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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE NUTRIÇÃO EMÍLIA DE JESUS FERREIRO
CURSO DE GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
VANESSA CONSTÂNCIO DE SOUZA BARBOSA
PESQUISA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE
TOXINA SHIGA (STEC) NAS FEZES DO GADO
LEITEIRO E NO LEITE CRU RECÉM-ORDENHADO
NITERÓI
2016
VANESSA CONSTÂNCIO DE SOUZA BARBOSA
PESQUISA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC)
NAS FEZES DO GADO LEITEIRO E NO LEITE CRU RECÉM-ORDENHADO
Orientadora:
Profª Drª Alice Gonçalves Martins Gonzalez
Niterói, RJ
2016
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
ao curso de Graduação em Nutrição da
Faculdade de Nutrição Emília de Jesus
Ferreiro, da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial à obtenção do título de
Bacharel em Nutrição.
VANESSA CONSTÂNCIO DE SOUZA BARBOSA
PESQUISA DE ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC)
NAS FEZES DO GADO LEITEIRO E NO LEITE CRU RECÉM-ORDENHADO
Aprovada em 29 de março de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Profª Drª Alice Gonçalves Martins Gonzalez - UFF
Profª. Drª. Lúcia Rosa de Carvalho – UFF
Profª. Drª. Nara Xavier Moreira
Niterói
2016
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
ao curso de Graduação em Nutrição da
Faculdade de Nutrição Emília de Jesus
Ferreiro, da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial à obtenção do título de
Bacharel em Nutrição.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Deus e à minha família.
AGRADECIMENTOS
Grata a Deus por sua infinita bondade, pois não me desamparou e me sustentou nos
momentos de maior dificuldade.
À minha mãe pelo carinho, amor e dedicação que foram meu suporte durante toda vida. E a
toda a minha família, pelo apoio e paciência diante das várias mudanças que tivemos que
passar nos últimos anos.
À minha amada Tia Nininha, que nos deixou recentemente, por permitir que ficasse em sua
casa nos primeiros anos de faculdade. Saudades eternas!
Aos meus familiares e amigos de infância que mesmo à distância me apoiaram e foram
compreensivos com a minha falta de tempo.
À minha orientadora, Alice Gonçalves Martins Gonzalez pela paciência, incentivo e
orientação em todo o tempo que passei no Laboratório de Microbiologia de Alimentos e na
elaboração deste trabalho.
A todos as pessoas que conheci no Laboratório de Microbiologia e que de alguma forma
contribuíram para este trabalho. E, em especial, à Patrícia Kraschinski Lopes, que me aceitou
como companheira de bancada e dividiu comigo parte do seu trabalho.
Às amizades que fiz durante o curso de Nutrição. Vocês tornaram os momentos difíceis mais
fáceis de suportar e, todos os meus dias mais alegres!
A todos os Professores que tive desde a pré-escola até o último ano da faculdade. Todos
contribuíram de alguma forma para que eu chegasse aqui!
RESUMO
O leite é um alimento consumido por todas as faixas etárias da população brasileira, sendo
que apenas uma pequena parcela da população não consome nenhum tipo de laticínio. Desse
modo, o controle, a prevenção e a vigilância de patógenos veiculados pelo leite são de
primordial importância para a saúde pública. Escherichia coli produtora de toxina Shiga
(STEC) é uma categoria de E. coli diarreiogênica (DEC) envolvida em casos graves de
doença humana, onde complicações podem levar à morte. O gado bovino é o principal
reservatório de STEC, estando esta bactéria entre os patógenos mais comumente veiculados
por leite cru na Europa e nos Estados Unidos. Este trabalho teve por objetivo avaliar, a
presença de STEC nas fezes do gado leiteiro e no leite recém-ordenhado, a fim de verificar a
incidência desta bactéria no reservatório animal e a contaminação do leite durante a ordenha.
