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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
THIAGO GOMES COSTA
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DAS
ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DA FUCANA B EXTRAÍDA DA
ALGA Dictyota menstrualis
Natal 2014
THIAGO GOMES COSTA
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E AVALIAÇÃO DAS
ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS DA FUCANA B EXTRAÍDA DA
ALGA Dictyota menstrualis
Dissertação de mestrado apresentada ao Departamento de Bioquímica, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Profa. Drª. Luciana Guimarães Alves Filgueira
Natal 2014
Dedico esta obra
A minha orientadora Profª Dra. Luciana Guimarães pela
sua paciência e ensinamentos constantes, não só na parte
científica como ensinamentos para toda vida.
A minha mãe Rose, por todo apoio, incentivo e amor
incondicional na minha jornada de vida sempre rindo e
chorando comigo, te amo.
Ao meu pai “in memorian” por me ensinar o valor da
sabedoria, sendo um importante incentivador, financiador e
motivador dos meus estudos.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por me permitir o dom da vida. Sou muito grato por tudo.
Aos meus pais Rose e Renato Costa que acima de tudo me criaram com muito amor, me
ensinando valores que carregarei por toda vida, sou muito grato a vocês por tudo que
fizeram por mim, sem vocês isso tudo seria impossível. AMO DEMAIS E PRA
SEMPRE.
Aos meus irmãos Daniel, Renata e Débora por estarem sempre torcendo pela minha
vitória e compartilhando momentos, e por todo carinho e apoio recebido.
Á toda minha família por está sempre presente na minha vida.
Á minha orientadora Luciana pelos seus ensinamentos constantes, companheirismo, e
por entender como ninguém cada um dos seus orientandos. Por se preocupar não
somente com nossa vida acadêmica, mas também com a nossa vida pessoal. Muito
obrigada por ter me aceitado como seu primeiro aluno e ter acreditado no meu futuro
acadêmico.
Aos professores do Departamento de Bioquímica que contribuíam para minha
formação.
A professora Edda por permitir a realização de experimentos em seu laboratório, uso
de equipamentos e atuando de forma presente sempre que precisei. Meu muito
obrigado e saiba que a senhora é um exemplo a todos nós.
Aos meus amigos da graduação pela amizade e que desde sempre acreditaram no meu
potencial e me apoiaram muito.
Aos meus amigos do laboratório de Glicobiologia Vegetal que participaram
diretamente da minha jornada acadêmica, e que se tornaram não somente colegas de
trabalho, mas sim, verdadeiros amigos.
A Marília que mesmo com todas as brigas (rsrs) foi a primeira pessoa que me mostrou
como se comportar e como trabalhar no laboratório de pesquisa. Muito obrigado por
tudo.
A Celina, uma pessoa sempre esteve do meu lado me ajudando e é um exemplo a ser
seguido, compartilhamos muitos momentos juntos, fazendo experimentos, discutindo
resultados, resenhando e rindo bastante. Obrigado por toda ajuda que me foi
fundamental.
A Hugo, uma pessoa muito especial que com o passar do tempo (7 anos) foi possível
conhecer a pessoa maravilhosa que ele é, e que apesar de as vezes não aguentarmos
mais um a cara do outro (rsrs) estamos sempre juntos pro que der e vier, essa
amizade sei que é pra vida toda.
A Kahena, também minha companheira de experimento, pela ajuda e amizade a mim
dedicadas, obrigado por tudo nêga.
A Monique por compartilhar comigo seu vasto conhecimento nas minhas horas de
aperreio. Ela é a eficiência em pessoa hehehe.
A Alisson, Luíza, Joedyson, Thuane, Almino e Adriane, pela constante amizade,
carinho, atenção e auxílio.
Aos colegas da minha turma de mestrado por compartilharmos e superarmos juntos
tantos momentos de dificuldades, sempre com muita preocupação uns com os outros.
Aos colegas do laboratório do professor Eliseu, que sempre me ajudaram e que com
certeza contribuíram para a realização deste trabalho. Obrigada a Negão, Rafael
Russi, Paula, Luciana, Tici...
Aos colegas do laboratório de Biopolímero que contribuíram de forma direta ou
indireta para a realização do trabalho, obrigado professor Hugo.
Obrigado aos meus amigos de vida Rodrigo, Matheus, Ricardo, Kleber, Júlio, Adno,
Max, Alex, Drika, Ana Paula, Dudu entre outros pelo apoio durante o mestrado e
entendimento quando precisava estudar e não podia farrear rsrs a amizade de vocês é
um incentivo de vida.
Especialmente a Paulo por todo companheirismo e ajuda na formatação e
desenvolvimento das minhas figuras nessa ultima etapa, agüentando todo meu Stress
rsrsr serei eternamente grato por tudo.
Aos funcionários e aos responsáveis pela limpeza do departamento de Bioquímica, pelo
companheirismo de todo dia, especialmente a Creuza que me ajudou muito desde o
início com nossos almoços, e a Ângela e Jonas pelos muitos cafés da manhã juntos.
Ao CNPQ e CAPES pela bolsa concedida e pelos fundos necessários para realização desse projeto.
Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do
que parecia impossível. Charles Chaplin
RESUMO
Algas marinhas são uma das principais fontes de compostos biologicamente ativos. Na matriz extracelular desses organismos existem os polissacarídeos sulfatados que funcionam como componente estrutural prevenindo-a contra desidratação. A fração 0,9 (FucB) rica em fucanas sulfatadas obtida da alga marrom Dictyota menstrualis foi caracterizada quimicamente e avaliada quanto a atividade farmacológica por meio de ensaios de atividade anticoagulante, ação estimulatória sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico, atividade antioxidante e seus efeitos na proliferação celular. Os principais componentes da FucB foram carboidratos (49,80 ± 0,10%) e sulfato (42,30 ± 0,015%), apresentando compostos fenólicos (3,86 ± 0,016%) e baixa contaminação protéica (0,58 ± 0,001%). FucB mostrou perfil polidisperso e sinais na análise de infravermelho em 1262, 1074 e 930 e 840 cm-1 atribuídos a ligações S=O de ésteres de sulfato, presença de ligação C-O de 3,6-anidrogalactose, β-D-galactose não sulfatada e sulfato na posição axial do C4 da fucose, respectivamente. FucB exibiu moderada atividade anticoagulante, este polissacarídeo prolongou o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) a 200 ug (>90s) não foi observado qualquer efeito de FucB sobre o tempo de protrombina (PT), que corresponde a via extrínseca da coagulação. Esta fração promoveu estimulação cerca de 3,6 vezes na síntese de heparam sulfato (HS) pelas células endoteliais da aorta de coelho (RAEC), em cultura, quando comparadas com as células não tratadas com FucB. Esta também demonstrou competir pelo sítio de ligação com a heparina. A fração rica em fucanas sulfatadas exibiu forte ação antioxidante sobre os ensaios de antioxidante total (109,7 e 89,5% comparados com padrões BHT e Ácido ascórbico), poder redutor (71% comparado ao Ácido ascórbico) e quelação férrica (71,5% comparando com ácido ascórbico). A fração dessa alga mostrou atividade citostática sobre as células RAEC revelando que o aumento da síntese de heparan sulfato não está relacionado à proliferação. FucB apresentou ação antiproliferativa sobre linhagens celulares modificadas como Hela e Hep G2 pelo ensaio de MTT. Esses resultados sugerem que FucB de Dictyota menstrualis tem potencial anticoagulante, antitrombótico, antioxidante bem como uma possível ação antitumoral, promovendo a estimulação da síntese de HS antitrombótico pelas células endoteliais, sendo útil na prevenção da trombose, devido também a sua ação inibitória sobre as espécies reativas do oxigênio (ROS) em alguns sistemas in vitro, estando envolvidos na promoção de estado de hipercoagulabilidade.
Palavras-chave: Fucanas sulfatadas; Alga marrom ; Dictyota menstrualis; Anticoagulante; Antitrombótica; Atividade antioxidante; Proliferação celular.
ABSTRACT
Seaweeds are a major source of biologically active compounds . In the extracellular matrix of these organisms are sulfated polysaccharides that functions as structural components preventing it against dehydration. The fraction 0.9 (FucB) rich in sulfated fucans obtained from brown seaweed Dictyota menstrualis was chemical characterized and evaluated for pharmacological activity by testing anticoagulant activity, stimulatory action on the synthesis of an antithrombotic heparan sulfate, antioxidant activity and its effects in cell proliferation. The main components were FucB carbohydrates (49.80 ± 0.10 %) and sulfate (42.30 ± 0.015 %), with phenolic compounds ( 3.86 ± 0.016 %) and low protein contamination ( 0.58 ± 0.001 % ) . FucB showed polydisperse profile and analysis of signals in the infrared at 1262, 1074 and 930 cm -1 and 840 assigned to S = O bonds sulfate esters , CO bond presence of 3,6- anhydrogalactose , β -D- galactose non- sulfated sulfate and the axial position of fucose C4 , respectively. FucB exhibited moderate anticoagulant activity , the polysaccharides prolonged time (aPTT ) 200 ug ( > 90s ) partial thromboplastin FucB no effect on prothrombin time (PT), which corresponds to the extrinsic pathway of coagulation was observed. This stimulation promoted fraction of about 3.6 times the synthesis of heparan sulfate (HS) by endothelial cells of the rabbit aorta ( RAEC ) in culture compared with cells not treated with FucB . This has also been shown to compete for the binding site with heparin. The rich fraction sulfated fucans exhibited strong antioxidant activity assays on total antioxidant (109.7 and 89.5 % compared with BHT and ascorbic acid standards ) , reducing power ( 71 % compared to ascorbic acid ) and ferric chelation ( 71 , comparing with 5 % ascorbic acid). The fraction of algae showed cytostatic activity on the RAEC cells revealed that the increase of the synthesis of heparan sulfate is not related to proliferation. FucB showed antiproliferative action on cell lines modified as Hela and Hep G2 by MTT assay . These results suggest that FucB Dictyota menstrualis have anticoagulant , antithrombotic , antioxidant potential as well as a possible antitumor action, promoting the stimulation of the synthesis of antithrombotic HS by endothelial cells and is useful in the prevention of thrombosis, also due to its inhibitory action on species reactive oxygen ( ROS ) in some in vitro systems , being involved in promoting a hypercoagulable state .
Keywords: sulfated fucans; brown seaweed, Dictyota menstrualis; Anticoagulant, Antithrombotic; antioxidant activity; Cell Proliferation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Representação de açúcar α-L-fucose .............................................. 17
Figura 2 Estruturas propostas para fucoidans de Fucus vesiculosus ........ 20
Figura 3 Estrutura de heterofucana obtida da alga marrom Spatoglossum
schröederi ........................................................................................... 21
Figura 4 Representação esquemática da ativação das vias intrínseca,
extrínseca e comum da coagulação sanguínea .............................. 25
Figura 5 Fontes intracelulares de ERO’s e principais mecanismos de
defesa antioxidante ............................................................................ 32
Figura 6 Dictyota menstrualis: alga marinha marrom utilizada neste
trabalho ............................................................................................... 38
Figura 7 Células endoteliais da aorta de coelho ............................................ 39
Figura 8 Células HeLa coradas com Hoechst 33258 ..................................... 40
Figura 9 Células Humanas de Fibroblastos .................................................... 40
Figura 10 Monocamada normal de células HepG2 .......................................... 41
Figura 11 Esquema de teste de tempo de tromboplastina parcial ativada
(aPTT) .................................................................................................. 48
Figura 12 Esquema de teste de tempo de Protrombina (PT) .......................... 49
Figura 13 Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA dos
polissacarídeos ácidos extraídos da alga Dictyota menstrualis ... 57
Figura 14 Perfil de eluição da FucB em cromatografia de gel filtração em
Sephadex G-75 ................................................................................... 59
Figura 15 Cromatografia descendente em papel da Fuc B ............................. 60
Figura 16 Espectro de infravermelho da F0,9 rica em heterofucanas da
alga D. menstrualis. Em foco a região de 500 – 1000 cm-1 ............ 62
Figura 17 Tempo de protrombina tratado com FucB em diferentes massas 64
Figura 18 Tempo de tromboplastina ativada de pool de plasma tratado
com FucB em diferentes massas ..................................................... 65
Figura 19 Glicosaminoglicanos sulfatados sintetizados por células
endoteliais em presença de diferentes concentrações de FucB ... 66
Figura 20 Ensaio de competição de ligação entre a heparina biotinilada e
FucB não biotinilada .......................................................................... 68
Figura 21 Atividade antioxidante total em equivalentes de ácido ascórbico
e BHT da FucB .................................................................................... 69
Figura 22 Poder redutor das diferentes concentrações da FucB da alga
Dictyota menstrualis .......................................................................... 70
Figura 23 Aumento da absorbância das diferentes concentrações de FucB
em comparação ao padrão (EDTA) na reação ................................. 71
Figura 24 Percentual de quelação férrica da FucB da alga Dictyota
menstrualis ......................................................................................... 72
Figura 25 Efeito da funcana B de Dictyota menstrualis na proliferação
celular de células normais e modificadas ....................................... 74
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Atividades farmacológicas atribuídas a polissacarídeos de
algas marrons ............................................................................. 22
Tabela 2 Eventos relacionados a espécies reativas de O2 .................... 32
Tabela 3 Rendimento (% do peso seco) obtido do subfracionamento
com acetona de F1,0 de D. menstrualis ................................... 55
Tabela 4 Composição química (% peso seco) das subpopulações
extraídas de Dictyota menstrualis............................................. 57
Tabela 5 Massa molecular e relação molar da FucB e da alga marinha
marrom D. menstrualis .............................................................. 60
Tabela 6 Resumo dos sinais de espectroscopia de infravermelho
apresentados pela FucB ................................................................. 62
Tabela 7 Atividade antioxidante relativa de Fucanas de alga D.
menstrualis (%) ........................................................................... 68
Tabela 8 Atividade sequestradora radicais hidroxila (OH•) e superóxido
(O2-•) e DPPH..........................................................................................
69
Tabela 9 Atividade antioxidante relativa ao poder redutor de Dictyota
menstrualis F0,9 (%) ................................................................... 70
LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS
μg micrograma μl microlitro aPTT Tempo de Tromboplastina Parcialmente Ativada CS Condroitin sulfato DS Dermatan sulfato EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético eNOS Óxido nítrico sintetase endotelial EROS Espécies Reativas do Oxigênio FIX Fator IX – Fator B anti-hemofílico (Fator de Christmas) FV Fator V- Pró acelerina FVII Fator VII – Pró convertina FVIII Fator VIII – Fator A anti-hemofílico FX Fator X- Fator de Stuart-Prower FXI Fator XI- Antecedente da Tromboplastina plasmática FXII Fator XII – Fator de Hageman GAGs Glicosaminoglicanos GLC Cromatografia gás - líquido g grama h hora H2O Água H2O2 Peróxido de Hidrogênio HS Heparan sulfato kDa Quilo Dáltons Kg quilograma LDL Low Density Lipoprotein LPS Lipopolissacarídeo M Molar min minuto ml mililitro mM milimolar MTT Brometo de 3- (4,5- dimetiltiazol)-2,5- difenil tetrazolium NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo na forma reduzida nm nanômetro nNOS Óxido nítrico sintetase neuronal NO Óxido nítrico NO2 íon nitrito NO3 íon nitrato O-2 Ânion superóxido O2 Oxigênio molecular ºC graus centígrados OH Radical hidroxila PBS Tampão salina fosfato PI Iodeto de Propídeo PDA Diaminopropanoacetato PT Tempo de Pró-trombina SOD Superóxido Dismutase v volume μM Micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 13
1.1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ............................................................... 13
1.2 ALGAS ................................................................................................. 14
1.3 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS ............................... 16
1.3.1 Estrutura de polissacarídeos fucosilados de algas ........................ 18
1.3.2 Atividades farmacológicas de Fucanas ........................................... 21
1.4 HEMOSTASIA ...................................................................................... 23
1.4.1 Papel da célula endotelial na hemostasia ........................................ 25
1.4.2 Agentes anticoagulantes e antitrombóticos ................................... 26
1.4.3 Atividade anticoagulante e antitrombótica de fucanas .................. 27
1.4.4 Relação entre coagulação e espécies reativas do oxigênio .......... 29
1.5 ANTIOXIDANTES ................................................................................ 30
1.5.1 Radicais livres .................................................................................... 30
1.5.2 Compostos Antioxidantes ................................................................ 33
1.6 PROLIFERAÇÃO CELULAR E CÂNCER ............................................ 33
2 OBJETIVOS ......................................................................................... 36
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................. 36
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................ 36
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................... 37
3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS .................................................................. 37
3.1.1 Alga marinha ....................................................................................... 37
3.1.2 Plasma humano ................................................................................. 38
3.1.3 Linhagens Celulares .......................................................................... 38
3.1.3.1 Células Endoteliais de Aorta de Coelho (RAEC) ................................. 38
3.1.3.2 Células HeLa (adenocarcinoma cervical - ATCC CCL-2) .................... 38
3.1.3.3 3T3 ....................................................................................................... 39
3.1.3.4 HepG2 .................................................................................................. 40
3.2 REAGENTES QUIMICOS E APARELHOS UTILIZADOS ................... 40
3.3 MÉTODOS ........................................................................................... 44
3.3.1 Caracterização estrutural dos polissacarídeos sulfatados
obtidos de D. menstrualis .................................................................
44
3.3.1.1 Eletroforese em gel de agarose ........................................................... 44
3.3.1.2 Análises químicas ................................................................................ 44
3.3.1.2.1 Dosagem de açúcares totais ................................................................ 44
3.3.1.2.2 Dosagem de sulfato ............................................................................. 45
3.3.1.2.3 Dosagem de proteínas ......................................................................... 45
3.3.1.2.4 Dosagem de compostos fenólicos ....................................................... 45
3.3.1.2.5 Dosagem de ácidos urônicos ............................................................... 45
3.3.1.3 Cromatografia descendente em papel ................................................. 46
3.3.1.4 Análise de Espectroscopia de Infravermelho (IR) ................................ 46
3.3.2 Avaliação das atividades farmacológicas ....................................... 46
3.3.2.1 Atividade anticoagulante ...................................................................... 46
3.3.2.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) ................................ 47
3.3.2.3 Tempo de protrombina (PT) ................................................................. 48
3.3.2.4 Atividade sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico .............. 48
3.3.2.4.1 Manutenção de cultura das células endoteliais de aorta de coelho
(RAEC) .................................................................................................
