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UNIVERSIDADE SANTA CECÍLIA
FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
CURSO DE FARMÁCIA
FLÁVIA GOMES ILLA ORNELAS
LEANDRO MOLINA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DA
FRAÇÃO DE ACETATO DE ETILA OBTIDA A PARTIR DO
RIZOMA DE Typha domingensis Pers (TYPHACEAE)
Santos - SP
Novembro/ 2010
UNIVERSIDADE SANTA CECÍLIA
FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
CURSO DE FARMÁCIA
FLÁVIA GOMES ILLA ORNELAS
LEANDRO MOLINA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DA
FRAÇÃO DE ACETATO DE ETILA OBTIDA A PARTIR DO
RIZOMA DE Typha domingensis Pers (TYPHACEAE)
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como exigência parcial para obtenção do título de Bacharel em Farmácia à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Santa Cecília, sob a orientação do Prof. Dr. Walber Toma.
Santos - SP Novembro/ 2010
FLÁVIA GOMES ILLA ORNELAS LEANDRO MOLINA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIULCEROGÊNICA DA FRAÇÃO DE ACETATO DE ETILA OBTIDA A PARITR DO RZOMA DE Typha domingensis Pers
(TYPHACEAE)
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como exigência parcial para obtenção do título de Bacharel em Farmácia à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Santa Cecília. Data da aprovação: 06 / 12 / 2010 Banca Examinadora:
Prof.(a) Maria Fernanda B. Penteado Pedroso
Prof(a) Maria Toshiko Funayama de Castro
Prof. Dr. Walber Toma Orientador
DEDICATÓRIA
A Nossas avós, Júlia e Isabel, para sempre amadas.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente queremos agradecer a Deus e todos aqueles que sempre estiveram
do nosso lado nos ajudando a seguir em frente. Ao Prof. Walber, pela dedicação e esforço, por conceder seu pouco tempo
disponível, pelo conhecimento transmitido e por acreditar na realização deste trabalho. À Eng.(a) Kátia, ao Prof. Paulo, ao pessoal dos laboratórios de química, de biologia e do herbário da Universidade Santa Cecília por toda ajuda, sempre
disponibilizando os materiais e laboratórios necessários , possibilitando a realização não só deste projeto, mas também de um sonho. A todos os Professores do curso de Farmácia Universidade Santa Cecília, por
toda dedicação e paciência, pelos ensinamentos e conhecimentos compartilhados e por deixar a maior lição de todas, ensinar a sermos pessoas melhores. Aos colegas da faculdade. Obrigado pelos momentos em que compartilhamos
sorrisos, brincadeiras e opiniões, e até mesmo pelos momentos de tristeza, pois todos eles jamais serão esquecidos. À Universidade Santa Cecília, por apoiar e viabilizar a realização deste trabalho.
E finalmente Aos Nossos pais, “Zoca” e “Léia”, Sérgio e “Bete” e nossos irmãos, Augusto, Débora e Sérgio, por acreditarem e sempre permanecerem ao
nosso lado nos momentos mais difíceis dessa longa caminhada. Obrigado,
Leandro e Flávia.
Renda-se, como eu me rendi. Mergulhe no que você não conhece, como eu mergulhei. Não se preocupe em entender, viver ultrapassa qualquer entendimento.
Clarice Lispector
RESUMO
O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo, contando com mais 55.000 espécies catalogadas, de um total de 550.000. Dentre estas espécies encontra-se a espécie Typha domingensis Pers, popularmente
conhecida como Taboa. Esta se trata de uma planta nativa da América do Sul, perene, herbácea, rizomatosa, aquática, com caule cilíndrico, podendo atingir até três metros de altura. Typha domingensis Pers vem sendo usada como depuradora
natural de ambientes aquáticos, por absorver metais pesados podendo contribuir para o saneamento ambiental. Dados etnofarmacológicos obtidos na aldeia Itaóca em Itanhaém-SP demonstram que a tribo indígena Tupi-Guarani, ali residente, utiliza Typha domingensis para o tratamento de processos inflamatórios e problemas
gástricos. Poucos são os trabalhos fitoquímicos e farmacológicos existentes relacionados à Typha domingensis. Desta forma, o presente projeto objetiva a
provável atividade antiulcerogênica da fração acetato de etila obtida a partir do rizoma de Typha domingensis e a presença de compostos polifenólicos atribuindo a
eles esta provável atividade. Após coleta e identificação da espécie pelo Herbário da Universidade Santa Cecília, os rizomas de Typha domingensis permaneceram em
estufa por 7 dias à 45°C para secagem. Após este processo os mesmos foram triturados e submetidos às extrações por maceração durante 7 dias com hexano e posteriormente acetona:água (7:3), sendo o extrato polar submetido à partição líquido-líquido com acetato de etila, n-butanol e água, obtendo três frações submetidas ao rotaevaporador. Foram avaliadas mediante análise fitoquímica qualitativa a presença de compostos polifenólicos nas frações obtidas. Posteriormente foi analisada a atividade antiulcerogênica da fração acetato de etila. Foram utilizados grupos de ratos Wistar (180-220 g), que após 24 horas em jejum foram tratados pela via oral com Lansoprazol (controle positivo, n=8), solução salina 0,9% (controle negativo, n=8) e fração acetato de etila de Typha domingensis (n=8).
