 2005;
BALISTRERI et al., 2010; OUCHI et al., 2011).
Um fator que influencia a expressão de moléculas secretadas pelos
adipócitos, inclusive adipocinas, é o tipo de tecido adiposo. Em humanos, assim
como em outros mamíferos, o tecido adiposo ocorre sob duas formas: tecido
adiposo branco (ou unilocular) e tecido adiposo marrom (ou multilocular). A maior
parte do tecido adiposo é do tipo branco e sua função é de ser local de
armazenamento energético e de produção de adipocinas. O tecido adiposo branco é
encontrado em dois grandes depósitos corporais: tecido adiposo visceral e tecido
adiposo subcutâneo (Figura 12). O tecido marrom ocorre principalmente em
neonatos e é importante na regulação da temperatura corpórea através da
termogênese. As principais células encontradas no tecido adiposo são os adipócitos,
mas há ocorrência de pré-adipócitos, células endoteliais, fibroblastos, leucócitos e
macrófagos, estando o número destas ultimas células relacionadas diretamente
relacionadas ao desenvolvimento da obesidade (TILG et al., 2006; OUCHI et al.,
2011; LEE et al., 2012).
Figura 12. Depósitos de tecido adiposo em humanos. Os dois principiais depósitos de tecido adiposo em humanos são o subcutâneo (principalmente nas regiões abdominal e glútea) e o visceral (associados com vários órgãos). Outros sítios comuns de depósito incluem as glândulas mamárias, regiões perirenal e periadventícia, coração, pulmões e medula óssea. Adaptado de CÂMARA et colaboradores, 2013.
41
A obesidade é acompanhada por um quadro de produção e secreção
exacerbada de adipocinas que também são fatores pró-inflamatórios, estando
muitos deles, como o TNF-α, a resistina, o PAI-1, a IL-6, a RBP-4 e a MCP-1,
diretamente relacionados à indução da resistência insulínica, a hipercoagulabilidade
e a aterogênese, que, por sua vez, culminam na elevação da pressão arterial
(hipertensão), na intensificação de estados inflamatórios crônicos e no aumento dos
riscos de ocorrência de eventos cardiovasculares e de acidentes tromboembólicos
gerados por rupturas de placas ateroscleróticas (LAU et al., 2005; OUCHI et al.,
2011).
1.6.2 Mecanismo de diferenciação adipocitária
Os adipócitos derivam de células-tronco mesenquimais e seu ciclo de vida
inclui mudanças em sua morfologia e na expansão clonal, e envolve uma complexa
cascata de expressão gênica que leva ao armazenamento de lipídeos e finalmente a
apoptose (FEVÈ, 2005; GREGOIRE 2001). A Figura 13 resume o mecanismo de
diferenciação adipocitária.
Figura 13. Diferenciação de adipócitos. Tipos celulares e eventos moleculares da diferenciação de células mesenquimais em adipócitos. Wnt (Via de sinalização constituída por proteínas envolvidas na
42
embriogênese); GATA (Família de fatores de transcrição caracterizados pela ligação a sequência “GATA” do DNA); δfosB (Membro da família de fatores de transcrição FOS); C/EBP-β, -α, - δ (Membros da família de proteínas de ligação potencializadora); PPAR-γ (Receptor ativado por proliferadores de peroxissoma); SREBP-1c (Elemento esterol responsivo a proteína de ligação 1c); Figura adaptada de FEVÈ, 2005.
O desenvolvimento de estudos sobre a adipogênese é realizado
principalmente pelo uso de modelos celulares como as linhagens murinas 3T3-L1 e
3T3-F442A (pré-adipócitos). Estas células quando estimuladas a se diferenciarem
em adipócitos seguem as mesmas vias metabólicas de diferenciação das células
mesenquimais (FARMER, 2006).
1.6.3 Atividade antiadipogênica de polissacarídeos sulfatados de algas
Com o intuito de tentar prevenir e/ou retardar os efeitos danosos gerados pelo
acúmulo excessivo de tecido adiposo, foram desenvolvidos diversos fármacos para
o tratamento da obesidade. No entanto, os compostos atualmente disponíveis
apresentam uma grande quantidade de efeitos indesejáveis (KUMAR et al., 2015), o
que tem intensificado a busca por fármacos anti-obesidade terapeuticamente
seguros. Várias plantas, extratos de plantas e fitoquímicos tem apresentado
propriedades anti-obesidade ou efeitos sobre o tecido adiposo e têm sido utilizados
como suplementos dietéticos (KANG et al., 2010).
Dentro desse contexto, muitos polissacarídeos sulfatados de algas
apresentam atividade anti-inflamatória e anticoagulante/antitrombótica, propriedades
desejadas em compostos que poderiam auxiliar no tratamento da obesidade e em
problemas associados à sua progressão. Se esses compostos apresentassem uma
atividade antiadipogênica e/ou antilipidêmica se tornariam moléculas multipotentes
com grande potencial para serem aplicados no tratamento da obesidade (JIAO et al.,
2011).
O primeiro relato de extratos de algas ricos em polissacarídeos sulfatados
com atividade antilipidêmica ocorreu em 2003 quando Pengzhan e colaboradores
descreveram dois extratos capazes de reduzir drasticamente os níveis séricos de
LDL e Triglicerídeos totais em ratos (PENGZHAN et al., 2003). Seis anos depois Kim
e colaboradores descreveram pela primeira vez a ação antiadipogênica de um
polissacarídeo sulfatado, um fucoidan obtido da alga marrom Fucus vesiculosos
(KIM et al., 2009). No entanto, apesar desses relatos há grande escassez na
43
literatura de polissacarídeos sulfatados com estes tipos de ação. Desta forma, quase
a totalidade das espécies de algas marinhas ainda não foram estudadas quanto a
sua capacidade sintetizadora de polissacarídeos sulfatados antiadipogênica.
1.7 ATIVIDADE IMUNOMODULATÓRIA
1.7.1 Imunomodulação mediada por macrófagos
O sistema imune desempenha um papel central na manutenção da
homeostase do corpo humano através de fatores inatos e adquiridos que o compõe.
O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra invasões microbianas, que
interagem com os patógenos de maneira não específica eliminando-os diretamente
ou destruindo células infectadas por eles. Esta função inata é realizada por células
fagocíticas (macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, dentre outras) e pelo
sistema complemento. Caso uma infecção não seja debelada pelo sistema inato,
entra em ação a imunidade adquirida que é constituída pelos linfócitos T, B e pelas
imunoglobulinas. No entanto, sob determinadas ocasiões o sistema imune pode
sofrer imunomodulações exacerbadas, resultando em efeitos indesejados que
levam, a longo prazo, ao aparecimento de doenças (JIAO et al., 2014). A
imunomodulação do sistema imune denota qualquer mudança na resposta imune
que envolva indução, expressão, amplificação ou inibição de parte ou de todo o
sistema imune (SAJOL et al., 2012).
Os macrófagos são células do sistema imune inato que tem importante papel
na manutenção da homeostasia, no processo de desenvolvimento embrionário,
durante o reparo tecidual e na imunidade (Figura 14). Ao se tornarem ativos, além
de serem células fagocíticas, secretam vários mediadores inflamatórios, incluindo
TNF-α, IL-1, PGE-2 e óxido nítrico, atuando na defesa contra microrganismos, tendo
papel central durante a inflamação. No entanto, suas funções reparativas,
inflamatórias e homeostáticas são subvertidas durante processos crônicos de
ativação, resultando em condições como fibrose, diabetes e obesidade ou de
supressão, resultando em quadros de infecção persistentes (WYNN et al., 2013).
44
Figura 14. Papel dos macrófagos no desenvolvimento, homeostase e doenças. Os macrófagos desempenham vários papéis durante o desenvolvimento, participando da modelação de vários tecidos, como cérebro, ossos e glândulas mamárias. A homeostase também é modulada por macrófagos e suas funções vai desde a participação no metabolismo até a manutenção da rede neuronal. Entretanto, estes papéis são subvertidos durante sua ativação exacerbada e contínua, contribuindo para o desenvolvimento de várias doenças. Adaptado de WYNN e colaboradores, 2013.
Assim, substâncias imunomoduladoras de macrófagos podem ser importantes
aliadas no combate a certas condições não desejadas resultantes de modificações
de seu perfil fisiológico.
1.7.2 Atividade imunomodulatória de polissacarídeos sulfatados de
algas
Os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas possuem atividades
imunomodulatórias que podem estar associadas com o estímulo da resposta imune,
algo importante para o tratamento de pacientes em estados de imunodepressão, ou
com o controle da atividade imune para mitigar efeitos negativos associados com a
inflamação (WIJESINGHE et al., 2012; JIAO et al., 2011).
Com base na literatura, é perceptível notar que o papel imunomodulatório de
polissacarídeos sulfatados de algas está relacionado principalmente com a
modulação de macrófagos (WANG et al., 2014; WIJESEKARA et al., 2011). Há
vários relatos de polissacarídeos capazes de aumentar a produção e secreção de
45
moléculas pró-inflamatórias pelos macrófagos como óxido nítrico (PÉREZ-RECALDE
et al., 2014; MAEDA et al., 2012; KARNJANAPRATUM et al., 2011; JIAO et al.,
2009; LEE et al., 2012), PGE-2 (KARNJANAPRATUM et al, 2011; KAEFFER et al.,
1999), IFN-γ (KIM et al., 2011) e IL-6 (LEE et al, 2010; KAEFFER et al., 1999). No
entanto, também já foram descritos polissacarídeos sulfatados capazes de aumentar
a secreção de moléculas anti-inflamatórias como a IL-10 (KAEFFER et al., 1999) ou
de reduzir a expressão de moléculas pró-inflamatórias como óxido nítrico, IL-1, IL-6,
MCP-1 e TNF-α (VASQUEZ et al., 2012). Assim, é perceptível o papel dual que os
polissacarídeos sulfatados de algas podem exercer sobre os macrófagos, indicando
uma versatilidade em seu uso no tratamento de condições pró ou anti-inflamatórias.
1.8 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA
1.8.1 Câncer
Câncer é o nome dado a um conjunto de mais de 100 tipos diferentes de
doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células anormais com
potencial invasivo (INCA, 2014). Atualmente, é a segunda maior causa de mortes no
mundo, inclusive no Brasil, ficando abaixo somente das doenças cardiovasculares
(WHO, 2011; INCA, 2014).
A origem do câncer se dá por condições multifatoriais como predisposições
genéticas, mutações, exposição demasiada a radicais livres, contato com
carcinógenos, exposição a radiações ionizantes e quadros inflamatórios
persistentes. Tais condições agem em conjunto para iniciar e/ou promover o
desenvolvimento do câncer ao longo de muitos anos (BOGO, 2012; HANAHAN et
al., 2011). Assim, alguns tipos de câncer podem ser evitados pela eliminação da
exposição a esses fatores determinantes. Além disso, se o potencial de malignidade
for detectado antes das células tornarem-se malignas, ou numa fase inicial da
doença, tem-se uma condição mais favorável para seu tratamento e,
consequentemente, para sua cura (INCA, 2014).
Os mecanismos que promovem o crescimento desordenado das células
cancerígenas e permitem a invasão tecidual por essas células ocorrem graças a
várias características que são inerentes a elas (Figura 15a e 15b).
46
Figura 15. Principais características das células cancerígenas. (a) – Seis principais características das células cancerígenas. A sinalização proliferativa sustentada ocorre pela secreção contínua de mitógenos que promovem o crescimento e divisão dessas células; A evasão de mecanismos de supressão celular pode ocorrer pela inativação de genes supressores de tumor ou pela perda de marcadores de superfície responsáveis pela inibição de crescimento por contato; A resistência a morte celular ocorre pela evasão aos mecanismos de apoptose; Os mecanismos replicativos de imortalidade, como a presença da telomerase, impedem que as células entrem em senescência; A indução da angiogênese ocorre pela ativação de genes responsáveis pela síntese de novos vasos, o que permite uma melhor nutrição e eliminação de metabólitos pelas células constituintes de tumores; por fim, os mecanismos de invasão e metástase também caracterizam as células cancerígenas e normalmente ocorre pela perda de algumas moléculas de adesão como a E-caderina. (b) – Características emergentes de células cancerígenas e alguns fatores promotores. Dois importantes fatores promotores estão envolvidos no desenvolvimento dessas características carcinogênicas: a instabilidade genética, que promove o surgimento de mutações e estados recorrentes de inflamação gerados por células do sistema imune. Outras duas características de células cancerígenas são a capacidade de reprogramar seu metabolismo celular, como por exemplo, ao aumentar a expressão de transportadores de glicose do tipo GLUT para aumentar a captação de glicose; e a fuga do sistema imune. Figura adaptada de HANAHAN e colaboradores, 2011.
As principais terapias escolhidas para o tratamento do câncer são a
radioterapia e a quimioterapia. No entanto, ambas apresentam uma série de efeitos
adversos como imunossupressão, diarreia, náuseas, vômitos, perda de apetite,
perda de peso, fadiga, anemia e trombocitopenia (MAIER, 2012; ROCHA et al.,
2011).
Tendo em vista a alta prevalência de câncer e as dificuldades em seu
tratamento, é cada vez mais crescente o incentivo para pesquisas que visem a
descobertas de novos agentes antitumorais eficazes e com menor toxicidade ou
prejuízos à saúde dos pacientes.
1.8.2 Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de algas
Os polissacarídeos sulfatados de algas apresentam características
promissoras para seu uso como agentes antitumorais, uma vez que apresentam
47
mecanismos de ação que podem ajudar na prevenção e no controle do câncer, bem
como na contenção da metástase (ATASHRAZM et al., 2015; KWAK, 2014; ROCHA
et al., 2011).
Com relação aos mecanismos preventivos, os polissacarídeos sulfatados de
algas já foram descritos como agentes antioxidantes (COSTA et al., 2014) e anti-
inflamatórios (VASQUEZ et al., 2012; HWANG et al., 2011) podendo prevenir desta
forma, condições ou ambientes favoráveis para o desenvolvimento do câncer, como
o stress oxidativo e quadros inflamatórios exacerbados (HANAHAN et al., 2011).
A progressão do câncer pode ser contida de forma indireta ou direta. Alguns
polissacarídeos já foram descritos como agentes anti-angiogênicos (DORE et al.,
2013; WANG et al., 2013), impedindo desta forma a neovascularização de tecidos
tumorais e a progressão do câncer de uma forma indireta. Outra forma indireta de
contenção seria através da imunoestimulação exercida por polissacarídeos
sulfatados por promoverem a ativação de células como macrófagos, neutrófilos,
linfócitos T e NK, células que podem agir no controle de células cancerígenas (LINS
et al., 2009; ZHOU et al., 2004). No entanto, os principais mecanismos de controle
de células cancerígenas residem na capacidade dos polissacarídeos em agir de
forma direta sobre as mesmas, inibindo sua proliferação e induzindo a apoptose ou
autofagia (PARK et al., 2011; SENTHILKUMAR et al., 2013; KWAK, 2014). Desta
forma, a atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados, em especial de
algas marrons, tem sido intensamente investigada para as mais diversas linhagens
tumorais (Tabela 02).
Tabela 02. Alguns estudos que demonstraram atividades antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de algas. Fonte: Autoria própria.
LINHAGEM TUMORAL
TECIDO
ALGA
REFERÊNCIA
A549 Carcinoma de pulmão Undaria pinnatifida SYNYTSYA et al.,
2010
AGS Carcinoma gástrico Laminaria japonica PARK et al., 2011
DLD-1 Adenocarcinoma
coloretal
Sargassum
mcclurei
THINH et al., 2013
HeLa Adenocarcinoma de
cérvix
Sargassum
fillipendula
COSTA et al., 2011
48
HepG2 Carcinoma hepática Undaria pinnatifida SYNYTSYA et al.,
2010
HL-60 Leucemia promielocítica Fucus vesiculosos JIN et al., 2010
HS-Sultan Linfoma de Burkitt Fucus vesiculosos AISA et al., 2005
MCF-7 Carcinoma de mama Cladosiphon
novae-caledoniae
ZHANG et al.,
2011
PC-3 Adenocarcinoma de
próstata
Undaria pinnatifida BOO et al., 2011
SK-MEL-28 Melanoma Costaria costata ERMAKOVA et al.,
2011
SMMC-7721 Carcinoma hepático Undaria pinnatifida YANG et al., 2013
U-937 Leucemia monocítica Ecklonia cava ATHUKORALA et
al., 2009
Por fim, a capacidade antimetastática desses polímeros também já foi
relatada, e parece estar ligada a capacidade dos polissacarídeos em bloquear as
interações entre as células cancerígenas e a membrana basal tecidual (ROCHA et
al., 2001; CUMASHI et al., 2007), além de promover a inibição de metaloproteinases
(YE et al., 2005) e heparinases (VLODAVSKY, 2001), enzimas relacionadas a
invasão tecidual exercida por células tumorais.
1.9 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
1.9.1 Leishmaniose e atividade leishmanicida de polissacarídeos
sulfatados de algas.
A leishmaniose é uma doença infecciosa de grande importância ao redor do
mundo, sendo responsável por 70 mil mortes por ano, além de ser fator de risco
para 350 milhões de pessoas em 88 países (TODOLI et al., 2012; KEDZIERSK,
2010). Esses números fazem da leishmaniose a segunda doença parasitária tropical
de maior mortalidade no mundo, ficando atrás apenas da malária (TODOLI et al.,
2012). No Brasil, tem-se constatado uma expansão das áreas endêmicas para a
leishmaniose, além do surgimento de surtos epidemiológicos em regiões antes
consideradas livres dessa doença (PEREIRA, 2012).
49
A leishmaniose é causada por protozoários pertencentes ao gênero
Leishmania, que compreende dois subgêneros, nos quais se distribuem uma grande
variedade de espécies responsáveis por infectar animais e humanos, através de
inoculações por mosquitos vetores, levando ao desenvolvimento da leishmaniose
cutânea, muco-cutânea e visceral, essa última conhecida também por Calazar
(KAYE et al, 2011; SINGH et al., 2012). O tratamento dessa infecção se dá
principalmente por antimoniais pentavalentes e, como uma segunda linha de
tratamento, pela anfotericina B, no entanto o tratamento com estes fármacos é
prolongado e de alto custo, além disso, eles apresentam alta toxicidade, vários
efeitos adversos, e já há cepas resistentes aos mesmos (YAMAMOTO et al, 2013;
TODOLI et al., 2012; SINGH, 2012).
Dentro desse contexto, a busca por compostos ativos, que possam dar
origem a novos medicamentos leishmanicidas mais seguros e eficazes apresenta-se
como uma necessidade urgente, principalmente, para pessoas em países em
desenvolvimento (SINGH et al., 2012) e as algas têm sido fontes promissoras de
compostos com este tipo de atividade (TORRES et al., 2014; FOULADVAND et al.,
2011; SOARES et al., 2012), apesar de haver apenas um único relato, de
polissacarídeos sulfatados com este tipo de atividade (PIRES et al., 2013b).
1.9.2 Infecções bacterianas e atividade antibiótica de polissacarídeos
sulfatados de algas.
O uso irracional e a automedicação têm contribuído para o desenvolvimento,
ao longo dos anos, de resistência microbiana a diversos antibióticos, o que tem
trazido novos desafios à terapêutica e elevado cada vez mais o número de mortes
causadas por bactérias (WHO, 2014; QUEIROZ et al., 2012). Dentro do grupo de
organismos relacionados ao desenvolvimento de infecções resistentes pode-se
destacar o Staphylococcus epidermidis e Klebsiella pneumoniae. Ambos são
microrganismos multirresistentes causadores de patogenias e infecções hospitalares
(QUEIROZ et al., 2012).
S. epidermidis é uma das bactérias encontradas naturalmente na microbiota
da pele de indivíduos e podem se introduzir na unidade de tratamento intensivo
pelos profissionais da saúde ou por pacientes, e assim causar infecções
oportunistas durante e após os procedimentos invasivos (CABRERA-CONTRERAS
50
et al., 2013; OTTO, 2009; MICHELIM et al., 2005). S. epidermidis é um dos
principais formadores de biofilmes em cateteres e já foram descritas cepas
resistentes a vários antibióticos como meticilina, rifamicina, fluoroquinolonas,
gentamicina, tetraciclina, cloranfenicol, eritromicina, clindamicina e sulfonamidas
(OTTO, 2009; MICHELIM et al., 2009).
A bactéria gram-negativa K. pneumoniae resistente a carbapenêmicos (KPC)
é uma ameaça em todo o mundo, uma vez que há opções terapêuticas limitadas
contra este patógeno, o que tem resultado em infecções de alta mortalidade
(GUPTA et al., 2011; KAISER et al., 2013). Os carbapenêmicos foram desenvolvidos
como a última linha de defesa contra infecções por microrganismos multirresistentes.
Contrariando esta ideia, um isolado de Klebsiella pneumoniae produzindo uma
carbapenemase (KPC) foi descrita pela primeira vez 2001, nos Estados Unidos e
atualmente tem sido responsável por surtos nosocomiais em todo o mundo. As
KPCs não são só resistentes a todos os β-lactâmicos, mas também a
aminoglicosídeos e fluoroquinolonas, além disso, estudos demonstraram que a sua
taxa de mortalidade se aproxima de 50%, representado, portanto, um grande desafio
para a terapia clínica atual (QUEIROZ et al., 2012).
Com isso, tem se intensificado a busca por novos compostos que visem à
contenção dessas bactérias multirresistentes aos tratamentos convencionais, e os
polissacarídeos sulfatados vêm sendo descritos como importantes moléculas com
potencial antibiótico (SEBAALY et al., 2014; LI et al., 2010; MARUDHUPANDI et al.,
2013; VIJAYABASKAR et al., 2013; AMORIM et al., 2012; PIERRE et al., 2011;
KANTACHUMPOO et al., 2010).
1.10 INIBIÇÃO DA FORMAÇÃO DE CRISTAIS
1.10.1 Urolitíase
A urolitíase ou cálculo renal, conhecida popularmente como pedra renal, é
uma condição fisiopatológica decorrente da formação e aglomeração de cristais
inorgânicos e orgânicos, que ocorre dentro dos canalículos renais. O
desenvolvimento dessa doença está relacionado a diversas causas, como: herança
genética, estilo de vida, clima, hábitos alimentares, obesidade, dentre outros (WONG
et al., 2015; XU et al., 2013; MOE, 2006).
O considerável aumento da sua prevalência no mundo nos últimos 20 anos
51
tem preocupado (XU et al., 2013), e tem sido atribuído as mudanças do estilo de
vida e de hábitos alimentares (KNOLL, 2010), tais como o aumento do consumo de
proteínas de origem animal e alimentos ricos em cálcio e sódio (LOPÉS et al., 2010;
ROMERO et al., 2010).