48
3.3.2.4.2 Marcação metabólica dos glicosaminoglicanos sulfatados .................. 49
3.3.2.4.3 Análise dos glicosaminoglicanos sintetizados ...................................... 49
3.3.2.5 Ensaio de competição da Fuc B por sítios de ligação em RAEC ......... 50
3.3.2.6 Atividade antioxidante .......................................................................... 50
3.3.2.6.1 Sequestro de radicais DPPH ................................................................ 50
3.3.2.6.2 Sequestro de radicais hidroxila ............................................................ 50
3.3.2.6.3 Sequestro de radicais superóxido ........................................................ 51
3.3.2.6.4 Ação quelante de ferro ......................................................................... 51
3.3.2.6.5 Poder redutor ....................................................................................... 52
3.3.2.6.6 Atividade antioxidante total .................................................................. 52
3.3.2.7 Ação sobre a viabilidade celular ........................................................... 53
3.3.2.7.1 Manutenção das culturas ..................................................................... 53
3.3.2.7.2 Experimento de viabilidade celular ....................................................... 53
3.3.3 Análises estatísticas .......................................................................... 54
4 RESULTADOS ..................................................................................... 55
4.1 CARACTERIZAÇÃO INICIAL DOS POLISSACARÍDEOS
EXTRAÍDOS DA ALGA D.menstrualis .................................................
55
4.1.1 Rendimento dos polissacarídeos obtidos pós subfracionamento 55
4.1.2 Perfil eletroforético dos polissacarídeos ......................................... 56
4.1.3 Composição química das populações obtidas no
subfracionamento ..............................................................................
57
4.2 CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA FRAÇÃO 0,9v (F0,9v) .................. 58
4.2.1 Massa molecular da F0,9v ................................................................. 58
4.2.2 Análise dos açúcares e sulfato presentes na FucB ........................ 59
4.2.3 Análise dos açúcares e sulfato presentes na FucB ........................ 59
4.2.4 Análise estrutural da FucB por espectroscopia de infravermelho
(IR) .......................................................................................................
60
4.3 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE ........................................................ 63
4.3.1 Tempo de protrombina ...................................................................... 63
4.3.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada ....................................... 63
4.4 ATIVIDADE SOBRE A SÍNTESE DE HEPARAM SULFATO
ANTITROMBÓTICO .............................................................................
64
4.5 ENSAIO DE COMPETIÇÃO POR SÍTIOS DE LIGAÇÃO EM
CÉLULAS ENDOTELIAIS ....................................................................
65
4.6 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ............................................................... 68
4.6.1 Capacidade antioxidante total (CAT) ................................................ 68
4.6.2 Atividade seqüestradora de radicais hidroxila (OH•), superóxido
(O2-•) .....................................................................................................
69
4.6.3 Poder Redutor .................................................................................... 70
4.6.4 Ação quelante de ferro ...................................................................... 71
4.7 AÇÃO SOBRE A VIABILIDADE CELULAR ......................................... 72
4.7.1 Teste Utilizando Células Endoteliais De Aorta De Coelho (Raec) . 72
4.7.2 Teste Utilizando Células De Câncer Cervical (Hela) ....................... 72
4.7.3 Teste Utilizando Células De Fibroblastos (3t3) ............................... 72
4.7.4 Teste Utilizando Células De Carcinoma Do Fígado Humano
(Hepg2) ................................................................................................
73
5 DISCUSSÕES ...................................................................................... 75
6 CONCLUSÕES .................................................................................... 84
REFERÊNCIAS .................................................................................... 84
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS
Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície da Terra, com espécies
marinhas que compreendem aproximadamente metade do total da biodiversidade
global (KIM & WIJESEKARA, 2010; SWING, 2003). Assim, a grande diversidade
de organismos marinhos está sendo reconhecido como fontes ricas de materiais
funcionais, incluindo lipídeos de pigmentos naturais, minerais essenciais,
vitaminas, enzimas, peptídeos bioativos e polissacarídeos (SHAHIDI, 2008;
SHAHIDI & ALASALVAR DE 2011, CAP. 36; SHAHIDI & JANAK KAMIL, 2001).
Entre os organismos marinhos, as algas marinhas ainda são
identificadas como um recurso pouco explorado, apesar de serem bastante
utilizadas em alimentos e remédios tradicionais no hemisfério oriental (HEO ET
AL., 2009).
A antiga tradição e consumo diário de algas tornou possível um grande
número de estudos epidemiológicos que mostraram seus benefícios na saúde,
relacionando a dieta internacional com a incidência de doenças crônicas.
Significativos fatores ambientais interferem na incidência de várias doenças, como
exemplo, a taxa de câncer de mama em Japoneses e Chineses é cerca de duas a
três vezes menores que em americanos e europeus e as taxas de câncer de
próstata são de três a quatro vezes maiores em europeus e americanos
comparados aos povos orientais (PISANI, BRAY, & PARKIN, 2002; YUAN &
WALSH, 2006). Assim, os resultados de estudos epidemiológicos têm mostrado
que os baixos casos de câncer de próstata e mama no Japão e China estão
associados a fatores ambientais, incluindo a dieta (LACEY, DEVESA, &
BRINTON, 2002). Uma das principais diferenças nutricionais entre os hemisférios
oriental e ocidental é o maior consumo de produtos marinhos, tais como peixes e
algas marinhas (TERRY, ROHAN, E WOLK, 2003). No leste da cultura asiática,
algas marinhas têm sido de interesse particular (KHAN, DE HONG KONG, KIM, &
KIM, 2010). Algas comestíveis são responsáveis por mais de 10% da dieta dos
Japoneses com um consumo médio de 1,4 kg por pessoa, por ano (BURTIN,
2003).
14
Além da sua importância alimentícia, por serem organismos autótrofos,
possuem uma grande importância ecológica pois os gases gerados pelo processo
de fotossíntese são responsáveis pela estruturação da atmosfera terrestre como a
conhecemos, possibilitando a vida dos organismos aeróbios na superfície do
planeta (KIRSHNER, 1994; DUVE, 1996). As algas têm um papel fundamental na
manutenção do ecossistema marinho, por serem os produtores primários desse
ecossistema e participarem de maneira direta na sua enorme biodiversidade tanto
na formação do fitoplâncton, sendo elementos formadores dos recifes de coral e
estando presas a diferentes substratos. Desta forma, as algas exercem papel
importante para manutenção do ciclo do carbono, e assim contribuem de forma
significativa para a manutenção do clima do planeta (OLIVEIRA, 1996). Além da
sua enorme importância ecológica, as macroalgas marinhas ainda produzem
outros metabólitos com potencial econômico importante como ácidos graxos,
esteróides, carotenóides, lectinas, compostos halogenados, toxinas e os
polissacarídeos sulfatados presentes em sua matriz extracelular. Esses
compostos são alvo de pesquisas na área de farmacologia, e pelo seu uso
potencial nas diferentes indústrias (LEITE ET AL., 1998, ROCHA, et al., 2006;
MANDAL et al., 2008; LUO et al., 2009: MAKATENKOVA et al, 2009; POMIN,
2009, CIANCIA et al., 2010, JIAO et al, 2011).
1.2 ALGAS
Ao longo dos últimos anos, organismos marinhos como bactérias,
microalgas e macroalgas têm representado uma grande fonte de valiosos
materiais (DELONG, 1997; RASMUSSEN & MORRISSEY, 2007). Estes
organismos são considerados geralmente como vegetais inferiores,
principalmente, por apresentarem uma menor diferenciação celular em relação
aos vegetais terrestres, considerados superiores. As algas ducícolas, apresentam
estruturas mais elaboradas, por conta de viver em ambiente aquático e com ele
interagirem estreitamente, não estando expostas parcialmente ao ar e ao solo,
como as plantas terrestres (SILVA, 1999). As algas não apresentam sistema
vascular, entretanto, suas células podem formar aglomerações, na forma de fios
ou de lâminas finas (MATIAS, 1999; PÁDUA, FONTOURA, MATHIAS, 2004).
15
Apresentam distribuição cosmopolita e considerável variação morfológica
(GERALDINO et al., 2010). Encontram-se distribuídas em diferentes habitats:
oceanos, corpos de água doce, solos, rochas, sobre a neve e superfície de
vegetais; desde que disponham de luz e umidade suficientes (VIDOTTI &
ROLLEMBERG, 2004). As algas estão classificadas em quatro grupos principais:
Clorofíceas ou algas verdes, Rodofíceas ou algas vermelhas, Cianofíceas ou
algas azuis (costumam caracterizar-se por serem algas unicelulares) e por último
as Feófíceas ou algas pardas. Seus diversos pigmentos correspondem: clorofilas,
“a” e “b” encontradas nos plastídeos associadas com proteínas. Existem outros
pigmentos, tais como: ficobilinas, ficocianinas, fucoxantinas e ficoetrinas (algas
vermelhas) e carotenos (PÁDUA, FONTOURA, MATHIAS, 2004).
As algas marinhas são de extrema importância para o nosso
ecossistema, pois são responsáveis por quase todo oxigênio produzido em nosso
planeta. Elas podem apresentar diversas utilidades em nosso dia-dia, seja na
alimentação, indústria, agricultura, microbiologia e cosméticos. Há cerca de cinco
décadas, o mundo ocidental desconhecia praticamente tudo a cerca das algas.
Entretanto, atualmente, muito já se conhece sobre seus constituintes, como, por
exemplo, que são ricos em proteínas, mucilagens, carboidratos, vitaminas,
fósforo, iodo, potássio, cloro, entre outros. Alguns desses elementos presentes
nas algas não são encontrados com freqüência em outros organismos, por isso,
até em quantidades diminutas elas têm grande importância (NOSEDA, 1994). Por
exemplo, os polissacarídeos de algas, além de apresentarem em sua estrutura
açúcares bastante comuns, como a glicose, xilose e galactose, possuem
açúcares bastante específicos e incomuns, diferentes dos encontrados em
animais e vegetais terrestres como é o caso da fucose e da 3,6-anidrogalactose.
(ZHANG et al., 2003).
Nas algas, alguns polissacarídeos possuem substituições de sulfato e
por isso são conhecidos por apresentarem este caráter. Estes estão localizados
na matriz mucilaginosa e devido o seu caráter altamente higroscópico, acredita-se
que protejam as algas da desidratação quando essa é submetida a longos
períodos de exposição ao sol durante as marés baixas. A natureza mucilaginosa
destes compostos, também parece contribuir para tornar a alga flexível o bastante
para crescer em ambiente líquido e rígida o suficiente para permanecer estendida,
16
e assim, melhor captar a luz e os nutrientes existentes (PERCIVAL; MAC
DOWELL, 1967). No entanto, há poucos estudos dedicados ao esclarecimento
das funções fisiológicas dos polissacarídeos sulfatados nas algas, por isso não se
pode descartar a possibilidade de que esses compostos venham desempenhar
outras funções além das estruturais já conhecidas. Nas algas vermelhas
(Rhodophyta), encontram-se homopolissacarídeos de galactose sulfatada, essas
galactanas sulfatadas também são conhecidas como carragenanas e agaranas.
Nas algas verdes (Chlorophyta) os polissacarídeos sulfatados são mais
heterogêneos e difíceis de serem reunidos em grupos. Na sua maioria são ricos
em galactose, manose, xilose, arabinose, glicose e ou rafnose. Homo e
heteropolissacarídeos podem ser encontrados, inclusive numa mesma alga, como
é o caso da alga Codium dwarkense (SIDDHANTA ET AL, 1999). Das algas
pardas (Phaeophyta) extraem-se polissacarídeos que apresentam L-fucose
sulfatada na sua composição. Aqueles que possuem mais de 90% desse
monossacarídeo na sua estrutura são chamados de fucanas e os demais são
denominados de fucoidans (BERTEAU; MULLOY, 2003). Contudo, vários autores
empregam esses termos como sinônimos.
1.3 POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS
Os polissacarídeos constituem um dos quatro grupos de
macromoléculas que compõem os seres vivos, nos quais, atualmente, lhes são
atribuídas, principalmente, funções estruturais e energéticas. Quantitativamente,
seus principais representantes, são a celulose e a quitina, duas das mais
abundantes moléculas orgânicas do planeta (LEHNINGER; NELSON; COX,
1995). Nas últimas décadas, um grupo específico de polissacarídeos vem
chamando a atenção de vários pesquisadores por apresentarem uma gama de
atividades farmacológicas: o grupo dos polissacarídeos sulfatados de algas
(BOISSON-VIDAL ET AL., 1995; MOURÃO ET AL., 1996). Os polissacarídeos
sulfatados, assim como os demais, apresentam polidispersão estrutural, porém,
devido à ligação dos grupamentos de sulfatos, essa polidispersão se demonstra
mais acentuada quando comparada a dos polissacarídeos neutros, carboxilados
ou dos fosforilados. O grupo sulfato pode variar em quantidade e posição da
17
substituição (DIETRICH, 1984; BOISSON-VIDAL ET AL., 1995; SUGAHARA;
KITAGAWA, 2000; HARON-BOUHEDJA ET AL., 2000).
Esses polímeros parecem ser encontrados em todos os filos de
animais, apesar de existirem alguns filos ainda não estudados. Acredita-se que
eles estão presentes em todos os animais devido as importantes funções
desempenhadas por esses compostos nos organismos multicelulares
(MEDEIROS ET AL., 2000). Outro grande grupo de seres vivos que apresenta
polissacarídeos sulfatados em sua composição é o das macroalgas marinhas
(KLOAREG; QUATRANO, 1988). Há trabalhos demonstrando a presença dos
polissacarídeos sulfatados em fungos (DORE, 2006) e há relatos de sua presença
em vegetais (AQUINO ET AL., 2005).
Das três principais divisões de algas marinhas as Phaeophytas se
destacam devido a presença de laminaranas (polissacarídeos neutros) como
moléculas de reserva e pigmentos como clorofila a, clorofila c e xantofilas, sendo
a fucoxantina o pigmento responsável pela cor marrom. Estas possuem em suas
paredes celulares polissacarídeos aniônicos ricos em grupos carboxilas
denominados de ácidos algínicos e na matriz extracelular as fucanas,
polissacarídeos sulfatados, os quais possuem a α-L-fucose (Figura 1) como
açúcar mais representativo (KLOAREG & QUATRANO, 1987), cujas cadeias, a
depender da espécie, podem ser compostas, além da fucose, por galactose,
xilose, manose e acido glucurônico.
Figura 1. Representação de açúcar α-L-fucose.
18
A α-L-fucose é uma desoxi-hexose na qual a hidroxila do carbono 6 (C-
6) é substituída por um hidrogênio. Este açúcar não é encontrado livre na
natureza como a ramnose e galactose, sendo isômeros destes, com exceção do
C-6. Este monossacarídeo é encontrado ligado a outras unidades formando
polímeros. Em mamíferos a α-L-fucose está presente em glicoconjugados
apresentando importante papel nas reações imunológicas, nos processos
envolvendo a adesão de leucócitos a células endoteliais mediados por selectinas
e em numerosos eventos ontogênicos, pois alterações na produção de
oligossacarídeos fucosilados foram observadas em vários processos patológicos,
incluindo câncer e aterosclerose (MOLONEY, 2000).
1.3.1 Estrutura de polissacarídeos fucosilados de algas
A estrutura dos polissacarídeos varia entre as diferentes espécies de
algas, tanto no tipo de açúcar constituinte, quanto na posição da ligação
glicosídica e sítio de sulfatação (MOURÃO et al, 1996). Homofucanas são
polissacarídeos constituídos principalmente por L-fucose unidas por ligações do
tipo α-(1->3), com ramificações em C2 ou C4 e com o grupo sulfato podendo estar
presente no carbono 2 e/ou 4.
Patankar et al (1993) estudando polissacarídeos da alga Fucus
vesiculosus verificou que o fucoidan extraído apresentava cadeia central
constituída por fucose unidas por ligações do tipo α-(1->3) e sulfato no carbono 4
da fucose e ligações do tipo α-(1->2), correspondentes as ramificações, as quais
ocorriam a cada dois ou três resíduos de fucose, apresentando alto grau de
ramificações (CONCHIE & PERCIVAL, 1950). Um polímero constituído de
unidades hexassacaridicas repetidas (cinco resíduos de α-L-fucopiranose ligadas
α-(1->3) com fucose ramificada em C2, apresentando sulfatação em C2 e C4,
com o C2 podendo apresentar-se acetilado como foi identificado na alga Chorda
filum (CHIZHOV et al, 1999).
19
Figura 2. Estruturas propostas para fucoidans de Fucus vesiculosus. (A) - Modelo de
CONHIE; PERCIVAL, 1950. (B) - Modelo proposto por PATANKAR et al., 1993.
Heterofucanas de algas são moléculas extremamente heterogêneas e
ramificadas possuindo como principal característica a α-L-fucose sulfatadas nos
carbonos 2, 3 e/ou 4, ligada a monossacarídeos como: xilose, galactose, glicose,
manose, ácidos urônicos e outros (MORY & NISIZAWA, 1982; LEITE et al, 1998;
DUARTE et al, 2001; ROCHA, 2002). Em algumas moléculas, pode-se encontrar
o grupo acetil (CHIZHOV et al, 1999; BILAN et al, 2002).
Leite et al (1998) ao estudar as propriedades de polissacarídeos da
alga marrom Spatoglossum schröederi demonstrou a estrutura de uma
heterofucana isolada de três frações (A, B e C) observadas na mobilidade
eletroforética, a de mais alto peso molecular obtido (Fucana A: 21 KDa) é formada
por ácido glucurônico compondo a cadeia central, unidos por ligações β-(1->3)
com substituições em C4 por trissacarídeos de α-L-Fucose, com este último
açúcar apresentando grupos sulfato no C4 e dissacarídeos de xilose, únidas por
ligações β-(1->4) no C2, denominada de xilofucoglucuronana. Na Figura 3 pode-
se observar a representação dessa fucana.