Passados 50 minutos dos tratamentos, a lesão gástrica foi induzida pela administração via oral de etanol absoluto. Os animais foram sacrificados 1 hora após administração do agente lesivo, sendo os estômagos retirados para contagem das lesões ulcerogênicas. Todos os experimentos foram submetidos ao Comitê de Ética em Experimentação Animal do núcleo de pesquisas (CEPE) da Universidade Santa Cecília sendo aprovados sob protocolo n° 10/2010. Os resultados obtidos demonstraram atividade antiulcerogênica significativa após utilização da fração acetato de etila de Typha domingensis. Estes foram analisados estatisticamente
utilizando Análise de Variância (ANOVA) com teste posteriori de Dunnet, com auxílio do software GraphPad Instat®. Tais resultados servem como base para estudos futuros objetivando a utilização desta planta em pacientes portadores de úlcera gástrica, servindo como suporte para indústria farmacêutica na produção de novos fármacos para tal patologia.
PALAVRAS-CHAVE: Typha domingensis Pers; compostos polifenólicos; úlcera
gástrica.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1- Classificação do tipo de flavonóide segundo reações
cromáticas................................................................................................................. 20
TABELA 2- Identificação do tipo de flavonóide segundo resultado da análise
fitoquímica................................................................................................................. 23
TABELA 3- Resultados dos índices de lesões....................................................... 25
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Resultados das reações cromáticas da fração de acetato de etila para
classificação de flavonóides...................................................................................... 23
FIGURA 2- Resultados das reações cromáticas da fração de acetato de etila para
classificação de taninos............................................................................................. 24
FIGURA 3- Gráfico com os resultados dos índices de lesões.................................. 26
FIGURA 4- Estômagos com as ulcerações............................................................... 26
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO...................................................................................................... 11
1.1 Plantas medicinais.................................................................................... 11
1.2 Typha domingensis Pers.......................................................................... 11
1.3 Úlceras pépticas....................................................................................... 13
1.4 Fármacos antiulcerogênicos..................................................................... 14
2 - OBJETIVO............................................................................................................ 17
3- MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 18
3.1 Coleta e processo extrativo...................................................................... 18
3.2 Perfis fitoquímicos.................................................................................... 19
3.2.1 Presença de flavonóides............................................................. 19
3.2.2 Presença de taninos................................................................... 20
3.3 Animais..................................................................................................... 21
3.4 Úlceras gástricas induzida por etanol em ratos........................................ 22
4- RESULTADOS...................................................................................................... 23
5- DISCUSSÃO......................................................................................................... 27
6- CONCLUSÃO........................................................................................................ 29
7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 30
ANEXO A- Declaração de Aprovação do Comitê de Ética....................................... 34
ANEXO B- Certificado de Apresentação do Trabalho no IX Workshop de Plantas
Medicinais de Botucatu............................................................................................. 35
ANEXO C- Certificado da Apresentação do Trabalho no 42° Congresso Brasileiro de
Farmacologia e Terapêutica Experimental.................................. .............................. 36
ANEXO D- Certificado de Apresentação do Trabalho no II Congresso Brasileiro de
Iniciação Científica da Universidade Santa Cecília................................................... 37
ANEXO E- Certificado de 1º lugar no COBRIC, Prêmio Dr. Milton Teixeira............. 37
ANEXO F- Certificado de Apresentação do Trabalho no XIV Congresso
Farmacêutico Ibero Latino americano – Chile 2010.................................................. 38
ANEXO G- Certificado de Apresentação do Trabalho no 10° Congresso Nacional de
Iniciação Científica.................................................................................................... 39
11
1 – INTRODUÇÃO
1.1 PLANTAS MEDICINAIS
As plantas medicinais correspondem a uma das principais ferramentas para o
tratamento de doenças desde o princípio da humanidade. Porém, por muitos anos a
indústria químico-farmacêutica com a sua produção dos mais diversos tipos de
medicamentos fez com que essa terapia não fosse mais usualmente aplicada.
