Embed Size (px)
Citation preview
Universidade Federal Fluminense Departamento de Morfologia
Instituto Biomédico Curso de Graduação em Biomedicina
Marcelo de Oliveira Cesar
Solução fixadora alternativa (livre de aldeídos) a partir de
composto vegetal isolado para preservação do sistema
nervoso.
Niterói 2014
2 II
Marcelo de Oliveira Cesar
Solução fixadora alternativa (livre de aldeídos) a partir de composto vegetal isolado para preservação do sistema nervoso.
Monografia submetida ao curso de
Biomedicina, como requisito final para
obtenção de grau do curso de
Bacharelado em Biomedicina com
especialização em Pesquisa Científica
e ênfase em Morfologia.
Orientador: Prof. Dr. Marcio Antonio Babinski Co-orientador: Prof. Dr. Rafael Cisne de Paula
Niterói 2014
II
3 II
Cesar, Marcelo de Oliveira.
Departamento de Morfologia, Instituto Biomédico, UFF / Marcelo de
Oliveira Cesar, 2014
Orientador: Marcio Antonio Babinski
Co-orientador: Rafael Cisne de Paula
Monografia – Bacharelado em Biomedicina – especialização em Pesquisa
Científica – ênfase em Morfologia
Universidade Federal Fluminense
Referências: f.26
III
4 II
Marcelo de Oliveira Cesar
Solução fixadora alternativa (livre de aldeídos) a partir de composto
vegetal isolado para preservação do sistema nervoso.
Monografia submetida ao curso de Biomedicina, como requisito final para obtenção de grau do curso de Bacharelado em Biomedicina com especialização em Pesquisa Científica e ênfase em Morfologia.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Rafael Cisne de Paula – Tutor e co-orientador Departamento de Morfologia – Universidade Federal Fluminense
_______________________________________________________________ Prof. Dr Carlos Alberto Araújo Chagas
Departamento de Morfologia – universidade Federal Fluminense
_______________________________________________________________Prof. Dr. Marco Aurélio Pereira Sampaio
Departamento de Morfologia – universidade Federal Fluminense
_______________________________________________________________ Prof. Dr. Marcio Antonio Babinski
Departamento de Morfologia – Universidade Federal Fluminense
_______________________________________________________________
Prof. Drª. Carla Lancetta Departamento de Morfologia – Universidade Federal Fluminense
IV
5 II
Agradecimentos
Agradeço em primeiro lugar a Deus. Pois sem Ele nada na minha vida é
possível, só Ele me da força, esperança e motivação para vencer os
obstáculos. A Ele toda honra.
Agradeço a minha família que sempre me apoiou e me deu forças em todo
período da faculdade, sempre me deu a estrutura e o sustento necessário.
Larissa Cesar minha irmã, meu pai Marcelo Guimarães e Liz Débora Cunha
minha mãe.
Agradeço a minha amiga e namorada Jéssyca Fonseca que me deu forças e
me motivou na reta final da faculdade. Agradeço também ao meu cunhado,
amigo e irmão Rogério Pontes que sempre me ajudou e me deu forças.
Agradeço a todos os amigos que tive ao longo da faculdade, em especial
gostaria de agradecer aos meus amigos da UFF Raquel de Souza, amiga que
sempre me motivou e me deu forças. Raul Mixo, Laís Galvão, Rayssa Justo
que sempre me ajudaram e me motivaram como meus amigos de laboratório. A
uma pessoa que me ajudou a ingressar na UFF que foi meu veterano Carlos
Gustavo Garcia.
Agradeço ao meu professor Márcio Antônio Babinski que me recebeu no
laboratório para realizar estágio e sempre me apoiou quando precisei.
Agradeço ao professor Rafael Cisne de Paula como meu tutor e meu orientador
durante todo período de estágio. A este devo honra especial por sempre me
direcionar, me motivar, me ensinar e me liderar com sabedoria. Certamente o
melhor professor e orientador que alguém poderia ter.
Agradeço a Nando Vieira e Mayda Ordonez. Este casal de amigos sempre tive
como conselheiros sempre me apoiaram e me deram forças. Agradeço também
a Heldo Mattos e Rosângela sua esposa que foram meus discipuladores e
conselheiros me motivando e me dando forças quando precisei.
V
6 II
Sumário
1. Resumo.................................................................................................1
2. Introdução.............................................................................................2
2.1. História dos fixadores...............................................................2
2.2. Propriedades dos fixadores.....................................................4
2.3. Fixação tecidual........................................................................5
2.4. Fixadores Convencionais.........................................................7
2.5. Características do sistema nervoso........................................8
2.6. protocolo para fixação do sistema nervoso............................9
2.7. Fixadores utilizados para sistema nervoso............................10
3. Justificativa...........................................................................................12
4. Objetivos...............................................................................................14
5. Relevância do estudo...........................................................................15
6. Material e métodos...............................................................................17
7. Resultados ...........................................................................................18
8. Conclusão.............................................................................................22
9. Cronograma...........................................................................................23
10. Referências Bibliográficas..................................................................24
VI
7 II
Resumo
Devido à necessidade da conservação de tecidos biológicos para o desenvolvimento de pesquisas, assim como para o avanço dos estudos na área da saúde, encontramos a importância de ter a disposição uma substância fixadora que preserve os mesmos. Ao longo da história foram testadas diversas substâncias e soluções utilizando os mais variados protocolos para preservação de tecidos biológicos, entretanto atualmente o formaldeído, mesmo sendo extremamente tóxico, permanece como principal substância para este fim. Portanto, faz-se necessário continuar a busca por uma substância fixadora que preserve tecidos biológicos de forma a ser uma alternativa de baixo custo ao formaldeído e que seja pouco tóxica. Neste estudo propomos um fixador alternativo de baixo custo com base alcoólica contendo um composto isolado de origem vegetal XXX que seja eficaz na preservação de tecido nervoso. Esta solução proposta foi comparada qualitativamente e quantitativamente com os principais fixadores utilizados para estes tecidos (formaldeído 20% e álcool 70%). Nossos resultados apontam que a nova solução fixadora proposta mostrou ser uma alternativa eficaz na fixação para o sistema nervoso, além de ser uma substância muito pouco tóxica, possui odor que não é irritante e de baixo custo.
Palavras-chaves: fixador alternativo; formaldeído; matriz extracelular;
substância fixadora; tecido nervoso.