Os cálculos renais surgem tipicamente entre os 20 e 60 anos de idade e tem
uma altíssima taxa de recorrência após a primeira crise renal do paciente (WONG et
al., 2015; MOE, 2006). Ocorre em maior prevalência em homens, porém, em países
desenvolvidos tem se notado uma rápida diminuição da diferença de ocorrência
entre os gêneros (MEHMET et al., 2015; DAWSON, 2012; MOE, 2006). A incidência
também é maior em países de clima quente, sobretudo no verão devido a diminuição
do débito urinário associado a redução da ingestão de líquidos (LOPÉS et al, 2010;
ROMERO et al., 2010; MOE, 2006). Do ponto de vista geográfico, há uma maior
prevalência de casos no hemisfério oeste frente ao hemisfério leste (LOPÉS et al.,
2010).
Os cálculos de oxalato de cálcio (CaOx) são os mais prevalentes, somando
aproximadamente 70% dos casos, com um pequeno percentual restrito aos de
fosfato de cálcio (10%). Em menor proporção estão os de ácido úrico (5-10%),
seguidos dos de cistina, estruvita e urato de amônio (DAUDON et al., 2015;
DAWSON, 2012; LÓPEZ et al., 2010). A urina, em condições normais, possui
moléculas tais como, citrato, pirofosfato, glicosaminoglicanos e glicoproteínas, que
inibem a formação desses cristais (LI et al., 2013). No entanto, quando a quantidade
destas moléculas é insuficiente, tem-se início a formação dos cálculos renais, que
ocorre em uma série de eventos físico-químicos complexos subdivididos em quatro
fases principais: nucleação, crescimento (cristalização), agregação e retenção do
cristal (Figura 16) (BASARAVAJ et al., 2007; JÚNIOR et al., 2010).
52
Figura 16. Etapas da formação dos cristais urinários. Fonte: JÚNIOR, et al., 2010.
A nucleação ocorre com o desenvolvimento de uma estrutura nanocristalina
formada quando determinado soluto supera o seu coeficiente de solubilidade,
tornando a solução supersaturada. O processo de nucleação em uma solução pura
é conhecido como nucleação homogênea, no entanto, na urina o que ocorre é uma
nucleação heterogênea na superfície de células epiteliais, hemácias, debris
celulares, outros cristais e bactérias (BASARAVAJ et al., 2007).
Concomitantemente a nucleação, ocorre o processo de cristalização ou
crescimento do cristal gerado pela redução da energia potencial de átomos e
moléculas quando estes formam ligações químicas entre si (BASARAVAJ et al.,
2007). Enquanto a nucleação de cristais é um processo muito lento em produzir
partículas de tamanhos clinicamente relevantes, o passo seguinte, a agregação,
permite a formação de grandes partículas de uma forma muito mais rápida
(BASARAVAJ et al., 2007; HESS et al., 2000).
A agregação consiste na união de um ou mais destes núcleos em
crescimento, que resulta na formação de cristais maiores e mais pesados que
podem se precipitar (FERNADES-QUEIROZ et al., 2015). A urina de um paciente
saudável possui naturalmente cristais de tamanhos irrelevantes para o
desenvolvimento de condições fisiopatológicas, e estes são naturalmente
excretados. No entanto, alguns cristais podem interagir com a superfície de células
epiteliais renais, o que ocasionará sua retenção, promovendo uma cascata de
respostas celulares, como o estresse oxidativo, além de aumentar a adesão de
cristais e substâncias adicionais que, por fim, darão origem aos cálculos renais
(BASARAVAJ et al., 2007; FONG-NGERN et al., 2011).
53
O oxalato de cálcio pode se cristalizar em três formas diferentes. O cristal
monohidratado (COM) apresenta uma geometria de prisma tetragonal alongada, já o
dihidratado (COD) possui uma geometria bipiramidal tetraédrica ou em forma de
cata-vento, o trihidratado (COT), por sua vez, possuem geometria mais complexa
(Figura 17) (GRASES et al., 1990; MELO et al., 2013; FERNANDES-QUEIROZ et
al., 2015). A forma monohidratada é a mais termodinamicamente estável e é a que,
predominantemente, constitui os cálculos renais. A forma dihidratada também pode
ser encontrada na constituição dos cálculos, mas são as principais formas de cristais
de oxalato de cálcio encontrados isoladamente na urina (WANG et al., 2010; MELO
et al., 2013). Vale ressaltar, que os cristais do tipo COM são considerados os mais
danosos, uma vez que são capazes de se aderirem as células epiteliais renais,
favorecendo a formação dos cálculos renais (WANG et al., 2010; LI et al., 2013;
WESSON et al., 1998).
Figura 17 - Imagens de microscopia eletrônica de varredura de Cristais de Oxalato de Cálcio. (A e B) Monohidratado; (C e D) Dihidratado; (E e F) Trihidratado Fonte: Adaptado de GRASES et al., 1989.
54
Os cristais COM apresentam três faces de crescimento (fig. 18A-B). Face
(101), (010) e (120). O crescimento desses cristais ocorre a partir da deposição
gradual de íons formando camadas, esse crescimento não é homogêneo, e ao se
observar em escala nanométrica verifica-se que essas camadas não se sobrepõem
totalmente, levando a formação de degraus e terraços a cada camada sobreposta
(fig. 18C-D) (QIU et. al., 2004).
Figura 18 – Faces dos cristais do tipo COM. COM observado em microscopia de varredura (a). Diagrama das faces dos cristais de CaOx (b). Visão da face (101) em microscopia de força atômica (c). Visão da face (010) em microscopia de força atômica (d). Fonte: Adaptado de QIU et al., 2004.
As primeiras observações do processo de formação dos cálculos renais
datam de 1937, quando Randall propôs que os cálculos renais se desenvolviam
sobre dois tipos de lesões pré-calculares situadas na papila renal (RANDALL, 1937;
KHAN et al., 2015). Tais lesões eram geradas por deposição subepitelial de fosfato
de cálcio (CaP), decorrente de condições patológicas na papila renal, formando
lesões pré-calculares do tipo I denominadas de placas de Randall, e em casos de
supersaturação urinária e necrose de células epiteliais tubulares, ocorreria a
cristalização e deposição nos túbulos coletores formando lesões tipo II denominadas
de “plugs” de Randall. Em ambos os casos, as lesões agiriam como um “ninho” para
deposição de outros cristais, resultando na formação de cálculos na pelve renal ou
nos ductos papilares, respectivamente (RANDAL, 1940; KHAN et al., 2015).
Atualmente, sabe-se que essas placas são formadas desde a medula interna, na
55
membrana basal do ramo delgado da alça de Henle, até a membrana basal do
urotélio papilar (EVAN et al., 2010; JAMESON et al., 2013).
Desde a descrição das placas de Randall, que inúmeras hipóteses sobre a
gênese da formação dos cálculos renais têm sido elaboradas, no entanto a relação
entre o estresse oxidativo e os cálculos renais parece estar bem clara (KHAN et al.,
2015; WONG et al., 2015; SELVAN, 2002). Selvan em 2002, propôs uma hipótese
sugerindo que alterações ou danos nas camadas superficiais protetoras do epitélio
renal, ocasionados por eventos oxidativos ou por danos físicos diretos ao epitélio
gerados por cristais formados em locais à montante nos túbulos renais, poderiam
expor diversas substâncias eletronegativas na superfície celular, que possuiriam alta
afinidade à cristais de oxalato de cálcio do tipo COM, que apresentam uma
superfície eletropositiva. Além disso, os cristais de oxalato de cálcio ainda poderiam
ser endocitados, provocando um estresse oxidativo ainda maior (Figura 19).
Figura 19. Modelo hipotético da representação da deposição/internalização do cristal de oxalato de cálcio nas células renais por endocitose e processo intracelular por oxalúria durante condições hiperoxalúricas. Os cristais formados se precipitam sobre a superfície celular ligam-se rapidamente à superfície de células epiteliais e são internalizados. Cristais monohidratados são prontamente reconhecidos e endocitados, ao passo que o dihidratado se liga fracamente a superfície celular e não é endocitado. Fonte: Adaptado de SELVAN,2002.
56
Por outro lado, com base em dados clínicos e experimentais recentes, Khan e
colaboradores propuseram uma teoria “unificada” para a formação das placas de
Randall (KHAN et al., 2015; WONG et al., 2015). Segundo os autores, a formação
dessas placas e “plugs” tem início quando células epiteliais renais, de formadores de
cálculos, são submetidas a condições de estresse oxidativo quando expostas a
excreção elevada de cálcio, fosfato e oxalato e/ou pelo decréscimo da produção de
inibidores de formação de cristais, como o citrato, ou ainda quando sofrem injúrias,
traumas ou simplesmente envelhecem (KHAN et al., 2015).
Esse estresse oxidativo leva a um aumento da expressão de genes e
proteínas específicas de células osteoblásticas, levando a uma de-diferenciação das
células epiteliais renais em células tipo-osteoblásticas. Essas células transformadas
produzem vesículas ligadas à membrana em forma de brotos, em direção à
membrana basal do tecido. Após a formação dessas vesículas ocorre a nucleação e
agregação de cristais de fosfato de cálcio (CaP) em suas superfícies, e esses
depósitos começam a formar grandes placas que ultrapassam a membrana basal.
Essas placas entram em contato com fibras de colágeno e restos necróticos de
membrana que também calcificam.
A deposição intersticial desses cristais acaba por gerar fibrose e inflamação
localizada, que disponibilizam ainda mais substratos para que ocorram novas
calcificações, até que, finalmente, se alcança a superfície do epitélio papilar. Uma
vez que a superfície epitelial papilar perde sua integridade, pelo aumento de
atividade de metaloproteinases de matriz ou simplesmente pela força física causada
pelo aumento da calcificação subepitelial, a placa de Randall é exposta na pelve
renal.
A pelve renal apresenta grandes concentrações de CaOx, fazendo com que
as camadas superficiais de hidroxipatita (cristais de fosfato de cálcio) sejam
substituídas por CaOx, através da desmineralização de CaP e mineralização de
CaOx. Alternativamente, a nucleação de cristais de CaOx ocorre diretamente sobre
a matriz orgânica que cobre a placa e cada vez mais o cálculo vai aumentando de
tamanho e se tornando preponderantemente constituído de CaOx (KHAN et al.,
2015). Dados de estudos endoscópicos e histológicos reforçam essa hipótese, uma
vez que a maior parte dos cálculos de oxalato de cálcio (75%), em pacientes
formadores de cálculos de oxalato de cálcio idiopáticos, é formada em associação
às placas de Randall (WONG et al., 2015; EVAN et al., 2010).
57
Uma alternativa para conter os danos oxidativos ocasionados por esta
cascata de eventos relacionados à formação dos cristais de oxalato de cálcio seria o
aumento da produção e/ou atividade de agentes antioxidantes. No entanto, os
resultados de estudos em ratos, que foram induzidos a formarem cálculos renais de
oxalato de cálcio, mostraram que há uma diminuição local das atividades das
enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase
(GPx), glucose-6-fosfato desidrogenase, glutationa-S-transferase, bem como
diminuição dos níveis de sequestradores de radicais livres como a vitamina E,
vitamina C, proteína tiol (TSH) e glutationa reduzida (GSH) (SELVAN, 2002).
Com isso, percebe-se que o processo de formação das placas de Randall é
um processo multifatorial e que há diversas formas de se conter o seu surgimento.
Tendo isso em mente, Abrol e colaboradores, propuseram recentemente um
esquema que ilustra essas novas informações acerca da complexidade do
desenvolvimento das placas de Randall (Figura 20).
Figura 20. Hipótese da patogênese das placas de Randall. Os quadrados amarelos representam condições predisponentes. LDL – Lipoproteína de baixa densidade; EROS – Espécies reativas de oxigênio; CaOX – Oxalato de cálcio. Fonte: Adaptado de ABROL et al., 2014.
58
1.10.2 Atividade antiurolítica de polissacarídeos sulfatados
Recentemente, os polissacarídeos sulfatados de algas também começaram a
ser avaliados quanto a sua capacidade antiurolítica. Estudos in vitro, demonstraram
que polissacarídeos da Laminaria japonica além de diminuir o tamanho dos cristais
COM também estabilizaram o tipo COD, os quais não podem se ligar a membrana
celular (OUYANG et al., 2010). Outro polissacarídeo obtido a partir da alga marrom
Sargassum graminifolia também se mostrou eficiente no processo da inibição da
cristalização de CaOx (ZHANG et al., 2012). Recentemente, nosso grupo de
trabalho, demonstrou que polissacarídeos sulfatados da alga Dictyopteris justii
também são capazes de inibir a formação de cristais de oxalato de cálcio, com
especial menção a fucana DJ-0.4 e a glucana DJ-0.5, essa última sendo capaz de
estabilizar os cristais de oxalato de cálcio sob a forma COD, prevenindo a formação
dos cristais do tipo COM mais termodinamicamente estáveis e danosos (MELO et
al., 2013).
Estudos in vivo com suplementação exógena de polissacarídeos sulfatados
para ratos hiperoxalúricos de Fucus vesiculosus foram eficazes na redução do
estresse oxidativo causado pelo processo de cristalização, aumentando a atividade
de enzimas antioxidantes como SOD, CAT, GPX e limitando a peroxidação lipídica.
Além disso, os polissacarídeos sulfatados foram capazes de evitar a retenção de
cristais, por evitar o dano da membrana induzida por cristais de oxalato de cálcio
(VEENA et al., 2007).
Até o momento, no entanto, nenhum polissacarídeo sulfatado de alga verde
teve a sua capacidade de inibição de formação de cristais avaliada.
Diante do exposto, e tendo em mente que o litoral potiguar, assim como o
nordestino, detêm várias espécies de algas marinhas que ainda não tiveram seus
polissacarídeos sulfatados estudados, este trabalho teve como objetivo realizar uma
prospecção de atividades farmacológicas de frações polissacarídicas obtidas da alga
verde Caulerpa prolifera. Para obtenção desse objetivo, pretendeu-se:
Obter frações ricas em polissacarídeos sulfatados a partir de C. prolifera;
Caracterizar físico-quimicamente os polissacarídeos sulfatados obtidos;
Avaliar a atividade anticoagulante das frações;
Avaliar a atividade antioxidante das frações;
59
Avaliar a atividade imunomodulatória das frações;
Avaliar a atividade antiadipogênica das frações;
Avaliar a atividade antiproliferativa das frações;
Avaliar a atividade microbicida (leishmanicida e bactericida) das frações;
Avaliar a influência das frações sobre a formação de cristais de oxalato de
cálcio.
60
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 REAGENTES
Acetona, ácido acético, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, álcool etílico, álcool
metílico, azul de toluidina, brometo de cetiltrimetilamônio P.A. (CETAVLON),
citrato de sódio, cloreto de bário, coomasie brilliant blue R 250, fosfato de sódio
dibásico, fosfato de sódio monobásico, glicina, hidróxido de sódio, peróxido de
hidrogênio e sulfato de ferro heptahidratado foram adquiridos da CRQ (Diadema,
SP, Brasil);
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) proveniente da VETEC (Duque de
Caxias, RJ, Brasil);
Metionina proveniente da Synth (Diadema, SP, Brasil);
Ácido gálico adquirido da CAQ Casa da Química Ind. e Com. (Diadema, SP,
Brasil);
Bacto-Getatina adquirido da Difco Laboratories (Detroit, MI, USA).
Ácido ascórbico, cloreto de sódio, 1,3-diaminopropano acetato, ferrozina,
nitroblue tetrazolium (NBT), riboflavina, L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-
manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose e ácido D-glucurônico foram
comprados da Sigma-Aldrich Brasil (São Paulo, SP, Brasil);
Agarose (Standart Low-MR) proveniente da BioRad Laboratories (Richmond, CA,
EUA);
Cloreto de ferro adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha);
Fenol, molibdato de amônia, sulfato de cobre, sulfato de potássio e sulfato de
sódio anidro adquiridos da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio de
Janeiro, RJ, Brasil);
Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada e kit de tempo de protrombina
provenientes da Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil);
Prozima (preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750)
adquirida da Prozyn Biosolutions, São Paulo, SP, Brasil;
Salicilato de sódio adquirido da FLUKA (Steinheim, Germany);
Reagente de Bradford da Bio-Rad (NY, EUA)
Reagente de Folin-Ciocalteau da Merck (Darmstadt, Alemanha)
61
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI e Soro Fetal Bovino (SFB) da
Cultilab (Campinas, SP, Brasil);
DMEM High glucose da Gibco (Carlsbad, CA, USA);
2.2 APARELHOS
Agitador orbital modelo 255-B, banhos-maria e estufas de temperatura constante
da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
Cuba para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e
col. (1968), da Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltd. (Tóquio, Japão);
Fontes de corrente contínua regulável desenvolvida pelo Dr. H. Rzeppa, Técnica
Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
Espectrofotômetro Femto 700 plus, Femto Ind. Com. Instrumentos Ltda. (São
Paulo, SP, Brasil);
Medidor de pH Orion Research, modelo 701 A/digital lonalyzer (Cambridge, MA,
EUA);
Coagulômetro automático Quick Timer da DRAKE eletrônica e comércio LTDA
(São José do Rio Preto, SP, Brasil);
Bomba a vácuo da TECNAL modelo TE-058 (Piracicaba, SP, Brasil).
Sistema de HPLC, Merck (Richmond, CA, EUA) com coluna LiChroCART® 250-4
LiChrospher® 100 NH2 (10 μm) acoplada.
Bancada de Fluxo Laminar Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil);
Banhos e estufas de temperatura controlável da FANEM Ltda (São Paulo, SP,
Brasil);
Zetaplus® analyzer, (Brookhaven instruments, Holtsville, NY, USA);
Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
Espectrofotômetro digital DR5000 UV/VIS da Hach Company® (Loveland,
Colorado, EUA);
Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110
(USA);
Leitor de microplacas Epoch-Biotek (Winooski, VT, EUA)
Microscópio NIKON Eclipse Ti-U (Melville, NY, EUA);
62
Microscópio Confocal Zeiss LSM 700 (Oberkochen, Alemanha)
Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,
EUA);
Espectrometro Thermo-Nicolet Nexus 470 pesetas.
2.3 ALGAS
Espécimes da alga marinha verde Caulerpa prolifera (Forsskål)
J.V.Lamouroux (Figura 21) foram coletados na Praia de Búzios (05°58′23″S,
35°04′97″O), situada no município de Nísia Floresta, litoral sul do estado do Rio
Grande do Norte, Brasil, em períodos de baixas marés de sizígia (entre 0,0 e 0,2
metros). Os espécimes foram prontamente levados ao Laboratório de Biotecnologia
de Polímeros Naturais (BIOPOL/UFRN), onde foram lavados em água corrente e
separados de epífitas, pequenos moluscos, inclusões calcárias e outros
contaminantes. Posteriormente, foram desidratadas em estufa aerada a 45 ºC,
trituradas, pesadas e guardadas em recipientes adequados.
Figura 21. Imagem da alga verde Caulerpa prolifera. Fonte:
http://www.marineaquariumsa.com/biological-natural-filtration/42272-caulerpa-prolifera.html
63
2.4 OBTENÇÃO DE FRAÇÕES RICAS EM POLISSACARÍDEOS
SULFATADOS DA MACROALGA VERDE CAULERPA PROLIFERA.
2.4.1 Despigmentação, delipidação e obtenção do pó cetônico
As algas secas e trituradas foram submetidas à despigmentação e
delipidação por meio da adição de 2 volumes de acetona PA, à temperatura
ambiente por um período de cerca de 12 horas. A fim de otimizar a
descontaminação por estes componentes (pigmentos e lipídeos) o processo foi
repetido 2 vezes. A acetona foi decantada e descartada e o resíduo foi levado para
secagem, à temperatura ambiente, sob aeração. A massa resultante de cada alga foi
denominada, por convenção, de pó cetônico.
2.4.2 Proteólise
Com o intuito de liberar os carboidratos que estavam ligados ou associados a
proteínas da matriz extracelular, ou de outras estruturas, fez-se uso de uma mistura
proteases alcalinas comercial (Prozima). Para isso foram adicionados ao pó
cetônico, dois volumes de NaCl a 0,25 M, e o pH foi ajustado para 8,0 com NaOH. A
Prozima foi então adicionada na proporção de 15 mg/g de pó cetônico. Os
recipientes contendo essas suspensões foram levados ao banho-maria (60 ºC) onde
permaneceram por 12 horas. Em seguida, os materiais foram centrifugados a 10.000
x g por 15 minutos à temperatura de 4 ºC. Após a centrifugação, realizou-se uma
filtração, desprezando-se o precipitado e armazenando-se o sobrenadante, onde
estavam presentes os polissacarídeos solúveis.
2.4.3 Fracionamento
Ao sobrenadante obtido após a centrifugação do material proteolisado,
acrescentou-se volumes crescentes de acetona segundo metodologia descrita
anteriormente por Rocha e colaborabores (ROCHA et al., 2001), sendo as frações
obtidas denominadas conforme o volume de acetona com o qual essas foram
precipitadas (CP-0.3, CP-0.5, CP-0.7, CP-0.9, CP-1.1, CP-1.5 e CP-2.0) (Figura 22).
64
Figura 22. Representação esquemática do procedimento de obtenção das frações ricas em polissacarídeos sulfatados extraídos da alga verde Caulerpa prolifera.
65
2.5 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS
EXTRAÍDOS
2.5.1 Eletroforese em gel de agarose a 0,6 %
Com o objetivo de identificar a presença de polissacarídeos sulfatados, bem
como identificar as diferentes populações desses presentes nas frações obtidas, as
amostras foram submetidas a uma corrida eletroforética como descrito abaixo
(DIETRICH; DIETRICH, 1976).
O gel de agarose foi preparado na concentração de 0,6% em tampão 1,3 -
diaminopropano acetato (PDA) e colocado sob lâminas de vidro (5,0 cm x 7,5 cm x
1,5 mm). Cinco microlitros de cada fração na concentração de 10 μg/μL, foram
aplicados em poços no gel e submetidos à corrida eletroforética (100 V/cm por 1
hora) em tampão PDA pH 9,0, dentro de uma cuba refrigerada a 4 ºC, partindo do
polo negativo. Em um dos poços do gel foram aplicados 5 μL vermelho de Cresol,
corante que serviu de padrão de referência para a corrida. Em seguida, os
polissacarídeos foram precipitados com brometo de cetiltrimetilamônio 0,1 %
(CETAVLON) por um período de no mínimo 2 horas à temperatura ambiente.
