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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL
MARYELLE DE CÁSSIA ALBINO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CONSUMO EM LONGO PRAZO E DA
RETIRADA DE ÁLCOOL SOBRE CÉLULAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO
DORSAL DA RAFE EM RATAS
NATAL, RN
2019
MARYELLE DE CÁSSIA ALBINO
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CONSUMO EM LONGO PRAZO E DA
RETIRADA DE ÁLCOOL SOBRE CÉLULAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO
DORSAL DA RAFE EM RATAS
Dissertação de Mestrado apresentada como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Biologia Estrutural e
Funcional, pelo Curso de Pós-Graduação em Biologia
Estrutural e Funcional da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
Orientadora: Profª. Drª. Vanessa de Paula Soares Rachetti
NATAL, RN
2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Albino, Maryelle de Cássia.
Avaliação dos efeitos do consumo em longo prazo e da retirada
de álcool sobre células serotonérgicas no núcleo dorsal da rafe
em ratas / Maryelle de Cássia Albino. - 2019. 64f.: il.
Dissertação (Mestrado)-Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Biociências, Curso de Pós-Graduação em Biologia Estrutural e Funcional, Natal, 2019.
Orientadora: Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti.
1. Álcool - Dissertação. 2. Sistema Nervoso Central -
Dissertação. 3. Serotonina - Dissertação. 4. Desordens Emocionais
- Dissertação. I. Rachetti, Vanessa de Paula Soares. II. Título.
RN/UF/BCZM CDU 576
Elaborado por Raimundo Muniz de Oliveira - CRB-15/429
TÍTULO: AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO CONSUMO EM LONGO PRAZO E DA
RETIRADA DE ÁLCOOL SOBRE CÉLULAS SEROTONÉRGICAS NO NÚCLEO
DORSAL DA RAFE EM RATAS.
AUTOR: MARYELLE DE CÁSSIA ALBINO
DATA DE DEFESA: 08/04/2019
BANCA AVALIADORA
Prof. Dr. Janaína Menezes Zanoveli
Departamento de Farmacologia - UFPR
Prof. Dr. Anna Karynna Alves de Alencar Rocha
Departamento de Fisiologia e Comportamento - UFRN
Prof. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti – Orientadora
Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por todas as oportunidades me dadas até aqui.
Por estar do meu lado, por ter me dado saúde e força para prosseguir.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade oferecida de
realizar o curso, pelo acolhimento e apoio ao aluno. Agradeço aos docentes, técnicos e
todos os funcionários pelo suporte e por todo conhecimento compartilhado.
À minha Orientadora, Professora Vanessa de Paula Soares Rachetti. Pela
receptividade, pela confiança depositada, pelo ensino, paciência, incentivo e amizade.
Agradeço por todas as conversas e pelo aprendizado. Agradeço imensamente pelo o
carinho transmitido e apoio em todos os momentos.
À Raliny, pelo esforço e dedicação na etapa inicial de tratamento dos animais e
preparo do material. Atividades que foram fundamentais para realização do trabalho.
À Professora Mariana Araújo, ao seu aluno João Rodrigo e à todos os
colaboradores do Instituto de Neurociências de Macaíba, pela disponibilidade de recursos
e apoio técnico importantíssimos na coleta e análise dos dados. Agradeço especialmente
à professora Mariana pela disposição em ajudar e sempre contribuir para melhora do
trabalho.
Aos Professores Expedito Junior e Judney Cavalcante do departamento de
Morfologia da UFRN, pelas valiosas contribuições realizadas na qualificação. Pela
disponibilização e oferecimento de recursos do Laboratório de Neuroanatomia.
Aos meus familiares. Aos meus pais, Solimar e Paulo (em memória), agradeço
por todos os ensinamentos e pelo amor incondicional. Agradeço com muito amor a minha
mãe, pelo cuidado, pela dedicação, pelo apoio, por sempre acreditar e incentivar os meus
sonhos. Agradeço especialmente a minha Dindinha, pelo apoio no dia a dia, pelos
conselhos e pela proteção. Aos meus irmãos Isabelly e Lucas e à toda minha família, por
me trazerem sorrisos, abraços, conversas e apoio. Ao meu namorado e amigo, Gabriel,
pelo companheirismo, amor e paciência. Agradeço pelo incentivo e apoio do dia a dia.
Agradeço por todo carinho.
Aos meus amigos do Laboratório de Farmacologia, Luana, Renato, Ana, Camila,
Juliete e Nathalia. Especialmente, à Lu e ao Renato, pela amizade, pelos dramas e sorrisos
compartilhados deixando a caminhada mais leve. Aos amigos da turma do curso pela
união e apoio. Especialmente à Rebeca (Beca), pelo ombro amigo, pelas orações e pela
companhia durante esta jornada. Aos amigos da república, sr. David, Paulo, Rayanne e
Regina, por serem os melhores vizinhos que já tive (risos), por todo apoio e amizade.
Gratidão a todas as pessoas que contribuíram diretamente ou indiretamente para
realização deste trabalho. Gratidão por contribuírem para meu crescimento profissional e
pessoal.
Gratidão à CAPES, pelo apoio financeiro e incentivo à pesquisa.
RESUMO
O uso contínuo do álcool pode provocar neuroadaptações prejudicando o funcionamento
normal do sistema nervoso central. Dentre as vias de neurotransmissão alteradas, está o
sistema serotonérgico, o qual possui um papel fundamental na mediação das emoções. É
conhecido que este sistema se apresenta disfuncional durante o consumo em longo prazo
e na retirada de álcool, com desregulação do nível de serotonina e de seus metabólitos e
até do nível seus receptores. Tais mudanças, podem favorecer desordens afetivas e
comportamentais observadas em indivíduos dependentes. Mulheres constituem um grupo
de risco para transtornos emocionais; por isto, neste trabalho foi avaliado se o consumo
crônico e a retirada do álcool promovem alterações na densidade celular serotonérgica
em diferentes porções da subdivisão dorsal (DRD) e na subdivisão caudal (DRC) do
núcleo dorsal da rafe de ratas Wistar. O núcleo dorsal da rafe contêm um grande número
de neurônios serotonérgicos e as subdivisões DRD e DRC se projetam para áreas
envolvidas com respostas emocionais, como amígdala, bed nucleus da estria terminal,
hipotálamo paraventricular e hipocampo ventral. Os animais foram submetidos a
concentrações crescentes de álcool (2%, 4% e 6%) como única fonte de dieta líquida por
21 dias ou água (grupo controle). Todos os grupos tiveram livre acesso à ração. Após este
período de tratamento, o álcool foi substituído por água e os animais foram submetidos à
perfusão transcardíaca e remoção dos encéfalos 72 horas após a substituição (grupo
retirada curto prazo) ou 21 dias após a substituição (grupo retirada longo prazo). Depois,
foi realizada uma análise imunoistoquímica para detecção de células imunorreativas para
serotonina (5-HT) no DRD e no DRC. Foi observado que a retirada a longo prazo
produziu efeito de aumento da densidade de células imunomarcadas para 5-HT na região
média do DRD e no DRC. Em conjunto, pode ser sugerido que este aumento na densidade
celular esteja relacionado com desregulação de respostas emocionais e comportamentais
observadas no período de abstinência alcoolica em longo prazo.
Palavras-chave: Álcool; Retirada; Sistema Nervoso Central; Serotonina; Núcleo Dorsal
da Rafe; Desordens Emocionais.
ABSTRACT
Long-term alcohol abuse may cause neuroadaptations impairing the normal functioning
of the central nervous system. Among the altered neurotransmission pathways, there is
serotonergic system that plays a fundamental role in the mediation of emotions. It is
known that this system is dysfunctional during long-term use e withdrawal of alcohol,
with deregulation of the serotonin level and this metabolites and even the level of this
receptors. Such changes may favour affective and behavioural disorders observed in
dependent individuals. Women constitute a risk group for emotional disorders; so, this
study evaluated whether long-term consumption and withdrawal of alcohol promoted
changes in serotonergic cell density in the dorsal (DDR) and caudal (DCR) subdivisions
of the dorsal raphe nucleus of female Wistar rats. The dorsal nucleus of the raphe contains
a large number of serotonergic neurons and the DDR e DCR subdivisions project into
areas involved with emotional responses, such as amygdala, bed nucleus of the terminal
stria, paraventricular hypothalamus, and ventral hippocampus. The animals were
submitted to increasing concentrations of alcohol (2%, 4% and 6%) as the unique source
of liquid diet for 21 days or water (control group). Both groups had free access to the
feed. After this treatment period, the alcohol was replaced with water and the animals
were submitted to transcardiac perfusion and brain removal 72 hours after replacement
by water (short term withdrawal group) or 21 days after replacement by water (long term
withdrawal group). Immunohistochemical analysis was performed the detection of
immunoreactive cells for serotonin (5-HT) in the DDR and DCR. It was observed that
long-term withdrawal produced an increase in the density of 5-HT immunolabelled cells
in the middle region of DDR and in DCR. Taken together, it may be suggested that this
increased in density of 5-HT immunolabelled cells is related to the dysregulation of
emotional and behavioural responses observed in the period of long-term alcohol
withdrawal.
Key words: Alcohol; Withdrawal; Central Nervous System; Serotonin; Dorsal Raphe
Nucleus; Emotional Disorders.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
5-HT 5-hidroxitriptamina, serotonina
5-HTP 5-hidroxitriptofano
5-HIAA Ácido 5-hidroxi-indolacético
5-HTT Transportador específico para serotonina
AMPc 3-5-monofosfato cíclico
ACTH Hormônio adrenocorticotrófico
CRF Fator liberador de corticotrofina
CRF-1 Receptores do tipo 1 para CRF
CFR-2 Receptores do tipo 2 para CRF
DRD Porção dorsal do núcleo dorsal da rafe
DRV Porção ventral do núcleo dorsal da rafe
DRVL Porção ventrolateral do núcleo dorsal da rafe
DRI Porção interfascicular do núcleo dorsal da rafe
DRC Porção caudal do núcleo dorsal da rafe
GABA Ácido gama-aminobutírico
GABAA Receptor do tipo A para GABA
HPA Eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
MAO Enzima monoaminoxidase
NDR Núcleo dorsal da rafe
NMDA Receptor N-metil-D-aspartato
SNC Sistema nervoso central
TF Tampão fosfato 0,1M, pH 7,4
TPH-2 Enzima triptofano-5-hidroxilase do tipo 2
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1
1.1. Considerações Gerais ......................................................................................... 1
1.2. O álcool .............................................................................................................. 4
1.2.1. Metabolismo ............................................................................................... 4
1.2.2. Interações com sistemas de neurotransmissão............................................ 5
1.3. A serotonina ..................................................................................................... 10
1.3.1. Neuroanatomia do sistema serotonérgico ................................................. 10
1.3.2. Influência do sistema serotonérgico das porções dorsal e caudal do núcleo
dorsal da rafe na modulação de comportamentos emocionais ................................ 17
2. OBJETIVOS ................................................................................................... 18
2.1. Objetivo Geral .................................................................................................. 18
2.2. Objetivos Específicos ...................................................................................... 18
3. METOLODOLOGIA .................................................................................... 19
3.1. Animais ............................................................................................................ 19
3.2. Protocolo de consumo e retirada de álcool ...................................................... 19
3.3. Perfusão transcardíaca ..................................................................................... 21
3.4. Microtomia ....................................................................................................... 21
3.5. Imunoistoquímica para 5-HT ........................................................................... 22
3.5.1. Análise das lâminas de imunoistoquímica para 5-HT .............................. 22
3.6. Análise Estatística ............................................................................................ 25
4. RESULTADOS .............................................................................................. 26
4.1. Densidade celular serotonérgica no DRD de fêmeas ....................................... 26
4.2. Densidade celular serotonérgica no DRC de fêmeas ....................................... 30
5. DISCUSSÃO ................................................................................................... 32
6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 40
7. REFERÊNCIAS ............................................................................................. 41
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações Gerais
O uso do álcool como bebida de consumo é antigo e demasiadamente influenciado
por fatores culturais, religiosos e sociais. Devido a legalização e fácil acesso, a efeitos
iniciais de desinibição comportamental, sensação de bem-estar, humor alegre e
diminuição da ansiedade, o consumo do álcool é amplo na sociedade e difundido em todo
mundo. Porém, o uso abusivo e repetido pode causar sérios danos à saúde física e mental
do indivíduo, além de favorecer prejuízos no contexto familiar, econômico e social
(DASGUPTA; LANGMAN, 2012; PETRAKIS et al., 2002).