1
8 II
Introdução
Existe um processo natural de transformação da matéria orgânica, que
chamamos de decomposição. Entretanto, se faz necessária a preservação dos
tecidos, ou mesmo, a preservação de peças cadavéricas com o objetivo de
realizar estudos com fins acadêmicos, científicos ou investigativos. Esta
preservação pode ocorrer do modo natural, como por exemplo, tecidos
preservados com extremo calor ou extremo frio.
Historicamente, povos antigos motivados pela fé acreditavam que
voltariam a viver nestes corpos, sendo então necessário conservá-los. (Mayor,
2000; Saeed et al, 2001; Itopa et al, 2011). Outros pretendiam entender a
disposição interna dos órgãos para aprimorarem a caça (Von Hagens, 2009),
ou ainda para tratarem enfermidades. (Von Staden, 1992; Mayor, 2000;
Osuagwu, 2006; von Hagens, 2009). O homem, portanto, sempre buscou
ferramentas que permitissem a conservação dos corpos ou dos tecidos deste
após a morte. A sociedade moderna busca essa conservação dos tecidos a fim
de estudar os organismos de maneira macroscópica e principalmente
microscopicamente. Para isso, são utilizadas técnicas diversas que nos
permitam tomar conhecimento da integridade de um tecido após ser submetido
ao processo de fixação, como: histoquímica, imunohistoquímica, biologia
molecular, etc (Saeed et al, 2001; Buesa et al, 2008). Diversas técnicas foram
desenvolvidas, porém as mesmas se adaptam melhor ou pior às realidades
atuais (Von Hagens, 2009). Diversas substâncias fixadoras são utilizadas
nestes estudos investigativos modernos, sendo a principal delas o formaldeído.
Esta substância, apesar de preservar com êxito os tecidos, é extremamente
toxica, e por isso, surge a necessidade pela busca de soluções alternativas.
História dos fixadores
A técnica mais antiga de preservação de um corpo é a mumificação, que
é uma forma de desidratação precedida por um tratamento químico com
substâncias das quais não se tem o conhecimento exato. Este método foi
usado por diversos povos antigos motivados principalmente pela fé. Temos
para este exemplo principalmente os Egípcios, que utilizaram diversos tipos de
2
9 II
embalsamento. Além deles outros povos também praticavam a mumificação.
Os babilônios conservavam os cadáveres em mel de abelha ou cera, eles
foram o primeiro povo a conservar animais com finalidades científicas (Mayor,
2000; Saeed et al, 2001; von Hagens, 2009). Além das múmias preparadas
pelo homem, houveram também múmias formadas naturalmente, sem
nenhuma preparação ou interferência do homem, a partir de condições
climáticas ou ambientais dos locais onde estas ficaram depositadas. Temos
como exemplo o calor e ventos constantes como em desertos da África, que
favorecem rápida desidratação dos corpos, ou mesmo o frio extremo como nas
regiões polares podendo atuar como elementos preservadores, mantendo os
corpos íntegros por longos períodos (Mayor, 2000; Von Hagens, 2009; Itopa et
al, 2011). Além destas podemos citar o frio das regiões polares, regiões ricas
em sal e certas substâncias químicas encontradas em pântanos,
principalmente no Norte da Europa (Hildebrand, 1968; Mayor, 2000; Rodrigues,
2010; Itopa et al, 2011).
O maior avanço na conservação de cadáveres ocorreu em 1868 com o
uso de formaldeído em técnicas anatômicas e microscópicas (Hildebrand,
1968; Fox et al.; 1985; Sompuram et al, 2004). Esta substância foi descoberta
no ano de 1859 pelo russo Butlerov, porém suas aplicações médicas surgiram
a partir de 1891 por Ferdinand Blum, através das descobertas das
propriedades antisséptica e antimicrobiana. Uma outra propriedade surgiu
caracterizada acidentalmente, quando Blum observou que sua pele dos dedos
apresentavam rigidez após o contato com a substância do formaldeído, sendo
esta maior ou igual a produzida pelo álcool (Fox et al., 1985). Blum preparou
alguns tecidos de rato e fixou com formaldeído a fim de analisar a capacidade
de fixação histológica e o uso de colorações histoquímicas nestes tecidos. Os
resultados apresentaram excelente capacidade fixadora da substância, sendo
estas propriedades confirmadas em seguida pelo famoso histologista de
Frankfurt, Weigert (Fox et al., 1985).
Nos dias atuais, a conservação de peças cadavéricas visa o estudo do
corpo humano, tanto para se aplicar a medicina, a pesquisa, assim como para
o aprendizado da anatomia, aplicando este conhecimento nas diversas áreas
da saúde. Além disso, temos a necessidade de realizar estudos histológicos,
mostrando a integridade de um tecido aplicando isso em estudos acadêmicos e
3
10 II
científicos para diversas disciplinas, ou mesmo, em hospitais quando são
realizados exames investigativos para descobrir possíveis patologias em um
determinado tecido. Apesar de toda tecnologia disponível e todo conhecimento
já adquirido, temos dificuldades de conservar peças cadavéricas e fragmentos
de tecidos com substâncias não tóxicas ou que preservem os tecidos nas
condições ideais para estudo, que seria o mais semelhante possível ao
organismo vivo. Portanto, temos necessidade de continuar a pesquisa por
novos agentes fixadores que não apresentem propriedades tóxicas e nos
permita uma melhor qualidade para estudos, conservando o tecido o mais
próximo possível do organismo vivo.
Propriedades dos fixadores
Fixadores são substâncias químicas que mantêm a integridade tecidual
diante da decomposição natural. Estas substâncias agem evitando alterações
na constituição celular, fixando proteínas proteolíticas, evitando a destruição do
tecido intracelular e extracelular (Tolosa et al, 2003). No que diz respeito a
fixação de componentes da matriz extracelular, devemos considerar
principalmente o colágeno e a elastina. Esta fixação consiste em formação de
ligações cruzadas que mantém a estrutura de colágeno mesmo que ligações
no tecido reticulado se rompam (Bowes & Carter, 1965), como mostra a figura
1. Alguns fatores, quando em condições favoráveis, aperfeiçoam esta função,
tais como: viscosidade, temperatura, volume, pH e osmolaridade da substância
(Fox et al, 1985; Tolosa et al, 2003 Zeng et al, 2013).
4
11 II
Figura 1 - Imagem esquemática mostrando a fixação de colágeno a partir de ligações cruzadas no tecido (Adaptado de
Bowes & Cater, 1965).