Posteriormente, o gel foi submetido a uma corrente de ar quente desidratado e então
corado com uma solução de azul de toluidina 0,6%. O excesso de corante foi
removido por uma solução de ácido acético 1% e etanol 49% em água (solução
descorante). Após a remoção do excesso de corante, a lâmina foi seca à
temperatura ambiente e analisada.
2.5.2 Dosagem de açúcares totais
Os açúcares totais foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico
(DUBOIS et al., 1956). O teor de açúcares existente em cada fração foi calculado
por espectrofotometria a 490 nm se fazendo uso de uma curva padrão construída a
partir de uma solução de D-galactose (10 μg/μL) em um intervalo de 0 a 100 μg.
2.5.3 Dosagem de sulfato
66
O teor de sulfato nas amostras foi determinado, após hidrólise ácida das
frações utilizando-se HCl 4 N por 6 horas à temperatura de 100 ºC, por turbidimetria
a 500 nm pelo método da gelatina/bário (DODGSON; PRICE, 1962) utilizando-se
uma curva padrão construída a partir de uma solução de sulfato de sódio (1 μg/μL)
em um intervalo de 0 a 40 μg.
2.5.4 Dosagem de proteínas
O teor de proteína de cada fração foi determinado utilizando-se o reagente de
Bradford, sendo a leitura realizada a 595 nm (BRADFORD, 1976). O teor de
proteínas foi determinado utilizando-se uma curva padrão de albumina bovina em
um intervalo de 0-10 μg.
2.5.5 Dosagem de compostos fenólicos
Os compostos fenólicos foram quantitativamente avaliados pelo método
colorimétrico de Folin-Ciocalteau, com leituras realizadas a 765 nm. O teor de
compostos fenólicos foi determinado utilizando-se uma curva padrão de ácido gálico
em um intervalo de 0-40 μg (COSTA et al., 2010).
2.5.6 Composição monossacarídica
As amostras foram hidrolisadas (HCl 2 N, 2 horas, 100 ºC) e os
monossacarídeos constituintes das frações foram determinados através de
cromatografia líquida de alta performance (HPLC), utilizando-se a coluna
LiChroCART® 250-4 LiChrospher® 100 NH2 (10 μm), tendo como fase móvel
acetonitrila:água (80:20) em um fluxo de 1 mL/min a 40 ºC . Usando-se como
padrões de açúcares: L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-
arabinose, D-ramnose e ácido D-glucurônico.
2.5.7 Análise de espectroscopia de infravermelho
Cada fração polissacarídica (10 mg) foi misturada cuidadosamente com
brometo de potássio e prensada para a obtenção de uma pastilha. Cada pastilha foi
67
então analisada em um aparelho de espectrometria de infravermelho (Thermo-
Nicolet Nexus 470 pesetas) e os espectros de infravermelho foram obtidos em uma
faixa compreendida entre 500 e 4000 cm-1. Trinta e duas varreduras em uma
resolução de 4 cm-1 foram calculadas e referenciadas contra o ar.
2.6 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE IN VITRO
Para a análise da possível atividade anticoagulante das frações
polissacarídicas previamente extraídas e caracterizadas, foram utilizados dois
ensaios, quais sejam: tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) e tempo de
protrombina (PT). Tais análises foram realizadas seguindo os protocolos fornecidos
pelos “kits” comerciais adquiridos (LABTEST, 2014).
Nesses ensaios foi verificada a massa de cada fração polissacarídica
necessária para dobrar o tempo de coagulação normal das amostras de plasma
coletadas.
Os tempos de coagulação foram determinados utilizando-se um coagulômetro
automático.
2.7 ATIVIDADES ANTIOXIDANTES IN VITRO
Para a análise da possível atividade antioxidante das frações polissacarídicas
obtidas, sete ensaios foram realizados: capacidade antioxidante total (CAT), poder
redutor, sequestro do radical hidroxila, sequestro do radical superóxido, sequestro
do peróxido de hidrogênio, quelação férrica e quelação cúprica.
2.7.1 Determinação da capacidade antioxidante total (CAT)
A determinação da capacidade antioxidante total (CAT) das frações
polissacarídicas foi realizada conforme metodologia descrita por Costa e
colaboradores (COSTA et al, 2010). O princípio do ensaio é a redução do Mo+6 a
Mo+5 pela amostra teste em diferentes concentrações, nesse processo, que ocorre
em pH ácido, há a formação de um complexo esverdeado fosfato/Mo+5. Esse
complexo colorido tem sua absorbância medida a 695 nm. Para realizar o ensaio as
amostras foram adicionadas em uma solução reagente (28 mM de fosfato de sódio,
68
0,6 M de ácido sulfúrico, 4 mM de molibdato de amônia). A solução foi mantida a
100 °C por 90 minutos e depois resfriada e lida em espectrofotômetro. O ácido
ascórbico foi utilizado como padrão e o resultado é expresso em equivalentes de
ácido ascórbico (mg de ácido ascórbico/g de amostra.
2.7.2 Avaliação do poder redutor
A avaliação do poder redutor das frações polissacarídicas foi realizada
conforme metodologia descrita por Costa e colaboradores (COSTA et al., 2010).
Para avaliar o poder redutor, 4 mL de solução contendo as amostras em diferentes
concentrações (0,1–1,0 mg/mL) foram misturadas ao tampão fosfato (0,2 M, pH 6,6)
e ferricianeto de potássio (1%) e incubados por 20 minutos a 50 ºC. A reação foi
interrompida pela adição de TCA (ácido tricloroacético) a 10%. Por fim, adicionou-se
água destilada e cloreto de ferro. A absorbância da solução é medida a 700 nm e
ácido ascórbico foi utilizado como padrão. O potencial redutor das amostras foi
expresso em percentual tendo como referência a atividade exibida por 0,1 mg/mL de
ácido ascórbico.
2.7.3 Avaliação do sequestro do radical hidroxila (OH.)
A avaliação da capacidade das frações polissacarídicas em sequestrar
radicais hidroxilas foi realizada conforme metodologia descrita por Costa e
colaboradores (COSTA et al, 2010). Para a realização deste teste, o radical hidroxila
foi gerado utilizando-se 3 mL de tampão de fosfato de sódio (150 mM, pH 7.4), que
continha 10 mM de FeSO4.7H2O, 10 mM de EDTA, 2 mM de salicilato de sódio, 30%
de H2O2 e concentrações diferentes dos polissacarídeos. O radical foi gerado devido
a reação de Fenton (Fe2 + + H2O2 → Fe3+ + OH-+ OH.). Para o controle foi utilizado
tampão fosfato em substituição ao peróxido de hidrogênio. Após incubação a 37 ºC
por 1 hora, a presença de radical hidroxila foi medida através da absorbância a 510
nm. O ácido gálico foi utilizado como controle.
2.7.4 Avaliação do sequestro do radical superóxido (O2-•)
69
A avaliação da capacidade das frações polissacarídicas em sequestrar
radicais superóxidos foi realizada conforme metodologia descrita por Costa e
colaboradores (COSTA et al., 2010). Este método baseia-se na capacidade da
amostra teste (frações polissacarídicas) em inibir a redução fotoquímica do nitroblue
tetrazolium (NBT) em um sistema riboflavina-luz-NBT. 3 mL da solução reagente
contendo: tampão fosfato (50 mM, pH 7,8), metionina (13 mM), riboflavina (2 μM),
EDTA (100 μM), NBT (75 μM) e 1 mL de solução contendo as frações
polissacarídicas em diferentes concentrações (10-1000 µg/mL), foram incubadas sob
iluminação com lâmpada fluorescente por 10 min. A produção do azul de formazan
foi monitorada pelo aumento da absorbância a 560 nm.
2.7.5 Avaliação do sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2)
A avaliação da capacidade das frações polissacarídicas em sequestrar H2O2
foi realizada a partir de uma adaptação da proposta inicial de Pick e Keisari (1980).
Trata-se de um método baseado na oxidação da fenolsulfoftaleína (ou vermelho de
fenol) mediada pela enzima Horseradish peroxidase (HRPO) dependente de H2O2. O
composto resultante apresenta um espectro de absorção no UV diferente do
vermelho de fenol reduzido, indo do rosa ao roxo com o aumento da concentração
de H2O2. Sua absorção ocorre em 610 nm, podendo então ser quantificado
espectrofotometricamente. Para a realização do método, foram adicionados a 100
µL de amostra em diferentes concentrações, 100 µL de H2O2 a 0,002% e 800 µL de
tampão fosfato 0,1 M salino (10 mM de NaCl). Esta solução foi incubada a 37 °C por
10 minutos. Posteriormente, foram adicionados 1 mL de vermelho de fenol (0,2
mg/mL) contendo peroxidase (0,1 mg/mL) em tampão fosfato 0,1 M salino (10 mM
de NaCl). A solução foi mantida em repouso por 15 minutos, com posterior adição de
NaOH 1 M. A leitura foi realizada a 610 nm.
2.7.6 Avaliação da capacidade em quelar ferro
A avaliação da capacidade das frações polissacarídicas em quelar ferro foi
realizada conforme metodologia descrita por Costa e colaboradores (COSTA et al.,
2010). Para avaliar a capacidade quelante de ferro das amostras, elas foram
70
pipetadas em diferentes concentrações junto à uma mistura de reação constituída de
cloreto de ferro II (0,05 mL, 2 mM) e ferrozina (0,2 mL, 5 mM). Após agitação por
alguns segundos, a mistura foi mantida a temperatura ambiente por 10 minutos para
que ocorressem as reações necessárias e posteriormente a absorbância da solução
foi obtida a 562 nm. O controle positivo foi o EDTA e a capacidade quelante das
amostras foi determinada conforme a equação abaixo.
Quelação de Ferro (%) = (Acontrole − Aamostra
Acontrole) ∗ 100
2.7.7 Determinação da capacidade em quelar cobre
A avaliação da capacidade das frações polissacarídicas em quelar cobre foi
realizada conforme metodologia descrita por Fernandes-Queiroz e colaboradores
(FERNADES-QUEIROZ et al., 2015). O método se baseia na capacidade do violeta
de pirocatecol em se associar a íons de cobre e formar um complexo colorido
(ANTON, 1960), quando o cobre é quelado, impede a formação desse complexo e
consequentemente a intensidade da coloração da solução é menor. O teste foi
realizado em microplaca. Em cada poço, foram adicionadas amostras em diferentes
concentrações (0,1 – 2,0 mg/mL), violeta de pirocatecol (4 mM) e sulfato de cobre II
pentahidratado (50 µg/mL), sendo a mistura homogeneizada após a adição de cada
item. A absorbância foi medida a 632 nm. Para o controle foi utilizado EDTA e a
capacidade de quelação foi calculada utilizando a equação abaixo:
Quelação de Cobre (%) = (Acontrole − Aamostra
Acontrole) ∗ 100
2.8 ENSAIO DO MTT
As linhagens Raw 264.7 (ATCC® TIB-71™, Macrófagos de camundongos),
3T3-L1 (ATCC® CL-173™, Pré-adipócitos de camundongos), HeLa (ATCC® CCL-
2™, Adenocarcinoma de colo uterino humano) e 786-0 (ATCC® CRL-1932™,
Adenocarcinoma renal humano) foram mantidas em cultivo em frascos contendo
meios Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ou Roswell Park Memorial
71
Institute (RPMI-1640, no caso da 786-0) suplementados com 10% de soro fetal
bovino (SFB), de acordo com protocolos da ATCC®. Para a realização dos
experimentos, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços em uma
densidade de 5 x 103 células/poço e mantidas em repouso para adesão por 24
horas, à 37 °C e 5% CO2. Posteriormente, o meio foi trocado por um novo, sem a
presença de SFB, e as células foram mantidas em carenciamento por 24 horas. No
dia seguinte, o meio foi novamente trocado por novo meio suplementado com SFB e
com diferentes concentrações das frações de C. prolifera. Como controle negativo,
utilizou-se células cultivadas na ausência das frações polissacarídicas. Após 24, 48
ou 72 h, o ensaio do MTT foi realizado como um parâmetro para se avaliar a
capacidade das células em reduzir o MTT, o que indiretamente indica a viabilidade
das mesmas (MOSSMANN, 1983). Para o ensaio do MTT, os meios contendo as
frações polissacarídicas foram retirados e substituídos por outro contendo 1 mg/mL
de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) e incubados por 4
h a 37 °C. Após este período de incubação, o sobrenadante foi removido e o cristal
purpura de formazan foi solubilizado em etanol. A placa foi mantida sob agitação
para homogeneização por 15 minutos, à temperatura ambiente, e a absorbância foi
medida à 570 nm em um leitor de microplaca (Epoch-Biotek, Winooski, VT, EUA). A
absorbância do controle negativo foi considerada como 100% de redução do MTT e
os valores das células tratadas foram calculados como percentual do controle
negativo.
2.9 ATIVIDADE IMUNOMODULATÓRIA (DOSAGEM DO ÓXIDO NÍTRICO)
Para avaliar o potencial imunomodulador das amostras, incialmente, as células
RAW 264.7 foram plaqueadas em uma concentração de 3 x 105 células por poço
(placa de 24 poços) em meio DMEM suplementado com 10% SFB por 24 horas.
Posteriormente, o meio foi trocado por um novo sem a presença de SFB e as células
foram mantidas em carenciamento por 24 horas. Após esse período, o meio foi
removido e as células foram estimuladas a sair de G0 pelo acréscimo de meio com
SFB 10% e amostras em diferentes concentrações com a presença (controle
positivo) ou ausência (controle negativo) de 2 µg/ml LPS. Após 24 horas de
tratamento, o meio foi coletado e a quantidade de óxido nítrico produzida foi
72
estimada pelo método de Griess, cuja absorbância foi determinada em 540 nm
(YOON et al., 2009).
2.10 ATIVIDADE ANTIADIPOGÊNICA
Os pré-adipócitos de camundongo (3T3-L1) foram cultivados em placas de 24
poços, contendo meio DMEM enriquecido com 10% de SFB. Após atingir 80% de
confluência, em geral 2 dias após o plaqueamento (designado “dia 0”), esse meio foi
retirado e adicionado o meio de diferenciação adipocitária (MDA) constituído por
DMEM com alta concentração de glicose (12100-046 Life Technologies), 10% de
SFB, 1 μM de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina (IBMX) e 10 µg/mL de
insulina (Figura 23). Após 3 dias (3° dia), o MDA foi substituído por um meio de
manutenção adipocitária (MA) constituído por DMEM, 10% de SFB e 10 µg/mL de
insulina. Este meio de manutenção (MA) foi trocado a cada 3 dias até o 12° dia,
conforme esquema abaixo (Adaptado de KIM et al., 2010).
Figura 23. Esquema das trocas de meios durante a diferenciação adipocitária.
As frações de C. prolifera foram avaliadas quanto à capacidade em reduzir a
diferenciação celular (efeito antiadipogênico). Para isso, as células 3T3-L1 foram
induzidas a se diferenciar (conforme Figura 23) na ausência (controle) ou presença
das amostras nas concentrações de 100 µg/mL, 200 µg/mL e 1000 µg/mL (MDA +
amostras, no dia 0). Após 15 dias, a diferenciação adipogênica foi mensurada pelo
uso do corante Oil Red O.
Após a indução da diferenciação, as células foram coradas com o lisocromo Oil
Red O. A solução de uso desse corante foi constituída por seis partes da solução
73
estoque de Oil Red O (0,6%) em isopropanol e quatro partes de água. Após o 15°
dia de diferenciação as células tratadas e não-tratadas (controle) com as amostras,
foram lavadas duas vezes em PBS, fixadas com uma solução de formaldeído (3,7%)
em PBS por 1 hora, lavadas três vezes em água, secas e coradas com Oil Red O
por 1 hora. O excesso de corante foi removido pela lavagem com água. Imagens das
células foram captadas utilizando um microscópio óptico. Posteriormente o corante
foi eluído de dentro das células com isopropanol 100% e quantificado pela medição
da absorbância a 520 nm. Os resultados das células diferenciadas na presença das
amostras foram comparados com aqueles obtidos para as células controle (100% de
diferenciação adipocitária) (KIM et al., 2010).
2.11 ATIVIDADE MICROBICIDA.
2.11.1 Atividades anti-Klebsiela pneumonia carbapenemases (KPC) e
anti-Staphylococcus epidermidis
O experimento foi realizado como descrito por Melo-Silveira e colaboradores
(MELO-SILVEIRA et al. 2012). O crescimento bacteriano de S. epidermidis (ATCC
35984) e um isolado clínico de KPC foi avaliado pela diferença de absorbância
medida a DO 600 nm no final e no início do tempo de incubação em placas de
microtitulação de poliestireno de 96 poços. Diferentes concentrações das frações
polissacarídicas de C. prolifera foram incubadas na presença de cada cepa
bacteriana. O controle com água destilada foi considerado como 100% do
crescimento bacteriano. Todas os experimentos foram realizados em triplicata.
2.11.2 Atividade anti-Leishmania amazonensis
Cepas de Leishmania (Leishmania) amazonenses (MHOM/BR/73/M2269)
foram obtidas e identificadas usando anticorpos monoclonais no Instituto Evandro
Chagas (Belém, Brasil). Estas cepas foram inoculadas e desenvolvidas em
camundongo BALB/C com 8 semanas de idade para manter sua infectividade, e os
animais foram alojados no biotério do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo
(São Paulo, Brasil). Para a manipulação da Leishmania, os parasitas foram obtidos
74
da pata dos camundongos, isoladas e cultivadas a 25 °C em meio Roswell Park
Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) (Gibco®, Life Technologies, Carlsbad, CA,
EUA) suplementado com 10% de SFB inativado, 10 µg/mL de gentamicina e 100
UI/mL de penicilina. A forma promastigota do parasita foi usada em um estágio de
crescimento estacionário.
Para avaliar a atividade leishmanicida das frações polissacarídicas de C.
prolifera, utilizou-se o protocolo descrito por Passero e colaboradores (PASSERO et
al., 2007). Cada amostra, em diferentes concentrações, foi colocada em poços de
microplacas de 96 poços contendo 3 x 107 promastigotas/mL. As placas foram
incubadas a 25 °C por 24 horas. Subsequentemente, as placas foram centrifugadas
(4000 RPM, 10 °C, 10 min), o sobrenadante foi removido e os poços forma lavados
duas vezes com PBS. Por fim, as células foram expostas a uma solução de MTT (4
mg/mL) durante 4 horas, à temperatura ambiente, e posteriormente 50 µL de SDS
10% foram utilizados para solubilizar os cristais de formazan. A placa ficou em
repouso por 18 horas, à temperatura de 25 °C, e a placa foi lida a 595 nm.
Anfotericina B foi utilizada como controle positivo.
2.12 EFEITO DOS POLISSACARÍDEOS SOBRE A FORMAÇÃO DE
CRISTAIS DE OXALATO DE CÁLCIO.
2.12.1 Cristalização do oxalato de cálcio
Este ensaio foi realizado de acordo com a metodologia sugerida por Zhang e
colaboradores em 2012 (ZHANG et al., 2012). Para tal, foi preparada uma solução
contendo cloreto de cálcio (8 mmol/L), oxalato de sódio (1 mmol/L), cloreto de sódio
(200 mmol/L) e acetato de sódio (10 mmol/L), sendo as concentrações dessa
solução próximas das concentrações fisiológicas da urina. A formação desses
cristais foi avaliada na ausência (controle) ou presença dos polissacarídeos.
2.12.2 Análise da morfologia dos cristais de CaOx por microscopia
Os cristais de CaOx formados conforme tópico anterior, foram centrifugados a
5000 x g, sendo o sobrenadante descartado. O precipitado, composto principalmente
75
por cristais de CaOx, foi ressuspendido em 0,5 mL de água e uma alíquota de 0,1
mL foi colocada em lâmina histológica e observada em microscópio óptico (600x)
imediatamente após a ressuspensão. Foram obtidas imagens de 10 campos
diferentes, selecionados aleatoriamente, de cada lâmina, que foram analisados
utilizando o software NIS Elements AR 4.00.03 64 bit (Nikon, Japão). Através do
software foi realizada a análise de tamanho dos cristais, onde o diâmetro máximo
dos cristais foi medido. Foram realizados 3 experimentos distintos.
2.12.3 Medida do potencial zeta (ζ) dos cristais de CaOx
Para a determinação do potencial zeta, foi induzida a formação dos cristais de
CaOx na ausência e presença das amostras. Após 30 minutos do início da formação
dos cristais, as soluções foram centrifugadas a 5000 x g. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado rico em cristais de CaOx foi ressuspendido em 1,5 mL de
água e avaliado no Zeta Plus®.
2.12.4 Análise da morfologia dos cristais de CaOx por microscopia
confocal
Para avaliação da morfologia dos cristais de CaOx por microscopia confocal,
inicialmente as frações polissacarídicas foram associadas ao Isotiocianato de
fluoresceína (FITC). Para tanto, 5 mg de cada fração foram adicionados a uma
solução 0,1 M de tampão fosfato em pH 7,0 contendo 0,1 mg de FITC. A solução foi
mantida protegida da luz sob agitação branda por 1 hora. Posteriormente o material
foi dialisado e liofilizado. As frações associadas ao FITC foram utilizadas para a
produção de novos cristais de oxalato de cálcio, conforme metodologia descrita
anteriormente no item 2.12.1. As lâminas para microscopia foram montadas
conforme metodologia descrita no item 2.12.2. Os cristais foram visualizados
utilizando-se o Microscópio Confocal Zeiss LSM 700 (Objetiva 63x/Oil) e analisados
pelo software ZEN.
2.13 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
76
Os dados referentes às atividades foram submetidos ao teste estatístico One-
way ANOVA, seguido do pós-teste de Student-Newman-Keuls. As diferenças
estatísticas foram consideradas significativas, quando o valor de p < 0,05.
77
3 RESULTADOS
3.1 ANÁLISES QUÍMICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DAS FRAÇÕES OBTIDAS A
PARTIR DE C. PROLIFERA
As sete frações obtidas pelo processo de extração foram submetidas a uma
eletroforese em gel de agarose e coradas com azul de toluidina para se evidenciar a
presença de polissacarídeos sulfatados (Figura 24).
Figura 24. Eletroforese em gel de agarose das frações polissacarídicas obtidas da alga marinha verde Caulerpa prolifera. 50 µg de cada fração polissacarídicas foram aplicados no gel de agarose 0,6% em tampão PDA (1,3-diaminopropano) pH 9,0 e submetidos a eletroforese à 100 V/cm por 1 hora. O gel foi mantido em CTV (Cetiltrimetilamônio), desidratado e os polissacarídeos corados com azul de toluidina 0,1%. A seta indica a origem e o sentido da corrida eletroforética.