Para isso foi realizada a pesquisa do gene stx a partir de swab retal dos animais e do
correspondente leite recém-ordenhado por meio da técnica PCR (Polymerase Chain
Reaction). As amostras stx-positivas foram adicionalmente submetidas à pesquisa do gene
rfbO157, marcador do sorogrupo O157. A presença do gene stx foi observada em 56% das
amostras fecais (56/63) e em 48,6% das amostras de leite cru recém-ordenhado (17/35). O
gene rfbo157 foi detectado em 12,5% das amostras fecais, porém, não foi detectado nas
amostras de leite cru recém-ordenho stx-positivas. Pode-se concluir que o gado bovino leiteiro
sadio da Região Noroeste do Estado do Rio de Janeiro é um importante reservatório de STEC,
incluindo o sorotipo O157:H7. A alta prevalência de STEC no leite cru indica que este
produto é um veículo em potencial de infecções causadas por este microrganismo. No entanto,
embora as propriedades rurais apresentassem más condições de higiene na ordenha, a
ocorrência do gene stx foi significativamente maior entre as amostras fecais do que no leite
cru recém-ordenhado. O tipo de ordenha empregado não influenciou no percentual de
amostras fecais bovinas e amostras de leite cru recém-ordenhado contaminadas por STEC.
Assim, para obtenção de produtos lácteos seguros é necessária a adequação dos produtores
rurais às Boas Práticas de Higiene no Campo.
Palavras-chave: Escherichia coli, E. coli produtora de toxina Shiga (STEC), E. coli O157,
toxina Shiga, bovinos, leite.
ABSTRACT
Milk is a food consumed by all age groups of the Brazilian population, and only a small
portion of the population does not consume any dairy. Thus, the control, prevention and
monitoring of the milk served pathogens are of prime importance to public health. Producing
Escherichia coli Shiga toxin (STEC) is a category of E. coli diarrheagenic (DEC) involved in
serious cases of human disease where complications can lead to death. Cattle are the main
reservoir STEC, with this bacterium from the pathogens most commonly served by raw milk
in Europe and the United States. This work aimed to evaluate the presence of STEC in feces
of dairy cattle and freshly milked milk in order to verify the incidence of this bacteria in the
animal reservoir and the contamination of milk during milking. For this search the STX gene
from rectal swabs of animals and the corresponding freshly milked milk by means of PCR
(Polymerase Chain Reaction) was performed. The stx-positive samples were further subjected
to search rfbO157 gene, O157 serogroup marker. The presence of the STX gene was observed
in 56% of stool samples (56/63) and 48.6% of samples of raw milk freshly milked (17/35).
The rfbo157 gene was detected in 12.5% of the fecal samples, however, was not detected in
samples of raw milk freshly milking stx-positive. It can be concluded that healthy dairy cattle
of the Northwest Region of Rio de Janeiro is an important reservoir of STEC, including the
O157: H7 serotype. The high prevalence of STEC in raw milk indicates that this product is a
potential vehicle of infections caused by this organism. However, although rural properties
presented poor hygiene conditions for milking, the occurrence of stx gene was significantly
higher in fecal samples than in freshly milked raw milk. The type of milking employee did
not influence the percentage of bovine faecal samples and samples of raw milk freshly milked
contaminated with STEC. Thus, to obtain dairy products secure the adequacy of farmers to
Good Hygienic Practices Course is required.
Keywords: Escherichia coli, E. coli Shiga toxin-producing (STEC), E. coli O157, Shiga
toxin, cattle, milk.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 Ocorrência de STEC em doença humana no Brasil, p.23
Quadro 2 STEC O157 e não-O157 no gado bovino de corte e de leite, p.26
Quadro 3 Isolamento de STEC em fezes de bovino leiteiro e de corte no Brasil, no
período de 1999 a 2012, p.26
Quadro 4 Procedimentos de higiene na rotina de ordenha, p.33
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Pesquisa do gene stx nas amostras fecais (swab retal) e leite cru recém-
ordenhado, p.40
Figura 2 Presença do gene stx entre as amostras de swab retal e leite cru recém-
ordenhado de acordo com o tipo de ordenha (manual e mecânica), p.41
Figura 3 Distribuição dos sorogrupos O157 e não-O157 entre as amostras fecais
bovina, p.42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Pesquisa do gene stx nas amostras fecais (swab retal) e leite cru recém-
ordenhado por propriedade rural, segundo o tipo de ordenha, p.39
Tabela 2 Número de amostras fecais (swab retal) e amostras de leite cru recém-
ordenhado quanto a pesquisa do gene stx, segundo o tipo de ordenha, p.41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI Brain Heart Infusion
CCS Contagem de Células Somáticas
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa
CH Colite Hemorrágica
CLED Cystine Lactose Eletrolyte Deficient Agar
CTB Contagem Bacteriana Total
DAEC Escherichia coli Produtora de Aderência Difusa
DEC Escherichia coli diarreiogênica
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Trifosfato Desoxinucleótido
DTA Doenças Transmitidas por Alimentos
EAEC Escherichia coli Enteroagregativa
EE Estados da Europa
EHEC Escherichia coli Enterohemorrágica
EIEC Escherichia coli Enteroinvasora
EPEC Escherichia coli Enteropatogênica clássica
ETEC Escherichia coli Enterotoxigênica
EUA Estados Unidos da América
Gb3 Globotriasilceramida 3
IN Instrução Normativa
LEE Locus of Enterocyce Effacemet
MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MATs Microangiopatias Trombóticas