A viscosidade do fixador esta diretamente relacionada com a velocidade
de penetração no tecido, assim como é proporcional a espessura do tecido. A
temperatura aumenta a velocidade de fixação, principalmente de fixadores
mais viscosos, ampliando a velocidade de penetração do fixador no tecido.
Para adequada fixação por imersão, o volume do fixador deve ser 20 – 30
vezes maior que o do tecido (Tolosa et al, 2003; Buesa, 2008; Zeng et al,
2013).
Em tecidos preparados para anatomia, tem sido utilizada o formaldeído
tamponado (3,7%) como padrão há décadas. Em soluções fixadas para
microscopia se destacam além do formaldeído substâncias como álcool e
gluteraldeído. (Buesa, 2008).
Fixação tecidual
Fixação é o processo onde um tecido é submetido a uma ou mais
substâncias fixadoras durante a decomposição natural para que ocorra a
preservação deste. A fixação de peças cadavéricas ou de fragmentos de
tecidos pode ser utilizada para: fins acadêmicos, sendo usada em aulas
práticas de disciplinas ligadas a área morfológica da saúde (disciplinas como
anatomia, embriologia e histologia) ou utilizada no aperfeiçoamento e
aprendizado de profissionais da área da saúde nas disciplinas morfológicas
5
12 II
principalmente no que diz respeito a cursos como: medicina, enfermagem,
veterinária, etc; fins científicos, sendo utilizada do desenvolvimento das
disciplinas de morfologia ou na pesquisa onde são pesquisados novos
conhecimento a respeito de estruturas histológicas ou anatômicas; fins
investigativos, como por exemplo, em exames onde a histologia é analisada
para analisar e diagnosticar patologias em um determinado indivíduo
(normalmente podem ser associados a exames moleculares que nos fornecem
diagnósticos mais precisos).
A fixação ocorre quando a solução fixadora penetra no tecido,
conservando as estruturas intra e extracelulares deste tecido. A preservação
intracelular ocorre quando o fixador penetra bem na célula, de modo que, o
tamanho da molécula fixadora interfere neste processo (moléculas maiores tem
dificuldade de penetrar nas células e nos núcleos destas). Um dos aspectos
que influenciam na qualidade da fixação é o pH da solução, que deve se
encontrar entre 7.2 e 7.5. para que a solução penetre melhor no tecido (Schultz
and Karlsson,1965). Outro aspecto importante na preservação de tecidos é a
temperatura. A temperatura em que a substância fixadora funciona influencia
no processo de fixação, mas isto depende do fixador. O tecido não fixado sofre
naturalmente o processo de autólise. Este pode ser inibido por fixadores de
baixa temperatura por refrigeração. Em contrapartida fixadores de alta
temperatura induzem vasodilatação, permitindo que melhore a vasodilatação
durante a perfusão do animal. Deste modo os fixadores penetram melhor nos
tecidos. Estudos de neurotoxicidade envolvendo perfusão recomendam
fixadores de temperatura ambiente (Fox et al, 1985; Fix and Garman, 2000).
Ainda outro aspecto importante a ser considerado para uma fixação
ótima é a osmolaridade da solução fixadora. Soluções fixadoras com alta
osmolaridade (hipertonicidade) podem provocar considerável encolhimento
(“shrinkage”) do tecido. Entretanto soluções fixadoras que possuam baixa
osmolaridade não penetram bem no tecido, logo a perfusão tecidual com esta
solução é insuficiente. Recomenda-se que sejam utilizados fixadores de média
osmolaridade entre 400-600 mOsmol (Fix and Garman, 2000).
Um fator importante que influencia na fixação dos tecidos é a maneira
como este fixador é introduzido no tecido. Existem soluções fixadoras que são
inseridas no tecido por perfusão (injetado via sistema vascular pelo ventrículo
6
13 II
esquerdo), entretanto alguns fixadores funcionam bem a partir da imersão do
tecido, ou do cadáver ao qual pertence o tecido, nesta solução. Indica-se que
durante a perfusão, a substância fixadora seja injetada com uma pressão de
120-150 mm Hg para um rato. (Fix and Garman, 2000).
Fixadores Convencionais
Entre os principais fixadores de baixo custo utilizados para histologia de
rotina atualmente, encontramos o formaldeído e o álcool 70%, sendo este
segundo só utilizado para fixação de pequenos fragmentos de tecido. A
escolha pela substância fixadora a ser utilizada se dá por aspectos como:
toxicidade (principalmente devido a preocupação com os profissionais e
estudantes que manipulam a solução), o custo e a eficácia para o fim
pretendido.
Formaldeído: esta substância caracteriza-se por ser um gás incolor com
forte odor irritante, sendo solúvel em água e possui alta reatividade química
(Sompuram et al, 2004; Moelans et al, 2011). Quando dissolvido em água
torna-se hidratado formando uma substância chamada metileno glicol (Fox et
al, 1985; Kiernan, 2000). Quando tecidos são submersos em formaldeído, eles
são rapidamente penetrados por metileno glicol sendo sua penetração mais
rápida em relação ao formaldeído carbonil. (Kiernan, 2000)
O formaldeído é um electrófilo reativo, reagindo com vários grupos de
macromoléculas biológicas a partir de ligações cruzadas, tais como: proteínas,
glicoproteínas e ácidos nucléicos. Este mecanismo altera consideravelmente as
características dos tecidos. Devido ao tamanho da molécula o formaldeído
penetra rapidamente no tecido, porém as pontes de metileno se formam
lentamente, fazendo com que uma adequada fixação demore dias, além disso
as pontes de metileno podem ser reversíveis (Moelans et al, 2011).
O formaldeído representa risco para a saúde humana principalmente em
locais de exposições excessivas como hospitais e universidades ou instituições
de pesquisa. Esta substância é classificada como carcinogênica para humanos
(Grupo 1) pela Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer (Iarc, 2006).
A Organização Mundial de Saúde (WHO, 2010) recomenda um valor de
qualidade do ar de no máximo 0,1 mg/m³ em ambientes internos, entretanto o
limite de exposição adotado pela legislação brasileira (Norma Brasileira NR-15
7
14 II
da ANVISA) é de 2,3 mg/m³ (valor muito superior aos limites recomendados
pela OMS). Este limite é significativamente maior do que os limites adotados
em outros lugares do mundo.