A análise química e o rendimento das frações polissacarídicas obtidas da alga
C. prolifera estão sumarizados na Tabela 03.
78
Tabela 03. Rendimento, dosagens químicas e composição monossacarídica das frações polissacarídicas extraídas da alga verde marinha Caulerpa prolifera. Aç: açúcares totais; Sulf: sulfato; Prot: proteína; Comp. fen.: compostos fenólicos; Fuc: fucose; Gal: galactose; Glic: glicose; Man: manose; Xil: xilose; -: Traços; n.d.: não detectado.
Frações Rend.
(%)
Aç.
(%)
Sulf.
(%)
Prot.
(%)
Comp.fen.
(%)
Razão molar
Fuc Gal Gli Man Xil
CP-0.3 7,4 97,0 1,9 n.d. 1,2 1,2 1,0 1,2 1,2 1,3
CP-0.5 28,5 68,9 30,9 n.d. 0,2 0,6 1,0 0,5 1,2 1,0
CP-0.7 21,8 81,4 18,5 n.d. 0,1 n.d. 1,0 - 0,6 -
CP-0.9 12,9 92,2 7,5 n.d. 0,3 - 1,0 - - -
CP-1.1 6,7 78,4 21,4 n.d. 0,2 - 1,0 0,5 - -
CP-1.5 5,4 77,0 22,2 n.d. 0,7 n.d. 1,0 0,9 0,5 n.d.
CP-2.0 7,3 84,9 13,9 0,3 0,9 - 1,0 1,1 0,9 -
O rendimento percentual da extração das frações polissacarídicas variou de
5,4% (CP-1.5) a 28,5% (CP-0.5). Contaminação proteica foi detectada apenas em
CP-2.0 (0,3%). A contaminação por compostos fenólicos foi baixa atingindo o valor
máximo de 1,2% (CP-0.3). CP-0.5 exibiu o menor conteúdo de açúcares totais
(68,9%), no entanto os polissacarídeos dessa fração parecem apresentar-se
ricamente sulfatados (30,9%), ao contrário de CP-0.3 que apresentou o maior
percentual de açúcares (97,0%) e o menor teor de sulfato (1,9%).
Com relação a análise da composição monossacarídica, CP-0.3 apresentou
uma razão molar uniforme entre os monossacarídeos não havendo grande
predominância de nenhum componente em detrimento dos demais. CP-0.5
apresentou uma composição diversificada com predomínio de manose, xilose e
galactose. CP-0.9 foi o único polissacarídeo com predominância apenas de
galactose. CP-0.7 e CP-1.1 apresentaram além de galactose, manose e glicose,
respectivamente. CP-1.5 e CP-2.0 apresentaram composição similar entre si,
variando apenas na relação entre manose e glicose.
Com o intuito de se observar similaridades e diferenças estruturais entre os
polímeros, assim como a presença de grupos funcionais típicos de polissacarídeos
sulfatados, os polímeros obtidos de C. prolifera foram submetidos a uma análise por
espectroscopia de infravermelho e os resultados encontram-se na Tabela 04.
79
Tabela 04. Espectro de infravermelho das frações polissacarídicas obtidas a partir da alga Caulerpa prolifera. IV: Infravermelho.
Frações IV (KBr) (cm-1)
O-H C-H S=O O=S=O C-O-SO4
CP-0.3 3351 2922 1233 1026 913 709 CP-0.5 3370 2928 1226 1016 812 710 CP-0.7 3371 2929 1224 1022 805 707 CP-0.9 3344 2932 1227 1028 826 713 CP-1.1 3328 2932 1227 1023 822 704 CP-1.5 3299 2939 1233 1020 828 700 CP-2.0 3326 2939 1232 1026 813 702
Ao visualizar a Tabela 04, pode-se perceber que todas as frações possuem
sinais bastante similares entre si.
3.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA.
A atividade anticoagulante in vitro das frações polissacarídicas de C. prolifera
foi avaliada através de dois ensaios: o tempo de tromboplastina parcial ativada
(TTPa) e o tempo de protrombina (TP). Os resultados da atividade anticoagulante
exibidos pelas frações polissacarídicas estão presentes na Tabela 05.
80
Tabela 05. Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga marinha verde Caulerpa prolifera avaliada pelos ensaios de Tempo de tromboplastina ativada (TTPa) e Tempo de protrombina (TP). n.d. - Atividade não detectada até a massa de 100 µg.
Frações TTPa* (µg) TP* (µg)
CP-0.3 n.d. n.d.
CP-0.5 80 µg n.d.
CP-0.7 80 µg n.d.
CP-0.9 40 µg n.d.
CP-1.1 80 µg n.d.
CP-1.5 20 µg n.d.
CP-2.0 80 µg n.d.
* Massa mínima necessária para dobrar o tempo de coagulação em relação ao controle.
Como pode ser observado na Tabela 05, nenhuma fração polissacarídica
exibiu atividade frente ao ensaio de TP, que avalia a via extrínseca da coagulação.
Por outro lado, no ensaio de TTPa, que avalia a via intrínseca da coagulação, as
frações polissacarídicas foram capazes de duplicar o tempo de coagulação, com
exceção de CP-0.3. CP-1.5 merece maior destaque uma vez que foi capaz de
duplicar o tempo de coagulação com apenas 20 µg de amostra. CP-0.9 duplicou o
tempo de coagulação do plasma com 40 µg de amostra. As demais frações
polissacarídicas necessitaram de uma maior quantidade de amostra (80 µg).
3.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA.
A atividade antioxidante das frações ricas em polissacarídeos sulfatados foi
avaliada em sete diferentes ensaios: Capacidade antioxidante total (CAT), poder
redutor, sequestro de radicais hidroxila, sequestro de radicais superóxido, sequestro
de peróxido de hidrogênio, quelação férrica e quelação cúprica.
3.2.1 Capacidade antioxidante total (CAT)
Os resultados obtidos pelas frações polissacarídicas no ensaio de capacidade
antioxidante total (CAT) estão expostos na Figura 25.
81
Figura 25. Capacidade antioxidante total (CAT) das frações polissacarídicas obtidas da alga marinha verde Caulerpa prolifera. Os resultados estão expressos como equivalentes de ácido ascórbico (mg de ácido ascórbico/g de polissacarídeos). Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p < 0,05) entre as frações polissacarídicas.
Das frações obtidas de C. prolifera, três (CP-0.7, CP-0.9 e CP-1.5)
apresentaram uma atividade irrelevante, sendo inferior a 0,5 mg/g de equivalentes
de ácido de ácido ascórbico (EAA). CP-0.5 e CP-1.1 apresentaram uma capacidade
antioxidante em torno de 5,1 mg/g de EAA, já CP-2.0 e CP-0.3 apresentaram as
atividades mais pronunciadas com 8,8 e 19,4 mg/g de EAA, respectivamente.
3.2.2 Poder redutor
Os resultados obtidos pelas frações polissacarídicas no teste do poder redutor
estão expressos na Figura 26.
82
Figura 26. Poder redutor das frações polissacarídicas de C. prolifera. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. O potencial redutor das amostras está expresso em percentual tendo como referência a atividade exibida por 0,1 mg/mL de ácido ascórbico. a,b,c Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4,5,6 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas.
As frações polissacarídicas de C. prolifera apresentaram um baixo potencial
redutor. As frações CP-0.5, CP-0.7, CP-0.9 e CP-1.1, na maior concentração
avaliada (1,0 mg/mL), exibiram um poder redutor menor do que 5,1%. Já as frações
CP-0.3, CP-1.5 e CP-2.0, em sua maior concentração avaliada, obtiveram um
melhor desempenho, tendo atividades da ordem de 11,5%, 12,8% e 15,6%,
respectivamente.
3.2.3 Sequestro do radical hidroxila (OH·)
O resultado do ensaio de sequestro de radicais hidroxila está exposto abaixo
na Figura 27.
83
Figura 27. Sequestro de radicais hidroxila (OH·) pelas frações polissacarídicas de C. prolifera. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4,5 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas.
As frações polissacarídicas de C. prolifera também apresentaram uma
pequena capacidade de sequestrar os radicais hidroxila. CP-1.1, CP-1.5 e CP-2.0
foram capazes de sequestrar apenas 4,5%, 5,2% e 8,2% de radicais hidroxila nas
concentrações de 0,5 e 1,0 mg/mL. CP-0.7 apresentou a melhor atividade com uma
capacidade de sequestro de até 16,5% nas concentrações mais elevadas. CP-0.3 e
CP-0.5 obtiveram resultados semelhantes sendo capazes de sequestrar em torno de
10,8% de radicais hidroxila nas concentrações de 0,5 e 1,0 mg/mL.
3.2.4 Sequestro do radical superóxido (O2•–)
Nenhuma fração polissacarídica de C. prolifera foi capaz de sequestrar
radicais superóxido.
3.2.5 Sequestro do peroxido de hidrogênio (H2O2)
Os dados do ensaio de sequestro do peróxido de hidrogênio estão disponíveis
na Figura 28.
84
Figura 28. Sequestro do peróxido de hidrogênio (H2O2) pelas frações polissacarídicas de C. prolifera. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas.
Todas as frações polissacarídicas de C. prolifera foram capazes de
sequestrar o peróxido de hidrogênio. CP-2.0 apresentou a menor capacidade,
obtendo valores em torno de 22% de sequestro até a máxima concentração
avaliada, desempenho similar a menor concentração de CP-0.5 (0,1 mg/mL). CP-
0.5, por sua vez, em sua concentração máxima obteve uma atividade de sequestro
de até 44%. CP-1.1 e CP-1.5 apresentaram uma atividade bem semelhante entre si,
sendo capazes de sequestrar até 50,2% e 53,4%. CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9
apresentaram os melhores resultados, sendo capazes de sequestrar o peróxido de
hidrogênio em uma ordem de até 61%.
3.2.6 Quelação férrica.
A capacidade das frações polissacarídicas em quelar íons de ferro está
exposta na Figura 29.
85
Figura 29. Quelação férrica pelas frações polissacarídicas de C. prolifera. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4,5 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas.
Todas as frações polissacarídicas de C. prolifera foram capazes de quelar
íons ferro. CP-0.7, CP-2.0 e CP-1.5 apresentaram as menores atividades, com
valores de 4,8%, 6,8% e 12,1%, respectivamente. CP-0.5, CP-1.1 e CP-0.3
desempenharam uma atividade intermediária, sendo capazes de quelar 19,3%, 23%
e 26,4% dos íons de ferro. CP-0.9 merece maior destaque, uma vez que em sua
maior concentração avaliada 1,0 mg/mL) foi capaz de quelar 55,8% de íons de ferro.
3.2.7 Quelação cúprica.
A capacidade das frações polissacarídicas em quelar íons de cobre está
exposta na Figura 30.
86
Figura 30. Quelação cúprica pelas frações polissacarídicas de C. prolifera. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4,5 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas.
Todas as frações polissacarídicas de C. prolifera foram capazes de quelar
íons cobre. As frações polissacarídicas CP-0.3 e CP-0.5 apresentaram as menores
atividades na maior concentração avaliada (1,0 mg/mL), quelando 18,7% e 25,5%,
respectivamente. As frações CP-0.7, CP-0.9 e CP-1.1 tiveram moderada capacidade
em quelar íons cobre, com valores em torno de 47,3%, 47,9% e 61,9%,
respectivamente. CP-1.5 e CP-2.0 apresentaram as melhores atividades, com
capacidades de quelação em similares em torno de 76,8% e 77,8%.
3.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA.
A atividade imunomodulatória dos polissacarídeos sulfatados de C. prolifera
foi avaliada através da dosagem de nitrito, um subproduto resultante da produção de
óxido nítrico frente a estimulação de macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7.
Para isso, primeiramente realizou-se a avaliação da influência das frações
polissacarídicas sobre a viabilidade dos macrófagos durante 24 horas (Figura 31).
87
Figura 31. Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a viabilidade de células da linhagem RAW 264.7 após 24 horas. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4,5 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas. ǂ indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle negativo (cultivo na ausência de LPS). * indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle positivo (cultivo na presença de LPS).
CP-1.1 e CP 1.5 não apresentaram grandes influências sobre a viabilidade
celular. CP-0.7 foi a única fração polissacarídica, que em concentrações mais
elevadas (0,5 e 1,0 mg/mL) foi capaz de aumentar a viabilidade destas células. CP-
0.3, CP-0.5, CP-0.9 e CP-2.0 promoveram uma redução de cerca de 40% da
viabilidade celular, quando utilizados em sua maior concentração (1,0 mg/mL).
Posteriormente, a influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre
a produção de óxido nítrico por macrófagos foi avaliada (Figura 32).
88
Figura 32. Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a produção de óxido nítrico pela linhagem de macrófagos RAW 264.7 após 24 horas. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas. ǂ indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle negativo (cultivo na ausência de LPS). * indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle positivo (cultivo na presença de LPS).
CP-0.5, CP-1.1, CP-1.5 e CP-2.0 não apresentaram qualquer tipo de atividade
imunogênica. CP-0.3, CP-0.7 e CP-0.9, ao contrário das demais, tiveram uma ação
imunogênica bastante pronunciada quando comparadas ao controle negativo,
aumentando em até 48, 142 e 163 vezes, respectivamente, a produção de óxido
nítrico, em suas maiores concentrações avaliadas.
A ação anti-inflamatória das frações polissacarídicas de C. prolifera frente a
estimulação de macrófagos murinos da linhagem RAW 264.7 por lipopolissacarídeos
de E. coli durante 24 horas também foi avaliada (Figura 33).
89
Figura 33. Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a produção de óxido nítrico pela linhagem de macrófagos RAW 264.7 estimulados por LPS de E. coli por 24 horas. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c,d Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas. ǂ indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle negativo (cultivo na ausência de LPS). * indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle positivo (cultivo na presença de LPS).
CP-1.1 não apresentou atividade anti-inflamatória, assim como CP-0.3 e CP-
2.0 em suas maiores concentrações (1,0 mg/mL). Como esperado, CP-0.7 e CP-0.9
novamente apresentaram um papel imunogênico bastante pronunciado em suas
concentrações máximas avaliadas, aumentando em cerca de 162 e 253 vezes,
respectivamente, a produção de óxido nítrico pelos macrófagos quando comparado
com o controle negativo. CP-0.3, CP-0.5, CP-0.7, CP-0.9, CP-1.5 e CP-2.0
promoveram uma redução na produção de óxido nítrico em torno de 30%, em
diferentes concentrações, quando comparados ao controle positivo. CP-2.0 merece
destaque, já que em sua menor concentração reduziu em 73% a produção do óxido
nítrico.
3.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-ADIPOGÊNICA DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA.
A atividade anti-adipogênica das frações polissacarídicas de C. prolifera foi
avaliada através da inibição da diferenciação celular da linhagem fibroblástica
90
embrionária 3T3-L1 em adipócitos. Tal inibição foi avaliada através da dosagem de
lipídios neutros ao final da diferenciação celular. Para isso, primeiramente realizou-
se a avaliação da influência das frações polissacarídicas sobre a viabilidade dos
fibroblastos durante 24, 48 e 72 horas (Figura 34).
91
Figura 34. Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a viabilidade de células da linhagem 3T3-L1 após 24 (A), 48 (B) e 72 (C) horas de exposição. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas. ǂ indica amostras com diferença significativa em relação ao controle negativo.
92
CP-0.7, CP-0.9, CP-1.1 e CP-2.0 não foram capazes de alterar a viabilidade
celular nos três intervalos de tempo avaliados em qualquer uma das concentrações
avaliadas, assim como CP-1.5, nas concentrações de 0,1 e 0,2 mg/mL. CP-1.5
apresentou um alto grau de toxicidade nos três intervalos de tempo avaliados, na
concentração de 1,0 mg/mL, chegando a reduzir em até 90% a viabilidade celular.
CP-0.3 e CP-0.5 não interferiram na viabilidade celular no tempo de 24 horas, porém
com 48h de tratamento pode-se notar uma queda de até 40% na viabilidade celular.
No tempo de 72 h, a queda na viabilidade celular alcança 60% para CP-0.5 na
concentração de 1,0 mg/mL.
Após a avaliação de possíveis influências sobre a viabilidade celular, a
capacidade em inibir a diferenciação celular em adipócitos foi investigada e os
resultados encontram-se expostos na Figura 35.
Figura 35. Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a diferenciação adipocitária de células da linhagem 3T3-L1. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c Diferentes letras indicam uma diferença significativa (p <0,05) entre as diferentes concentrações de uma mesma fração. 1,2,3,4 Diferentes números indicam diferença significativa (p <0,05) entre a mesma concentração de diferentes frações polissacarídicas. ǂ indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle negativo. * indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle positivo.
93
CP-0.3, CP-0.5, CP-0.7, CP-0.9, CP-1.1 e CP-2.0 não tiveram qualquer
influência sobre a formação de novos adipócitos. No entanto, CP-1.5 merece grande
destaque. Nas 3 concentrações avaliadas essa fração foi capaz de reduzir a
diferenciação celular em 37%, 65% e 98%, respectivamente. Vale ressaltar que
apenas em sua maior concentração avaliada CP-1.5 exibiu toxicidade, algo que não
ocorreu nas menores concentrações testadas.
O aspecto das células após a diferenciação celular na presença de CP-1.5
pode ser visualizado na Figura 36.
Figura 36. Células da linhagem 3T3-L1 visualizadas em microscopia óptica de campo claro. A – Controle negativo, células não diferenciadas e coradas com Oil Red-O (200 x), B – Controle positivo, células induzidas a diferenciação sem aplicação do corante Oil Red-O (200 x), C – Controle positivo, células induzidas a diferenciação e coradas com Oil Red O (200x), D – Células induzidas a diferenciação e tratadas com 0.2 mg/mL de CP-1.5 e coradas com Oil Red O (200x).
Na Figura 36A pode-se observar o aspecto fibroblástico típico das células da
linhagem 3T3-L1 não diferenciadas, bem como a ausência de corante utilizado para
se visualizar depósitos de lipídeos neutros dentro das células. Na Figura 36B pode-
se observar o aspecto típico de adipócitos totalmente diferenciados com muitas
vesículas de gordura dentro do citoplasma celular e a morfologia arredondada de
94
grandes proporções dos adipócitos. Esses quando corados com Oil Red O, que
possui alta afinidade por lipídeos neutros, revelam a presença de grandes
quantidades de trialcilgliceróis dentro das vesículas citoplasmáticas (Figura 36C).
Em 36D pode-se observar a redução na quantidade de adipócitos pelo tratamento
das células com CP-1.5 na concentração de 0.2 mg/mL.
3.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DAS FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA.
A atividade antiproliferativa das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre
as linhagens tumorais HeLa e 786-0 foi avaliada utilizando-se o ensaio de MTT
(Figuras 37A e 37B).
95
Figura 37. Influência das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a viabilidade de células da linhagem HeLa (A) e 786-0 (B) após 24 e 48 horas de tratamento. Cada valor representa a média de três determinações ± desvio-padrão. a,b,c diferentes letras indicam uma diferença significativa (p < 0.05) entre diferentes concentrações de uma mesma fração em um mesmo intervalo de tempo. 1,2 Diferentes números indicam uma diferença significativa (p < 0.05) entre a mesma concentração de um mesma fração em diferentes intervalos de tempo. ǂ indica amostras sem diferença significativa em relação ao controle negativo.
96
Para a linhagem tumoral HeLa (Figura 37A), apenas CP-0.3, em sua maior
concentração avaliada, exibiu uma discreta toxicidade nas primeiras 24 horas de
exposição. No entanto, após 48 horas de tratamento, exceto CP-2.0 não teve
influência sobre a viabilidade celular. CP-0.3, CP-0.5, CP-0.7 e CP-0.9, nas
concentrações de 0,1 mg/mL e 0,25 mg/ml, foram capazes de reduzir em cerca de
40% a viabilidade celular. Redução da viabilidade celular em torno de 55% ocorreu
nos tratamentos com as maiores concentrações de CP-0.3 e CP-0.5, assim como
para CP-0.9 na concentração de 1,0 mg/mL. CP-1.1 e CP-1.5 também apresentaram
citotoxicidade (em torno de 45%) na concentração de 1,0 mg/mL
Para a linhagem tumoral renal 786-0 (Figura 37B), todas as frações
polissacarídicas de C. prolifera já apresentam uma atividade antiproliferativa
apreciável nas primeiras 24 horas de tratamento, excetuando-se CP-0.7. Deve-se
destacar a atividade exercida por CP-1.5, que em sua maior concentração, reduziu
em 75% a viabilidade dessa linhagem tumoral. Com 48 horas de tratamento há uma
queda considerável da viabilidade celular ao se utilizar a concentração máxima das
frações polissacarídicas, excetuando-se CP-0.9 e CP-2.0. Novamente, CP-1.5
merece maior destaque, uma vez que foi capaz de reduzir a viabilidade em cerca
65%. CP-0.3 e CP-0.5 com redução de 60% da viabilidade celular, e CP-07 e CP-1.1
com 50% também apresentaram uma boa atividade citotóxica.
3.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MICROBICIDA DE FRAÇÕES
POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE C. PROLIFERA.
A atividade microbicida das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre
promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonenses e cepas de
Staphylococcus epidermidis e Klebsiella pneumoniae resistente à Carbapenêmicos
(KPC) encontra-se ilustrada na Tabela 06.
97
Tabela 06. Atividade microbicida das frações polissacarídicas obtidos a partir de C. prolifera.
IC50 – Concentração mínima inibitória capaz de matar 50% dos organismos; %IV – Inibição da
viabilidade; n.d. – Não detectado; n.dt. Não determinado; Anfot. B – Anfotericina B Os dados
representam média ± desvio-padrão de no mínimo três experimentos
Amostras Atividade
Anti-L. amazonensis
(IC 50)
Atividade
Anti-KPC
(% IV)
Atividade
Anti-S.epidermidis
(% IV)
CP-0.3 n.d.* n.d.* n.d.*
CP-0.5 n.d.* n.d.* n.d.*
CP-0.7 n.d.* n.d.* n.d.*
CP-0.9 n.d.* n.d.* n.d.*
CP-1.1 n.d.* n.d.* n.d.*.
CP-1.5 n.d.* n.d.* 23.8 ± 0.1
CP-2.0 n.d.* n.d.* n.d.*
Anfot. B 0,6 n.dt. n.dt.
* Até a máxima concentração avaliada (1 mg/mL);
As frações polissacarídicas de C. prolifera não apresentaram atividade sobre
promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonenses e cepas de Klebsiella
pneumoniae resistente à Carbapenêmicos (KPC). Apenas CP-1.5 apresentou uma
atividade citotóxica (23,8%) contra cepas de Staphylococcus epidermidis.