Entretanto, o custo desses medicamentos tornou-se cada vez maior e em
consequência grande parte da população não tinha acesso aos mesmos. Por isso, o
estudo de plantas medicinais começou a ser amplamente incentivado (OLIVEIRA et
al, 2005). Estes estudos e pesquisas de plantas medicinais podem levar à
reorganização das estruturas de uso dos recursos naturais (em vista da necessidade
de sua extração estar associada aos planos de manejo) e à elevação do PIB, visto
que há grande tendência mundial de aumento na utilização de fitoterápicos.
Atualmente, a indústria mundial de fitoterápicos movimenta US$ 40 bilhões
por ano sendo que, a maior parte destes recursos financeiros permanece nos países
industrializados, onde possuem uma biodiversidade restrita. Em contrapartida, o
Brasil é um país rico em biodiversidade e extremamente carente de informações
sobre a mesma, necessitando preservar as espécies e intensificar programas para
produzir medicamentos fitoterápicos, com o objetivo de prevenir e combater
enfermidades (FERRO, 2006).
1.2 Typha domingensis Pers
O Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal do mundo,
contando com 55.000 espécies catalogadas, de um total de 550.000 (DIAS, 1996).
12
Dentre estas espécies encontra-se a espécie Typha domingensis Pers.
Popularmente conhecida como Taboa, Paineira-de-Brejo, Esteira-de-Brejo, Capim-
de-Esteira, Bucha, Tifa, Rabo-de-Gato, Cattail (EUA) com a qual realizaremos um
estudo sobre sua possível atividade antiulcerogênica de seu rizoma.
A Typha domingensis Pers pertence à família Typhaceae que é uma família
de plantas pertencente à ordem Poales. Esta família contém apenas o gênero Typha
com cerca de uma dúzia de espécies. Esta se trata de uma planta perene, herbácea,
rizomatosa, aquática, com caule cilíndrico, podendo atingir até três metros de altura,
nativa da América do Sul. A Typha domingensis Pers é uma planta bastante
vigorosa chegando a produzir 7.000 kg de rizomas por hectares (BIANCO et al.,
2003), o que viabiliza este projeto de pesquisa com seus rizomas.
Typha domingensis Pers vem sendo usada como depuradora natural de
ambientes aquáticos, por absorver metais pesados podendo contribuir para o
saneamento ambiental (GALLARDO-WILLIAMS et al., 2002). Dados
etnofarmacológicos obtidos na aldeia Itaóca em Itanhaém- SP demonstram que a
tribo indígena Tupi-Guarani, ali residente, utiliza Typha domingensis para o
tratamento de processos inflamatórios e problemas gástricos.
Relatado por ter ação anódina, anticoagulante, adstringente, afrodisíaca,
diurética, emética, hemostática, refrigerante, sedativa, adstringente, supurativa,
tônica, vermífuga, a Typha domingensis é um remédio popular para amenorréia,
contusões, queimaduras, cistite, diarréia, hidropisia, disenteria, equimose, erisipela,
febre, gonorréia, hematoquezia, hematêmese, hematúria, leucorréia, sarampo,
metroxenia, oftalmia, hemorróidas, picada de cobra, feridas, inchaços, tumores,
vaginite, etc (DUKE, 1999).
Poucos são os trabalhos fitoquímicos e farmacológicos relacionados à Typha
domingensis, porém é importante salientar que em trabalhos fitoquímicos realizados
com a mesma, foi detectada a presença de flavonóide e taninos. Esses compostos
13
polifenólicos são metabólitos secundários vegetais de grande importância dentro do
contexto clínico da fitoterapia, pois, segundo De Angelis et al.(2009) os taninos
apresentam uma provável atividade antiulcerogênica, citoprotetora, antisecretora e
ação cicatrizante.
Como não há relato de estudos da provável atividade antiulcerogênica
realizados com extratos ou frações obtidos a partir de Typha domingensis Pers na
literatura científica, este estudo torna-se relevante.
1.3 ÚLCERA PÉPTICA
A úlcera péptica é uma área de lesão na mucosa gástrica ou intestinal,
causada principalmente pela ação digestiva do suco gástrico ou das secreções no
intestino delgado superior. A causa comum é o desequilíbrio entre a taxa de
secreção de suco gástrico e o grau de proteção dado pela barreira da mucosa
gastroduodenal e pela neutralização do ácido gástrico pelos sucos duodenais.