Nagaoka et al (1999) isolou uma homofucana da alga marrom
Cladosiphon okamuranus apresentando cadeia central com resíduos de fucose
unidas por ligações α-(1->3), varias ramificações em C2 e, em algumas
ramificações as fucoses poderiam estar ligadas ao acido α-D-glucurônico. Uma
fucana de Fucus evanescences foi caracterizada como apresentando cadeia
central de α-L-fucopiranose com ligações alternadas α-(1->3) e α-(1->4),
20
apresentando sulfatação no C2, podendo ainda estar sulfatado no C4 (BILAN et
al, 2002). Outros açúcares, em baixas quantidades, podem ser encontrados em
estruturas de homofucanas (CARDOSO et al, 2009).
De acordo com Rocha (2002), das 35 espécies de algas pesquisadas
entre os anos de 1960 e 1980, cerca de 20 demonstraram possuir somente ou
também heterofucanas, comprovando que estas são tão comuns quanto a
homofucanas. Diversos trabalhos na literatura mostram a variabilidade estrutural
das fucanas onde dentre estes alguns arranjos estruturais foram encontrados na
caracterização de heterofucanas sulfatadas.
Marques et al (2007) estudando a alga marrom Padina gymnospora
identificou uma fração polissacarídica composta de fucose, xilose, galactose e
glicose, apresentando razão molar de 1:0,4:0,3:0,2, com absorções na região do
IV típicas de grupamentos sulfato na posição axial, correspondentes ao sulfato
ligado no carbono 4 e sinais na RNM correspondentes a α-L-Fucose.
Medeiros et al (2008) ao estudar polissacarídeos sulfatados da alga
Lobophora variegata isolou um heteropolissacarídeo composto de fucose,
galactose e sulfato, o qual apresentou razão molar de 1:3:2, identificando também
a presença do grupamento sulfato e carbono anomérico correspondente a β-D-
galactose em ensaios espectroscópicos de infravermelho (IV) e ressonância
magnética nuclear (RMN), respectivamente.
Figura 3. Estrutura de heterofucana obtida da alga marrom Spatoglossum
schröederi. Adaptado de Leite et al, 1998.
21
Estudos estruturais com fucanas de algas demonstraram que estas
variam de espécie para espécie e, às vezes, em diferentes partes da mesma
(FARIAS, 1993; DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000; HAROUN-BOUHEDJA et
al., 2000). Polissacarídeos sulfatados, fucosilados e ramificados também foram
identificados em equinodermos (MOURAO et al, 1996). A complexidade
estrutural desses compostos é atribuída às múltiplas possibilidades de ligações
entre os monossacarídeos constituintes e a distribuição dos grupamentos sulfato
no composto, o que torna cada polissacarídeo único. Sendo assim, cada fucana
extraída será potencialmente um novo composto a ser descoberto, tanto
estruturalmente, como em relação às atividades biológicas e farmacológicas que
ele possa vir a apresentar.
1.3.2 Atividades farmacológicas de Fucanas
Muitas são as referências que demonstram as atividades
farmacológicas de polissacarídeos fucosilados sulfatados (fucanas), sejam em
experimentos utilizando modelos animais ou utilizando reações químicas
produtoras de radicais livres, mimetizando alterações biológicas in vivo ou
estresse oxidativo in vitro, respectivamente. Várias atividades biológicas têm sido
atribuídas à compostos fucosilados, dentre elas destacam-se: atividade
anticoagulante (NISHINO et al, 1991;1999;2000; NARDELLA et al, 1996),
antitrombótica (MOURAO & PEREIRA, 1996), antiinflamatória (LASKY et al, 1995;
MEDEIROS et al, 2008), antioxidante (SOUZA et al, 2007; WANG et al, 2008; YE
et al, 2008) e antitumoral (HIQASHI OKAI, OTANI, & OKAI, 1999; OKAI &
HIGASHI OKAI, 1997; ISHIKAWA et al. 2008; GANESAN et al. 2011; GANESAN
et al., 2011)
A atividade farmacológica de fucanas tem sido relacionada à presença
de carga, ao grau de ramificação e a disposição estrutural dos grupamentos
sulfato presentes no polímero (QUEIROZ et al, 2008), que são necessários para
respostas específicas do sistema imunológico (TOKUNAKA et al, 2000). Sun et al
(2009) relataram que o componente monossacarídico, assim como tamanho
molecular, estrutura e conformação estão relacionados à atividade antioxidante
22
dos polissacarídeos. A capacidade de polissacarídeos sulfatados de algas
marinhas em reduzir componentes moleculares e remover radicais livres como
ânion superóxido e o radical hidroxila em sistemas in vitro tem demonstrado
relevância na atividade desses compostos naturais também na coagulação
sanguínea e proliferação celular (ZUBIA; ROBLETO; FREILE-PELEGRIN, 2007:
SOUZA et al, 2007: WANG et al, 2008: YE et al, 2008).
Vários trabalhos, inclusive desenvolvidos pelo nosso grupo, avaliaram
a atividade de fucanas de algas em sistemas biológicos onde a heparina possui
ação, tais como anticoagulante, antitumoral e antitrombótica, tendo em vista que
tanto a fucana quanto a heparina são polissacarídeos sulfatados com altas
densidades de carga negativa (LEITE et al., 1998, ROCHA et al., 2001; ROCHA
et al., 2005A; ROCHA et al., 2005B).
Tabela 1 - ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS ATRIBUÍDAS A POLISSACARÍDEOS DE ALGAS MARRONS
ATIVIDADE ALGAS (Referência)
Antiploriferativa F. vesiculosos, Cladosiphon okamuranus (TERUYA et al., 2007; YAMASAKI-MIYAMAMOTO et al., 2009)
Antioxidante Sargassum crassifólia, Sargassum pallidum, L. japônica (AL-AMOUDI et al., 2009; YE et al., 2008; ZHAO et al., 2007)
Anticoagulante Laminaria japonica, Laminaria saccharina, Dictyota menstrualis, Sargassum vulgare (CUMASHI et al., 2007; LI et al., 2008; WANG et al. 2010; DORE et al., 2012)
Antitumoral S. pallidum, S. stenophillum (DIAS et al., 2005; YE et al., 2008)
Antiviral L. japonica, C. okamuranus, F. vesiculosos (HIDARI et al., 2008; MAKARENKOVA et al., 2010)
Antiangiogênica F. vesiculosos, Ascophylum nodosum, Sargassum stenophillum (CUMASHI et al., 2007; DIAS et al., 2005)
Proliferativa Capsosiphon fulvescens, A. nodosum (GO et al., 2010; JIANG et al., 2010)
23
1.4 HEMOSTASIA
A hemostasia é uma resposta fisiológica protetora ao dano vascular
resultando na exposição de camadas subendoteliais da parede do vaso aos
componentes sanguíneos (MACKMAN, TILLEY, KEY, 2007), funcionando como
um processo dinâmico que tem como objetivo a interrupção do sangramento em
local de lesão tecidual, no qual a coagulação do sangue é iniciada e terminada de
forma rápida e bastante regulada (NATHAN et al., 2003). O sistema hemostático
mantém o sangue em estado fluido sobre condições normais, e responde com
rápida formação de um coágulo quando há lesão vascular (MACKMAN, TILLEY,
KEY, 2007).
Após a lesão vascular, as plaquetas aderem às macromoléculas em
tecidos subendoteliais e agregados para formar um tampão plaquetário. As
plaquetas estimulam a ativação local dos fatores de coagulação do plasma,
levando à geração de um coágulo de fibrina que reforça o agregado de plaquetas.
Idéias sobre o (s) mecanismo (s) de coagulação do sangue que se baseia em no
modelo de cascata foi introduzida no início da década de 60 (DAVIE & RATNOFF,
1964; MACFARLANE, 1964). Tradicionalmente, a coagulação foi dividida em uma
via intrínsica, uma extrínsica e uma via comum (Figura 4). A via intrínsica é
iniciada pela ativação dos fatores de contato e envolve a ativação subseqüente de
calicreína, fatores XII (FXII), XI (FXI) e IX (FIX), levando a ativação do fator X
(FX). A via extrínsica é iniciada por um fator tecidual (FT) sobre a expressão de
lesão tecidual e posterior formação complexo de FT com fator VII (FVII), que
também resulta em ativação de FX. Na via comum, FX ativado ativa protrombina
finalmente levando à formação de fibrina (Figura 4).
Embora o conceito destingua a via intrínsica e extrínsica, serviu por
muitos anos como um modelo útil para a coagulação, as vias não são, de fato,
redundante, mas estão interligadas. Para exemplo, altos níveis de FT no
complexo com FVII ativado (FVIIa) diretamente ativa o FX, enquanto que em
baixas concentrações de FT, a ativação FX envolve não somente FVIIa mas
também FIXa da via intrínseca (OSTERUD & RAPAPORT, 1977; MARLAR,
KLEISS, GRIFFIN, 1982). A hipótese atual sobre o início de coagulação do
sangue é, portanto, que após a lesão vascular, o FT é exposto ao sangue e forma
24
um complexo com FVII. Posteriormente, o complexo FT/FVII ativa FX diretamente
(via extrínsica) ou indiretamente através da ativação do FIX (via intrínsica),
resultando em clivagem da protrombina em trombina, mediada pelo fator X
ativado (FXa). A trombina cliva fibrinogênio em fibrina (monômeros de fibrina
forma polímeros) e um coágulo de fibrina é formado. Além disso, a trombina ativa
os fatores FXI, FVIII e FV, resultando em aumento da produção de FIXa e FXa,
aumentando assim a produção de trombina (GAILANI & BROZE, 1991; NAITO &
FUJIKAWA, 1991).
Porém a coagulação sanguínea é controlada por anticoagulantes que
sob condições normais prevalecem sobre as forças procoagulantes (DAHLBACK,
VILLOUTREIX, 2005).
Figura 4. Representação esquemática da ativação das vias intrínseca, extrínseca e
comum da coagulação sanguínea. Adaptado de Arjun (2011).
25
Para evitar complicações trombóticas devido à excessiva formação de
fibrina extemporânea, vários mecanismos de regulação existem, envolvendo
proteínas anticoagulantes. Dentre as proteínas anticoagulantes endógenas, existe
a proteína S, o qual atua como um co-fator para ação anticoagulante da proteína
C, onde esta detém essa função por inativação dos fatores Va e VIIIa.
1.4.1 Papel da célula endotelial na hemostasia
Trombose é uma causa importante de morte no mundo todo, gerando
complicações em doença aterosclerótica, falha cardíaca, câncer, cirurgia e
gestação (BAILEY, SCANTLEBURY, SMYTH, 2009). Colburn e Buonassisi
(1982), nos anos 80, relataram que a superfície das células endoteliais tem
atividade antitrombótica. Quando esta superfície muda, há possibilidade de
formação de trombo.
A camada intacta de células endoteliais fornece uma superfície não
trombogênica que ajuda a prevenir hemostasia indesejável (MICHIELS, 2003),
uma vez que se apresentam cobertas de proteoglicanos de heparam sulfato, que
são capazes de potencializar a ação da antitrombina (CINES et al., 1998),
promovem a síntese de substâncias como a trombomodulina (envolvida com a
ativação da proteína C), TFPI (inibidor da via do fator tecidual), prostaciclina,
ativador do plasminogênio tecidual, que ou inibem a cascata de coagulação e
função plaquetária ou ativam a fibrinólise (AMBROSIO, TRITTO, GOLINO, 1997).
Além, de sintetizar a proteína S (cofator da proteína C) e produzir vasodilatadores
como o óxido nítrico (NO) (CINES et al., 1998). No entanto, a perturbação da
integridade endotelial conduz ao desenvolvimento de superfície aderente e
formação de lacunas intercelulares que permitem a passagem de plasma solúvel
e células sanguíneas para fora do lúmen vascular para o tecido subjacente
(MICHIELS, 2003).
Na superfície e na matriz extracelular das células endoteliais encontra-
se presente o heparam sulfato, um glicosaminoglicano que tem mostrado possuir
atividade antitrombótica em vários modelos.
26
Sugere-se que a atividade antitrombótica da heparina e de outros
agentes antitrombóticos esteja, pelo menos em parte, relacionada com a ação
destes nas células endoteliais estimulando a síntese de heparam sulfato
antitrombótico (NADER et al., 2001).
Heparam sulfato é um polímero linear polidisperso que compartilha
características estruturais com a heparina, sendo composto por unidades
alternantes de α-D-glucosamina (GlcN) e ácido urônico, ou β-D-ácido glicurônico
(GlcA) ou α-L-ácido idurônico (IdoA), unidos por ligação glicosídicas (1→4). Uma
diferença importante entre o heparam sulfato e a heparina é o grau de sulfatação,
em que a heparina apresenta grau de sulfatação superior ao heparam sulfato
(DREYFUSS et al., 2009). O heparam sulfato é encontrado na superfície da
maioria das células eucarióticas e na matriz extracelular, ancorados a superfície
celular pelo cerne do seu proteoglicano. Células endoteliais em cultura sintetizam
heparam sulfato. Cerca de 1 a 10% dessas moléculas apresentam atividade
anticoagulante, pois contém resíduos de glicosamina 3-0-sulfatadas que é a
região do pentassacarídeo de ligação à antitrombina (HALLGREN, SPILLMANN,
PEJLER, 2001). A ligação do pentassacarídeo à antitrombina induz alteração
conformacional na antitrombina, acelerando de 2 a 3 ordens de magnitude a taxa
de inibição da antitrombina sobre alguns fatores de coagulação (WEITZ, 2003).
1.4.2 Agentes anticoagulantes e antitrombóticos
A indústria farmacêutica utiliza uma larga escala polissacarídeos de
origem animal, especialmente para o tratamento de doenças do sistema
cardiovascular. O mais popular deles, com a mais ampla aplicação prática é a
heparina. A heparina é um dos glicosaminoglicanos, um mucopolissacarídeo
ácido contendo grupos alquil (HIRSH, 1991; BEMILLER, 2008). Desde a sua
descoberta por McLean em 1915 (MCLEAN, 1959), a heparina tornou-se um
anticoagulante utilizado para o tratamento e prevenção de doenças trombóticas
por manter a fluidez do sangue em dispositivos extracorpóreos (FREEDMAN,
1992; Johnell et al., 2002).
27
O efeito anticoagulante da heparina é mediado principalmente por sua
ligação a antitrombina (AT), acelerando assim a inibição do fator Xa (FXa) e
trombina no plasma (BISACCHI, 2003). Infelizmente, a principal complicação com
a terapia de heparina é que, às vezes, há risco de sangramento. A heparina
provoca outros problemas, incluindo trombocitopenia induzida por heparina, esta
ainda possui pobre biodisponibilidade (BLAISDELL, 1996; GREINACHER &
WARKENTIN, 2006). Há uma necessidade clínica de novos anticoagulantes
parenterais que sejam eficazes e seguros quando utilizados em conjunto com os
agentes à terapia antiplaquetária fibrinolítica ou em pacientes com doenças
cardiovasculares (HIRSH, 2001; STONE & SHORE-LESSERSON, 2006).
Polissacarídeos com atividade anticoagulante e antitrombóticas foram
encontrados não só em mamíferos (BISACCHI, 2003; BEMILLER, 2008), mas
também em algas marinhas (PEREIRA, MULLOY, & MOURÃO, 1999;
FARIAS,VALENTE, PEREIRA & MOURÃO, 2000; MAYER & HAMANN, 2002,
2004, 2005, 2007).
1.4.3 Atividade anticoagulante e antitrombótica de fucanas
A atividade anticoagulante e antitrombótica associada com
polissacarídeos de algas a muito vem sendo estudada, foi primeiramente descrita
por Chargaff et al. (1936). Posteriormente, diversos autores viram o grande
potencial dessa biomolécula na coagulação. Springer et al. (1957) estudaram o
efeito anticoagulante in vivo e in vitro de frações purificadas da alga marrom
Fucus vesiculosus por precipitação diferencial com etanol. Grauffel et al. (1989)
estudando fucanas extraídas de cinco algas marrons verificaram que a ação
anticoagulante era decorrente, principalmente, pela interação com a trombina.
Entretanto investigações sobre a ação das fucanas sobre as vias intrínseca e
extrínseca da cascata de coagulação sugerem um efeito catalítico semelhante ao
da heparina, porém não ocorrendo inibição do fator Xa. Alguns autores também já
observaram que fucanas mais sulfatadas e de peso molecular próximo a 50 kDa
apresentavam uma atividade significativamente maior (COLLIEC et al., 1991). O
efeito anticoagulante das fucanas com diferentes teores de sulfato, extraídas da
28
alga marrom Ecklonia kurome, forneceu uma comprovação adicional da
importância da relação estrutura versus atividade farmacológica. A ação inibitória
destes compostos sobre a formação do coágulo de fibrina é mediada pelo cofator
II da heparina (HC II), sendo essa ação proporcional a massa molecular das
fucanas e ao seu teor de sulfato, bem como, pela interação das fucanas com o
fibrinogênio e em menor intensidade com a trombina. A capacidade das fucanas,
com o mesmo conteúdo de sulfato e diversas massas moleculares, de interagirem
com o fibrinogênio, não sofreu alterações em função da massa molecular,
sugerindo dessa forma, que o mecanismo de inibição poderia ser também em
consequência do impedimento estérico para a ação da serino-protease, resultante
da ligação do polissacarídeo ao fibrinogênio (NISHINO et al., 1991a). Mais tarde,
um fucoidan purificado dessa mesma alga, denominado de C II, se mostrou capaz
de inibir a ativação da protrombina, tanto pela via intrínseca como extrínseca, por
impedir a formação do complexo protrombinase (complexo formado pelos fatores
Xa, Va, fosfolipídeos e cálcio). Além disso, esse composto também bloqueia a
ativação do fator X por um mecanismo ainda não definido e inibe a trombina pela
via do HC II (NISHINO et al., 1999).
Trabalhos verificando a ação anticoagulante do fucoidan extraído da
alga Fucus vesiculosus têm demonstrado que o seu principal mecanismo de ação
está relacionado com a formação de um complexo ternário entre o HC II, fucoidan
e trombina numa proporção de 1:1:1 (CHURCH et al., 1989; SOEDA et al., 1992;
DÜRIG et al., 1997), como descrito para a heparina e dermatam sulfato (Colwell,
Grupe & Tollefsen, 1999).