3.7 EFEITO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS OBTIDAS A PARTIR DE
C. PROLIFERA SOBRE A FORMAÇÃO DE CRISTAIS DE OXALATO DE
CÁLCIO.
O efeito das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a formação de
cristais de oxalato de cálcio está resumida na Figura 38.
98
Figura 38. Efeito das frações polissacarídicas de C. prolifera sobre a formação de cristais de oxalato de cálcio. (A) Tamanho dos cristais; (B) Percentual dos tipos de cristais formados (azul: cristais monohidratados (COM); vermelho: cristais dihidratados (COD); verde: cristais trihidratados) (COT); (C-K) Microscopia de campo claro (600 X) dos cristais formados; (C) Controle negativo; (D) Citrato de sódio (1mM); (E) CP-0.3; (F) CP-0.5; (G) CP-0.7; (H)
CP-0.9; (I) CP-1.1; (J) CP-1.5; (K) CP-2.0. A concentração utilizadas das frações foi de 0,25 mg/mL Cristais COM; Cristais COD
Cristais COT Cristais COM de bordas arredondadas; Letras (a), números(1-4) e símbolos (* e #) indicam Diferença significativa (p <0,05) entre as amostras.
99
Ao se analisar as figuras 38A e 38B, e as imagens de microscopia
representadas pelas figuras 38E, 38F e 38I, pode-se perceber que as frações CP-
0.3, CP-0.5 e CP-1.1 proporcionaram apenas a formação de cristais de oxalato de
cálcio do tipo dihidratado (COD) de tamanho bastante reduzido, com
aproximadamente 1 µm, tamanho cerca de 5 vezes menor que os COD formados no
controle negativo e nas amostras contendo citrato de sódio. As imagens 38E, 38F e
38G também chamam a atenção pela quantidade de cristais formados, que foi cerca
de 20 vezes maior na presença de CP-0.3 e 40 vezes maior na presença de CP-0.5
e CP-1.1, quando comparadas ao controle negativo. Como pode ser observado nos
gráficos 38A e 38B e na figura 38K, CP-2.0 também foi capaz de induzir a formação
de cristais do tipo COD (cerca de 10 vezes mais do que o controle negativo) de
pequeno tamanho (aproximadamente 1,5 µm), no entanto essa amostra também foi
capaz de induzir a formação de cristais trihidratados (COT). CP-0.7, assim como o
controle negativo e o Citrato, foi capaz de induzir a formação de cristais do tipo COM
e COD, estes últimos com tamanho duas vezes menor do que os cristais formados
no controle negativo. CP-0.9, assim como CP-2.0, foi capaz de produzir cristais do
tipo COT e COD, estes últimos com tamanho um pouco menor do que o do controle
negativo. CP-1.5 foi a única amostra capaz de induzir a formação dos 3 tipos de
cristais, e o que chama a atenção na figura 38J, é a estrutura dos cristais
monohidratados com bordas arredondadas, semelhantes ao encontrados quando se
utiliza o citrato (figura 38D).
Com o intuito de analisar se as mudanças no número e na morfologia dos
cristais estavam associadas às alterações na carga superficial desses, verificou-se
potencial zeta (ζ) dos cristais formados na presença das frações polissacarídicas. Os
resultados estão expostos na Tabela 07. O valor médio do ζ dos cristais de CaOx
sem tratamento foi + 17,43 ± 1,50 mV. Este caráter positivo da superfície do cristal
pode ser correlacionado com a presença principalmente dos íons de Ca2+ presentes
na estrutura do cristal. O citrato de sódio reduziu a positividade da superfície dos
cristais com um potencial zeta de + 7,23 ± 1,58. Todas as frações polissacarídicas
diminuíram drasticamente o potencial zeta dos cristais de CaOX. Na presença de
CP-1.5 e CP-2.0 o ζ teve a menor redução, com valores de -25,06 ± 0,79 mV e -
20,54 ± 2,78 mV, respectivamente. CP-0.5, CP-0.7, CP-0.9 e CP-1.1 tiveram
resultados semelhantes entre si, com uma redução do ζ para uma ordem de -35 mV.
CP-0.3 apresentou a maior redução do ζ, com valores de -41,20 ± 1,05.
100
Tabela 07. Potencial Zeta de cristais formados na presença das frações polissacarídicas da alga C. prolifera à temperatura de 25 ° C.
a, b, c, d Letras diferentes indicam diferença significativa (p
<0,05) de Potencial Zeta entre CaOx e CaOx tratado com cada fração.
Amostras Potencial ζ (mV)
CaOx + 17,43 ± 1,50a
CaOx + Citrato de Sódio + 7,23 ± 1,58b
CaOx + CP-0.3 -41,20 ± 1,05c
CaOx+ CP-0.5 -34,45 ± 2,00d
CaOx + CP-0.7 - 37,28 ± 1,77d
CaOx + CP-0.9 -34,88 ± 0,94d
CaOx + CP-1.1 - 36,28 ± 1,42d
CaOx + CP-1.5 -25,06 ± 0,79e
CaOx + CP-2.0 -20,54 ± 2,78e
Com o intuito de se entender melhor como e onde os polissacarídeos
sulfatados interagem para a modificação da morfologia dos cristais de oxalato de
cálcio, as frações polissacarídicas de C. prolifera foram associadas à um marcador
fluorescente (FITC) (Figura 39).
101
Figura 39. Sequência de cortes transversais, obtidos por microscopia confocal, de cristais de oxalato de cálcio formados na presença de
frações polissacarídicas de C. prolifera. (A) Cristal de oxalato de cálcio do tipo COD formado na presença de CP-0.7+FITC. (1) Cristal do tipo
COD em microscopia de campo claro; (2-9) Sequência de cortes transversais de um cristal do tipo COD de seu ápice (2) até sua base (9). (B) Cristais
do tipo COM formados na presença de CP-1.5+FITC. (1-9) Sequência de cortes transversais de cristais do tipo COM de seus ápices (2) até suas
bases (9).
102
Ao visualizar a Figura 39a verifica-se um cristal do tipo COD formado na
presença de CP-0.7+FITC e em 39b cristais do tipo COM modificados (com bordas
arredondadas) formados na presença de CP-1.5+FITC. Pode-se perceber que os
polissacarídeos estão presentes ao longo de toda estrutura dos cristais, desde o
ápice até a base.
103
4 DISCUSSÃO
O grupo em que se insere esta tese tem se focado, há mais de uma década,
em extrair, caracterizar estruturalmente e avaliar possíveis atividades farmacológicas
de polissacarídeos sulfatados de algas marinhas (ROCHA et al., 2001; ROCHA et
al., 2005a, 2005b; BARROSO et al., 2008; ALMEIDA-LIMA et al., 2010, CAMARA et
al., 2011; COSTA et al., 2012; MELO et al., 2013; FIDELIS et al., 2014). Embora
haja uma grande quantidade de trabalhos disponíveis na literatura acerca de
estudos de bioprospecção de polissacarídeos sulfatados, há ainda uma grande
variedade de algas não estudadas, e que, portanto, não tiveram seus
polissacarídeos sulfatados avaliados em diversos aspectos.
A escolha pela extração e caracterização de polissacarídeos sulfatados da
alga C. prolifera se deu pela necessidade em dar continuidade ao trabalho realizado
por Costa e colaboradores (COSTA et al., 2010), que haviam obtido extratos ricos
em polissacarídeos sulfatados de 11 espécies de algas (incluindo C. prolifera), que
exibiram potenciais atividades anticoagulante, antioxidante e antiproliferativa.
Nesse contexto, espécimes da alga marinha verde Caulerpa prolifera foram
coletados e após processo de extração descrito anteriormente, obteve-se sete
frações (CP-0.3, CP-0.5, CP-0.7, CP-0.9, CP-1.1, CP-1.5 e CP-2.0) que foram
nomeados conforme o volume de acetona necessário para precipitá-las em solução
aquosa.
Com o intuito de se evidenciar a presença de polissacarídeos sulfatados e
sua distribuição ao longo das frações, essas foram submetidas à eletroforese em gel
de agarose e coradas com azul de toluidina (Figura 01). Nesse sistema de
eletroforese, o tampão utilizado apresenta em sua constituição o 1,3-
diaminopropano, que tem suas aminas protonadas em pH 9,0. Esses grupamentos
são capazes de se complexar com os grupos carregados negativamente dos
polissacarídeos, tais como o sulfato. Porém, tal complexação não é simplesmente
dependente da carga absoluta do polissacarídeo sulfatado, mas também da
conformação espacial que a molécula assume no sistema e de como esta favorece a
exposição de seus grupamentos carregados (DIETRICH; DIETRICH, 1976). Devido
as peculiaridades estruturais inerentes a cada polissacarídeo, esses assumem
conformações espaciais únicas, sendo possível individualiza-los com o uso da 1,3-
diaminopropano. Essa metodologia tem se mostrado tão útil para a identificação e
104
caracterização preliminar de polissacarídeos sulfatados, que até polímeros
estruturalmente muito parecidos, como heparina, heparan sulfato, condroitin sulfato
e dermatan sulfato podem ser facilmente diferenciados pelo uso dessa amina
(MEDEIROS et al., 2000), assim como polissacarídeos sulfatados extraídos de uma
mesma espécie de alga (ALBUQUERQUE et al. 2013), inclusive do gênero Caulerpa
(COSTA et al., 2012). O corante azul de toluidina, por ter a capacidade de se
complexar com polissacarídeos sulfatados, foi utilizado para permitir a análise dos
polissacarídeos sulfatados contidos nas frações. Esse corante ao interagir com
polissacarídeos sulfatados passa a exibir uma coloração violácea (JAQUES, 1961).
Ao se analisar a lâmina (Figura 01), pode-se perceber que todas as frações
obtidas a partir de C. prolifera apresentaram um padrão de coloração típico de
compostos sulfatados. Além disso, é possível notar que os polissacarídeos
sulfatados apresentaram um padrão de mobilidade eletroforética diferente, com
exceção de CP-1.5 e CP-2.0.
Com relação à caracterização química das frações polissacarídicas (Tabela
03), foi observado um alto teor de açúcares totais (entre 68,9 a 97,0%) e presença
de sulfato (entre 1,9 a 30,9%) em todas as frações. O baixo teor de sulfato (1,9%)
em CP-0.3 pode explicar a baixa interação dessa fração polissacarídica com o azul
de toluidina (Figura 01). A contaminação proteica (0,3%), assim como a
contaminação por compostos fenólicos (1,2%), foi baixa, quando comparado a
resultados obtidos por Melo e colaboradores (MELO et al., 2013), que obtiveram
valores de contaminação proteica de até 1,6% e fenólica de até 5,0%; por Dietrich e
colaboradores (DIETRICH et al., 1995), que obtiveram valores de até 7,5% de
proteínas; e por Silva e colaboradores que obtiveram frações com níveis de
contaminação proteica variando entre 0,6 e 5,8% (SILVA et al., 2005). Quando
analisados em conjunto, esses dados indicam que a metodologia utilizada durante o
processo de extração dos polissacarídeos foi essencial para a obtenção de baixos
níveis de contaminantes proteicos e fenólicos.
A análise da composição monossacarídica das frações polissacarídicas de C.
prolifera demonstrou que tais moléculas são na sua maioria heteropolímeros, com
ressalvas para aquela encontrada na fração CP-0.9. A presença de
heteropolissacarídeos parece ser algo comum em diferentes gêneros de algas
verdes como evidenciado em Ulva fasciata (SHAO et al., 2013), Enteromorpha
intestinallis (WANG et al., 2014), Capsosiphon fulvescens (KARNJANAPRATUM et
105
al., 2012), e em espécies do gênero Caulerpa como em Caulerpa cupressoides var.
flabellata (COSTA et al. 2012), Caulerpa lentifera (MAEDA et al., 2012), Caulerpa
racemosa (CHATTOPADHYAY et al., 2007) e Caulerpa okamurai (HAYAKAWA et
al., 2000). No entanto, vale ressaltar que homopolissacarídeos, como as galactanas
sulfatadas, também podem ser evidenciadas em algas verdes como observado em
Caulerpa brachypus (HAYAKAWA et al., 2000) e Codium isthmocladum (FARIAS et
al., 2008). A presença de diferentes polissacarídeos sulfatados em uma mesma alga
também é algo comum, ocorrendo inclusive dentro do gênero Caulerpa (COSTA et
al., 2012). Ressalta-se também, que a diversidade estrutural é algo de grande
interesse, uma vez que diferentes moléculas podem atuar em diferentes alvos
bioquímicos e exibir diferentes atividades, aumentando dessa forma o valor
biotecnológico desses biopolímeros.
Na espectroscopia de infravermelho, os sinais ao redor das regiões de 3000-
3400 cm−1 e de 2900-2920 cm−1, encontradas em todas as frações, indicam a
presença de polissacarídeos, uma vez que representam sinais de vibração de
alongamento de ligações O–H e C–H, respectivamente (COSTA el al., 2012; WANG
et al., 2010; CHOPIN et al., 1999). Sinais característicos de polissacarídeos
sulfatados foram encontrados em todas as frações. Foi possível identificar, por
exemplo, sinais ao redor de 805 cm-1 e 905 cm-1 que estão associados a vibrações
da ligação C-O-SO4 (CHOPPIN et al., 1999), assim como sinais ao redor de 815-820
cm-1, 825-830 cm-1 e 705 cm-1 que estão associados a vibração da ligação C-O-SO4
nos carbonos C6, C2 e C4 da galactose (WANG et al., 2010; CHOPIN et al., 1999).
Outros sinais associados a presença de polissacarídeos sulfatados foram
detectados, como os identificados na região de 1220–1235 cm−1 que se referem a
vibração de alongamento de S=O (MELO et al., 2013; WANG et al., 2010) e os
sinais ao redor de 1026 cm−1 que estão associados ao alongamento pseudosimétrico
de O=S=O do grupamento sulfato em C2 e ao redor de 1012 cm−1 de um
grupamento sulfato em C6 (SEKKAL et al, 1993).
A atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados é a mais bem
estudada dentre as propriedades avaliadas para polissacarídeos sulfatados.
A atividade anticoagulante das frações polissacarídicas de C. prolifera já
havia sido relatada anteriormente (RODRIGUES et al., 2012a), no entanto, devido as
diferenças de metodologias de obtenção dos mesmos e da indisponibilidade de mais
dados estruturais, seria impróprio fazer qualquer tipo de comparação entre aqueles
106
polissacarídeos e os que foram obtidos aqui neste trabalho. A atividade
anticoagulante de um extrato rico em polissacarídeos sulfatados obtidos de C.
prolifera através da mesma metodologia de extração já havia sido relatado
previamente por nosso grupo de pesquisa (COSTA et al., 2010). Com base nos
resultados obtidos aqui, com as sete frações polissacarídicas, pode-se perceber que
a atividade anticoagulante do extrato rico em polissacarídeos sulfatados se deveu,
principalmente, a presença de CP-0.9 e CP-1.5 em sua composição, ressaltando-se
que enquanto foram necessários 40 µg do extrato para dobrar o tempo de
coagulação no ensaio de TTPa, obteve-se o mesmo efeito utilizando-se apenas 20
µg de CP-1.5.
Os dados aqui obtidos indicam que os alvos moleculares dos polissacarídeos
sulfatados de C. prolifera residem na via intrínseca e/ou comum da coagulação, uma
vez que se identificou a presença de atividade apenas no ensaio de TTPa. Outra
conclusão importante, e que corrobora com dados da literatura (NGO et al., 2013;
JIAO et al., 2011; COSTA et al., 2012), é a de que a atividade anticoagulante parece
não depender apenas da quantidade de sulfato encontrada nos polissacarídeos
sulfatados, uma vez que frações com menores graus de sulfatação, como CP-0.9,
apresentaram atividades mais pronunciadas do que frações mais sulfatadas como
CP-0.5, CP-0.7, CP-1.1 e CP-2.0. Portanto, outras características como a disposição
desses grupamentos funcionais na estrutura do polissacarídeo, bem como os tipos
de resíduos de carboidratos que constituem os polímeros parecem também ter
influência sobre a atividade anticoagulante desses polissacarídeos.
Os polissacarídeos sulfatados de algas também têm aparecido como
promissores agentes antioxidantes naturais (WIJESEKARA et al., 2011). Ao avaliar a
capacidade antioxidante total das frações de C. prolifera, os valores obtidos variaram
entre 0,2 a 19,4 mg/g de equivalentes de ácido ascórbico (CP-1.5 e CP-0.3,
respectivamente). Esses dados demonstraram que a atividade antioxidante do
extrato rico em polissacarídeos sulfatados obtidos de C. prolifera por Costa e
colaboradores (Costa et al, 2010) reside na presença de CP-0.3 em sua composição
e pode ser considerada uma atividade apreciável, uma vez que Chandini e
colaboradores usando extratos das algas Padina tetrastomatica e Turbinaria
conoides, determinaram uma atividade de 9,79 e 9,65 equivalentes de ácido
ascórbico para essas amostras, valores que foram considerados elevados pelos
autores (CHANDINI et al., 2008). Esse resultado exibido por CP-0.3 se assemelha
107
ao de dois polissacarídeos sulfatados obtidos de Caulerpa cupressoides var.
flabellata, que tiveram uma atividade antioxidante total em torno de 20 equivalentes
de ácido ascórbico (COSTA et al., 2012).
As frações polissacarídicas de C. prolifera apresentaram um baixo potencial
redutor. Na maior concentração avaliada (1,0 mg/mL), o poder redutor variou de
5,1% até 15,6%. Quando o extrato rico em polissacarídeos sulfatados de C. prolifera
foi avaliado por Costa e colaboradores em 2010, esse também exibiu uma baixa
capacidade de doar elétrons, assim como os extratos de outras algas verdes (C.
sertularioides, C. ishtmocladum e C. cupressoides), quando comparados aos
resultados obtidos para os extratos de algas marrons como S. filipendula, D.
delicatula e C. cervicornis, que exibiram um poder redutor entre 90 e 100% na maior
concentração avaliada (COSTA et al., 2010). Ao que parece, o mecanismo
antioxidante de doação de elétrons, avaliado pelo CAT e pelo teste do poder redutor,
parece não ser o principal mecanismo antioxidante pelo qual tais polímeros agem.
Outras atividades antioxidantes avaliadas foram a de sequestro de radicais
superóxido e hidroxila. O ânion superóxido é considerado uma espécie reativa
primária, uma vez que é capaz de gerar derivados reativos por interações diretas
com outras moléculas ou por processos catalisados por metais ou enzimas (VALKO
et al., 2007). O radical hidroxila, por sua vez, possui alta reatividade e sua principal
forma de produção in vivo ocorre por meio da reação de Fenton (VALKO et al.,
2007). Não se identificou, nas frações polissacarídicas de C. prolifera, atividade
frente aos ânions superóxidos e apenas uma baixa capacidade em sequestrar o
radical hidroxila, com atividade variando entre 4,5% (CP-1.1) e 16,5% (CP-0.7),
resultados um pouco melhores aos encontrados com o uso dos extratos ricos em
polissacarídeos sulfatados de C. sertularioides, D. menstrualis, D. mertensis e G.
caudata (COSTA et al., 2010). A ausência ou a presença de baixa atividade no
ensaio de sequestro de radicais hidroxila e superóxido é comum em polissacarídeos
sulfatados extraídos de algas verdes (COSTA, et al 2010; COSTA et al., 2014). Isto
mostra que a eliminação de radicais hidroxila, também não é o principal mecanismo
antioxidante desses polissacarídeos.
Tendo em vista que o principal modo de formação de radicais hidroxilas
ocorre por meio da reação de Fenton, as frações polissacarídicas de C. prolifera
foram avaliadas quanto a capacidade em quelar íons metálicos de ferro e de cobre,
além de sequestrar o peróxido de hidrogênio.
108
Todas as frações de C. prolifera exibiram uma boa capacidade em quelar íons
ferro, com destaque para CP-0.9, que na maior concentração testada (1,0 mg/mL)
foi capaz de quelar 55,8% dos íons. Essa atividade foi duas vezes melhor do que a
apresentada pelo extrato de C. prolifera, avaliado anteriormente (COSTA et al.,
2010). Todas as frações também foram capazes de quelar íons cobre, no entanto,
de uma forma muito mais eficaz, com grande destaque para CP-1.5 e CP-2.0 que
foram capazes de quelar 76,8% e 77,8% dos íons cobre presentes na solução teste.
Ao se avaliar a capacidade de sequestro do peróxido de hidrogênio, novamente
todas as frações exibiram uma boa atividade, com destaque para CP-0.3, CP-0.7 e
CP-0.9 que foram capazes de sequestrar o peróxido de hidrogênio em uma ordem
de até 61%.
Desta forma, apesar das frações polissacarídicas de C. prolifera
apresentarem baixa capacidade em sequestrar o radical hidroxila, a mais potente
das espécies reativas de oxigênio, elas são capazes de evitar a formação destes
radicais por não disponibilizarem precursores (íons metálicos e H2O2) que fazem
parte das duas principais reações responsáveis por sua formação in vivo, as reações
de Fenton e de Haber-Weiss.
Além disso, as frações polissacarídicas por apresentarem este alto poder
quelante, possuem um potencial terapêutico para o tratamento de condições em que
haja depósito excessivo de ferro no organismo, como no caso de condições como
hemocromatose decorrente de transfusões sanguíneas recorrentes, talassemia,
anemia falciforme ou de condições genéticas; ou no caso de acúmulo de cobre,
como na doença de Wilson. Existe uma relativa escassez de fármacos que podem
ser utilizados nessas condições, como a deferoxamina e a penicilamina, e os
mesmos apresentam uma série de efeitos adversos (retinopatia, agranulocitose,
reações de hipersensibilidade, trombocitopenia e síndrome nefrótica), baixa
versatilidade em vias de administração (a deferoxamina não é absorvida pelo trato
gastrointestinal, por exemplo), preços elevados (o tratamento com deferoxamina
pode custar até U$ 20000/anuais) e potencial teratogênico comprovado (como no
uso da penicilamina) (MURRAY et al., 2003; KANWAR et al., 2014).
Diversos autores relatam que a atividade antioxidante dos polissacarídeos
sulfatados está associada ao teor de sulfato nos polímeros (COSTA et al., 2014; QI
et al., 2005a), porém não foi observada essa correlação com os dados descritos aqui
nesta tese, o que leva a proposta de que muito mais importante que o teor de
109
sulfatação, a localização destes grupamentos deve ter um maior efeito sobre esta
condição. Estudos futuros de caracterização estrutural poderão confirmar esta
hipótese.