Segundo a Organização Mundial de Saúde, o consumo de álcool é um fator de
risco para o desenvolvimento de um grande número de doenças, incluindo cirrose
hepática, cânceres envolvendo o sistema gastrointestinal e doenças cardiovasculares.
Além disso, é um fator incidente em lesões por confrontos violentos, acidentes de trânsito
e suicídios. Em 2016, o uso nocivo do álcool provocou a morte de 3,3 milhões de pessoas
(5,3% de todas as mortes) em todo mundo, possuindo índice de mortalidade maior do que
doenças como tuberculose, síndrome da imunodeficiência adquirida e diabetes. Desta
estimativa, 2,3 milhões de mortes foram de homens e 0,7 milhões de mulheres.
Aproximadamente 28,7% do total dos óbitos foram atribuídos a lesões, 21,3% devido a
doenças do trato digestivo, 12,9% a doenças infecciosas e 12,6% por cânceres (WORLD
HEALTH ORGANIZATION, 2018).
De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, DSM-
V (AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION APA, 2013), o álcool é classificado
como uma das substâncias capazes de induzir transtorno de dependência química. Este
transtorno é considerado um distúrbio encefálico e pode ser identificado quando o
indivíduo manifesta em um período de doze meses pelo menos dois dos seguintes critérios
descritos na tabela a seguir:
Tabela 1. Critérios utilizados para identificação de transtornos relacionados ao uso do álcool – DSM V.
1. O álcool é frequentemente consumido grandes quantidades ou por um período
mais longo do que o pretendido.
2. Há um desejo persistente ou esforços malsucedidos no sentido de reduzir ou
controlar o uso do álcool.
2
3. É gasto muito tempo com atividades necessárias para a obtenção de álcool, na
utilização de álcool ou recuperação dos seus efeitos.
4. Fissura, desejo intenso ou urgência de consumir álcool.
5. Uso recorrente de álcool resultando em fracasso em cumprir obrigações
importantes no trabalho, na escola ou em casa.
6. Uso continuado de álcool, apesar de uns problemas sociais ou interpessoais
persistentes ou recorrentes causados ou exacerbados pelos efeitos do álcool.
7. Importantes atividades sociais, profissionais ou recreativas são abandonadas ou
reduzidas em virtude do uso do álcool.
8. Uso recorrente de álcool em situações nas quais isto representa perigo para a
integridade física.
9. O uso do álcool é mantido apesar da consciência de ter um problema físico ou
psicológico persistente ou recorrente que tende a ser causado ou exacerbado pelo
álcool.
10. Tolerância, definida por qualquer um dos seguintes aspectos:
a) Necessidade de quantidades progressivamente maiores de álcool para
alcançar a intoxicação ou o efeito desejado.
b) Acentuada redução do efeito com o uso continuado da mesma quantidade de
álcool.
11. Abstinência, manifestada por qualquer um dos seguintes aspectos:
a) Síndrome de abstinência característica, quando o uso pesado e prolongado
de álcool é reduzido ou cessado. O indivíduo pode apresentar dois ou mais
dos seguintes sintomas no período de algumas horas a alguns dias após a
interrupção: hiperatividade autonômica (por exemplo sudorese ou frequência
cardíaca maior que 100 bpm), tremor aumentado nas mãos, insônia, náusea
ou vômitos, alucinações ou ilusões visuais, táteis ou auditivas transitórias,
agitação psicomotora, ansiedade, convulsões tônico-clônicas generalizadas.
b) Álcool é consumido para aliviar ou evitar os sintomas de abstinência.
Fonte: AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION APA, 2013.
A abstinência alcoolica, causa um grande sofrimento ao indivíduo. Para o
entendimento das alterações no organismo devido à exposição prolongada e retirada de
álcool, uma variedade de modelos animais tem sido desenvolvidos. Os pesquisadores
submetem os animais (por exemplo, roedores) a exposição ao álcool utilizando técnicas
3
como administração forçada de álcool por infusão intragástrica; exposição ao vapor de
álcool em caixa inalatória; administração de álcool na dieta líquida; consumo voluntário
de álcool em contexto livre escolha entre beber álcool ou água, dentre outras. Depois o
álcool é retirado, e a dependência química pode ser evidenciada com o surgimento de
sintomas de abstinência como hiperatividade do sistema nervoso autônomo (batimentos
cardíacos acelerados, constrição de vasos sanguíneos e aumento da pressão sanguínea),
redução da ingestão de comida e água, diarreia, alteração no controle de temperatura,
tremores e piloereção. Além disso, os animais podem apresentar comportamentos do tipo
ansiosos e de agressividade em testes comportamentais. Grande parte destas medidas
fisiológicas e comportamentais correspondem aos sinais e sintomas observados em
humanos dependentes alcoolicos (BECKER, 2000).
É relatado na literatura que os sintomas de abstinência alcoolica tanto em humanos
quanto em animais segue padrão temporal de apresentação. Na ausência de comorbidade
e do uso de outras drogas, são descritas três fases de abstinência: aguda, precoce e
prolongada (HEILIG et al., 2010).
A abstinência aguda ocorre aproximadamente em período de 48 a 72 horas nos
humanos e de 24 a 48 horas nos animais. Esta fase é marcada pela hiperexcitabilidade
generalizada do sistema nervoso central (SNC), tremores, hiperatividade do sistema
nervoso autônomo, risco de delirium tremens, convulsões e sintomas psicológicos como,
distúrbios de humor e de sono. Após a primeira semana de retirada, sintomas físicos
agudos raramente são encontrados (HEILIG et al., 2010).
A abstinência precoce pode ocorrer no período de 3 a 6 semanas em humanos e 1
a 2 semanas em animais. É um período intermediário, no qual há continuação dos
sintomas de ansiedade, baixo humor e sono perturbado (HEILIG et al., 2010).
Já a fase de abstinência prolongada, é considerada acima 3 meses em humanos e
acima de 1 mês em animais. Nesta fase, além da ansiedade e da disforia, há alteração do
processamento afetivo. Desafios pequenos, normalmente insignificantes, provocam afeto
negativo, desejo e recaída ao álcool. Ainda pode haver atenuação ou ausência de respostas
positivas esperadas para eventos normalmente agradáveis (HEILIG et al., 2010).
Os sintomas físicos da abstinência diminuem com os dias, mas os sintomas
psicológicos como transtornos psicóticos, bipolares, depressivos, de ansiedade, entre
outros, podem permanecer por um longo período e levar o indivíduo à recaída ao álcool
a fim de alívio e, consequentemente, a continuar o ciclo prejudicial de dependência da
4
bebida alcoolica (AMERICAN PSYCHIATRY ASSOCIATION APA, 2013; KOOB,
2009).
1.2. O álcool
1.2.1. Metabolismo
Após administração oral, o álcool pode ser oxidado no estômago por isoformas da
enzima álcool desidrogenase. Em estado de jejum, o álcool pode passar rapidamente para
o duodeno, onde é absorvido. Na circulação sanguínea, é distribuído na água corporal e,
em menor proporção, no tecido adiposo. Cerca de 90%-98% da metabolização do álcool
ingerido ocorre no fígado pela enzima álcool desidrogenase. Por meio de ação oxidativa,
esta enzima biotransforma o álcool, formando acetaldeído. O acetaldeído, uma molécula
altamente reativa, é transformado em ácido acético rapidamente, pela enzima aldeído
desidrogenase. Grande parte do ácido acético deixa o fígado, se direcionando para tecidos
periféricos, nos quais é transformado em acetil-CoA e participa do metabolismo
energético das células. O restante da metabolização do álcool pode ser realizado pela
enzima catalase e por enzimas da família do citocromo P450 (CYP2E1). Pequena
concentração do álcool na circulação pode permanecer inalterado e pode ser eliminado
via urina, ar exalado e suor (BRUNTON et al., 2015; CEDERBAUM, 2012;
KLAASSEN; WATKINS, 2012).
Os sintomas de intoxicação ocorrem quando a concentração de álcool no sangue
é alta (5-10 mmol/L). Em humanos há uma sensação de euforia ou desinibição
comportamental. A medida que a concentração aumenta, a função motora é prejudicada
e a fala fica arrastada. Entre 200 mg/dL e 300 mg/dL (entre 43 mmol/L e 65 mmol/L) de
álcool no sangue pode ocorrer vômito e estupor. E, em concentrações de 500 mg/dL (109
mmol/L) pode ocorrer insuficiência respiratória, coma e morte (DAVIES, 2003).
Grande parte destes efeitos são mediados pela ação do álcool sistema nervoso
central (SNC). Devido a sua estrutura lipossolúvel o álcool consegue se difundir entre as
membranas celulares, podendo interagir com proteínas e moléculas dos neurônios. Assim,
pode comprometer a condução elétrica, impulsos nervosos e a atividade normal celular.
Consequentemente, as circuitarias neurais e a liberação de neurotransmissores são
modificadas (CEDERBAUM, 2012; GILPIN; KOOB, 2008). A seguir, serão descritas
ações importantes do álcool sobre sistemas de neurotransmissão encefálicos.
5
1.2.2. Interações com sistemas de neurotransmissão
Sistema GABAérgico
O sistema GABAérgico, é o principal sistema com funções inibitórias no SNC.