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PTT Púrpura Trombocitopênica Trombótica
SHU Síndrome Hemolítica Urêmica
STEC Escherichia coli produtora de toxina Shiga
Stx Toxina Shiga
TSB Tryptone Soya Broth
USA United States of America
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 14
2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 14
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 14
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...................................................................................... 15
3.1 ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC) .......................... 15
3.1.1 Histórico de STEC ................................................................................................... 15
3.1.2 Fatores de Virulência ............................................................................................... 16
3.1.3 Quadro Clínico ......................................................................................................... 19
3.1.4 Transmissão de STEC .............................................................................................. 20
3.1.5 Epidemiologia de STEC ........................................................................................... 21
3.1.5.1 STEC em doença humana ................................................................................. 21
3.1.5.2 STEC no leite bovino ........................................................................................ 24
3.1.5.3 STEC no reservatório bovino ............................................................................ 25
3.2 O LEITE ......................................................................................................................... 29
3.2.1 Boas práticas para obtenção do leite cru .................................................................. 30
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 34
4.1 DESENHO DO ESTUDO .............................................................................................. 34
4.2 AMOSTRAGEM ............................................................................................................ 34
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS ......................................................................................... 35
4.3.1 Material fecal............................................................................................................ 35
4.3.2 Leite cru recém-ordenhado....................................................................................... 35
4.4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ...................................................................... 35
4.5 EXTRAÇÃO DO DNA DA CULTURA POLIMICROBIANA .................................... 36
4.6 PESQUISA DO GENE stx ............................................................................................. 36
4.7 PESQUISA DO GENE rfbO157 .................................................................................... 37
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 37
5 RESULTADOS .................................................................................................................... 38
6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 42
7 CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 50
BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................................... 51
12
1 INTRODUÇÃO
O leite e seus derivados são consumidos, em diferentes níveis, por indivíduos de todas
as faixas etárias da população brasileira (IBGE, 2010). O leite em si, faz parte do grupo de
alimentos minimamente processados que segundo o novo Guia Alimentar da População
Brasileira, deve compor, juntamente com os alimentos in natura e dentro de uma alimentação
variada, a base da alimentação dos brasileiros (BRASIL, 2014b).
Segundo definição da Instrução Normativa (IN) nº 62 entende-se por leite, sem outra
especificação, “o produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta, em condições de
higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas”, sendo o leite cru aquele “produzido
em propriedades rurais e destinados à obtenção do Leite Pasteurizado” que pode ser para
consumo humano direto ou para produção de derivados em laticínios inspecionados
oficialmente (BRASIL, 2011).
Com uma composição altamente nutritiva, rica em proteínas de alto valor biológico,
vitaminas, e sais minerais, o leite é considerado a principal fonte alimentar humana de cálcio
(FAO, 2013). No entanto, essa composição nutricional rica, também o torna um meio propício
ao desenvolvimento de microrganismos (PINTO; MARTINS; VANETTI, 2006). Desse
modo, as condições de saúde do animal e a adoção de Boas Práticas na ordenha e em todos
demais pontos da cadeia produtiva do leite são necessários para garantir a qualidade e
segurança do produto que será disponibilizado ao consumidor (RODRIGUES, 2013).
O gado bovino leiteiro é reconhecido como reservatório de várias bactérias
patogênicas que podem contaminar o leite cru causando surtos e casos esporádicos de doenças
de origem alimentar (FAO, 2013). Dentre estas bactérias está Escherichia coli produtora de
toxina Shiga (STEC), cujo bovino é o principal reservatório. STEC é uma categoria
patogênica de E. coli, caracterizada por carrear o gene stx ou elaborar a toxina Stx. Esta
bactéria está envolvida em casos graves de doença humana como colite hemorrágica (CH),
síndrome hemolítica urêmica (SHU) e púrpura trombocitopênica trombótica (PTT), doenças
estas, cujas complicações podem levar à morte ou deixar sequelas crônicas (RILEY, 1983;
KARMALI et al., 1983).