A atividade imunomodulatória dos polissacarídeos sulfatados de C. prolifera
foi avaliada através da dosagem de nitrito, um subproduto resultante da produção de
óxido nítrico frente à estimulação de macrófagos da linhagem RAW 264.7. Duas
frações polissacarídicas (CP-0.7 e CP-0.9) tiveram uma ação imunogênica bastante
pronunciada, quando utilizadas em suas maiores concentrações (1,0 mg/mL),
aumentando em 162 e 253 vezes, respectivamente, a produção de óxido nítrico,
quando comparadas com o controle negativo. A literatura relata que polissacarídeos
sulfatados, principalmente carragenanas de algas vermelhas, apresentam esse
papel imunoestimulatório (WIJESEKARA et al., 2011). Um dos poucos exemplos
desta atividade com polissacarídeos em algas verdes, é o de SP1, um
polissacarídeo sulfatado obtido da alga Caulerpa lentillifera que foi capaz de
aumentar a produção de óxido nítrico de maneira dose-dependente, alcançando um
máximo de 115 vezes em relação ao controle negativo, na concentração de 5 µg/mL
além de aumentar a expressão de genes relacionados a síntese de citocinas e
atividade fagocítica de macrófagos (MAEDA et al., 2012). Portanto, os resultados
obtidos por CP-0.7 e CP-0.9 são bastante motivadores, uma vez que além de
atribuírem um grande valor biotecnológico a essas duas frações polissacarídeos
ainda se torna um dos poucos relatos de ocorrência de polissacarídeos sulfatados
imunoestimulatórios em algas verdes.
Algumas frações de C. prolifera apresentaram capacidade em reduzir a
produção do óxido nítrico por macrófagos. CP-2.0 destacou-se dentre as demais na
menor concentração avaliada (0,1 mg/mL) por reduzir em 75% o teor de óxido nítrico
produzido, tendo assim uma potencial atividade anti-inflamatória. A busca por
compostos naturais com atividade anti-inflamatória é de grande importância, uma
vez que muitos fármacos sintéticos disponíveis são conhecidos por provocarem
principalmente irritações gastrointestinais (WIJESINGHE et al., 2012).
A atividade antiadipogênica das frações polissacarídicas de C. prolifera
também foi avaliada. Ao analisar os dados, percebe-se que CP-1.5 foi capaz de
reduzir em 65% a diferenciação adipocitária. Esse é o primeiro relato de
polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade antiadipogênica. Além
disso, comparando aos dados disponíveis na literatura, CP-1.5 possui um dos mais
110
potentes efeitos anti-adipogênicos já documentados para polissacarídeos sulfatados.
Anteriormente, apenas fucoidans obtidos de diferentes algas marrons tiveram tal
atividade. Em 2009, pesquisadores relataram que um fucoidan comercial foi capaz
de reduzir a incorporação de Oil Red por adipócitos em até 39,7% na concentração
de 0,2 mg/mL (KIM et al., 2009). Posteriormente, utilizando outro fucoidan comercial
Kim e colaboradores obtiveram resultados de redução em até 52,4% da formação de
vesículas lipídicas por adipócitos utilizando 0,2 mg/mL de amostra (KIM et al., 2010).
Esses resultados foram semelhantes aos obtidos por um outro grupo de pesquisa
utilizando um fucoidan comercial adquirido da mesma empresa (PARK et al., 2012).
Recentemente, Kim e colaboradores utilizando um fucoidan obtido do esporofilo de
Undaria pinnatifida obtiveram redução de até 71% da formação de vesículas de
gordura por adipócitos. Além disso, esse fucoidan foi capaz de reduzir a formação
de espécies reativas do oxigênio e de diminuir a expressão de genes relacionados a
inflamação pelas células da linhagem 3T3-L1 (KIM et al., 2012). Desta forma, CP-1.5
demonstrou ser um promissor agente anti-adipogênico e a investigação dos
mecanismos moleculares pelos quais atua, inibindo a diferenciação adipocitária,
estão sendo investigados.
O efeito anti-adipogênico além de ter um papel na prevenção da obesidade e
de suas condições associadas discutidas anteriormente, ainda pode ter um efeito
indireto sobre a prevenção da osteoporose, condição que afeta principalmente as
mulheres devido aos desequilíbrios hormonais associados a menopausa (DRAKE et
al., 2015). Uma vez que os adipócitos e os osteoblastos têm origem a partir de uma
mesma célula mesenquimal (MIGLIACCIO et al., 2011), fatores que inibam a
adipogênese são capazes de estimular a osteogênese e vice-versa (LIMA, 2012).
Alguns autores relatam que, através da síntese de citocinas pró-inflamatórias como
IL-6 e TNF-α, os adipócitos aumentam a atividade dos osteoclastos, levando a um
aumento da desmineralização óssea, enquanto simultaneamente estimulam ainda
mais a adipogênese (MIGLIACCIO et al, 2011; LIMA, 2012). Porém esta associação
entre obesidade e osteoporose ainda apresenta alguns pontos controversos, e
estudos a longo termo são necessários para que ocorra uma melhor compreensão
desta correlação (HOLECKI et al., 2011; LIMA, 2012).
O Câncer será uma causa cada vez maior de morbidade e mortalidade nas
próximas décadas, em todas as regiões do mundo. A estimativa de incidências de
novos casos de câncer que foi de 12,7 milhões em 2008 tende a crescer para 21,4
111
milhões até 2030, e esse crescimento é algo inevitável haja visto o aumento da
expectativa de vida da população mundial associado a dificuldade em sua
prevenção (WHO, 2011).
O tratamento de câncer através do uso de quimioterápicos está associado a
uma série de efeitos adversos como fadiga, queda de cabelo e neutropenia, que
acabam por diminuir drasticamente a qualidade de vida de portadores desta
condição (LOFTI-JAM et al., 2008). Com isto, tem se intensificado a busca por
compostos naturais que sejam capazes de impedir a proliferação de células tumorais
com nenhum ou com efeitos adversos mínimos. Além disso, a identificação de novos
agentes com um papel quimiopreventivo, como os antioxidantes, pode se tornar uma
estratégia preventiva para o desenvolvimento de cânceres (WIJESEKARA et al.,
2011). Dentro desse contexto, os polissacarídeos sulfatados de algas marinhas têm
aparecido como alternativas importantes para o tratamento e prevenção do câncer,
uma vez que tem se atribuído propriedades antiproliferativas e antioxidantes a esses
compostos (DORE et al., 2013; NGO et al., 2013; COSTA et al., 2011a).
Para a linhagem tumoral HeLa, apenas CP-0.3 e CP-1.5 em suas maiores
concentrações avaliadas exibiram discreta toxicidade nas primeiras 24 horas de
exposição. No entanto, após 48 horas de tratamento, todas frações apresentaram
influência sobre a viabilidade celular. CP-0.3, CP-0.5, CP-0.7 e CP-0.9, merecem
destaque, uma vez que nas menores concentrações (0,1 mg/mL e 0,25 mg/mL),
reduziram em cerca de 40% a viabilidade celular. Redução da viabilidade celular em
torno de 55% ocorreu nos tratamentos com as maiores concentrações de CP-0.3 e
CP-0.5, assim como para CP-0.9 na concentração de 1,0 mg/mL. CP-1.1 e CP-1.5
também apresentaram citotoxicidade na concentração de 1,0 mg/mL em torno de
45%. Desta forma, o efeito antiproliferativo dos polissacarídeos sulfatados de C.
prolifera sobre a linhagem HeLa se mostrou ser tempo e dose dependente,
excetuando-se CP-2.0 que não teve nenhum efeito sobre a viabilidade das duas
linhagens tumorais avaliadas.
Para a linhagem tumoral renal 786-0 (Figura 10), de maneira geral os
polissacarídeos de C. prolifera já apresentam uma atividade antiproliferativa
apreciável com 24 horas de tratamento, excetuando-se CP-0.7, e com grande
destaque para CP-1.5 que em sua maior concentração chega a reduzir em 75% a
viabilidade dessa linhagem tumoral. Com 48 horas de tratamento há uma queda
considerável da viabilidade celular ao se utilizar a concentração máxima dos
112
polissacarídeos, excetuando-se CP-0.9 e CP-2.0, e destacando-se CP-1.5 com
redução de 65% de viabilidade celular. CP-0.3 e CP-0.5 com redução de 60% da
viabilidade celular, e CP-0.7 e CP-1.1 com 50% também merecem destaque.
Este é apenas o terceiro relato na literatura de polissacarídeos sulfatados de
algas verdes com atividade antiproliferativa, e os dois relatos anteriores envolviam
espécies do gênero Caulerpa (COSTA et al., 2010; JI et al., 2008). Em conjunto com
os resultados obtidos para a atividade antioxidante, conclui-se que as frações de C.
prolifera podem agir em duas frentes no combate ao câncer, quais sejam:
prevenindo o surgimento de mutações no DNA decorrentes da ação de radicais
livres e tendo um efeito citotóxico sobre células alteradas.
As frações polissacarídicas de C. prolifera não tiveram atividade citotóxica
contra Leishmania amazonenses, no entanto, as frações polissacarídicas poderiam
atuar de uma forma indireta sobre esses parasitas. Em seu ciclo de vida em
mamíferos, as formas amastigotas desse parasita, infectam preferencialmente
macrófagos sendo capazes de resistirem à ação microbicida das hidrolases ácidas,
multiplicando-se por divisão binária, até causar a lise destas células, sendo então
fagocitadas por outros macrófagos. Desta forma, o controle do crescimento
intracelular da Leishmania em macrófagos depende, fundamentalmente, da ação de
óxido nítrico (NO) (PEREIRA, 2012). Assim, substâncias que estimulem a produção
de óxido nítrico pelos macrófagos podem ser úteis no combate a Leishmania, e
estudos futuros poderão confirmar se estes efeitos ocorrem em modelos
experimentais adequados. Como vimos anteriormente, CP-0.7 e CP-0.9 tiveram uma
ação imunogênica bastante pronunciada, aumentando em 162 e 253 vezes,
respectivamente, a produção de óxido nítrico por macrófagos, quando utilizados em
suas maiores concentrações. Desta forma, tais frações poderiam apresentar um
efeito benéfico indireto no controle da infecção de macrófagos por amastigotas de
Leishmania.
As frações de C. prolifera não apresentaram atividade frente a bactéria
multirresistente Klebsiella pneumoniae Carbapenemase e apenas CP-1.5 foi capaz
de agir contra S. epidermidis. Este é apenas o terceiro relato de polissacarídeos
sulfatados de algas contra essa bactéria Gram positiva envolvida em infecções
hospitalares. Anteriormente apenas Sebaaly e colaboradores haviam descrito
polissacarídeos sulfatados (uma carragenana e uma galactana extraídas da alga
113
vermelha do gênero Corallina) com este tipo de atividade bactericida (SEBAALY et
al., 2014).
Atualmente, os principais tratamentos de cálculos urinários são os diuréticos
tiazídicos, citrato, ortofosfato, alopurinol e as preparações de magnésio. Entretanto,
os mecanismos de ação pelos quais estes compostos agem não são totalmente
entendidos e seus efeitos curativos não são tão efetivos. Portanto, o
desenvolvimento de alternativas mais eficientes, pouco onerosas e não tóxicas para
a prevenção e o tratamento da urolitíase é de grande relevância medica (OUYANG
et al., 2010). Com base nesse contexto, alguns autores têm relatado nos últimos
anos, a ação de glicosaminoglicanos e polissacarídeos sulfatados de algas como
agentes inibitórios na formação de cálculos de oxalato de cálcio (FUJISAWA et al.,
1992; RAJESWARI et al., 2006; ESCOBAR et al., 2007; ZHANG et al., 2012; MELO
et al., 2013).
Ao analisar a Figura 38, é possível perceber que todas as frações
polissacarídicas de C. prolifera tiveram influência sobre a formação dos cristais de
oxalato de cálcio, seja alterando a morfologia/tipo de cristais (COM, COD ou COT), o
seu tamanho ou ainda a quantidade de cristais formados.
CP-0.3, CP-0.5 e CP-1.1 proporcionaram apenas a formação de cristais de
oxalato de cálcio do tipo dihidratado (COD) de tamanho bastante reduzido, com
aproximadamente 1 µm, tamanho cerca de 5 vezes menor que os COD formados no
controle negativo e nas amostras contendo citrato de sódio. Este tamanho é 200
vezes menor do que o tamanho necessário para obstruir um néfron (SELVAN,
2002). As imagens 38E, 38F e 38G também chamam a atenção pela quantidade de
cristais formados, que foi cerca de 20 vezes maior na presença de CP-0.3 e 40
vezes maior na presença de CP-0.5 e CP-1.1, quando comparadas ao controle
negativo. CP-2.0 também foi capaz de induzir a formação de cristais do tipo COD
(cerca de 10 vezes mais do que o controle negativo) de pequeno tamanho
(aproximadamente 1,5 µm). Tais amostras, portanto, aumentam a nucleação dos
cristais, no entanto impedem sua agregação. Resultados semelhantes foram obtidos
por Escobar e colaboradores, que trabalhando com compostos sulfatados (dermatan
sulfato, heparina hipersulfatada e queratan sulfato) e fosforilados (quitosana
fosforilada) perceberam que tais moléculas não inibiam a cristalização de cristais de
oxalato de cálcio, mas mostraram um efeito protetor contra a formação de cálculos
renais por estabilizar as formas dihidratadas (COD) em detrimento das formas
114
monohidratadas (COM), que são mais prejudiciais (ESCOBAR et al., 2007). Shum e
colaboradores, ao analisar o processo de formação de cristais na presença de
condroitin sulfato e heparan sulfato, notaram que tais compostos eram promotores
da nucleação de cristais de oxalato de cálcio, no entanto eles poderiam atuar na
prevenção da urolitíase por impedir o crescimento dos cristais, fazendo com que
eles fossem excretados com uma maior facilidade (SHUM et al., 1993).
A influência sobre o tamanho e quantidade de cristais de oxalato formados na
presença de polissacarídeos de algas marinha foi recentemente relatado por dois
grupos de pesquisa. Zhang e colaboradores, analisando um polissacarídeo da alga
marrom Sargassum graminifolium perceberam que o polímero inibia tanto a
nucleação de cristais (inibição de 69,2%), e consequentemente o número de cristais
formados, quanto a agregação (inibição de 76,8%), que está associada com o
aumento do tamanho dos cristais (ZHANG et al., 2012). Resultados semelhantes
foram relatados por Melo e colaboradores, que obtiveram polissacarídeos sulfatados
da alga marrom Dictyopteris justii capazes de reduzir tanto a nucleação (em até
84,1%) quanto a agregação (em até 86%). Algumas amostras (DJ-0.5 e DJ-1.2)
ainda foram capazes de estabilizar os cristais sobre a forma COD, e outras (DJ-0.3 e
DJ-0.4) alteraram a morfologia de cristais do tipo COM em suas “faces 120”, assim
como CP-1.5 em nosso trabalho, produzindo cristais com arestas mais arredondas,
que são mais fáceis de serem excretados (MELO et al. 2013).
Escobar e colaboradores, no mesmo trabalho citado anteriormente, ainda
foram capazes de estabelecer uma relação entre a estrutura dos compostos
estudados com o processo de estabilização de cristais do tipo COD. Os autores ao
utilizarem compostos não sulfatados (dermatan desulfatado, ácido hialurônico e
quitosanas de baixa e alto peso molecular), perceberam que o processo de
cristalização ocorria de forma semelhante ao exibido pelo controle negativo, ou seja,
sob a forma de grandes quantidades de cristais do tipo COM. Este mesmo resultado
foi obtido quando eles utilizaram o ácido polimetilsulfonico (PMSA). Tais resultados
levaram a crer que o efeito sobre a cristalização de cristais de oxalato de cálcio, não
é unicamente um efeito de cargas, mas também de como estas cargas estão
distribuídas na molécula (ESCOBAR et al., 2007). Esta conclusão também foi
perceptível em nosso trabalho, uma vez que CP-1.5, mesmo sendo uma das
amostras mais sulfatadas, permitiu a formação de cristais do tipo COM em
115
quantidades próximas ao do controle negativo, condição oposta a apresentada pelas
demais amostras.
Segundo a literatura, outros fatores que proporcionam mudanças no processo
de cristalização do oxalato de cálcio são: a topologia do cristal e a interação entre o
poliânion e as faces do cristal (MELO et al., 2013). Como mostrado na Figura 18, os
cristais apresentam faces diferentes que possuem regiões com maior predominância
de Ca2+ ou oxalato. Substâncias como a Osteopontina e o Citrato tem preferência
por áreas da face 101 dos cristais, região onde há maior exposição de íons Ca2+
(QIU et al., 2003; GROHE et al., 2007; GROHE et al., 2011).
Com o intuito de melhor entender como os polissacarídeos sulfatados,
presentes nas frações de C. prolifera, atuam sobre a modificação da morfologia dos
cristais de oxalato de cálcio realizou-se a análise do potencial zeta (ζ) dos cristais
formados, além de uma microscopia confocal utilizando-se frações marcadas com
FITC.
O potencial zeta (ζ) é uma medida da carga total da superfície de partículas
(inclusive moléculas) e reflete a estabilidade eletrostática de uma solução, sendo
valores de ζ superiores a +/- 30 mV consideráveis ideais para que tal solução seja
estável, devido as repulsões eletrostáticas (ANDRADE, et al., 2008).
Na Tabela 07 estão expostos os potenciais ζ dos cristais formados na
presença ou ausência do tratamento com as frações de C. prolifera. O caráter
positivo (+17,43 mV) dos cristais de oxalato de cálcio formados sem a presença dos
polissacarídeos se deve pela presença de íons Ca2+. Quando os polissacarídeos
sulfatados foram utilizados, todos foram capazes de diminuir, em diferentes graus, o
potencial zeta dos cristais de CaOx. Tal diminuição pode ser explicada pela
interação destes polissacarídeos com os íons Ca2+ presentes na superfície dos
cristais. Além disso, na presença de 5 frações (CP-0.3, CP-0.5, CP0.7, CP-0.9 e CP-
1.1) o potencial ζ se manteve inferior a -30 mV, valores que indicam grande
estabilidade das partículas formadas, e pode explicar o tamanho reduzido dos
cristais formados, uma vez que está alta carga negativa aumenta a repulsão entre as
partículas, impedindo o processo de agregação dos cristais. Ainda analisando a
Tabela 06, pode parecer um contrassenso a fração menos sulfatada (CP-0.3)
apresentar os cristais com potencial ζ mais negativo, no entanto, segundo Melo e
colaboradores, o ζ também reflete o quanto a conformação que a molécula assume,
“expondo” ou “escondendo” as cargas da molécula, assume em determinada
116
solução (MELO et al., 2013). Assim, CP-0.3, nesta solução, parece assumir uma
conformação que expõe muito mais suas cargas negativas, contribuindo para um
potencial zeta tão negativo.
Ao analisar a formação dos cristais utilizando frações de C. prolifera
associadas ao FITC (Figura 39), pode-se perceber que os polissacarídeos não estão
presentes apenas na superfície dos cristais formados, impedindo seu crescimento,
mas também no interior dos mesmos. Qui e colaboradores, demonstraram
anteriormente que durante o crescimento desses cristais ocorre uma deposição
gradual de íons formando camadas (QUI et al., 2003). Assim, analisando a
sequência de imagens da microscopia confocal, parece que os polissacarídeos
sulfatados de C. prolifera se intercalam nessas camadas, interferindo na morfologia
dos cristais formados, estabilizando a forma COD ou então tornando as arestas dos
cristais COM mais arredondadas.
As frações polissacarídicas de C. prolifera podem, portanto, agir de duas
formas na contenção dos danos ocasionados pelos cálculos renais, quais sejam:
primeiramente elas alteram a morfologia de cristais de oxalato de cálcio,
favorecendo a formação de cristais diminutos do tipo COD, menos danosos e mais
facilmente excretados; além disso, as frações polissacarídicas apresentam uma
atividade antioxidante que pode atuar na prevenção de danos a membrana de
células renais, condição que também favorece a formação de cálculos renais.
Os resultados obtidos com este trabalho demonstram que as frações ricas em
polissacarídeos sulfatados da alga verde C. prolifera possuem um potencial
farmacológico multiterapêutico, uma vez que apresentaram resultados promissores
como agentes anticoagulantes, antioxidantes, imunomodulatórios, anti-adipogênicos,
antiproliferativos, microbicidas, efeitos benéficos sobre a formação de cristais de
oxalato de cálcio. Passos posteriores de purificação e de caracterização estrutural
desses polissacarídeos sulfatados, bem como estudos de investigação dos
mecanismos de ação pelos quais estes polímeros agem, devem ser realizados.
117
REFERÊNCIAS
ABROL, N.; K. et al. Revisiting Randall’s plaque. African Journal of Urology, [S.l.], v. 20, p. 174-179, 2014. ADAMS, R. L. C.; BIRD, R. J. Coagulation cascade and therapeutics update: relevance to nephrology. Part 1: Overview of coagulation, thrombophilias and history of anticoagulants. Nephology, [S.l.], v. 14, p. 462-470, 2009. ADL, S. M. et al. The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists. The Journal of Eukaryotic Microbiology, [S.l.], v. 52, n. 5, p. 399-451, 2005. ADL, S. M. et al. The revised classification of eukaryotes. The Journal of Eukariotic Microbiology, [S.l.], v. 59, n. 5, p. 429-493, 2012. AISA, Y. Fucoidan Induces Apoptosis of Human HS-Sultan Cells Accompanied by Activation of Caspase-3 and Down-Regulation of ERK Pathways. American Journal of Hematology, [S.l.], v. 78, p. 7-14, 2005. ALBUQUERQUE, I. R. L. et al. Evaluation of anti-nociceptive and anti-inflammatory activities of a Heterofucan from Dictyota menstrualis. Marine Drugs, [S.l.], v. 11, 2722-2740, 2013. ALFADDA, A.; SALLAM, R. Reactive Oxygen Species in Health and Disease. Journal of Biomedicine and Biotechnology, [S.l.], v. 2012, p.1-14, 2012. ALMEIDA-LIMA, J. et al. Evaluating the possible genotoxic, mutagenic and tumor cell proliferation-inhibition effects of a non-anticoagulant, but antithrombotic algal heterofucan. The Journal of applies toxicology, [S.l.], v. 30, 708-715, 2010. AMORIM, R. N. et al. Antimicrobial Effect of a Crude Sulfated Polysaccharide from the Red Seaweed Gracilaria ornata. Brazilian archives of biology and technology, [S.l.], v. 58, n. 2, p. 171-181, 2012. ANDRANDE, J. E. Medidas de Tamanho e Potencial Zeta de Nanopartículas Utilizando Espalhamento de Luz, [S.l.]: Universidade Federal do Sergipe, 2008. AQUINO, R. S. et al. Occurrence of sulfated galactans in marine angiosperms: evolutionary implications. Glycobiology, [S.l.], v. 15, p. 11-20, 2005.