Atuando como agonista, a molécula do álcool interage com receptores para ácido gama-
aminobutírico (GABA) do tipo A (GABAA), presentes na membrana de neurônios de
diferentes áreas encefálicas. Os receptores GABAA são canais iônicos permeáveis cloreto,
íon carregado negativamente. O álcool promove uma potencialização GABA sobre estes
receptores, aumentando o fluxo de íons para células, consequentemente há
hiperpolarização, redução da atividade neuronal e um efeito depressor em várias áreas do
SNC. Assim, o indivíduo pode apresentar sintomas de sedação e fala arrastada, alívio da
ansiedade, falta de coordenação motora e movimentos lentos (MCINTOSH; CHICK,
2004; SAXENA; RAJ PAL; AMBEKAR, 2003; KORPI, 1994; MIHIC; HARRIS, 1997).
A literatura relata que o consumo contínuo de álcool gera uma resposta adaptativa
no sistema GABAérgico. Por exemplo, em estudo com roedores expostos ao álcool
concentrado em 6% durante 14 dias (quantidade de álcool ingerida por dia: 10-12 g/kg;
concentração sanguínea de álcool 150-200 mg/100 ml), os pesquisadores observaram que
os níveis da subunidade α1 e α4 do receptor GABAA estavam alterados no córtex
(DEVAUD et al., 2002). Estas alterações dificultam a montagem de receptores GABAA
funcionais, o que contribui para um mau funcionamento do sistema GABAérgico e de
sua ação inibitória em outros sistemas (MIHIC; HARRIS, 1997).
Na retirada abrupta do álcool, há um aumento da excitabilidade no SNC, devido
a baixa atividade regulatória GABAérgica, promovendo a manifestação de sintomas de
ansiedade, convulsão e hiperatividade, entre outros (MIHIC; HARRIS, 1997;
FAINGOLD; LI; EVANS, 2000; BROUSSE et al., 2012).
Sistema glutamatérgico
Já o sistema glutamatérgico, é o principal sistema com funções excitatórias no
SNC. O álcool pode interagir com receptores para o glutamato, como por exemplo com
o receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), bloqueando sua atividade e alterando a
sinalização excitatória no SNC (WOODWARD, 1994). Receptores glutamatérgicos
NMDA estão presentes em grande parte dos neurônios do SNC e são canais iônicos
permeáveis a moléculas carregadas positivamente, como Na+ e Ca2+. Quando ativados,
6
permitem o influxo de íons para célula, contribuindo para despolarização celular e
geração de impulsos nervosos. Desta maneira, influencia na liberação de
neurotransmissores e no funcionamento celular (GONZALES; JAWORSKI, 1997).
Também é relatado na literatura, neuroadaptações do sistema glutamatérgico
devido ao consumo a longo prazo do álcool. Por exemplo, os pesquisadores Hendricson
e colaboradores (2007) observaram que o consumo de álcool (75mM) por 5-9 dias,
provocou um aumento na expressão e no número de subunidades de receptores NMDA,
e ainda, observaram aumentada atividade excitatória glutamatérgica após o álcool ser
retirado (HENDRICSON et al., 2007).
Quando consumo de álcool é cessado os receptores NMDA são desinibidos.
Devido ao aumento do número dos mesmos previamente durante o uso prolongado do
álcool, há uma atividade glutamatérgica acentuada. Consequentemente, pode haver danos
e morte celular, predispondo o indivíduo a doenças neurológicas e a transtornos mentais.
O aumento da excitabilidade do SNC é acompanhado de sintomas, como tremores,
hiperatividade e convulsões (GONZALES; JAWORSKI, 1997; TSAI; GASTFRIEND;
COYLE, 1995).
Sistema dopaminérgico
O sistema dopaminérgico, tem como neurotransmissor a dopamina. É relacionado
com diferentes funções como sensação de recompensa, prazer, modulação da atenção e
da memória de curto prazo. O álcool estimula neurônios dopaminérgicos da área
tegmentar ventral, favorecendo a liberação de dopamina em áreas encefálicas inervadas
por estes neurônios, como no núcleo accumbens. Este núcleo é visto como importante
para geração de respostas de recompensa e emoções gratificantes (ARIAS-CARRIÓN et
al., 2010; BOILEAU et al., 2003; DI CHIARA, 1997; KAPICZINSK; QUEVEDO;
IZQUIERDO, 2004).
Durante o uso prolongado de álcool, há uma diminuição dos níveis de dopamina
e seus metabólitos em áreas associadas com a modulação do estado emocional,
movimentos e processos cognitivos, incluindo porção ventral do estriado (onde se
localiza o núcleo accumbens) e na sua porção dorsal (ROTHBLAT; RUBIN;
SCHNEIDER, 2001). Em estudos com lesões núcleo accumbens e alteração do sistema
dopaminérgico, os pesquisadores observaram um aumento significativo da ingestão de
álcool (QUARFORDT; KALMUS; MYERS, 1991).
7
Na retirada alcoólica, é relatado que há depleção dos níveis de dopamina,
principalmente no núcleo accumbens. Assim, a diminuição de dopamina e funcionamento
anormal das vias dopaminérgicas favorece a procura do indivíduo por mais álcool, em
busca de emoções gratificantes contribuindo para o desenvolvimento da dependência
alcoolica (DI CHIARA, 1997; KAPICZINSK; QUEVEDO; IZQUIERDO, 2004;
NOBLE, 1996).
Sistema de estresse encefálico
Os sistemas de estresse encefálico, são circuitarias neuronais ativadas durante a
exposição a estímulos aversivos. São considerados existentes dois sistemas estresse: a) o
eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA), b) um sistema extra-hipotalâmico que inclui
regiões do neocórtex, amígdala estendida (composta pelo núcleo central da amígdala, bed
nucleus da estria terminal, núcleo accumbens shell), tálamo e núcleos mesencefálicos.
Em ambos, o fator liberador de corticotrofina (CRF) é um importante modulador que
ativa as circuitarias, promovendo respostas comportamentais relacionadas ao estresse,
típicas de cada espécie (HEIMER; ALHEID, 1991; KOOB et al., 2014; SWANSON et
al., 1983).
Em estudos com modelos animais é possível observar respostas comportamentais,
como congelamento (ou freezing), sobressalto, evitação de áreas abertas ou de altura,
quando os mesmos são expostos a estímulos aversivos ou a um estressor.
Comportamentos são semelhantes a respostas comportamentais de humanos e tem sido
sugeridos como indicativos de ansiedade (KOOB et al., 2014).
Foi visto que os sistemas de estresse encefálico se encontram desregulados na
retirada de álcool após consumo prolongado. É relatado um aumentado nível de CRF
ativando as circuitarias destes sistemas e mediando respostas estressoras e ansiogênicas
(MERLO PICH et al., 1995; RIVIER; BRUHN; VALE, 1984).
No eixo HPA, estímulos estressantes ativam células parvocelulares no núcleo
paraventricular do hipotálamo que liberam o CRF. Este, por sua vez, estimula a liberação
do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH) da hipófise anterior. O ACTH induz a síntese
e a liberação de glicorticoides pela glândula adrenal (BACKSTRÖM; WINBERG, 2013;
RAADSHEER et al., 1993). Os glicocorticoides exercem um efeito de feedback negativo
sobre o eixo, atuando em receptores presentes no núcleo paraventricular e hipocampo,
principalmente (KOOB, 2009).
8
Acredita-se que os mecanismos envolvidos no reforço negativo do álcool envolve
o sistema extra-hipotalâmico CRF da amígdala estendida (ZAHR; SULLIVAN, 2008).
Esta região, quando ativada, libera CRF em áreas como núcleo paraventricular
hipotalâmico e tronco encefálico, ativando estas regiões e promovendo respostas
comportamentais e autonômicas (Figura 1) (PURVES, 2010). Além disso, as regiões
envolvidas na modulação do estresse estão interligadas a estruturas límbicas importantes
para respostas emocionais (PURVES, 2010; KOOB; KREEK, 2007).
Figura 1. Respostas comportamentais e autonômicas mediadas pelo CRF extra-hipotalâmico da amígdala
estendida. Abreviações: BNST: bed nucleus da estria terminal; PVN: núcleo paraventricular hipotalâmico;
AMYG: amígdala; CRF: fator liberador de corticotrofina e NE: noradrenalina (ZAHR; SULLIVAN, 2008).
Sistema serotoninérgico
O sistema serotonérgico possui um papel importante na modulação da emoção,
assim como de outras funções encefálicas, como no ciclo do sono, apetite, locomoção,
regulação hormonal e fator trófico, funções cognitivas como atenção, controle da
impulsividade, comportamento social, aprendizado, memória, entre outras funções
(BELMER et al., 2016; KETCHERSIDE; MATTHEWS; FRANCESCA, 2013).
9
Na ingestão aguda de álcool há evidências de que os níveis de serotonina (5-HT,
5-hidroxitriptamina) e de seus metabólitos, como ácido 5-hidroxi-indolacético (5-HIAA),
aumentam (HELANDER; ERIKSSON, 2002; BADAWY, 1998; LOVINGER, 1997). O
álcool agudo eleva níveis de 5-HT em várias regiões encefálicas, incluindo o hipocampo
ventral (BARE; MCKINZIE; MCBRIDE, 1998), amígdala (MCBRIDE, 2002), córtex
pré-frontal medial (LANGEN; DIETZE; FINK, 2002), núcleo accumbens
(YOSHIMOTO et al., 1992), área tegmentar ventral (YAN et al., 1996), entre outras. Na
área tegmentar ventral a 5-HT pode potencializar a ação do álcool sobre neurônios
dopaminérgicos, favorecendo os efeitos recompensadores do álcool (BRODIE;
TRIFUNOVIĆ; SHEFNER, 1995). Contudo, estudos eletrofisiológicos demonstraram
que a administração intravenosa aguda de álcool em ratos diminuiu a atividade de
neurônios serotonérgicos no núcleo dorsal da rafe (PISTIS et al., 1997; THIELEN;
MORZORATI; MCBRIDE, 2001).
Estudos avaliando os efeitos do álcool crônico sobre o sistema serotonérgico
encontraram uma redução de 5-HT e 5-HIAA em várias áreas encefálicas, como cortéx
frontal, corpo estriado, área tegmentar ventral e pálido ventral (UZBAY; USANMAZ;
AKARSU, 2000; VASCONCELOS et al., 2004; WOODS; DRUSE, 2002). Também foi
visto uma redução de 5-HIAA no líquido cefalorraquidiano de pacientes com
dependência alcoólica (BANKI, 1981), indicando uma diminuição da atividade
serotonérgica no sistema nervoso central.
