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Universidade Nova de Lisboa
Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Abordagem molecular para o diagnóstico e análise da
variabilidade genética de Schistosoma haematobium e de
Schistosoma mansoni em Angola.
Ilda Rosalina Jeremias
DISSERTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS,
ESPECIALIDADE DE PARASITOLOGIA MÉDICA
ABRIL, 2018
I
Universidade Nova de Lisboa
Instituto de Higiene e Medicina Tropical
Abordagem molecular para o diagnóstico e análise da
variabilidade genética de Schistosoma haematobium e de
Schistosoma mansoni em Angola.
Autor: Ilda Rosalina Jeremias
Orientadora: Professora Doutora Silvana Maria Duarte Belo
Coorientadora: Professora Doutora Maria Amélia Grácio
Coorientadora: Investigadora Doutora Ana Júlia Afonso
Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de
Doutor em Ciências Biomédicas, Especialidade de Parasitologia Médica.
Apoio financeiro concedido pela Fundação Calouste Gulbenkian, no âmbito da “2ª Edição de
bolsas de doutoramento na área das Doenças Tropicais Negligenciadas para licenciados dos
PALOP”
II
Dedicatória
Dedico este trabalho de tese à minha família,
nomeadamente aos meus pais, que sempre
me ensinaram que o conhecimento é uma
herança que nunca nos será retirada,
ao meu esposo Marcolino Victorino,
aos meus filhos, Arildson Victorino, Airton Victorino,
Edivaldo Victorino e Victória Victorino,
Vocês são os vasos mais preciosos da minha vida.
III
Agradecimentos
Este trabalho de tese foi desenvolvido na Unidade de Ensino e Investigação de
Parasitologia Médica (UEIPM), Grupo de Helmintologia e Malacologia Médicas, do
Instituto de Higiene e Medicina Tropical (IHMT/UNL). Não teria sido possível realizá-
lo sem o apoio e amizade de muitas pessoas. Na impossibilidade de mencionar todas elas,
destaco algumas das mais marcantes. Deste modo, quero agradecer:
Em primeiro lugar a Deus, que me manteve equilibrada durante todos os momentos, que
me deu capacidade de acreditar na minha paixão e prosseguir meus sonhos.
À minha orientadora, Professora Doutora Silvana Belo, Profª Auxiliar do IHMT, pela
orientação deste trabalho e pela oportunidade que me deu de poder trabalhar em
investigação, pela dedicação, pela aposta que fez em mim, no acompanhamento
sistemático da realização da tese, pelos seus conselhos, pelo seu espírito crítico sempre
prontos ao longo deste percurso, os ensinamentos, a sua pronta disposição em apoiar-me
e pelo envolvimento incondicional neste trabalho, pelo seu dom de compartilhar os seus
conhecimentos, assim como toda a amizade demonstrada ao longo de todo este tempo
que temos trabalhado juntas, a minha gratidão.
À minha coorientadora, Professora Doutora Maria Amélia Grácio, Professora Catedrática
Jubilada do IHMT, pela coorientação e supervisão deste trabalho, por todo o apoio, pela
dedicação no acompanhamento da tese, pelo carinho, pelos seus ensinamentos, pelos seus
conselhos e apoio incondicional, pela sua sensibilidade, sua generosidade e incentivo
O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na
intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos
inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis.
“Fernando Pessoa”
IV
dado durante todo este tempo, muito obrigada.
À minha coorientadora, Investigadora Doutora Ana Júlia Afonso pela paciência,
determinação, carinho, sabedoria e dedicação, pela sua pronta disponibilidade para tirar
todas as dúvidas que me iam surgindo no decorrer dos trabalhos e sobretudo pela amizade
e simplicidade o que tornou esta grande batalha possível de vencer, pelo seu envolvimento
neste trabalho, compartilhando as descobertas e fracassos, a sua competência e
generosidade despertam em mim admiração, muito obrigada.
À Professora Doutora Manuela Calado, pela paciência, ensinamentos que me transmitiu,
durante todo este tempo, o apoio incondicional dado durante os trabalhos de laboratório
sobretudo na biologia molecular e pronta disponibilidade em ensinar e apoiar, a minha
gratidão.
À Doutora Patrícia Salgueiro, a minha gratidão pelos ensinamentos que me transmitiu
durante os trabalhos de laboratório, nomeadamente a nível da biologia molecular.
À Professora Doutora Isabel Maurício, pelos ensinamentos e apoio incondicional dado
durante os trabalhos de laboratório sobretudo na biologia molecular e pronta
disponibilidade em ensinar, a minha gratidão.
Ao Doutor Pedro Ferreira, pelo apoio durante as práticas laboratoriais, pelos seus
conselhos, a sua pronta disposição em ensinar-me neste trabalho, pela sua disponibilidade
em compartilhar os seus conhecimentos, assim como toda a amizade demonstrada,
durante todo este tempo, a minha gratidão.
Aos colegas Tiago Mendes e António Pinto, pelo apoio durante as práticas laboratoriais,
pela amizade e consideração, o meu muito obrigado.
Às Técnicas Nelma Pontes, Alda Deolinda, Maria da Conceição Dias dos Santos e Dr.
Joltim Quinvinja pelo apoio durante o trabalho laboratorial no Instituto Nacional de
Saúde Pública (INSP), Luanda.
V
À Técnica Isabel Clemente, pela amizade e disponibilidade em apoiar-me na execução
das técnicas parasitológicas, no IHMT.
A Doutora Constantina Furtado pela amizade e incentivo para a frequência desta
formação e pelo apoio moral.
Ao Ministério da Saúde da República de Angola, em particular ao INSP, por me ter
autorizado a realização deste projeto de doutoramento.
Às Forças Armadas Angolas pelo apoio financeiro, para conclusão deste projeto.
À equipa técnica da Direção Provincial da Saúde do Hospital Central de Malange e à
organização não governamental CONSAUDE pelo apoio dado durante o trabalho de
campo.
Às autoridades das aldeias de Malange, nomeadamente da população do Quela 1 e Quela
2, da Funda, no Município de Cacuaco em Luanda, que aceitaram participar no estudo
com a sua excelente cooperação.
À Direção da Escola da Funda/Cacuaco por permitir trabalhar com os seus alunos.
Às Direções Provinciais de Saúde da Bengo e da Huíla, pelo apoio dado durante o
trabalho de campo.
Ao Instituto de Higiene e Medicina Tropical de Lisboa, Portugal, por todo o apoio
concedido.
Ao Centro “The Schistosomiasis Resource Center for distribution by BEI Resources,
NIAID, NIH” por me ter cedido amostra de DNA de S. haematobium para o controlo
positivo.
VI
Resumo
As espécies Schistosoma haematobium e Schistosoma mansoni são os agentes causais das
schistosomoses urogenital e intestinal, respetivamente, em Angola e responsáveis pela
elevada morbilidade na população, com destaque para S. haematobium, espécie endémica
em todo o país. O tratamento dos grupos populacionais de maior risco é uma das medidas
prioritárias dos programas de controlo da doença, sendo fundamental a utilização de
métodos de diagnóstico apropriados para identificação mais precisa das comunidades
alvo de controlo terapêutico. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivos avaliar
a aplicabilidade dos métodos moleculares baseados na Polymerase Chain Reaction (PCR)
na deteção de Schistosoma spp em amostras biológicas (excreta) de indivíduos residentes
nas províncias de Luanda, Bengo, Huíla e Malange, e a influência da infeção no perfil
hematológico, bem como analisar a estrutura populacional dos parasitas destas regiões.
O estudo envolveu 366 indivíduos, 187 do género feminino e 179 do masculino, com
idades compreendidas entre os 2 e 75 anos (média 18,5 anos ±12,2 DP), sendo a maioria
(67,7%) do grupo etário inferior aos 20 anos. Conjugando as técnicas parasitológicas
(filtração da urina e Kato-Katz) com a PCR, as prevalências globais estimadas foram de
76,9% para S. haematobium e de 73,8% para S. mansoni. Com exceção da província do
Bengo, onde não se detetou S. mansoni, as restantes são coendémicas para as duas
espécies de Schistosoma e, atendendo à taxa de prevalência, poderão ser consideradas
hiperendémicas para S. haematobium, situação idêntica para S. mansoni em Malange.
Acresce que no controlo efetuado quatro meses após a terapêutica (Malange e Luanda)
foi evidente a persistência da infeção schistosómica nos indivíduos previamente tratados.
Apesar da maioria dos indivíduos analisados apresentar grau de infeção moderado, foi
evidente a associação do parasitismo com os parâmetros hematológicos indicadores de
anemia, em particular com os níveis de hemoglobina e hematócrito, significativamente
inferiores (Mann-Whitney, P=0,048) nos indivíduos parasitados e na ausência de
coinfecção por outros parasitas.
O presente estudo realça a vantagem de utilização adicional da técnica da PCR,
demonstrando maior sensibilidade que os métodos parasitológicos, possibilitando a
deteção e diferenciação das duas espécies em situações de coinfecção e de baixa carga
parasitária. Esta caraterística foi especialmente marcada no caso da infeção por S.
mansoni, com o dobro de casos positivos detetados pela PCR em comparação com o
método de Kato-Katz. Acresce que só com a inclusão da PCR foi possível detetar casos
positivos por esta espécie na província da Huíla. A análise genética por RAPD-PCR das
populações de S. haematobium de Luanda e Malange, demonstrou baixo coeficiente de
similaridade (0,55 e 0,35) para dois primers A01 e A02, respetivamente, sugerindo a
existência de variabilidade genética inter-regional. No entanto, o estudo mais específico
da diferenciação genética entre os parasitas das duas regiões, utilizando um painel de 14
marcadores de microssatélites, revelou resultados pouco consistentes, apontando para a
necessidade de estudos mais diferenciados, com vista a identificar a existência de sub-
estrutura populacional destas espécies no país e a sua eventual relação com as diferenças
regionais observadas a nível da patologia e da resposta à terapêutica.
Palavras-Chave: Schistosoma haematobium, Schistosoma mansoni, diagnóstico
molecular, variabilidade genética, Angola.
VII
Abstract
In Angola, Schistosoma haematobium and Schistosoma mansoni, the causative agents of
urogenital and intestinal schistosomiasis, respectively, are responsible for high morbidity
in the population, with emphasis for S. haematobium, due to its endemicity in the whole
country. Treatment of the highest-risk population groups is one of the priority measures
of the disease control programmes, and the use of appropriate diagnostic methods for the
more accurate identification of the target communities required drug administration is
essential. In this sense, the objective of this study was to evaluate the applicability of
molecular methods based on the Polymerase Chain reaction (PCR) in the detection of
Schistosoma spp. in biological samples (excreta) of individuals resident in the provinces
of Luanda, Bengo, Huíla and Malange, and the influence of the infection in the
hematological profile, as well as to analyse the genetic structure of the parasites of these
regions.
The study involved 366 individuals, 187 females and 179 males, aged between two and
seventy-five years (average 18.5 years ± 12.2 SD), most of which were (67.7%) of the
age group under 20 years. Combining the parasitological techniques (urine filtration and
Kato-Katz) with PCR, the estimated global prevalence was 76.9% for S. haematobium
and 73.8% for S. mansoni. With the exception of the province of Bengo, where no S.
mansoni has been found, the remaining are co-endemic for both Schistosoma species and,
based on the prevalence rate, should be considered hyper-endemic to S. haematobium, as
well as for S. mansoni in Malange. In addition, the control carried out four months after
treatment (Malange and Luanda) was evident the maintenance of schistosome infection
in previously treated individuals. Although most of the subjects analysed have moderate
infection, there was a significant association of infection status with the main
haematological parameters of anaemia, in particular with the levels of haemoglobin and
haematocrit, significantly lower (Mann-Whitney, P=0.048) in those infected even in the
absence of coinfection by other parasites.
This study highlights the advantage of additional use of the PCR technique, showing
greater sensitivity than the parasitological methods, enabling the detection and
differentiation of the two species in coinfection and low parasitic load. This feature was
especially marked in S. mansoni infection, with twice of positive cases detected by PCR
as compared to the Kato-Katz method. In addition, only with the inclusion of PCR was
possible to detect positive cases by this specie in the province of Huíla. The genetic
analysis by RAPD-PCR comparing S. haematobium isolates from Luanda and Malange,
demonstrated low coefficient of similarity (0.55 and 0.35) for two primers A01 and A02,
respectively, suggesting the existence of interregional genetic variability. However, more
specific genetic characterization of the parasites of the two regions, using a panel of 14
microsatellites markers, revealed little consistent results, pointing out to the need for more
differentiated studies, in order to identify the existence of eventual differences among
population’s structure of these species in the country and their eventual relationship with
the regional differences observed in pathology and response to therapy.
Keywords: Schistosoma haematobium, Schistosma mansoni, molecular diagnostis,
genetic variability, Angola.
VIII
Índice Geral
Dedicatória ..................................................................................................................... II
Agradecimentos ………………………………………………………………..….…III
Resumo .........................................................................................................................VI
Abstract ……………………………………………..………………………………VII
Índice Geral………………………………………………………………………… VIII
Índice de Figuras ........................................................................................................ XII
Índice de Tabelas………………………………………………...………………… XIV
Lista de abreviaturas ……………………………………...……………………….. XV
1. Introdução...................................................................................................................1
1.1. Schistosoma spp e schistosomose..............................................................................2
1.1.1. Nota histórica ..............................................................................................................2
1.1.2. Dados históricos de schsitosomose em Angola...........................................................4
1.1.3. Taxonomia e sistematica de Schistosoma spp..............................................................4
1.1.4. Morfologia e biologia de Schsitosoma spp...................................................................5
1.1.5. Ciclo de vida ...............................................................................................................6
1.1.6. Patologia....................................................................................................................10
1.1.7. Distribuição geografica de Schistosoma spp.............................................................12
1.1.8. Schistosomose: Situação epidemiológica global......................................................13
1.1.9. Situação epidemiológica da schistosomose em África ............................................15
1.2. Epidemiologia da schistosomose em Angola...........................................................15
1.2.1. Bacia hidrográfica e a schistosomose........................................................................18
1.2.2. Breve caracterização geográfica e sociodemográfica de Angola...............................20
1.3. Diagnóstico da schistosomose ................................................................................22
1.3.1. Métodos parasitológicos ...........................................................................................22
1.3.2. Métodos imunológicos ............................................................................................23
1.3.3. Métodos moleculares................................................................................................24
1.4. Controlo da schistosomose.......................................................................................27
1.5. Variabilidade genética de Schistosoma spp: implicações no controlo.....................29
IX
2. Objectivos ............................................................................................................................32
3. Material e Métodos ...................................................................................................33
3.1. Locais e população ……………………..................................................................34
3.1.1. Província de Luanda .................................................................................................35
3.1.2. Província do Bengo...................................................................................................36
3.1.3. Província de Malange ...............................................................................................36
3.1.4. Província da Huíla ....................................................................................................37
3.2. Sensibilização da população nas províncias em estudo............................................39
3.3. Colheita e preparação de amostras biológicas (urina, fezes e sangue) ….................39
3.4. Pesquisa de ovos de Schistosoma haematobium e detecção de hematúria................40
3.5. Colheita e processamento das amostras de fezes......................................................41
3.6. Método molecular....................................................................................................43
3.6.1. Extração de DNA para detecção de S. haematobium e S. mansoni.............................43
3.6.2. Extração e precipitação de DNA de fezes e urina conservadas em Trizol
(Invitrogen) ………………………………………………………..………………43
3.6.3. Extração de DNA de fezes e urina pelo método de CTAB (Tampão brometo de
hexadecilitrimetilamônio), descrito por Stothard & Rollinson (1996), com
ligeiras modificações ................................................................................................43
3.6.4. Quantificação e pureza de DNA................................................................................44
3.6.5. Análise molecular......................................................................................................44
3.6.6. Reação de PCR convencional....................................................................................46
3.6.6.1. Deteção de DNA de S. haematobium pela PCR......................................................46
3.6.6.2. Deteção de DNA de S. mansoni pela PCR..............................................................46
3.7. Análise por RAPD-PCR...........................................................................................47
3.7.1. Método de RAPD-PCR............................................................................................47
3.7.1.1. Extração de DNA genómico …………………………………………………….47
3.7.1.2. Amplificação de RAPD-PCR ………………………………………………...…48
3.7.1.3. Reação de RAPD-PCR ………………………………………………...………..48
3.7.1.4. Gel de agarose a 2% ………………………………………………………….….49
3.7.1.5. Análise dos perfis electroforéticos ………...…………………………………….49
3.7.1.6. Otimização de RAPD-PCR …………………………………………….......……49
X
3.8. Estudo populacional através da análise dos microssatélites....................................50
3.8.1. Schistosoma haematobium........................................................................................51
3.8.1.1. Multiplex com 7 loci...............................................................................................52
3.8.1.2. Amplificação da PCR de Schistosoma haematobium............................................52
3.8.1.3. Perfil da PCR-multiplex de Schistosoma haematobium.........................................53
3.8.2. Schistosoma mansoni................................................................................................54
3.8.2.1. Amplificação da reação de S. mansoni....................................................................55
3.8.2.2. Multiplex com 7 loci...............................................................................................55
3.8.2.3. Condições da reação do ciclo de S. mansoni............................................................56
3.8.3. Análise dos fragmentos e genotipagem......................................................................58
3.9. Análise Estatística ...................................................................................................58
3.10. Considerações Éticas.............................................................................................59
4. Resultados..................................................................................................................61
4.1. Caracterização e distribuição da população analisada...........................................61
4.1.1. Perfil sociodemográfico dos participantes do estudo................................................61
4.2. Resultados da análise parasitológica (urina e fezes)..............................................63
4.2.1. Prevalência de Schistosoma haematobium e Schistosoma mansoni..........................64
4.2.2. Prevalência da infecção schistosómica em relação ao género …..............................64
4.2.3. Prevalência e intensidade do parasitismo em relação à idade....................................65
4.3. Resultados da análise molecular............................................................................66
4.3.1. Detecção de DNA de S. haematobium na urina e de S. mansoni nas fezes ……........66
4.3.2. Coinfeção de S. haematobium e S. mansoni pelos métodos parasitológicos e
pela PCR….…………………………………………...…………..........................68
4.3.3. Especificidade da técnica de PCR na coinfecção com outros helmintas...................69
4.3.4. Estimativas da prevalência de S. haematobium e S. mansoni com as técnicas
parasitológicas e a PCR……………………………………………………………70
4.3.5. Controlo Pós terapêutico em Malange e Luanda.......................................................71
4.4 Análise hematológica e o estado parasitológico.....................................................72
4.5. Características sociodemográficas associadas à infeção por Schistosoma spp…..74
4.6. Análise da variabilidade genética de isolados de S. haematobium e
S. mansoni…………………………………………………………...……….….76
XI
4.6.1. Análise genética por RAPD-PCR...............................................................................76
4.6.1.1. Análise dos fragmentos obtidos...............................................................................76
4.6.1.2. Coeficiente de similaridade.....................................................................................78
4.6.1.3. Análise da diversidade genética...............................................................................79
4.6.2. Análise genética por microssatélites..................................................................79
5. Discussão ...................................................................................................................81
6. Conclusões e Recomendações ……………………………….……………...……..93
7. Referências bibliográficas........................................................................................97
8. Anexos......................................................................................................................131
Anexo1. Procedimentos Éticos .................................................................................................132
Anexo 1.1. Pedido de autorização ao Comite de Ética de Angola (3ª via)..................................132
Anexo 1.2. Pedido de Consentimento Informado aos participantes...........................................133
Anexo 1.3. Parecer do Comité de Ética de Angola…................................................................134
Anexo 2. Técnicas parasitológicas............................................................................................136
Anexo 2.1.Técnica de Kato-Katz..............................................................................................136
Anexo 2.2. Técnica de Telemann-Lima....................................................................................139
Anexo 2.3. Técnica de filtração da urina...................................................................................140
Anexo 2.4. Ficha de inquérito...................................................................................................141
Anexo 3. Técnicas moleculares.................................................................................................143
Anexo 3.1. Extração de DNA de fezes e urina pelo método de CTAB (Tampão brometo de
hexadecilitrimetilamônio), descrito por Stothard & Rollinson (1996), com
ligeiras modificações..............................................................................................146
Anexo 3.2. Extração de DNA de fezes e urina pelo método de Trizol com ligeiras
modificações …………………………………………….……………...…...…..148
XII
Índice de Figuras
Figura1: Representação esquemática de vermes adultos de Schistosoma spp..................5
Figura 2: Morfologia dos ovos de Schistosoma spp ....................................................... 6
Figura 3: Ciclo biológico de Schistosoma spp ................................................................ 7
Figura 4: Schistosoma spp, respectivos hospedeiros intermediários e distribuição ....... 8
Figura 5: Distribuição geográfica das espécies de Schistosoma spp ............................ 12
Figura 6: Classificação da prevalência da schistosomose ............................................ 14
Figura 7: Distribuição e prevalência da schistosomose por S. haematobium. .............. 16
Figura 8: Prevalência da hematúria em Angola..............................................................17
Figura 9: Distribuição de Schistosoma mansoni em Angola ....................................... .17
Figura 10: Bacia hidrográfica de Angola.. .................................................................... 19
Figura 11: Atividades diárias da população no rio Bengo ............................................ 19
Figura 12: Províncias angolanas onde decorreu o estudo ............................................. 34
Figura 13: Escola do ensino primário da Funda/ Cacuaco .......................................... 36
Figura 14: Fonte de infeção de schistosomose Quela/Malange .................................... 37
Figura 15: Curso de água permanente, Município da Humpata/Huíla ...........................38
Figura 16: Centro Médico do Municipio da Humpata/Huíla..........................................39
Figura 17: Kit para filtração de urina para pesquisa de S. haematobium …………..…...41
Figura 18: Fitas reativas para a deteção de hematuria (Test UX®) ............................. 41
Figura 19: Método de Kato-Katz ................................................................................. 42
Figura 20: Método de Telemann-Lima ........................................................................42
Figura 21: Gel de electroforese a 2% de otimização da PCR, para deteção de
DNA S. haematobium na faixa dos 121 pb em 12 amostras.............................................46
Figura 22: Imagem ilustrativa do gel de electroforese a 2% da optimização do
RAPD-PCR, para amplificação de DNA dos ovos de S. haematobium...........................50
Figura 23: Imagem representativa do gel de electroforese 2% para
optimização da técnica dos microssatélites.....................................................................57
Figura 24: Prevalência de S. haematobium em 366 amostras de urina ....................... 63
Figura 25: Prevalência de S. mansoni em 145 amostras de fezes ................................. 63
Figura 26:.Prevalência de S. haematobium e S. mansoni nas províncias de
Malange, Luanda, Huíla e Bengo ……………………………………………………...64
XIII
Figura 27: Prevalência de S. haematobium e de S. mansoni em relação ao género….. 65
Figura 28: Prevalência de S. haematobium em relação ao grupo etário …………….. 65
Figura 29: Prevalência de S. mansoni em relação ao grupo etário…………………... 66
Figura 30: Deteção de DNA de S. haematobium na faixa dos 121 pares de bases….. .67
Figura 31: Deteção de DNA de S. mansoni nas fezes por PCR convencional……… .68
Figura 32: Análise por PCR convencional na deteção de DNA de infecções mistas
por S. haematobium e S. mansoni. …………...………………………..……………….69
Figura 33: Número de casos em coinfeção com outras helmintoses………………… 69
Figura 34: Prevalência estimada das infeções por S. haematobium e S. mansoni
com os métodos parasitológico e molecular ………………………………………….. 71
Figura 35: Comparação dos níveis de hemoglobina e hematócrito de acordo
com o parasitismo por S. haematobium…………………......………………………….72
Figura 36: Correlação dos niveis de hemoglobina (HGB) e do hematócrito (HCT)
com a carga parasitária de S. mansoni.............................................................................73
Figura 37: Infeção por geohelmintas.............................................................................74
Figura 38: Gel de agarose a 1,5% usando o primer A01 e marcador de 2000 pb
para as amostras de S. haematobium da província de Malange......................................77
Figura 39: Gel de agarose a 1,5% usando o primer A02 e marcador de 2000 pb
para as amostras de S. haematobium da província de Malange........................................77
Figura 40: Gel de agarose a 1,5% usando o primer A01 e marcador de 2000 pb
para as amostras de S. haematobium da província de Luanda.........................................77
Figura 41: Gel de agarose a 1,5% usando o primer A02 e marcador de 2000 pb
para as amostras de S. haematobium da província de Luanda........................................78
Figura 42: Diversidade genética entre as populações de S. haematobium de Malange e
Luanda aplicando o programa PHYLIP e o método da Maximum Parcimony.................79
XIV
Índice de Tabelas
Tabela 1: Primers específicos utilizados na PCR convencional para detecção de
S. haematobium e respetivas sequênciase ……………………………………………45
Tabela 2: Marcadores RAPD utilizados e respetivas sequencias nucleotidicas ....... 48
Tabela 3: Microssatélites: primers de S. haematobium sequências e marcadores . ... 51
Tabela 4: Preparação de 10X Primer Mix (contendo 2 µm de cada primer) ............ 52
Tabela 5: Mix do multiplex - PCR .............................. ………………………..…….52
Tabela 6abc: Condições de amplificação de ciclos de S. haematobium.......................53
Tabela 7: Microssatélites: primers de S. mansoni respetivas sequências
e marcadores................................................................................................................54
Tabela 8: Mix do Multiplex - PCR para S. mansoni.....................................................55
Tabela 9: Preparação de 10X primers mix...................................................................55
Tabela 10 abc: Condições de amplificação do ciclo de S. mansoni.............................56
Tabela 11: Perfil sociodemográfico da população analisada.......................................62
Tabela 12: Comparação da sensibilidade analítica das técnicas de PCR com a
filtração e o teste de hematúria no diagnóstico de S. haematobium na urina.................67
Tabela 13: Comparação da sensibilidade analítica das técnicas de Kato-Katz e da
PCR no diagnóstico de S. mansoni nas fezes................................................................68
Tabela 14: Estimativas da prevalência de S. haematobium e S. mansoni.....................70
Tabela 15: Controlo pós tratamento em Malange e Luanda.........................................71
Tabela 16: Condições sociodemográficas associadas ao estado parasitológico...........75
Tabela 17: Número de bandas polimórficas encontradas para as amostras
de S. haematobium e S. mansoni aplicando os primers A01 e A02...............................76
Tabela 18: Coeficiente de similaridade de Dice (S) entre as províncias de
Luanda e Malange para S. haematobium......................................................................78
Tabela 19: Cálculo de número de ovos por gramas de fezes......................................138
XV
Lista de abreviaturas
16S rRNA: região 16 da pequena subunidade ribossomal
CAA: Antigénio Circulante Anódico - Circulating anodic antigen
CCA: Antigénio Circulante Catódico - Circulating cathodic antigen
cDNA: ADN complementar - Complementary DNA
CI: Incompatibilidade citoplasmática - Cytoplasmatic incompatibility
Ct: Ciclo máximo do threshold na reação de PCR em tempo real
CTAB: Cetyltrimethylammonium Bromide
DALYs: Disability Adjusted Life Years
d’NTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados
DNA: Ácido desoxirribonucleico - Deoxyribonucleic acid
DO: Densidade Óptica
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FNUAP: Fundo das Nações Unidas para a População- United Nations Population Fund
HCT: Hematócrito
HDR: Human Development Report
HGB: Hemoglobina
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana - Human Immunodeficiency Vírus
HMM: Helmintologia e Malacologia Médicas
H2O dd: Água destilada desionizada
IHMT: Instituto de Higiene e Medicina Tropical
INSP: Instituto Nacional de Saúde Pública
ITS: Transcrição da Região Interna- Internal Transcribed Spacer
IgG: Imunoglobulina G
IL: Interleucina
INF- γ: Interferão gama
ITS2: Internal transcribed spacer 2
L1-5: Larva de primeiro ao quinto estádio
XVI
LAMP: Loop-Mediated Isothermal Amplification
mg: Miligrama
MgCl2: Cloreto de Magnésio
mM: micromolar
MINPLAN: Ministério do Planeamento e do Desenvolvimento Territorial
MINSA: Ministério da Saúde de Angola
mRNA: Ácido ribonucleico mensageiro
mtDNA: DNA mitocondrial
Ng: Nanograma
NTD: Doenças Tropicais Negligenciadas - Neglected Tropical Diseases
NTR: Number of Tandem Repeats
OMS: Organização Mundial da Saúde
OPG: Número de ovos por grama de fezes
pH: Potencial de Hidrogénio
Pb: Pares de bases
PBS: Tampão fosfato salino - Phosphate Buffered Saline
PCR: Reação em cadeia da polimerase - Polymerase chain reaction
PIB: Produto Interno Bruto
PNCS: Programa Nacional de Controlo da Schistosomose
PNUD: Programa das Nações Unidas Para o Desenvolvimento
PZQ: Praziquantel
RAPD: Amplificação Arbitrária de ADN Polimórfico- Random Amplified Polymorfism
RFLP: Polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição- Restriction Fragment
Length Polymorfism
RNA: Ácido Ribonucleico- Ribonucleic Acid
SADC: Southern African Development Community
SI: Sistema imunitário
SIDA: Síndrome de Imuno Deficiência Adquirida
SSR: Repetição de Frequências Simples- Simple Sequence Repeats
SNPs: Polimorfismos Nucleotídicos Únicos Simples- Single Nucleotide Polymorphisms
T.A.: Temperatura ambiente
TAE: Tris-Acetato-EDTA
XVII
TE: Tris-EDTA
Th1: Resposta imunitária de tipo 1
Th2: Resposta imunitária de tipo 2
TNF-α: Factor de necrose tumoral alfa
UNICEF: Fundo das Nações Unidas para a Infância - United Nations Children`s Fund
UV: Ultravioleta
VNTRs: Número Variável de Repetições Sequenciais em Tandem- Variable Number of
Tandem Repeats
WGA: Whole Genome Amplification
WGS: Whole Genome Shotgun
WHO: World Health Organization
l: Microlitro
1
1. Introdução
Introdução
2
1. Introdução geral
1.1 – Schistosoma spp e schistosomose
Os tremátodes do género Schistosoma são os agentes causais da schistosomose
(ou bilharziose), parasitose aguda e crónica, que afeta aproximadamente 240 milhões de
pessoas em todo o mundo, das quais cerca de 93% na África subsariana. A schistosomose
é responsável, anualmente, por 70 milhões de anos de vida de incapacidade perdidos
(DALYs) só no continente africano (King & Bertino, 2008; Hotez & Fenwick, 2009).