Do fucoidan da alga Fucus vesiculosus foram obtidas várias frações
com diferentes massas moleculares e grau de sulfatação. Foi observado que
todas as frações possuíam ação sobre a ativação plaquetária e atividade
anticoagulante, sendo o efeito máximo obtido com um polímero de 150 kDa. Por
outro lado, uma fucana de baixo peso molecular (LMWF) de 50kDa com
diferentes graus de sulfatação apresentou efeito insignificante sobre a ativação
das plaquetas (DÜRIG et al., 1997).
Mauray et. al. (1998) demostraram que outro fucoidan, obtido da alga
Ascophyllum nodosum, apresentava atividade anticoagulante via HC II. Contudo
os autores relatam que mais estudos são necessários para se verificar se essa
29
atividade também não ocorre por mecanismos adicionais, como por exemplo,
inibição da formação do complexo protrombinase. Além disso, foi demonstrado
que sua atividade anticoagulante é dependente de sulfato (HAROUN-BOUHEDJA
et al., 2000).
Experimentos realizados com fucanas extraídas da alga Padina
gymnospora mostraram que a atividade anticoagulante da mesma foi 2,5 vezes
menor que a da heparina de baixo peso molecular. Esta atividade foi
completamente abolida quando a fucana foi dessulfatada, neste caso, indicando
que a presença da 3-O-sulfatação foi importante para atividade anticoagulante do
composto em questão (SILVA et al., 2005).
A galactofucana presente na alga S. schroederii não apresentou
atividade anticoagulante in vitro, mas mostrou atividade anti-FXa em células
endoteliais quando as mesmas foram expostas a ação do polissacarídeo (ROCHA
et al., 2005b).
Fucanas da alga Dictyota menstrualis mostraram atividade
anticoagulante por aumentar o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), já
as fucanas da alga Spatoglossum schroederi não apresentaram qualquer
alteração no aPTT (ROCHA et al., 2004, ALVES 2006).
Pode-se concluir, portanto, que a ação exercida pelas fucanas no
processo de coagulação estaria diretamente relacionada com o grau de
sulfatação e tamanho do polímero, sendo o principal sítio de ação o HC II.
Entretanto, devido a grande variabilidade estrutural das fucanas, mais de um sítio
e mecanismo de ação podem ser identificados, sendo esses, muitas vezes não
usuais para outros compostos anticoagulantes.
1.4.4 Relação entre coagulação e espécies reativas do oxigênio
Coagulação exacerbada e trombose estão ligadas a várias doenças
metabólicas, cardiovasculares e câncer. Muitas dessas doenças estão associadas
a níveis aumentados de espécies reativas do oxigênio (ERO) causando
citotoxicidade e funcionam também, como moléculas de sinalização em várias
células. Algumas evidências mostram que as EROs e o estado redox são
30
importantes no controle da coagulação do sangue e trombose (GÖRLACH, 2005).
As EROs são capazes de afetar o equilíbrio delicado entre os sistemas
procoagulante, anticoagulante e fibrinolítico, e por essa razão estão envolvidos
em doenças trombóticas (GÖRLACH, KIETZMANN, HESS, 2002; HERKERT et
al., 2004; GÖRLACH, 2004). As EROs interferem adicionalmente, no processo de
formação do trombo em múltiplos passos, nas plaquetas, parede do vaso e
fatores da coagulação (AMBROSIO, TRITTO, GOLINO, 1997).
1.5 ANTIOXIDANTES
1.5.1 Radicais livres
Cada átomo contém um núcleo, que é cercado por 1 ou mais pares de
elétrons. Um único qualquer elétron em uma órbita é chamado de um elétron
desemparelhado. Um elétron desemparelhado em torno do núcleo constitui uma
radical (KAUL et al., 1993). Os radicais livres são altamente reativos com radicais
e derivados não-radicais. Na verdade, radical livre não é o termo ideal para
designar os agentes reativos patogênicos, pois alguns deles não apresentam
elétrons desemparelhados em sua última camada. Como em sua maioria são
derivados do metabolismo do oxigênio, no decorrer deste texto utilizaremos o
termo “espécies reativas do oxigênio” (ERO) para referirmos a eles. ERO’s,
subprodutos altamente tóxicos do metabolismo aeróbico, reagem
desfavoravelmente com macromoléculas circundante, resultando em danos
graves a células dos tecidos. O oxigênio (O2) molecular é uma das principais
fontes de formação radicais livres em ambientes intracelulares e extracelulares
(KUMAR & JUGDUTT, 2003). Estas espécies reativas são encontradas em todos
os sistemas biológicos. Em condições fisiológicas do metabolismo celular aeróbio,
o O2 sofre redução tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na
formação de H2O.
Em sistemas aeróbicos, é essencial o equilíbrio entre agentes óxidos
redutores e o sistema de defesa antioxidante. Esses agentes são gerados
endogenamente como conseqüência direta do metabolismo do O2 e também em
31
situações não-fisiológicas, como a exposição da célula a xenobióticos que
provocam a redução incompleta de O2 (ROSS & MOLDEUS, 1991). A figura 5
mostra as maiores fontes produtoras de ERO’s, onde incluem a mitocôndria,
retículo endoplasmático, membrana plasmática e citosol. A mitocôndria gera o
radical superóxido (O2.-) durante a respiração, que é convertido a peróxido de
hidrogênio (H2O2) pela Mn-Superóxido desmutase (SOD). No citosol, O2·- é
convertido a H2O2. As duas maiores defesas contra H2O2 são o ciclo redox da
glutationa presente em ambos, citosol e mitocôndria e catalase presente na fração
peroxissomal. Outras fontes de O2·- incluem as enzimas xantina oxidase no
citosol, NADPH oxidase na membrana plasmática e citocromo P450 no retículo
endoplasmático. Bcl-2, que esta relacionado com o ciclo celular e apoptose pode
funcionar como um antioxidante em alguns sistemas apoptóticos induzindo a
relocalização de glutationa no núcleo. O oxido nítrico (NO) pode ser produzido no
citosol ou na mitocôndria por espécies reativas do nitrogênio (NOS’s).
Adicionalmente, o fator de necrose tumoral (TNF) pode induzir ativação de NOS,
resultando na geração de óxido nítrico (NO). NO pode reagir com lipídeos de
membrana e podem causar mutações no DNA (ANAZETTI & MELO, 2007).
Figura 5. Fontes intracelulares de ERO’s e principais mecanismos de defesa
antioxidante. Fonte: SOUZA, 2010.
32
O desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes que resulta
na indução de danos celulares pelos ERO’s tem sido chamado de estresse
oxidativo (SIES, 1993). A ocorrência de um estresse oxidativo moderado,
frequentemente é acompanhada do aumento das defesas antioxidantes
enzimática, mas a produção de uma grande quantidade de ERO’s pode causar
danos e morte celular (ANDERSON, 1996). Os danos oxidativos induzidos nas
células e tecidos têm sido relacionados com a etiologia de várias doenças,
incluindo doenças degenerativas tais como as cardiopatias, aterosclerose e
problemas pulmonares (AMES et al., 1993; WITZUM, 1994; ROY & KULKARNI,
1996; STAHL & SIES, 1997) e outras (Tabela 2). Os danos no DNA causados
pelas ERO’s também desempenham um papel importante nos processos de
mutagênese e carcinogênese (POULSEN et al., 1998).
Tabela 2 – EVENTOS RELACIONADOS A ESPÉCIES REATIVAS DE O2
Envelhecimento;
Mutações;
Câncer;
Aterosclerose;
Lesão por toxicidade de O2 em pulmão e retina;
Lesão pós-isquemia e reperfusão de cérebro, coração, pele, intestino, pâncreas, fígado, músculo, rins e pulmões;
Lesão pós-concussão cerebral e pós-hipertensão intracraniana;
Síndrome demencial;
Disfunção renal pós-transplante;
Artrite reumatoide;
Hemocromatose transfusiomal;
Doenças auto-imunes.
* Adaptado de COHEN, 1989; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1990; HALLIWELL, 1992.
A utilização de compostos antioxidantes encontrados na dieta ou
mesmo sintéticos é um dos mecanismos de defesa contra esses agentes reativos
e hoje vêm sendo alvo de diversas pesquisas como também neste estudo.
33
1.5.2 Compostos Antioxidantes
Os antioxidantes podem ter um efeito positivo sobre a saúde humana
como eles podem proteger o corpo humano contra o dano por EROS, que podem
atacar macromoléculas tais como lípidos da membrana, proteínas e DNA, levam a
problemas de saúde diversos, tais como o cancro, diabetes mellitus, o
envelhecimento e as doenças neurodegenerativas, como já visto à cima, (NGO,
WIJESEKARA, VO, VAN TA, & KIM, 2010). Além disso, a deterioração de alguns
alimentos foi identificada devido à oxidação dos lípidos ou ranço e a formação de
indesejável produtos de peroxidação de lipídios secundárias. Oxidação lipídica
por EROS, tais como o anion superóxido, radicais hidroxila e H2O2 também
provoca uma diminuição no valor nutritivo dos alimentos lipídicos, e afetar a sua
segurança e aparência.
Atualmente a indústria farmacêutica comercializa vários compostos
antioxidantes sintéticos tais como hidroxianisol butilado (BHA), butil-
hidroxitolueno (BHT), terc-butil-hidroquinona (TBHQ) e gaiato de propilo (GP)
esses compostos têm sido amplamente utilizados para retardar a oxidação e
processos de peroxidação (JE, PARK, & KIM, 2005; KIM et al, 2001;. NI, WANG,
& KOKOT, 2000). No entanto, o uso desses antioxidantes sintéticos deve estar
sob restrita regulação devido a riscos potenciais à saúde (PARK, JUNG NAM,
SHAHIDI, & KIM, 2001; SAFER & AL-NUGHAMISH, 1999). Assim, a busca de
antioxidantes naturais como alternativas seguras é importante na indústria
alimentar e farmacêutica (PENA-RAMOS & XIONG, 2001). Recentemente, há um
interesse considerável na alimentar, bem como a indústria farmacêutica para o
desenvolvimento de antioxidantes a partir de fontes naturais, tais como a flora
marinha e fauna. Entre os recursos marinhos, as algas marinhas representam
uma das mais ricas fontes de antioxidantes naturais (CORNISH & GARBARY,
2010).
1.6 PROLIFERAÇÃO CELULAR E CÂNCER
As células tumorais, conceitualmente, proliferam independentes dos
controles normais e são capazes de invadir e colonizar os tecidos circunvizinhos.
34
Pela possibilidade de formar tumores chamados de secundários ou metastáticos
se tornam difíceis de erradicação cirúrgica.
A proliferação celular normal é regulada diretamente por mecanismos
que determinam quando uma célula deve passar o seu estágio de restrição ou
ponto de restrição (START) do ciclo de divisão celular, ou indiretamente, através
da regulação de seu caminho à diferenciação final. Em ambos os casos os
agentes reguladores normais podem ser geneticamente classificados naqueles
cujo produto auxilia no estimulo da proliferação celular e naqueles que seu
produto possa inibi-la.
Correspondentemente há duas rotas mutacionais pelas quais a
proliferação celular se torna descontrolada podendo caracterizar um câncer. A
primeira seria aquela na qual um gene “estimulador” poderia estar hiperativo e a
segunda quando um gene “inibidor” estivesse inativo (ALBERTS et al., 1989;
VIDEIRA et al., 2002).
Câncer é um conjunto de doenças caracterizado pelo progressivo
acúmulo de mutações no genoma de uma célula. Estas mutações levam a
alterações na expressão ou função de genes-chave para a manutenção da
homeostasia celular. Essas alterações genéticas podem converter uma célula
normal em uma célula transformada, que se caracteriza por não mais responder
aos sinais de controle de proliferação, morte e diferenciação que governam a
comunidade celular.
Estudos epidemiológicos mostram que a idade é um dos principais
fatores de risco para o desenvolvimento do câncer. Ou seja, o câncer é uma
doença relacionada com a idade, ocorrendo mais freqüentemente em pessoas
idosas. Assim, com o aumento progressivo da expectativa de vida média das
pessoas, a incidência de câncer tende a aumentar. Este fato é interpretado como
um aumento na probabilidade de mutações acumularem-se no material genético
de cada indivíduo devido à exposição acumulada a fatores mutagênicos. Assim,
numa situação limite, o aparecimento de uma célula cancerosa seria praticamente
inevitável. (GREENWALD et al., 1996; SPORN & SUH, 2002)
Atualmente tem-se discutido intensivamente e comprovado que a
formação de células cancerígenas no corpo humano pode ser diretamente
induzida por radicais livres naturais, os estudos em busca de fármacos
35
anticancerígenos e também fármacos utilizáveis como agentes quimioterápicos,
ganharam uma popularidade positiva no estudo, descobertas importantes para o
tratamento do câncer. Desta forma, compostos que possuam atividades
antioxidantes, tais como, compostos derivados de fontes naturais, podem ser
usados indiretamente para reduzir a formação de células cancerígenas no corpo
humano.
Compostos derivados de algas marinhas como dito anteriormente são
conhecidos por serem importantes varredores de radicais livres prevenindo danos
causados pela oxidação, que é um importante contribuinte para que seu efeito
possa ser avaliado na carcinogênese.
Durante a cascata de formação do câncer existem várias fases, as
células normais sofrem processos de iniciação, promoção e progressão. A maioria
dos compostos anticancerígenos utilizados atualmente são capazes de manipular
o crescimento das células cancerígenas com efeitos secundários. Portanto,
identificação de quimioterápicos novos e eficazes, com um menor efeito colateral
tornou-se uma importante estratégia mundial no estudo para prevenção e
tratamento do câncer.
Efeitos significativos no tratamento desta doença já foram observados
em compostos extraídos de algas marinhas, principalmente pigmentos e
polissacarídeos sulfatados e seus derivados, onde têm sido amplamente
estudados, com especial ênfase no seu efeito in vitro em células de linhagens
cancerígenas (TERUYA et al., 2007; YAMASAKI-MIYAMAMOTO et al., 2009) e
ambiental na dietética, mostrando ser um fator antimutagênico (FERRUZZI et al.,
2007).
Tendo em vista o amplo espectro de atividades atribuídas aos
polissacarídeos sulfatados das algas marinhas, torna-se pertinente o estudo
desses compostos quanto a sua atividade antioxidante, anti-hemostática e
antiproliferativa da alga marrom Dictyota menstrualis, objeto deste estudo.
36
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar estruturalmente e prospectar possíveis atividades
farmacológicas da Fucana B (Fuc B) extraída da alga marrom Dictyota
menstrualis.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Caracterizar estruturalmente a fucana B da alga D.menstrualis;
Prospectar possíveis atividades farmacológicas da Fucana B frente aos
seguintes processos farmacológicos:
o Atividade anticoagulante in vitro.
o Ação estimulatória sobre a síntese de heparam sulfato
antitrombótico sintetizado por células endoteliais de aorta de coelho
(RAEC).
o Ensaio de competição por sítios de ligação em células endoteliais de
aorta de coelho (RAEC);
o Ação antioxidante in vitro;
o Viabilidade celular de linhagens celulares normal e modificadas;
37
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS
3.1.1 Alga marinha
Os polissacarídeos sulfatados, para a realização do estudo, foram
obtidos da alga marrom Dictyota menstrualis (Figura 6), coletada no litoral sul do
Estado do Rio Grande do Norte, na praia de Búzios, durante a maré baixa. A alga
Dictyota menstrualis apresenta a seguinte taxonomia (ALGAEBASE, 2009):
Divisão: Phaeophyta
Classe: Phaeophycea
Ordem: Dictyotales
Gênero: Dictyota
Espécie: Dictyota menstrualis
Figura 6 - Dictyota menstrualis: alga marinha marrom utilizada neste
trabalho.
As algas foram processadas no mesmo dia da coleta e acondicionadas em
sacos de polietileno, sendo então, posteriormente, submetidas aos processos de
extração e purificação (ALVES, 2006). Sendo assim, as amostras de
polissacarídeos sulfatados utilizadas neste trabalho foram gentilmente cedidas
pela Profa. Dra. Luciana Guimarães Alves Filgueira.
38
3.1.2 Plasma humano
O sangue humano foi coletado com citrato de sódio (concentração
final 0,82%) sob agitação leve, em frasco de polietileno esterilizado. O plasma foi
separado por centrifugação e alíquotas de 10 mL foram estocadas a -20°C em
fracos de vidro esterilizados.
3.1.3. Linhagens Celulares
3.1.3.1. Células Endoteliais de Aorta de Coelho (RAEC)
Células endoteliais da aorta de coelho (RAEC, rabbit aortic endothelial cell),
clone ClPs, foram gentilmente cedidas pelo Dr. V. Buonassisi (Buonassisi &
Colburn, 1973) e utilizadas nas dependências da Sala de Cultura do
Departamento de Biologia Molecular e Bioquímica da Universidade Federal de
São Paulo (UNIFESP) (Ensaio de Síntese de HS antitrombótico e Competição por
Sítios de Ligação) (figura 07).
Figura 7. Células endoteliais da aorta de coelho
Fotografia analisada em microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC). Fonte:
Laboratório de bioquímica e biologia celular (UNIFESP)
3.1.3.2. Células HeLa (adenocarcinoma cervical - ATCC CCL-2)
A linhagem celular utilizada no presente estudo foi gentilmente cedida
pela professora Dra. Silvia Regina do departamento de Genética da universidade
39
federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e utilizada nas dependências da Sala de
Cultura do Departamento de Bioquímica desta mesma universidade.
Figura 8. Células HeLa coradas com Hoechst 33258.
Fonte: HeLa cells stained with Hoechst 33258.jpg|thumb|180px|Legenda
3.1.3.3. Células 3T3
As células de fibroblastos de camundongos (3T3) utilizada no presente
estudo foram gentilmente cedidas pelo professor Dr. Edvaldo S. Trindade do
departamento de Biologia Celular da Universidade Federal do Paraná (UFPR) e
utilizadas nas dependências da Sala de Cultura do Departamento de Bioquímica
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)
Figura 9. Células Humanas de Fibroblastos Fonte: http://www.sciencepro.com.br/produtos/engenharia-de-tecido-e-cultura-celular/5015
40
3.1.3.4. Células De Carcinoma Do Fígado Humano (HepG2)
A linhagem celular utilizada no presente estudo foi gentilmente cedida
pelo professor Dr. Valter Ferreira do departamento de Microbiologia e
Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e utilizada
nas dependências da Sala de Cultura do Departamento de Bioquímica desta
mesma universidade.