Histologicamente, tecidos fixados com formaldeído são preservados. No
entanto, este fixador não penetra bem no núcleo impossibilitando a realização
de técnicas de biologia molecular (como extração de RNA e DNA). O tecido
nervoso, devido a características do tecido, não fica bem preservado com este
fixador sendo necessária a utilização do dobro da concentração na diluição do
fixador, mesmo assim não apresenta com esta concentração preservação
eficaz.
Álcool: este composto é utilizado principalmente na conservação de
pequenos fragmentos de tecido tendo nestes uma rápida penetração e fixação
(Tolosa et al, 2003). O etanol não preserva tecidos por ligação cruzada de
proteínas, portanto a morfologia produzida por estes fixadores não é idêntica à
formalina (Cox et al, 2006).
Entre as vantagens da utilização de fixadores a base de álcool encontramos: a
fixação rápida, eliminação de vapores cancerígenos, intensifica a coloração no
tecido e facilita o uso da amostra em análises imunohistoquímicas (Buesa,
2008; Moelans et al, 2011). Entretanto esta substância pode causar
encolhimento do tecido, o endurecimento, a deposição de artefatos em
amostras de sangue, causa lise parcial ou total de eritrócitos, além de
aumentar a inflamabilidade do ambiente (Sompuram et al, 2004; Moelans et al,
2011). Este fixador não é utilizado para macroscopia, apenas preserva
pequenos fragmentos de tecido. Tecidos fixados com álcool 70% apresentam
ótima fixação, com boa visualização das estruturas. Entretanto podemos
identificar nas imagens histológicas a presença de vacúolos ao redor dos
núcleos como sinal de retração tecidual devido a desidratação do tecido
Características do sistema nervoso
O tecido nervoso é um tecido diferenciado, pois é rico em água e lipídeos.
Notadamente este tecido se deteriora rapidamente, sendo difícil encontrar bons
fixadores para este tecido. Encontramos no tecido nervoso duas regiões, sendo
uma a substância cinzenta que é uma região rica em corpos de neurônios,
dentritos porções iniciais não mielinizadas de axônios e células da glia. Esta
8
15 II
região é onde ocorrem principalmente as sinapses do sistema nervoso central
e está contida principalmente na superfície do sistema nervoso central. A outra
região é a substância branca, que é encontrada nas partes mais internas do
sistema nervoso central. Esta ultima é predominada por axônios mielinizados (a
mielina é a substância lipídica que proporciona a diferença de cor entre as
regiões do sistema nervoso, sendo responsável por aumentar a velocidade da
condução do impulso nervoso gerado pelas sinapses dos neurônios). A
substância branca também contem alguns grupos de neurônios e células da
glia.
Outra característica do sistema nervoso é a presença de barreiras que
protegem este sistema. A barreira mais importante a ser citada quando se trata
de fixação de tecidos nervosos é a barreira hematoencefálica. A barreira
hematoencefálica é uma barreira funcional formada por endotélio entre o
sistema nervoso e o sangue. Esta tem a função de impedir que agentes
químicos ou toxinas entrem no sistema nervoso e ao mesmo tempo permite a
função metabólica normal do sangue. A isto se deve o fato da maioria dos
fixadores serem introduzidos de modo mais eficiente nos tecidos nervosos
através da perfusão (Junqueira, 2008).
Protocolo para fixação do sistema nervoso
A forma mais comum de se fixar o sistema nervoso é por direta imersão
do órgão ou tecido na solução fixadora. Entretanto, o modo mais eficiente de é
através da perfusão via sistema vascular (Fix and Garman, 2000). Isto se deve
devido ao rápido ressecamento e deterioração que sofre este tecido após a
morte, fator este que se deve as propriedades do tecido, que é rico em água e
lipídeos (Carmmermeyer J, 1968).
É importante que o tecido nervoso ao ficar bem fixado mostre em sua
histologia neurônios vistos com clareza (por serem as principais células do
sistema nervoso central). Portanto, deve ser possível identificar bem suas
principais estruturas como os axônios, os corpos dos neurônios e os núcleos.
Na histologia do sistema nervoso central, também esperamos encontrar vasos
dilatados. Esta característica indica que vasos e capilares foram igualmente
perfundidos ao longo do tecido mostrando a fixação homogênea através deste.
Outro fator importante a ser notado na histologia do tecido nervoso é a falta de
9
16 II
espaços de retração. Estes espaços são vacúolos em torno dos núcleos das
células que mostram que houve retração do tecido por desidratação. Um tecido
bem fixado não deveria apresentar este sinal de desidratação. Além disso, os
fascículos nervosos e as camadas de mielina deveriam se apresentar lisas e
sem fissuras. Esta característica vista na histologia do tecido nervoso central
mostra a preservação destas estruturas (Fix and Garman, 2000).
Existem alguns fatores importantes a serem levados em consideração
para que um fixador possa atingir seu perfil “ótimo” na fixação de um tecido.
Como por exemplo, o pH da substância que deve ser em torno de 7.2 a 7.5,
pois um pH ácido ou básico poderiam destruir o tecido. Alguns fatores inclusive
deveriam ser próprios para cada tecido. Assim como a osmolaridade, pois
recomenda-se que para cada tecido deve apresentar uma osmolaridade
específica para uma melhor fixação. Isto indica que, para cada tipo de tecido
deveria existir um fixador diferente que proporcionasse uma ótima fixação. No
tecido nervoso, recomenda-se uma osmolaridade entre 400-600 mOsmol
(hipertonicidade média). Pois uma hipertonicidade (acima de 1000 mOsmol)
poderia causar retração do tecido e uma baixa tonicidade (abaixo de 300
mOsmol) poderia causar fixação pobre (Fix and Garman, 2000).
Fixadores utilizados para sistema nervoso
Este tecido apresenta dificuldade para a penetração da solução fixadora no
tecido. O tecido cerebral é normalmente fixado com formaldeído a 20%, mas
este fixador é tóxico e além de não penetrar tão bem neste tecido, não fixa tão
bem devido ao excesso de água na região encefálica. Outro fixador que é
usado neste tecido é o etanol. Este é um bom fixador para pequenos
fragmentos, e facilita a utilização de histoquímica, mas não é tão utilizado, pois
possui muitas contraindicações, principalmente por provocar um endurecimento
do tecido e contração do mesmo.