É uma parasitose endémica em 78 países das regiões tropical e subtropical,
especialmente nas áreas rurais de países de baixa renda, estimando-se que mais de 700
milhões de pessoas estejam expostas ao risco de contrair a infeção, por contacto com
coleções de água doce, em atividades profissionais, domésticas ou de lazer. A
schistosomose está no topo das designadas Doenças Tropicais Negligenciadas (DTN) e é
considerada a segunda doença parasitária, imediatamente após a malária, de maior
importância em termos de morbidade e mortalidade em África, Ásia e América Latina
(WHO, 2013a; 2014).
A dinâmica de transmissão de Schistosoma spp é complexa, estando dependente
de uma variedade de factores intrínsecos relacionados com as espécies parasitárias
(capacidade infetante, imunogenicidade e patogenicidade), assim como, de fatores
dependentes dos hospedeiros intermediários e definitivos, condições ecológicos e sociais.
Admite-se que variações genotípicas intra-populacionais nas espécies de Schistosoma que
parasitam o ser humano possam ser responsáveis por diferenças na gravidade clínica,
magnitude da prevalência e resposta ao tratamento, observadas na mesma região ou em
diferentes regiões geográficas (Gentile & Oliveira, 2008; Steinauer et al., 2008).
Das principais espécies patogénicas para os humanos, destacam-se S.
haematobium, responsável pela schistosomose urogenital, sendo as restantes, S. mansoni,
S. japonicum, S. intercalatum e S. mekongi, os agentes etiológicos da forma intestinal da
doença. Tanto S. haematobium como S. mansoni são endémicas em Angola, sendo uma
das principais causas de morbilidade no país.
Introdução
3
1.1.1 – Nota histórica
Deve-se a Theodore Bilharz, patologista alemão, a identificação de Schistosoma
haematobium em exames pos-mortem realizados em soldados egípcios em 1851, no
Cairo, mas incluído no género Distomium. Weinland, em 1858, substituiu este nome por
Schistosoma. No entanto, as referências às manifestações clínicas da schistosomose
urogenital, como a hematúria crónica, descritas nos antigos papiros de Ebers, Hearts e
Kahum, cerca de 1900 anos a. C., sugerem que a doença já era conhecida no Egipto e
Mesopotâmia. Os resultados de investigações paleoepidemiológicas e paleogeográficas,
demonstraram a presença de ovos calcificados de Schistosoma haematobium nos rins
(Ruffler, 1910) e de antigénios circulantes (Colley, 1996) em múmias da 20ª dinastia da
era dos Faraós (1000-1250 a. C.), comprovando assim, a sua existência na antiguidade.
Posteriormente, Harley (1864) e Cobbold (1864) sugeriram que a infeção humana ocorria
por via cutânea.
A presença de ovos de esporão lateral, identificados por Manson em 1902 no
exame coprológico de um doente em Londres, demonstrou a existência de uma segunda
espécie do parasita, para a qual foi proposta a designação de Schistosoma mansoni. O
papel de um molusco de água doce como hospedeiro intermediário, no ciclo biológico do
parasita, foi descoberto por Leiper, em 1815 (citado por Barakat, 2013).
Apesar da espécie Schistosoma japonicum ter sido identificada só em 1904, por
Katsurada, as manifestações clínicas associadas à doença, como a síndrome de Katayama,
tinham sido descritas em 1847, na região de Hiroshima, Japão, o que comprova a
antiguidade do conhecimento remoto da parasitose (Mao & Shao, 1982). Na sequência
de estudos experimentais, Fujinamie e Nakamura (1909), citado por Tanaka e Tsuji
(1997), demonstraram a via de transmissão e a presença de vermes adultos no sistema
porta e, em 1924, foi identificado, na China, o respetivo hospedeiro intermediário,
moluscos anfíbios do género Oncomelania (Cook & Zumla, 2009). No período mais
recente, foram identificadas mais duas espécies, Schistosoma intercalatum, no Zaire
(Fisher, 1934), Schistosoma mekongi (Voge, Bruckner & Bruce, 1978), numa área do
delta do Mekong confinada ao Laos e Camboja, e Schistosoma malayensis, descoberta
numa área limitada da Malásia em 1988, como potencialmente infetante para os humanos
(Blair et al, 1997).
Introdução
4
1.1.2 – Dados históricos de Schistosoma spp em Angola
As primeiras referências da infeção humana por S. haematobium em Angola
datam de 1896 e foram feitas por Aires Kopke e Bernardino Roque em relação à região
norte do país. Em 1902 foram idenficados, por Bernardino Roque, os primeiros casos de
infeção nas províncias de Cabinda, Ambriz e Huíla. No entanto, a parasitose só começou
a ser divulgada nos boletins sanitários entre 1938 a 1955 (Leitão, 1989), apesar das
medidas de controlo terem sido iniciadas em 1923 (Carvalho et al, 1966; Grácio,
1977/78a). A ocorrência de S. mansoni foi registada, pela primeira vez, na província de
Benguela, em 1955 assim como a identificação dos respetivos moluscos hospedeiros
intermediários: Bulinus africanus, para S. haematobium e Biomphalaria pfeifferi para S.
mansoni (Leitão, 1989)
1.1.3 - Taxonomia e Sistemática de Schistosoma spp
Os parasitas do género Schistosoma integram um grupo zoológico de espécies
inteiramente adaptadas ao parasitismo intravascular. São trematódes digenéticos, dióicos
(sexos separados) pertencentes à Família Schistosomatidae e ao género Schistosoma que
inclui as cinco principais espécies responsáveis pela doença nos humanos (Cook &
Zumla, 2009).
Reino: ANIMALIA
Filo: PLATHYHELMINTHES
Superclasse: EUPLATHYHELMINTTHES
Classe: TREMATODA
Subclasse: DIGENEA
Ordem: STRYGEIFORMES
Família: Schistosomatidae
Subfamília: Schistosomatinae
Género: Schistosoma
Espécie: Schistosoma haematobium – (Bilharz, 1851)
Schistosoma mansoni - (Manson, 1902)
Schistosoma japonicum – (Katsurada, 1904)
Schistosoma intercalatum - (Fisher, 1934)
Schistosoma mekongi – (Voge, Bruckner & Bruce, 1978)
Introdução
5
1.1.4 - Morfologia e biologia de Schistosoma spp
As espécies de Schistosoma são parasitas com acentuado dimorfismo sexual na
fase adulta, apresentam alternância de gerações entre o hospedeiro definitivo vertebrado
e o hospedeiro intermediário, moluscos gastrópodes aquáticos ou anfíbios, específicos
das espécies parasitárias. As fêmeas medem entre 10 a 30 mm de comprimento e 0,2 mm
de largura, têm o corpo alongado e filiforme, apresentam o ovário oblongo, ligeiramente
lobado e único, situado no terço médio do corpo (Figura 1). Os machos são mais curtos e
robustos do que as fêmeas da mesma espécie, apresentam o corpo esbranquiçado e medem
cerca de 10 a 20 mm de comprimento e 0,3 a 1 mm de largura com 4 ou 5 testículos,
dependendo da espécie, situados junto à ventosa ventral (Rey, 2001). Apresentam um
sulco ventral que se alonga até à extremidade posterior, formando o canal ginecóforo
onde a fêmea é mantida após o acasalamento. Esta só é capaz de completar a sua
maturação mediante o acasalamento com o macho (Gryseels, 2012), o qual possui um
mecanismo pouco conhecido que regula a expressão de genes na fêmea e estimulação de
factores necessários para o seu crescimento e desenvolvimento, bem como para o
processo de fertilização dos ovos (Grevelding et al, 1997; Kunz, 2001). O acasalamento
dos vermes ocorre nos capilares hepáticos pré-sinusoidais do hospedeiro vertebrado (Rey,
2001).
Figura 1- Representação esquemática de vermes adultos de Schistosoma
Introdução
6
Os ovos diferem na sua morfologia, arredondados ou com forma elíptica e
possuem um esporão terminal ou lateral caraterístico da espécie (Figura 2), elemento
necessário à sua penetração na parede dos vasos sanguíneos para serem eliminados com
os excreta (urina ou fezes, dependendo da espécie).
Espécie
de
Schistoso
ma
S. haematobium
S. mansoni
S. intercalatum
S. japonicum
Morfologia
Dimensões 115-175µm x45-
75µm
115–175µm x 45-
70µm
140-240µm x 50-
85µm
75-95 µm x 45–
65µm
Via de
eliminação
Urina
Fezes
Fezes
Fezes
Figura 2- Morfologia dos ovos de Schistosoma (Original do IHMT)
1.1.5 - Ciclo de vida
O género Schistosoma apresenta uma biologia diferente dos outros Plathelmintas,
relativamente ao modo de infeção do hospedeiro definitivo que consiste na penetração
das cercárias de cauda bifurcada (furcocercárias) através da pele, quando os indivíduos
entram em contacto com coleções de água doce onde existem estas formas larvares do
parasita libertadas pelos moluscos gastrópodes, hospedeiros intermediários específicos
do parasita. A transmissão dos schistosomas (Figura 3) ocorre quando o hospedeiro
definitivo infectado elimina ovos viáveis e embrionados de Schistosoma na urina (S.
haematobium) ou nas fezes (S. mansoni, S. intercalatum, S. japonicum e S. mekongi) que
entram em contato com coleções de água doce (rios, lagos, lagoas, etc).
Introdução
7
Figura 3 - Ciclo de vida de Schistosoma spp. (Autorizada adaptação de CDC-DPDx)
Neste ambiente, com temperatura de 25º a 30 °C, luminosidade e pressão osmótica
adequadas, os ovos eclodem libertando uma forma larvar ciliada, denominada miracídio;
esta movimenta-se até encontrar o molusco hospedeiro intermediário específico (Figura
4), penetrando nas zonas expostas nomeadamente pé, tentáculos e colar do manto.
Para S. haematobium e S. intercalatum, são moluscos do género Bulinus enquanto
para S. mansoni pertencem ao género Biomphalaria. Moluscos anfíbios dos géneros
Oncomelania e Tricula atuam como hospedeiros intermediários de S. japonicum e S.
mekongi, respetivamente.
Introdução
8
Espécies de
Schistosoma
Molusco Hospedeiro Intermediário Distribuição
S.haematobium
Bulinus africanus
B. forskalli
B. truncatus/tropicus
complex
B. reticulatus
África Subsariana
África e Arábia e
Ilhas do Oceano
Índico
África e Médio
Oriente
África, Península
Arábica e Índia
S. mansoni
Biomphalaria pfeifferi
B. alexandrina
B. glabrata
B. tenogophila
África Subsariana
África: Sudão e
Egipto
Nordeste da América
do Sul
Península Arábica
Antilhas e
Madagáscar
S.intercalatum
Bulinus africanus
B. forskalli
Nordeste RDC
Camarões
Gabão
S. japonicum
Oncomelania h. hupensis
O. h. quadrasi
O. h. nosophora
O. h. lindoensis
O. h. formosana
China
Filipinas
Japão
Indonésia
Taiwan
S. mekongi
Neotricula aperta
Camboja
Laos
Tailândia
Malásia
Figura 4 – Schistosoma spp, respetivos hospedeiros intermediários e distribuição
Introdução
9
No caracol, os miracídios passam por modificações morfológicas, com um
período de viabilidade infetante de 8 a 12 horas, originando esporocistos de 1ª geração,
cerca de 24 horas após a penetração. Nesta forma, as células germinativas proliferam,
crescem e multiplicam-se dando origem a esporocistos de 2ª geração que migram para os
órgãos digestivo e sexual do molusco, onde se desenvolvem e sofrem rápidas divisões,
dando origem a milhares de cercárias do mesmo sexo, forma larvar infetante para o
hospedeiro definitivo. Estas são eliminadas do molusco cerca de 34 dias após penetração
do miracídio e, segundo Rey (2001), este ciclo intra-molusco pode manter-se durante o
período de sobrevivência do molusco, superior a oito meses, consoante a espécie.
O número de cercárias eliminadas pelo molusco, por dia, varia de acordo o
tamanho e idade do molusco e oscila de 500 a 2000 cercárias. Essa eliminação depende
dos hábitos de contacto do hospedeiro definitivo com a água, sendo a capacidade
infectante das cercárias máxima nas primeiras oito horas, diminuindo até perder a sua
atividade em 72 horas (Rey, 2001). Ao encontrar o mamífero suscetível (humanos, alguns
primatas e roedores), penetram ativamente na pele ou mucosas. Ao penetrar no
hospedeiro definitivo, as cercárias perdem a cauda e atravessam a epiderme até a lâmina
basal num período de 15 a 30 minutos e transformam-se em schistosómulos. Este
processo ocorre devido a contrações musculares e de enzimas líticas, segregadas pelas
suas glândulas. Esta forma do parasita é mais vulnerável aos anticorpos do hospedeiro
vertebrado nas primeiras três horas, podendo mesmo resultar na sua destruição.
Os schistosómulos invadem, preferencialmente, os vasos venosos da derme e são
transportados passivamente para o coração e bombeados para os pulmões através das
artérias pulmonares, cerca de sete dias após a penetração; através das veias pulmonares
deixam o pulmão, passam para o coração esquerdo, seguem a circulação sistémica até
alcançarem o sistema porta-hepático, onde se desenvolvem e atingem a maturidade sexual
num período de 21 dias, podendo ao 14º dia já se distinguirem as fêmeas dos machos. O
acasalamento ocorre entre o 29º e o 31º dia e o par de vermes migra, contra a corrente
sanguínea, para o local onde ocorrerá a oviposição, nomeadamente para as veias do plexo
vesical que drenam o sistema urinário no caso de S. haematobium e para as veias
mesentéricas do intestino no caso de S. mansoni, S. intercalatum e S. mekongi. No
Introdução
10
endotélio vascular, as fêmeas depositam entre 50 a 500 ovos na mucosa vesical ou na luz
intestinal, consoante a espécie de Schistosoma, que são eliminados, em parte, com a urina
ou fezes, recomeçando o ciclo (Pellegrino & Coelho, 1978; Valadares et al, 1981; Lenzi
et al, 2008).
Cerca de dois terços dos ovos produzidos diariamente pelas fêmeas ficam retidos
na mucosa vesical ou intestinal, desencadeando uma reação inflamatória com formação
de granulomas peri-ovulares, responsáveis pela patogenia da doença. Acidentalmente os
ovos podem alojar-se noutros órgãos e tecidos, dando origem às formas ectópicas da
schistosomose (Ferrari et al, 2004; Araújo et al, 2006; Koukounari et al, 2009; Ibironke
et al, 2011; Figueiredo et al, 2014; Lodh et al, 2014).
1.1.6 - Patologia
No caso de indivíduos infetados residentes em áreas endémicas, as manifestações
agudas da doença passam quase sempre despercebidas. O período pré-patente varia de 1
a 2 meses e compreende desde a penetração das cercárias até ao aparecimento dos
primeiros sintomas. Neste período, há relatos ocasionais de alguns sintomas como
astenia, cefaleia, anorexia, mal-estar e náuseas. O início dos sintomas da fase aguda
coincide com a eliminação e deposição dos primeiros ovos nos tecidos e pode caraterizar-
se por um quadro febril denominado síndrome de Katayama. A fase crónica pode
manifestar-se ao fim de vários meses ou anos, resultante da oviposição intensa e
prolongada, com consequente resposta imunológica aos antigénios solúveis libertados
pelos ovos, levando à formação de granulomas.
Na infeção crónica por S. haematobium, as manifestações caraterizam-se
inicialmente por hematúria, disúria e polaquiúria, mais frequentes em crianças. A
retenção dos ovos nas vénulas urogenitais e pélvicas, originam granulomas na bexiga e/ou
nos órgãos genitais, provocam lesões locais com hiperemia e desenvolvimento de
granulomas que evoluem para fibrose, resultando em cistites crónicas. Há hipertrofia
muscular que evolui para lesões polipoides levando à formação de papilomas, ulcerações
e fibrose (Abdel-Hadi & Talaat, 2000). Pode ocorrer calcificação do plexo urinário e da
uretra, provocando lesões extensas, incluindo ureterohidronefrose, conduzindo a
insuficiência renal. Devido à passagem direta dos ovos das veias urogenitais para as veias
Introdução
11
sistémicas e destas para a circulação pulmonar, pode conduzir a cor pulmonale. Também
tem sido observada uma maior incidência de carcinoma de células escamosas da bexiga
nas infeções por esta espécie (Gryschek & Chieffi, 2008; Rambau et al, 2013). Além
destas manifestações patológicas, as lesões causadas pelo parasita na mucosa genital
podem potenciar a infeção pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH), especialmente
em mulheres, (Leutsher et al, 2008; OMS, 2009). Outros efeitos resultantes da infeção
incluem disfunção sexual e infertilidade, devido à ulceração e outras e outras lesões
genitais, que, consequentemente, conduzem a diminuição da função reprodutiva (Richter,
2000; King & Dangerfield-Cha, 2008; Leutsher et al, 2009).
Nas espécies de Schistosoma responsáveis pela forma intestinal, a patologia pode
ser causada pela inflamação precoce ou pela fibrose resultante dos granulomas formados
no espaço periportal pré-sinusoidal, podendo causar hepatoesplenomegália, sobretudo
nos grupos etários mais jovens (Booth et al 2004; Gryeels & Striland, 2013). Na fase
hepatointestinal, as manifestações mais frequentes caraterizam-se por presença de
diarreia e epigastralgia. As complicações induzidas pela cronicidade da infeção resultam
da deposição massiva difusa de colagénio no espaço periportal podendo levar à fibrose
de Symmer`s, com oclusão progressiva da veia porta, hipertensão portal, esplenomegália,
circulação venosa colateral, ascite e varizes esofágicas (Dunne & Pearce 1999; Wilson et
al., 2011; Elbaz & Esmat, 2013).
Para além da patologia direta nos órgãos, a infeção por schistosomas tem efeitos
nocivos colaterais, incluindo a nível nutricional, das reservas orgânicas, especialmente
ferro, desenvolvimento estato-ponderal e cognitivo, sobretudo em crianças (Hotez &
Molyneux, 2008; WHO, 2012; Adenowo et al., 2015).
Interação parasita hospedeiro
Devido ao carácter crónico que a schistosomose apresenta e a sua forma de
transmissão, com cargas parasitárias relativamente pequenas, a infeção pode manter-se
durante longos anos, sugerindo a existência de longo período de coevolução do
hospedeiro e do parasita, limitando a morbidade e prevenindo a morte do hospedeiro. Esta
interação complexa entre o hospedeiro e o parasita promove o equilíbrio e permite a
transmissão contínua do parasita sem causar danos nocivos imediatos ao hospedeiro
Introdução
12
(King et al., 2001). O parasita apresenta mecanismos de escape sofisticados ao sistema
imunitário do hospedeiro definitivo, o que lhe permite habitar os vasos do sistema
circulatório por longos períodos. Uma das formas de escape envolve a expressão de
antigénios de superfície, interferência do parasita na síntese de citocinas através da
indução da apoptose de células de defesa do hospedeiro e modificação da resposta imune
ao parasita por interferência com o sistema hormonal através de receptores do próprio
parasita (Salzet et al, 2000; Angeli et al, 2001; Chen et al, 2002).
1.1.7 - Distribuição geográfica de Schistosoma spp
Das cinco espécies de Schistosoma que parasitam o ser humano são de grande
relevância, S. haematobium, responsável pela schistosomose urogenital e S. mansoni e S.
japonicum causadoras da forma intestinal da doença, devido à ampla distribuição
geográfica e elevada morbilidade; as duas restantes espécies, S. intercalatum e S.
mekongi, também causam schistosomose intestinal, mas apresentam uma distribuição
mais restrita (Figura 5). De acordo com Rey (2001), espécies zoonóticas de Schistosoma
que parasitam aves e mamíferos, podem causar reações inflamatórias cutâneas em
humanos, denominadas dermatites cercarianas, mas não evoluem até à fase adulta no
organismo.