Outros fatores que predispõem ao desenvolvimento das úlceras são: tabagismo,
devido ao aumento da estimulação nervosa das glândulas secretoras do estômago;
álcool, pois tende a romper as barreiras mucosas; antiinflamatórios não-esteroidais,
que afetam a integridade da barreira mucosa; e infecção bacteriana por Helicobacter
pylori (GUYTON et al., 2006).
Segundo Katzung, (2006), a regulação da secreção de ácido pelas células
parietais é importante na úlcera péptica, e um alvo específico para a ação de
fármacos. Essas células sofrem três estímulos principais: gastrina, acetilcolina e
histamina. O mecanismo exato de como ocorre esse processo não é bem definido,
porém há duas teorias principais: a hipótese da célula única e a de duas células. Na
primeira hipótese, a célula parietal possui receptores H2 para histamina, receptores
muscarínicos M1 para acetilcolina e receptores para gastrina. O estímulos nos
14
receptores H2 aumentam a adenosina de monofosfato cíclica (AMPc), e a
estimulação nos receptores M1 e nos receptores da gastrina aumenta o cálcio (Ca2+)
do citosol da célula parietal. E de modo sinérgico essas substâncias induzem a
secreção do ácido gástrico. Na segunda hipótese, a gastrina e acetilcolina
desempenham seu papel induzindo uma liberação de histamina ou, em parte, por
liberar histamina e outra por ação direta sob seus receptores
1.4 FÁRMACOS ANTIULCEROGÊNICOS
Existem, hoje, diversos tratamentos para a úlcera péptica sendo que os mais
amplamente utilizados são os fármacos antagonistas dos receptores H2 de
histamina e os inibidores da bomba de prótons. No entanto, apesar da ampla gama
terapêutica de fármacos utilizados na terapia contra a úlcera gástrica, ainda não foi
encontrado um fármaco capaz de proporcionar uma cicatrização qualitativa das
lesões gástricas, havendo deste modo o retorno da doença (TOMA et al., 2005).
Além disso, estimativas globais sugerem que cerca de 3/4 da população mundial
ainda não tem acesso às terapias sintéticas para as mais diversas patologias, dentre
elas a úlcera gástrica. Deste modo, tal setor populacional torna-se dependente do
uso da medicina tradicional, em especial das plantas medicinais, para o tratamento
destas patologias. Sendo assim, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estimula o
desenvolvimento da fitoterapia nos países em desenvolvimento objetivando o
surgimento de programas de saúde à população de menor renda econômica (DHAR
et al., 2002).
Durante muitos anos os antiácidos foram à única classe de medicamentos
utilizados para o tratamento da dor promovida pelas úlceras. No entanto, a partir de
1972, ensaios clínicos conduzidos por Black e colaboradores, forneceram uma
classe mais específica de inibidores da secreção do ácido gástrico (RANG et al.,
15
2003). Estas drogas inibem competitivamente a secreção ácida gástrica estimulada
pela histamina (antagonistas H2), gastrina (inibidores da secreção de gastrina), e em
menor grau, a induzida por agonistas muscarínicos (antagonistas muscarínicos). Há
também os fármacos mais modernos, que são os inibidores da bomba protônica e os
análogos de prostaglandinas.
Os antagonistas muscarínicos reduzem a liberação do HCl e retardam o
esvaziamento gástrico. Os antagonistas H2 foram desenvolvidos para bloquear os
efeitos da histamina sobre a secreção de HCl, sem a ocorrência de efeitos nos
receptores H1. A ranitidina e a cimetidina são exemplos de antagonistas
histaminérgicos muito utilizados no tratamento de úlceras gástricas e duodenais. O
bloqueio exercido por essas drogas interfere parcialmente na secreção gástrica
induzida pela gastrina e acetilcolina (SPINOSA et al., 1999).
Os inibidores da bomba de prótons são agentes que bloqueiam
reversivelmente a molécula transportadora H+/K+/ATPase, localizada nas
membranas das células parietais que são responsáveis pela secreção de HCl. Essa
molécula troca íons H+ por K+. Os principais representantes dessa classe de drogas
são o Omeprazol, o Lanzoprazol e o Pantoprazol (RANG et al., 2003).