Na retirada do álcool, foi observado em estudo com indivíduos dependentes
hospitalizados, níveis de 5-HIAA plasmático significativamente reduzidos no período de
28-63 dias após a última bebida alcoolica (BALLENGER et al., 1979). Ainda outro
estudo mostrou diminuídos níveis plasmáticos de 5-HT em homens dependentes
hospitalizados para desintoxificação já no primeiro dia abstinência à bebida (PATKAR
A. et al., 2003). A disfunção do sistema serotonérgico provocada pelo álcool tem sido
associada ao desenvolvimento de desordens emocionais, como ansiedade, desejo
exagerado pela droga, favorecendo recaídas e o comportamento de beber
(CICCOCIOPPO, 1999).
10
1.3. A serotonina
1.3.1. Neuroanatomia do sistema serotonérgico
A 5-HT, molécula neurotransmissora do sistema, é uma amina biogênica
produzida a partir do aminoácido triptofano, adquirido na dieta (ATTENBURROW et al.,
2003). No sistema nervoso, é sintetizada principalmente em neurônios localizados nos
núcleos da rafe (MOHAMMAD-ZADEH; MOSES; GWALTNEY-BRANT, 2008). Estes
núcleos serotonérgicos encontram-se distribuídos na linha média ao longo da extensão
rostrocaudal do tronco encefálico (VERTES; CRANE, 1997). Os núcleos mais rostrais
enviam projeções para o prosencéfalo, enquanto os caudais para tronco encefálico caudal
e medula espinal (HORNUNG, 2003). Dahlstrom e Fuxe (1964), descreveram nove
grupos celulares contendo serotonina no núcleo da rafe (B1-B9) (apud PIERUCCI et al.,
2014). Os grupos caudais, situados na medula, são o núcleo magno da rafe (NMR, grupo
B5), núcleo obscuro da rafe (NOR, grupos B1, B2 e B3) e núcleo pálido da rafe (NPR,
grupo B4). O grupo rostral, localizados na ponte e mesencéfalo, são o núcleo dorsal da
rafe (NDR, grupos B6 e B7), e o núcleo mediano da rafe (MRN, grupo B8). O B9 está
localizado no tegmento ventrolateral da ponte e mesencéfalo (Figura 2) (PIERUCCI et
al., 2014).
Figura 2. Visão sagital mediana do tronco encefálico de rato com grupos celulares serotonérgicos e
algumas de suas projeções ascendentes e descendentes (modificado PIERUCCI et al., 2014; “Raphe
Nuclei”, 2009).
11
Para a síntese de 5-HT, o triptofano é hidroxilado pela triptofano-5-hidroxilase do
tipo 2 (TPH-2; presente em neurônios) em 5-hidroxitriptofano (5-HTP). O 5-HTP é
descarboxilado pela enzima aminoácido descarboxilase formando 5-HT (CLARK;
WEISSBACH; UDENFRIEND, 1954; PATEL; PONTRELLO; BURKE, 2004). Estas
enzimas estão distribuídas por todo citoplasma dos neurônios serotonérgicos. Após a
síntese, a 5-HT é transportada para vesículas por meio do transportador vesicular de
monoaminas e armazenada no interior destas. As vesículas são encontradas em toda
extensão do neurônio, ou seja, nos axônios, corpos celulares e dendritos (GOLAN et al.,
2014). Quando ocorre o impulso nervoso e influxo de cálcio, as vesículas com 5-HT no
terminal do axônio se fundem com a membrana celular, liberando as moléculas na
sinapse.
Além da liberação sináptica nos terminais nervosos, há liberação de 5-HT fora da
sinapse no corpo do neurônio (COLGAN; PUTZIER; LEVITAN, 2009), nos dendritos
(COLGAN et al., 2012) e ao longo axônio, nas varicosidades axonais (BRUNS et al.,
2000). Tem sido relatado que a 5-HT liberada fora da sinapses é independente de
potencial de ação; como exemplo, nos dendritos é induzida por canais de cálcio do tipo-
L, os quais podem ser ativados por receptores glutamatérgicos NMDA (BELMER;
MAROTEAUX, 2018).
A 5-HT livre pode interagir com receptores específicos nas células pós-sináptica
e pré-sináptica. Estes, são classificados em sete famílias com base em suas sequências de
aminoácidos e propriedades estruturais: 5-HT1A/B/D/E/F, 5-HT2A/B/C, 5-HT3, 5-HT4, 5-
HT5A/B, 5-HT6, 5-HT7 – treze são receptores transmembrana acoplados a proteína G e um
receptor é um canal iônico dependente de ligante (5-HT3) (Figura 3) (BARNES et al.,
2018). Conforme o tipo de sinalização, estes receptores podem ser divididos em quatro
grupos:
I. Receptores 5-HT1A/B/D/E/F e 5-HT5A/B: acoplados a Gαi; a ativação induz
inibição da adenilciclase e diminuição do mensageiro adenosina 3,5-
monofosfato cíclico (AMPc), podendo induzir hiperpolarização celular.
II. Receptores 5-HT4, 5-HT6 e 5-HT7: acoplados a Gαs; a ativação estimula
adenilciclase e a produção de AMPc. AMPc tem numerosos alvos, como
canais iônicos e proteína cinase A, podendo participar da regulação do fluxo
de cálcio, excitabilidade celular, entre outros processos.
12
III. Receptores 5-HT2A/B/C: acoplados a proteína Gαq; induzem a hidrólise de
fosfoinositídeos da membrana, formando diacilglicerol e fosfato inositol,
responsáveis por ativar a proteína cinase C e elevar o cálcio intracelular.
IV. Receptores 5-HT3: canais iônicos dependentes de ligante, permeáveis a
Na+/K+, encontrados nas membranas pré- e pós-sináptica. Sua ativação
contribui para despolarização celular (NICHOLS; NICHOLS, 2008).
O transportador para serotonina (5-HTT), localizado na membrana do neurônio
pré-sináptico, remove 5-HT da sinapse (MOHAMMAD-ZADEH; MOSES;
GWALTNEY-BRANT, 2008). Novamente dentro do neurônio, 5-HT pode ser reciclada
em vesículas sinápticas ou metabolizada no citosol pela enzima monoaminoxidase
(MAO), formando ácido 5-HIAA, metabólito excretado principalmente pela via urinária
(Figura 3) (MCISAAC; PAGE, 1959).
Figura 3. Síntese de 5-HT em neurônios e suas interações com receptores específicos (NICHOLS;
NICHOLS, 2008).
13
Dentre as áreas encefálicas envolvidas na produção de 5-HT, o núcleo dorsal da
rafe (B6/B7), envia densa inervação serotonérgica para o prosencéfalo e para regiões
importantes de regulação do humor (Quadro 1) (ISHIMURA et al., 1988).
Quadro 1. Apresentação das principais aferências e eferências do núcleo dorsal da rafe.
Porção núcleo
dorsal da rafe
Aferências principais Eferências principais
Rostral
(Bregma -6,92 a -7,94)
Córtex cingulado rostral
Córtex peduncular dorsal
Áreas pré-ópticas medial
e lateral
Áreas hipotalâmicas
posteriores
Habênula lateral
(PEYRON et al., 1998; WANG;
GUAN; SHIODA, 2001)
Caudado putâmen
Amígdala
Substância negra
(IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986)
Medial
(Bregma -7,73 a -8,45)
Córtex cingulado rostral
Córtex infralímbico
Córtex peduncular dorsal
Núcleo central da
amígdala
Bed nucleus da estria
terminal
Pálido ventral
Áreas pré-ópticas medial
e lateral
Núcleos hipotalâmicos
Habênula lateral
Núcleo paraventricular
(PEYRON et al., 1998; WANG;
GUAN; SHIODA, 2001)
Caudado putâmen
Hipocampo
Núcleo central da
amígdala
Substância negra
Área hipotalâmica dorsal
Bed nucleus da estria
terminal
Substância cinzenta
periaqueductal
Córtex pré-frontal medial
Núcleo basolateral da
amígdala
Núcleo accumbens
(COMMONS; CONNOLLEY;
VALENTINO, 2003; IMAI;
STEINDLER; KITAI, 1986;
STEZHKA; LOVICK, 1997; HALE
14
et al., 2008; VAN BOCKSTAELE;
BISWAS; PICKEL, 1993)
Caudal
(Bregma -8,52 a -9,24)
Córtex pré-frontal
medial
Habênula lateral
Núcleo interpeduncular
Área pré-óptica lateral
Área hipotalâmica
perifornical, tegmental
laterodorsal, núcleo
arqueado
Substância negra
Núcleo prepósito
Núcleo do hipoglosso
Área postrema
(LEE et al., 2003)
Revestimento ependimal
dos ventrículos
Locus coeruleus
Hipocampo ventral
Amígdala
Núcleos talâmicos
(KROUT; BELZER; LOEWY,
2002; MIKKELSEN; HAY-
SCHMIDT; LARSEN, 1997;
SIMPSON et al., 1998; IMAI;
STEINDLER; KITAI, 1986)
Foi observado que o núcleo dorsal da rafe exibe uma organização topográfica
conforme suas entradas e saídas de fibras axonais, suas funções e parâmetros
citoarquitetônicos (REN et al., 2018; LOWRY et al., 2008a). Com base nestas
características, Lowry e colaboradores (2008) propuseram a subdivisão do núcleo dorsal
da rafe nas seguintes partes: dorsal (DRD), ventrolateral (DRVL), ventral (DRV),
interfascicular (DRI) e caudal (DRC) (Figura 4 e 5), cujas funções na regulação de
respostas comportamentais e emocionais seriam distintas (LOWRY et al., 2008a).
15
Figura 4. Ilustração de uma secção mediana sagital do tronco encefálico de rato, apresentando a
distribuição de neurônios serotonérgicos no mesencéfalo, ponte e medula. Cada ponto representa um
neurônio imunomarcado para triptofano-hidroxilase. Abreviações: Aq, aqueduto cerebral; DRC, parte
caudal do núcleo dorsal da rafe; DRD, parte dorsal do núcleo da rafe; DRV, parte ventral do núcleo dorsal
da rafe; IPA, núcleo interpeduncular; mlf, fascículo medial longitudinal; RMg, núcleo da rafe; ROb, núcleo
obscuro da rafe; RPa, núcleo pálido da rafe; xscp, decussação do pendúnculo cerelebar superior. A escala
ilustra a posição ântero-posterior tendo como referência o Bregma (mm). Barra de escala 1mm (LOWRY
et al., 2008a).
16
Figura 5. Ilustração de secções coronais do tronco encefálico de rato, apresentando os principais grupos
celulares da rafe, o DR com suas subdivisões e o MRN. Abreviações: Aq, aqueduto cerebral; DRC, parte
caudal do núcleo dorsal da rafe; DRD, parte dorsal do núcleo da rafe; DRV, parte ventral do núcleo dorsal
da rafe; DRVL, parte ventrolateral do núcleo dorsal da rafe; MRN, mediano da rafe. A imagem superior
representa a secção localizada no bregma -8.04, e a imagem inferior, bregma -8.64 conforme o Atlas
Paxinos e Watson (modificado PAXINOS; WATSON, 2007).