Figura 5. Distribuição geográfica das espécies de Schistosoma
(Fonte: http//www.manole.com.br/clinica. Acesso a 8-07-2016)
Introdução
13
1.1.8 - Schistosomose: situação epidemiológica global
A schistosomose (ou bilharziose) é considerada a principal Doença Tropical
Negligenciada (DTN) e, segundo a WHO (2013a), a segunda doença parasitária mais
devastadora em termos de Saúde Pública e socioeconómicos, imediatamente após a
malária, na África Subsariana. Sendo uma das principais parasitoses humanas com
ocorrência mundial, (Figura 5), distribuída pela África, Ásia e América Latina, no
Mediterrâneo Oriental e Pacífico Ocidental (Engels et al, 2002), encontra-se incluída no
Plano Global de controlo das DTN para 2008-2020. De acordo com Chitsulo et al., (2004)
e WHO (2012), das mais de 270 milhões de pessoas infetadas no mundo, cerca de 90%
residem no continente africano. Para além disso, estima-se que mais de 700 milhões
estejam expostos à infeção e cerca de 20 milhões possuam patologia grave.
Das quatro espécies endémicas em África, S. haematobium é a predominante e
principal responsável pela morbimortalidade nas regiões subsariana e Mediterrâneo
oriental. É endémica em 54 países, incluindo Angola, Moçambique e Guiné-Bissau,
coexistindo com S. mansoni, S. intercalatum e S. guineensis em algumas zonas (Gryseels
et al., 2006). É na região africana que se regista a prevalência mais elevada da parasitose
(Figura 6). Quanto à schistosomose por S. mansoni é também frequente na América
central e do sul, enquanto S. japonicum e S. mekongi encontram-se nalguns países do
sudeste asiático.
Introdução
14
Figura 6 – Classificação da prevalência da schistosomose (WHO, 2012)
De acordo com Engels (2002), a schistosomose embora apresente, de um modo
geral, um índice de mortalidade baixo, a sua acentuada morbilidade faz com que estes
números sejam preocupantes, pelo facto de a doença apresentar um carácter insidioso,
não sendo comum o seu diagnóstico nos estágios iniciais, mas a sua evolução, na ausência
de tratamento, pode levar ao desenvolvimento de doenças incapacitantes para homens e
mulheres, em idades mais produtivas.
A schistosomose está associada à pobreza e ao baixo desenvolvimento
económico, que geram a necessidade de utilização de águas naturais contaminadas para
o exercício da agricultura, de atividades domésticas (lavar roupa e utensílios) e de higiene
das populações. Apesar de ser considerada uma doença de áreas agrícolas rurais, assiste-
se cada vez mais à presença de focos urbanos (Mungomba & Michelson, 1995; Ribeiro
et al, 2004; Massara et al, 2008; Barbosa et al, 2010; Leal Neto et al, 2011).
No entanto, a dinâmica populacional de Schistosoma spp. é complexa, estando
dependente de uma variedade de factores relacionados com os hospedeiros definitivos e
Introdução
15
intermediários, nomeadamente o comportamento humano, a imunidade, aspectos sociais
e ecológicos, a densidade populacional de caracóis e taxa de infeção, fatores que
determinam a magnitude e distribuição populacional dos parasitas nas comunidades
humanas e consequente grau de endemicidade.
1.1.9 - Situação epidemiológica da schistosomose em África
Só no continente africano, calcula-se que a schistosomose cause 280 mil mortes
por ano (Van der Werf et al, 2003) e seja responsável anualmente, por 70 milhões de anos
de vida de incapacidade perdidos DALYs (Disability Adjusted Life Years) (King et al,
2008), sendo este valor superior às estimativas para a malária e comparáveis aos do
HIV/AIDS (WHO, 2008). Em 2011, pelo menos 243 milhões de indivíduos continuavam
a necessitar de tratamento nesta região africana (WHO, 2013a).
Os grupos populacionais de maior risco incluem as mulheres e crianças (devido
às atividades recreativas), bem como agricultores e pescadores. Além disso, estudos sobre
percepções e práticas associadas a outras endemias ilustraram a grande influência que
exercem os universos social e cultural. Com efeito, um estudo realizado no Gana focando
a schistosomose por S. haematobium, concluiu que muitos membros da comunidade
sabiam da existência da schistosomose urinária, mas não a viam como doença. Muitos
entrevistados acreditavam que a cor vermelha da urina era sinal de virilidade, de
masculinidade. Outros atribuíam a cor vermelha da urina a uma variedade de cana-de-
açúcar que era consumida na região (Taylor et al., 1987; Maghema, 2005).
1.2 - Epidemiologia da schistosomose em Angola
Em Angola, a schistosomose é endémica nas 18 províncias, o que corresponde a
100% do território nacional (MINSA, 2000). As duas espécies são S. haematobium e S.
mansoni, sendo S. haematobium a espécie dominante amplamente distribuída no país com
uma prevalência de 25 a 49% no centro e mais baixa na costa litoral, de 5 a 24% (Figura
7). A espécie S. mansoni é restrita nas regiões do planalto central e do Norte. De acordo
com Grácio (1980), Chitsulo et al. (2000) e Figueiredo (2008), a schistosomose por S.
intercalatum, aparentemente continua ausente no país.
Estudos efetuados na década de 70 (Séc. XX), incidindo sobre a schistosomose
Introdução
16
em crianças (Grácio, 1977/78a,b, 1980), demonstraram prevalências de 46 a 93% para S.
haematobium, em várias regiões do país, taxas que se mantiveram praticamente
inalteradas segundo algumas investigações mais recentes efetuadas na população infantil
(Chipopa, 2000; MINSA, 2005).
De acordo com o MINSA (2005), a prevalência global da schistosomose na
população infantil em Angola era de 28,0%, (IC95%; 26,6–30,3). Estima-se que a
morbilidade anual no país seja de 20.999 mil casos e uma mortalidade de 0.02% de óbitos
(MINSA, 2012). Alguns estudos epidemiológicos realçam não só a endemicidade e ampla
distribuição da parasitose mas também a sua ocorrência nos diversos grupos etários, com
prevalências regionais de 20% a 69% (Maghema, 2005).
Após a interrupção dos programas de controlo durante cerca de 30 anos, os
resultados do primeiro estudo epidemiológico efetuado no país neste grupo populacional
(MINSA, 2005), utilizando a detecção de microhematúria como indicador proxy da
infecção por S. haematobium (Savioli et al, 1990; Ross et al, 2002), indicaram uma
prevalência global de microhematúria de 28,0% (IC95=26,6-30,3). As zonas de Cabinda,
Namibe, sul da Huíla, Cunene e sul de Kuando Kubango apresentaram as prevalências
mais elevadas, com 40,6% (IC95=34,3-46,9) e 39,6% (IC95=32,6-46,5),
respectivamente. A prevalência mais baixa, 11,8% (IC95=7,8-15,7), foi observada na
zona ocidental do país e este de Angola (Figura 8), tendo-se encontrado uma prevalência
da hematúria macroscópica de 1,2%, indicador proxy da infeção grave por S.
haematobium (MINSA, 2005).
Figura 7 - Distribuição e prevalência da schistosomose por S. haematobium
em Angola (MINSA, 2005)
Prevalência da infeção %
1-4 %
5-24 %
25-49 %
50-100 %
Introdução
17
Figura 8 - Prevalência da hematúria em Angola
(Adaptado de MINSA, 2005)
Em relação à schistosomose intestinal por S. mansoni, encontra-se circunscrita às
regiões norte e centro do país, afetando consideravelmente tanto a população adulta como
a infantil. É endémica nas províncias de Cabinda, Uíge, Zaire, Malange (Figura 9), com
uma prevalência global de 4,5% (MINSA, 2005).
Figura 9 - Distribuição de S. mansoni em Angola
(Adaptado: MINSA 2005 acesso: 15/05/2016)
Distribuíção e prevalência da schistosomiase por província
≥30% (Hematuria)
< 30% (Hematuria)
< 10%
Nenhum dado
Distribuíção e prevalência da schistosomiase por província
≥30% (Hematuria)
< 30% (Hematuria)
< 10%
Nenhum dado
Prevalência da infeção %
0
1-4%
Introdução
18
Quanto aos moluscos hospedeiros intermediários identificados no país, Bulinus
globosus e Bulinus africanus são as espécies envolvidas na transmissão de S.
haematobium e Biomphlaria pfeifferi na transmissão de S. mansoni (Grácio, 1980).
1.2.1 – Bacia hidrográfica e a schistosomose
A existência de uma bacia hidrográfica extensa aliada a características
geomorfológicas e deficiências socioeconómicas, promovem a existência de fatores
epidemiológicos favoráveis à disseminação de Schistosoma spp. De um modo geral,
Angola possui 47 bacias hidrográficas (Figura 10) sendo a principal rede hidrográfica
composta por dez grandes bacias e 7 grandes rios, nomeadamente: bacias do Congo, dos
Cuanhamas, do Noroeste Angolano, do Sudoeste Angolano, do Centro Oeste Angolano,
do Cuando, do Cuvango, do Cunene, do Kwanza, do Zambeze e do Kubango.
Desta rede de bacias destacam-se os seguintes rios: Kubango, Queve ou Cuvo,
Bengo (província que foi alvo do presente estudo), Zaire, Cunene, Kwanza (um dos focos
principais da schistosomose por S. mansoni e S. haematobium) e Rio Dande, (também foi
alvo do presente estudo). Tanto o Rio Kwanza como o Zaire são frequentemente
utilizados em diversas atividades (Figura 11), incluindo turísticas, devido à sua vasta
extensão de navegabilidade.
Introdução
19
Figura 10 - Bacia hidrográfica de Angola
(https://www.ezilon.com/maps/images/africa/Angola)
Figura 11 – Atividades diárias da população no Rio Bengo
(Foto I. Jeremias, 05/07/2016)
Introdução
20
1.2.2 - Breve caraterização geográfica e sociodemográfica de Angola
Angola está localizada geograficamente na zona climática tropical quente na costa
ocidental da África Austral a Sul do Equador, entre os paralelos 04º 22’ e 18º 02’de
latitude Norte (N) e Sul (S), o que lhe confere apenas duas estações climáticas distintas
no ano, a época chuvosa, quente e húmida que vai de setembro a abril e a época fria e
seca (cacimbo), de maio a setembro. As temperaturas variam de 18ºC a 37ºC durante o
ano.
O país ocupa uma área de 1.246.700 km2, com uma costa de 1.650 km e uma
fronteira terrestre de 4.837 km, tendo os seguintes limites territoriais politicamente
divididos: a norte a República Democrática do Congo (RDC) e a República do Congo
(RC); a sul a República da Namíbia, a este a RDC e República da Zâmbia, e a oeste o
Oceano Atlântico. Possui ainda uma fronteira descontínua, a do território de Cabinda,
com 421 Km, que faz fronteira com dois países a RC e a RDC em 201 Km.
A sua divisão político-administrativa compreende 1.271 povoações, 536
comunas, 164 municípios e 18 províncias, nomeadamente: Bengo, Benguela, Bié,
Cabinda, Cunene, Huambo, Huíla, Kwanza Norte, Kwanza Sul, Kuando Kubango, Lunda
Norte, Lunda Sul, Malange, Moxico, Namibe, Uíge, Zaire e Cabinda. É um país
multicultural e multilinguístico, tendo o português como língua oficial e conta com nove
grupos etno linguísticos, com mais de 18 línguas nacionais. A população residente é
estimada em aproximadamente 25 milhões de habitantes, sendo o índice de juventude da
população (percentagem da população com menos de 20 anos de idade) estimado em 60%
(PNUD, 2005); FNUAP, 2017). Cerca de 37% da população vive abaixo da pobreza e a
taxa de alfabetização é de 42%. A igualdade de género continua a ser um grande desafio
a nível nacional, sobretudo em termos de acesso à escola secundária, com um ratio de
cinco meninos para cada menina (PNUD, 2010).
O perfil epidemiológico do país é caracterizado pelas grandes endemias
nomeadamente a Malária, Tuberculose, HIV, doenças tropicais negligencias (DTN) com
destaque para a Schistosomose, Filarioses e Geohelmintoses, com efeitos negativos
consideráveis a nível familiar e geral (PNUD, 2010).
A situação de instabilidade vivida em Angola entre 1975 e 2002, caracterizada
Introdução
21
por um conflito militar que durou quase trinta anos, com consequente destruição e
degradação das infraestruturas económicas e sociais, debilitando o funcionamento dos
serviços de saúde, educação e proteção social (MINPLAN, 2005). Quanto ao sistema de
saúde, existe um médico por 10.000 habitantes, sendo de 13 o número de enfermeiros por
10.000 habitantes. Os gastos totais do governo em saúde foram de 6,68% entre 2001 a
2012, tendo as despesas da saúde variado de 2,7% a 3,40% do PIB, valores que são
considerados ainda muito baixos (PNUD, 2010; WHO, 2013b). Quanto aos indicadores
de desenvolvimento humano e apesar da evolução do rendimento per capita na última
década, ainda se situam abaixo dos valores de referência (HDR Report, 2013).
A maior parte da população tem baixo nível de escolaridade e consequentemente
baixas condições socioeconómicas. De acordo com a UNPAF (2015-2019), o acesso a
serviços públicos básicos, nomeadamente água, energia, saúde, educação, saneamento e
habitação, apesar de estar a melhorar, ainda continua limitado. Estima-se que apenas 43%
da população tenha acesso a água potável (WHO, 2013b), sendo visível a assimetria entre
as regiões e uma pressão demográfica nos centros urbanos, sobrecarregando os serviços
e estruturas públicas, o que constitui um fator de limitação para o desenvolvimento
socioeconómico e humano do país. O aumento da população e as necessidades
correspondentes de energia e água, muitas vezes resultam em esquemas de
desenvolvimento e modificações ambientais e que também leva ao aumento da
transmissão da doença. Devido à ausência de rede de canalização, grande parte da
população tem contato com os rios, desenvolvendo assim as suas atividades domésticas
e profissionais como a pesca e agricultura, bem como as recreativas por parte das crianças.
Na tentativa de minimizar o problema, as autoridades regionais têm vindo a
implementar a construção de tanques de tratamento de água e fontanários; contudo, a
população continua a recorrer a cursos de água doce, dificultando as medidas preventivas
de exposição às fontes de infeção. Este aspeto reforça a necessidade de outras abordagens
de intervenção, nomeadamente, o conhecimento de fatores sociais e culturais na aceitação
e adoção de comportamentos (Barbosa, 1995; Uchôa, 2000).
Introdução
22
1.3 - Diagnóstico da schistosomose
Os métodos diretos, para a detecção e identificação de ovos de Schistosoma spp
nos excreta (urina e fezes), através da microscopia óptica, continuam a ser os mais
utilizados no diagnóstico laboratorial da schistosomose. No entanto, é reconhecida a sua
baixa sensibilidade sobretudo em casos de baixa carga parasitária ou em infeções mistas
e no caso de híbridos (Huyse et al, 2009; Oliveira et al, 2010), por isso torna-se necessário
recorrer a outros métodos complementares, nomeadamente a determinação e
identificação de antigénios ou anticorpos, bem como a detecção de fragmentos
específicos de DNA do parasita.
1.3.1 - Métodos parasitológicos
Os métodos parasitológicos utilizados para o diagnóstico da schistosomose
consistem em dois tipos, nomeadamente qualitativos, que detectam a presença de ovos
dos parasitas nas fezes e urina, e os quantitativos que, para além da identificação,
permitem quantificar o número de ovos presentes nas amostras de fezes e de urina. São
métodos pouco dispendiosos e específicos, mas a sua desvantagem reside na baixa
sensibilidade, principalmente nas áreas de baixa intensidade de parasitismo (De Vlas &
Gryssels, 1996; Barreto et al, 1990; Ebrahim et al, 1997). Os factores que concorrem para
esta limitação são, entre outros, a baixa intensidade e/ou a infeção por formas imaturas
de parasita (Cheveer & Powers, 1968; Engels et al, 1997). De acordo com Chieffi &
Kanamura (1978), os exames parasitológicos negativos não significam necessariamente
que os indivíduos não estejam infetados pelo que, ao avaliar a prevalência por meio de
técnicas parasitológicas, pode-se ter uma ideia falsa da realidade, subestimando a
prevalência real, com importantes consequências para o controlo da infeção (De Vlas &
Gryssels, 1992; Enk et al, 2008).
Em inquéritos epidemiológicos populacionais e investigações epidemiológicas, a
técnica de filtração da urina é a recomendada pela WHO (1991) para detecção e
quantificação da carga parasitária de S. haematobium (num volume de 10 ml), enquanto
o método de Kato-Katz (Katz et al., 1972) é o recomendado para as espécies responsáveis
pela schistosomose intestinal e também útil para helmintas intestinais tais como Ascaris
Introdução
23
lumbricoides, Trichuris tricuria, Ancilostomidios e Taenia sp., permitindo classificar a
intensidade do parasitismo em baixa, moderada e pesada, de acordo com o número de
ovos existentes por grama de fezes.
A utilização de métodos indiretos, como a detecção de hematúria macro e
microscópica, em estudos epidemiológicos apenas tem sido aplicada a S. haematobium,
uma vez que a presença de eritrócitos na urina, visível a olho nu (hematúria
macroscópica) ou mediante tiras reativas (hematúria microscópica), é um indicador
sensível da infeção parasitária sobretudo em crianças.
1.3.2 - Métodos imunológicos
As técnicas de imunodiagnóstico constituem alternativas aos métodos
parasitológicos e têm como alvo a detecção de antigénios parasitários ou de anticorpos
dirigidos contra esses antigénios. Das mais utilizadas destaca-se a técnica de Enzyme-
Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para o diagnóstico em massa (Oliveira et al,
2003), por apresentar baixo custo, alta reprodutividade e facilidade de execução. Outras
técnicas como a Imunofluorescência direta e indireta e reação periovular têm sido também
utilizados em alguns estudos clínicos e epidemiológicos, mas em casos mais limitados,
devido à exigência de equipamento e condições laboratoriais mais onerosos. No entanto,
os métodos imunológicos podem apresentar algumas limitações em relação à
especificidade, devido à coendemicidade com outros parasitas em muitas regiões,
induzindo a reações cruzadas. Outro inconveniente reside no facto de serem métodos
invasivos, uma vez que é necessário recorrer à colheita de sangue.
Para detecção de antigénios circulantes, geralmente recorre-se à captura de
antigénio por anticorpos monoclonais. Na maior parte utilizam-se dois dos principais
antigénios que envolvem as glicoproteínas, o antigénio circulante anódico (CAA) e o
antigénio circulante catódico (CCA) com proveniência do epitélio intestinal dos parasitas,
em que a presença destes antigénios indicam a presença de infeção ativa (Deelder &
Kornelis, 1980; De Jonge et al, 1991; Rabello, 1997). A sua principal desvantagem devia-
se ao facto de exigirem o tratamento prévio da amostra além de apresentarem uma
sensibilidade baixa no caso de baixas prevalência e intensidade da infeção, bem como o
seu alto custo. Contudo, estes aspetos parecem ter sido ultrapassados na sua atual
Introdução
24
apresentação em formato imunocromatográfico (em avaliação), a aplicar na urina, o que
poderá ser uma alternativa de fácil utilização no terreno e não invasiva (Danso-Appiah et
al, 2016) para S. mansoni e possivelmente também para S. haematobium.
1.3.3 - Métodos moleculares
Ao longo da última década, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tornou-se
uma técnica generalizada para o diagnóstico e diversos ensaios genéticos baseados em
amplificação seletiva de DNA. A técnica da PCR baseia-se na amplificação seletiva de
uma quantidade reduzida de DNA e permite obter múltiplas cópias de um segmento de
DNA. De acordo com a literatura científica, os ensaios de PCR são caracterizados por
elevadas sensibilidade e especificidade na detecção de DNA do parasita em amostras
biológicas (Enk et al, 2012).
A demonstração de que os métodos moleculares (PCR) são altamente sensíveis e
específicos para deteção de DNA de Schistosoma em amostras de urina e fezes de
humanos, permitiu um grande avanço a nível do diagnostico da parasitose (Oliveira et al,
2010; Ibironke et al, 2011). A sua principal limitação foi sempre a reduzida quantidade
de material genético disponível para o estudo. Várias técnicas de biologia molecular,
nomeadamente PCR convencional, PCR em Tempo-real, RAPD-PCR (Randon
Amplified Polymorfism), RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorfism),
Nested-PCR e Microssatélites, têm sido aplicadas atualmente à schistosomose, as quais
se descrevem resumidamente:
Técnica da PCR convencional
A PCR é uma técnica que consiste na amplificação sensível de detecção do DNA
numa amostra ou fragmento que esteja presente. Em 2001, Hamburger et al descreveram
sequências altamente repetitivas do genoma de S. mansoni. Os primeiros trabalhos sobre
a detecção de DNA especifico de Schistosoma para determinação da infeção em moluscos
hospedeiros intermediários do parasita foram publicados em 1997 (Hanelt et al, 1997;
Janotti-Passos et al, 1997).
De acordo com Alberts (1997), esta técnica veio revolucionar a Medicina Forense
por permitir a identificação do indivíduo a quem pertence a amostra pelo seu fingerprint
Introdução
25
genético. No decorrer da reação da PCR, um segmento de ácido desoxirribonucleico
(DNA) de dupla hélice ou simples é amplificado através de ciclos sucessivos. Esta técnica
está fundamentada em três reações, que ocorrem em diferentes temperaturas de incubação
e que consistem (1) na desnaturação das fitas do DNA-alvo; (2) seguida pela etapa de
hibridização das sequências de iniciadores (que são pequenas sequências de DNA
sintetizadas, complementares às sequências conhecidas de DNA-alvo); (3) e finalmente
a etapa de extensão da região flanqueada pelos iniciadores.
Apesar da sua sensibilidade e especificidade no diagnóstico de parasitoses
intestinais, a PCR apresenta algumas dificuldades quanto ao processo de extração do
DNA em fezes, devido à complexidade do material biológico uma vez que as fezes
possuem enormes quantidades de substâncias capazes de inibir a ação da enzima (Taq
polimerase) necessária para a realização do processo.
De acordo com Mullis & Faloona (1987), uma outra desvantagem reside na
possibilidade de contaminação, durante a manipulação, devido a termosensibilidade da
enzima (Taq DNA-polimerase), o que pode levar ao surgimento de bandas inespecíficas.
Substâncias como bilirrubina, etanol, complexos de polissacarídeos, sais biliares e outras
interferem significativamente na reação de PCR (Saiki et al, 1985; Monteiro et al, 1997;
Vandenberg & Oorschot, 2002).
No entanto, a otimização desta metodologia tem demonstrado a sua aplicação em
amostras fecais para detecção de S. mansoni, bem como de outras espécies causais de
schistosomose intestinal (Gomes et al, 2010; Schwarz et al, 2014, Ferrer et al, 2015;
Siqueira et al, 2015).
Nested-PCR
É uma técnica que consiste em aumentar a sensibilidade de detecção. A técnica
de PCR tem sofrido algumas adaptações, como por exemplo, a dupla amplificação
(Nested-PCR). Nesta técnica, o ensaio é realizado em duas etapas consecutivas (duas
PCRs simples). Na primeira etapa, uma sequência maior de DNA alvo é amplificada com
um par de primers (sequências iniciadoras) externos. Uma alíquota do produto de PCR
obtido, é então submetida à segunda etapa, para amplificação de uma sequência interna
do DNA alvo, usando-se um novo par de primers (internos em relação à posição de
hibridização do primeiro par utilizado). Assim, no final desta última etapa obtém-se a
Introdução
26
sequência alvo interna amplificada que pode ou não se sobrepor a uma das terminações
finais da sequência alvo maior.
É a segunda etapa de amplificação com oligonocleótidos internos que confere à
Nested-PCR especificidade e sensibilidade superiores àquelas obtidas por uma PCR
simples. A sua elevada sensibilidade torna a Nested-PCR, inclusive, altamente
recomendada para a detecção de alvos de agentes patogénicos com baixo número de
cópias, por exemplo, em amostras clínicas, de solo, de água e alimentos (Dupin et al.,
2002), e também para a detecção de Schistosoma spp em infeções leves, com baixa carga
parasitária ou em infeções ectópicas (Utzinger et al, 2015; Bruscky et al, 2016)
PCR em tempo real
A técnica de PCR em tempo real permite a visualização dos ciclos durante o curso
da amplificação, manter o registo dessa evolução e permite estimar a concentração de
DNA alvo nas amostras. Esta técnica é baseada na detecção de fluorescência, mediante a
utilização de um corante SYBER Green 1, ou recorrendo a sondas oligonucleótidas
específicas como as TaqMan (Yoshimura et al., 2005), com propriedades similares às de
um termociclador (Rivas, et al, 2001). É um método de detecção bastante usado em
ensaios de PCR quantitativo em tempo real. Os primers específicos utilizados na reação
devem ser desenhados com bastante cuidado devido o risco de amplificação de produtos
inespecíficos e formação de dímeros, pelo facto do corante ser altamente sensível e ligar-
se a qualquer DNA de dupla hélice.
Pelo facto de se realizar a monitorização em tempo real, elimina a necessidade de
detecção dos produtos amplificados por eletroforese e simplifica a PCR quantitativa pela
possibilidade de identificação do ciclo no qual a amplificação se inicia: ciclo máximo do
threshold na reação de PCR em tempo real (Ct).
Diversos estudos têm demonstrado a sua aplicabilidade no diagnóstico da
schistosomose urogenital e intestinal com resultados promissores (Vinkeles et al, 2014;
Gordon et al, 2015;; Sady et al, 2015).
Introdução
27
RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism)
RFLP-PCR é uma técnica que consiste em explorar as variações nas sequências
homólogas de DNA. A técnica baseia-se na especificidade de restrição de endonucleases
que são altamente específicas de sequências de cadeia dupla de DNA. Na análise de
RFLP, o DNA é quebrado em pedaços e digerido por enzimas de restrição; os fragmentos
resultantes da restrição são separados de acordo com os seus comprimentos por
eletroforese. A ação de restrição de enzimas produz comprimentos variáveis de
sequências menores ou polimorfismos. O RFLP é uma ferramenta importante na
impressão digital genética, na identificação de genes em caso de doenças genéticas,
mapeamento do genoma e na determinação do risco de doenças.