118
ATASHRAZM, F. et al. Fucoidan and Cancer: A Multifunctional Molecule with Anti-Tumor Potential. Marine Drugs, [S.l.], v. 13, p. 2327-2346, 2015. ATHUKORALA, Y. et al. Antiproliferative activity of sulfated polysaccharide isolated from an enzymatic digest of Ecklonia cava on the U-937 cell line. Journal of Applied Phycology., [S.l.], v. 21, p. 307-314, 2009. BALDAN, B. et al. Cellulose in algal cell wall : an “in situ” localization. European Journal of Histochemistry, [S.l.], v. 45, 51-56, 2001. BALISTRERI, C. R.; CARUSO, C.; CANDORE, G. The Role of Adipose Tissue and Adipokines in Obesity-Related Inflammatory Diseases. Mediators of Inflammation, [S.l.], v. 2010, p. 1-19, 2010. BARAHONA, T. et al.. Antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from seaweeds. A kinetic approach. Food Hydrocolloids, [S.l.], n. 25, p. 529-535, 2011. BARROSO, E. M. A. et al. A non anticoagulant heterofucan has antithrombotic activity in vivo. Planta Medica, [S.l.], v. 74, p. 712-718, 2008. BARTZ, R. R.; PIANTADOSI, C. A. Clinical review: Oxygen as a signaling molecule. Critical Care, [S.l.], v.14, p 234-243, 2010. BASAVARAJ, D. R. The Role of Urinary Kidney Stone Inhibitors and Promoters in the Pathogenesis of Calcium Containing Renal Stones. European Journal of Urology, [S.l.], v., p. 126-136, 2007. BAST, F. An illustrated review on cultivation and life history of agronomically important seaplants. In: POMIN, Vitor Hugo (Ed.) Seaweed: mineral Composition, Nutritional and Antioxidant Benefits and Agricultural Uses,. New York: Nova Publishers, 2014. p. 39-70. BOGO, D. Avaliação Da Atividade Antitumoral In Vitro E In Vivo De Compostos De Liquens. 2012. f 110. Tese (Doutorado em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro-Oeste) - Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. Campo Grande, MS, 2012.
119
BOO, H.J. et al. Fucoidan from undaria pinnatifida induces apoptosis in a549 human lung carcinoma cells. Phytotherapy Research, [S.l], v. 25, p. 1082-1086, 2011. BOUHLAL, R. et al. Antiviral activities of sulfated polysaccharides isolated from Sphaerococcus coronopifolius (Rhodophytha, Gigartinales) and Boergeseniella thuyoides (Rhodophyta, Ceramiales). Marine Drugs, [S.l.], v. 9, p. 1187-1209, 2011. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, V.72, p. 248-256, 1976. BRAY, G. A. Medical therapy for obesity. Mount Sinai Journal of Medicine, [S.l.], v. 77, p. 407-417, 2010. BURRITT, D. J.; LARKINDALE, J.; HURD, C. L. Antioxidant metabolism in the intertidal red seaweed Stictosiphonia arbuscula following desiccation. Planta, [S.l.], v. 215, p. 829-838, 2002. CABRERA-CONTRERAS, R. et al. Antibiotic Resistance and Biofilm production inStaphylococcus epidermidis Strains, Isolated from a Tertiary Care Hospital in Mexico City. ISRN Microbiology, [S.l.], v. 2013, p. 1-5, 2013. CAMARA, R. B .G. et al. Heterofucans from the Brown Seaweed Canistrocarpus cervicornis with Anticoagulant and Antioxidant Activities. Marine Drugs, [S.l.], v. 9, p. 124-138, 2011. CAMARA, R. B. G.; OLIVEIRA, R. M.; ROCHA, H. A. O. Polysaccharides obtained from marine organisms in obesity control. In Marine Medicinal Glycomics. New York: Nova Science Publishers, 2013, p. 79-94. CARDOZO, K. H. M. et al. Metabolites from algae with economical impact. Comparative biochemistry and physiology, [S.l.], v. 146, 60-78, 2007. CARNEIRO, J. G. et al. Peripheral antinociception and anti-inflamatory effects of sulphated polysaccharides from the alga Caulerpa mexicana. Basic and Clinical, Pharmacology and Toxicology, [S.l.], v. 115, n. 2, 2014. CASU, B.; NAGGI, A; TORRI, G. Re-visiting the structure of heparina. Carbohydrate research, [S.l.], v. 403. p. 60-68, 2015.
120
CHANDINI, S. K.; GANESAN, P.; BHASKAR, N. In vitro antioxidante activities of three selected brown seaweeds of India. Food Chem, [S.l.], n. 107, p. 707-713, 2008. CHARGAFF, E.; BANCROFT, F. W.; STANLEY-BROWN, M. Studies on the chemistry of blood coagulation. I. The measurement of the inhibition of blood clotting. Methods and units. Journal of Biological Chemistry, [S.l.], v. 115, p. 6-8, 1936. CHATTOPADHYAY, K. et al. Polysaccharides from Caulerpa racemosa: Purification and structural features. Carbohydrate polymers, [S.l.], v. 68, 407-415, 2007. CHEN, P. et al. Review of the biological and engineering aspects of algae to fuels approach. International Journal of Agricultural and Biology, [S.l.], v. 2, n. 4, 1-30, 2009. CHENG, J. J. Characterization and biological functions of sulfated polysaccharides from sulfated-salt treatment of Antrodia cinnamomea. Process Biochemistry, [S.l.], v. 44, 453-459, 2009. CHOPIN, T.; KERIN, B. F.; MAZEROLLE, R. Phycocolloid chemistry as a taxonomic indicator of phylogeny in the Gigartinales, Rhodophyceae: A review and current developments using Fourier transform infrared diffuse reflectance spectroscopy. Phycological Research, [S.l.], v. 47, p. 167-188, 1999. CONTRERAS-PORCIA, L. et al. Tolerance to oxidative stress induced by desiccation in Porphyra columbina (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Experimental Botany, [S.l.], v. 62, n. 6, p 1815-1829, 2011. COSTA, L. S. et al. Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds. Biomedicine & Pharmacotherapy, [S.l.], v. 64, p. 21-28, 2010. COSTA, L. S. et al. Heterofucan from Sargassum filipendula Induces Apoptosis in HeLa Cells. Marine Drugs, [S.l.], v. 9, p. 603-614, 2011. COSTA, M. S. S. P. Et al. Evaluating the possible anticoagulant and antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga Caulerpa cupressoides var. flabellata. Journal of Applied Phycology, [S.l.], v. 24, 1159-1167, 2012.
121
COSTA, M. S. S. P.; et al. Antioxidant sulfated polysaccharides from seaweed. In: POMIN, Vitor Hugo (Ed.). Seaweeds: agricultural uses, biological and antioxidants agents. New York: Nova Science Publishers, 2014. p. 189-208. CUMASHI, A. et al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds. Glycobiology, [S.l.], v. 17, p. 541-552, 2007. DANTAS-SANTOS, N. et al. Freshwater Plants Synthesize Sulfated Polysaccharides: Heterogalactans from Water Hyacinth (Eicchornia crassipes). International Journal of Molecular Sciences, [S.l.], v. 13, 961-976, 2012. DAUDON, M.; BAZIN, D.; LETAVERNIER, E. Randall’s plaque as the origin of calcium oxalate kidney stones. Urolithiasis, [S.l.], v. 43, p. 5-11, 2015. DAVIE, E.; RATNOFF, O. D. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. Science, [S.l.], v. 145, p. 1310-1312, 1964. DAWSON, C. H.; TOMSON, C. R. V. Kidney stone disease: pathophysiology, investigation and medical treatment. Clinical Medicine, [S.l], v. 12, n.5, p. 467-471, 2012. DE CATERINA, R. et al. Parenteral anticoagulants in heart disease: Current status and perspectives (Section II). Thrombosis and Haemostasis, [S.l.], v.109, p. 789-796, 2013. DENIAUD-BOUET, E. et al. Chemical and enzymatic fractionation of cell walls from Fucales: insights into the structure of the extracellular matrix of brown algae. Annals of Botany, [S.l.], p.1-14, 2014. DIETRICH, C. P. et al. A new approach for characterization of polysaccharides from algae: Presence of four main acidic polysaccharides in three species of the class Phaeophycea. Plant Science, [S.l.], v. 108, p. 143-153, 1995. DIETRICH, C. P.; DIETRICH, S. M. Electrophoretic behaviour of acidic mucopolysaccharides in diamine buffers. Analytical Biochemistry. [S.l.], v. 70, n. 2, p. 645-647, 1976.
122
DOBROVOLSKY, A. B.; TITAEVA, E. V. The Fibrinolysis System: Regulation of Activity and Physiologic Functions of Its Main Components. Biochemistry, [S.l.], v. 67, n. 1, p. 99-108, 2002. DODGSON, K. S.; PRICE, R. G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides. Biochemistry Journal, [S.l.], v. 84, p. 106-110, 1962. DORE, C. M. P. G. et al. Antiangiogenic activity and direct antitumor effect from a sulfated polysaccharide isolated from seaweed. Microvascular Research, [S.l.], v. 88, p. 12-18, 2013. DUBOIS, M. et al. Colorimetric method for determination of sugars, and related substances. Analytical Chemistry, [ S.l.], v. 28, n. 3, p. 350-356, 1956. ERMAKOVA, S. et al. Fucoidans from Brown Seaweeds Sargassum hornery, Eclonia cava, Costaria costata: Structural Characteristics and Anticancer Activity. Applied Biochemistry and Biotechnology, [S.l], v. 164, p.841-850, 2011. ESCOBAR, Carla et al. Role of Sulfated Macromolecules in Urinary Stone Formation. Biomineralization: From Paleontology to Materials Science, [S.l.], p. 343-358, 2007. EVAN, A. P. Physiopathology and etiology of stone formation in the kidney and the urinary tract, Pediatric Nephrology, [S.l.], v. 25,n. 5, p. 831-841, 2010. FARIAS, E. H. et al., A preponderantly 4-sulfated, 3-linked galactan from the green alga Codium isthmocladum, Glycobiology, [S.l.], v. 3, p. 250-259, 2008. FARMER, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism, [S.l.], v. 4, n. 4, p. 263-273, 2006. FERNANDES-QUEIROZ, M. et al. Does the Use of Chitosan Contribute to Oxalate Kidney Stone Formation? Marine Drugs, [S.l.], v. 13, p. 141-158, 2015. FEVÈ, B. Adipogenesis: cellular and molecular aspects. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, [S.l.], v. 19, n. 14. p. 483-499, 2005.
123
FIDELIS, G. L. et al. Proteolysis, NaOH and Ultrasound-Enhanced Extraction of Anticoagulant and Antioxidant Sulfated Polysaccharides from the Edible Seaweed, Gracilaria birdiae. Molecules (Basel. Online), [S.l.], v. 19, p. 18511-18526, 2014. FONG-NGERN, K. et al. Large-scale Identification of Calcium Oxalate Monohydrate Crystal-binding Proteins on Apical Membrane of Distal Renal Tubular Epithelial Cells. Journal of proteome research, [S.l.], v. 10, p. 4463-4477, 2011. FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA) Proposal to Encourage the reintroduction of Bovine Heparin to the US Market. Disponível em: < http://www.fda.gov/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/ScienceBoardtotheFoodandDrugAdministration/ucm399395.htm>. Acesso em: 7 jul. 2015. FOULADVAND, M. et al. Evaluation of in vitro anti-Leishmanial activity of some brown, green and red algae from the Persian Gulf. European Review for Medical and Pharmacological Sciences, [S.l.], v. 15, p. 597-600, 2011. FUJISAWA, M.; ARIMA, S.; YACHIKU, S. A study of inhibitory effect of chondroitin polysulfate on stone formation of calcium oxalate. Nihon Hinyokika Gakkai Zasshi. [S.l.], v. 83, n. 10, p. 1647-1654, 1992. GADENNE, V. et al. Antiadhesive activity of ulvan polysaccharides covalently immobilized onto titanium surface. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, [S.l.], v. 112, p. 229-236, 2013. GHOSH et al. Focus on antivirally active sulfated polysaccharides: from structure-activity analysis to clinical evaluation. Glycobiology, [S.l.], v.19, p. 2-15, 2009. GRASES, F.; MILLAN, A.; CONTE, A. Production of calcium oxalate monohydrate, dihydrate or trihydrate: A comparative study. Urological research, [S.l.], v. 18, p. 17-20, 1990. GRASES, F.; GENESTAR, C.; MILLAN, A. The influence of some metallic ions and their complexes on the kinetics of crystal growth of calcium oxalate.Journal of Crystal Growth, [S.l.], v. 94, n. 2, p. 507-512, 1989. GRAY, E.; HOGWOOD, J.;MULLOY, B. Heparin - A Century of Progress. Handbook of Experimental Pharmacology, [S.l.], v. 207, p. 43-61, 2012.
124
GRAY, E.; MULLOY, B.; BARROWCLIFFE. Heparin and low-molecular-weight heparina. Thrombosis and Haemostasis, [S.l.], v. 99, p. 807-818, 2008. GREGOIRE, F. M. Adipocyte Differentiation: From Fibroblast to Endocrine Cell. Experimental Biology and Medicine, [S.l.], v. 226, p. 997-1002, 2001. GROHE, B. et al. Control of Calcium Oxalate Crystal Growth by Face-Specific Adsorption of an Osteopontin Phosphopeptide. Journal of American Chemistry Society, [S.l.], v. 129, p. 14946-14951, 2007. GROHE, Bernd et al. Citrate modulates calcium oxalate crystal growth by face-specific interactions. Cells Tissues Organs, [S.l.], v. 194, n. 2-4, p. 176-181, 2011. GUIRY, M. D.; GUIRY, G. M. Algaebase versão 4.2. World-wide electronic Publication. National University of Ireland. Galway, Ireland. Disponível em: <http:/www.algaebase.org, 2014>. Acessp em: 20 ago. 2015. GUPTA, N. et al. Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae: Epidemiology and Prevention. Healthcare epidemiology, [S.l.], v. 53, p. 60-67, 2011. HANAHAN, D.; Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell, [S.l.], n. 144, p. 646-674, 2011. HASSAN, S. et al. Improvement of lipid profile and antioxidant of hypercholesterolemic albino rats by polysaccharides extracted from the green alga Ulva lactuca Linnaeus. Saudi Journal of Biological Sciences, [S.l.], v. 18, p. 333-340, 2011. HAYAKAWA, Y. et al.. Inhibition of thrombin by sulfated polysaccharides isolated from green algae. Biochimica et Biophysica Acta, [S.l.], v. 1543, p. 86-94, 2000. HESS, B. et al. Citrate determines aclcium oxalate crystallization kinectics and Crystal morphology – studies in the presence of Tamm-Horsfall protein of a healthy subject and a severely recurrent calcium stone former. Nephrology dialysis transplantation, [S.l.], v. 15, p. 366-376. 2000. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA. Estimativa 2014: incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro: INCA, 2014.
125
ITO, N.; FUKUSHIMA, S.; TSUDA, H. Carcinogenicity and modification of the carcinogenic response by BHA, BHT, and other antioxidants. Critical Reviews in Toxicology, [S.l.], v. 15, n. 2, p. 109-150, 1985. JAMESON, J. L.; LOSCALZO, J. Nefrologia e distúrbios ácidos básicos de Harrison. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. JAQUES, L. B. Heparin and the mast cell: panel discussion. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, [S.l.], v. 39, n. 3, p. 643-651, 1961. JI, H. et al.Separation of the Polysaccharides in Caulerpa racemosa and Their Chemical Composition and Antitumor Activity. Journal of Applied Polymer Science, [S.l.], v. 110, p. 1435-1440, 2008. JIAO, G. et al. Chemical Structures and Bioactivities of Sulfated Polysaccharides from Marine Algae. Marine drugs, [S.l.], v. 9, p. 196-223, 2011. JIAO, L. et al. Characterization and anti-tumor activity of alkali-extracted polysaccharide from Enteromorpha intestinalis. International Immunopharmacology, [S.l.], n. 9, p. 324-329, 2009. JIN, J.O. et al. The mechanism of fucoidan-induced apoptosis in leukemic cells: Involvement of erk1/2, jnk, glutathione, and nitric oxide. Molecular Carcinogenesis, [S.l.], v. 49, p. 771-782, 2010. JOMOVA, K. et al. Metals, oxidative stress and neurodegenerative disorders. Molecular and Cellular Biology, [S.l.], p. 1-14, 2010. JUNIOR, A. N.; FILHO, M. Z.; REIS, R. B. Urologia fundamental. São Paulo: Planmark, 2010. KAEFFER, B. et al. Biological properties of ulvan, a new source of green seaweed sulfated polysaccharides, on cultured normal and cancerous colonic epithelial tells. Planta Medica, [S.l.], v. 65, p. 527-531, 1999. KAISER, R. M. et al. Trends in Klebsiella pneumoniae carbapenemase-positive K. pneumoniae in US hospitals: report from the 2007–2009 SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Diagnostic Microbiology and infectious disease, [S.l.], v. 76, p. 356-360, 2013.
126
KANETO, H. et al. Role of Reactive Oxygen Species in the Progression of Type 2 Diabetes and Atherosclerosis. Mediators of Inflammation, [S.l.], p.1-11, 2010. KANG, M-H.; PARK, W-J.; CHO, M-K. Anti-Obesity and Hypolipidemic Effects of Lycium chinense Leaf Powder in Obese Rats. Journal of Medicinal Food, [S.l.], v.13, n. 4, p. 801-807, 2010. KANTACHUMPOO, A.; CHIRAPART, A. Components and Antimicrobial Activity of Polysaccharides Extracted from Thai Brown Seaweeds. Kasetsart Journal (Natural Science), [S.l.], v. 44, p. 220-233, 2010. KARLENIUS, T. C.; TONISSEN, K. F. Thioredoxin and Cancer: A Role for Thioredoxin in all States of Tumor Oxygenation. Cancers, [S.l.], v. 2, p. 209-232, 2010. KARNJANAPRATUM, S.; YOU, S. Molecular characteristics of sulfated polysaccharides from Monostroma nitidum and their in vitro anticancer and immunomodulatory activities. International Journal of Biological Macromolecules, n. 48, p. 311-318, 2011. KARNJANAPRATUM, S. et al. Characterization and immunomodulatory activities of sulfated polysaccharides from Capsosiphon fulvescens. International Journal of Biological Macromolecules, [S.l.], v. 51, p. 720-729, 2012. KAYE, P.; SCOTT, P. Leishmaniasis: complexity at the host–pathogen interface. Nature Reviews: Microbiology, [S.l.], v. 9, p. 604-615, 2011. KEDZIERSKI, L.. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? Journal of Global Infectious Diseases, [S.l.], v. 2, n. 2, p. 177-185, 2010. KHAN, S. R.; Canales, B. K. Unified theory on the pathogenesis of Randall’s plaques and plugs. Urolithiasis, [S.l.], v. 43, p. 109-123, 2015. KIM, J-K. et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of sulfated polysaccharides from Enteromorpha prolifera. International Journal of Biological Macromolecules, [S.l.], v. 49, p. 1051-1058, 2011. KIM, K-J.; LEE, B-Y. Fucoidan from the sporophyll of Undaria pinnatifida suppresses adipocyte differentiation by inhibition of inflammation-related cytokines in 3T3-L1 cells. Nutrition Research, [S.l.], v. 32, p. 439-447, 2012.
127
KIM, K-J.; LEE, O-H.; LEE, B-Y. Fucoidan, a sulfated polysaccharide, inhibits adipogenesis through the mitogen-activated protein kinase pathway in 3T3-L1 preadipocytes. Life Science, [S.l.], v. 86, n. 21-22, p. 791-797, 2010. KIM, M-J.; CHANG, U-J.; LEE, J-S. Inhibitory effects of fucoidan in 3t3-l1 adipocyte differentiation. Marine Biotechnology, [S.l.], v. 11, p. 557-562, 2009. KNOLL, Thomas. Epidemiology, pathogenesis, and pathophysiology of urolithiasis. European Urology Supplements, [S.l.], v. 9, n. 12, p. 802-806, 2010. KRAAN, S. Algal polysaccharides, novel applications and outlook. In Carbohydrates – Comprehensive Studies on Glycobiology and Glycotechnology. Chapter 22,489-532, Intech, 2012. KUBIER, A.; O’BRIEN, M. Endogenous Anticoagulants. Topics in Companion Animal Medicine, [S.l.], v. 27, p. 81-87, 2012. KUMAR, P.; BHANDARI, U. Obesity pharmacotherapy: current status EXCLI Journal, [S.l.], v.14, p. 290-293, 2015. KUMARAN, S. et al., Antibiotic resistant Esherichia coli strains from seafood and its susceptibility to seaweed extracts. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, p. 977-981, 2010. KWAK, J-Y. Fucoidan as a Marine Anticancer Agent in Preclinical Development. Marine drugs, [S.l.], v. 12, p. 851-870, 2014. LABTEST. Guia técnico de coagulação. Disponível em: <http://www.labtest.com.br/download.php?a=5491>. Acesso em: 11 out. 2014. LAU, D. C. W. et al. Adipokines: molecular links between obesity and atheroslcerosis. American Journal of Physiology (Heart and Circulatory Physiology), [S.l.], v. n. 288, p. 2031-2041, 2005. LAVIE, C. J.; MILANI, R. V.; VENTURA, H. O. Obesity and Cardiovascular Disease: Risk Factor, Paradox, and Impact of Weight Loss. Journal of the American College of Cardiology, [S.l.], v. 53, p. 1925-1932, 2009.