17
1.3.2. Influência do sistema serotonérgico das porções dorsal e caudal do
núcleo dorsal da rafe na modulação de comportamentos emocionais
Estudos mostraram que as porções dorsal (DRD) e caudal (DRC) do núcleo dorsal
da rafe, são seletivamente ativadas por um número de estímulos estressantes e
relacionados a ansiedade, participando da modulação de comportamentos emocionais
(LOWRY et al., 2008b; HALE; LOWRY, 2011). Por exemplo, estudos avaliando o DRD,
observaram que drogas ansiogênicas, tais como cafeína, antagonista do receptor de
adenosina; m-clorofenil piperazina, agonista do receptor 5-HT2A/2C; e o N-metil-beta-
carbolina-3-carboxamida (FG-7142), agonista inverso parcial benzodiazepínico podem
ativar os neurônios nesta região (ABRAMS et al., 2005). Além disso, o neurotransmissor
urocortina 2 (neurotransmissor da família do CRF), o CRF e estímulos ansiogênicos e
estressantes, podem ativar as duas regiões, DRD e DRC (EVANS; HEERKENS;
LOWRY, 2009; GARDNER et al., 2005; HALE et al., 2010; HAMMACK et al., 2002;
STAUB; SPIGA; LOWRY, 2005).
Pesquisadores viram que quando se ativava neurônios a partir do DRD com
projeções para o núcleo central da amígdala, a liberação e aumento de 5-HT na região
favorecia um comportamento do tipo ansioso nos animais. Quando se depletava a enzima
triptofano hidroxilase 2 destes neurônios, reduzia-se o comportamento ansiogênico (REN
et al., 2018).
Algumas características importantes destas regiões: O DRD no encéfalo de ratos
se estende aproximadamente do bregma -7.32 a -8.40 no Atlas proposto por Paxinos e
Watson (PAXINOS; WATSON, 2007). É limitado dorsalmente pelo aqueduto
mesencefálico, ventralmente pelo DRV e lateralmente pelo DRVL. Possui células de
tamanho médio fusiformes ou bipolares, orientadas em direção rostrocaudal. Na região
mediana ao longo da extensão rostrocaudal do DRD, há um denso grupo central de
células chamado DRD core (DRDc) e ao redor há neurônios dispersos, chamados de DRD
shell (DRDSh) (LOWRY et al., 2008a; LOWRY et al., 2008b; ABRAMS et al., 2005).
O DRD recebe um grande número de aferências, das partes lateral, ventral e
medial do núcleo intersticial da estria terminal. Junto com o DRVL, recebe aferências de
fibras descendentes do córtex infralímbico (LOWRY et al., 2008a). Envia eferências para
o núcleo central da amígdala, região envolvida em respostas fisiológicas e
comportamentais ao medo. Origina também densa inervação na área dorsal hipotalâmica,
envolvida em respostas autonômicas, neuroendócrinas e comportamentais induzidas pelo
18
estresse. Ainda, envia projeções para o núcleo intersticial da estria terminal, envolvido na
regulação de comportamentos relacionados a ansiedade. Além disso, envia projeções
colaterais para o núcleo accumbens, córtex pré-frontal medial e núcleo basolateral da
amígdala (IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986; VAN BOCKSTAELE; BISWAS;
PICKEL, 1993).
Já o DRC no encéfalo de rato se estende aproximadamente do bregma -8.40 a -
9.24 no Atlas proposto por Paxinos e Watson (PAXINOS; WATSON, 2007). É
delimitado dorsalmente pelo aqueduto mesencefálico, lateralmente pelo núcleo tegmentar
dorsal e ventralmente pelo DRI. Contém pequenos neurônios serotonérgicos redondos na
sua parte rostral e neurônios de tamanho médio (HALE; LOWRY, 2011a).
Aferências direcionadas ao DRC são originadas do córtex pré-frontal medial,
habênula lateral, núcleo interpeduncular, área pré-óptica lateral, área hipotalâmica
perifornical, núcleo tegmental laterodorsal, núcleo arqueado, substância negra, núcleo
prepósito, núcleo do hipoglosso e área postrema (LEE et al., 2003).
Neurônios da parte dorsal do DRC, próximas ao aqueduto, se projetam para o
revestimento ependimal dos ventrículos (MIKKELSEN; HAY-SCHMIDT; LARSEN,
1997; SIMPSON et al., 1998). Também, envia projeções para o locus coeruleus, o
hipocampo ventral, amígdala (IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986) e para núcleos
talâmicos (KROUT; BELZER; LOEWY, 2002).
Dados prévios da literatura, inclusive aqueles obtidos no Laboratório de
Psicofarmacologia, do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte - UFRN, mostraram que a retirada do álcool após
consumo a longo prazo favorece respostas defensivas relacionadas a ansiedade e a
depressão em ratos e ratas (JUNQUEIRA-AYRES et al., 2017; SANTOS, 2014). As
evidências mencionadas nos parágrafos anteriores apontam a transmissão serotonérgica
do DRD e DRC como candidatas à modulação destas respostas comportamentais
observadas na abstinência. Apesar da menor prevalência do abuso de álcool por mulheres,
estas são mais diagnosticadas com desordens emocionais, quando comparadas aos
homens (“WHO | Gender and women’s mental health”, 2013). Tendo em vista este fator,
neste trabalho foram utilizadas lâminas de imunoistoquímica com marcação para
serotonina de fêmeas – ratas Wistar –, que passaram por consumo em longo prazo de
álcool (21 dias) e retirada alcoolica em curto (72h) e longo prazo (21 dias). As ratas que
passaram pelo período de abstinência apresentaram comportamentos ansiogênicos, porém
19
não apresentaram alterações no número de celular serotonérgica no núcleo dorsal da rafe
(dados não publicados SANTOS, 2014). No presente estudo, foi testada a hipótese de que
a exposição a longo prazo e da retirada do álcool promove alterações de densidade celular
serotonérgica no DRD e no DRC do núcleo dorsal da rafe.
18
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Verificar se a retirada do álcool após consumo a longo prazo altera a densidade de
células serotonérgicas do DRD e no DRC.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar a marcação de serotonina no DRD em ratas Wistar submetidas ao
consumo de álcool por 21 dias, à retirada de álcool por 72h e à retirada de álcool
por 21 dias.
Avaliar a marcação de serotonina nas porções rostral, média e caudal do DRD em
ratas Wistar submetidas ao consumo de álcool por 21 dias, à retirada de álcool por
72h e à retirada de álcool por 21 dias.
Avaliar a marcação de serotonina no DRC em ratas Wistar submetidas ao
consumo de álcool por 21 dias, à retirada de álcool por 72h e à retirada de álcool
por 21 dias.
19
3. METOLODOLOGIA
3.1. Animais
Para a realização do estudo foram utilizadas ratas Wistar adultas (90 dias)
provenientes do Biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (DBF-UFRN). As mesmas foram alojadas em gaiolas de
polietileno, com livre acesso à ração e água ou às soluções de álcool de acordo com grupo
experimental. Foram mantidas em ambiente controlado sob o ciclo de luz claro-escuro de
12 horas (06:00 às 18:00) e temperatura 22°C ± 1°C. Os procedimentos experimentais
tiveram aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN (protocolo
n.°: 051/2012). As etapas: protocolo de consumo e retirada de álcool, perfusão
transcardíaca, microtomia e imunoistoquímica foram realizadas pela Bióloga Raliny
Oliveira Santos.
3.2. Protocolo de consumo e retirada de álcool
Os animais foram divididos em quatro grupos, da seguinte forma:
Grupo controle (n=6): consumo de água ad libitum por 21 dias
Grupo consumo em longo prazo (n=6): consumo de álcool por 21 dias
Grupo retirada em curto prazo (n=6): consumo de álcool por 21 dias e retirada
alcoolica de 72h
Grupo retirada em longo prazo (n=7): consumo de álcool por 21 dias e retirada
alcoolica de 21 dias.
Os animais dos grupos tratados foram submetidos ao álcool como única fonte de
dieta líquida em concentrações crescentes (adaptado de TIRAPELLI et al., 2008). O
álcool possui um gosto aversivo para os animais, este modo de exposição permite os
animais se adaptarem gradualmente a dieta alcoolica. O protocolo de tratamento utilizado
será demonstrado no esquema a seguir:
20
O tratamento crônico com etanol foi iniciado com solução de álcool 2% (1° dia),
sendo gradualmente aumentado a cada três dias para 4% (4° dia) e 6% (7° dia em diante,
mantendo está concentração até o 21° dia). Após o consumo prolongado, foram realizados
seguintes protocolos:
Consumo contínuo de álcool
(grupo consumo longo prazo)
Após 21 dias de consumo prolongado, os
animais foram em seguida submetidos a
perfusão transcardíaca para remoção do
encéfalo e posterior análise
imunoistoquímica.
Retirada em curto prazo
(grupo de retirada curto prazo)
Após 21 dias de consumo prolongado, o
álcool foi substituído por água e, com 72
horas de abstinência, os animais foram
submetidos a perfusão transcardíaca para
remoção do encéfalo e posterior análise
imunoistoquímica.
Retirada em longo prazo
(grupo de retirada longo prazo)
Após 21 dias de consumo prolongado, o
álcool foi substituído por água e, com 21
dias de abstinência, os animais foram
21
submetidos a perfusão transcardíaca para
remoção do encéfalo e posterior análise
imunoistoquímica.
O grupo controle recebeu água ad libitum durante todo o experimento.
3.3. Perfusão transcardíaca
Os animais foram anestesiados por meio da administração de Quetamina e
Xilazina (80 mg/Kg/mL e 10 mg/Kg/mL i.p., respectivamente) e submetidos à técnica de
perfusão transcardíaca. Durante o procedimento o animal foi posicionado em decúbito
dorsal sobre uma tela de arame mantida na horizontal dentro de uma capela de exaustão
com ponto de água corrente. Depois, com auxílio de materiais cirúrgicos, foi feito um
corte na cavidade torácica para dar acesso ao coração. Foi inserida uma agulha (17mm x
1,5mm) no ventrículo esquerdo de modo que ficasse orientada em direção à aorta. A
agulha era conectada à uma bomba peristáltica que impulsionou 400 ml de solução NaCl
0,9% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 (PB), seguido de 700 ml de paraformaldeído 4%
em PB. Imediatamente após a inserção da agulha no ventrículo esquerdo, o átrio direito
foi seccionado para que o sangue fosse escoado do corpo do animal. Posteriormente, os
encéfalos foram retirados e permaneceram 4h em solução de paraformaldeído 4% e
sacarose 30% em PB para a pós-fixação. Depois, os encéfalos foram armazenados em
solução de sacarose 30% em PB até a realização do procedimento de microtomia. Para
evitar o desenvolvimento de fungos, a solução de sacarose foi trocada diariamente.