Figura 10. Monocamada normal de células HepG2.
Fonte: Muller, 2010
3.2 REAGENTES QUIMICOS E APARELHOS UTILIZADOS
1,10-Fenantrolina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
[35S] – sulfato de sódio, do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, IPEN (São Paulo,
SP);
Acetona (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);
Ácido 2-tiobarbitúrico 98% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
Ácido acético (VETEC, Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
Ácido ascórbico 99% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
Ácido clorídrico (VETEC, Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
41
Ácido sulfúrico (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);
Agarose (Standard-Low-Mr)da BioRad Laboratories (Richmond,CA, EUA);
Azul de toluidina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
BHT (Farmafórmula, Natal, Brasil);
Butanol (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);
Células endoteliais da aorta de coelho (RAEC) cultivadas em meio F-12 nriquecido com soro
bovino fetal na presença de penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina (100 mg/mL) em
atmosfera de 2,5% de CO2;
Citrato de sódio (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);
Cloreto de bário da Reagen QuimiobrásIndústrias Químicas S.A. (Rio De Janeiro, RJ, Brasil);
Cloreto férrico (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);
Condroitim sulfato - Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio, Japão);
Coomassie Blue Brilliant G (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
Dermatam sulfato - Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio, Japão);
Dextranas de diferentes tamanhos (Pharmacia);
DMSO (dimetilsulfóxido) (MERK, Darmstadt, Germany);
Etanol (Cromoline, SP, Brasil);
Fator Xa (FXa) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
Ferrozina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
Folin Ciocalteau (Cromoline Química Fina Ltda, São Paulo, SP, Brasil);
Fosfato de sódio monobásico (Nuclear, SP, Brasil);
Heparam sulfato (purificado de pulmão bovino no INFAR, UNIFESP (São Paulo, SP);
Kits comerciais de coagulação – tempo de tromboplastina parcial ativado (aPTT) e tempo de
protrombina (PT) (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil)
Maxatase - protease de Esporocacillus (Biobrás, Montes Claros, MG, Brasil);
Meio F-12 - mistura de nutrientes, F-12 com glutamina, sem bicarbonato de sódio (Gibco –
Grand Island, NY, USA) e penicilina/ estreptomicina (liofilizadas em pó, 10.000 unidades de
penicilina e 10 mg de estreptomicina por ml em cloreto de sódio 0,9%) da Sigma Chemical
42
Co. (St. Louis, MO, USA) contendo 10% de soro bovino fetal da Cutilab (Campinas, São
Paulo);
Metanol (VETEC, Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
Metasulfato de fenazina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
MTT – brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium (Sigma Chemical Company,
St. Louis, MO, USA);
NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) (Reagente de Folin Ciocalteau (Cromoline
Química Fina Ltda, São Paulo, SP, Brasil);
Nitroblue tetrazolium (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA);
Peróxido de hidrogênio (Cromato produtos químicos, SP, Brasil);
Piridina (MERK, Darmstadt, Germany);
RNase (Ribonuclease A de pâncreas bovino 5x crystallized Type I-A-protease free, essentially
salt-free) - (Reagente de Folin Ciocalteau (Cromoline Química Fina Ltda, São Paulo, SP,
Brasil);
Scrapper – rodinho para placa de cultura;
Sephadex G-100 (Pharmacia, USA);
Solução de EBSS (solução salina balanceada de Earle sem cálcio e sem magnésio)
preparada no INFAR, UNIFESP (São Paulo, SP) contendo 6,8 g NaCl; 0,4 g KCl; 1,14 g
Na2HPO4; 0,2 g KH2PO4; 0,14 g Na2HPO4 x 1H2O; 2,2 g NaHCO3; 1,0 g D-glucose e 0,01
g de vermelho de fenol em um litro de água;
Solução salina 0.9% (estéril e apirogênica);
Substrato cromogênico da trombina (N-benzoyl-Phe-Val-Arg-γ-nitroamilidahydrochloride)
(Reagente de Folin Ciocalteau (Cromoline Quνmica Fina Ltda, Sγo Paulo, SP, Brasil);
Substrato cromogκnico do FXa (N-benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilide) (Reagente de Folin
Ciocalteau (Cromoline Quνmica Fina Ltda, Sγo Paulo, SP, Brasil);
Sulfato de ferro II - sulfato ferroso - (Cromoline Quνmica Fina Ltda, Diadema, SP, Brasil);
Sulfato ferroso (Cromoline, SP, Brasil);
Tampγo 1,3 diaminopropanoacetato (PDA);
Trombina bovina (Reagente de Folin Ciocalteau (Cromoline Quνmica Fina Ltda, Sγo Paulo,
SP, Brasil);
43
Tubo a vαcuo com EDTA (VACUETTE, Greiner Bio-One Brasil);
Viocase extraνda de pβncreas de porco – mistura de esterases, nucleases, colagenases e
elastases (Gibco – Life tecnologies, Rockville, MD, USA);
Todos os demais reagentes utilizados foram da melhor qualidade disponνvel.
Alιm dos aparelhos utilizados na rotina do laboratσrio, podemos citar:
Agitador de tubos mod AP 56 da Phoenix Ltda. (Araraquara, SP, Brasil);
Agitador orbital mod. 255-B da FANEM Ltda. (Sγo Paulo, SP, Brasil).
Banhos e estufas de temperatura constante da FANEM Ltda. (Sγo Paulo, SP, Brasil).
Bombas peristαlticas Microperpex S mod. 2232 da LKB (Bromma, Suιcia) e Econo Pump
mod. EP-1 da Bio Rad Laboratories (Hercules, CA, EUA).
Centrνfuga refrigerada RC 2-B da Ivan Sorvall Inc. (Norwalk, CO, EUA).
Centrνfuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltd. (Tσquio, Japγo).
Espectrofotτmetros Varian - Series 634 da Varian Techtron PPTY Ltd. (Springvale, Vico,
Austrαlia) e Hitachi U-2000 (Tσquio, Japγo).
Espectrτmetro de infravermelho modelo FT1 6PC da Perkin Elmer (EUA)
Evaporador rotatσrio Evapo-Mix da Buchler Instruments (Fort Lee, NJ, EUA).
Medidor de pH, Orion Research model 701 A/ digital lonalyzer (Cambridge, MA, EUA)
Fontes de corrente contνnua regulαvel desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa, Tιcnica Permatron
Ltda. (Sγo Paulo, SP, Brasil).
Coagulτmetro da Drake (Sγo Paulo, SP, Brasil)
Bancada de fluxo laminar- Pachane Pa300, Piracicaba- Sγo Paulo;
Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110- USA;
Microscσpio Nikon CFI60, Spectrum Bioengenharia Mιdica Hospitalar LTDA. Sγo Paulo- Sγo
Paulo- Brasil
44
3.3 MÉTODOS
3.3.1 Caracterização estrutural dos polissacarídeos sulfatados obtidos de D.
menstrualis
3.3.1.1 Eletroforese em gel de agarose
Para o preparo do gel, a agarose (0,6%) foi dissolvida em tampão 1,3
diaminopropanoacetato (PDA) 0,05 M, pH 9,0 aquecido a 100 °C. Em seguida foi
colocado sobre lâminas de vidro medindo 7,5 x 5,0 x 0,2. Alíquota de 5 uL das
frações da alga (10 mg/mL) foram aplicadas em poços no gel e submetidas à
corrente elétrica por volta de 1 h e 30 min a 100 V, em cuba resfriada a 4ºC
(DIETRICH, DIETRICH, 1976).
Após o tempo de migração, a lâmina foi submersa em CETAVLON
0,1%, por 12 h a temperatura ambiente, visando à precipitação dos
polissacarídeos no gel. Depois desse processo, o gel foi seco em corrente
contínua de ar quente e corado em azul de toluidina 0,06% por 15 min. O excesso
do corante foi removido por solução descorante. Em seguida, a lâmina foi deixada
a temperatura ambiente para secar totalmente. Foi utilizado como referência de
mobilidade, os padrões de glicosaminoglicanos sulfatados, uma vez que não
dispomos de padrões específicos dos heteropolissacarídeos de algas.
3.3.1.2 Análises químicas
3.3.1.2.1 Dosagem de açúcares totais
Os açúcares totais foram quantificados pelo método do fenol/ácido
sulfúrico de acordo com Dubois et al., (1956), empregando o monossacarídeo
fucose como padrão. As leituras foram realizadas a 490 nm.
45
3.3.1.2.2 Dosagem de sulfato
A determinação do teor de sulfato foi realizada após hidrólise ácida
(HCl 6N, 6 horas, 100°C), pelo método turbidimétrico da gelatina-bário
(DODGSON, PRICE, 1962). Como padrão foi utilizado o sulfato de sódio (1
mg/mL), o qual foi submetido às mesmas condições das amostras em estudo.
3.3.1.2.3 Dosagem de proteínas
O conteúdo protéico foi determinado pelo método de Bradford, (1976),
usando o reagente Coomassie Blue Brilliant e a albumina bovina como padrão, e
a leitura realizada a 595 nm.
3.3.1.2.4 Dosagem de compostos fenólicos
A concentração de compostos fenólicos foi determinada pelo método
de Folin Ciocalteau (SWAIN, HILLS, 1959) com algumas modificações, usando
0,5 mL de etanol, 2,5 mL de água destilada, 0,25 mL de reagente de Folin
Ciocalteau, 0,5 mL de carbonato de sódio, 0,5 mL das frações rica em fucanas da
alga D. menstrualis (1 mg/mL). A leitura foi realizada a 755 nm. Uma solução de
ácido gálico em água destilada foi usada para elaboração da curva de
concentração padrão.
3.3.1.2.5 Dosagem de ácidos urônicos
O conteúdo de ácido urônico foi determinado pela reação do carbazol,
segundo DISCHE (1974), utilizando-se como padrão ácido D-glucurônico, sendo
as leituras realizadas a 525 nm.
46
3.3.1.3 Cromatografia descendente em papel
A FucB foi hidrolisada (HCl 2N, 2 h, 100º C), e posteriormente,
neutralizada, dessecada, e ressuspendida em água destilada e aplicada em papel
Whatman n°1 e submetida ao sistema de solvente butanol: piridina: água (v/v/v, 2:
3: 1,5). Os monossacarídeos foram revelados com nitrato de prata (TREVELYAN,
PROCTER, HARRISON, 1950).
3.3.1.4 Análise de Espectroscopia de Infravermelho (IR)
A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectômetro FT-
IR ABB Bomen modelo MB 104 (4000 a 400 cm-1). O composto foi analisado
após secagem sob a forma de pastilha de KBr, sendo necessário 10 mg do
composto teste para a análise.
3.3.2 Avaliação das atividades farmacológicas
3.3.2.1 Atividade anticoagulante
O tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e o tempo de
protrombina (PT) do pool de plasma citratado misturado a F0,9 foram
determinados por kits comerciais da Labtest (São Paulo, SP). O teste de aPTT
avalia a influência dos compostos sobre os fatores da via intrínseca e comum da
coagulação e o teste de PT avalia a influência sobre os fatores da via extrínseca e
comum da coagulação.
O sangue humano, utilizado na avaliação da atividade anticoagulante
da FucB, foi obtido de voluntários sadios que não haviam utilizado medicamento
ao longo de 2 semanas antes da coleta nem tinham feito uso de bebida alcoólica
nos últimos três dias, assim como também de mulheres que não fazem uso de
anticoncepcional.
O sangue foi coletado por punção venosa e misturado cuidadosamente
com citrato de sódio a 3,2%, na proporção de 9:1. Em seguida, o sangue foi
centrifugado a 1000 x g por 10 min a temperatura ambiente. Após a centrifugação,
47
o sobrenadante foi retirado e colocado em tubos plásticos siliconizados,
representando o pool de plasma citratado.
3.3.2.2 Tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT)
Para determinar o tempo de tromboplastina parcial ativada foram
misturados 90 μl do pool de plasma citratado com 10 μl da F0,9 contendo 5, 10,
25, 50, 100, 150, 200, 250, 350 μg, e incubados por 3 min a 37°C. Após esse
tempo, foram adicionados 100 μl de cefalina pré-aquecida a mistura anterior, e
incubado por mais 3 min a 37°C. Em seguida, foram adicionados 100 μl de CaCl2
pré-aquecido e o tempo para a formação do coágulo foi aferido em coagulômetro.
Como controle foi utilizado 100 μl do pool de plasma citratado (Figura 11).
Figura 11 – Esquema de teste de tempo de tromboplastina parcial ativada
(aPTT)
48
3.3.2.3 Tempo de protrombina (PT)
Para a determinação do tempo de protrombina foram misturados 90 μL
do pool de plasma citratado com 10 μL da F0,9 contendo 50, 75, 100, 150, 200
μg, e incubado por 3 min a 37°C. Após esse tempo, foram adicionados 200 μL do
reagente soluplastin pré-aquecido a 37°C e o tempo para a formação do coágulo
foi aferido em coagulômetro. Como controle foi utilizado 100 μL do pool de plasma
citratado (Figura 12).
Figura 12 – Esquema de teste de tempo de Protrombina (PT)
3.3.2.4 Atividade sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico
3.3.2.4.1 Manutenção de cultura das células endoteliais de aorta de coelho
(RAEC)
As células foram mantidas em meio F-12, enriquecido com 10% de soro
fetal bovino (SFB) e penicilina/estreptomicina, respectivamente, 10.000 U e 10 mg
para cada litro de meio.
O meio foi preparado dissolvendo-se F-12 em pó (mistura de nutrientes
Ham's F-12) em água recém-destilada e filtrada em sistema Milli-Q,
acrescentando-se 1,18g de bicarbonato de sódio, 10.000U de penicilina e 10mg
de estreptomicina para cada litro de meio. Depois de dissolvido, o meio foi
49
esterilizado em filtros de acetato de celulose com 0,22µm. Para a manutenção e
subcultivo das células, o meio foi enriquecido com 10% de SFB e
armazenado a 4ºC.
3.3.2.4.2 Marcação metabólica dos glicosaminoglicanos sulfatados
As células foram cultivadas em placas de Petri P35 (35x10mm) até
atingirem a confluência. A seguir, as células foram lavadas por 3 vezes em meio
F12 na ausência de SFB e adicionado novo meio contendo 150Ci/ml de [35S]-
sulfato de sódio na presença ou ausência dos polissacarídeos e mantidas por
tempos determinados a 37oC sob tensão de 2,5% de CO2.
Após o tempo de incubação, o meio foi removido e armazenado em tubo de
microcentrífuga de 2 mL a -20ºC. As células foram lavadas por 3 vezes com PBS
em banho de gelo e removidas com 1,0 mL de uma solução de uréia 3,5 M em
tampão Tris-HCl 0,05 M pH 8,0 com o auxílio de um “scrapper”. Uma alíquota de
20 L foi separada para a dosagem de proteínas, utilizando-se o reagente
Coomassie Brilliant Blue G (Spector, 1978).
3.3.2.4.3 Análise dos glicosaminoglicanos sintetizados
Alíquotas da célula e do meio de cultura foram submetidas à proteólise com
maxatase e, posteriormente, à eletroforese em gel de agarose tampão PDA 0,05
M, pH 9,0. Após a eletroforese, as amostras foram analisadas e quantificadas
pela exposição do gel de agarose a um filme radiosensível que excita íons de
fósforo. A seguir, o filme sensibilizado foi submetido a varredura a laser no
aparelho CycloneTM, o qual faz a leitura do fósforo excitado e o quantifica como
unidade de luminescência, variando conforme o grau de excitação. Amostras de
radioatividade conhecida são impressionadas no mesmo filme e a quantificação
da radioatividade de cada banda de glicosaminoglicano é determinada
empregando-se software OptiQuantTM, para análise de imagem, específico para o
aparelho.
50
3.3.2.5 Ensaio de competição da Fuc B por sítios de ligação em RAEC
Células endoteliais de aorta de coelho foram cultivadas em placas de 96
poços (8000 celulas/poço) em meio F-12 contendo 10% de SFB. Após 4 dias de
cultura, o meio condicionado foi removido e as células foram lavadas com PBS
contendo 1% de BSA a 4ºC. Em seguida, as células foram expostas a diferentes
concentrações de heparina biotinilada mais 100 vezes o excesso molar de fucana
A por 1 hora a 4ºC. Após esse tempo, as células foram então lavadas com PBS
contendo BSA 1%. A ligação da heparina biotinilada às células foi detectada por
incubação com estreptavidina conjugada com Europium (1:5000 em PBS), por 40
minutos a 4ºC. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS contendo BSA
1% e a fluorescência foi analisada em leitor de fluorescência Wallak Multilabel
Counter (Bouças et al., 2000; Bouças, 2003).
3.3.2.6 Atividade antioxidante
3.3.2.6.1 Sequestro de radicais DPPH
A atividade sequestradora de radicais 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
foi determinada de acordo com o método de Ye et al., (2008) modificado. 0,1 ml
de concentrações variadas (0,08 – 5,0 mg/ml) das frações foram adicionados em
1,5 mL de solução etanólica de DPPH (0,1 mM). Após 30 minutos em temperatura
ambiente, a absorbância foi mensurada a 517 nm. A atividade sequestradora de
radicais DPPH foi determinada pela fórmula: atividade sequestradora (%) = (1-
Aamostra/ Acontrole) x 100, onde Acontrole se refere a absorbância da solução etanólica
de DPPH na ausência da amostra, a qual é substituída por álcool etílico
(absorbância do controle), e Aamostra se refere a absorbância da solução etanólica
de DPPH na presença da amostra teste (absorbância da amostra).