As principais prostaglandinas (PGs) sintetizadas na mucosa gástrica são as
PGE2 e PGI2 que atuam como citoprotetoras por inibirem a síntese de HCl e
estimularem a produção de muco pelas células da mucosa gástrica. O misoprostol
(Cytotec®) é um análogo sintético da PGE2 utilizado na terapêutica dos estados de
hipersecreção gástrica. Essa droga tem como efeitos colaterais o aumento da
motilidade uterina e intestinal.
Quando a bactéria Helicobacter pylori está envolvida na patogenia das
ulcerações gástricas torna-se necessário, além da terapia padrão, a adoção de uma
antibioticoterapia. Tem sido relatada a utilização de terapias combinadas, utilizando
inibidores da bomba de prótons ou antagonistas H2, associados a antibióticos, como
16
Amoxicilina e Eritromicina, Metronidazol e Claritromicina ou Amoxicilina e
Metronidazol (LAU et al., 2000).
Dentre todos estes fármacos antiulcerogênicos citados, é fato comum na
clínica médica à prescrição dos mesmos em associação às drogas antiinflamatórias
não esteroidáis não seletivas (DAINES não seletivos). O grande objetivo desta
associação medicamentosa é de propiciar fator preventivo no que tange ao
desenvolvimento de lesões ulcerogênicas induzidas pelo uso de DAINES não
seletivos. Deste modo, o clínico prescritor objetiva o tratamento do processo
doloroso, bem como a prevenção do desenvolvimento de um efeito colateral
decorrente do uso contínuo destes antiinflamatórios.
Apesar da lógica clínica desta associação, torna-se evidente a necessidade
da busca de novos fármacos analgésicos e antiinflamatórios que possam
proporcionar alívio no quadro álgico do paciente, porém sem induzir algum outro tipo
de doença, como por exemplo, a úlcera gástrica.
Levando-se em conta todos os fatos, e somando-se a trabalhos que relatam a
presença de flavonóides e taninos nos extratos obtidos a partir de diversos órgãos
de Typha domingensis Pers, é de se esperar que resultados promissores sejam
visualizados neste trabalho, uma vez que são inúmeras as publicações defendendo
a hipótese de propriedades antiulcerogênicas dos flavonóides (ANDREO et al.,
2006; HAMAISHI et al., 2006; HIRUMA-LIMA et al., 2006; RAO et al., 2007; CHOI et
al., 2007; SPERONI et al., 2007) e atividade antiulcerogênica dos taninos (DE
ANGELIS et al 2009).
17
2– OBJETIVO
Este trabalho teve por objetivo avaliar a atividade antiulcerogênica de três
frações obtidas a partir do rizoma de Typha domingensis Pers (Typhaceae) em
modelos de indução de úlcera gástrica em roedores. Este trabalho objetivou também
a presença de compostos polifenólicos, tais como, taninos e flavonóides, atribuindo
a eles a provável atividade antiulcerogênica.
18
3– MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 COLETA E PROCESSO EXTRATIVO
A planta Typha domingensis Pers foi coletada na cidade do Guarujá-SP na
estrada do Perequê na altura do Km 9 e levada ao Herbário da Universidade Santa
Cecília (HUSC) onde foi realizado exsicata para identificação da espécie. A planta foi
submetida à trituração à fresco e logo em seguida ao processo de secagem em
estufa a 45ºC por sete dias consecutivos. Após secagem o rizoma foi submetido ao
processo extrativo de maceração à frio por uma semana com o solvente hexano, a
fim de retirar algumas impurezas presentes na planta, na proporção de 50g de
rizoma para cada 300 ml de solvente (BARATELLI, 2006). Após esta maceração, foi
realizada uma filtragem e os rizomas foram submetidos à outra extração, novamente
por maceração à frio durante uma semana, utilizando acetona:água (7:3) como
solvente, na proporção de 50g de rizoma para 300ml de solvente. Depois dos sete
dias, o extrato foi submetido ao rotaevaporador com 50rpm em temperatura
controlada entre 45 e 50°C. O extrato acetona:água de Typha domingensis Pers
sofreu partição líquido-líquido com três solventes de polaridade crescente, obtendo
assim frações semi-purificadas. Esta metodologia proporciona um adequado clean
up dos extratos/frações polares (CALIXTO & YUNES, 2001). Aproximadamente 20g
do extrato foram dissolvidos em 150 ml de água em um funil de separação; 50 ml de
acetato de etila foram adicionados ao funil de separação e particionados por 3
vezes. Em seguida a fase aquosa foi particionada também com 50 ml de n-butanol,
novamente por 3 vezes. Após a partição três frações são obtidas: fração acetato de
etila, fração n-butanol e fração aquosa. Essas fração foram submetidas ao
rotaevaporador com 50rpm e temperatura controlada entre 45 e 50°C para a
obtenção das três frações finais.