3.4. Microtomia
Os encéfalos foram congelados em gelo seco e seccionados em micrótomo de
deslizamento manual. Foram feitos cortes coronais com uma espessura de 30 µm, onde
foram distribuídos serialmente e sequencialmente em seis compartimentos, de modo que
os cortes em cada poço tiveram uma distância de 180 µm. As secções foram armazenadas
em solução anticongelante e acondicionadas em um freezer com temperatura de -20 °C
até a realização do processo imunoistoquímico.
22
3.5. Imunoistoquímica para 5-HT
Para a imunoistoquímica, os cortes foram retirados da solução anticongelante e
submetidos a um tratamento prévio para inativação de peroxidases endógenas e
prevenção da formação de artefatos. Inicialmente, os cortes foram lavados em tampão
fosfato 0,1M, pH 7,4 (TF) por 5 minutos, quatro vezes. As lavagens foram realizadas em
recipientes posicionados em agitador orbital. Depois, os cortes foram incubados com
solução de peróxido de hidrogênio 0,03% em TF durante 20 minutos. Em seguida, foram
lavados quatro vezes em TF, com duração de 5 minutos para cada lavagem. Após, os
cortes foram incubados em solução contendo o anticorpo primário anti-5-HT obtido em
coelho (1:5000) diluído em TF contendo Triton X-100 0,04% e soro normal de cabra
(1:50) durante 18h e colocados em um rotor com rotação lenta e eixo de inclinação de
30°. Depois, os cortes foram lavados quatro vezes em TF com duração de 4 min cada
lavagem. Em sequência, foram incubados com solução contendo anticorpo secundário
diluído anti-coelho, obtido em cabra (1:1000) em tampão fosfato contendo Triton X-100
0,4% por 2h. Após, foram feitas mais quatro lavagens por 5 min cada, em solução tampão.
Depois, as secções foram incubadas com complexo avidina-biotina-peroxidase Triton X-
100 NaCl por 2h. Posteriormente, realizou-se mais quatro lavagens com TF. Para a
visualização da reação, as secções foram submetidas a uma técnica de revelação que
ocorria em meio líquido contendo TF e peróxido de hidrogênio 0,003%, tendo como
cromógeno a diaminobenzidina. Os cortes foram imersos nesta solução por 10 min.
Passado o período, os cortes foram lavados quatro vezes em TF, 5 min a cada lavagem.
Finalmente, as soluções foram montadas em lâminas de vidro gelatinizadas. Depois da
secagem em temperatura ambiente, a reação de imunoistoquímica foi intensificada em
solução de tetróxido de ósmio a 0,05% seguida de desidratação e diafinização em bateria
de álcoois. Com auxílio do meio de montagem ERV-MOUNT as lamínulas foram coladas
sobre as lâminas.
3.5.1. Análise das lâminas de imunoistoquímica para 5-HT
A marcação com o anticorpo anti-5-HT permite a visualização de corpos celulares
e fibras nervosas que contenham moléculas de serotonina. Com auxílio dos diagramas do
atlas estereotáxico de encéfalo de rato (PAXINOS; WATSON, 2007), foram selecionados
cortes nas lâminas contendo o DRD (bregma -7,20 a -8,40) e o DRC (bregma -8,52 a -
23
9,24) para análise. E para mensurar as áreas do DRD e DRC nestes cortes com maior
exatidão, foram realizados os seguintes passos:
1. Nos diagramas do atlas Paxinos que continham as áreas de interesse, foram
mensuradas a largura e altura do mesencéfalo, a largura e altura das porções do
DRD ou DRC (mm). Exemplo:
2. Depois, foram mensurados a largura e altura (mm) do mesencéfalo nos cortes
selecionados das lâminas:
3. Para determinar a possível largura e altura do DRD ou DRC nos cortes foram
feitos cálculos de proporcionalidade com as medidas obtidas nos passos anteriores
da seguinte forma:
Para largura:
24
Para altura:
4. Após, as lâminas foram colocadas em microscópio óptico acoplado a câmera
digital e visualizadas com auxílio do software Neurolucida® no computador. Em
aumento de 2,5x e grade (50 μm), observando o formato da porção de interesse
no Atlas Paxinos e com as medidas obtidas pelo cálculo de proporcionalidade, as
áreas foram delimitadas com ferramentas de contorno do software.
5. Utilizando aumento de 20x e visualizando a área delimitada, foi feita uma
contagem de células imunomarcadas para 5-HT, considerando corpos celulares
preenchidos e ajustando o foco fino quando necessário.
6. Com a área das partes de interesse e o número total de células contadas, foi
realizado o cálculo da densidade celular: Densidade celular = n° células/área
(mm2)
25
3.6. Análise Estatística
Foram selecionadas as seguintes porções para análise de dados densidade celular:
DRD nas porções rostral (bregma -7,44 a -7,68), média (bregma -7,80 a -8,04)
e caudal (bregma -8,16 a -8,28);
DRD englobando todas as porções (bregma -7,44 a -8,28)
DRC (bregma -8,64 a -9,00).
Utilizando o software SPSS, os dados foram submetidos ao teste não-paramétrico
Kruskal Wallis para comparação da distribuição da densidade de células entre os
tratamentos. Quando apropriado, foram realizadas comparações em pares como teste
post-hoc. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todos os
dados serão apresentados como mediana e intervalo interquartil.
26
4. RESULTADOS
4.1. Densidade celular serotonérgica no DRD de fêmeas
A figura 6, mostra fotomicrografias de cortes coronais do encéfalo de ratas
imunomarcados para 5-HT na posição rostrocaudal do bregma -8,04, aproximadamente.
Nos cortes podemos visualizar as porções dorsal, ventrolateral e ventral do núcleo dorsal
da rafe das ratas; e corpos celulares serotonérgicos bem delimitados e preenchidos. Além
disso, percebemos uma maior intensidade de células imunomarcadas na imagem D,
referente aos animais que passaram pela retirada alcoolica em longo prazo.
Figura 6. Fotomicrografias de secções coronais encefálicas do DRD de ratas, na posição rostrocaudal do
bregma -8,04, aproximadamente. A) Grupo controle; B) Grupo álcool crônico; C) Grupo retirada curta e
D) Grupo retirada crônica. As setas preenchidas, nos quadrados inferiores, apontam os corpos celulares
imunorreativos a 5-HT. As capturas das imagens foram realizadas em aumento de 20x e 40x. Barra de
escala, 100 µm.
27
O teste de Kruskal Wallis não mostrou efeito dos tratamentos sobre a densidade
celular da porção rostral DRD, intervalo de bregma -7,44 a -7,68 [x2(3)=6,594; p=0,086].
Já na porção média do DRD, no intervalo -7,80 a -8,04, o teste estatístico evidenciou um
efeito dos tratamentos [x2(3)=8,113; p=0,044]. O teste post-hoc de comparações em pares
demonstrou diferença significativa do grupo retirada em longo prazo ao ser comparado
ao grupo controle (p=0,046). Na porção caudal do DRD, no intervalo -8,16 a -8,28,
também houve um efeito significativo dos tratamentos sobre a densidade celular
[x2(3)=8,501; p=0,037]. Sendo que o teste post-hoc evidenciou uma diferença
significativa entre os grupos retirada em longo e em curto prazo ao serem comparados
(p=0,044) (Figura 7).
Quando as densidades celulares do DRD de cada grupo tratado foram analisadas
englobando todas as porções (-7,44 a -8,28), o teste de Kruskal Wallis não mostrou
nenhum efeito significativo dos tratamentos sobre a densidade de células imunomarcadas
[x2(3)=6,770; p=0,080] (Figura 8).
28
Figura 7. Densidade celular de neurônios serotonérgicos na porção rostral (-7,44 a -7,68), média (-7,80 a -
8,04) e caudal (-8,16 a -8,28) do DRD. A) Porção rostral DRD; grupos controle (21 dias água ad libitum,
n=5), álcool crônico (21 dias álcool, n=5), retirada curta (21 dias álcool e 72h água, n=5) e retirada longa
(21 dias álcool e 21 dias água, n= 6). B) Porção média DRD; grupos controle (n=3), álcool crônico (n=6),
*
A
B
C
29
retirada curta (n=4) e retirada longa (n=5). C) Porção caudal do DRD; grupos controle (n=3), álcool crônico
(n=5), retirada curta (n=5) e retirada longa (n=6). “x” média; “*” p < 0,05 em relação ao grupo controle.
Figura 8. Densidade celular de neurônios serotonérgicos no DRD, intervalo de bregma -7,44 a -8,28.
Grupos controle (21 dias água ad libitum, n=5); álcool crônico (21 dias álcool, n=6); retirada curta (21 dias
álcool e 72h água, n=5) e retirada longa (21 dias álcool e 21 dias água, n=6).“x” média.
30
4.2. Densidade celular serotonérgica no DRC de fêmeas
A figura 9, mostra fotomicrografias de cortes coronais do encéfalo de ratas
imunomarcados para 5-HT na posição rostrocaudal do bregma -8,64, aproximadamente.
Nos cortes podemos visualizar a porção caudal do núcleo dorsal da rafe das ratas; e corpos
celulares serotonérgicos bem delimitados e preenchidos. Nas imagens, fica evidente que
a subdivisão DRC possui menor número de células serotonérgicas quando comparada a
subdivisão DRD. Na fotomicrografia A, referente ao grupo controle, percebemos uma
menor quantidade destas células, além de estarem com uma imunomarcação mais fraca,
quando comparada visualmente aos outros grupos.
Figura 9. Fotomicrografias de secções coronais encefálicas do DRC de ratas, na posição rostrocaudal do
Bregma -8.64, aproximadamente. A) Grupo controle; B) Grupo álcool crônico; C) Grupo retirada aguda e
D) Grupo retirada longa. As setas preenchidas, nos quadrados inferiores, apontam corpos celulares
imunorreativos a 5-HT. As capturas das imagens foram realizadas em aumento de 20x e 40x. Barra de
escala, 100 µm.
31
No DRC, o teste de Kruskal Wallis mostrou um efeito significativo dos
tratamentos sobre a densidade celular [x2(3)=8,557; p=0,036]. O teste post-hoc
evidenciou uma diferença significativa da densidade celular do grupo retirada a longo
prazo ao ser comparado ao grupo controle (p=0,037) (Figura 10).
Figura 10. Densidade celular de neurônios serotonérgicos no DRC, intervalo de bregma -8,64 a -9,00.
Grupos controle (21 dias água ad libitum, n=3); álcool crônico (21 dias álcool, n=5); retirada curta (21 dias
álcool e 72h água, n=4) e retirada longa (21 dias álcool e 21 dias água, n=6).“x” média; “*” p < 0,05 em
relação ao grupo controle.
*
32
5. DISCUSSÃO
No presente estudo, observou-se a densidade celular serotonérgica nas
subdivisões dorsal e caudal do NDR após consumo e retirada de álcool, visto que estas
regiões tem um papel importante na modulação das emoções. Transtornos de ansiedade
e depressão são observados em pacientes dependentes de álcool, principalmente durante
o período de abstinência. Tais emoções os predispõe ao comportamento de beber para o
alívio dos sintomas negativos, continuando o ciclo prejudicial da dependência do álcool.