Os marcadores RFLP também são utilizados para diferenciar entre dois
organismos ou espécies. Ao realizar a análise de RFLP, o DNA alvo é normalmente
submetido à reação de PCR, que produz milhões de cópias de filamentos de DNA
idênticas ao original. Este DNA amplificado é combinado com um conjunto de enzimas
de restrição, que clivam o DNA em locais específicos. A aplicação desta metodologia tem
permitido aprofundar o conhecimento não só sobre a diversidade genética das populações
de Schistosoma e dos seus hospedeiros intermediários, mas também sobre a identificação
de genes potencialmente associados à suscetibilidade à infeção e a fármacos
schistosomicidas (Teodoro et al, 2011; Marques et al, 2014; Quan et al, 2015; Caldeira
et al, 2016).
1.4 - Controlo da schistosomose
A principal estratégia para o controlo da schistosomose tem sido a quimioterapia
em massa (Spear et al, 2011), reconhecendo que o acesso à água potável e saneamento
adequado continuam a ser um desafio em muitos países em desenvolvimento (Andrade,
1998). Na África, a Tunísia é o único país a ter conseguido erradicar a schistosomose,
devido ao cumprimento dos programas de controlo desde 1982, realizados em todo o país
(Rey, 2001). O tratamento e o controlo da schistosomose são baseados na administração
do Praziquantel (PZQ), no saneamento ambiental, controlo de moluscos, abastecimento
de água e na educação ambiental e em saúde. A provisão de água canalizada tem o
Introdução
28
benefício de prevenir o contato humano com coleções de água contaminadas por
cercárias. O controlo de moluscos visa reduzir a sua densidade populacional e,
consequentemente, a diminuição de cercarias no respetivo habitat.. Já a educação
ambiental e em saúde tem como objetivo fortalecer o exercício da cidadania através da
participação de toda a população no contexto e no quotidiano do controlo da
schistosomose. Com efeito, vários autores enfatizam a necessidade de enraizar as ações
educativas e o planeamento em saúde mediante o conhecimento prévio dos fatores sociais
e culturais que influenciam a aceitação e participação das populações num determinado
programa. Como nenhuma das medidas acima se tem mostrado efetiva por si só, o sucesso
do controlo da schistosomose depende de seu uso combinado, levando em conta as
peculiaridades de cada área.
Desde 1980, o Praziquantel (PZQ) tornou-se disponível e demonstrou ser um
fármaco eficaz na luta contra o schistosomose. O fármaco tem efeitos adversos mínimos
e baixo custo, sendo por esse motivo um instrumento útil em programas de saúde pública
que visam o controlo desta doença (Doenhoff, et al, 2009).
O tratamento com este anti-helmíntico não só erradica o parasita, como também
reverte a resposta inflamatória responsável pelas manifestações crónicas da doença,
(Summer et al, 2006; Mascarenhas & Castro, 2011). Os principais efeitos colaterais
referidos após administração do PZQ incluem cefaleias, náuseas, vómitos, diarreia e
cólicas abdominais cuja severidade e a sua frequência estará relacionada com a
intensidade da infeção (Polderman et al., 1984).
Este fármaco tem atividade moderada contra schistosómulos, as formas jovens do
parasita (Doenhoff et al., 2008; Manneck et al., 2010). Apesar da sua eficácia, o
tratamento não impede a reinfeção. Um dos aspetos, ainda pouco estudado, é a
possibilidade de algumas espécies de Schistosoma apresentarem resistência natural ou
induzida ao fármaco (Raso et al., 2004), o que será um problema grave uma vez que irá
comprometer o controlo nas áreas endémicas a longo prazo (King, 2006; Liang et al.,
2007). De acordo com King et al, (2006; 2007), a quimioterapia em massa pode levar à
seleção de parasitas resistentes ao PZQ em particular nas áreas de maior pressão
terapêutica.
Introdução
29
A quimioterapia em massa tem duplo benefício: reduzir a morbilidade causada
pela presença dos vermes adultos no hospedeiro humano e diminuir o número de ovos
eliminados no ambiente. Contudo, diferenças na resposta ao PZQ têm sido relatadas por
vários autores, sendo importante monitorizar eventuais alterações induzidas pelo PZQ na
genética e estrutura populacional de Schistosoma. Desde 1955 que têm sido observadas
diferenças na susceptibilidade aos fármacos específicos por estirpes geográficas de S.
mansoni (Gonnert & Vogel, 1955). Em relação ao PZQ, o primeiro caso preocupante
ocorreu no Senegal, em que se observou uma taxa de cura baixa, 18-39% (Gryseels et al,
1994 e Stelma et al, 1995). Na opinião de Doenhoff et al., (2002) a menor sensibilidade
poderá ser devida à intensidade do parasitismo e/ou a elevadas taxas de infeção e
reinfeção responsáveis pela presença concomitante de vermes imaturos e adultos,
considerando que o fármaco não afeta os vermes imaturos.
Atendendo a que o modo de ação do PZQ ainda não é totalmente conhecido, o
fenómeno de menor sensibilidade/resistência pode envolver diversos mecanismos,
nomeadamente caraterísticas genéticas naturais e/ou adquiridas, dentro da mesma espécie
(Greenberg, 2013).
1.5 - Variabilidade genética de Schistosoma spp.: implicações no controlo
A variabilidade genética inter e intra-espécies, inter e intra-populações de S.
haematobium e S. mansoni tem sido observada em variadas áreas geográficas. As
alterações fenotípicas (morfológicas), a diminuição da sensibilidade aos fármacos, as
diferenças nas infetividade aos hospedeiros definitivos e intermediários, patogenicidade
e imunogenicidade induzidas pelos parasitas, serão consequências da eventual
variabilidade genética nestas espécies (Rollinson et al, 1986; Brouwer, et al, 2003;
Norton et al, 2010; Gasmelseed et al, 2014). Estas alterações genéticas influenciam na
variação do fenótipo e consequentemente a relação hospedeiro-parasita com reflexos na
patologia e na epidemiologia (Glenn et al, 2013; Akinwale et al, 2014; Webster et al,
2015).
A redução da diversidade genética resultante da quimioterapia pode indicar que a
população será menos capaz de se adaptar a uma série de pressões quer ambientais quer
quimioterapêuticas (Tran et al., 2006; Webster et al, 2008; Gentile & Oliveira, 2008). Por
Introdução
30
outro lado, o aumento da diversidade ou a mudança genotípica pode indicar um maior
intercâmbio genético de uma população de parasitas com outras populações em áreas
geograficamente diferentes e espécies hospedeiras da schistosomose (Standley et al.,
2012a; 2012b).
Deste modo, o estudo da genética das populações, incluídos nos estudos de
programas de prevenção com quimioterapia em larga escala, contribuem para melhorar a
compreensão da diversidade genética das populações de Schistosoma, do seu fluxo
genético nos hospedeiros, assim como monitorizar qualquer alteração significativa na
população de parasitas na sequência do tratamento (Webster et al., 2008; Gower et al,
2013; Santos et al, 2015).
31
2. Objetivos
Objetivos
32
2. Objetivos
Atendendo ao facto de Angola ser um país endémico para a schistosomose e na
perspetiva de o programa de controlo ser aplicado de forma regular e de ter cobertura
nacional, torna-se necessário obter indicadores mais precisos sobre a prevalência da
parasitose, incluindo potenciais efeitos hematológicos adversos associados ao
parasitismo, assim como monitorizar a eficácia do tratamento e de outras medidas de
controlo implementadas. Neste sentido, a otimização de técnicas de diagnóstico mais
sensíveis e específicas serão um complemento adicional relevante tanto para o
diagnóstico inicial como para o controlo pós-terapêutico. Por outro lado, pouco se sabe
sobre a estrutura genética e distribuição geográfica das populações de S. haematobium e
de S. mansoni endémicas no país, conhecimento que poderá esclarecer alguns aspetos
sobre as diferenças regionais observadas pelos clínicos, a nível da resposta ao tratamento
e da patologia, particularmente no caso da schistosomose urogenital.
Deste modo, o presente estudo exploratório teve como objetivos:
Atualizar a informação sobre a ocorrência das espécies de Schistosoma spp
endémicas e as suas implicações nas comunidades das províncias de Luanda,
Bengo, Malange e Huíla;
Comparar a sensibilidade e especificidade da técnica da PCR convencional em
relação aos métodos parasitológicos, para detecção de S. haematobium e de S.
mansoni em amostras de campo, obtidas nas comunidades das províncias
referidas;
Analisar a existência de eventual variabilidade genética intraespécie e inter-
regional de isolados de ovos de S. haematobium e de S. mansoni, obtidos a partir
de amostras de urina e de fezes de residentes nas províncias de Luanda, Bengo,
Malange e Huíla, utilizando marcadores de RAPD-PCR e de microssatélites.
33
3. Material e Métodos
Material e Métodos
34
3. Material e Métodos
3.1 - Locais e população
O estudo decorreu em Angola, nas províncias de Luanda, Bengo, Malange e Huíla
(Figura 12) e incluiu utentes que acorreram ao laboratório do Instituto Nacional de Saúde
Pública (INSP) por indicação médica e a população que integrou o estudo epidemiológico
que realizámos naquelas províncias (após autorização do Ministério da Saúde, Anexo 1).
Província de Luanda
Província de Malange
Figura 12 - Províncias angolanas onde decorreu o estudo
Província da Huíla
Província do Bengo
Material e Métodos
35
3.1.1 - Província de Luanda
A Província de Luanda, onde se situa a capital Luanda, é a segunda província mais
pequena do país, em termos de dimensão, com 18.826 km2 de área, possui uma população
de aproximadamente 7,1 milhões de habitantes, com 347 pessoas por cada km2,
apresentando uma enorme assimetria geográfica em termos de densidade demográfica,
visivelmente acentuada nos municípios de Cazenga e Luanda, com 23.306 e 18.169
habitantes por km2, respetivamente. Localizada na costa do Oceano Atlântico, tem
fronteira com a província do Bengo, é composta por seis distritos (Kilamba Kiaxi,
Maianga, Rangel, Sambinzanga, Samba e Viana) e sete municípios (Cacuaco, Belas,
Cazenga, Viana, Quissama, Ícolo e Bengo e Luanda).
Estima-se que mais de 70% da população viva em zona suburbana, sendo a
província com maior crescimento económico e social, por ter sofrido poucos efeitos
durante a guerra civil. Apesar de não existirem rios de grande caudal que desemboquem
no litoral da cidade, possui vários cursos de água que formam o sistema de bacias fluviais
de Luanda. Os rios mais próximos são o Kwanza (maior rio de Angola) e o rio Bengo.
Instituto Nacional de Saúde Pública (INSP)
No INSP foi efetuado o diagnóstico parasitológico a adultos e jovens, solicitado
pelos seus médicos, por suspeita clínica de schistosomose urogenital e intestinal
(hematúria, sangue nas fezes, entre outras queixas). Estes utentes, que voluntariamente
acederam participar no estudo, foram inquiridos sobre algumas informações individuais
relevantes para o estudo, nomeadamente: idade, profissão, escolaridade, condições
socioeconómicas e conhecimento da schistosomose (Anexo 2.4).
Município da Funda (Cacuaco)
Por solicitação do Departamento de Saúde Escolar, foi efetuado um inquérito
parasitológico em crianças de idade escolar do município da Funda (pertencente à
província de Luanda), em virtude de apresentarem hematúria (Figura 13).
Material e Métodos
36
Figura 13- Escola do ensino primário da Funda/Cacuaco (Foto I. Jeremias)
3.1.2- Província do Bengo
A Província do Bengo, localiza-se no Norte do país, a 55 km de Luanda. A sua
capital é a cidade do Caxito e possui cerca de 41.000 km2, com 461 mil habitantes e é
composta por seis municípios: Ambriz, Bula Atumba, Dande, Dembos, Nambuangongo
e Pango Aluquém. O estudo decorreu no período de 10 a 15 de agosto de 2015, com
participação de adultos e escolares do ensino primário.
3.1.3 - Província de Malange
A cidade de Malange é a capital da Província que possui uma área de 98.302 Km2
e uma população de aproximadamente 998.000 habitantes. É constituída pelos municípios
de Cacuso, Caombo, Kalandula, Cambundi-Catembo, Cangandala, Cuaba, Nzogo,
Cunda-Dia-Baze, Luquembo, Marimba, Massango, Mucari, Quirima, Quela e Malange
(os dois últimos alvos do estudo). Está situada no Nordeste de Angola e a sua altitude vai
de 500 m a 1500 m. A agricultura e produção de carne bovina são as principais atividades
da população, constituída por diferentes grupos etnolinguísticos: Quimbundos, Bangalas,
Bondos e Songos que ocupam a parte Central e Sul, os Gingas a norte e Umbundos,
Quiocos, Suelas na zona do planalto. Para além da agricultura de subsistência, as
principais atividades são a caça e a pesca artesanal.
A primeira fase do estudo decorreu no período de 26 de outubro a 9 de novembro
de 2011. Foi realizada no Hospital central, na sede de Malange, bem como na escola
primária de Cahala e nas aldeias de Ngola Kabila I e II, Quela, (Figura 14), pertencentes
Material e Métodos
37
ao Município do Quela situado a 115 Km a Leste da cidade de Malange, com uma
população estimada de 15 mil habitantes. Procedeu-se ao inquérito epidemiológico de
schistosomose na população (adultos e crianças em idade escolar e adultos que acorreram
ao hospital central) e colheita de amostras biológicas (de urina, fezes e sangue). A
segunda fase decorreu em março de 2012, com a finalidade de se proceder ao controlo
pós-tratamento dos indivíduos previamente tratados com PZQ.
Figura 14 – Fonte de infeção de schistosomose Quela/Malange (Foto I. Jeremias)
3.1.4 - Província da Huíla
A província da Huíla está localizada no Sudoeste de Angola e apresenta os
seguintes limites e fronteiras: a Norte as províncias de Benguela e do Huambo, a Sul a
Província do Cunene, a Este as províncias do Bié e do Cuando Cubango e a Oeste as
províncias do Namibe e de Benguela. A sua capital é o Lubango e tem uma área de 75.002
Km2 e uma população de 680.000 habitantes, sendo a população total da província
estimada em 2,3 milhões de habitantes. A densidade populacional é de cerca de nove (9)
pessoas por Km2. O clima varia entre o tropical de altitude, no Centro Norte e no Planalto
da Humpata é o semiárido nas áreas de menor altitude. A temperatura média é entre 19º
C e 21 °C e a precipitação média entre 600 e 1200 mm3. A cidade do Lubango possui
duas estações: estação chuvosa e estação seca (cacimbo), as temperaturas oscilam entre
15°C e 19ºC, com acentuada amplitude térmica diária, ausência de pluviosidade e
Material e Métodos
38
consequentemente humidade relativa do ar muito baixa. Possui 14 municípios
nomeadamente, Caconda, Cacula, Caluquembe, Chiange, Chibia, Chicomba, Chipindo,
Cuvango, Humpata (foi alvo do estudo), Quilengues, Quipungo, Matala, Jamba e
Lubango.
Município da Humpata
Este Município tem cerca de 150 mil habitantes e uma área de 1261.25 km2, uma
densidade populacional de 24.58 habitantes /Km2 e uma altitude de 1937 m. Possui uma
considerável rede hidrográfica subterrânea que apresenta constantemente uma superfície
caudal (Figura 15). As terras são bastante férteis sendo a agricultura a sua atividade
principal.
Figura 15 - Curso de água permanente, Município da Humpata/Huíla (Foto I. Jeremias)
O estudo decorreu de 20 de agosto a 3 de setembro de 2015 no centro médico do
Município da Humpata (Figura 16) em indivíduos adultos, crianças e mulheres grávidas
que acederam àquele Centro. Os utentes que voluntariamente aceitaram participar no
estudo, foram inqueridos quanto a algumas informações individuais: idade, profissão,
escolaridade, condições socioeconómicas, conhecimento da schistosomose e presença de
hematúria, informações relevantes para o estudo (Anexo 2.4 ).
Material e Métodos
39
Figura 16 - Centro Médico do Município da Humpata/Huíla (Foto I. Jeremias) 20/08/2016
3.2 - Sensibilização da população nas províncias em estudo
Para dar inicio ao estudo, contactou-se previamente os administradores “Sobas”
das aldeias, os enfermeiros, os professores e seguidamente procedeu-se à sensibilização
da população alvo. Informou-se sobre o objetivo do estudo assim como a importância da
schistosomose e das helmintoses intestinais na saúde da população. As áreas onde
decorreu o estudo estão localizadas maioritariamente em zonas rurais, sendo a agricultura
e a pesca artesanal, as principais atividades de subsistência.
A seleção destas áreas de estudo, por indicação do MINSA, deve-se ao
conhecimento prévio sobre a elevada prevalência de schistosomose e helmintoses
intestinais na população escolar (MINSA, 2005), e à não existência de dados posteriores
sobre a situação epidemiológica. Para além disso e de acordo com os dados regionais, a
taxa de analfabetismo nesta população continua a ser elevada e a maioria reside em áreas
com condições de extrema pobreza, com deficientes condições de saneamento básico.
3.3 - Colheita e preparação de amostras biológicas (urina, fezes e sangue)
A colheita de amostras biológicas, urina, fezes e sangue, foi feita durante o pré e
pós-tratamento com PZQ, em utentes do INSP, Cacuaco, Quela e escola primária de
Malange e Humpata. As amostras foram identificadas conforme a ordem de obtenção das
Material e Métodos
40
mesmas, com número e nome do paciente. A referida colheita de material biológico
ocorreu no período entre as 10 e as 14 horas. Após a colheita os recipientes com os
produtos biológicos foram armazenados em caixas térmicas. Procedeu-se à preparação
das amostras, no laboratório do respetivo hospital ou centro de saúde, consoante a análise
a efetuar, nomeadamente:
a) Uma amostra de fezes e de urina sem conservante para análise de PCR de acordo com
Gomes et al., (2006), conservadas a -20ºC.
b) Uma amostra de fezes e de urina, conservadas em formol a 10% para os exames
parasitológicos, para detecção de ovos nas fezes e na urina.
Conservação das amostras biológicas
Todos os produtos recolhidos foram conservados em frigorífico a -20ºC. O
transporte das amostras (fezes, urina e sangue) foi realizado em caixas térmicas, contendo
gelo para o laboratório do INSP, em Luanda. As amostras para análise posterior no IHMT,
foram preparadas de sedimentos obtidos após concentração de fezes e de urina (2
alíquotas para cada amostra, uma com Etanol 70º e outra com Trizol) e conservadas a -
80ºC até ao seu transporte.
3.4 – Pesquisa de ovos de Schistosoma haematobium e detecção de hematúria
A cada indivíduo foi distribuído um recipiente descartável, com capacidade de 80
ml (Diag Testi), previamente identificado com os seus dados pessoais, no qual se
recolhiam 25 ml de urina da micção efetuada no período da manhã (das 10 às 14 horas).
As amostras de urina colhidas, uma por utente, foram centrifugadas (Figura 17) e
o depósito foi conservado e posteriormente observado, analisado para a detecção de ovos
de Schistosoma haematobium, pelo método de filtração (Mott, 1988 e WHO, 1991),
(Anexo 2.3). A intensidade da infeção (carga parasitária) foi expressa em número de ovos
de S. haematobium por 10 ml de urina e classificada em leve (1-10 ovos/10 ml), moderada
(11-49 ovos/10 ml) e pesada ( 50 ovos /10 ml).
Após as análises parasitológicas, o sedimento urinário foi dividido em duas
alíquotas, numa das quais se adicionou Trizol (para posterior análise molecular) e noutra
formol a 10% (para confirmação do diagnóstico parasitológico, se necessário). A
presença de hematúria foi efetuada imediatamente após a colheita, utilizando tiras reativas
Material e Métodos
41
(Test UX), (Figura 18).
Figura 17 - Kit para Filtração de Urina para pesquisa de S. haematobium
(Foto I. Jeremias 2016)
Figura 18 - Fitas reativas para a detecção de hematúria, (Test UX) (Foto I. Jeremias)
3.5 - Colheita e processamento das amostras de fezes
Cada participante recebeu um frasco rotulado com o número, nome e data para
a colheita de fezes, com a explicação verbal dos procedimentos da colheita de fezes. Os
produtos recolhidos foram examinados pelos métodos de Kato-Katz e de Telemann-Lima
(Figuras 19 e 20) para a detecção de ovos de S. mansoni e de helmintas intestinais (Anexos
2.1 e 2.2). A quantificação da carga parasitária foi expressa em número de ovos por grama
Material e Métodos
42
de fezes (OPG), sendo a classificação do grau de parasitismo leve, moderado e pesado,
de acordo com o cut-off definido para cada espécie de helminta (WHO, 2004). A amostra
restante foi centrifugada com água destilada e o sedimento preparado com Trizol e Etanol
70º (2 alíquotas por sedimento) e conservado (-80ºC) para posterior análise molecular.
Figura 19 – Método de Kato-Katz (Foto I. Jeremias)
Figura 20 - Método de Telemann-Lima (Foto I. jeremias)
Material e Métodos
43
3.6 - Método molecular
3.6.1- Extração de DNA para detecção de S. haematobium e S. mansoni
A fase de extração de DNA nas amostras de urina e fezes foi realizada com base
no protocolo de CTAB proposto por Stothard & Rollinson (1996), e pelo método de Trizol
(Invitrogen) com ligeiras modificações (Anexos 3.1 e 3.2).
3.6.2 Extração e precipitação de DNA de fezes e urina conservadas em Trizol
(Invitrogen)
Com a finalidade de proceder a extração de RNA para análise de RT-PCR (PCR
em Tempo Real) e garantir maior reprodutividade da técnica, as amostras de urina e fezes
foram conservadas em Trizol (Invitrogen) até se efetuar a extração de DNA pelo método
tradicional, utilizando o mesmo reagente, de acordo com protocolo e recomendações do
fabricante, com pequenas modificações. Deste modo, inicialmente colocaram-se 300 µl
de amostra do sedimento contendo ovos de S. haematobium (urina) ou de sedimento
contendo ovos de S. mansoni (fezes) em eppendorf, seguido de homogeneização com 1
ml de Trizol.
A este material contendo ovos de Schistosoma macerados, adicionaram-se cerca
de 300 µl de Etanol a 100%, seguido de agitação por inversão durante 2 minutos (min).
Seguidamente deixou-se a amostra repousar à temperatura ambiente (T. A.) por 2 a 3
minutos com posterior centrifugação a 2000 rpm durante 5 min a 4ºC. Descartou-se o
sobrenadante, lavou-se com 1ml de citrato de sódio e deixou-se repousar por 30 min à
T.A., repetindo-se a operação anterior. Em seguida a amostra foi lavada com 2 ml de
Etanol a 70% e após um período de repouso de 10 a 20 minutos à T. A. e centrifugação
(2000 rpm durante 5 min a 4ºC), retirou-se o sobrenadante, colocou-se em tubo aberto a
60º C (15 min) e adicionaram-se 50 µl de tampão TE (10mM Tris, 1 mM EDTA pH 8),
conservando-se a -80ºC até a sua utilização.
3.6.3 - Extração de DNA de fezes e urina pelo método de CTAB (Tampão Brometo de
hexadeciltrimetilamônio), descrito por Stothard & Rollinson (1996) com ligeiras
modificações.
Material e Métodos
44
De acordo com o protocolo, colocaram-se inicialmente 600 l de tampão CTAB
(2 M Tris acetato 0,05 EDTA, pH=8,3) previamente aquecido na estufa a 56,5ºC durante
10 minutos, num tubo de eppendorf, ao qual foi adicionado um volume de 10 l de
proteinase K para desproteinização da amostra. Juntou-se uma alíquota de 300 l,
previamente preparada, do sedimento positivo para S. haematobium ou para S. mansoni.
Após homogeneização, a mistura foi incubada em estufa a 55ºC, durante 90 min
com agitação regular de 15 em 15 minutos. Posteriormente, adicionou-se à mistura 600
l de Clorofórmio:Isoamyl (24:1) previamente aquecido a 56,5ºC na estufa, durante 10
minutos, e agitou-se a mistura por inversão durante 2 minutos. Seguidamente foi
submetida à centrifugação rápida separando-se a parte orgânica da fase aquosa.
Colocaram-se 800 l de Etanol gelado em novos tubos de eppendorf, transferiu-
se o sobrenadante para estes tubos e descartando-se o tubo contendo o filtrado da
centrifugação. A amostra foi submetida a centrifugação de 13000 rpm durante 20 minutos
e, após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante e procedeu-se a lavagem do pellet
adicionando 500 l de Etanol a 70%, seguido de nova centrifugação de 13000 rpm
durante 15 minutos. Após descartar o sobrenadante total, a amostra foi deixada em
repouso por 5 minutos à Temperatura Ambiente (T.A) para melhor concentração do
DNA. O pellet foi seco a 55ºC (15 min) e o DNA foi ressuspendido em 50 l de água
destilada.
3.6.4 - Quantificação e pureza do DNA
A quantificação e a pureza do DNA extraído foram avaliados com recurso ao
NanoDrop ND-1000 Espectrómetro (NanoDrop Techonologies, USA), e as amostras
foram armazenadas a -80ºC, até utilização.