19
3.2 PERFIL FITOQUÍMICO
Visando a identificação dos principais grupos químicos presentes no rizoma
de Typha domingensis Pers, o ensaio sistemático de análise fitoquímica das três
frações de acetato de etila, de n-butanol e aquoso foi realizado utilizando
metodologias descritas por Costa, (2000); Simões et al., (2004) e Gambeta, (2008)
com algumas adaptações. Nestas frações foram realizados testes para a
identificação de flavonóides e taninos.
3.2.1 Presença de Flavonóides
Foi realizado análise qualitativa de flavonóides, através de reações
cromáticas descritas nos procedimentos à seguir, afim de previamente classificar o
tipo de flavonóide encontrado. Previamente aos experimentos foi realizado um
processo extrativo através de 1,5g do fração seca tratada com 10 mL de éter de
petróleo, agitando durante 10 minutos e aquecendo ocasionalmente em banho-
maria. O líquido sobrenadante foi desprezado com uma pipeta de Pasteur após a
sua sedimentação. Ao pó sedimentado foi adicionado 10 mL de metanol e este
aquecido banho-maria por 10 minutos, solubilizando periodicamente com um bastão
de vidro. A amostra ainda quente foi filtrada utilizando algodão e funil, levando então
o filtrado à chapa evaporando o liquido, obtendo um resíduo que foi solubilizado com
5mL de etanol. A seguir as reações de caracterização foram realizadas.
Foi utilizado um tubo de ensaio contendo apenas a fração a ser analisada
sem nenhum reagente para comparação da coloração dos tubos de ensaio com as
reações a seguir
20
- Reações de Shinoda ou Cianidina: colocar em um tubo de ensaio 2 mL da
fração e adicionar fragmentos de magnésio e em seguida, cuidadosamente, 5 gotas
de HCl concentrado (verificando a efervescência)(COSTA, 2000).
- Reação com Hidróxido de Sódio: colocar em um tubo de ensaio 2 mL da
fração e adicionar 2 mL de solução de hidróxido de sódio 2% (COSTA, 2000).
- Reação com Cloreto Férrico: colocar em um tubo de ensaio 2mL da fração e
adicionar 3 gotas da solução de cloreto férrico a 4,5% (COSTA, 2000).
- Reação com Ácido Sulfúrico concentrado: colocar em um tubo de ensaio
2mL da fração e adicionar algumas gotas de ácido sulfúrico concentrado (SIMÕES et
al., 2004).
As colorações apresentadas nas reações cromáticas descritas à cima
identificam o tipo de flavonóide segundo classificação da Tabela 1.
TABELA 1- Classificação do tipo de Flavonóide segundo reações cromáticas.
3.2.2 Presença de Taninos
Das frações foram retiradas alíquotas que foram transferidas a tubos de
ensaio para análise através de reações descritas abaixo, que serão comparadas à
um tubo controle contendo apenas as alíquotas da fração, sem nenhum reagente.
21
- Teste com Sais de Chumbo (acetato): adicionar à 2 mL da fração, gotas de
solução aquosa à 10% p/v de acetato de chumbo (COSTA, 2000).
- Reação com Sais de Cobre (acetato): adicionar à 2mL da fração algumas
gotas de uma solução aquosa de acetato de cobre à 3% p/v (COSTA, 2000).
- Reação com Sais de Ferro: acrescentar à 2mL da fração 5 mL de água
destilada e algumas gotas da solução de cloreto férrico à 2% (COSTA, 2000).
- Reação com Acetato de Chumbo: adicionar à 5 mL da fração, 10 mL de
ácido acético diluído à 10% e cerca de 5 mL de solução de acetato de chumbo à
10% (COSTA, 2000).
3.3 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar albinos (180-250g). Os mesmos permaneceram
aclimatados às condições do biotério da Universidade Santa Cecília sob temperatura
(23 ± 2ºC) e ciclo claro-escuro (12 horas) controlados, alimentados com ração
Nuvital e água “ad libitum”. Os animais foram distribuídos ao acaso em 3 grupos:
grupo de controle positivo, grupo de controle negativo e grupo tratado com a fração
de acetato de etila do rizoma de Typha domingensis, (sendo n=8 para cada grupo).