Em roedores, dentre as respostas comportamentais observadas no período de
abstinência alcoolica, destacam-se as respostas defensivas relacionadas à ansiedade
(BONASSOLI; MILANI; DE OLIVEIRA, 2011; LOWERY-GIONTA;
MARCINKIEWCZ; KASH, 2015; OVERSTREET et al., 2006; SANTOS, 2014;
FLEMING et al., 2019; SIDHU; KREIFELDT; CONTET, 2018; METTEN et al., 2018).
Santos (2014) avaliou os efeitos da retirada de 72 horas e de 21 dias após consumo de
álcool por 21 dias sobre comportamento de ratas Wistar submetidas ao teste do labirinto
em cruz elevado e do campo aberto. A pesquisadora observou um aumento no
comportamento do tipo ansioso das fêmeas dos grupos retirada em curto e em longo prazo
do álcool submetidas ao labirinto em cruz elevado, pois as mesmas diminuíram o tempo
de exploração dos braços abertos do aparato. Ainda, foi visto um efeito do tipo
ansiogênico da retirada em longo prazo no teste do campo aberto; as ratas deste grupo
diminuíram a exploração da área central do aparato, quando comparadas às fêmeas do
grupo controle (SANTOS, 2014).
Junqueira-Ayres e colegas (2017) utilizando ratos Wistar e o mesmo protocolo de
exposição e retirada do álcool empregado por Santos (2014) e do presente estudo,
observaram um aumento do comportamento do tipo ansioso nos animais que passaram
pela retirada alcoolica em curto prazo (72 h), mas não nos animais do grupo retirada em
longo prazo (21 dias) (JUNQUEIRA-AYRES et al., 2017). Estes resultados indicam uma
diferença dos comportamentos ansiogênicos atribuídas ao gênero. É relatado na literatura
que mulheres sofrem mais de transtornos emocionais do tipo ansiosos (MCLEAN et al.,
2011); desta forma, pode ser sugerido fêmeas tenham maior sensibilidade e se recuperem
mais lentamente dos sintomas ansiosos provocados consumo a longo prazo e retirada do
álcool.
Apesar da possibilidade de investigar os efeitos da exposição e da abstinência do
álcool sobre o sistema serotonérgico em pacientes e em animais de laboratório, os dados
33
disponíveis na literatura são conflitantes. Por exemplo, o nível do metabólito da
serotonina, o ácido 5-HIAA, no líquido cefalorraquidiano de pacientes dependentes de
álcool de início precoce (antes dos 25 anos de idade) abstinentes encontra-se mais baixo
do que em dependentes de início tardio (depois dos 25 anos de idade) (FILS-AIME et al.,
1996). Estudos avaliando os níveis de 5-HIAA e de triptofano no líquido
cefalorraquidiano de pacientes do sexo feminino com dependência de álcool encontraram
que apenas o 5-HIAA estava diminuído nestas pacientes, quando comparados à
indivíduos controles (BANKI, 1981), sugerindo que o baixo nível de 5-HT e seus
metabólitos não seja devido a uma deficiência nutricional ou alteração do transporte
destes no líquido cefalorraquidiano (BANKI, 1981).
Outros estudos conduzidos em humanos (post mortem), avaliando a região do
NDR, observaram um aumento significativo da enzima triptofano hidroxilase no DRD de
indivíduos suicidas deprimidos dependentes de álcool (BONKALE; TURECKI;
AUSTIN, 2006). Ainda, em outro estudo post mortem, foi relatado um aumento dos
processos neuronais serotonérgicos em toda porção do NDR de indivíduos dependentes
de álcool, sugerindo que a síntese do neurotransmissor estaria aumentada
(UNDERWOOD; MANN; ARANGO, 2007).
Esta discrepância de resultados é também observada em estudos com animais de
laboratório avaliando o efeito do álcool sobre a transmissão serotonérgica: baixos níveis
de 5-HT e 5-HIAA foram encontrados no encéfalo de roedores que possuem preferência
pelo álcool, quando comparados à animais sem preferência pelo álcool. Nos animais com
preferência pelo álcool, os níveis do neurotransmissor e seu metabólito estavam reduzidos
no córtex, no hipocampo, no corpo estriado, no tálamo e no hipotálamo (MURPHY et al.,
1982).
Outros trabalhos investigaram os efeitos da exposição e da retirada de álcool sobre
a transmissão serotonérgica especificamente no NDR de roedores. Yamane e
colaboradores (2003), testaram o efeito do tratamento com álcool por 14 dias
(concentração de 50%, via subcutânea) sobre a síntese de 5-HT no encéfalo de ratos e
sugeriram que não houve aumento da atividade serotonérgica no NDR após este
tratamento. Eles observaram, por meio de análise autorradiográfica, um aumento da taxa
de síntese de 5-HT em alguns grupos celulares descendentes da rafe, em estruturas
nigroestriatais, no hipocampo e no córtex, mas não encontraram mudanças na atividade
de síntese nos núcleos dorsal e mediano da rafe no corpo pineal (YAMANE;
34
TOHYAMA; DIKSIC, 2003). Estes dados corroboram com o achado do presente estudo,
no qual a exposição ao álcool por 21 dias não alterou a densidade celular serotonérgica
nas subdivisões dorsal e caudal do NDR.
Porém, no estudo conduzido por Shibasaki e colaboradores (2010), foi observado
um aumento no RNA mensageiro para o transportador de 5-HT (5-HTT) na região
mesencefálica superior contendo o NDR (grupos celulares B6 e B7) de camundongos
machos após o tratamento com vapor de álcool por 9 dias (SHIBASAKI et al., 2010). Os
autores sugeriram que este aumento, acompanhado de uma elevada expressão do 5-HTT
em áreas de projeção, como córtex, hipocampo e núcleo accumbens, representaria uma
resposta adaptativa a um aumento de 5-HT liberada durante a exposição prologada ao
álcool. Confirmando a hipótese de que a exposição ao álcool em longo prazo aumenta a
transmissão serotonérgica no NDR, Yoshimoto e colaboradores (2012) encontraram um
aumento no metabolismo de 5-HT (proporção aumentada de 5-HIAA:5-HT) no NDR de
camundongos machos C57BL ⁄6J tratados com vapor de álcool intermitente por 20 dias
(YOSHIMOTO et al., 2012). Curiosamente, no estudo de Shibasaki e colaboradores
(2010), em outra área de projeção do NDR envolvida na modulação das emoções, a
amígdala, houve uma redução na expressão da proteína 5-HTT, o que ilustra quão
complexo é avaliar os efeitos do álcool sobre a transmissão serotonérgica. Além disso,
diferenças metodológicas, tais como protocolo de exposição ao álcool, diferenças
interespécies, bem como acuidade em relação às áreas do NDR consideradas para análise
podem contribuir para as divergências entre os achados de trabalhos aumentando o nível
de complexidade de compreensão dos efeitos do álcool sobre o sistema serotonérgico.
É importante considerar também, a diversidade de receptores serotonérgicos
presentes no NDR. Neste sentido, Kelai e colaboradores (2008) mostraram que
camundongos expostos ao consumo voluntário de álcool durante 21 dias exibiram uma
aumentada sensibilidade do autorreceptor 5-HT1A, que é inibitório, nesta área.
Encontraram este resultado quando administraram um agonista do receptor 5-HT1A e a
potência deste agonista foi aumentada no NDR dos animais que consumiram álcool, aos
serem comparados com o grupo controle (KELAÏ et al., 2008). Já o trabalho de
Yoshimoto e colaboradores (2012) demonstrou um aumento de receptores excitatórios
dos subtipos 5-HT2A e 5-HT2C no NDR de camundongos após exposição prolongada ao
vapor de álcool por 20 dias (YOSHIMOTO et al., 2012).
35
A mesma complexidade pode ser observada quando os efeitos da retirada do
álcool são investigados. Um estudo utilizando a técnica de eletrofisiologia, no qual foi
avaliada a atividade de neurônios no NDR de camundongos DBA2/J após exposição ao
vapor de álcool por 5 dias, registrou um aumento da excitabilidade e uma redução da
transmissão inibitória no NDR durante a retirada alcoolica de 24 horas (LOWERY-
GIONTA; MARCINKIEWCZ; KASH, 2015). Analisando o efeito da retirada por um
período maior, de 7 dias, os pesquisadores observaram o aumento da transmissão
excitatória no NDR ainda presente. Os autores sugeriram que o aumento da excitabilidade
no NDR seria devido ao aumento de receptores glutamatérgicos e do próprio
neurotransmissor glutamato (LOWERY-GIONTA; MARCINKIEWCZ; KASH, 2015).
Corroborando estes achados, Bonassoli e colegas (2011) observaram uma maior
marcação para proteína Fos (marcadora de atividade neuronal) indicando maior ativação
de neurônios do NDR em um período de 24 horas de abstinência alcoolica após 21 dias
de consumo de solução de álcool concentrada em 6 a 8% (BONASSOLI; MILANI; DE
OLIVEIRA, 2011).
No presente trabalho, a retirada em longo prazo aumentou significativamente a
densidade de células imunomarcadas para serotonina na porção média do DRD e no DRC.
Porém na porção rostral e caudal do DRD dos animais, nenhum dos tratamentos
provocaram alteração da densidade celular serotonérgica. Na porção caudal DRD foi
possível observar uma tendência de aumento da densidade no grupo retirada alcoolica em
longo prazo, porém o teste estatístico não evidenciou diferenças significativas. Os
neurônios do NDR recebem diferentes aferências ao longo do eixo rostrocaudal (veja o
Quadro 1). Aqueles localizados na porção média NDR recebem pesadas aferências de
regiões moduladoras de respostas e comportamentos emocionais como a amígdala e bed
nucleus da estria terminal, já os neurônios mais rostrais NDR não recebem estas mesmas
aferências (PEYRON et al., 1998; REN et al., 2018). Assim o padrão de distribuição de
aferências no NDR poderia explicar a diferença da densidade celular observada nas
diferentes porções do DRD vista neste estudo.
Durante a retirada do álcool, há uma maior excitabilidade em neurônios do NDR,
provavelmente mediada pelo aumento na transmissão glutamatérgica (LOWERY-
GIONTA; MARCINKIEWCZ; KASH, 2015). Como o glutamato consegue gerar
potenciais de ação em neurônios serotonérgicos por sua ação em receptores específicos,
tais como receptores NMDA (BELMER; MAROTEAUX, 2018; DE KOCK et al., 2006),
36
seria plausível sugerir que a atividade de neurônios serotonérgicos esteja aumentada no
NDR na retirada do álcool por 21 dias. Ainda, pode ser sugerido aumento da síntese do
neurotransmissor 5-HT, por isso pode ser observado aumento da densidade celular.