3.6.5 - Análise molecular
A análise molecular das amostras obtidas foi realizada na UEI de Parasitologia
Médica/ Helmintologia e Malacologia Médicas, IHMT.
PCR convencional
Foi utilizada a técnica de PCR convencional (Hamburger et al,2001). Esta técnica
é indicada para o diagnóstico de Schistosoma spp. e outros microrganismos em situações
Material e Métodos
45
especiais onde a alta sensibilidade e especificidade são requeridas (Rabello et al, 2002).
No caso de S. mansoni a técnica de PCR foi realizada utilizando o primer especifico
SmPF (forward), com a seguinte sequência, (5´GATCTGAATCCGACCAACCG3´) e o
Primer SmPR (reverse), correspondente à seguinte sequência
(5´ATATTAACGCCCACGCTCTC 3´). A amplificação de S. mansoni ocorreu a 110 pb
(Hamburger et al, 2001) - Tabela 4. Para S. haematobium foi utilizado o primer ShDra1F
(forward) com a seguinte sequência, (5´GATCTCACCTATCAGACGAAAC3´) e o
primer ShDra1R (reverse), correspondente a seguinte sequência,
5´TCACAACGATACGACCAAC 3´. A amplificação de S. haematobium ocorreu no
fragmento de 121 pb (Lodh et al, 2014) - Tabela 1.
Tabela 1- Primers específicos utilizados na PCR convencional para detecção de S.
haematobium e respetivas sequências (Hamburger et al, 2001 e Lodh et al, 2014).
Primers Sequências Size
SmPF 5´- GATCTGAATCCGACCAACCG – 3´ 110 pb
SmPR 5´- ATATTAACGCCCACGCTCTC – 3´ 110 pb
ShDra1F 5´- GATCTCACCTATCAGACGAAAC– 3´ 121 pb
ShDra1R 5´-TCACAACGATACGACCAAC – 3´ 121 pb
Otimização
A otimização da técnica foi realizada com uma temperatura de hibridização, o
número de ciclos e a quantidade de enzima correspondente à reação de amplificação com
10 amostras que também foram utilizadas na reação normal da PCR. Como controlos
positivos, utilizou-se DNA de verme adulto de S. mansoni e, para S. haematobium, DNA
do parasita gentilmente cedido por BEI Resources (NR-31682, BEI Resources, USA).
Após a visualização de bandas nítidas (Figura 21), o protocolo foi considerado otimizado.
Material e Métodos
46
3.6.6 - Reação de PCR convencional
3.6.6.1 - Detecção de DNA de S. haematobium pela PCR
Para a deteção de DNA recorreu-se à reação descrita por Lodh et al, (2014), para
S. haematobium, que consistiu em uma MIX, em tubos de PCR, para um volume final de
25 µl [10 µl de tampão (1x Green GoTaq® Flexi Buffer, Promega), 6 µM de MgCl2,
Promega, 3 µl (1,2 µM de DnTP Promega, Primer Foward 0,5 µl (0,5 µM Promega),
Primer Reverse 0,5 µl (0,5 µM Promega), 0,5 µl (5U GoTaq® DNA Polymerase,
Promega)] e cerca de 1 µl de DNA template (5-10 ng/µl) sendo o volume final completado
com água ultrapura. O programa de amplificação para deteção de S. haematobium, teve
inicio com um ciclo de desnaturação a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 33 ciclos de
desnaturação a 95 °C durante 30 segundos, hibridização a 53 °C durante 90 segundos e
72 °C durante 1 minuto e finalizando com uma extensão de 5 minutos a 60 °C.
3.6.6.2 - Detecção de DNA de S. mansoni pela PCR
Efetuou-se a reação de amplificação descrita por Hamburger et al. (2001), que
consistiu em uma mistura, em tubos de PCR, para um volume final de 25 µl dos seguintes
reagentes: 10 µl (1x Green GoTaq® Flexi Buffer, Promega), 6 µl (6 µM de MgCl2,
Figura 21 - Gel de eletroforese a 2% de otimização da PCR, para deteção de DNA de S.
haematobium, na faixa dos 121 pb em 12 amostras (de 45 a 59) parasitologicamente
positivas e duas amostras (419 e 422) que serviram como controlo (CP+) e a amostra (NT)
corresponde ao controlo negativo (amostra sem DNA), Primer ShDra1F/R e o marcador
molecular de 100 pb.
200 bp→ 121 bp→
Material e Métodos
47
Promega), 3 µl (1,2 µM de DnTP Promega) Primer Foward 0,5 µl (0,5 µM Promega),
Primer Reverse 0,5 µl (0,5 µM Promega), 0,5 µl (5U GoTaq® DNA Polymerase,
Promega) e cerca de 1 µl (5 -10 ng/µl) de DNA template sendo o volume final completado
com água ultrapura. A reação teve inicio com um ciclo de desnaturação a 95 °C durante
10 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95 °C durante 30 segundos,
hibridização a 60ºC durante 90 segundos e a 72ºC durante 30 segundos, finalizando com
uma extensão de 5 minutos a 72ºC. Esta amplificação foi realizada em termociclador
GnBh Mechatronic Systems.
Visualização
Os produtos amplificados da PCR (10 µl) em Tampão TAE 1X (2M Tris-Acetato,
00,5 Mm EDTA, pH 8,3) foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 2% corado
com 10 µl de Brometo de Etídio (para cada 100 ml de gel), a 100 V durante 1 hora, com
marcador de 100 pb (Hypperladder II Bioline), posteriormente visualizados sob UV em
transluminador (Alphalmager HP, Alpha Innotech) e fotografados.
3.7 - Análise por RAPD-PCR
3.7.1 - Método de RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA fragments).
3.7.1.1 - Extração DNA genómico
Para a extração do DNA genómico, foram selecionada, aleatoriamente, amostras
positivas de urina e de fezes de indivíduos parasitados oriundos das províncias de Luanda
e Malange. Os ovos foram concentrados pelas técnicas de concentração usando solução
salina durante várias vezes até ficarem limpos.
A metodologia usada na extração de DNA foi similar à descrita previamente
(3.6.1), com algumas modificações (volume de reagentes, tempo de incubação).
Resumidamente, os ovos de S. haematobium foram colocados em diferentes tubos de 1,5
ml com 650 µl de tampão CTAB (2 M tris acetato 0,05 EDTA, pH=8,3) aquecido ao qual
se adicionaram 10 µl de Proteinase K e procedeu-se à maceração dos ovos. De seguida
colocaram-se os tubos na estufa durante 90 minutos, a 65ºC. No final deste tempo, foram
Material e Métodos
48
adicionados 650 µl de Clorofórmio-Isoamyl (24:1), agitou-se por inversão durante dois
minutos e centrifugou-se a 13000 rpm (23000 rcf) por alguns segundos. O sobrenadante
foi transferido para um novo tubo e adicionou-se 750 µl de etanol absoluto gelado para
que se desse a precipitação do ADN e em seguida centrifugou-se durante 20 minutos a
13000 rpm. O sobrenadante foi rejeitado e o pellet foi lavado com 500 µl de etanol a 70%
e centrifugado de novo, nas mesmas condições. Por fim, rejeitou-se o sobrenadante e o
pellet obtido foi ressuspendido em 50 µl de tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH=8).
A quantificação do ADN foi determinada recorrendo ao espectrofotómetro NanoDrop™
1000 (V3.7.1) e guardado a -20ºC, até ser utilizado.
3.7.1.2 - Amplificação de RAPD-PCR
Foram selecionados cinco primers aleatórios (Tabela 2) para a amplificação do
ADN pela técnica de RAPD-PCR, descritos por Barral et al, (1993) e Shalaby et al.,
(2011) e sequências iniciadoras (Gasmelseed et al., 2014).
Tabela 2- Marcadores RAPD utilizados (Eurofins MWG Operon), e respetivas sequências
de nucleótidos.
Primers Sequência 5 3
Primer I (A01) CAG GCC CTT C
Primer II (A02) TGC CGA GCT G
Primer III (A12) TCG GCG ATA G
Primer IV (A13) CAG CAC CCA C
Primer VI (Y20) AGC CGT GGA A
3.7.1.3 - Reação de RAPD-PCR
A amplificação foi realizada segundo a metodologia descrita por Williams et al.,
(1990) e Shalaby et al., (2011). A mistura de reação foi feita para um volume final de 25
µl, contendo uma concentração final de 3 µl (1x Green GoTaq® Flexi Buffer, Promega),
2 µl (2,5mM) de MgCl2, (Promega), 2 µl (0,2 mM) de cada dNTP, (Promega), 1,5 µl (0,15
mM) dos primers, 0,5 µl (1U de GoTaq® DNA Polymerase, Promega) e cerca de 2 µl
Material e Métodos
49
(concentração de 5-10 ng/µl de ADN de cada amostra a testar), sendo o volume final
completado com água ultrapura.
A amplificação foi realizada em termociclador (AVISO®, GmBH Mechatronic
Systems), com as seguintes condições: período de desnaturação de 5 minutos a 92ºC,
seguindo-se 35 ciclos, com 1 minuto de desnaturação a 92ºC cada, 4 minutos de
hibridização a 34ºC e 2 minutos de extensão a 72ºC. Terminados os 35 ciclos foi realizada
uma extensão final de 10 minutos a 72ºC.
3.7.1.4 - Gel de agarose a 2%
Após amplificação os fragmentos de ADN (10 l) foram submetidos a
eletroforese em gel de agarose em Tampão a 1,5% TAE 1X (2M Tris-Acetato 00,5 mM
EDTA 1mM, pH 8,3) onde foi incorporado Brometo de Etídio (0,5 µg/ml). Juntamente
com os produtos amplificados utilizou-se um marcador de massa molecular
“HypperLadder II” (Bioline) de 2000 pares de bases. A migração ocorreu a 100
V durante 2h30m e os fragmentos de ADN foram visualizados num
transluminador (Alphalmager HP, Alpha Innotech) e fotografados com luz ultravioleta
(UV). A reação de PCR foi realizada de acordo com a descrita por Shalaby et al., (2011).
3.7.1.5 - Análise dos perfis electroforéticos
Na análise da variabilidade genética foi construída uma matriz de dados binários
para os fragmentos polimórficos amplificados onde foi atribuído o valor (1) para a
presença e (0) para a ausência de bandas. As bandas visíveis foram consideradas enquanto
as de difícil resolução foram excluídas da análise. A similaridade entre as amostras das
duas províncias, Luanda e Malange, foi calculada através do Coeficiente de Similaridade
(S) (Dice’s coeficiente), de acordo com a seguinte formula: S=2a/2a+b+c, em que a
corresponde ao número de bandas partilhadas pelas amostras da mesma espécie (S.
haematobium ou S. mansoni) das duas províncias, Luanda e Malange.
3.7.1.6 - Otimização de RAPD-PCR.
Foi realizada a otimização da técnica de RAPD-PCR, com uma temperatura de
hibridização, o número de ciclos e a quantidade de enzima correspondente à reação de
Material e Métodos
50
amplificação, com 8 amostras que também foram utilizadas na reação normal da PCR.
Foi utilizado o controlo positivo do verme adulto de S. mansoni diluído a 1:10 e, para S.
haematobium, foi utilizada a amostra NR-31682 (BEI Resources, USA). Após a
visualização de bandas nítidas, o protocolo foi considerado otimizado (Figura 22).
Figura 22 – Imagem ilustrativa do gel de eletroforese 2% da otimização do RAPD-PCR
e amplificação de DNA dos ovos de S. haematobium e perfis encontrados das amostras
de Malange, usando o Primer (A02) e marcador de 2000 pb.
3.8 - Estudo populacional através da análise dos microssatélites
A amplificação das regiões dos microssatélites foi efetuada selecionando 7 pares
de loci. As sequências dos primers e as respetivas temperaturas de hibridação encontram-
se descritas nas Tabelas 4 e 13. Em cada reação de PCR foi utilizada uma mistura com 7
pares de primers, correspondentes a 14 loci, foram amplificados os fragmentos de DNA
de ovos de S. mansoni e S. haematobium. O volume das sequências utilizadas para cada
reação foi de 1µl de DNA (concentração entre 2 a 4 ng).
Para a amplificação das regiões dos microssatélites, recorreu-se a conjuntos de
primers Reverse (R) e Foward (F). Os loci foram marcados por fluorescência utilizando
6-FAM do corante (azul), VIC (verde), NED (amarelo) e PET (vermelho). As sequências
dos primers e as temperaturas de hibridação encontram-se descritas nas Tabelas 4 e 8.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
M 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
!
êê
è300pb200pb è
ê
Material e Métodos
51
Assim, para determinar a eficácia do protocolo de extração de DNA (CTAB),
utilizado para todas as amostras genotipadas, utilizaram-se sete marcadores
correspondentes a 14 loci dos microssatélites previamente caraterizados em uma única
reação de PCR multiplex de acordo com o descrito por Huyse et al, (2008). Para S.
haematobium os loci selecionados foram: C102, C131, C111, D3, C11, C116, C146 (Blair
et al., 2001 e Gower et al., 2011) - Tabela 3, nas condições de preparação especificadas
na Tabela 4.
3.8.1 - Schistosoma haematobium
Para S. haematobium foram utilizados os seguintes primers, com as respetivas
sequências e tamanhos (Tabela 3).
Tabela 3 - Microssatélites: Primers (S. haematobium), respetivas sequências e
marcadores (Blair et al., 2001; Curtis et al., 2001 e Gower et al., 2007)
Locus Fluorocromo Tamanho
Amplicão Sequência Primer TH (ºC)
C102-F 6-FAM 168-206 F- TGTCTCTGTTGAATGACCGAAT
R-TTAGATGAATAATAATGTTGAAACCAC
51ºC
C131-F PET 240-296 F-CTTGTCATTTGGGCATTGTG
R-CATGGTGAGGTTCAAACGTG
51ºC
C111-F NED 108-234 F-CCCTTGTCTTCAATGCGTTA
R-GAACGTCTAACTGGCGATCA
51ºC
D3-F VIC 217-226 F-TTCGATCTGCACTATGAAGGAC
R-TGCAAGCGAGAAGTAATCAGG
51ºC
C11-F 6-FAM 84-126 F-GGAGCGTAAAAGTAAAACAAGAACA
R- GCACCTTTCCGTTTCCTCT
51ºC
C116-F 6-FAM 263-425 F-TCGAAAAATAAAGATACACAGAGTGG
R-AGGGTGCCCTCAAAATCTCT
51ºC
C146-F PET 138-186 F-AAGCATCAGAAATGACAAATCG
R-TTGAATTCACAGGAGGCAAC
51ºC
Material e Métodos
52
3.8.1.1 - Multiplex com 7 loci
Tabela 4 - Preparação de 10x Primer mix (contendo 2 M de cada Primer)
Concentração do Primer stock: 100 M (100 mol/l)
C102_F 1 µl
C102_R 1 µl
C131_F 1 µl
C131_R 1 µl
C111_F 1 µl
C111_R 1 µl
D3_F 1 µl
D3_R 1 µl
C11_F 1 µl
C11_R 1 µl
C116_F 1 µl
C116_R 1 µl
C146_F 1 µl
C146_R 1 µl
TE buffer ou H2O 36 µl
Total volume 50 µl
3.8.1.2- Amplificação da PCR de S. haematobium
A amplificação da PCR, foi realizada com 10 µl do produto da PCR da reação
com 1 µl de DNA template (concentração de 10 ng/µl), 12,5 µl (1,6 µM) de 2x QIAGEN
Multiplex PCR, Master Mix (HotStarTaq DNA Polimerase, Multiplex PCR Buffer e
dNTP Mix), 2,5 µl (0.02 µM) de Primer 10x Primer mix (ml) L46951 (20 µM) e (0,04
µl) de cada Primer, 9 µl de H2O destilada ultrapura para completar o volume final da
reação (Tabela 5). As condições de amplificação encontram-se descritas nas Tabela 6 (a-
c).
Tabela 5- Mix do Multiplex - PCR
1-Reativação da Mix para o Multiplex PCR Por Tubo Total
Número de PCR-Tubos 1
Total Volume per PCR-Tubo (µl) 25
Template DNA (added later) (µl) 1
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix (µl) 12,5 12,5
10x primer mix (µl) 2,5 2,5
Água destilada (µl) 9 9
Volume Total (µl) 24
Volume por tubo (µl) 24
Material e Métodos
53
3.8.1.3 - Perfil da PCR-multiplex de S. haematobium
Tabelas 6 abc) - Condições de amplificação de ciclos de S. haematobium
a)
Desnaturação e HotStarTaq
DNA Ativação da Polimerase 15 min a 95°C
Numero de ciclos 40 CICLOS
Desnaturação 30’’ a 94°C
Hibridização 90’’ a T°C
Extensão 60” a 72ºC
Extensão Final 30 min 60°C
b)
Hibridização I 1º 20 CICLOS
Numero de ciclos 2 ciclos x 10
temperaturas
Desnaturação 30’’ a 94°C
Hibridização 90’’ a 60°C-
51°C
Extensão 60” a 72ºC
Extensão Final 30
min 60°C
c)
Hibridização II 2º 20 CICLOS
Numero de ciclos 20 ciclos
Desnaturação 30’’ a 94°C
Hibridização 90’’ a 50°C
Extensão 60” a 72ºC
Extensão Final 30 min 60°C
Material e Métodos
54
3.8.2 - Schistosoma mansoni
Para S. mansoni, foram selecionados os seguintes loci: SMDA28, SMD28, CA11-
1, SMS9-1, SMD25, SMD89 e SMU31768 (Durand et al., 2000; Blair et al., 2001; Curtis
et al., 2001; Gower et al., 2007), com as respetivas sequências e tamanhos - Tabela 7.
Tabela 7- Microssatélites: primers de S. mansoni, respetivas sequências e marcadores
(Blair et al., (2001; Curtis et al., 2001 e Gower et al., 2007)
Locus Fluorocromo Tamanho
Amplicão Sequência Primer TH (ºC)
SMDA2
8
FAM
92-128 F-CATGATCTTAGCTCAGAGAGCC
R-AGCCAGTATAGCGTTGATCATC
48ºC
CA11-1
PET
191-231 F-
TTCAAAACCATGAGCAATAGATAC
R-
CAACAAACAAGAAGGCTGATTAG
48ºC
SMD28
NED
230-245 F-CATCACCATCAATCACTC R-
R-TATTCACAGTAGTAGGCG
48ºC
SMU31
768
VIC
179-247 F-TACAACTTCCATCACTTC
R-CCATAAGAAAGAAACCAC
48ºC
SMD25
FAM
272-312 F-GATTCCCAAGATTAATGCC
R-GCCATTAGATAATGTACGTG
48ºC
SMS9-1
FAM
178-208 F-ATTACGATTGCACAGATACTTTTG
R-TTTCAGAAATTTGTTTCCTCCTC
48ºC
SMD89 PET 138-169 F-AGACTACTTTCATAGCCC
R-TTAAACCGAAGCGAGAAG
48ºC
3.8.2.1 - Amplificação da reação de S. mansoni
Foi efetuada a amplificação da PCR, utilizando a Mix contendo, 10 µl do produto
da PCR da reação com 1 µl de DNA template (concentração de 10 ng/µl), 12,5 µl (1,6
µM) de 2x QIAGEN Multiplex PCR, Master Mix (HotStarTaq DNA Polimerase,
Multiplex PCR Buffer e dNTP Mix), 2,5 µl (0,02 µM) de Primer 10x Primer mix (ml)
L46951 (20 µM) e (0.04 µl) de cada Primer, 9 µl de H2O destilada ultrapura para
completar o volume final da reação de acordo com a Tabela 8.
A amplificação da PCR das duas espécies nomeadamente S. mansoni e S.
haematobium, foi efetuada no termociclador GnBh Mechatronic Systems usando as
condições referidas anteriormente, de acordo com as Tabelas 6 a) b) c) e 10 a) b) c).
Material e Métodos
55
Tabela 8 - Mix do Multiplex – PCR para S. mansoni
1-Reativação Mix para o Multiplex
PCR
Por Tubo Total
Número de PCR-Tubos 1
Total Volume per PCR-Tubo (µl) 25
Template DNA (added later) (µl) 1
2x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix
(µl)
12,5 12,5
10x primer mix (µl) 2,5 2,5
Água destilada (µl) 9 9
Volume Total (µl) 24
Volume por tubo (µl) 24
3.8.2.2 - Multiplex com 7 Loci
Tabela 9 - Preparação de 10x primer mix (contendo 2 M de cada
primer). Concentração do primer stock: 100 M (100 mol/l)
SMDA28_F 1 l
SMDA28_R 1 l
SMD25_F 1 l
SMD25_R 1 l
SMD28_F 1 l
SMD28_R 1 l
SMD89_F 1 l
SMD89_R 1 l
SMU31768_F 1 l
SMU31768_R 1 l
CA11-1_F 1 l
CA11-1_R 1 l
SMS9-1_F 1 l
SMS9-1_R 1 l
TE buffer ou H2O 36l
Total volume 50l
Material e Métodos
56
3.8.2.3 - Condições da reação do ciclo de S. mansoni
Tabela 10 abc) – Condições de amplificação do ciclo de S. mansoni
a)
Desnaturação e HotStarTaq
DNA Ativação Polimerase 15 min a 95°C
Numero de ciclos 40 CICLOS
Desnaturação 30’’ a 94°C
Hibridização 90’’ a 58°C-
48ºC
Extensão 60’’ a 72°C
Extensão Final 30 min 60°C
b)
Hibridização I 1º 20 CICLOS
Numero de ciclos 2 ciclos x 10
temperaturas
Desnaturação 30’’ a 94°C
Hibridização 90’’ a 58°C-
48°C
Extensão 60’’ a 72°C
Extensão Final 30 min 60°C
c)
Hibridização II 2º 20 CICLOS
Numero de ciclos 20 ciclos
Desnaturação 30’’ a 94°C
Hibridização 90’’ a 48°C
Extensão 60’’ a 72°C
Extensão Final 30 min 60°C
Material e Métodos
57
Otimização
A otimização da técnica foi realizada com uma temperatura de hibridização, o
número de ciclos e a quantidade de enzima correspondente à reação de amplificação com
11 amostras que também foram utilizadas na reação normal da PCR (Figura 23). Foram
utilizados os controlos positivos de S. mansoni e de S. haematobium referidos
anteriormente.
Figura 23 - Imagem representativa do gel de electroforese 2%, para otimização da
técnica dos microssatélites, Loci 4, Tº 48ºC, DNA de 11 amostras positivas
parasitologicamente para S. mansoni (96-114), controlos positivo (CP+) e negativo (CN)
Visualização
Os produtos de PCR amplificados (10 μl) foram separados por eletroforese em gel
de agarose a 2%, em tampão TAE e corados com de Brometo de Etídio (10 mg/µl) para
cada 100 ml de gel, e submetidos a 130 V durante 30 minutos; posteriormente foram
visualizados sob UV no transluminador e fotografados. Após a confirmação de que as
bandas obtidas eram as esperadas e ter-se verificado a ausência de bandas inespecíficas
(o que pressupõe a boa qualidade do DNA, dos primers e do programa utilizado), seguiu-
se a fase da análise dos fragmentos.
M 96 97 98 99 100 101 110 111 112 113 114 CP+ CN
Material e Métodos
58
3.8.3 - Análise dos fragmentos e genotipagem
Com objetivo de avaliar a eventual variabilidade genética intrapopulacional das
duas espécies (S. mansoni e S. haematobium) entre as províncias estudadas, realizou-se a
fase de genotipagem que consistiu na diluição de 4 µl (0,16 µM) do produto da PCR
multiplex, adicionada à mistura 10 µl de N-Dimetil HiDi Formamide® (ABI #4311320)
Nk com GeneScan 1- 500 (ROX 500) sendo o tamanho do padrão analisado em
sequenciador automático ABI 377 e GeneScan V 3.7 (PE Applied Biosystems). Os
tamanhos dos alelos foram calculados utilizando o ABI PRISM GeneScan V 2.7 e
software Genotyper V 2.7 (Applied Biosystems) em 96 poços da placa de PCR
previamente fechada, centrifugada e posteriormente analisada pelo Size standard
LIZ500® standard (ABI #402985). Para cada espécie a diversidade genética foi
examinada através do cálculo do número de alelos, usando a análise de rarefação da
heterozigosidade esperada (diversidade genética) (He) e a heterozigosidade observada
(Ho) usando o software 6.5 GenAlEx.
3.9 – Análise estatística
Para analisar as variáveis do estudo recorreu-se ao software estatístico, IBM SPSS
Statistics (Statístical Package for the Social Sciences) versão 24 para Microsoft
Windows. Para comparação dos vários parâmetros entre os grupos diferentes, aplicou-se
o teste de Qui-quadrado (χ2) na avaliação da frequência e diferenças de parasitismo entre
os grupos da população. Quando os valores esperados eram inferiores a 5, utilizou-se o
teste de Fisher em alternativa ao teste de (χ2). Na comparação das medianas das variáveis
quantitativas entre grups independentes (por exemplo, na comparação da intensidade do
parasitismo entre os grupos populacionais - género, grupo etário aplicaram-se os testes
não paramétricos de Mann-Whitney-Wilcoxon ou de Kruskal-Wallis. O coeficiente de
Kappa foi aplicado para avaliar o grau de concordância entre as técnicas parasitológicas
e a PCR.
Para analisar a associação existente entre diferentes parâmetros recorreu-se ao
coeficiente de correlação de Spearman. O nível de significância foi de 5%.