Existem ainda alguns fixadores utilizados para se trabalhar com material
genético de tecido nervoso, como por exemplo o Methacarn (fixador composto
por metanol, clorofórmio e ácido acético) e a acetona. Ambos os fixadores são
protocolados para se trabalhar com baixas temperaturas (-80ºC). Este tipo de
fixadores que funciona com baixas temperaturas além de serem de caro
manuseio, não são eficazes para se trabalhar com histologia. Além disso,
10
17 II
trabalhar com baixas temperaturas induziriam congelamento do tecido. Este
fator causaria danos no tecido nervoso pela formação de cristais de gelo, já
que este tecido é rico em água (Akani H, 2013).
Deste modo continuamos a busca por um fixador para o sistema nervoso
que seja eficaz para as propriedades do tecido. Apresentando portanto, uma
boa penetração no tecido e permitindo que sejam nitidamente visualizadas as
estruturas teciduais, como por exemplo os axônios dos neurônios.
11
18 II
Justificativa
A conservação de peças cadavéricas visa o estudo de tecidos biológicos
com finalidades acadêmicas, cientificas e investigativas. Esta conservação dos
tecidos é realizada a partir de elementos que atuem inibindo a destruição dos
componentes teciduais (intracelulares e extracelulares), e seus principais
agentes são físicos (ex: calor) e químicos (ex: aldeídos). Apesar de toda
tecnologia disponível e todo conhecimento já adquirido, temos dificuldades de
conservar peças cadavéricas e fragmentos de tecidos com substâncias não
tóxicas ou que preservem estes tecidos nas condições ideais para estudo, que
seria o mais semelhante possível ao organismo vivo. Além disso, um bom
fixador precisa permitir que pequenos fragmentos de tecidos sejam utilizados
em diferentes técnicas de estudo, especialmente técnicas atuais de
histopatologia e biologia molecular.
O principal fixador utilizado no mundo é o formaldeído. Esta substância
quando diluída em água e tamponada, gera a formalina. Uma importante
característica do processo de fixação com esta solução fixadora é que devido
ao tamanho pequeno da molécula, o formaldeído penetra rapidamente no
tecido. Entretanto, a formação das pontes de metileno (ligações cruzadas que
estabilizam a matriz extracelular) ocorre lentamente e uma adequada fixação
pode levar dias, além disso, estas pontes podem ser reversíveis.
Este composto como fixador apresenta algumas desvantagens, como a
formação espontânea de acido fórmico quando este é exposto a oxigênio
atmosférico, a luminosidade e ao aumento de temperatura. O ácido fórmico é
responsável pela destruição tecidual, contrastando com a formalina que
preserva o tecido. Porém, seu principal fator negativo é a sua toxicidade, sendo
esta substancia classificada como carcinogênica para humanos pela Agência
Internacional para Pesquisa sobre Câncer. Além disso, o formaldeído é
extremamente irritante para as vias aéreas, para os olhos e para a pele. Há
também alguns estudos sobre os efeitos genotóxicos em trabalhadores
expostos a esta substancia. Sua alta solubilidade em água provoca uma rápida
absorção pelo trato respiratório e gastrointestinal, que é conhecido por causar
tumores nasais em roedores. Além disso, fragmentos de tecido expostos a
formalina não permitem estudos de biologia molecular com precisão, e cobrem
12
19 II
epítopos proteicos (o que dificulta e aumenta o processo de
imunohistoquímica). Apesar de suas características tóxicas e a diminuição dos
tipos de técnicas a que um fragmento fixado com formaldeído pode ser
aplicado, atualmente esta substancia continua sendo o principal meio de
fixação de peças cadavéricas e fragmentos de tecidos para histologia. Alguns
autores atribuem a este fenômeno o nome de “dogma do formol”.
Este fato torna-se agravado quando tecidos de sistema nervoso
precisam ser fixados nesta substancia, pois o formaldeído não é um bom
fixador para sistema nervoso, principalmente devido às características do
próprio tecido que possui altas concentrações de lipídeo e água, além da
dificuldade de penetração de soluções neste meio. Além deste fator, este
tecido possui osmolaridade impar quando comparado aos demais. Portanto, há
de se valorizar a importância de uma solução especial para este meio, com
osmolaridade e características especificas. Usualmente o formaldeído é
utilizado neste meio na concentração de 20% (dobro da concentração
normalmente utilizada para outros tecidos), a fim de potencializar o poder de
penetração da solução fixadora no tecido, sendo muito elevados os efeitos
tóxicos da substancia nesta concentração. Esta concentração foi estabelecida
ainda no sec. XIX, quando pouco se atribua importância aos efeitos tóxicos e
destrutivos dos compostos. Este “dogma” segue até os dias atuais.
Surge desta forma, a necessidade por novos agentes ou soluções
fixadoras capazes de atuar neste tipo especial de tecido, com baixo custo,
baixa toxicidade e que permitam uma boa preservação aliado a possibilidade
de desenvolvimento de explorações técnicas como: histoquímica,
imunohistoquímica e biologia molecular.
13
20 II
Objetivos
1- Analisar de nova solução fixadora alternativa de base alcoólica contendo um
composto vegetal isolado para preservação de tecidos nervosos do sistema
nervoso.
2- Analisar uma solução fixadora de teor atóxico, baixo custo e melhor eficácia
em comparação ao formaldeído 20% e ao álcool 70% (fixadores presentes
comumente utilizados para fixação de tecido nervoso).
3- Analisar a capacidade de aplicação de técnica de coloração histológica em
H&E para analise qualitativa e quantitativa em tecidos preservados com a
solução fixadora alternativa de base alcoólica a partir de composto vegetal.
14
21 II
Relevância do estudo
Temos necessidade de continuar a pesquisa por novos agentes
fixadores que não apresentem propriedades tóxicas e nos permita uma melhor
qualidade para estudos, conservando o tecido o mais próximo possível do
organismo vivo. Neste trabalho propomos uma nova solução fixadora com base
alcoólica contendo um composto XXX, visando analisar a capacidade da
mesma na preservação de tecidos do sistema nervoso, assim como,
comparando com demais meios de preservação utilizados. Esta nova
substância fixadora tem como principal componente um composto de origem
vegetal isolado, o XXX.
Ao longo da história encontramos relatos da utilização deste composto
XXX como participantes do processo de mumificação em alguns povos antigos,
mostrando que este composto possui uma propriedade de conservação Esta
característica é atribuída a algumas propriedades da molécula como a
capacidade deste composto de precipitar proteínas. Além disso, este composto
tem a capacidade de atenuar a ação de proteases na digestão de elastina e
colágeno, componentes que fazem parte da estrutura da matriz extracelular.