Esses grupos serviram de parâmetros para ánalise dos resultados, sendo o grupo de
controle positivo tratado com um fármaco considerado padrão no tratamento de
úlcera gástrica e o grupo de controle negativo tratado com uma solução fisiológica
que não promoverá alterações na indução de úlcera gástrica. Os tratamentos foram
feitos sempre pela via oral, após período de jejum de 24 horas de acordo com a
metodologia utilizada.
22
3.4 ÚLCERA GÁSTRICA INDUZIDA POR ETANOL EM RATOS
De acordo com Robert et al., (1979), grupos de ratos Wistar permaneceram
em jejum por período de 24 horas. Em seguida foram tratados com 30 mg/Kg de
Lansoprazol (controle positivo, n=8), 10 ml/Kg de solução salina 0,9% (controle
negativo, n=8) e 100 mg/Kg da fração de acetato de etila do rizoma de Typha
domingenses (n=8). Passados 50 minutos dos tratamentos, a lesão gástrica foi
induzida pela administração via oral de 1 ml de etanol absoluto. Os animais foram
sacrificados 1 hora após a administração do agente lesivo, sendo sacrificados por
deslocamento cervical e os estômagos retirados para contagem das lesões
ulcerogênicas de acordo com Szelenyi & Thiemer, (1978).
Todos os procedimentos foram realizados nos laboratórios de farmácia, biologia e
química da Universidade Santa Cecília. Todos os procedimentos foram submetidos
ao Comitê de Ética em Experimentação Animal do núcleo de pesquisas (CEPE) da
Universidade Santa Cecília sendo aprovados sob protocolo n° 10/2010.
23
4– RESULTADOS
A análise qualitativa de flavonóides, através de reações cromáticas,
apresentou colorações que nos permitiu classificar o tipo de flavonóide encontrado
conforme classificação da Tabela 2.
FIGURA 1- Resultados das reações cromáticas da fração de acetato de etila para
classificação de flavonóides
TABELA 2- Identificação do tipo de flavonóide segundo resultado da análise fitoquímica.
24
Após análise das 4 reações cromáticas realizadas concluiu-se que o resultado
foi positivo para flavonóides do tipo flavanonas.
Para a análise qualitativa de taninos, segundo Costa (2000), as colorações e
a presença de precipitado caracterizaram os taninos com:
- Teste com Sais de Chumbo: Normalmente surge precipitado volumoso e
denso na presença de taninos.
- Reação com Sais de Cobre: Surge precipitado na presença de taninos.
- Reação com Sais de Ferro: Nesta reação os taninos hidrolisáveis produzem
coloração azul-violeta e os condensados coloração esverdeada.
- Reação com Acetato de Chumbo: Esta reação é considerada positiva para
galhotaninos na presença de precipitado.
FIGURA 2- Resultados das reações cromáticas da fração de acetato de etila para classificação de
taninos.
25
Analisando os resultados das reações concluiu-se que as reações de sais de
chumbo e sais de cobre caracterizaram a presença de taninos, e as reações de sais
de ferro e de acetato de chumbo caracterizaram a presença de taninos condensados
e de galhotaninos, respectivamente.
Verificou-se a presença de compostos polifenólicos na fração de acetato de
etila. Como a presença de compostos polifenólicos é parte de nosso objetivo, os
experimentos para análise da atividade antiulcerogênica foram realizados somente
com a fração de acetato de etila, pois esta, possuía os metabólitos de interesse.
Os resultados obtidos a partir da ulcera gástrica induzida por etanol em ratos
demonstraram atividade antiulcerogênica significativa após utilização da fração
acetato de etila do rizoma de Typha domingensis Pers. O grupo controle negativo
apresentou área de lesão ulcerogênica média de (1,372 ± 0,2450 mm2), ao passo
que os grupos controle positivo (Lansoprazol) e fração acetato de etila do rizoma de
Typha domingensis apresentaram, respectivamente, (0,9820 ± 0,2694 mm2 com
*p<0.05 quando comparado ao controle negativo) e (0,7366 ± 0,2013 mm2 com
**p<0.01 quando comparado ao controle negativo). Os resultados foram analisados
estatisticamente utilizando Análise de Variância (ANOVA) com teste posteriori de
Dunnet, com auxílio do software GraphPad Instat®.
TABELA 3 – Resultados dos índices de lesões.
26
FIGURA 3- Gráfico dos índices de lesões
FIGURA 4- Estômagos com as ulcerações
27
5- DISCUSSÃO
O uso da fitoterapia como alternativa terapêutica vem sendo cada vez mais
apoiado pela OMS (Organização Mundial de Saúde), devido ao fato de uma grande
parte da população mundial não ter acesso aos tratamentos convencionais para
patologias como úlcera gástrica.