Material e Métodos
59
3.10 - Considerações Éticas
O estudo teve a aprovação da Comissão de Ética do Ministério da Saúde de
Angola, Instituto Nacional de Saúde Pública de Angola (Anexo 1) e do Conselho
Científico do Instituto de Higiene e Medicina Tropical em Portugal.
O consentimento prévio dos adultos e dos pais ou encarregados de educações dos
menores para participação voluntária no estudo foi obtido após a leitura e explicação dos
objetivos e procedimentos do estudo (Anexo 1). Os dados dos participantes foram
codificados e analisados de forma anónima de modo a garantir a sua confidencialidade.
O tratamento foi efetuado a todos os indivíduos (crianças e adultos) parasitados por S.
haematobium e/ou S. mansoni (com PZQ, 40 mg/kg) e/ou helmintas intestinais
(Albendazol, 400 mg/kg), de acordo com as recomendações (WHO, 2006). O tratamento
adicional com Sulfato Ferroso foi efetuado de acordo com o grau de anemia.
Os procedimentos terapêuticos estiveram a cargo das equipas técnicas das
Direções Provinciais de Saúde e da ONG CONSAÚDE em Malange, província onde foi
efetuado o controlo pós-tratamento após quatro meses. Os casos em que os valores
hematológicos (hemoglobina e hematócrito, principalmente) estavam manifestamente
abaixo do normal, indicadores de anemia grave, foram encaminhados para o respetivo
hospital ou centro de saúde onde efetuaram o tratamento com Sulfato Ferroso.
60
4. Resultados
Resultados
61
4. Resultados
Os resultados apresentados neste capítulo estão subdivididos de acordo com as
metodologias utilizadas na avaliação da prevalência da schistosomose urogenital e
intestinal e análise genética dos seus agentes etiológicos. Apresentamos o perfil
sociodemográfico da população analisada em quatro províncias e a sua relação com a
infeção por S. haematobium e S. mansoni, assim como a sua associação ao estado
hematológico. Descrevemos as diferenças genéticas encontradas nos isolados destas duas
espécies nas áreas geográficas estudadas.
4.1- Caraterização e distribuição da população analisada
4.1.1 - Perfil sociodemográfico dos participantes no estudo
O estudo foi realizado em 366 indivíduos, residentes nas províncias de Luanda,
Bengo, Malange e Huíla (Tabela 11) sendo 187 do sexo feminino e 179 do sexo
masculino, com idades compreendidas entre os dois e os 75 anos (média 18,5 anos (±
12,2 DP). A maioria residia na província de Malange (39,9%), seguida da Huíla (29,9%),
Luanda (24,9%) e Bengo (6,3%). Os grupos etários maioritários correspondiam a crianças
e jovens com idade inferior aos 20 anos (67,7%), sendo os restantes (32,3%) com idade
superior. Em concordância com a idade, os estudantes constituíam o maior grupo
analisado (62%), seguido dos agricultores e comerciantes (13,7% e 12,6%,
respetivamente).
Quanto ao local de residência, a maioria dos participantes residia em comunidades
rurais (57,9%) e em bairros suburbanos (37,2%); apenas 18 (4,9%) moravam em área
urbana. De um modo geral, as condições de saneamento básico e, em particular, de água
canalizada nas respetivas habitações eram bastante deficientes, apenas 46 (12,6%)
dispunham de água na residência, enquanto 230 (62,8%) possuíam casa de banho. A
ausência destas condições essenciais foi mais acentuada nas comunidades das províncias
da Huíla e Malange.
Com exceção das variáveis referentes aos grupos etários, grau de escolaridade e
atividade profissional, observaram-se diferenças estatisticamente significativas (2,
P=000) nos restantes indicadores (género, residência, condições de saneamento básico e
água canalizada nas habitações)
Resultados
62
Tabela 11 - Perfil sociodemográfico da população analisada
Malange Luanda Huíla Bengo Totais P
Indicadores N (%) N (%) N (%) N (%) N (%)
Género ≈0,000
Masculino 105 (71,9) 44 (48,4) 21 (19,8) 9 (39,1) 179 (48,9)
Feminino 41 (28,1) 47 (51,6) 85 (80,2) 14 (60,9) 187 (51,1)
Idade (anos) NA
≤10 63 (43,2) 37 (40,7) 3 (2,8) 8 (34,8) 111 (30,3)
11-20 75 (51,4) 23 (25,3) 26 (24,5) 13 (56,5) 137 (37,4)
21-30 6 (4,1) 15 (16,5) 51 (48,1) 2 (8,7) 74 (20,2)
31-40 0 (0,0) 10 (11,0) 11 (10,4) 0 (0,0) 21 (5,7)
≥41 2 (1,4) 6 (6,6) 15 (14,2) 0 (0,0) 23 (6,3)
Escolaridade NA
Nenhuma 41 (28,1) 2 (2,2) 30 (28,4) 1 (4,4) 74 (20,2)
Ens. Primário 79 (54,1) 51 (56,0) 61 (57,5) 19 (82,6) 210 (57,4)
1º ciclo 26 (17,8) 30 (33,0) 12 (11,3) 3 (3,0) 71 (19,4)
2º ciclo 0 (0,0) 7 (7,7) 2 (1,9) 0 (0,0) 9 (2,5)
Licenciatura 0 (0,0) 1 (1,1) 1 (0,9) 0 (0,0) 2 (0,5)
Residência ≈0,000*
Urbana 0 (0,0) 17 (18,7) 1 (0,9) 0 (0,0) 18 (4,9)
Suburbana 32 (21,9) 67 (73,6) 18 (17,0) 19 (82,6) 136 (37,2)
Rural 114 (78,1) 7 (7,7) 87 (82,1) 4 (17,4) 212 (57,9)
Água canal. ≈0,000*
Sim 4 2,7) 33 (36,3) 2 (1,9) 7 (30,4) 46 (12,6)
Não 145 (97,3) 58 (63,7) 104 (98,1) 16 (69,6) 320 (87,4)
Saneamento ≈0,000*
Com WC 91 (62,3) 82 (90,1) 34 (32,1) 23 (100) 230 (65,8)
Sem WC 55 (37,7) 9 (9,9) 72 (67,9) 0 (0,0) 136 (37,2)
Profissão NA
Estudante 138 (94,5) 56 (61,5) 12 (11,3) 21 (91,4) 227 (62,0)
Agricultor 6 (4,1) 0 (0,0) 43 (40,6) 2 (8,6) 50 (13,7)
Comerciante 0 (0,0) 25 (27,5) 20 (18,9) 0 (0,0) 46 (12,6)
Doméstica 2 (1,4) 9 (9,9) 31 (29,2) 0 (0,0) 42 (11,5)
Militar 0 (0,0) 2 (2,1) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (0,3)
N=número; Ens.=ensino; *Diferenças significativas; NA=não aplicável
Resultados
63
4.2 – Resultados da análise parasitológica (urina e fezes)
4.2.1 - Prevalência de S. haematobium e de S. mansoni
A prevalência global de S. haematobium (Figura 24), pela técnica de filtração da
urina, foi de 48,4% (177/366), tendo o intervalo de confiança (IC a 95%) variado entre
43,0%-53,2%. Em relação à carga parasitária, a maioria dos indivíduos parasitados (154;
87%) apresentava grau de parasitismo moderado (< 50 ovos/10 ml de urina) e apenas 23
(13%) tinham infeção pesada (≥50 ovos/10 ml). A carga parasitária variou de 1 a 143
ovos/10 ml, sendo a mediana de 21,7 ovos/10 ml de urina de S. haematobium nos
indivíduos parasitados.
Quanto ao parasitismo por S. mansoni (Figura 25), das 145 amostras de fezes
examinadas, detetaram-se ovos do parasita em 32 (21,1%) IC a 95% 16%-30% e, à
semelhança de S. haematobium, a maioria dos parasitados tinha uma carga parasitária
leve/moderada (84,4%), correspondente a menos de 400 ovos por grama de fezes (opg),
tendo os restantes 15,6% uma carga pesada (≥400 opg). A mediana da carga parasitária
foi de 120 opg, variando de 24 a 696 ovos/grama de fezes.
Figura 24 – Prevalência de S. haematobium Figura 25 – Prevalência de S. mansoni
em 366 amostras de urina em 145 amostras de fezes
Comparando a prevalência do parasitismo a nível regional (Figura 26), a taxa mais
elevada para S. haematobium registou-se nos participantes da província do Bengo com
78,3% (18/23), seguida de Luanda com 63,7% (58/91), Malange com 58,9% e a menor
observada na Huíla, com 14,2% (15/106). No caso de S. mansoni, só foram detetados
S. haematobium
Positivo Negativo
Positivo71,3%
Negativo28,7%
S. mansoni
Positivo Negativo
Positivo 48,4%
Negativo 51,6%
Resultados
64
casos positivos em Malange e em Luanda, sendo a prevalência de 27,8% (30/108) e de
8,3% (2/24), respetivamente. Verificaram-se diferenças significativas inter-províncias
tanto para S. haematobium (2, P≈0,000) como para S. mansoni (2, P=0,015).
Figura 26 – Prevalência de S. haematobium e de S. mansoni nas províncias
de Malange, Luanda, Huíla e Bengo. (Diferenças significativas, 2, P<0,005)
4.2.2 – Prevalência da infeção schistosómica em relação ao género
O maior número de indivíduos parasitados pelos dois agentes etiológicos de
schistosomose era do género masculino (Figura 27), mas apenas no caso de infeção por
S. haematobium se observaram diferenças com significado estatístico (P=0,048) em
relação à população feminina. Com efeito, 96 (53,6%) dos casos positivos ocorreram no
grupo masculino e 81 (45,8%) no feminino. Padrão idêntico foi observado em relação à
infeção por S. mansoni, dos quais 20 (23,8%) eram da população masculina e 12 (19,7%)
da feminina. Contudo, neste caso não se verificaram diferenças estatisticamente
significativas (P=0,851). A ocorrência de infeções moderadas e pesadas foi superior na
população masculina para as duas espécies, mas sem diferenças significativas (P>0,05).
58,963,7
14,2
78,3
27,8
8,3
0,0 0,00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Malange Luanda Huíla Bengo
Pre
valê
nci
a (%
)
S. haematobium S. mansoni
Resultados
65
Figura 27 – Prevalência de S. haematobium e de S. mansoni em relação ao
género. x – diferenças significativas (P=0,048)
4.2.3 – Prevalência e intensidade do parasitismo em relação à idade
Em relação à infeção pelas duas espécies de Schistosoma, a prevalência foi mais
elevada nos grupos jovens que, no caso de S. haematobium (Figura 28), incidiu nas
crianças (<10 anos); por sua vez, foi também o grupo que apresentou maior número de
indivíduos com infeção pesada (>50 ovos/10 ml de urina. Em relação a S. mansoni, tanto
a prevalência como a carga parasitária (leve e moderada) foram superiores no grupo com
idades compreendidas entre os 11-20 anos (Figura 29); os cinco (15,6%) casos de infeção
pesada também foi observada neste grupo etário.
Figura 28 – Prevalência de S. haematobium em relação ao grupo etário Cp mod= carga parasitária moderada (1-50 ovos/10 ml); Cp pes= carga parasitária pesada (>50 ovos /10 ml)
0
20
40
60
80
100
120
S. haematobium S. mansoni S. haematobium S. mansoni
Pre
valê
nci
a (%
)
Sexo masculino Sexo feminino
Positivo Negativo
0102030405060708090
<11 11-20 21-30 31-40 >40
Grupo etário (anos)
Pre
valê
nci
a (%
)
Positivo Negativo Cp mod Cp pes
Resultados
66
Figura 29 – Prevalência de S. mansoni em relação ao grupo etário Cp leve= carga parasitária leve (1-99 ovos/g); Cp mod= carga parasitária moderada (100-399 ovos/g)
4.3 – Resultados da análise molecular
4.3.1 - Detecção de DNA de S. haematobium na urina e de S. mansoni nas fezes
A detecção de DNA parasitário pela técnica da PCR, utilizando os primers
específicos, só foi possível ser efetuada em 229 amostras de urina, para diagnóstico de S.
haematobium e em 80 amostras de fezes para S. mansoni.
Das 105 amostras de urina que tinham sido negativas pelo método de filtração,
detetou-se DNA de S. haematobium em 55 (52,4%) enquanto 112 (90,3%) das 124
amostras positivas parasitologicamente confirmaram a positividade pela PCR, com a
presença de bandas de peso molecular de 121 pb, caraterísticas do parasita (Figura 30),
sendo evidente o baixo nível de concordância entre os dois métodos (K= 0,392; P=0,057),
devido sobretudo ao resultado dos casos negativos; com efeito, apenas 50 amostras
(47,6%) foram simultaneamente negativas por filtração e PCR (Tabela 12).
Em relação à deteção de hematúria por tiras reativas, o seu grau de concordância
com a PCR também foi baixo (Tabela 12), apesar de ser estatiscamente significativo (K=
0,065; P=0,037).
Resultados
67
Figura 30. Detecção do DNA de S. haematobium na faixa dos 121pb. Amostras de 1-
6: controlos positivos de carga parasitária leve (1-2), moderada (3-4) e pesada (5-6);
amostras 7 e 17: controlos negativos; amostras 8-10: urina negativa (filtração e PCR)
e amostras 11-16 positivas para S. haematobium M- Marcador molecular com 50pb.
Tabela 12 – Comparação da sensibilidade analítica das técnicas de PCR com a filtração
e o teste de hematúria no diagnóstico de S. haematobium na urina
PCR
Urina Positivo Negativo Total K P
Filtração
Positivo 112 12 124 0,392 0,057
Negativo 55 50 105
Total 167 65 229
Hematúria
Positivo 29 4 33 0,065 0,037
Negativo 138 58 196
Total 167 62 229
K= coeficiente de Kappa; P - não significativo
Resultado semelhante verificou-se em relação a S. mansoni; das 52 amostras de
fezes negativas pelo método de Kato-Katz, 22 (42,3 %) também foram negativas pela
PCR e, das 28 positivas, 27 (96,4%) confirmaram ser positivas pela PCR, apresentando
bandas com peso molecular de 110 pb (Figura 31) correspondente ao descrito por Lodh
et al (2014). Os dois métodos apresentaram um baixo nível de concordância (K=0,313;
P=0,075), em particular nos resultados das amostras negativas (Tabela 13).
Resultados
68
Figura 31 - Detecção de DNA de S. mansoni nas fezes por PCR. Amostras 96-114
negativas por Kato-Katz; CP- controlo positivo (DNA de verme adulto de S. mansoni
diluído 1:10); CN – controlo negativo. A seta indica a banda de referência de 110 pares
de bases (tamanho esperado).
Tabela 13 – Comparação da sensibilidade analítica das técnicas de Kato-Katz
e da PCR no diagnóstico de S. mansoni nas fezes
S. mansoni - Kato-Katz
Positivo Negativo Total K P
PCR
Positivo 27 30 57 0,313 0,075
Negativo 1 22 23
Total 28 52 80
K= coeficiente de Kappa; P - não significativo
4.3.2 – Coinfecção de S. haematobium e de S. mansoni pelos métodos parasitológicos
e pela PCR
Dos participantes que tinham simultaneamente urina e fezes (n=145),
diagnosticaram-se 18 casos de coinfecção pelos métodos parasitológicos (filtração da
urina e Kato-Katz) em comparação com 27 casos detetados pela PCR, comprovando a
sensibilidade superior desta técnica (Figura 32). A maioria das infeções mistas foi
observada nos participantes das províncias de Malange (23) e da Huíla (4).
Resultados
69
Figura 32- Análise por PCR convencional para deteção de DNA de infeções mistas por
S. haematobium e S. mansoni. CPSm- controlo positivo (DNA do verme de S. mansoni
diluído 1:10); CPSh – controlo positivo (DNA de S. haematobium BEI Resources, NR-
31682). NT - controlo negativo (amostra sem DNA). As setas indicam as bandas de
referência de 110 pb e 121 pb. Amostras de 104-96 são positivas para S. mansoni e S.
haematobium
4.3.3 - Especificidade da técnica de PCR na coinfecção com outros helmintas
A presença de helmintoses intestinais concomitantes (Figura 33), em 44,8% das
amostras fecais, não afetou a sensibilidade da PCR tanto para S. haematobium como para
S. mansoni.
Figura 33 – Frequência de casos de Schistosoma em coinfecção com outros helmintas
0 10 20 30 40 50 60
Ascaris
Ancilostomídeos
Trichuris
Strongyloides
H. diminuta
H. nana
Taenidae
S.haematobium S.mansoni Positivo
Resultados
70
4.3.4 – Estimativa da prevalência de S. haematobium e de S. mansoni com as técnicas
parasitológicas e a PCR
Comparando a prevalência estimada com base nas técnicas parasitológicas e na
PCR, verificaram-se diferenças com significado estatístico (2, P≈0,000) quer para S.
haematobium quer para S. mansoni (Tabela 14). O número de casos positivos das duas
espécies detetado pela PCR foi praticamente o dobro, sobretudo para S. mansoni, do
encontrado pelas técnicas parasitológicas.
Tabela 14 – Estimativa da prevalência de S. haematobium e de S. mansoni
Técnica (N) Positivo Prevalência IC 95% P
S. haematobium (229) ≈0,000
Filtração 124 54,1% 0,48-0,60
PCR 167 72,9% 0,67-0,78
Filtração+PCR 176 76,9% 0,71-0,82
S. mansoni (80) ≈0,000
K-K 28 35,0% 0,25-0,46
PCR 57 71,3% 0,60-0,80
K-K+PCR 59 73,8% 0,63-0,82
N= número de amostras; IC 95% - intervalo de confiança a 95%; K-K=Kato-Katz
Estimativa global da prevalência da schistosomose nas províncias associando as
técnicas parasitológicas e moleculares
Considerando o número de indivíduos analisados em cada província, a
prevalência estimada de schistosomose (Figura 34), conjugando os métodos
parasitológicos e a PCR, não demonstra diferenças significativas (2, P=0,086) inter-
províncias, ao contrário do observado apenas pelos métodos parasitológicos. Acresce que
só com a inclusão da PCR foi possível identificar casos positivos de S. mansoni na
província da Huíla. Face aos resultados, qualquer das regiões poderá ser classificada
como hiperendémica para S. haematobium e mesoendémica para S. mansoni, de acordo
com o definido pela WHO (2002) e MINSA (2005).
Resultados
71
Figura 34 – Prevalência estimada das infeções por S. haematobium e
S. mansoni conjugando os métodos parasitológicos e moleculares (PCR)
4.3.5 – Controlo pós-terapêutico em Malange e Luanda
A avaliação da schistosomose, quatro meses após o tratamento com Praziquantel,
só foi efetuada nas províncias de Malange e de Luanda, pelos métodos parasitológicos e
PCR. Participaram 94 indivíduos (a maioria menores de 20 anos e do género masculino),
dos quais 34 tinham sido tratados na primeira observação. Destes, 25 (73,5%) e 13
(39,3%), continuavam infetados por S. haematobium e S. mansoni, respetivamente
(Tabela 15). Dos 60 que participaram exclusivamente nesta observação, 41 (68,3%)
estavam infetados por S. haematobium e 20 (33,8%) por S. mansoni. Estes valores são
resultantes da associação das técnicas parasitológicas e da PCR.
Tabela 15 – Controlo pós-tratamento em Malange e Luanda
S. haematobium S. mansoni
N Positivo (%) N Positivo (%)
Pós-tt 34 25 (73,5) 33 13 (39,3)
Sem tt 60 41 (68,3) 59 20 (33,8)
Total 94 66 (73,5) 92 33 (35,8)
Pós-tt=pós-tratamento
72,5
83,376,2
100,0
66,7
15,8 17,5
0,00
20
40
60
80
100
120
Malange Luanda Huíla Bengo
Pre
valê
nci
a (%
)
S. haematobium S. mansoni
Resultados
72
4.4 – Análise hematológica e estado parasitológico
Na análise dos indicadores hematológicos e parasitológicos, foram excluídos os
participantes com hemoglobinopatias (como a drepanocitose) ou com outras infeções
(exemplo: por Plasmodium spp).
Dos parâmetros hematológicos determinados, salientam-se os mais utilizados na
avaliação da anemia: a concentração de hemoglobina (HGB) e a do hematócrito (HCT).
Tanto na infeção por S. haematobium (Figura 35) como por S. mansoni (Figura 36), os
indivíduos parasitados apresentavam níveis de HGB e de HCT inferiores aos não
infetados (parâmetros normais), mas as diferenças só foram significativas em relação ao
HCT (Teste de Mann-Whitney, P=0,048).
Figura 35 – Comparação dos níveis de hemoglobina e hematócrito de acordo
com o parasitismo por S. haematobium.
HGB=hemoglobina (diferenças não significativas; Mann-Whitney, P=0,067)
HCT=hematócrito (diferenças significativas; P=0,048)
Resultados
73
Por sua vez, a concentração destes parâmetros variou na razão inversa da carga
parasitária (ao aumento da carga parasitária correspondia a diminuição da concentração),
mas a correlação negativa só foi significativa para HCT na infeção por S. mansoni (Teste
de Spearman, ro= -0,258; P=0,025).
Figura 36 – Correlação dos níveis de hemoglobina (HGB) e do hematócrito
(HCT) com a carga parasitária de S. mansoni (opg);
HCT - correlação negativa e significativa HCT (ro=-0,258; P=0,025)
opg=nº de ovos por grama de fezes
A infeção pelas duas espécies de Schistosoma parece ser o co-fator agravante da
anemia, uma vez que nos indivíduos apenas parasitados por geohelmintas, os níveis de
hemoglobina e do hematócrito não diferiam significativamente dos não parasitados
(Figura 37), embora os valores fossem inferiores na presença de infeção e mais
acentuados em situações de coinfecção por dois geohelmintas.
Resultados
74
Figura 37 - 0=negativo; 1,00= monoinfeção; 2,00=coinfecção por
duas espécies HGB=hemoglobina; HCT=hematócrito (teste Kruskal-Wallis, P>0,05)
4.5 – Caraterísticas sociodemográficas associadas à infeção por Schistosoma spp.
Na análise da relação entre as condições sociodemográficas com o estado da
infeção schistosómica (Tabela 16), foi evidente o maior número de infetados pelas duas
espécies nos participantes mais jovens, dos primeiros anos de escolaridade (primária e 1º
ciclo), residentes em zonas rurais e suburbanas e com condições precárias a nível de água
canalizada nas habitações. No entanto, as diferenças entre os grupos não foram
estatisticamente significativas.
Resultados
75
Tabela 16 - Condições sociodemográficas associadas ao estado parasitológico
S. haematobium P S. mansoni P
Indicadores Pos (%) Neg (%) Pos (%) Neg (%)
Género 0,383 0,104
Masculino 117 (50,6) 62 (45,9) 30 (50,0) 54 (63,5)
Feminino 114 (49,4) 73 (54,1) 30 (50,0) 31 (36,5)
Idade (anos) 0,000* 0,240
≤10 86 (37,2) 25 (18,5) 24 (40,0) 33 (38,8)
11-20 91 (39,4) 46 (34,1) 17 (28,4) 35 (41,2)
21-30 36 (15,6) 38 (28,1) 12 (20,0) 11 (12,9)
31-40 7 (3,0) 14 (10,4) 5 (8,3) 2 (2,4)
≥41 11 (4,8) 12 (8,9) 2 (3,3) 4 (4,7)
Escolaridade 0,005* 0,418
Nenhuma 43 (18,6) 31 (23,0) 19 (31,7) 23 (27,1)
Prim+1ºciclo 145 (62,8) 65 (48,1) 31 (51,7) 40 (47,1)
>=2º ciclo 43 (18,6) 39 (28,9) 10 (16,6) 22 (25,8)
Residência 0,001* 0,388
Urbana 5 (2,2) 13 (9,6) 4 (6,6) 4 (4,7)
Suburbana 96 (41,6) 40 (29,6) 13 (21,7) 27 (31,8)
Rural 130 (56,2) 82 (60,8) 43 (71,7) 54 (63,5)
Água canal. 0,506 0,661
Com 27 (11,7) 19 (14,1) 7 (11,7) 8 (9,4)
Sem 204 (88,3) 116 (85,9) 53 (88,3) 77 (90,6)
Saneamento 0,390 0,199
Com WC 149 (64,5) 81 (60,0) 31 (51,7) 53 (62,4)
Sem WC 82 (35,5) 54 (40,0) 29 (48,3) 32 (37,6)
Profissão 0,000* 0,347
Estudante 170 (73,6) 57 (42,2) 39 (65,0) 65 (76,5)
Agricultor 20 (8,7) 30 (22,2) 5 (8,3) 5 (5,9)
Comerciante 18 (7,7) 29 (21,4) 9 (15,0) 11 (12,9)
Doméstica 23 (10,0) 19 (14,2) 7 (11,7) 4 (4,7)
Água canal.=água canalizada; Prim=primária; Pos=positivo; Neg=negativo;
*Diferenças significativas
Resultados
76
4.6 – Análise da variabilidade genética de isolados de S. haematobium e de S.
mansoni
4.6.1 – Análise genética por RAPD-PCR
4.6.1.1 - Análise dos fragmentos obtidos
Na análise genética das populações de S. mansoni e S. haematobium em estudo,
efetuou-se a comparação dos fragmentos amplificados obtidos pelos primers com médio
e alto nível de amplificação e que apresentaram um perfil diferente dos outros. As
amostras de ovos de S. mansoni e S. haematobium foram obtidas de fezes e urina,
respetivamente, da população afetada das províncias de Luanda e Malange.Neste estudo
apenas foram analisados os perfis electroforéticos de dois dos cinco primers,
nomeadamente, os primers A01 e A02. Os restantes três foram excluídos por não
apresentarem um padrão passível de comparação.