Este composto fornece estabilidade às fibras elásticas, isto devido a sua
afinidade pelas regiões hidrofóbicas se ligando a regiões de clivagem e,
portanto impedindo competitivamente a ligação destas proteases.
Esta substância possivelmente possui maior facilidade de penetrar nos
tecidos em relação ao formaldeído, e favorece a manutenção da matriz
extracelular. Além de ser um fixador com potencial de preservação maior neste
tecido, ele pode ser adquirido por baixo custo, sendo ainda atóxico para os
estudantes, profissionais ou pacientes, que entrem em contato com esta
substância ou com tecidos tratados com a mesma.
Material e métodos
As pesquisas foram realizadas a partir do uso de uma nova solução fixadora
na preservação de tecido nervoso comparando com as principais soluções
fixadoras utilizadas convencionalmente (formaldeído 20% e álcool 70%). A
nova solução proposta e soluções de coloração histológica foram obtidas
15
22 II
através da Sigma-Aldrich Co. A solução de formaldeído 20% tamponado foi
obtido através da Merck-Millipore Co.
Aquisição dos tecidos e eutanásia
O estudo designado e protocolo de experimentos foram aprovados por um
comitê de ética e pesquisa animal da Escola de Medicina Veterinária da
Universidade de São Paulo (número de protocolo 2851/2012, que tem como
base para análise o Guia para cuidados e uso de animais de laboratório). O
experimento foi desenvolvido de acordo com as diretrizes do Colégio Brasileiro
para Experimentação Animal. Foram utilizados ratos Wistar (n=5) obtidos a
partir do Biotério Central do Departamento de Patologia da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da USP. Estes tecidos foram utilizados para
diversos projetos do Laboratório de Síntese e Analise de Biomateriais do
Departamento de Morfologia da UFF, incluídos nesta linha de pesquisa. Estes
animais foram sacrificados com tiopental, sendo as doses utilizadas
recomendadas para o sacrifício de acordo com o peso do animal (acima de 40
mg/Kg).
Protocolo de processamento
Imediatamente depois do sacrifício animal, encéfalos foram removidos e
armazenados por 72h em temperatura ambiente nas três diferentes soluções
(formaldeído 20%, álcool 70% e solução XXX). Foi realizada a clivagem dos
tecidos, onde foram feitos cortes coronais nos encéfalos.
Preparação histológica
Estes tecidos foram desidratados com banhos crescentes em álcool (70%,
80%, 90% e absoluto), novamente hidratados com dois banhos de Xilol e
embebidos em banhos de parafina, seguindo o procedimento padrão para
inclusão do material. Foram realizados cortes com 5 μm de espessura
utilizando um micrótomo (MRP-09 Lupetec, São Carlos, Brazil). Estes cortes
foram capturados em “banho maria” a 37ºC com lâminas histológicas. Estas
lâminas foram posteriormente submetidas à coloração histológica com
16
23 II
Hematoxilina e Eosina (H&E) conforme descrita pelo fabricante (Sigma-Aldrich,
St. Louis, USA), para analisar a integridade do tecido.
Análise qualitativa das imagens
Aspectos histológicos dos tecidos corados por Hematoxilina & Eosina foram
utilizados para analisar a qualidade morfológica das imagens, tendo como
parâmetros a identificação do núcleo celular, citoplasma e matriz extracelular
(método modificado de Cox et al., 2006).
Randomização das amostras
Foram clivados e analisados cortes de tecido: cortes coronais dos encéfalos
de cinco animais para cada fixador. Foi realizada a técnica de coloração em
H&E. Nesta foram corados três secções de cada encéfalo Em cada lâmina
corada, dez campos (20x) foram selecionados aleatoriamente e, em seguida,
avaliadas quanto às características específicas.
Aquisição das imagens
Foram analisados uma centelha de áreas testes para cada tecido. Estas
imagens foram digitalizadas por uma câmera de vídeo Sony CCD (DXC 151-A
modelo) juntamente com um microscópio óptico Olympus BX52 (Olympus
America Inc, New York, EUA).
Criação de imagem binárias
Cores foram selecionadas e convertidas em preto e branco (formando
imagens binárias em 2D), utilizando software ImageJ (versão 1.43u – Research
Services Branch, Instituto Nacional de Saúde Mental, Bethesda, Maryland),
para observar parâmetros específicos para a integridade do tecido (Fig. 2).
Para a contagem de núcleos foi utilizada a pigmentação por Hematoxilina. Para
medir a fração de área foi utilizada a eosina subtraindo a área medida em torno
das células.
Análise de partículas para quantificação
17
24 II
Todos os parâmetros específicos foram contados para determinar o número
médio por imagem, e a média de todas as imagens de todos os tecidos foram
utilizados para determinar os valores médios e erro padrão (SEM). A técnica foi
realizada utilizando um contador automático de células e medindo a fração de
área dos tecidos (em relação a área total da imagem) com o uso do software
ImageJ.
Análise estatística
Estes parâmetros nos permitiram realizar uma análise estatística do tecido
estudado. A partir destes dados que foram gerados (contagem de núcleos e
fração de área) pelo programa foi feita uma análise estatística através do
software “Graphpad Prism 5.01”. Estes foram analisados estatisticamente no
pré-teste de Bartlett’s e no teste estatístico One-way Analysis of Variance
(ANOVA), mostrando significância estatística positiva do experimento, com um
valor de p < 0.0001.
Figura 2 - Imagens de tecido nervoso (20x), obtido após coloração em H&E, mostrando a imagem binária (gerada a
partir do programa ImageJ 1.46R) utilizada para gerar dados a partir das imagens. Esta figura demonstra em “A” uma
imagem original do tecido nervoso fixado na solução XXX. Em “B”, uma imagem binária deste mesmo tecido usada
para a quantificação de núcleos e em “C” foi feita uma imagem binária para quantificar a fração de área.
Resultados
Análise histoquantitativa
Contagem de núcleos
Amostras foram fixadas em uma solução fixadora com base alcoólica
contendo um composto XXX de origem vegetal e comparadas com as
A B C
Imagem original Contagem de núcleos Fração de área
18
25 II
principais substâncias fixadoras de baixo custo e fácil acesso: álcool (70%) e
formaldeído (20%).