Neste trabalho, a retirada do álcool por 72 horas não alterou a densidade de células
marcadas para serotonina nas porções do DRD e no DRC. Curiosamente, Pistis e
colaboradores (1997) observaram que na retirada de 12 horas após 6 dias de tratamento
com álcool (concentração 20%, via intragástrica), houve uma diminuição da taxa média
de disparo de neurônios serotonérgicos do NDR de ratos, no intervalo de bregma -7,7 a -
7,9 mm.
Corroborando com a ausência de efeito encontrado no presente estudo, com 72
horas de retirada alcoolica, os autores observaram uma normalização dos disparos de
neurônios serotonérgicos no NDR (PISTIS et al., 1997). Considerando que estes autores
não consideraram as diferentes subáreas do NDR em sua análise eletrofisiológica,
permanece por ser investigado se outras porções do NDR, como a ventrolateral e a
ventral, estariam envolvidas na modulação da retirada a curto prazo do álcool e quais
sistemas de neurotransmissão participam nesta modulação.
Como descrito anteriormente, as porções DRD/DRC podem ser ativadas por
substâncias e estímulos ansiogênicos (ABRAMS et al., 2005; GARDNER et al., 2005;
EVANS; HEERKENS; LOWRY, 2009; HAMMACK et al., 2002; STAUB; SPIGA;
LOWRY, 2005). Tanto o DRD, como o DRC possuem projeções para áreas associadas
com a modulação das emoções, tais como amígdala e suas extensões (como o bed nucleus
da estria terminal), hipotálamo paraventricular e hipocampo ventral (COMMONS;
CONNOLLEY; VALENTINO, 2003; IMAI; STEINDLER; KITAI, 1986; CALHOON;
TYE, 2015; REN et al., 2018). Então, se o aumento na marcação para 5-HT observado
no presente trabalho representar um aumento da atividade de neurônios serotonérgicos e
aumento da síntese e liberação de 5-HT nestas áreas encefálicas terminais, tal aumento
poderia favorecer alterações comportamentais observadas durante a abstinência alcoolica.
De acordo com Deakin e Graeff (1991), projeções serotonérgicas do NDR são
ativadas por estímulos aversivos condicionados (estímulos neutros que adquirem
propriedades aversivas), e estão envolvidas no estado de ansiedade antecipatória a estes
potenciais estímulos ou ambientes nocivos. Os autores propuseram que a 5-HT facilita
comportamentos de evitação, congelamento e vigilância, quando liberada na amígdala e
em outras áreas prosencefálicas, podendo funcionar como um sistema modulador da
37
ansiedade antecipatória ou um sistema favorecedor do medo. Eles também propuseram
que a 5-HT pode interromper respostas de luta/fuga mediadas por áreas envolvidas no
sistema de defesa ativado por ameaças próximas, dentre elas a substância cinzenta
periaqueductal (DEAKIN; GRAEFF, 1991). Quando as ameaças são detectadas à
distância pela amígdala, respostas autonômicas e respiratórias da substância cinzenta
periaqueductal são ativadas, mas a resposta de luta/fuga é interrompida pela ação da 5-
HT liberada na região, vinda de projeções do NDR. Assim, Deakin (2013) sugeriu que a
ansiedade antecipatória pode guiar o organismo discretamente para longe da ameaça
(DEAKIN, 2013).
Com base nos dados comportamentais previamente observados no laboratório e
nos de imunoistoquímica aqui apresentados, poderia ser proposta a hipótese de que o
aumento na marcação de 5-HT aqui observado seja importante para a expressão do
comportamento do tipo ansiogênico causado pela retirada em longo prazo, mas não em
curto prazo, do álcool. Sendo assim, um aumento de 5-HT no NDR estaria relacionado a
um aumento na liberação de 5-HT em áreas de projeções deste núcleo, dentre elas, a
amígdala e o bed nucleus da estria terminal.
De fato, na amígdala o aumento de 5-HT contribuiu para respostas de ansiedade
(CHRISTIANSON et al., 2010; REN et al., 2018). Pesquisadores observaram que ao
ativar neurônios do núcleo dorsal da rafe que se projetavam para o núcleo central da
amígdala, a liberação e aumento de serotonina na região favorecia um comportamento do
tipo ansioso nos animais (REN et al., 2018). Ainda, quando ratos eram expostos a um
estímulo estressante incontrolável (choque nas patas), havia um aumento de 5-HT na
amígdala basolateral capaz de ativar receptores 5-HT2C e favorecer respostas de
ansiedade (CHRISTIANSON et al., 2010). De maneira interessante, quando os receptores
5-HT2C na amígdala eram previamente antagonizados, impedindo parte da ação
serotonérgica, ocorria uma atenuação do comportamento do tipo ansioso exibido na
retirada de 5 horas após 15 dias de exposição ao álcool (OVERSTREET et al., 2006).
Permanece por ser investigado se o efeito do tipo ansiogênico observado por Santos
(2014) utilizando o mesmo protocolo de retirada (72 horas e, principalmente, 21 dias)
empregado no presente estudo envolve a ativação de receptores 5-HT2C ou de outros
subtipos de receptores em áreas de projeção do DRD e do DRC, como a amígdala e o bed
nucleus da estria terminal.
38
No bed nucleus da estria terminal, a 5-HT liberada pode interagir com um
subconjunto de neurônios CRF despolarizando-os, via ativação de receptores 5-HT2C
(MARCINKIEWCZ et al., 2016). E o CRF liberado pode interagir com receptores CRF-
1, favorecendo comportamentos do tipo ansiosos (HUANG et al., 2010). Estudos
mostraram que animais que foram expostos cronicamente ao álcool e depois passaram
pelo processo de retirada de 4,5 a 9 horas apresentaram altos níveis de CRF no bed
nucleus da estria terminal (OLIVE et al., 2002). Desta forma, ainda que o período de
abstinência seja maior, o aumento de 5-HT nesta região, favorecendo o aumento na
transmissão mediada por CRF poderia, também, contribuir para respostas ansiogênicas
vistas na retirada em longo prazo do álcool.
Outra hipótese que poderia ser levantada seria a possibilidade da liberação da
serotonina vesicular do NDR ocorrer localmente via soma, dendritos e axônios
(COLGAN; PUTZIER; LEVITAN, 2009; COLGAN et al., 2012; BRUNS et al., 2000),
estar modulando localmente a atividade de neurônios do NDR (ADELL et al., 2002;
ANDRADE et al., 2015). Esta hipótese é corroborada por estudos de microinjeção de
drogas, os quais demonstram que a administração do agonista parcial de receptores 5-
HT1A buspirona no NDR reduziu os efeitos comportamentais da retirada de 5 horas de
álcool (OVERSTREET et al., 2003). E, quando se administrou um agonista inverso
(efeitos semelhantes à antagonistas) de receptores 5-HT2, não houve redução do
comportamento do tipo ansioso no teste de interação social. Isto porque estes receptores
estão presentes em interneurônios GABAérgicos no NDR, e a inibição destes poderia ter
retirado o controle inibitório sobre o neurônios serotonérgicos (OVERSTREET et al.,
2006). Ainda, quando se administrou ondansteron, um antagonista seletivo do receptor 5-
HT3, no NDR houve uma redução dos efeitos comportamentais da retirada de álcool por
48 horas (COSTALL et al., 1990). Considerando que os receptores 5-HT3 estão presentes
em interneurônios glutamatérgicos no núcleo dorsal da rafe (MONTI; JANTOS, 2008),
permanece por ser investigado se a liberação extrasináptica de serotonina contribui para
o aumento na transmissão serotonérgica observada na retirada do álcool em longo prazo.
Limitações técnicas do trabalho. No presente estudo, o DRD foi dividido inicialmente
em três intervalos, devido sua longa extensão e mudança de formato ao longo do eixo
rostrocaudal. Já para avaliação do DRC, a porção não foi dividida, devido a mesma ser
mais curta. Para avaliação do efeito dos tratamentos na densidade de células
39
imunomarcadas, foram analisadas todas as lâminas disponíveis previamente preparadas
dos animais de cada grupo. O número de animais era reduzido (6 animais por grupo), e
em alguns deles não foram encontrados cortes representativos dos intervalos ou estavam
com algum dano devido ao processamento das amostras durante a microtomia ou
histologia. Este fato contribuiu para redução do conjunto de dados principalmente durante
a análise do DRC. Pela proximidade desta porção com o aqueduto, durante a microtomia
possivelmente os cortes se rasgaram e quando foram observados no microscópio foram
excluídos da análise. Desta forma, estas limitações dificultaram a avaliação do efeito dos
tratamentos sobre a densidade de células marcadas nas porções do NDR. Ainda, não foi
possível repetir os experimentos, para aumentar o conjunto de dados, pois o biotério
estava passando por reforma e assim havia um número baixo de animais disponíveis.
40
6. CONCLUSÃO
Principais achados:
A retirada de álcool em longo prazo (21 dias) após consumo prolongado favoreceu
o aumento da densidade celular serotonérgica na porção média do DRD e no DRC
de fêmeas.
O tratamento com álcool por 21 dias e a retirada em curto prazo (72 horas) após
o consumo prolongado não alteram a densidade de células das porções dorsal e
caudal do núcleo dorsal da rafe.
Os dados obtidos permitem as seguintes conclusões:
A densidade serotonérgica aumentada na retirada de álcool em longo prazo pode
estar relacionada com a modulação emocional e com os comportamentos
expressos durante o período de abstinência.
Possivelmente, os processos adaptativos no sistema serotonérgico devem ocorrer
gradualmente durante o período de abstinência. Por isto, não observamos um
efeito na densidade celular serotonérgica no consumo prolongado e retirada de
álcool em curto prazo.
O aumento da densidade celular serotonérgica pode ser reflexo do aumento
atividade celular serotonérgica e aumento da síntese de serotonina. Outras análises
são necessárias para a compreensão deste processo.
Mais pesquisas precisam ser realizadas para conhecer a concentração extracelular
de 5-HT e a densidade de fibras axonais contendo este neurotransmissor no NDR
em regiões terminais de projeção DRD/DRC importantes para modulação da
emoção e desenvolvimento de afeto negativo no período de abstinência alcoolica.
Desta forma, teremos uma melhor compreensão da participação da
neurotransmissão serotonérgica na modulação dos comportamentos emocionais
nesta fase do alcoolismo.
41
7. REFERÊNCIAS
ABRAMS, J. K. et al. Serotonergic systems associated with arousal and vigilance
behaviors following administration of anxiogenic drugs. Neuroscience, v. 133, n. 4, p.
983–997, 1 jan. 2005.
ADELL, A. et al. Origin and functional role of the extracellular serotonin in the
midbrain raphe nuclei. Brain research. Brain research reviews, v. 39, n. 2–3, p. 154–
80, set. 2002.
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Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais. 5 ed., 2013.
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