Os resultados apresentados comparam as amostras positivas para S. haematobium
e S. mansoni em Malange. A comparação inter-regional foi efetuada apenas com as
amostras positivas de S. haematobium das províncias de Luanda e de Malange. Assim,
analisando os resultados para a província de Malange, observou-se que com o primer
A01, foi gerado um total de 20 bandas polimórficas (38,5%) e com primer A02, 14 bandas
(27%) do número total de bandas polimórficas obtidas (n=52) (Tabela 17). Para a
província de Luanda 11 (21%) foram polimórficas para o primer A01 e 7 (13,5%) para o
primer A02.
Tabela 17 - Número de bandas polimórficas encontradas para as amostras de S.
haematobium e S. mansoni aplicando os primers A01, A02
Primer A01 Primer A02 Total
S. haematobium 11 8 19
S. mansoni 9 6 15
Luanda S. haematobium 11 7 18
Total 31 21 52
Malange
Resultados
77
Os fragmentos gerados variaram entre os 100 e 800 pares de base para o primer
A01 e entre os 100 e 600 pares de bases para o primer A02 (Figuras 38 a 41).
Figura 38 – Gel de agarose a 1,5% usando o primer A01 para as amostras de S.
haematobium da província de Malange
Figura 39 – Gel de agarose a 1,5% usando o primer A02 para as amostras de
S. haematobium da província de Malange
Figura 40 - Gel de agarose a 1,5% usando o primer A01 para as amostras de
S. haematobium da província de Luanda.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1000 pb
600 pb
300 pb
100 pb
1000 pb
800 pb
300 pb
100 pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Resultados
78
Figura 41 - Gel de agarose a 1,5% usando o primer A02 para as amostras de
S.haematobium da província de Luanda.
A identificação das bandas polimórficas foi realizada na comparação de padrões
de bandas para o mesmo gel, apenas para as amostras de S. haematobium das províncias
de Luanda e Malange que foram detetadas em todos as amostras. Não foi possível a
obtenção de resultados para S. mansoni para a província de Luanda.
4.6.1.2 - Coeficiente de Similaridade (S)
Após a observação das diferenças polimórficas foi calculado o Coeficiente de
Similaridade (Dice’s Coefficient) apenas para S. haematobium das duas províncias em
estudo, Luanda e Malange. Os resultados obtidos para S. mansoni, não permitiram
calcular o coeficiente. Os dois primers A01 e A02, apresentam um coeficiente de
similaridade de 0,55 e 0,35, respetivamente (Tabela 18), sugerindo a existência de
variabilidade genética entre as duas populações de S. haematobium das duas regiões.
Tabela 18 - Coeficiente de Similaridade de Dice (S) entre as populações
de S. haematobium de e Luanda e Malange
Primer A1 Primer A2
Coeficiente de Similaridade (S) 0,55 0,35
Número de bandas presentes apenas
nas amostras de Malange 6 6
Schistosoma haematobium
Número de bandas presentes apenas
nas amostras de Luanda4 3
Número de bandas partilhadas entre
as amostras de Malange e Luanda 6 5
Resultados
79
4.6.1.3 - Análise da diversidade genética
As diferenças dos perfis de RAPD-PCR, entre as populações de S. haematobium
e obtidos de diferentes indivíduos (amostras de urina) de Luanda e Malange para o primer
A01 parecem ter produzido uma maior variabilidade genética, permitindo assim efetuar
uma análise de distância das populações em questão. No que respeita à diversidade
genética intrapopulacional observámos que a amostra M37 (Malange) é bastante diferente
das restantes, geneticamente mais próxima das de Luanda (Figura 42).
A árvore de diversidade genética foi construída usando o programa Maximum
Parsimony (PHYLIP).
Figura 42 – Diversidade genética entre as populações de S. haematobium de Luanda e
Malange aplicando o programa PHYLIP e o método de Maximum Parsimony
4.6.2 – Análise genética por microssatélites
A análise molecular dos microssatélites para S. mansoni, foi efetuada em 40
amostras de fezes positivas, conservadas em etanol, tendo cada amostra sido amplificada
para sete fragmentos de DNA microssatélites nuclear (SMD25, SMD89, SMDA28,
SMU31768, SMD28, CA11-1, SMS9-1) e, para S. haematobium, em amostras de DNA
extraídas de filtrado de urinas conservadas em etanol, de 87 doentes infectados, em que
cada amostra foi também amplificada para sete fragmentos de DNA de microssatélites
nuclear (C102, C131, C111, C11, C146, D3 e C116), pela técnica de PCR descrita
anteriormente (3.8.1); os pares de primers de microssatélite foram marcados utilizando
Resultados
80
marcadores fluorescentes 6-FAM, PET, NED e VIC. No presente estudo analisamos, no
total, 14 marcadores de microssatélites, no entanto apenas dois para S. mansoni e dois
para S. heamatobium produziram amplificação de DNA, facto que condicionou os
resultados pouco consistentes da análise de rarefação da heterozigosidade esperada (He)
e a heterozigosidade observada (Ho), quer da comparação da mesma amostra para os
diferentes marcadores quer das diversas amostras “regionais” para os vários marcadores,
limitando a obtenção de resultados mais robustos de diferenciação genética comparativa,
obtidos pela técnica de RAPD-PCR.
81
5. Discussão
Discussão
82
5. Discussão
Atendendo à ampla distribuição de S. haematobium e consequente patologia
urogenital assim como a sua coendemicidade com S. mansoni, responsável pela forma
intestinal da schistosomose, em algumas províncias do país, torna-se premente o seu
controlo, com vista à redução da morbilidade causada pela parasitose para níveis que
deixem de constituir um problema de saúde pública, meta preconizada pela OMS no plano
estratégico de 2012 a 2020 (WHO, 2013a).
O programa de controlo da schistosomose em Angola foi reiniciado em 2005, após
ter sido interrompido durante cerca de 30 anos, tendo como alvo a população escolar
infantil (5-14 anos); nesse inquérito, demonstrou-se a contínua endemicidade das duas
espécies, com prevalências de infeção de 40,6% para S. haematobium e de 4,5% para S.
mansoni, nas crianças examinadas (MINSA, 2005). Acresce que taxas de infeção
similares foram encontradas também na população juvenil e adulta em alguns estudos
posteriores, sobretudo nas regiões do centro e norte, demonstrando a transversalidade da
parasitose a todos os grupos etários (Figueiredo, 2008; Sousa-Figueiredo et al., 2012).
A eficácia das medidas de controlo, nomeadamente o tratamento em massa ou
seletivo com praziquantel (PZQ), depende não só da correta identificação dos indivíduos
infetados e a sua monitorização regular bem como das medidas complementares que
tenham sido implementadas, como distribuição de água tratada, melhoria de saneamento
básico e educação para a saúde, condições fundamentais para reduzir o contacto da
população com cursos de água e a contaminação destes com os excreta humanos (WHO,
2002; Grimes et al, 2014).
No entanto, verfica-se que o tratamento e a sua avaliação em Angola não têm sido
efetuados no país com a regularidade recomendada pela WHO (2002), facto que promove
a recorrência da parasitose com taxas idênticas à fase pré-controlo, tal como observado
por Sousa-Figueiredo et al. (2012) e Bocanegra et al. (2015) no país, assim como em
diversas áreas de endemia (Satayathum et al., 2006; Liang et al., 2006). A inclusão de
medidas adicionais, concretamente a nível do diagnóstico, poderá fornecer uma
estimativa mais concreta da situação epidemiológica para uma abordagem de controlo
mais eficaz.
Discussão
83
Os métodos parasitológicos qualitativos e quantitativos como o de Kato-Katz para
a schistosomose intestinal e a filtração da urina para a forma urogenital, são os mais
aplicados nos estudos epidemiológicos da schistosomose, permitindo estimar a
prevalência e a intensidade do parasitismo, indicadores relevantes para a estratégia de
tratamento anual ou bi-anual das crianças em idade escolar (WHO, 1998; 2006b).
Contudo, em indivíduos com baixa carga parasitária e/ou em regiões endémicas sob
controlo terapêutico periódico, os métodos parasitológicos apresentam baixa
sensibilidade, o que tem consequências diretas sobre os indivíduos infetados (não são
tratados) assim como sobre a situação da schistosomose, substimando a prevalência real
(Engels et al, 1997, 2002; WHO, 2008).
De acordo com Terer et al, (2013), a ausência de um teste de diagnóstico sensível
e eficaz para o diagnóstico de infeções assintomáticas, não é possível realizar-se uma
estimativa precisa da prevalência da doença. As técnicas moleculares baseadas na deteção
de DNA das espécies de Schistosoma nos excreta têm revelado maior sensibilidade, sendo
um complemento útil nestas situações (Pontes et al, 2003; Gomes et al., 2010; Enk et al,
2012; Ibironke et al., 2012; Lodh et al, 2014; Hessler et al, 2017 )
Os resultados do presente estudo estão em concordância com os dos autores
referidos. Com efeito, com a utilização dos métodos parasitológicos nos 366 indivíduos
das quatro províncias alvo (Luanda, Bengo, Malange e Huíla) obtiveram-se prevalências
de 48,4% (177/366) para S. haematobium e 22,1% (32/145) para S. mansoni (Figuras 24
e 25), significativamente inferiores (P≈0,000) às obtidos pela técnica da PCR, com 72,9%
e 71,3% para S. haematobium e S. mansoni, respetivamente (Tabela 14). A deteção de
DNA parasitário em amostras de urina e fezes parasitologicamente negativas, demonstrou
a elevada sensibilidade da PCR, confirmada pela presença de bandas de peso molecular
de 121 pb (S. haematobium) e de 110 pb (S. mansoni) específicas dos parasitas (Figuras
30 e 31).
De acordo com Oliveira et al, (2007) e Ibironke et al, (2011), a presença de outras
bandas, como se detetou também neste estudo (200 pb) pode ocorrer devido à elevada
quantidade de oligonucleótidos livres, complementares de uma sequência repetitiva de
DNA.
Estes resultados confirmam os que foram previamente encontrados por Jeremias
Discussão
84
et al. (2015), num estudo realizado em Angola em que num total de 142 amostras de urina
não foram encontrados ovos de S. haematobium pelos métodos parasitológicos mas o
método de PCR revelou a presença de DNA do parasita em 105 amostras de urina.
Na análise comparativa da sensibilidade analítica entre os métodos
parasitológicos e a PCR (Tabelas 12 e 13), verificou-se uma baixa concordância quer com
a filtração da urina (Kappa=0,392) quer com a técnica de Kato-Katz (Kappa=0,313),
embora com algum significado estatístico (P=0,057) no caso de S. haematobium. De
acordo com Pontes et al, (2003) os casos positivos por métodos parasitológicos e não
detetados pela PCR convencional, devem-se a vários factores como a inibição de
amplificação do DNA devido a compostos fecais, degradação do DNA da urina ou de
fezes após a colheita no campo ou durante o transporte para o laboratório, o
acondicionamento ou mesmo a ausência de ovos no material biológico analisado.
Um dos dados mais relevantes com a aplicação da técnica da PCR foi a deteção
do 10 casos de parasitismo por S. mansoni nos participantes da Huíla, enquanto que
nenhum caso foi detetado pelo Kato-Katz.
À semelhança do observado por Lodh et al (2014) no Gana e Hessler et al (2017)
na Zâmbia, também constatamos a superioridade analítica da PCR na co-infeção pelas
duas espécies, com 27 casos detetados em comparação com 18 identificados pelos
métodos diretos. Os indivíduos infetados simultaneamente pelas duas espécies eram
sobretudo das regiões do Planalto Central, Malange e Huíla. De igual modo, a
especificidade da PCR no diagnóstico da infeção schistosómica manteve-se elevada na
presença de parasitismo concomitante por geohelmintas (Figura 33).
Conjungando os resultados dos dois métodos (parasitológicos e PCR) e de acordo
com a classificação estabelecida pela WHO (2002), a situação da schistosome por S.
haematobium nas quatro províncias é considerada hiperendémica (prevalência≥50%),
enquanto para S. mansoni as regiões de Luanda e Huíla podem ser consideradas
mesoendémicas (prevalência ≥10% e <50%). A situação na província de Malange é a
mais preocupante atendendo à hiperendemicidade encontrada para as duas espécies de
Schistosoma (Figura 34). Acresce que no controlo realizado quatro meses após a
terapêutica (possível apenas em Luanda e Malange), dos 64 indivíduos tratados, 38
Discussão
85
continuavam infetados (Tabela 15). Uma vez mais, a associação dos métodos
parasitológicos e a PCR forneceu indicadores mais precisos na avaliação após o
tratamento.
Uma das principais dificuldades na monitorização dos programas de controlo em
massa reside no seguimento dos indivíduos tratados e, deste modo, poder avaliar-se a
eficácia da terapêutica a nível individual e o seu impacte a nível global. Possivelmente a
inclusão de metodologias mais sensíveis e simples de executar pelos técnicos dos centros
de saúde regionais, permitirão efetuar o follow-up periódico e tratar seletivamente os
indivíduos infetados, contribuindo para a redução da morbilidade e transmissão dos
parasitas a nível das comunidades.
De um modo geral, a schistosomose predomina em áreas onde as estruturas
sanitárias e recursos de saúde humanos e materiais são mais limitados, o que condiciona
a realização de métodos de diagnóstico como a PCR em estudos no terreno. Na perspetiva
de colmatar esta limitação, alguns métodos baseados na PCR encontram-se em fase de
validação, como a técnica de Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), que é
uma técnica de PCR baseada na tecnologia isotérmica de amplificação de ácidos
nucleicos e sem recurso a equipamentos mais sofisticados como termocicladores, e os
resultados visualizados de imediato, o que a torna passível de ser realizada em
laboratórios com menos recursos (Notomi et al, 2000).
Segundo Fernandez-Soto et al. (2014) e Lodh et al. (2014), a sensibilidade e
especificidade da técnica de LAMP no diagnóstico de infeção simples e mista (S.
haematobium e/ou S. mansoni) foram idênticas às da PCR, usada como referência. De
acordo com os resultados de Gandasegui et al. (2018), no primeiro estudo realizado no
Brasil aplicando a técnica de LAMP na deteção simultânea de S. mansoni em amostras
humanas (fezes) e em moluscos hospedeiros intermediárias (Biomphalaria straminea),
numa área de baixa transmissão, a sua sensibilidade foi bastante superior tanto na infeção
humana, comparando com o método de Kato-Katz “gold standard”, como na deteção do
parasita em moluscos, em comparação com a técnica de referência, a nested-PCR.
Além disso, mostrou ser mais económica e exequível em laboratório de campo,
devido à simplicidade de execução, interpretação dos resultados e com menos custos. Por
Discussão
86
outro lado, é cada vez mais consensual a integração destes métodos moleculares em
estudos malacológicos, uma vez que possibilitam a deteção dos parasitas nos respetivos
moluscos hospedeiros intermediários na fase pré-patente, tornando-os ferramentas
promissoras na identificação de potenciais áreas de risco e na monitorização dos
programas de controlo (Abbasi et al, 2010; Hamburger et al, 2013; Caldeira et al. 2017).
Um outro método em fase de avaliação no terreno visa a deteção de antigénio
circulante catódico (cathodic circulating antigen - CCA) na urina, excretado pelos
vermes adultos ativos de Schistosoma spp. Os resultados de estudos em curso indicam
que o método apresenta sensibilidade e especificidade elevadas para qualquer dos
agentes, embora mais pronunciada na infeção por S. mansoni. O facto de ser um teste
rápido, em formato imunocromatográfico e ser aplicado na urina, mais fácil de obter dos
participantes, e a sua relação custo-eficácia, poderá ser o método ideal para rápido
mapeamento e avaliação do controlo terapêutico nas comunidades mais remotas (Danso-
Appiah et al., 2016).
Em relação à intensidade do parasitismo, avaliada pelos métodos parasitológicos
e microscopia, os nossos resultados corroboram os de estudos anteriores (MINSA, 2005;
Figueiredo, 2014); a maioria dos participantes (87%) apresentava uma carga parasitária
moderada (<50 ovos/10 ml de urina) para S. haematobium, sendo a mediana de 21,7
ovos/10 ml. Contudo, o predomínio de infeção pesada (≥50 ovos/10 ml) verificou-se nos
adultos (≥40 anos). Quanto à carga parasitária de S. mansoni, também predominou o grau
moderado (<400 ovos/grama de fezes, mediana=120 opg) na maioria (84,4%) dos
parasitados e nas crianças e jovens com idades compreendidas entre os 11 e 20 anos.
No que respeita à distribuição da schistosomose em relação ao género e à idade,
apesar do maior número de participantes do género feminino (Tabela 11), a infeção pelas
duas espécies foi predominante no género masculino, com diferenças significativas (χ2,
P=0,048) no caso de S. haematobium (Figura 27), sobretudo nos mais jovens (≤10 anos).
É possível que esta diferença esteja relacionada com a idade e atividades (Tabela 11),
atendendo a que a maioria da população examinada pertencia aos grupos etários mais
jovens (<20 anos) e estudantes (62%), sendo o que mais contacto tinham com os cursos
Discussão
87
de água doce em atividades recretivas.
Este padrão epidemiológico é caraterístico na schistosomose nas áreas endémicas
(Zacharias et al, 2002; Palmeira et al, 2010; Tchuem Tchuenté et al, 2013; Lodh et al,
2014). Geralmente a infeção é adquirida na infância sendo também este grupo
populacional o que apresenta cargas parasitárias mais elevadas devido ao efeito
cumulativo do parasitismo resultante da exposição frequente (Rey, 1987, Webster et al.,
1997, Palmeira et al., 2010).
A intensidade da infeção é considerada um indicador da morbilidade uma vez que
existe uma correlação direta entre a carga parasitária e as manifestações clínicas da
doença (Clements et al, 2008); na ausência de tratamento, a infeção tende a evoluir para
a cronicidade, com os efeitos patológicos a nível do trato urinário e/ou intestinal,
dependendo da espécie. Por estas razões, as crianças constituem o grupo-alvo dos
programas de controlo da doença, incluindo recentemente o grupo pré-escolar (3-5 anos)
(WHO, 2013a).
No entanto, outros grupos de risco abrangem adultos cujas atividades
profissionais (agricultores, pescadores) ou domésticas obrigam a exposição frequente a
coleções hídricas infetantes (Ibironke et al, 2011), o que poderá explicar a prevalência de
cargas parasitárias pesadas por S. haematobium em indivíduos adultos agricultores,
principalmente na Huíla.
Nos participantes das quatro províncias-alvo do estudo, constata-se que a infeção
por S. haematobium continua a ser expressiva (Figura 34), com prevalências que variaram
entre 72,5% e 100% o que traduz a magnitude da parasitose em todas as províncias. A
taxa mais elevada registada na província do Bengo poderá ser devida, entre outras causas,
às condições hidrográficas e ambientais favoráveis à disseminação dos moluscos
hospedeiros intermediários. Com efeito, a província possui um número considerável de
rios, canais de irrigação, lagoas e uma barragem o que propicia o contacto frequente da
população com as águas, para as suas diversas atividades (WHO, 2002; MINSA, 2005),
sendo o risco de infeção, segundo Sousa-Figueiredo et al, (2012), consideravelmente
mais elevado na barragem (OR= 22,23) do que em rios (OR=4,72).
Ao contrário das diferenças inter-regionais e com significado estatístico (χ2,
P=0,015) obtidas com os métodos diretos, estas não se verificaram com a inclusão da
análise molecular, o que reforça a vantagem adicional desta técnica na obtenção de
Discussão
88
indicadores mais precisos sobre a prevalência real da parasitose.
Constata-se, também, que a situação epidemiológica da schistosomose urogenital
no país permanece idêntica ou até mais elevada do que há várias décadas, conforme os
registos de vários estudos efetuados por diversos autores (Mesquita, 1952; Grácio, 1977a,
b e c; Chipopa, 2000; Belo et al, 2005; Dumba, 2006; Figueiredo, 2014), entre outros.
Este facto será reflexo de situações complexas ocorridas no país e reforça a prioridade de
investimento em programas de controlo adequados.
Quanto à endemicidade de S. mansoni, aparentemente continua a ter uma
distribuição mais restrita às regiões do centro e norte do país (MINSA, 2005; Dumba,
2006), uma vez que não foram encontrados casos positivos na província do Bengo. É
possível que os casos identificados em Luanda possam ser de indivíduos originários
daquelas regiões, atendendo a que em estudos anteriores não foram detectados casos
autóctones na província de Luanda.
Das três províncias em que se detetaram casos de parasitismo pelas duas espécies,
Malange é a que apresenta as prevalências mais elevadas tanto para S. haematobium como
para S. mansoni (Tabela 11), ao passo que nas duas restantes (Luanda e Huíla), as
prevalências de S. mansoni foram consideravelmente inferiores às de S. haematobium.
De acordo com as observações dos clínicos do serviço de Urologia do Hospital
Américo Boavida em Luanda (Figueiredo, 2014), os doentes com schistosomose
urogenital oriundos de Malange apresentam, geralmente, lesões patológicas mais
frequentes e de maior gravidade, incluindo carcinomas invasivos de pior prognóstico
assim como uma resposta à terapêutica (PZQ) menos eficaz, sendo necessário, por vezes,
efetuar até cinco ciclos de tratamento. Desconhecem-se as razões para estas diferenças
mas uma das hipóteses poderá ser atribuída à infecção pelos dois agentes etiológicos,
fator sugerido por Meurs et al., (2012) perante observações similares no Senegal.
Segundo Rollinson et al., (1997) e Curtis et al., (2000), as diferenças observadas a nível
das manifestações clínicas em diversas regiões, poderá ser devida a “estirpes” de S.
haematobium e de S. mansoni dotadas de maior capacidade infetante, imunogenicidade e
patogenicidade.
Para além do parasitismo por schistosomas, verificámos também a coinfecção por
Discussão
89
helmintas intestinais em diversos indivíduos (Figura 13), com destaque para os
geohelmintas Ascaris lumbricoides, ancilostomídeos, Trichuris trichiura e Strongyloides
stercoralis, o que está em concordância com alguns estudos realizados no país (Chipopa,
2000; MINSA, 2005; Figueiredo, 2008; Bocanegra et al., 2015). A infeção concomitante
de Schistosoma com geohelmintas (e outros parasitas) ocorre com frequência em áreas
endémicas, pelo que os programas de controlo para a schistosomose integram igualmente
as geohelmintoses (WHO, 1998, Savioli et al, 2004) uma vez que afetam os grupos
populacionais com condições sociais e económicas mais precárias.
Relativamente à associação verificada entre S. haematobium e S. mansoni com
ancilostomatídeos e S. stercoralis poderá ser explicada pelo facto de ocuparem os
mesmos espaços no ambiente. Os ancilostomatídeos e Strongyloides têm preferência por
locais de clima quente e húmido como as margens dos rios ou lagoas e provavelmente as
crianças ter-se-ão infetado nestes locais, em virtude de andarem descalças nas horas do
mergulho, favorecendo a penetração das larvas destes parasitas na pele.
É reconhecido o impacte significativo que estas helmintoses provocam não só na
saúde e desenvolvimento psicomotor e cognitivo nas crianças, mas também nos adultos,
afetando a produtividade e o rendimento, contribuindo para o ciclo de pobreza,
especialmente na África Subsariana. Devido às caraterísticas biológicas destes parasitas
e, em particular, à absorção de micronutrientes e a hemotofagia dos vermes adultos de
Schistosoma spp (fêmeas), ancilostomídeos e T. trichiura, são um dos fatores causais ou
potenciais de anemia ferropénica, com repercussões no estado nutricional e imunológico,
especialmente em crianças e mulheres grávidas ou em período de amamentação (Petney
e Andrews, 1998; Faust e Craig, 2003; Bethony et al., 2006; Adenowo et al. 2016).
À semelhança de observações anteriores no país (Figueiredo, 2008; Jeremias et
al, 2010, Sousa-Figueiredo et al, 2012) e em outras áreas endémicas (Friedman et al,
2005; Ajanga et al, 2006; Bates et al, 2007), os resultados deste estudo também
evidenciam uma associação entre o parasitismo por Schistosoma spp e a presença de
anemia (Figura 36), como uma correlação negativa e significativa (ro= - 0,258; P=0,025)
com a intensidade do parasitismo, sobretudo nos casos de infeção por S. mansoni (Figura
36).
Discussão
90
Embora nesta investigação não se tenha observado uma correlação significativa
entre os helmintas intestinais e o grau de anemia (Figura 37), verificou-se que os níveis
da hemoglobina e do hematócrito eram mais baixos nos indivíduos infetados por estes
parasitas. No entanto, existem fortes evidências que comprovam que as infeções causadas
por helmintas podem contribuir para o aumento de síndromes inflamatórios, prejudicando
a eritropoiese e interferindo na mobilização das reservas do ferro e reticulo endotelial
assim como a redução da sobrevivência de eritrócitos (Shaw e Friedman, 2011).
Estas síndromes são agravadas pela infeção simultânea por vários agentes
parasitários, independentemente da carga parasitária, como demonstraram Ezeamama et
al, (2005), em um estudo realizado nas Filipinas em crianças com poliparasitismo de
baixa intensidade, a prevalência de anemia era cinco vezes superior em comparação com
as não parasitadas.