STEC é hoje um dos principais agentes de infecção de origem alimentar, estando
envolvida em vários surtos e casos esporádicos em diversos locais do mundo (MOOLENAAR
13
et al., 2012; SCHAFFZIN et al., 2012), inclusive no Brasil (GUTH et al., 2002b; IRINO et al.,
2002; SOUZA et al., 2011). Uma vez que o bovino é portador saudável da bactéria, alimentos
derivados destes animais têm sido os principais implicados na infecção por STEC, de modo
que o consumo de uma grande variedade de produtos lácteos, principalmente leite cru, ou
inadequadamente pasteurizado, assim como produtos à base de leite cru têm sido atribuídos à
infecção por STEC (FARROKH et al., 2013; SMITH; FRATAMICO; GUNTHER, 2014).
Dentro da categoria STEC o sorotipo O157:H7 é o mais estudado. Este sorotipo é altamente
virulento, apresentando baixa dose infecciosa (FARROKH et al., 2013). No entanto, outras
cepas de STEC (não-O157) têm sido associadas à doenças graves como CH e SHU, podendo
levar ao óbito (FARROKH et al., 2013; SMITH; FRATAMICO; GUNTHER, 2014).
A pesquisa direta do gene stx, marcador da categoria STEC, através da Reação em
Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) tem sido utilizada, com grande
vantagem perante às outras técnicas. A técnica da PCR permite que a sequência gênica de
interesse possa ser amplificada até 109 vezes, mesmo partindo de uma quantidade mínima de
DNA molde (até mesmo uma cópia) (BELKUM et al., 1994). O uso da técnica da PCR
permite a detecção do gene stx, marcador da categoria, assim como de outros genes, como rfb
(codifica variações do antígeno O de E. coli) em amostras microbiologicamente complexas,
como fezes e alimentos, inclusive amostras com microrganismos não viáveis (FARROKH et
al., 2013).
Tendo em vista que a prevenção de doenças bacterianas veiculadas por alimentos
requer estratégias para interromper os modelos de transmissão, o controle e a prevenção de
patógenos veiculados pelo leite, é de primordial importância para a saúde pública. Estudos
para avaliar a ocorrência de STEC no reservatório bovino e no leite, principalmente no leite
cru, a fim de ser reunir um conjunto de dados que permitam a avalição de risco deste
microrganismo no leite e produtos lácteos em nosso país, apresentando benefícios aos
produtores, colaboradores, consumidores e governo. Desse modo, a investigação de STEC nas
fezes do gado leiteiro e no leite recém-ordenhado, a fim de verificar a ocorrência desta
bactéria no reservatório animal e a contaminação do leite durante a ordenha pode fornecer
dados iniciais sobre os riscos microbiológicos associados à contaminação do leite cru por
STEC na região estudada, bem como relacionar estes resultados ao procedimento higiênico
adotado durante a ordenha.
14
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Pesquisar Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) nas fezes do gado
leiteiro e no leite cru recém ordenhado de cinco propriedades rurais do Noroeste Fluminense.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Pesquisar STEC através da identificação do gene stx, marcador da categoria, a partir
da amostra fecal bovina coletada antes da ordenha e no leite cru recém ordenhado;
2. Comparar a ocorrência do gene stx entre as amostras fecais e amostras de leite cru;
3. Comparar a ocorrência do gene stx entre as amostras coletadas nas propriedades com
regime de ordenha manual e ordenha mecânica;
4. Pesquisar o gene rfbO157 a partir das amostras stx-positivas.
15
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DE TOXINA SHIGA (STEC)
Descrita pela primeira vez em 1885, pelo pediatra alemão Theodor Von Escherich,
ainda como Bacterium coli commune (ESCHERICH, 1885 apud NEIL et al., 1994), a espécie
Escherichia coli é formada por um grupo extenso de microrganismos que, em sua maioria,
não são capazes de causar doença, existindo como comensais no intestino de humanos e
diversos animais (NATARO; KAPER, 1998).
Vivendo como comensal, a E. coli apresenta uma relação benéfica com o hospedeiro,
no entanto, algumas cepas desta espécie são relacionadas ao desenvolvimento de infecções
intestinais ou extraintestinais. As cepas envolvidas em doença intestinal são denominadas E.
coli diarreiogênicas (DEC; diarrheagenic Escherichia coli) e são divididas em categorias de
acordo com seus fatores de virulência e mecanismos com que causam doença (NATARO;
KAPER, 1998). Atualmente são conhecidas seis categorias de DEC, E. coli enteropatogênica
clássica (EPEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli
produtora da toxina Shiga (STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli produtora de
aderência difusa (DAEC) (FARROKH et al., 2013).