Na contagem celular, foi observada uma qualidade (por quantificação)
superior para os tecidos fixados com a nova solução fixadora proposta neste
estudo, em comparação aos fixadores comparados (XXX = 131,3 ± 4,022;
álcool (70%) = 91,34 ± 1,950; formaldeído (20%) = 75,09 ± 2,338). Estes foram
analisados estatisticamente no pré-teste de Bartlett’s e no teste estatístico One-
way Analysis of Variance (ANOVA), mostrando significância estatística positiva
do experimento, com um valor de p < 0.0001.
Além disso, na análise entre os grupos de tratamento utilizamos um pós-
teste estatístico de múltipla comparação de Newman-Keuls. Neste teste
podemos observar diferença estatística entre os três grupos de tratamento
(indicado na fig.3 pelas letras “a”, “b” e “c”). O grupo referente à nova solução
fixadora proposta (XXX) mostrou uma maior contagem de núcleos. Deste
modo, podemos observar uma melhor preservação tecidual nos tecidos fixados
pela nova solução proposta.
Figura 3 – Resultado da quantificação de um experimento onde foi comparada a preservação da substância proposta
“XXX” com os fixadores convencionais. O gráfico mostra a contagem de células de cada grupo, este dado indica a
quantidade de células resistentes em cada tecido tratado pelos diferentes fixadores (Formol 20% e Álcool 70%). As
letras “a” “b” e “c” mostram que cada grupo é diferente estatisticamente do outro com um valor de p < 0,0001.
Fração de área
Em outra etapa foi quantificada a fração de área que revela a distorção
volumétrica causada pelo fixador da quantificação da área celular. Para esta
etapa é realizada construindo com o programa “ImageJ 1.46R” a imagem
binária de quantificação, sendo possível fazer a análise a partir deste programa
Brain tissue
Formol
Alc
ohol
XXX
0
50
100
150Formol
Alcohol
XXXp< 0.0001
p< 0.0001
ab
c
Co
un
t cell (
mean
±S
EM
)
19
26 II
da fração de área preservada no tecido (%). Na quantificação de fração de área
deste experimento obtivemos resultado positivo para o pré-teste de Bartlett’s
indicando a realização do teste estatístico One-way Analysis of Variance
(ANOVA).
Na análise entre os grupos no pós-teste de múltipla comparação de
Newman-Keuls, a nova substância fixadora de origem vegetal proposta foi
superior na preservação tecidual em comparação aos outros dois fixadores. O
álcool foi superior estatisticamente ao formaldeído (XXX = 93,62% ± 0,2787;
álcool (70%) = 90,97% ± 0,2900; formaldeído (20%) = 87,44% ± 0,3930). O
teste ANOVA mostrou diferença estatística entre as três soluções (indicado na
fig.4 pelas letras “a” “b” e “c”) e apresentou um p < 0,0001.
Figura 4 - Análise histoquantitativa que mostra a fração de área preservada nos tecidos tratados por cada substância
fixadora. A substância proposta “XXX” é comparada aos fixadores convencionais (formaldeído (20%) e álcool (70%)).
As letras “a” “b” e “c” mostram que cada grupo é diferente estatisticamente do outro com um p < 0,0001.
Análise histoqualitativa
Foi realizada uma análise qualitativa das imagens coradas em H&E e
capturadas em microscopia óptica. A figura 5 mostra imagens tiradas em uma
lente objetiva com aumento de 20X. Estas imagens nos permitem ter uma
noção geral da integridade do tecido. Foi feita a comparação entre as imagens
dos tecidos de encéfalo fixados com a nova solução proposta (XXX),
comparando com imagens de tecidos fixados com as soluções utilizadas
convencionalmente (formaldeído 20% e álcool 70%). Nesta figura podemos ver
Formol
Alc
ohol
XXX
0
20
40
60
80
100Formol
Alcohol
XXX
a b cp< 0.0001
Brain tissue
p< 0.0001
Are
a (
% ±
SE
M)
20
27 II
uma maior quantidade de células nas imagens “B” e “C” (imagens de tecidos
fixados em álcool 70% e a solução alternativa XXX). As imagens de tecidos
fixados em formaldeído 20% (imagem “A” da fig. 5) mostram um número
reduzido de núcleos marcados na coloração em H&E, mostrando que grande
parte das células deste tecido não foram preservadas. Além disso, os tecidos
fixados em álcool 70% mostram vacúolos em torno dos núcleos celulares,
indicando que houve uma retração do tecido. Este estudo revela, a partir deste
resultado, que os tecidos fixados em álcool 70% sofrem uma desidratação.
Figura 5 - Imagens histológicas de tecido nervoso (20X) preparado com a coloração H&E. No experimento
previamente realizado nota-se uma maior quantidade de núcleos de células em C = substância proposta do que nas
substâncias fixadoras existentes no mercado A= formol 20% e B=álcool 70%.
A figura 6 mostra uma análise qualitativa realizada a partir de imagens
histológicas obtidas em H&E com objetiva de 40x. Nesta imagem, onde é
realizada a comparação entre os tecidos fixados nos fixadores utilizados no
experimento (formol 20%, álcool 70% e a solução fixadora alternativa).
Podemos observar que as estruturas dos neurônios se encontram melhor
definidas nos tecidos fixados pelo fixador álcool 70%. Entretanto foram bem
visualizadas nos tecidos fixados pelo fixador alternativo sendo melhores
visualizadas em relação à visualização de estruturas do tecido nervoso em
tecidos fixados pelo formol 20%.
Notamos que nas imagens “B” e “C” as estruturas como axônios e corpo
de neurônio estão mais bem definidas enquanto na imagem “A” essas
estruturas não se encontram tão bem definidas. Portanto, esta análise mostra
que o tecido fixado pela solução proposta, se encontra mais preservado que o
tecido fixado pelo formol 20% e quase tão bom quanto o tecido fixado pelo
álcool 70%.
21
28 II
Figura 6 - Análise histoqualitativa realizadas em tecido nervoso (40x), obtidas por coloração em H&E. As setas em
vermelho mostram axônios, as setas em azul mostram corpos de neurônios e as setas em verde mostram núcleos de
neurônios. A figura A mostra uma imagem de encéfalo fixado em formol 20%; B mostra uma imagem de encéfalo fixado
em álcool 70%; C uma imagem de tecido do encéfalo fixado com a nova solução proposta “XXX”.