Em consequência dos efeitos negativos diretos e sinérgicos das infeções por
schistosomas e geohelmintas na etiologia da anemia ferropénica e o efeito positivo da
administração simultânea de antihelmíntico e suplemento ferroso, tem sido recomendada
a inclusão desta avaliação e aborgem terapêutica nos cuidados primários de saúde (Tohon
et al. 2008; Ayoya et al., 2012; Taylor-Robinson et al, 2015).
Quanto ao tratamento da schistosomose, o praziquantel (PZQ) é o fármaco de
eleição devido à ação schistosomicida eficaz para todas as espécies de Schistosoma
patogénicas para os humanos. Pelo facto de ser um fármaco de fácil administração (dose
única oral) e praticamente sem efeitos secundários ou mínimos, tem sido amplamente
utilizado nos programas de controlo da doença há cerca de 30 anos. No entanto, têm vindo
a ser reportados casos de possível resistência/tolerância ao PZQ, quer em regiões com
programas de controlo regulares, quer em áreas com pouca pressão terapêutica (Melman
et al, 2009; Wang et al, 2012), não se excluindo a possibilidade de existirem populações
parasitárias naturalmente tolerantes ou menos sensíveis ao fármaco e/ou à dosagem
recomendada.
De acordo com Davies et al, (2001) e Doenhoff et al, (2009), a administração de
PZQ em larga escala pode levar a novas e intensas pressões sobre o parasita, incluindo, a
seleção de parasitas fármaco-resitentes, seleção esta que pode mudar rapidamente os
fenótipos de infecciosidade e virulência do parasita bem como a estrutura genética
Discussão
91
populacional dentro de poucas gerações.
Como foi referido anteriormente, a presença de estirpes de S. haematobium
aparentemente tolerantes ao PZQ na população de Malange, levou-nos a investigar a
eventual existência de diversidade genética intrapopulacional comparativamente aos
parasitas isolados em Luanda. Os resultados da análise por RAPD-PCR sugerem
diferenças genéticas entre as duas populações parasitárias, evidenciadas pelo número de
bandas exclusivas presentes nos isolados de cada região e pelo coeficiente de similaridade
(Tabela 18) assim como pela análise da distância genética (Figura 42).
Era expectável que os valores do coeficiente de similaridade estivessem próximos
de 1, ausência de diversidade, mas curiosamente estes valores são extremamente baixos
(0,55 e 0,35 para os primers A01 e A02, respetivamente), o que sugere variação genética
inter-regional.
No entanto, a análise molecular dos microssatélites, para identificação mais
precisa de eventuais mutações a nível do DNA, produziu resultados pouco consistentes.
Dos sete pares de primers utilizados para cada amostra, 87 de S. haematobium (Tabela 3)
e 40 de S. mansoni (Tabela 7), apenas dois pares de primers para cada espécie produziram
amplificações consistentes, número insuficiente para uma análise robusta da
caracterização alélica comparativa. A presença de inibidores nas amostras biológicas
poderá ter tido influência nestas reações, uma vez que os 14 loci selecionados aplicados
em estudos anteriores (Norton et al., 2010; Gower et al., 2013), permitiram idenficar altos
níveis de diversidade genética nas populações de S. mansoni e S. haematobium em seis
países diferentes da África subsariana (Quénia, Tanzânia, Mali, Níger, Uganda e
Camarões), tanto a nível regional como continental.
Investigações de diversos autores (Webster et al, 2012; Gower et al., 2011, 2013;
Glen et al, 2013) sobre a diversidade genética populacional de Schistosoma spp. de
diferentes regiões, confirmaram a existência de um haplotipo de S. haematobium,
sugerindo que na recente história evolutiva do parasita poderá ter havido uma seleção
genética seguida de expansão da população.
A transmissão de Schistosoma spp. é complexa, resultante da inter-relação de
múltiplos fatores quer de contexto social (económicos, culturais, demográficos,
Discussão
92
comportamentais,) quer de contexto ecológico (ambientais, biológicos). Contudo, dos
diversos fatores que intervêm na transmissão de Schistosoma spp, e de outras doenças
tropicais negligenciadas (DTN), é reconhecido o peso preponderante dos determinantes
sociais e económicos, com destaque para a ausência ou deficiência no abastecimento de
água potável e de saneamento básico (UNICEF, 1998; Belo et al., 2005; WHO, 2012;
Grimes et al, 2014).
Estes fatores são responsáveis pela elevada exposição da população aos focos de
infeção hídricos e ambientais, para a realização quotidiana das suas atividades
profissionais, domésticas e de de higiene individual, assim como pela contaminação das
coleções de água e do ambiente. Para além disso, o precário status socioeconómico é um
fator limitante ao acesso a cuidados de saúde primários (Coutinho et al, 1992; King &
Bertino, 2008; King, 2010).
As condições sociodemográficas da população analisada neste estudo (Tabela16)
são demonstrativas da direta relação com a prevalência da schistosomose (e das
helmintoses intestinais). Com efeito, a maioria dos participantes residia em áreas rurais e
suburbanas com condições precárias a nível de água canalizada e saneamento básico nas
habitações, principalmente na área rural. Precisamente nesta área foi onde se observou
um maior número de casos positivos quer de S. haematobium (60,8%) em comparação
com os residentes no meio suburbano (38,1%), quer de S. mansoni (72,9% vs 20,3%). Por
sua vez, as precárias condições básicas (água e saneamento) mais comuns na área rural,
foram os fatores mais expressivos da sua relação com o estado parasitológico,
comparativamente aos que possuíam essas condições, o que explica a elevada prevalência
da parasitose.
Está demonstrado que o investimento na melhoria destas condições sociais tem
um efeito considerável na redução da schistosomose e de outras infeções parasitárias,
sendo dos pilares mais eficazes nos programas de controlo integrado (King et al, 2006;
WHO, 2009; Grimes et al, 2014).
93
6. Conclusões e
Recomendações
Conclusões e Recomendações
94
6. Conclusões e Recomendações
Os resultados obtidos neste estudo confirmam a amplitude e elevada prevalência
da schistosomose nas comunidades mais desfavorecidas social e economicamente dos
meios suburbanos e rurais do país. Atendendo à morbilidade causada pela infeção, é
fundamental que os programas de controlo tenham sustentabilidade e sejam
monitorizados regularmente nestas áreas. A obtenção de indicadores mais precisos sobre
a situação epidemiológica e o impacte das medidas de controlo são necessários para
implementação de abordagens mais seletivas e adaptadas a determinados contextos
sociodemográficos.
Perante os nossos resultados e de outros estudos efetuados consideramos de maior
importância o investimento a nível do diagnóstico, da prevenção e educação para a saúde,
e do desenvolvimento social nas comunidades de maior risco.
Em relação ao diagnóstico, é reconhecida a limitação dos métodos parasitológicos
aplicados em estudos epidemiológicos e, neste sentido, a inclusão dos métodos de
biologia molecular como a PCR podem contribuir para fornecer estimativas mais precisas
sobre a prevalência real da parasitose. Como verificámos neste estudo, a conjugação
destes métodos foi significativa, particularmente nos casos de baixa intensidade de
parasitismo não detetados nos exames por microscopia.
Nestas circunstâncias, será possível atuar de forma mais eficaz a nível do
tratamento, com efeitos positivos tanto a nível individual (impedindo a progressão da
doença) como a nível da transmissão (redução dos reservatórios dos parasitas).
Acresce que a aplicação de métodos moleculares irá permitir um melhor
conhecimento sobre a estrutura genética das espécies de S. haematobium e de S. mansoni
endémicas e a sua eventual diversidade, informações que poderão ser relevantes no
contexto clínico, terapêutico e na farmacovigilância em programas de controlo.
Devido à distribuição geográfica de S. mansoni, poucos estudos têm sido
realizados no país sobre a magnitude da morbilidade da schistosomose intestinal. No
entanto, como constatamos, a prevalência desta espécie em certas províncias não é
negligenciável e, no caso de Malange, situa-se praticamente ao mesmo nível de S.
Conclusões e Recomendações
95
haematobium. Neste sentido, consideramos relevante a sua investigação de modo a
conhecer o seu impacte a nível clínico e epidemiológico. Com a movimentação constante
da população e as alterações hidrológicas, com a construção de novas barragens, registada
nestes últimos anos, é de admitir que tenha havido expansão da sua área de endemicidade
tradicional e consequente aparecimento de novos focos noutras regiões vizinhas. A
realização de estudos malacológicos, previamente à implementação e durante os
programas de controlo, podem fornecer dados bastante úteis e ser uma mais valia na
referenciação de potenciasis áreas de risco.
A nível das medidas de prevenção, que incidem sobretudo nas crianças em idade
escolar (5-14 anos), é fundamental a inclusão de outros grupos etários, nomeadamente
jovens e adultos com atividades profissionais de maior exposição a Schistosoma spp.
Como se constatou no presente estudo, o maior número de parasitados verificou-se em
crianças e jovens e, de acordo com os clínicos no país (Figueiredo, 2014), é frequente a
observação de lesões secundárias a nível do trajeto uretral com microgranulomas
específicos da infeção por S. haematobium em adolescentes e jovens. Assim, justifica-se
a integração deste grupo no tratamento preventivo, de forma a evitar a evolução para os
estádios mais graves da doença.
Adicionalmente, a investigação e tratamento simultâneos de morbilidades
associadas, nomeadamente as helmintoses intestinais e as resultantes direta ou
indiretamente por estas parasitoses, como a anemia por deficiência de ferro, tem
demonstrado ser uma abordagem com efeitos positivos mais rápidos a nível da saúde. Na
avaliação hematológica e parasitológica efetuada neste estudo, verificamos não só uma
elevada frequência de geohelmintoses associadas às infeções por Schistosoma spp., como
também a sua ação nos quadros de anemia.
Em relação aos fatores sociais, é fundamental maior envolvimento e investimento
das autoridades governamentais a nível provincial e central, a nível do abastecimento de
água tratada e saneamento básico nas comunidades, bem como de infraestruras sanitárias
mais acessíveis às populações.
Conclusões e Recomendações
96
A principal estratégia de controlo da schistosomose tem sido a quimioterapia em
massa com PZQ mas cedo se verificou que esta abordagem exclusiva era insuficiente para
uma redução eficaz da parasitose, sendo fundamental a integração de várias medidas.
97
7. Referências
bibliográficas
Referências bibliográficas
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7. Referências Bibliográficas
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http://geo-geografias.blogspot.pt
http:// www.newdruginfo.com
http://www.researchgate.net acesso
http//www.manole.com.br/clinica
132
8. Anexos
Anexos
133
Anexo 1- Procedimentos Éticos
Anexo 1.1 – Pedido de autorização ao Comité de Ética de Angola (3ª via)
Anexos
134
Anexo 1.2 – Pedido de Consentimento Informado aos participantes
Instituto Nacional de Saúde Pública, Luanda, Angola Instituto de Higiene e Medicina Tropical, UNL, Lisboa, Portugal
Consentimento informado para um estudo sobre
“Schistosoma spp: genética do fenótipo de fármaco-resistência ao praziquantel” Informação aos participantes e responsáveis de educação das crianças que participam no estudo Informação sobre a schistosomose As pessoas podem ter schistosomose (bilharziose), uma doença provocada por parasitas que se transmitem através do contacto com coleções de água doce, como rios, lagoas, riachos. Estes parasitas podem causar “urina com sangue”, diarreia, dores de barriga e podem tornar as pessoas mais fracas (especialmente as crianças) e sujeitas a vir a ter outras doenças, tais como anemia e outras infecções. Se as pessoas tiverem esses parasitas e não forem tratadas, podem vir a ter problemas graves como cancro da bexiga, anemia. Nas crianças pode provocar atraso de crescimento e no desenvolvimento da aprendizagem. O que nós pretendemos fazer? A schistosomose é um problema sério de saúde nas nossas comunidades. A doença precisa de ser mais estudada de forma a avaliar se o medicamento usado no tratamento é eficaz para os parasitas que causam esta doença. Para isso precisamos de recolher amostras de sangue para avaliar a hemoglobina para saber se tem anemia, bem como recolher amostras de urina e de fezes para saber se tem schistosomose e outras parasitoses intestinais que também devem ser tratadas pelos profissionais de saúde. O que tem que fazer para você/ou a sua criança participar no estudo? Gostaríamos de lhe pedir que colhesse uma amostra de fezes e de urina e respondesse a perguntas sobre o modo de vida. Além disso, gostaríamos que nos autorizasse a recolher sangue para analisar e ver se tem anemia. Quais são os benefícios do estudo? O estudo ajudará a entender melhor como é que os parasitas que causam a schistosomose reagem ao medicamento. Para além disso, o estudo vai permitir tratar todos os participantes com exames positivos para schistosomose e também outras doenças parasitárias e a anemia, caso seja necessário, pelos profissionais de saúde. O tratamento é seguro e gratuito. Quais são os riscos de participar neste estudo? Não há nenhum risco relacionado com a colheita de amostras e a observação clínica. A colheita de fezes e de urina não causa dor. A avaliação da hemoglobina causa uma pequena dor no momento da colheita de sangue. As informações sobre os resultados das amostras só serão usadas para este estudo e serão mantidas secretas. O participante pode recusar participar no estudo? Sim, pode recusar. Se recusar, não haverá nenhuma consequência negativa. O que acontecerá depois do estudo? As amostras de sangue, fezes, o valor da hemoglobina e as informações sobre o modo de vida dos participantes serão estudados. Os resultados serão transmitidos às autoridades de saúde provincial. Se ainda tiver perguntas sobre este estudo, esteja à vontade para as fazer.
Muito obrigada pela sua participação!
Anexos
135
Anexo 1.3 - Parecer do Comité de Ética de Angola
Anexos
136
Anexos
137
Anexo 2 – Técnicas parasitológicas
Anexo 2. 1 – Técnica de Kato-Katz
É um método baseado no principio de filtração, que consiste na eliminação de
constituintes fecais mais volumosos e clarificando-os com o verde malaquita-glicerina, o
que permite a contagem dos ovos de helmintas presentes (OMS, 1985; Belo, 2010b).
Material (kit Ovo-FEC®)
- Filtro de Nylon
- Espátula perfuradas
- Lâminas de vidro
- Tiras de celofane embebidas em solução de glicerina–verde malaquita
- Rolhas de catchu
- Papel absorvente
- Microscópio
Método
1. Colocar a placa perfurada sobre a lâmina de vidro formando um ângulo reto com a
mesma.
2. Com a espátula retirar uma amostra de fezes, e comprimir com a extremidade da
espátula, o que fará com que partes das fezes passem através da rede.
3. Com o auxílio da espátula, recolher as fezes que passaram pelo filtro e depositá-las no
orifício da placa, perfurada, comprimindo-as até encher o orifício central.
4. Retirar o excesso de fezes, se necessário, passando a espátula sobre a placa.
5. Levantar a placa perfurada, inclinando ligeiramente um dos extremos, de modo que
fique sobre a lâmina um cilindro de matéria fecal.
6. Colocar sobre o cilindro de matéria fecal a tira de celofane embebida em verde
malaquita e comprimir com a rolha de catchu, de modo que as fezes se distribuam
uniformemente na lâmina.
7. Manter a preparação à temperatura ambiente durante uma hora ou sob uma lâmina
acesa durante 10–20 minutos, para clarificar a amostra de fezes.
8. Examinar ao microscópio, contando os ovos encontrados na preparação por espécie de
helminta.
9. Com o auxílio da Tabela anexa, calcular o número de ovos/gramas de fezes (para cada
espécie).
Anexos
138
Tabela 19 - Cálculo de número de ovos por gramas de fezes
Nº de ovos
encontrados
na lâmina
Nº de ovos/
por grama
Nº de ovos
encontrados
na lâmina
Nº de
Ovos/grama
No. de ovos
encontrados
na lamina
Nº de
ovos /grama
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
24
48
72
96
120
144
168
192
216
240
264
288
312
336
360
384
408
432
456
480
504
528
552
576
600
624
648
672
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
864
888
912
936
960
984
1008
1032
1056
1080
1104
1128
1152
1176
1200
1224
1248
1272
1296
1320
1344
1368
1392
1416
1440
1464
1488
1512
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
1704
1728
1752
1776
1800
1824
1848
1872
1896
1920
1944
1968
1992
2016
2040
2064
2088
2112
2136
2160
2184
2208
2232
2256
2280
2304
2328
2352
Anexos
139
29
30
31
32
33
34
35
698
720
744
768
792
816
840
64
65
66
67
68
69
70
1536
1560
1584
1608
1632
1656
1680
99
100
101
102
103
104
105
2376
2400
2424
2448
2472
2496
2520
Para obter o número de ovos por grama de fezes, multiplica-se por 24 o número de ovos
encontrado na preparação microscópica.
Anexos
140
Anexo 2.2 – Técnica de Telemann-Lima
Este método permite a pesquisa e identificação de helmintas nas fezes, consistindo numa
emulsão, com duas fases distintas, uma aquosa e outra lipófila, separando as partículas
fecais nomeadamente parasitas, resíduos alimentares e bactérias (Belo, 2010b).
Material
- Água destilada
- Gaze ou rede metálica de malhas finas
- Centrifuga e respetivos tubos
- Éter;
- Rolhas de cortiça
- Copos cónicos de vidro
- Copos de vidro- Varetas de vidro
- Lâminas e lamelas de vidro
- Microscópio
Método
1. Emulsionar em cerca de 20 cm3 de água destilada o equivalente a uma colher de café
de fezes (quando sólidas) ou a uma colher de sopa (quando líquidas).
2. Coar a emulsão obtida através de duas espessuras de gaze ou rede metálica de malhas
finas.
3. Deitar o filtrado em tubos de centrifuga enchendo-o até um terço da sua altura e juntar
um volume igual de uma mistura feita com água e éter em partes iguais.
4. Tapar o tubo de centrifuga com uma rolha e agitar bem
5. Centrifugar a 1500 rpm durante 2 minutos
6. Decantar o sobrenadante
7. Examinar o sedimento recorrendo a preparações microscópicas.
Anexos
141
Anexo 2.3 - Técnica de filtração da urina
Objetivo: Pesquisa e quantificação de ovos de Schistosoma haematobium na urina.
Material
- Seringas de plástico de 10 ml
- Suportes de plástico para filtros (13 mm ou 16 mm de diâmetro)
- Filtros de policarbonato (Nucleopore®) ou de nylon (Nytrel®)
- Lâminas de microscópio
- - Pinças
- - Luvas
- - Microscópio
Método
1. Colocar o filtro no suporte.
2. Agitar ligeiramente o recipiente contendo a urina ou encher a seringa com a urina e
vaza–la de novo para o recipiente 2-3 vezes.
3. Com a seringa, aspirar 10 ml da urina (se a quantidade da amostra for inferior a 10
ml, registar o volume).
4. Adaptar à seringa o suporte contendo o filtro.
5. Mantendo a seringa na posição vertical e segurando no suporte, pressionar o êmbolo
para que a urina seja expelida através do filtro.
6. Retirar o suporte da seringa, enchê-la com ar, colocar novamente o suporte e expelir o
ar (esta operação tem por finalidade eliminar o excesso da urina e fixar melhor os ovos
ao filtro).
7. Retirar de novo suporte a seringa e com ajuda da pinça, retirar o filtro Nucleopore®) e
coloca–lo sobre a lâmina e em posição invertida.
8. Observar ao microscópio, contando os ovos presentes no filtro.
9. O resultado é expresso em nº de ovos/10 ml de urina.
Nota:Se o volume da urina analisada for inferior a 10 ml, a carga parasitária é
determinada pela seguinte equação:
Nº de ovos por 10 ml de urina = n º de ovos contados x 10
X
Onde X = volume de urina filtrada e examinada
Anexos
142
Anexo 2.4 – Ficha de inquérito
Pesquisa de Schistosoma haematobium e S. mansoni nas Províncias de Angola
Data ________________________ Ficha No____________________
Hospital/Centro__________________________________
Localidade_________________
A. Dados pessoais
Nome_____________________________________________________Idade______
Naturalidade_____________________________
Província_________________________
Residência/ Bairro__________________________ tempo de residência____________
Meio Urbano [ ] Suburbano [ ] Rural [ ] Outro [ ]
Escolaridade___________________________ Profissão________________________
Atividade agrícola: Sim [ ] Não [ ]
Rendimento: <20 $USD [ ] 20-100 $USD [ ] >100 $USD [ ]
B. Condições de Habitação
Água canalizada: Sim [ ] Não[ ] Fonte
_______________________
Casa de banho: sim [ ] Não[ ] Interior [ ] Exterior [ ]
C. Informação clínica
Gravidez: 1-Primípara [ ] Tempo de gestação: semanas_______ Faz consultas regulares:
sim [ ]
Gravidez: Multípara [ ] normal [ ] de risco [ ]
Alimentação (nº de refeições/ dia) ______
Sabe o que é a Schistosomose? Sim [ ] Não [ ]
Já teve Schistosoma? sim [ ] Tomou Praziquantel? Sim [ ] Não [
]
Anexos
143
D. Resultados laboratoriais
1 – Sangue Hemograma Valores de referência
WBC_________________ ________________
RBC _________________ ________________
HGB_________________ ________________
HCT _________________ ________________
MCV ________________ ________________
MCH ________________ ________________
MCHC _______________ ________________
PLT _________________ ________________
2. Exame de Urina: aspeto macroscópico _______________________________
Grau de hematúria: 0 [ ] 1 [ ] 2 [ ] 3 [ ] 4 [ ]
Nº de ovos de S. haematobium ________________/10 ml
3. Exame de fezes
Sangue nas fezes: sim [ ] não [ ]
Schistosoma mansoni: sim [ ] não [ ]
Helmintas A. lumbricoides [ ] nº ovos _______ovos/g ________
T. trichiuria [ ] nº ovos _______ ovos/g ________
Ancilostomideos [ ] nº ovos _______ ovos/g ________
E. vermicularis [ ] nº ovos _______ ovos/g ________
S. mansoni [ ] nº ovos _______ovos/g_________
Taenidae [ ] nº ovos _______ovos/g ________
Hymenolepis sp [ ] nº ovos _______ovos/g ________
S. stercoralis [ ] larvas _____
Observações
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
_________________________________________________________________
Anexos
144
Anexo 3 - Técnicas moleculares
Anexo 3.1 - Extração de DNA de fezes e urina pelo método de CTAB (tampão
brometo de hexadeciltrimetilamônio), descrito por Stothard et al, (1998) com
ligeiras modificações.
1. De acordo com as recomendações do fabricante, coloca-se inicialmente 600l de
tampão CTAB (2M tris acetato 0,05 EDTA, pH=8,3) previamente aquecido na estufa
56,5ºC durante 10 minutos, num tubo de ependorf.
2. Adicionar 10l de proteinase K com o objetivo de desproteinização da amostra.
3. Coloca-se uma alíquota de 300l de amostra nomeadamente, o sedimento contendo
ovos de S. haematobium (urina) ou sedimento contendo ovos de S. mansoni (fezes) em
tubo de eppendorf estéril, previamente preparada.
4. Homogeneizar muito bem.
5. Em seguida a mistura é incubada em estufa a 55ºC, durante 1h e 30 minutos agitando
de 15 em 15 minutos.
6. Posteriormente adicionou-se á mistura 600l de Clorofórmio: Isoamyl 24:1
previamente aquecido a 56,5ºC na estufa durante 10 minutos
7. Agita-se a mistura por inversão durante 2 minutos.
8. Seguidamente submete-se á centrifugação rápida separando-se a parte orgânica da fase
aquosa.
9. Coloca-se 800l de Etanol gelado em tubos novos de ependorf.
10. Transfere-se o sobrenadante para os tubos novos contendo etanol gelado e descartado
o tubo contendo o filtrado da centrifugação.
11. Amostra é submetida a centrifugação 13000 rpm durante 20 minutos. Após a
centrifugação descartou-se o sobrenadante.
12. Seguidamente procede-se a lavagem do pellet adicionando 500l de etanol a 70%.
13. Centrifuga-se novamente a 13000 rpm durante 15 minutos.
14. Descarta-se o sobrenadante total e escorrer.
15. Após esta etapa a amostra é deixada em repouso por 5 minutos á temperatura ambiente
para melhor concentração do DNA. Secar o pellet a 55ºC no máximo 15 minutos e o DNA
é ressuspendido em 50l de água destilada e conservado até sua utilização.
Anexos
145
Anexo 3.2 - Extração de DNA de fezes e urina pelo método de Trizol com ligeiras
modificações.
Extração e Precipitação do DNA
1. Retirar certa quantidade de amostra e colocar em tubos estéreis
2. Macerar o material
3. Adicionar 300 µl de etanol 100%
4. Agitar por inversão
5. Deixar a amostra repousar a temperatura ambiente por 2 a 3 minutos
6. Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos a 4°C
7. Retirar o sobrenadante
8. Lavar com 1mL de Citrato Sódio
9. Deixar repousar por 30 minutos a temperatura ambiente
10. Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos a 4°C
11. Repetir os passos 6, 7, 8 e 9
12. Descartar o sobrenadante
13. Lavar com 2 ml de etanol 70%
14. Deixar repousar 10 a 20 minutos a temperatura ambiente
15. Centrifugar a 2000 rpm por 5 minutos a 4°C
16. Retirar o sobrenadante
17. Colocar o tubo aberto a 60ºC no máximo 15min
18. Adicionar 50-100µl de tampão TE (pH 7) ou água ultrapura.