3.3.2.6.2 Sequestro de radicais hidroxila
O sequestro de radicais hidroxilas foi determinado pelo método de
Smirnoff e Cumbers (1989) modificado. 0,5 mL de concentrações variadas (0,08 –
51
5,0 mg/ml) da F0,9 foram adicionadas a 0,5 mL de fenantrolina (5 mM/l), 0,75 ml
de tampão fosfato (20 mM; pH 7,4) e 0,5 mL de Fe2SO4 (7,5 mM/l). Em seguida,
foram adicionados 0,5 ml de H2O2 a 15% e a mistura incubada a 37°C por 90
minutos. Após incubação, a mistura foi centrifugada (1200 rpm por 5 min) com
leitura realizada a 536 nm. A atividade sequestradora de radicais hidroxilas foi
determinada pela seguinte fórmula: atividade sequestradora (%) = (1- Aamostra/
Acontrole) x 100, onde Acontrole se refere à absorbância da mistura na ausência da
amostra teste (absorbância do controle), e Aamostra se refere a absorbância da
mistura na presença da amostra (absorbância da amostra).
3.3.2.6.3 Sequestro de radicais superóxido
Os radicais superóxidos foram gerados em 3 ml de tampão Tris-HCl
(16 mM; pH 8), contendo 50 μM de nitroblue tetrazolium, 10 μM de metasulfato de
fenazina, 78 μM de NADH (forma reduzida) e concentrações variadas (0,08 – 5,0
mg/mL) da F0,9. A reação colorimétrica foi detectada a 560 nm (ZHANG et al.,
2003) e o percentual de inibição determinado pela fórmula: taxa de atividade
sequestradora(%) = [(Acontrole positivo– Aamostra)/Acontrole positivo – Acontrole negativo)] x 100,
onde Acontrole positivo é a absorbância da mistura na ausência da amostra teste
(absorbância do controle positivo), Aamostra é a absorbância da mistura na
presença da amostra teste (absorbância da amostra) e Acontrole negativo é a
absorbância da mistura na ausência de NADH (absorbância do controle negativo).
3.3.2.6.4 Ação quelante de ferro
A atividade quelante de ferro foi determinada utilizando 0,2 ml da F0,9
em concentrações variadas (0,08 – 5,0 mg/ml) misturadas com 0,025 ml de
sulfato de ferro (2 mM) e incubadas por 1 minuto a temperatura ambiente. Após
esse tempo, 0,1 ml de ferrosina (5 mM) foram adicionadas, e a mistura foi
incubada por mais 20 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, foi
adicionada água destilada para completar 2 ml e a leitura feita a 562 nm. O
percentual da atividade quelante foi determinado pela fórmula: taxa de atividade
quelante (%) = [(Acontrole positivo – Aamostra)/Acontrole positivo] x 100, onde Acontrole
52
positivo é a absorbância da mistura na qual a amostra teste foi substituída por
água destilada (absorbância do controle positivo) e Aamostra se refere a
absorbância da mistura na presença da amostra teste (absorbância da amostra)
(SALTARELLI et al., 2009).
3.3.2.6.5 Poder redutor
O poder redutor foi determinado pelo método de Yuan et al., (2005)
modificado. Para isto, 0,2 ml da F0,9 em concentrações variadas (0,08 – 5,0
mg/ml) foram misturadas com 0,5 ml de tampão fosfato (0,2 M; pH 6,6) e 0,5 ml
de ferrocianeto de potássio (1,0%, p/v) e a mistura foi incubada por 20 min a
50°C. Cerca de 0,5 ml de ácido tricloroacético TCA (10%, p/v) foi adicionado a
mistura, a qual foi centrifugada por 10 min a 3000 x g. Após a centrifugação, o
sobrenadante (0,5 ml) foi misturado com 0,1 ml de solução de FeCl3 (1,0%, p/v) e
0,5 ml de água destilada e a leitura foi realizada a 700 nm. O resultado foi
expresso em absorbância, quanto maior a absorbância maior o poder redutor.
Para o controle negativo, na mistura da reação a amostra teste foi substituída por
tampão fosfato e como branco da reação, todos os reagentes foram utilizados
com exceção do FeCl3, o qual foi substituído por água. O BHT foi usado como
antioxidante padrão para comparação do poder redutor das amostras testes.
3.3.2.6.6 Atividade antioxidante total
Foi realizada utilizando 1ml de solução reagente, contendo molibdato
de amônio (4 mM), ácido sulfúrico (600mM) e fosfato de sódio (28mM) e 0,1ml de
solução de amostra, à diferentes concentrações, em tubos de hemólise, em
seguida foram fechados e incubados à 95ºC por 90 min. Após resfriamento a
temperatura ambiente as atividades foram monitoradas espectrofotometricamente
pela formação de fosfomolibdênio que apresenta absorbância máxima em 695nm
(PRIETO et al, 1999).
53
3.3.2.7 Ação sobre a viabilidade celular
3.3.2.7.1 Manutenção das culturas
Para a manutenção das culturas, foi utilizado o meio DMEM da Gibco,
penicilica/estreptomicina (liofilizadas em pó, 10.000 U de penicilina e 10 mg de
estreptomicina por mL de solução de cloreto de sódio a 0,9%) da Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO, EUA) e Soro Fetal Bovino (SFB) da Cultilab (Campinas, SP,
Brasil) para as células da linhagem HeLa (adenocarcinoma cervical - ATCC CCL-2)
e as células HepG2 e células de fibroblastos de camundongos (3T3). As células
foram semeadas em placas de 96 poços com uma densidade de 1 x 106
células/poço e incubadas com o polissacarídeo a 37°C, 5% de CO2, ao tempo de
24, 48 e 72 horas. Ao final destes períodos foi adicionado 100µl de MTT, seguindo
a incubação por 4h. Em seguida foi adicionado 100µl de ácido isopropanol 0,04N
aos poços e misturado para dissolver os cristais de formazan azul-escuro com
leitura a 570nm. (MOSMANN, 1983). Para as células RAEC, na manutenção da
cultura o meio utilizado foi o F-12.
3.3.2.7.2 Experimento de viabilidade celular
O método de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-
difeniltetrazolium) é um ensaio de viabilidade celular utilizado para determinar a
citotoxicidade após a exposição das células a substâncias testes. A citotoxicidade
da FucB de D. menstrualis foi medida como previamente descrita por Mosmann
(1983) usando células endoteliais da aorta de coelho (RAEC), células da linhagem
HeLa (adenocarcinoma cervical - ATCC CCL-2) e as células HepG2 e células de
fibroblastos de camundongos (3T3). As culturas foram expostas a 25, 50 e 100 μg
da FucB (em triplicata) e incubadas a 37°C por 24 h. Após a incubação, 100 μl de
meio F-12 contendo MTT (concentração final de 5 mg/ml), foi adicionado a cada
poço, e as placas foram incubadas a 37°C por 4 horas. Decorrido o tempo, o
sobrenadante foi removido e 100 μl de etanol P.A. foram adicionados a cada poço
para solubilizar os cristais de formazan. Após homogeneização, a leitura foi
54
realizada a 570 nm. Para o controle da reação (100% de proliferação), a FucB foi
substituída por meio DMEM e F-12 de acordo com a linhagem celular analizada.
3.3.3 Análises estatísticas
As atividades farmacológicas testadas foram analisadas
estatisticamente pela Análise de variância (ANOVA) com nível de significância de
p<0,05 e pelo Teste de Turkey-Kramer para determinar as diferenças entre os
valores obtidos para os grupos controle e experimentais (comparações múltiplas)
com níveis de significância de p<0,05. Análises também foram realizadas
utilizando o teste t de Student, com nível de significância de p<0,05. Os valores
são dados em média ± desvio padrão. Os cálculos para determinação do EC50
(concentração necessária para atingir 50% da atividade máxima do composto) e
IC50 (concentração do composto necessária para atingir 50% de inibição do
sistema gerado) foram realizados no GraphPad Prisma 5.
55
4. RESULTADOS 4.1 CARACTERIZAÇÃO INICIAL DOS POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DA
ALGA D.menstrualis
4.1.1 Rendimento dos polissacarídeos obtidos pós subfracionamento
O extrato bruto contendo polissacarídeos obtido da alga Dictyota
menstrualis (295 mL) foi submetido a um fracionamento com concentrações
crescentes de acetona (0,5 – 3,0 v), do qual foi obtida, entre outras, a fração 1,0
(F1,0), ora precipitada com 1,0 volume de acetona. Para uma melhor purificação
da fração escolhida, fração 1,0 foi submetida a um subfracionamento com
acetona devido ao seu bom rendimento em relação ao peso seco obtido e por
apresentar, em seu perfil eletroforético, no mínimo duas populações
polissacarídicas com diferente perfil migratório (dado não mostrado) (ALVES,
2006). Os dados do rendimento das amostras provenientes do subfracionamento
com concentrações crescentes de acetona (0,5-1,5 v), foi também calculado em
relação ao peso seco e está expresso na tabela 3.
Tabela 3 - RENDIMENTO (% DO PESO SECO) OBTIDO DO SUBFRACIONAMENTO COM ACETONA DA F 1,0 DE D. MENSTRUALIS.
Dyctiota menstrualis Rendimento
(%)
0,5 19,13
0,6 4,46
0,7 15,08
0,8 11,08
0,9 25,92
1,0 10,82
1,1 5,84
1,5 7,65
56
4.1.2 Perfil eletroforético dos polissacarídeos
Uma caracterização inicial dos compostos obtidos foi feita por
eletroforese em gel de agarose utilizando-se o azul de toluidina como corante.
Conforme NEWTON, SCOTT, WHITEMAN (1974), um composto rico em sulfato
demonstra coloração azul arroxeada característica na presença do corante. A
eletroforese das subfrações de Dictyota menstrualis, demonstrou que estas são
constituídas por compostos sulfatados, sendo comprovado pela metacromasia
apresentada após a coloração. (Figura 13A). Para verificar a presença de
polissacarídeos carboxilados na mistura, realizou-se a descoloração dos
compostos em acetato de sódio 0,2M pH 5,8 (Newton et. al., 1974) (Figura 13B).
A figura 13A demonstra a presença de polissacarídeos sulfatados,
exceto nas frações 0,5v; 0,6v e 1,5v. Já a figura 13B indica a presença de
alginatos (compostos carboxilados) precipitando juntamente com as populações
sulfatadas, sendo evidente nas frações entre 0,6v e 0,9v, mostrando uma maior
migração em relação aos polissacarídeos sulfatados. Ainda nesta figura podemos
visualizar que as frações 1,0v e 1,1v possuem duas populações de
polissacarídeos sulfatados cada, migrando em alturas distintas.
A B
Figura 13. Eletroforese em gel de agarose em tampão PDA dos polissacarídeos ácidos extraídos da alga Dyctiota menstrualis. (A) – Frações obtidas a partir do
subfracionamento da Fração 1,0 utilizando-se acréscimo de diferentes volumes acetona, como descrito em métodos. Cerca de 50ìg de cada fração foram submetidos à eletroforese em gel de agarose em tampão PDA 0,05M, pH 9,0. A visualização dos polissacarídeos foi feita com azul de toluidina 0,01%. (B) – Mesma eletroforese da figura A, descorada com acetato de sódio, conforme métodos.Legenda: P - padrão de glicosaminoglicanos: CS – condroitim sulfato; DS – dermatam sulfato; HS – heparam sulfato, _ sentido da corrida.
57
4.1.3 Composição química das populações obtidas no subfracionamento
Para uma melhor caracterização das frações foram realizados
experimentos em relação às suas composições químicas (Tabela 4). Os
resultados mostram que as subfrações da F1,0 são compostas principalmente por
carboidratos, apresentando alto conteúdo de sulfato. As amostras possuem baixa
contaminação protéica e baixo conteúdo de compostos fenólicos.
a. Dubois et al., (1956); b. Bradford, (1976); c. Dische, (1974); d. Dogson, Price (1962); e.
Swain, Hills, (1959).
Com o objetivo de analisar algumas propriedades farmacológicas de
fucanas, decidiu-se trabalhar com apenas um composto. Desta forma, escolheu-
se a fração F0,9v, por apresentar um maior rendimento em peso seco, por possuir
pouquíssima contaminação protéica e com compostos fenólicos, bem como seu
excelente percentual de sulfato.
Tabela 4 - Composição química (% peso seco) das subpopulações extraídas de Dictyota menstrualis
Frações Açucares
totaisa
(%)
Proteínasb
(%)
Ácidos urônicosc
(%)
Sulfatod
(%)
Compostos fenólicose
(%)
0,5 43,7 1,61 4,8 29,3 4,75
0,6 47,8 1,74 4,8 32,0 4,87
0,7 45,2 1,70 4,3 30,4 5,64
0,8 50,7 1,60 4,1 38,6 3,84
0,9 49,8 0,58 4,3 42,3 3,86
1,0 49,7 1,99 8,7 36,9 3,74
1,1 48,5 2,45 5,8 35,3 4,01
1,5 44,9 1,73 3,2 30,8 4,59
58
4.2 CARACTERIZAÇÃO PARCIAL DA FRAÇÃO 0,9v (F0,9v) 4.2.1 Massa molecular da F0,9v
Com o objetivo de se obter o valor da massa molecular da Fuc 0,9v,
esta fração foi submetida à cromatografia em gel filtração em coluna de Sephadex
G-75 (figura 14). A fração foi eluída em frações de 1mL e monitoradas pelas
dosagens de açúcares totais (métodos). De acordo com a cromatografia em gel
filtração utilizando padrões de polissacarídeos com massas moleculares
conhecidas, a F0,9v apresentou massa molecular aproximada de 26 KDa. Como
a F0,9v apresentou apenas um pico correspondente à carboidratos e tem um
perfil de migração intermediário, convencionamos denominá-la de Fucana B (Fuc
B).
Figura 14. Perfil de eluição da Fuc B em cromatografia de gel filtração em Sephadex
G-75. Cerca de 50mg da Fuc B foram submetidos à cromatografia em coluna de gel filtração
separadamente (118 x 1,3cm), As frações de 1 mL foram coletadas através de um coletor de
frações acoplado a coluna e o acompanhamento do perfil de eluição foi feito pela da dosagem de
açucares totais, conforme descrito em métodos.
59
4.2.2 Análise dos açúcares e sulfato presentes na FucB
Para uma caracterização dos constituintes monossacarídicos, a Fuc B
foi submetida à cromatografia descendente em papel após hidrólise, conforme
métodos. Conforme pode ser observado na Figura 15 abaixo, a cromatografia
descendente em papel dos hidrolisados ácidos da FucB em solvente butanol:
piridina:água, mostra que esta fração é composta principalmente pelos
monossacarídeos fucose e galactose, definindo a presença de uma heterofucana.
Além disso apresenta também em sua estrutura outros monossacarídeos
utilizados como padrão nesta cromatografia como xilose e ácido glucurônico.
Figura 15. Cromatografia descendente em papel da Fuc B. Solvente: butanol: piridina:
água. Monossacarídeos utilizados - Fuc: fucose; Xil: xilose; Man: manose; Glc: glicose; Gal: galactose; GlcAu: ácido glucurônico. F0,9: FucB. Origem: referente ao ponto de aplicação da FucB e dos monossacarídeos padrão. A seta se refere à direção da cromatografia
4.2.3 Análise dos açúcares e sulfato presentes na FucB
Após a análise da cromatografia foi realizada a densitometria das
bandas e representamos na tabela abaixo (Tabela 5), a massa molecular, o
percentual de açúcares totais e a relação molar entre os monossacarídeos e
sulfato da FucB.
60
Tabela 5. Massa molecular e relação molar da FucB e da alga marinha marrom D.
menstrualis
4.2.4 Análise estrutural da FucB por espectroscopia de infravermelho (IR)
As análises de infravermelho da FucB extraída da alga Dictyota
menstrualis mostrou sinais em 3423, 2930, 1653, 1415, 1262, 1156, 1074, 930,
840, 820, 770, 740 cm-1, como pode ser visto na Figura 16 e na Tabela 6. Sinais
observados em 3423 e 2930 cm-1 são referentes a vibração do H-O existente na
ligação de hidrogênio das moléculas e vibração do -CH, respectivamente (SUN et
al., 2009). O sinal em 1653 cm-1 indica a presença de água associado ao
composto teste (KIM et al., 2006) e em 1413 cm-1 estaria associado com vibração
simétrica devido a grupos carboxila (VAN HOOGMOED, BUSSCHER, DE VOS,
2003). O sinal em 1262 cm-1 comprovou a ligação S=O de ésteres de sulfato,
relacionado a presença de sulfatação na amostra (PEREIRA et al., 2009). Sinais
em cerca de 1156 cm-1 demonstram vibrações C-O do anel de piranose, comum
a todos os polissacarídeos (GÓMEZ-ORDÓÑEZ, RUPÉREZ, 2011). Os sinais
obtidos a 1074 e 930 cm-1 revelam a presença de ligação C-O da 3,6-
anidrogalactose. Sinais em 840 e 820 cm-1 estão relacionados a presença de
sulfato na posição axial e equatorial do C4 da fucose respectivamente (DUARTE
et al., 2001 e OLSON et al., 1993) Os sinais em 770 e 740 cm-1 são referentes
ao esqueleto de flexão do anel piranose (MATSUHIRO, 1996). Sinais entre 537 –
606 cm-1 estão associados a bandas características de ligação peptídica, sendo
referente a flexão C=O fora do plano, designada como amida VI (KONG, YU,
2007).
Massa
Molecular Açucares
Totais
Relação Molar
Fuc Xil Gal GluAu Sulfato
FucB 26 KDa 49,8% 1 0,8 4,5 0,1 2
61
Figura 16. Espectro de infravermelho da FucB rica em heterofucanas da alga D.
menstrualis. Em foco a região de 500 – 1000 cm-1.
62
Em resumo as análises até agora demonstram que temos uma
heterofucana sulfatada, composta principalmente por galactose, fucose e xilose
(Xilogalactofucana sulfatada) a qual denominamos de FucB, conforme
mencionamos anteriormente. Desta forma, decidimos então prospectar possíveis
atividades farmacológicas desta fucana frente a determinados processos
farmacológicos como se apresenta a seguir.
Tabela 6 - RESUMO DOS SINAIS DE ESPECTROSCOPIA DE INFRAVERMELHO APRESENTADOS PELA FucB
Sinais (cm-1) Descrição do sinal Referência
3423 Vibração do H-O existente na ligação de hidrogênio
das moléculas SUN et al., 2009
2930 Vibração do -CH SUN et al., 2009
1653 Presença de água
associado ao composto teste
KIM et al., 2006
1413 Vibração simétrica devido
a grupos carboxila
VAN HOOGMOED, BUSSCHER, DE VOS,
2003.