É importante ressaltar que o uso de plantas medicinais possui vantagens
inegáveis, pois além de seu baixo custo e fácil obtenção, já que o Brasil é o país
com a maior diversidade vegetal do mundo, são utilizadas como terapia alternativa
e/ou complementar.
Com base nesses dados, o estudo da avaliação da atividade antiulcerogênica
da fração acetato de etila obtida a partir do rizoma de Typha domingensis Pers se
tornou relevante visando uma possível terapia complementar no tratamento de
úlceras.
A avaliação da atividade antiulcerogênica realizada através da indução de
úlceras gástricas em roedores com etanol absoluto, apresentou efeito
antiulcerogênico para o tratamento com a fração acetato de etila (*p<0,01) se
comparado com o controle negativo salina, e ainda apresentou diferença significativa
a favor do tratamento com a fração acetato de etila se comparado com o controle
positivo tratado com Lansoprazol (medicamento referência) (*p<0,05).
Tais resultados comprovam que a fração possui efeito antiulcerogênico e que
possivelmente, esse efeito se dá pela presença de compostos polifenólicos, tais
como taninos e flavonóides encontrados na fração acetato de etila através dos
testes fitoquímicos. Plantas ricas em taninos são empregadas na medicina
tradicional no tratamento de diversas moléstias, tais como diarréias, hipertensão
arterial, reumatismo, hemorragias, feridas, queimaduras, problemas estomacais,
renais e do sistema urinário (MELLO, 2001), processos inflamatórios e úlceras em
28
geral (SHEN et al., 2007; FAN et al., 2004). Acredita-se que as atividades
farmacológicas dos taninos são devidas, pelo menos em parte, a três características
gerais que são comuns em maior ou menor grau aos dois grupos de taninos,
condensados e hidrolisáveis: 1) complexação com íons metálicos (ferro, manganês,
vanádio, cobre, alumínio, cálcio, entre outros), 2) atividade antioxidante e
seqüestradora de radicais livres e 3) habilidade de complexar com outras moléculas
incluindo macromoléculas tais como proteínas e polissacarídeos (HASLAM, 1996).
Os mecanismos dos efeitos antiulcerogênicos dos compostos polifenólicos
encontrados na Typha domingensis Pers não são bem definidos pela literatura,
sendo assim necessária a realização de outros trabalhos de estudo para avaliar e
comprovar o mecanismo. Tais estudos são necessários para que a fração acetato de
etila do rizoma de Typha domingensis seja utilizada como terapia complementar e/ou
alternativa terapêutica no tratamento de úlceras gástricas.
29
6- CONCLUSÃO
Com o presente projeto pode se concluir que a fração acetato de etila obtida
a partir do rizoma de Typha domingensis Pers apresentou atividade antiulcerogênica
significativa, possivelmente pela presença de compostos polifenólicos tais como
taninos condensados e flavonóides do tipo flavanonas.
Estes resultados servem como base para estudos futuros objetivando a
utilização desta planta em pacientes portadores de úlcera gástrica, servindo como
suporte para indústria farmacêutica na produção de um tratamento fitoterápico
alternativo para úlcera gástrica de fácil acesso e baixo custo.
Esse estudo comprova a importância do farmacêutico nas pesquisas pré-
clínicas para a busca de novas terapias farmacológicas provenientes de plantas
medicinais, podendo auxiliar ou não em terapias já existentes para o combate à
diversas patologias. Tais estudos devem ser estimulados, a fim de promover o
conhecimento de nossas espécies vegetais, já que o Brasil possui a maior
diversidade genética vegetal do mundo, ainda pouco explorada.
30
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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p.345-350, 2005.
34
ANEXO A
Declaração de aprovação do Comitê de Ética
35
ANEXO B
Certificado de apresentação do trabalho no IX Workshop de Plantas Medicinais de Botucatu
36
ANEXO C
Certificado de apresentação do trabalho na 42º Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica
Experimental
37
ANEXO D
Certificado de apresentação do trabalho no II Congresso Brasileiro de Iniciação Científica
ANEXO E
Certificado de 1º lugar no COBRIC - Prêmio Dr. Milton Teixeira
38
ANEXO F
Certificado de apresentação do trabalho no XIV Congreso Farmacéutico Ibero-Latinoamericano- Chile 2010
39
ANEXO G
Certificado de apresentação do trabalho no 10º Congresso Nacional de Iniciação Científica