128
LEE, J. Y. et al. Immunostimulatory Effect of Laminarin on RAW 264.7 Mouse Macrophages. Molecules, v. 17, p. 5404-5411, 2012. LEE, J.B. et al. Immunostimulating effects of a sulfated galactan from Codium fragile. Carbohydrate Research, [S.l.], v. 345, p. 1452-1454. 2010, LEE, Y-H et al. In Vivo Identification of Bipotential Adipocyte Progenitors Recruited by β3-Adrenoceptor Activation and High-Fat Feeding. Cell metabolism, [S.l.], v.15, p. 480-491, 2012. LI, J-J.; XUE, J-F.; OUYANG, J-M. Stabilization of Submicron Calcium Oxalate Suspension by Chondroitin Sulfate C May Be an Efficient Protection from Stone Formation. Bioinorganic chemistry and applications, [S.l.], v. 2013, p. 1-9, 2013. LI, L-Y.; LI, L-Q.; GUO, C-H. Evaluation of in vitro antioxidant and antibacterial activities of Laminaria japonica polysaccharides. Journal of Medicinal Plants Research, [S.l], v. 4, n. 21, p. 2194-2198, 2010. LIMA, M. A. et al. A New Approach for heparin standardization: combination of scanning UV spectroscopy, nuclear magnetic resonance and principal component analysis. Plos one, [S.l.], v. 6, n. 1, 2011. LINS, K. O. A. et al. Antitumor properties of a sulfated polysaccharide from the red seaweed Champia feldmannii (Diaz-Pifferer). Journal of Applied Toxicology, [S.l.], v. 29, p. 20-26, 2009. LOFTI-JAM et al. Nonpharmacologic Strategies for Managing Common Chemotherapy Adverse Effects: A Systematic Review. Journal of Clinical Oncology, [S.l.], v. 26, n. 34, p. 5618-5629, 2008. LÓPEZ, M.; HOPPE, B. History, epidemiology and regional diversities of urolithiasis. Pediatric Nephrology, [S.l], v. 25, n. 1, p. 49-59, 2010. MACFARLANE, R. G. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism, and its function as a biochemical amplifier. Nature, [S.l.], v. 202, p. 498-499, 1964. MAEDA, R. et al., Immunostimulatory activity of polysaccharides isolated from Caulerpa lentilifera on macrophage cells. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, [S.l.], v. 76, p. 501-505, 2012.
129
MAGALHAES, K. D. et al. Anticoagulant, antioxidant and antitumor activities of heterofucans from the seaweed Dictyopteris delicatula. International Journal of Molecular Sciences (Online), [S.l.], v. 12, p. 3352-3365, 2011. MAIER, R. C. Indian herbs for the treatment of chemo- and radiotherapy: Side-effects in cancer patients: a systematic review. 2012. f 65. Dissertação (Dissertação da Middlesex University) – Middlesex University. London, UK. MANTZOROS, C. S. et al. Leptin in human physiology and pathophysiology. American Journal of Physiology, [Sl.], v. 301, n. 4, 2011. MARUDHUPANDI, T.; THANGAPPAN, T.; KUMAR, A. Antibacterial effect of fucoidan from Sargassum wightii against the chosen human bacterial pathogens. International Current Pharmaceutical Journal, [S.l.], v. 2, n. 10, p. 156-158, 2013. MATSUBARA, K. et al. Antiangiogenic properties of a sulfated galactan isolated from a marine green alga, Codium cylindricum. Journal of Applied Phycology, [S.l.], v. 15, n. 1, p. 87-90, 2003. MAYER, A. M. et al. Marine Pharmacology in 2009–2011: Marine compounds with antibacterial, antidiabetic, antifungal, anti-Inflammatory, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action. Marine Drugs, [S.l.], v. 11, p. 2510-2573, 2013. MCLEAN, J. The thromboplastic action of cephalin. American Journal of Physiology, [S.l.], v. 41, p. 250-257, 1916. MEDEIROS, G. F. et al. Distribution of sulfated glycosaminoglycans in the animal kingdom: widespread occurrence of heparin-like compounds in invertebrates. Biochemical et Biophysica Acta, [S.l.], v. 1475, n. 3, p. 285-294, 2000. MEHMET, N. M.; ENDER, O. Effect of urinary stone disease and its treatment on renal function. World Journal of Nephtology, [S.l.], v. 4, n. 2, p. 271-276, 2015. MELO, A. et al. Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases: Mechanisms and Therapeutic Perspectives. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, [S.l.], v. 2011, p. 1-14, 2011.
130
MELO, K. R. T. et al. Evaluation of Sulfated Polysaccharides from the Brown Seaweed Dictyopteris Justii as Antioxidant Agents and as Inhibitors of the Formation of Calcium Oxalate Crystals. Molecules, [S.l.], v. 18, p. 14543-14563, 2013. MELO-SILVEIRA, R. F. et al. In Vitro Antioxidant, Anticoagulant and Antimicrobial Activity and in Inhibition of Cancer Cell Proliferation by Xylan Extracted from Corn Cobs. International Journal of Molecular Science, [S.l.], v. 13, n. 1, p. 409-426, 2012. MICHELIM, L. et al. Pathogenicity Factors And Antimicrobial Resistance Of Staphylococcus Epidermidis Associated With Nosocomial Infections Occurring In Intensive Care Units. Brazilian Journal of Microbiology, [S.l.], v. 36, p. 17-23, 2005. MOE, Orson W. Kidney stones: pathophysiology and medical management. The lancet, [S.l.], v. 367, n. 9507, p. 333-344, 2006. MOHANKUMAR, K. et al. Sulfated polysaccharides of Turbinaria conoides dosedependently mitigate oxidative stress by ameliorating antioxidants in isoproterenol induced myocardial injured rats: Evidence from histopathological study. The Egyptian Heart Journal, [S.l.], v. 64, p. 147-153, 2012. MORONEY, J. V; YNALVEZ, R. A. Algal Photosynthesis. In: eLS. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2009. MOSSMAN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. [S.l.], v., 65, n. 1, p. 55-63, 1983. NADER, H. B. et al. Heparins and heparinoids: occurrence, structure, and mechanism of antithrombotic and hemorrhagic activities. Current Pharmaceutical Design, [S.l.], v. 10, p. 951-966, 2004. NGO, D-H.; KIM, S-K. Sulfated polysaccharides as bioactive agents from marine algae. International Journal of Biological Macromolecules, [S.l.], v. 62, p. 70-75, 2013. NORDENHEM, A. The fibrinolytic enzyme system: new markers of potential interest in cardiovascular disease. Stockholm-SU, 2006. [Tese do Departmento de medicina molecular e cirurgia de Karolinska Institute].
131
O’SULLIVAN, L. et al. Prebiotics from marine macroalgae for human and animal health applications. Marine Drugs, [ S.l.], v. 8, p. 2038-2064, 2010. ORTIZ, J.; et al. Functional and nutritional value of the Chilean seaweeds Codium fragile, Gracilaria chilensis and Macrocystis pyrifera. European Journal of Lipid Science and Technology, v. 111, n. 4, p. 320–327, 2009. OTTO, M. Staphylococcus epidermidis – the “accidental” pathogen. Nature Review Microbiology, n. 7, v. 8, p. 555–567, 2009. OUCHI, N. et al.. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews (Immunology), v. 11, 85-97, 2011. OUYANG, J-M et al. Renal epithelial cell injury and its promoting role in formation of calcium oxalate monohydrate. Journal of Biological Inorganic Chemistry, v. 16, n. 3, p. 405-416, 2011. PARK, H. S. et al. Antiproliferative Activity of Fucoidan Was Associated with the Induction of Apoptosis and Autophagy in AGS Human Gastric Cancer Cells. Journal of food Science, v. 76, n. 3, 2011. PARK, M-K.; JUNG, U.; ROH, C. Fucoidan from Marine Brown Algae Inhibits Lipid Accumulation. Marine Drugs, v. 9, p. 1359-1367, 2011. PASSERO, L. F. et al. Comparative studies of the anti-leishmanial activity of three Crotalus durissus ssp. venoms. Parasitology Research, v. 101, n. 5, p. 1365-1371, 2007. PENGZHAN, Y. et al. Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta). Pharmacological Research, v. 48, p. 543–549, 2003 PEREIRA, I. O. Determinação da Atividade Leishmanicida, Antiproteolítica e Antioxidante de Arrabidaea brachypoda. Araraquara-SP, 2012. [Tese do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNESP]. PÉREZ-RECALDE, M. et al. In vitro and in vivo immunomodulatory activity of sulfatedpolysaccharides from red seaweed Nemalion helminthoides. International Journal of Biological Macromolecules, v. 63, p. 38-42, 2014.
132
PICK, E.; KEISARI, Y. A Simple Colorimetric Method For The Measurement Of Hydrogen Peroxide Produced By Cells In Culture. Journal of lmmunological Methods, v. 38, p. 161—170, 1980. PIERRE, G. et al. Antibacterial Activity of a Sulfated Galactan Extracted from the Marine Alga Chaetomorpha aerea Against Staphylococcus aureus. Biotechnology and Bioprocess Engineering, v. 16, p. 937-945, 2011. PIRES, C. L. et al. Evaluation of Macroalgae Sulfated Polysaccharides on the Leishmania (L.) amazonensis Promastigote. Marine Drugs, v. 11. 934-943, 2013a. PIRES, C. L. et al. Sulfated polysaccharide extracted of the green algae Caulerpa racemosa increase the enzymatic activity and paw edema induced by sPLA2 from Crotalus durissus terrifi cus venom. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 23, n. 4, p. 635-643, 2013b. POPPER, Z. A. et al. Evolution and diversity of plant cell walls: from algae to flowering plants. The Annual Review of Plant Biology, v. 62, 567-590, 2011. PUJOL, C. A. Antiviral activity against dengue virus of diverse classes of algal sulfated polysaccharides. International Journal of Biological Macromolecules, V. 51, 412- 416, 2012. QI, H. et al. Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm (Chlorophyta). Journal of Applied Phycology, [S.l.], v. 17, n. 6, p. 527-534, 2005b. QI, H. et al. Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) in vitro. International Journal of Biological Macromolecules, [S.l.], v. 37, n. 4, p. 195-199, 2005a. QIU, S-R. et al. Molecular modulation of calcium oxalate crystallization by osteopontin and citrate. PNAS, v. 101, n. 7, p. 1811-1815, 2004. QUEIROZ, G. M. et al. Multirresistência microbiana e opções terapêuticas disponíveis. Revista Brasilera de Clínica Médica, v. 10, n. 2, p 132-138, 2012
133
RADER, D. J.; DAUGHERTY, A. Translating molecular discoveries into new therapies for atherosclerosis. Nature, [S.l.], v. 451, p. 904-913, 2008. RAJESWARI, A.; VARALAKSHMI, P. Low molecular weight heparin protection against oxalate-induced oxidative renal insult. Clinica Chimima Acta, n. 370, p. 108–114, 2006. RANDALL, A .The origin and growth of renal calculi. Annals of Surgery, v. 105, p. 1009-1027, 1937. RANDALL, A. Papillary pathology as a precursor of primary renal calculus. Journal of Urology, v. 44, p. 580-589, 1940. RIBEIRO, N. A. et al. Sulfated polysaccharides isolated from the green seaweed Caulerpa racemosa plays antinociceptive and anti-inflammatory activities in a way dependent on HO-1 pathway activation. Inflammation Research, v. 63, p. 569-580, 2014. ROCHA, F.D. Produtos naturais de algas marinhas e seu potencial antioxidante. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 17, n. 4, 631-639, 2007. ROCHA, H. A. et al. Natural sulfated polysaccharides as antithrombotic compounds. Structural characteristics and effects on the coagulation cascade. In Insigths into carbohydrate Structure and Biological Function. Kerala: Transworld Research Network, [S.l.], p. 51-67, 2006. ROCHA, H. A. O. et al. A fucan from the brown seaweed Spatoglossum schröederi inhibits Chinese hamster ovary cell adhesion to several extracellular matrix proteins. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, [S.l.], v. 34, p. 621-626, 2001. ROCHA, H. A. O. et al. A xylogalactofucan from the brow seaweed Spatoglossum schroederi stimulates the synthesis of an antithrombotic heparan sulfate from endothelial. Planta Medica, [S.l.], v. 71, n. 4, p. 379-81, 2005b ROCHA, H. A. O. et al. Structural and hemostatic activities of a sulfated galactofucan from the brown alga Spatoglossum schröederi. An ideal antithrombotic agent? Journal of Biological Chemistry, [S.l.], v. 280, p. 41278-41288, 2005a.
134
ROCHA, H. A. O.; COSTA, L. S.; LEITE, E. L. STRUCTURAL AND BIOLOGICAL INSIGHTS INTO ANTITUMOR SEAWEED SULFATED POLYSACCHARIDES. In Seaweed. Editor Vitor H. Pomin, Editora: Nova Science Publishers, 2011. RODRIGUES, J. A. G. Comparative study of sulfated polysaccharides from Caulerpa spp. (Chlorophyceae). Biotechnological tool for species identification? Acta Scientiarum. Biological Sciences, v. 34, n. 4, p. 381-389, 2012a. RODRIGUES, J. A. G. et al. Antinociceptive and anti-inflammatory activities of a sulfated polysaccharide isolated from the green seaweed Caulerpa cupressoides. Pharmacological Reports, v. 64, 282-292, 2012b. ROMERO, V.; AKPINAE, H.; ASSIMOS, D. G. Kidney Stones: A Global Picture of Prevalence, Incidence, and Associated Risk Factors. Disease state review, v. 12, p. 86-96, 2010. SAJOL, P. et al. An Overview On Immunomodulation. Journal of Advanced Scientific Research, v.3, n. 1, 07-12, 2012. SANZ, J.; FAYAD, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature, [S.l.], v. 451, p. 953-957, 2008. SEBAALY, C. Anticoagulant and antibacterial activities of polysaccharides of red algae Corallina collected from Lebanese coast. Journal of Applied Pharmaceutical Science, v. 4, n. 4, p.30-37, 2014. SEKKAL, M.; LEGRAND, P. A spectroscopic investigation of the carrageenans and agar in the 1,500–100 cm−1 spectral range. Spectrochimica Acta Part A, v. 49, p. 209–221. 1993. SELVAM, R. Calcium oxalate stone disease: role of lipid peroxidation and antioxidants. Urological research, v. 30, n. 1, p. 35-47, 2002. SENTHILKUMAR, K. et al. Brown seaweed fucoidan: Biological activity and apoptosis, growth signaling mechanism in câncer. International Journal of Biological Macromolecules, n. 60, p. 366-374, 2013. SHANMUGAM, M. et al. Distribution of heparinoid-active sulphated polysaccharides in some Indian marine green algae. Indian Journal of Marine Sciences, v. 34, n. 4, p. 222-227, 2001.
135
SHAO, P.; CHEN, X.; SUN, P. In vitro antioxidant and antitumor activities of different sulfatedpolysaccharides isolated from three algae. International Journal of Biological Macromolecules, v. 62, p. 155-161, 2013. SHIBATA, H. et al. Preventive effects of Cladosiphon fucoidan against Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils. Helicobacter, [S.l.], v. 8, n. 1, p. 59-65, 2003. SHOBHARANI et al. Anticoagulant Properties of Marine Polysaccharides. In: Marine Medicinal Glycomics. 1ed.New York: Nova Science Publishers, Inc., v. 1, p. 115-142, 2013. SHUM, D.K.Y., GOHEL, M.D.I. Separate effects of urinary chondroitin sulphate and heparan sulphate on the crystallization of urinary calcium oxalate: differences between stone formers and normal control subjects. Clinical Science, v. 85, p. 33-39, 1993 SILVA, J. M. C. et al. Biological activities of the sulfated polysaccharide from the vascular plant Halodule wrightii. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 22, n. 1, 94-101, 2012. SINGH, N.; KUMAR, M. SINGH, R. K. Leishmaniasis: Current status of available drugs and new potential drug targets. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, p. 485-497, 2012. SOARES, D. C. et al. Dolabelladienetriol, a Compound from Dictyota pfaffii Algae, Inhibits the Infection by Leishmania amazonenses. Plos Neglected tropical diseases, v. 6, n. 9, p. 1-12, 2012. SOSA, V. et al. Oxidative stress and cancer: An overview. Ageing Research Reviews, V. 12, 376-390, 2013. SPALDING, K. L. et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature, v. 453, p. 783-787, 2008 SYNYTSYA, A. et al. Structure and antitumor activity of fucoidan isolated from sporophyll of Korean brown seaweed Undaria pinnatifida. Carbohydrate Polymers, 81, 41-48, 2010.
136
THINH, P. D. et al. Structural Characteristics and Anticancer Activity of Fucoidan from the Brown Alga Sargassum mcclurei. Marine drugs, n. 11, p. 1456-1476, 2013. TILG, H.; MOSCHEN, A. R. Adipocytokines: mediators linking adipose tissue, inflammation and immunity. Nature Reviews (Immunology), v. 6, p. 772-783, 2006. TODOLI, F. et al. Head-to-Head Comparison of Three Vaccination Strategies Based on DNA and Raw Insect-Derived Recombinant Proteins against Leishmania. Plos One, v. 7, n. 12, p. 1-9, 2012. TORRES, F. A. E. New drugs with antiprotozoal activity from marine algae: a review. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 24, p. 265-276, 2014. UTTARA, B. et al. Oxidative Stress and Neurodegenerative Diseases: A Review of Upstream and Downstream Antioxidant Therapeutic Options. Current Neuropharmacology, v. 7, 65-74, 2009. VALKO, M. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, [S.l.], v. 39, p. 44-84, 2007. VALKO, M. et al. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions, [S.l.], v. 160, p. 1-40, 2006 VASQUEZ, R. D.; RAMOS, J. D. A. Immunomodulatory effect of sulfated polysaccharides form Sargassum siliquosum J.G. agardh on peripheral blood mononuclear cells. Journal of Research in Phytochemistry and Pharmacology, v.2, n. 1, p. 55-63, 2012. VEENA, C. K. et al. Beneficial role of sulfated polysaccharides from edible seaweed Fucus vesiculosus in experimental hyperoxaluria. Food chemistry, v. 100, n. 4, p. 1552-1559, 2007. VIJAYABASKAR, P.; VASEELA, N.; THIRUMARAN, G. Potential antibacterial and antioxidant properties of a sulfated polysaccharide from the brown marine algae Sargassum swartzii. Chinese Journal of Natural Medicines, v. 10, n. 6, p. 421-428, 2012.
137
VINAYAK, R. C.; SABU, A. S.; CHATTERJI, A. Bio-Prospecting of a Few Brown Seaweeds for Their Cytotoxic and Antioxidant Activities. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, v. 2011, p. 1-9. 2011. VLODAVSKY, I.; FRIEDMANN, Y. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. The Journal of Clinical Investigation, v. 108, n. 3, p. 341-347, 2001. VOLK, R. et al. Complement modulating and anticoagulant of a sulfated exopolysaccharide released by Cyanobacterium Synechocystis aquatilis. Planta Medica, [S.l.], v. 72, p. 1424-1427, 2006. WANG, J. et al. Potential antioxidant and anticoagulant capacity of low molecular weight fucoidan fractions extracted from Laminaria japonica. International Journal of Biological Macromolecules, v. 46, p. 6-12, 2010. WANG, L. et al. Overview on Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years. Marine Drugs, v. 12, p. 4984-5020, 2014. WANG, X.et al. Structure–antioxidant relationships of sulfated galactomannan from guar gum. International Journal of Biological Macromolecules, V. 46, P. 59-66, 2010. WANG, Y-O.; MIAO, Z-H. Marine-Derived Angiogenesis Inhibitors for Cancer Therapy. Marine Drugs, v. 11, p. 903-933, 2013. WEI, N.; QUARTERMAN, J.; JIN, Y-S. Marine macroalgae: an untapped resource for producing fuels and chemicals. Trends in Biotechnology, v. 31, n. 2, p. 70-77, 2013. WESSON, J. A. et al. Control of calcium oxalate crystal structure and cell adherence by urinary macromolecules. Kidney International, v. 53, p. 952-957, 1998. WICKENS, A. P. Ageing and the free radical theory. Respiratory Physiology, [S.l.], v. 128, n. 3, p. 379-391, 2001. WIJESEKARA, I.; PANGESTUTI, R.; KIM, S-K. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae. Carbohydrate Polymers, v. 84, 14-21, 2011.
138
WIJESINGHE, W. A. J. P.; Jeon, Y-J. Biological activities and potential industrial applications of fucose rich sulfated polysaccharides and fucoidans isolated from brown seaweeds: A review. Carbohydrate Polymers, v. 88, 13-20, 2012. WONG., Y. V.; COOK, P. SOMANI, B. K. The Association of Metabolic Syndrome and Urolithiasis. International Journal of Endocrinology, v. 2015, p. 1-9, 2015. WORLD ORGANIZATION OF HEATH. Global status report on noncommunicable diseases 2010. Geneva, Switzerland: WHO Press, 2011. WORLD ORGANIZATION OF HEATH. Antimicrobial resistance: global report on surveillance. WHO Press, 2014. WYNN, T. A.; CHAWLA, A.; POLLARD,J. W.,Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature, V. 496, p. 445-455, 2013. XU, H. aet al. Kidney stones: an update on current pharmacological management and future directions. Expert Opinion on Pharmacotherapy, v. 14, n. 4, p. 435-447, 2013. XUE, C-H. et al. Chemical characters and antioxidative properties of sulfated polysaccharides from Laminaria japonica. Journal of Applied Phycology, [S.l.], v. 13, p. 67-70, 2001. YAMAMOTO, E. S. et al. Treatment with triterpenic fraction purified from Baccharis uncinella leaves inhibits Leishmania (Leishmania) amazonensis spreading and improves Th1 immune response in infected mice. Parasitology Research (1987. Print), v. 113, p. 333-339, 2013. YANG, L. et al. Fucoidan Derived from Undaria pinnatifida Induces Apoptosis in Human Hepatocellular Carcinoma SMMC-7721 Cells via the ROS-Mediated Mitochondrial Pathway. Marine drugs, v. 11, 1961-1976, 2013. YE, H. et al. Purification, antitumor and antioxidant activities in vitro of polysaccharides from the brown seaweed Sargassum pallidum. Food Chemistry, [S.l.], v. 111, n. 2, p. 428-432, 2008.
139
YENDE, S-R.; HARLE, U-N.; CHAUGULE, B.B. Therapeutic potential and health benefits of Sargassum species. Pharmacognosy Reviews, v. 8, n. 15, p. 1-7, 2014. YOON, S-B. et al. Anti-inflammatory effects of Scutellaria baicalensis water extract on LPS-activated RAW 264.7 macrophages. Journal of Ethnopharmacology, v. 125, n. 2, P. 286-290, 2009. ZHANG, C-Y et al. Antioxidant properties of polysaccharide from the brown seaweed Sargassum graminifolium (Turn.), and its effects on calcium oxalate crystallization. Marine drugs, v. 10, n. 1, p. 119-130, 2012. ZHANG, Y. ET al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, v. 372, p. 425-432, 1994. ZHANG, Z. et al. Fucoidan Extract Induces Apoptosis in MCF-7 Cells via a Mechanism Involving the ROS-Dependent JNK Activation and Mitochondria-Mediated Pathways. Plos One, v. 6, n. 11, p. 1-14, 2011. ZHOU, G. et al. In vivo antitumor and immunomodulation activities of diferente molecular weight lambda-carrageenans from Chondrus ocellatus. Pharmacologial research, v. 50, p. 47-53, 2004.