1262
Ligação S=O de ésteres de sulfato, relacionado a
presença de sulfatação na amostra
PEREIRA et al., 2009
1156 Vibrações C-O do anel de piranose, comum a todos
os polissacarídeos.
GÓMEZ-ORDÓÑEZ, RUPÉREZ, 2011.
1074, 930 Presença de ligação C-O da 3,6-anidrogalactose
PEREIRA et al., 2009
840 Sulfato na posição axial do
C4 da fucose DUARTE et al., 2001
820 Sulfato na posição
equatorial OLSON et al., 1993
770, 740 Esqueleto de flexão do
anel piranose MATSUHIRO, 1996
63
4.3 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE
4.3.1 Tempo de Protrombina
A atividade anticoagulante da FucB de Dictyota menstrualis foi
realizada através dos ensaios de Tempo de Protrombina (PT) para avaliar sua
ação sobre a via extrínseca da coagulação.
Os resultados do ensaio de PT indicam que diversas concentrações da
amostra testada não são capazes de aumentar o tempo de coagulação, com isso
podemos afirmar que a FucB não apresentou atividade anticoagulante sobre a via
extrínseca da coagulação (Figura 17).
Figura 17. Tempo de protrombina tratado com FucB em diferentes massas. Nível de
significância em relação ao controle: (*) p<0,05. Valores foram expressos por médias ± desvio
padrão (n=3).
4.3.2 Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada
Os resultados obtidos pelo ensaio de tempo de tromboplastina parcial
ativada, (Figura 18), demonstraram que a FucB apresentou atividade
anticoagulante (p<0,001) quando comparada com o controle negativo (30 s). As
diferentes massas testadas (25, 50, 100, 150, 200 e 250 μg) causaram aumento
no tempo para a formação do coágulo, com exceção da massa de 25 μg, na qual
Massa de FucB (μg)
64
não foi visualizada diferença estatisticamente significante no tempo de formação
do coágulo comparando-se com o controle (p>0,05).
Figura 18. Tempo de tromboplastina ativada de pool de plasma tratado com FucB
em diferentes massas. Nível de significância em relação ao controle: (30s) p>0,05; (***)
p<0,001.Valores foram expressos por médias ± desvio padrão (n=3).
4.4 ATIVIDADE SOBRE A SÍNTESE DE HEPARAM SULFATO
ANTITROMBÓTICO
A heparina e fucanas extraídas de outras algas marrons mostraram ter
efeito estimulatório sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico em células
endoteliais de aorta de coelho (NADER et al., 2004, ALVES et al., 2011).
Com o objetivo de saber se a FucB possui efeito estimulatório na
síntese do HS antitrombótico em células endoteliais de aorta de coelho
confluentes (clone ClPs), as mesmas foram expostas a diferentes concentrações
de FucB durante 22 horas na presença de 150Ci/mL de [35S]-sulfato de sódio.
A FucB mostrou-se capaz de estimular a síntese de HS antitrombótico,
atingindo estímulo significante a partir de 25 g/mL, tanto na célula quanto no
meio (figura 19A e B). Percebe-se também que as concentrações de 75 e
Massa de FucB (μg)
65
100g/mL para o extrato celular e de 100 g/mL mostraram-se sem efeito sobre a
síntese do HS, indicando que pode existir uma relação de dose-dependência.
Figura 19. Glicosaminoglicanos sulfatados sintetizados por células endoteliais em
presença de diferentes concentrações de FucB. Células endoteliais de aorta de coelho
(RAEC), clone ClP´s foram cultivadas em placa de Petri (35 x 10mm) até atingirem a confluência e
então foram incubadas com meio F-12, livre de SFB, contendo [35s]-sulfato de sódio (150Ci/mL)
em diferentes concentrações de fucana A. Os GAGs presentes no extrato celular (A) e secretados
para o meio de cultura (B) foram quantificados por eletroforese em gel de agarose e tampão PDA
0,05M pH 9,0. A seguir, o gel foi impressionado em filmes de raio-X e a radioatividade quantificada
em aparelho Cyclone. Nível de significância em relação ao controle: (30s) p>0,05; (***)
p<0,001.Valores foram expressos por médias ± desvio padrão (n=3).
4.5 ENSAIO DE COMPETIÇÃO POR SÍTIOS DE LIGAÇÃO EM CÉLULAS
ENDOTELIAIS
A heparina, polissacarídeo sulfatado de origem animal, também possui
efeito estimulatório sobre a síntese deste mesmo composto, o que sugere a
existência de sítios de ligação específicos para a heparina na matriz ou na
66
superfície celular destas células, bem como possíveis interações com proteínas
presentes na matriz extracelular (Trindade et al., 2004; Nader et al., 2002).
Heparinas marcadas com biotina obtidas de diferentes fontes também
demonstraram possuir efeito estimulatório na síntese do HS (Trindade et al.,
2000, Andrade, 2006), assim como a fucana B extraída da alga Spatoglossum
schroederii (Rocha et al., 2005a) e a fucana A extraída da alga Dictyota
menstrualis (ALVES, 2006). Tal fato nos leva a supor que o efeito das fucanas de
algas sobre a célula endotelial possa ser decorrente da ligação delas na matriz
e/ou superfície celular, assim, as fucanas poderiam estar se ligando a esses
mesmos sítios de ligação da heparina. Diante disso, decidimos verificar se a FucB
da alga D. menstrualis compete com a heparina por sítios de ligação em células
endoteliais.
O experimento de competição entre a heparina biotinilada e a FucB foram
realizados utilizando-se diferentes concentrações de heparina biotinilada em
presença de uma concentração 100 vezes maior de FucB não-biotinilada (figura
20). Quando submetidas à ligação apenas a heparina biotinilada, verificou-se uma
ligação dose-dependente (Trindade, 2004). Quando a heparina biotinilada foi
incubada com heparina não-biotinilada houve um deslocamento em relação à
heparina biotinilada, demonstrando que ambos compostos ligam-se aos mesmos
sítios.
Quando a FucB foi incubada juntamente com a heparina biotinilada
observou-se que houve também um significativo deslocamento da ligação em
relação à heparina, indicando que estes polissacarídeos tanto reconhecem como
se ligam aos mesmos sítios de ligação da heparina.
67
Figura 20. Ensaio de competição de ligação entre a heparina biotinilada e FucB não
biotinilada. Células endoteliais foram subcultivadas em placas de 96 poços em uma
concentração de 3x104 células/poço e mantidas em cultura por 3 dias. A seguir as células foram
submetidas a ensaios de competição entre a heparina biotinilada e a FucB não-biotinilada, sendo
feito outro ensaio com heparina biotinilada e não-biotinilada para servir como controle positivo,
como descrito em métodos.
68
4.6 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
4.6.1 Capacidade antioxidante total (CAT)
Para a atividade antioxidante total a FucB mostrou capacidade de
156% em relação ao padrão BHT com concentração de 62,5µg/ml enquanto em
relação ao ácido ascórbico apresentou 89% com concentração de 4000µg/ml
(Figura 21 e Tabela 7).
Figura 21. Atividade antioxidante total em equivalentes de ácido ascórbico e BHT da FucB. Valores expressos por média.
Tabela 7 – ATIVIDADE ANTIOXIDANTE RELATIVA DE FUCANAS DE ALGA D. menstrualis (%)
FucB 62,5 µg 125 µg 250 µg 500 µg 1000 µg 2000 µg 4000 µg
Padrão BHT 156,9 72,1 48,8 54,9 60,2 96,8 109,7
Padrão Ac Ascórbico
13,4 17,0 24,5 33,8 50,8 68,8 89,5
69
4.6.2 Atividade seqüestradora de radicais hidroxila (OH•), superóxido (O2-•) e
DPPH.
O ação seqüestradora de radicais hidroxila mostrou ser dose
dependente nas concentrações testadas (0,31 – 10 mg/ml) variando de 22,56 ±
0,14% a 28,62 ± 0,49%, promovendo o sequestro desses radicais da ordem de
28,62% desses radicais quando a FucB foi utilizada a 10mg/ml (Tabela 8).
Conforme a mesma tabela citada anteriormente, a FucB apresenta
baixa atividade sequestradora dos radicais superóxido dose dependente nas
concentrações testadas (0,31 – 10 mg/ml), exibindo uma ação sequestradora que
variava de 7,73 ± 0,41% a 15,39 ± 1,34%.
Pode ser também observado, a ação seqüestradora dose dependente
de concentrações variadas da FucB (0,31 – 10 mg/ml) sobre radicais DPPH
oscilando entre 4,59 ± 0,36% e 6,17 ± 0,68%.
Valores são as médias de triplicatas ± desvio padrão
Tabela 8 – Atividade sequestradora radicais hidroxila (OH•) , superóxido (O2-•) e
DPPH
FucB (mg/ml) Inibição de OH• (%) Inibição de O2-• (%)
Inibição de DPPH (%)
0,31 22,56 ± 0,14 7,48 ± 0,55 4,59 ± 0,36
0,62 23,48 ± 0,42 7,84 ± 1,54 4,37 ± 0,56
1,25 23,51 ± 0,45 9,62 ± 1,51 4,86 ± 1,04
2,5 25,34 ± 1,16 10,32 ± 0,47 5,64 ± 0,26
5 26,93 ± 1,23 11,25 ± 0,36 5,97 ± 1,11
10 28,62 ± 0,49 12,20 ± 1,43 6,17 ± 0,68
70
4.6.3 Poder Redutor
A Figura 22 mostra que o poder redutor da FucB foi dose dependente,
e quanto maior a concentração maior a absorbância observada. Pelo método
estudado, na presença das concentrações testadas (0,15-5mg/mL) observou-se
um poder redutor de até 71% em relação ao ácido ascórbico, na concentração de
2,5 µg/ml (Tabela 9).
Figura 22. Poder redutor das diferentes concentrações da F0,9 da alga Dictyota
menstrualis. Valores expressos por média.
Tabela 9 – ATIVIDADE ANTIOXIDANTE RELATIVA AO PODER REDUTOR DE Dictyota menstrualis F0,9 (%)
FucB (µg/ml) 0,15 0,31 0,625 1,25 2,5
Padrão Acido Ascórbico
47,8 45,6 46,9 56,8 71,5
71
4.6.4 Ação quelante de ferro
O ferro apresenta alta reatividade, sendo conhecido como o mais
importante prooxidante para oxidação lipídica. A ferrozina forma um complexo
com o ferro no estado ferroso (Fe +2), no entanto na presença de agentes
quelantes de ferro, ocorre a interrupção da formação deste complexo, o que pode
ser avaliado pela diminuição da cor vermelha gerada pelo complexo. Por isso, a
redução da cor de refere a atividade quelante do composto testado (QI et al.,
2006). Nas concentrações testadas, a FucB exibe uma razoável ação quelante do
metal ferro, com ação de 37 a 80% quando comparada com o composto padrão
(EDTA) (Figuras 23 e 24).
Figura 23. Aumento da absorbância das diferentes concentrações de FucB em
comparação ao padrão (EDTA) na reação.
Figura 24. Percentual de quelação férrica da FucB da alga Dictyota menstrualis.
72
4.7 AÇÃO SOBRE A VIABILIDADE CELULAR
Outra atividade farmacológica testada foi a verificação da ação da
FucB sobre a viabilidade celular de diferentes linhagens celulares normais e
modificadas.
4.7.1 Teste Utilizando Células Endoteliais De Aorta De Coelho (RAEC)
A FucB não apresentou diferenças significativas entre as doses nos
tempos testados, ou seja, não houve alteração significativa na viabilidade celular
nas doses e tempos testados (Figura 25A). Este primeiro resultado é importante,
pois, neste podemos observar que o efeito antitrombótico da FucB ocorre pelo
estímulo da síntese do HS antitrombótico. Confirmando o estudo, visto que se
não houve alteração na proliferação celular, o efeito antitrombótico não é dado
pelo aumento do número celular (proliferação).
4.7.2 Teste Utilizando Células De Fibroblastos (3t3)
Outra verificação foi feita sobre a proliferação de fibroblastos.
Observamos que após 24h de incubação das células com a FucB, na
concentração de 25µg houve um aumento significante na viabilidade celular o que
não ocorreu nas concentrações 50 e 100µg nas mesmas 24h e nas
concentrações de 25, 50 e 100µg quando a FucB foi incubada por 48 e 72h,
tendo sido reduzido significativamente a viabilidade celular. A dose de 100µg em
24 e 48 horas têm diferença significante p<0,05, sendo mais citotóxica no tempo
de 48 horas onde observamos tempo dependência. As demais doses não
apresentaram diferenças significativas (Figura 25.C).
4.7.3 Teste Utilizando Células De Câncer Cervical (Hela)
Quando células HeLa foram incubadas com FucB, nas primeiras 24 e
48 horas não houve nenhuma diferença estatisticamente significante entre as
concentrações das amostras. As doses de 25 e 50µg têm diferenças estatísticas
73
entre os tempos de 24 e 72 horas (p<0,05), indicando assim que a amostra passa
a diminuir a viabilidade celular nessa linhagem após 72 horas. A concentração de
100µg de amostra no tempo de 72 horas apresentou diferença estatisticamente
significativa com o p<0,001 (Figura 25B). Este resultado demonstra que as células
Hela são sensíveis a FucB e de forma dependente ao tempo de exposição.
4.7.4 Teste Utilizando Células De Carcinoma Do Fígado Humano (Hepg2)
O efeito da FucB na viabilidade celular em células HepG2 mostrou que nas
primeiras 24 horas houve uma proliferação celular estatisticamente significante
em todas as concentrações testadas no ensaio, porem com o aumento do tempo
de exposição das células à FucB, observamos uma diminuição estatisticamente
significante da viabilidade celular após 48 e 72h em todas as concentrações
(Figura 25D).
74
Figura 25. Efeito da funcana B de Dictyota menstrualis na proliferação celular de
células normais e modificadas. (A) - Células endoteliais de aorta de coelho (RAEC). (B) -
Células de câncer cervical (HeLa). (C) - Células de fibroblastos (3T3). (D) - Células de carcinoma
do fígado humano (Hep G2). Células tratadas com 25, 50 e 100 µg de fucana B, por 24, 48 e 72
horas. Nível de significância em relação ao controle: (*) p<0,05 e (***) p<0,001. Valores são
médias percentuais +- desvio padrão.
75
5 DISCUSSÃO
As análises envolvendo a estrutura de polissacarídeos requerem uma
extração eficiente, livre de contaminantes e que não provoquem danos ao
polímero. Em se tratando de algas marinhas, não existe um método padrão de
extração, isto porque, cada classe desses vegetais apresenta um certo grau de
dificuldade para extração dos polissacarídeos (Percival & MacDowel, 1967).
Assim, baseado em estudos anteriores, adotamos uma metodologia que vem
sendo utilizada como rotina em nossos laboratórios e que possui reprodutibilidade
na extração desses compostos tão peculiares já vistos em Spatoglossum
schroederi (Leite et al., 1998, Rocha et al., 2005), Sargassum filipendula (Costa et
al., 2011), Sargassum vulgare(Dore et. al. 2012) entre outros.
No presente estudo foram extraídas oito subfrações polissacarídicas da
fração 1,0 da fucana B da alga marinha marrom Dictyota menstrualis. Como era
de se esperar, as frações iniciais tiveram um maior rendimento em relação às
frações finais. Isso pode ser explicado pela concomitante precipitação de ácidos
algínicos nas primeiras frações, outro tipo de polissacarídeo ácido presente em
algas marrons. A precipitação dos ácidos algínicos nas frações iniciais também foi
descrita em trabalhos anteriores (Dietrich et al, 1995, Leite et al, 1998; Queiroz,
2002; e Silva et al., 2005), trabalhando com outras algas marrons.
Fracionamentos de polissacarídeos de algas marrons de outras espécies, em
iguais condições mostraram rendimentos similares ao nosso, indicando a
reprodutibilidade do método escolhido (Rocha, 1998, Queiroz, 2002 e Silva et al.,
2005).
O perfil eletroforético apresentado pelas heterofucanas deste estudo
também foram vistas por outros autores em fucanas extraídas de diferentes algas,
o que foi descrito primeiramente por Dietrich et al. (1995), indicando a presença
de três bandas com migração diferenciadas, as quais foram denominadas de
banda A (menor migração), banda B (migração intermediária) e banda C (maior
migração). Nesse trabalho evidenciou-se também a presença dessas três
populações polissacarídicas das frações estudadas.
76
As análises químicas das oito frações demonstram que uma maior
quantidade de polissacarídeo total foi encontrado na fração 0,9v (49,8%)
indicando que foi a fração extraída que possuía um maior grau de pureza em
relação à quantidade de açúcar encontrado. A quantidade de proteínas
encontradas nas frações foi relativamente baixa, entre 0,58 a 2,45%, indicando
uma vez mais, que o método de extração com a enzima proteolítica maxatase foi
eficaz. Todos os compostos extraídos são sulfatados, sendo que a fração 0,9v
também apresentou o maior percentual de sulfatação (42,3%) e uma baixa
contaminação protéica (0,58%). Hussein e col. (1980) encontraram em fucanas de
Padina povonia um elevado teor de proteínas (67%) enquanto que Detrich e col.
(1995) obtiveram para Padina gymnospora valores compreendidos entre 1,6-
7,5%, já as fucanas de Fucus vesiculosus apresentaram índices de contaminação
protéica variando entre 0,16% - 0,24%, (Carvalho, 2001). Outras fucanas que
foram extraídas de S. schröederi apresentaram contaminação inferior a 5,8%
(Leite et al., 1998). Vale salientar, que nestes dois últimos casos as fucanas foram
obtidas por metodologias semelhantes às utilizadas neste trabalho.