Conclusão
Podemos concluir que a nova solução fixadora proposta com base
alcoólica e tendo um componente vegetal isolado “XXX” revela-se como uma
alternativa as principais substâncias fixadoras utilizadas convencionalmente. A
nova solução proposta também se mostrou muito pouco tóxica devido a sua
base alcoólica e a presença do principal composto da solução ser de origem
vegetal. É eficaz para preservação tecidual do sistema nervoso (permitindo a
realização de estudos histológicos para fins investigativos, científicos e
acadêmicos) e de baixo custo. A nova solução fixadora proposta nos permitiu
com eficácia a aplicação de técnicas histológicas em coloração por H&E para
coloração do tecido nervoso.
A B C
22
29 II
Cronograma
Ano 2014
Meses 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Pesquisa bibliográfica
Coleta de material
Processamento histológico
Coloração
Captura de imagens
Análise histoqualitativa
Análise histoquantitativa
Interpretação dos resultados
Elaboração da dissertação
Apresentação da dissertação
23
30 II
Referências bibliográficas
ANVISA. Norma Brasileira NR15 - Segurança e Medicina do Trabalho -
Atividades e Operações Insalubres.: Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
BOWES, J.; CARTER, C. Crosslinking of collagen. Journal of Applied
Chemistry, v. 15, n. 7, p. 296-304, 1965 1965. ISSN 0021-8871.
Buesa R. 2008. Histology without formalin? Annals of Diagnostic Pathology
12:387-396.
Cox M, Schray C, Luster C, Stewart Z, Korytko P, Khan K, Paulauskis J,
Dunstan R. 2006. Assessment of fixatives, fixation, and tissue processing on
morphology and RNA integrity. Experimental and Molecular Pathology 80:183-
191.
FOX, C. et al. Formaldehyde Fixation. Journal of Histochemistry &
Cytochemistry, v. 33, n. 8, p. 845-853, 1985 1985. ISSN 0022-1554.
HILDEBRAND, G. Y. Fixed saddle bridges. Acta Odontol Scand, v. 26, n. 5, p.
435-42, Nov 1968. ISSN 0001-6357. Disponível em: <
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5255310 >.
IARC. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 2006.
Disponível em: < http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-
33847035255&partnerID=40&md5=37727d85e2513d59f8326239b43a8689 >.
Acesso em: 20 September.
ITOPA, E. Use of formalin and modified gravity-feed embalming technique in
veterinary anatomy dissection and practicals. J Vet Med and Anim Health v. 3,
p. 79-81, 2011.
KIERNAN, J. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde and glutaraldehyde:
24
31 II
What they are and what they do. Microscopy Today v. 1, p. 8-12, 2000.
MALOMO, A. O.; IDOWU, O. E.; OSUAGWU, F. C. Lessons from history:
Human anatomy, from the origin to the renaissance. International Journal of
Morphology, v. 24, n. 1, p. 99-104, 2006. ISSN 07179367. Disponível em: <
http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-
33646740341&partnerID=40&md5=820ceb2733523e6dbfb6e21d61c1f0fd >.
MAYOR, R. Embalming: history, theory and practice. 3rd. Dallas: McGraw–Hill
Co., 2000. 728 ISBN 0838521878.
MOELANS, C. B. et al. Formaldehyde substitute fixatives: Effects on nucleic
acid preservation. Journal of Clinical Pathology, v. 64, n. 11, p. 960-967, 2011.
ISSN 00219746. Disponível em: <
http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-
80054932503&partnerID=40&md5=2625a2001454e2d9329c6e3379ffc9f2 >.
RODRIGUES, H. Técnicas Anatômicas (Anatomical Techniques). 4º. Vitória,
ES, Brazil: GM - Gráfica & editora, 2010. 269 ISBN 978-85-99510-62-9.
SAEED, M.; RUFAI, A.; ELSAYED, S. Mummification to plastination - Revisited.
Saudi Medical Journal, v. 22, n. 11, p. 956-959, NOV 2001 2001. ISSN 0379-
5284.
SOMPURAM, S. et al. A molecular mechanism of formalin fixation and antigen
retrieval. American Journal of Clinical Pathology, v. 121, n. 2, p. 190-199, FEB
2004 2004. ISSN 0002-9173.
Tolosa E, Rodrigues C, Behmer O, Neto A. 2003. Manual de técnicas para
histologia normal e patológica., 2nd ed. São Paulo: Manole.
Rodrigues, H. (2010). Técnicas anatômicas. 4º ed, Vitória – ES; p. 269.
VON HAGENS, G.; WHALLEY, A. The original exhibition of real human bodies.
25
32 II
Heidelberg, Germany: Arts & Sciences, 2009. 280 ISBN 978-3-937256-09-2.
VON STADEN, H. The discovery of the body: Human dissection and its cultural
contexts in ancient Greece. Yale Journal of Biology and Medicine, v. 65, n. 3, p.
223-241, 1992. ISSN 00440086.
WHO. Guidelines for indoor air quality: selected pollutants., 2010. Disponível
em: < http://www.euro.who.int/__data/assets/pdf_file/0009/128169/e94535.pdf
>. Acesso em: 20 September.
ZENG, F. et al. Determination of the lowest concentrations of aldehyde
fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging
and quantification. Histochemistry and Cell Biology, v. 139, n. 5, p. 735-749,
MAY 2013 2013. ISSN 0948-6143.
Schultz RL, Karlsson U. Fixation of the central nervous,1965.
System for electron microscopy by aldehyde perfusion. II. Effect
of osmolarity, pH of perfusate, and fixative concentration. J Ultrastruc Res 12:
187-206.
Fix and Garman, Pratical Aspects of Neuropathology: A Technical Guide for
Working with Nervous System, 2000. Toxicologic Pathology, vol 28, no1,
pp122-131.
Cammermeyer J. Nonspecific changes of the central nervous
system in normal and experimental material. In: The Structure and
Function of Nervous Tissue, 1968.Vol 6, Bourne GH (ed). Academic
Press, New York, pp 131-251.
Akani, Hirotoshi Methacarn as a whole brain fixative for gene and protein
expression analyses of specific brain regions in rats, 2013. The Journal of
Toxicological Sciences, vol.38 no 3 pp431-443
26
33 II
Manuel G. Forero and Alicia Hidalgo. Image processing methods for automatic
cell couting in vivo or in situ using 3D confocal microscopy, 2011. Advanced
Biomedical Engineering, Dr. Gaetano Gargiulo (Ed.), ISBN: 978-953-307-555-6.
Junqueira L. C. and Carneiro, José. Histologia Básica, 11ª ed. Rio de Janeiro -
Guanabara Koogan,2008.
27