O fato de se ter encontrado polissacarídeos, sulfato e outros compostos
em proporções diferentes propõe diferenças entre as frações, leva a preposição
de que a alga em estudo sintetiza mais de um tipo de fucana e que elas se
encontram distribuídas nas frações obtidas. Uma varredura na literatura com
relação à estrutura de fucanas de algas demonstra que algas sintetizando mais de
um tipo de fucanas não são uma exceção e sim uma regra. Os dados das
pesquisas feitas pelo grupo em que está inserido esta trabalho, também não
fogem a esta regra, todas as algas estudadas até o momento sintetizam mais de
um tipo de fucana, como Lobophora variegata, Dictyota mertensis (Farias 1992),
Dictyota menstrualis (Albuquerque et al., 2004), Padina gymnospora, (Silva et al.,
2005), Canistrocarpus cervicornis (Câmara et al., 2011).
A confirmação de fucose, em todas as frações, somado à presença de
sulfato e de outros monossacarídeos como: xilose, galactose e ácido glucurônico
indicam a presença de heterofucanas nas frações. A presença destes compostos
parece ser comum nas Dictyotales, pois há um número considerável de citações
na literatura de algas dessa classe que apresentam heretofucanas na sua
composição (Queiroz, 2003; Rocha 2005a; Rocha 2005b; Albuquerque, et al.
77
2004; Kloareg & Quatrano, 1988; Silva 2005; Percival, et al. 1984; Abdel-Fathah
et al., 1978; Mian & Percival, 1973; Hussein et al., 1980).
A fração 0,9v em estudo apresentou um perfil de mobilidade
intermediário em eletroforese, quando se compara às outras frações
polissacarídicas, caracterizando-a como uma fucana B, de acordo com a
denominação proposta por Rocha (2004). Sendo assim, decidimos denominá-la
de FucB da alga D. menstrualis, a qual apresentou uma massa molecular
aproximada de 26 KDa. Massas de 500 kDa foram observadas para fucanas
extraídas da alga Lessonia nigrescens (Percival et al., 1984). Já da alga
Sargassum horneri, Preeprame et al., (2001) obtiveram uma fucana de 270 kDa.
Por outro lado Nishino et al., (1994) descreveram uma heterofucana com massa
molecular de 6.8 kDa. Já fucanas de S. schröederi apresentaram massas
moleculares em torno de 21 kDa (Leite et al., 1998; Rocha et al., 2005). Por tanto,
não há um consenso com relação a definição do que seriam fucanas de alta e
baixa massa molecular, o que revela a contradição devido a grande variação de
massas moleculares apresentadas. Um exemplo é a descrição de uma fucana de
baixa massa molecular de 56 kDa (Nagaoka et al., 1999). Dentro desse contexto,
a FucB é considerada de baixa massa molecular. Discrepâncias como essas
deixam evidente a necessidade de uma melhor definição do que seriam fucanas
de alta, média ou baixa massas moleculares.
A FucB então apresenta-se como uma heterofucana que apresenta
galactose, xilose e fucose possuindo sua sulfatação uma vez mais confirmada por
espectroscopia de infravermelho demonstrando sinais indicando absorções
características da presença de ésteres de sulfato em 1262 cm-1 (PEREIRA et al.,
2009), o que demonstrou a presença de fucoses sulfatadas, tipo fucana, na fração
estudada.
As fucanas possuem estruturas complexas devido às várias
possibilidades de combinações entre diferentes açúcares e posições de
sulfatação, o que aliado ao fato da presença de altas massas moleculares criam
dificuldades para que sejam determinadas todas as características estruturais
desses polissacarídeos e faz com que mesmo técnicas modernas de estudos
estruturais, fiquem no limite de suas capacidades, sem que com isso promovam
78
uma resolução da estrutura de fucanas (CHEVOLOT et al., 2001; BILAN et al.,
2002).
De acordo com Pereira(1999) e Kariya (2004) fucanas de algas marrons
possuem uma complexidade estrutural diferente das fucanas extraídas de outras
fontes, podendo apresentar açúcares constituintes diversificados, quantidade e
posição do sulfato diferentes e variações de massa molecular. Leite et al., 1998 e
Rocha et al., (2005), determinaram a estrutura de fucanas extraídas da alga
marrom Spatoglossum schoroederi, fucana A e fucana B, respectivamente, as
quais apresentavam grande heterogeneidade estrutural e massa molecular
semelhante às encontradas neste trabalho.
A FucB apresentou atividade anticoagulante, entretanto esta se
restringe a via intrínseca da coagulação, analisada pelo teste de aPTT. Poucos
compostos anticoagulantes possuem ação sobre a via extrínseca da coagulação.
Costa et al., 2010, analisando a ação de polissacarídeos extraídos de 11 espécies
de algas sobre a coagulação, encontrou em apenas uma espécie polissacarídeos
com ação sobre a via extrínseca da coagulação. A literatura relata que peso
molecular, ramificações, densidade de cargas e estrutura tridimensional de
polissacarídeos sulfatados influencia nas suas interações com as proteínas da
coagulação sanguínea (OLSON, BJORK, & BOCK, 2002). Os polissacarídeos
sulfatados fornecem grande vantagem como alternativa para terapia
anticoagulante realizada com a heparina (FAREED, HOPPENSTEADT, BICK,
2000). Entretanto, nem todos os polissacarídeos sulfatados mostram ação
anticoagulante, e a ação antitrombótica exibida por estes polissacarídeos é
importante uma vez que causa inibição indireta na formação do trombo, como
observado por Rocha et al., (2005), estudando uma galactofucana de
Spatoglossum schroederi.
Estudos dos mecanismos envolvidos na atividade anticoagulante das
fucanas, realizados por Melo et al., (2004), com invertebrados como Echinometra
lucunter, Herdmania monus e Strongylocentrotus franascanus, mostraram que
exigências estruturais para a interação de fucanas com inibidores da coagulação
e proteases alvos não são, simplesmente, uma conseqüência da densidade de
carga e do conteúdo de sulfato, mas que estas conferem esteroespecíficidade às
mesmas.
79
A base estrutural da interação é complexa porque envolve
polissacarídeos heterogêneos, mas depende da distribuição de grupos sulfato no
polímero e da composição monossacarídica. As fucanas sulfatadas possuem
cadeias significativamente mais longas que a heparina para realizar a atividade
anticoagulante.
Drogas anticoagulantes, como a heparina, aumentam o tempo de
coagulação para até 300s em baixas concentrações (0 a 50 μg) para os testes de
aPTT, PT e HepTest. (Andrade, 2006). Segundo a literatura uma fucana extraída
da alga Padina gymnospora chegou a prolongar o tempo de aPTT para 240
segundos, mesmo tempo observado para a heparina (9μg), utilizada numa
concentração de 100μg (Silva et al., 2005).
A heparina e fucanas extraídas de outras algas marrons mostraram ter
efeito estimulatório sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico em células
endoteliais de aorta de coelho (Nader et al., 2004).
Estudos mostraram que a heparina previne a trombose devido a sua
atividade anticoagulante e ação indutora da síntese de heparam sulfato
antitrombótico pelas células endoteliais, ou seja, pela sua atividade
antitrombótica, sendo muito difícil distinguir esses dois efeitos (ROCHA et al.,
2005). Estudos de Leite et al., (1998), com uma xilofucoglucuronana da alga
marrom Spatoglossum schroederi, mostraram que este polissacarídeo promoveu
estimulação de cerca de 2,7 vezes na produção e liberação do heparam sulfato
para o meio, sendo esta ação comparável a atividade estimulatória provocada
pela heparina, neste mesmo estudo.
A FucB rica em fucanas sulfatadas de D. menstrualis apresentou ação
estimulatória na síntese de heparam sulfato antitrombótico, induzindo um
aumento na síntese e liberação deste glicosaminoglicano para o meio pelas
células endoteliais da aorta de coelho em cultura tratadas com a Fuc B.
Observou-se que não houve estimulação significativa (p<0,01) na síntese de
condroitim sulfato pelas células endoteliais. Esses resultados corroboram com os
dados de Leite et al., (1998) e Rocha et al., (2005), uma vez que a fração
estimulou a produção de heparam sulfato e não causou qualquer efeito
estimulatório sobre a produção de condroitim sulfato. A heparina tem também,
80
ação estimulatória sobre a síntese de heparam sulfato sem apresentar qualquer
efeito estimulatório sobre a síntese de condroitim sulfato.
Nader et al., (2001), avaliando a ação estimulatória de vários agentes
antitrombóticos sobre a síntese de heparam sulfato antitrombótico pelas células
endoteliais em cultura, mostraram que a heparina quando N-dessulfatada perde
completamente sua ação estimulatória sobre a síntese de heparam sulfato. Este
dado sugere que o sulfato possa ter importância na atividade estimulatória da
síntese de heparam sulfato pelas células endoteliais, o que poderia explicar a
forte atividade estimulatória provocada pela FucB, chegando a ter uma ação na
síntese cerca de três vezes maior quando comparado ao controle negativo.
Rocha (2002) mostrou que as fucanas A e B também competem pelo
mesmo sítio de ligação da heparina nas células endoteliais, sendo que a fucana B
demonstrou um deslocamento ainda maior que o observado para a heparina não
marcada, o que foi confirmado neste trabalho, resultado este que indica a
existência de algum componente na superfície celular ou na matriz extracelular
que se liga a heparina e que também foi capaz de se ligar a fucanas, inclusive a
FucB de D. menstrualis.
A eficiência de um agente antioxidante é determinada pela sua
estrutura química e pode variar de acordo com a concentração, temperatura, tipo
de substrato, oxidação e estado físico do meio do sistema. Além da presença de
agentes que funcionariam como antagonistas ou em sinergia (YANISHLIEVA-
MASLAROVA, 2001).
Algumas pesquisas têm sugerido uma relação entre atividades
antioxidantes, massa molecular e o grau de sulfatação de polissacarídeos
sulfatados de algas (ZHAO et al., 2004; QI et al., 2005). Esta correlação foi
observada por Tannin-Spitz et al., (2005), estudando polissacarídeos de
Porphyridium, os quais mostraram que as frações de polissacarídeos com maior
teor de sulfato (4,5%) apresentavam atividade antioxidante 20% superior a outro
grupo de polissacarídeos que possuíam 3% de sulfato, quando avaliada pelo
método de FOX (WOLF, 1994). Existe portanto, a necessidade de mais estudos
para esclarecer a relação entre o conteúdo de sulfato com a sua ação
antioxidante.
81
A atividade antioxidante de um dado composto é também expressa
como habilidade de seqüestrar o radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)
(WANG et al., 2010). Em nosso estudo, a FucB apresentou baixa ação
antioxidante sobre radicais DPPH, na concentração de 2,5 mg/mL promovendo
5,64±0,26% de atividade sequestradora sobre esses radicais. Yangthong,
Hutadilok-Towatana, Phromkunthong, (2009) estudando extratos aquosos de 4
algas marinhas comestíveis do sudeste da Tailândia, mostram que em relação à
atividade seqüestradora de radicais DPPH, o extrato aquoso da alga verde Ulva
lactuca exibiu ação em torno de 18,47±0,23% na mesma concentração dita
anteriormente.
A FucB exibiu baixa ação antioxidante pelo método de seqüestro de
radicais superóxidos, com atividade seqüestradora de 11,25% na concentração
de 5 mg/mL. Estudos de Liu et al., (2007) mostram que polissacarídeos
purificados da alga Porphyra yezoensis exibem ação seqüestradora de radicais
superóxidos cerca de 80% quando utilizado na concentração de 160 μg/mL.
A remoção de radicais hidroxila é muito importante para a defesa
antioxidante em células e em sistemas alimentares (ARUOMA, 1998). Os
compostos podem apresentar mecanismos antioxidantes diferentes em relação
aos radicais hidroxila, suprimindo a geração desses radicais ou seqüestrando os
radicais já gerados (UEDA et al., 1996). A geração destes radicais ocorreria pela
reação do Fe+2 e H2O2. Estudos mostraram que o grupo sulfato dos
polissacarídeos poderia reduzir a formação de radicais hidroxilas pela ação
quelante de Fe+2 (ZOU et al., 2008). Uma vez que os íons metálicos participam da
geração dos radicais hidroxila, os agentes quelantes de íons promoveriam a
inibição da geração destes radicais (UEDA et al., 1996). No presente estudo,
encontramos resultados semelhante dos encontrados por Zou et al., (2008) pois a
FucB (5 mg/mL) rica em sulfato apresentou moderada ação antioxidante sobre
radicais hidroxila promovendo o seu seqüestro em 26,93% e razoável ação
quelante de Fe+2 (75%), quando utilizada na mesma concentração. A FucB (1,25
mg/mL) mostrou atividade quelante de ferro de cerca de 58%, sendo superior à
atividade de uma fração da alga Gracilaria caudata precipitada com 2 volumes de
etanol, que exibiu ação quelante de cerca de 40,2% quando avaliada pela mesma
metodologia e utilizada na mesma concentração (COSTA et al., 2010).
82
O poder redutor apresentado por um composto pode funcionar como
um indicador do seu potencial antioxidante (SUN et al., 2009). Podemos observar
que a FucB de D. menstrualis nas concentrações testadas apresentou razoável
poder redutor quando comparado ao ácido ascórbico (71,5%). Mostrou poder
redutor considerávelmente maior à fração polissacarídica F2 extraída de
Laminaria japonica eluída de coluna de cromatografia quando utilizada na mesma
concentração (WANG et al., 2008) e poder redutor inferior quando comparada a
um extrato aquoso-quente proveniente da alga Sargassum hemiphyllum, que na
concentração de 1 mg/mL exibiu absorbância de cerca de 1,2 a 700 nm (HWANG
et al., 2010).
A ação da Fuc B na proliferação celular foi observada através do ensaio
de MTT quando as células endoteliais da aorta de coelho foram incubadas com a
Fuc B em diferentes intervalos de tempo e concentrações, demonstrando que a
fração estudada neste trabalho não promoveu alteração no metabolismo das
enzimas mitocondriais que são responsáveis pela conversão do reagente MTT a
formazan, que é o composto detectado no ensaio em questão, sem causar,
portanto a morte das células.
Neste trabalho a Fuc B apresentou um bom efeito citotóxico em cultura
de células da linhagem Hela (adenocarcinoma cervical - ATCC CCL-2), onde a
fucana aparece com um agente antoproliferativo e antitumoral de células
cancerígenas com efeito significativo em 72 horas em todas as concentrações
testadas, mostrou caráter proliferativo para as células 3T3 (fibroblastos) apenas
na menor concentração testada (25 µg) em 24 horas, apresentando caráter
citotóxico com o aumento do tempo e da dose. A Fuc B apresentou um melhor
desempenho na inibição da proliferação de células da linhagem de carcinoma do
fígado humano (Hep G2) em todas as concentrações à partir de 48 horas de
ensaio, nas primeiras 24 horas apresentou um caráter proliferativo nas doses
testadas. Podemos comparar a boa atividade antiproliferativa da Fuc B, com a
atividade antiproliferativa de outras fucanas. No trabalho de Costa, L. S. el al
(2011) as heterofucanas estudadas, extraídas da alga marrom Sargassum
filipendula apresentaram também atividade antiproliferativa em células da
linhagem Hela, HepG2 (Hepatocarcinoma) e células PC3 (Carcinoma de Próstata)
utilizando o teste MTT. Essas heterofucanas exibiram uma forte inibição em
83
células HeLa por indução de apoptose, com efeito dose-dependente, aumentando
a atividade com o aumento da concentração da amostra. No trabalho de Ysantha,
A. et al. (2006) com extratos de cru de polissacarídeos, as amostras testadas
apresentaram uma forte inibição da proliferação celular em todas as linhagens de
células cancerígenas testadas (CT-26, de câncer do cólon, THP-1 e U-937 de
leucemia, e B-16, de melanoma) no ensaio de proliferação celular in vitro.
Assim, a Fuc B da macroalga marinha marrom Dictyota menstrualis,
composta principalmente de carboidratos e sulfato, apresenta forte potencial
contra a ocorrência de trombose, uma vez que além de aumentar o tempo de
coagulação diretamente através dos fatores de coagulação, também pôde
apresentar vigorosa ação antitrombótica pela alta estimulação da síntese de
heparam sulfato antitrombótico pelas células endoteliais da aorta de coelho em
cultura, assim como também pela sua ação inibitória sobre os EROS em alguns
sistemas in vitro, que como já discutido, os EROS estão envolvidos na promoção
do estado de hipercoagulabilidade. A Fuc B também não exibiu ação citotóxica
sobre as células endoteliais da aorta de coelho, apresentando ação citostática
sobre esta linhagem de células normais.
Diante destes resultados, concluímos que isolamos um composto com
diferentes potenciais farmacológicos, porem serão necessários mais estudos para
se verificar a elucidação dos mecanismos envolvidos em tais atividades para que
futuramente se possa comprovar a possível aplicabilidade do composto em
questão como agente terapêutico.
84
6 CONCLUSÕES
A F0,9 posteriormente denominada FucB rica sulfato obtida da alga
marrom Dictyota menstrualis apresentou melhor rendimento proveniente do
fracionamento com acetona.
A fucana B possui alta concentração de açúcares totais e sulfato, com
baixo teor de compostos fenólicos e baixa contaminação protéica, tendo em sua
composição, além de galactose e xilose, a fucose, tratando-se então de uma
heterofucana sulfatada.
FucB mostrou sinais referentes a ligações S=O de ésteres de sulfato,
presença de ligação C-O de 3,6-anidrogalactose, β-D-galactose não sulfatada e
ligação C-O-SO4 no C4 da galactose.
A FucB apresentou moderada atividade anticoagulante nas concentrações
testadas, atuando sobre a via intrínseca e comum, não apresentando atividade
anticoagulante sobre a via extrínseca da coagulação.
A FucB exibiu ação estimulatória significativa na síntese de heparam
sulfato antitrombótico pelas células endoteliais em cultura quando comparadas
com o controle e ainda demonstrou competir pelos mesmos sítios de ligação com
heparina em células endoteliais.
A FucB exibiu ação antioxidante significativa sobre o ensaio de atividade
antioxidante total, poder redutor, varredura de radical hidroxila e quelação de
ferro.
A FucB apresentou ação citostática uma vez que não ocorreu a
proliferação nem morte de células da aorta de coelho pelo ensaio de MTT;
apresentou caráter antiproliferativo em células de câncer cervical pelo ensaio do
MTT; aumentou a viabilidade celular de fibroblastos em doses baixas em 24
horas; e, exibiu caráter citotóxico dose dependente em células de carcinoma do
fígado humano.
85
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