Cepas de E. coli que carreiam o gene stx ou elaboram a toxina Shiga (Stx) são
referidas como STEC (Shiga toxin-producing Escherichia coli) (NATARO & KAPER, 1998).
A toxina Stx é o principal fator de virulência de STEC. Esta toxina é semelhante à toxina
produzida por Shigella dysenteriae tipo I (O’BRIEN et al., 1982). Por ser citotóxica para
células Vero (células renais de macaco verde africano), Stx também pode ser denominada
verotoxina (KONOWALCHUK; SPEIRS; STAVRIC, 1977). Neste estudo utilizaremos o
termo STEC para indicar as cepas de E. coli que portam o gene stx ou elaboram Stx .
3.1.1 Histórico de STEC
E. coli O157:H7 foi o primeiro sorotipo de STEC reconhecido. Nos anos 80, STEC
O157:H7 foi descrita como patógeno emergente, após ser isolada das fezes diarreicas de
16
pacientes em surtos de colite hemorrágica (CH) nos Estados Unidos, possivelmente
relacionada ao consumo de hambúrgueres mal cozidos em uma rede de fast food (RILEY et
al., 1983). Posteriormente, tal cepa foi identificada por O’Brien et al. (1983) como produtora
de Stx. Ainda no ano de 1983, foi publicado um estudo relacionando o desenvolvimento de
síndrome hemolítica urêmica (SHU), doença reconhecida na época por ser precedida por CH,
com a produção de Stx por cepas de E. coli, colocando a toxina Stx como fator comum em
ambas as doenças (KARMALI et al., 1983).
Nesse contexto, a categoria STEC foi reconhecida como uma nova classe patogênica
de E.coli. STEC, em si, é mais abrangente, abarcando todos os sorotipos de E. coli que
carreiam o gene stx ou elaboram a toxina Stx, incluindo os que não são capazes de provocar
doença em humanos. Assim, sorotipos de STEC envolvidos em doenças humanas e capazes
de produzirem uma lesão denominada lesão A/E (attaching-effacing), que resulta em
aplainamento e destruição das microvilosidades intestinais, relacionada com maior chance de
desenvolver CH e SHU, são incluídos na subcategoria EHEC (E. coli enterohemorrágica),
sendo, portanto, EHEC um subgrupo de bactérias estritamente patogênicas, dentro da
categoria STEC, tendo o sorotipo O157:H7 como protótipo (NATARO; KAPER, 1998).
Atualmente, um grande número de sorotipos de STEC é conhecido, estando mais de
380 deles envolvidos em doença humana (KARMALI; GANNON; SARGEANT, 2010). O
sorotipo O157:H7 ainda é o mais estudado e reconhecido devido à sua virulência e elevada
prevalência em surtos ao redor do mundo. Alguns sorotipos não-O157 são considerados
patógenos e também têm sido associados com doenças graves como CH e SHU, levando ao
óbito (SMITH; FRATAMICO; GUNTER, 2014). Os sorotipos não-O157 mais envolvidos em
doença grave são os incluídos na subcategoria EHEC, porém cepas STEC não-EHEC (não
produtoras de lesão A/E) também podem provocar doença grave em humanos, como, por
exemplo, cepas pertencentes ao sorotipo O113:H21 (BUGAREL et al., 2010).
3.1.2 Fatores de Virulência
A espécie E. coli apresenta grande diversidade genômica que leva a diferentes formas
de interação da bactéria com o hospedeiro bem como de gravidades da doença desenvolvida.
Essa diversidade é conferida, principalmente, por plasmídeos relacionados à virulência e Ilhas
de Patogenicidade cromossomais, que carreiam conjuntos de genes de virulência. Quanto a
17
traços individuais de virulência, estes podem ser codificados por transposons ou por fagos
(NATARO; KAPER, 1998).
Uma das características mais importantes da infecção por STEC é a baixa dose
infecciosa necessária para causar doença, principalmente no que se refere ao sorotipo
O157:H7, menos de 100 microrganismos seriam suficientes (SMITH; FRATAMICO;
GUNTER IV, 2014). Alguns autores relatam que cerca de 5-50 células já poderiam levar a
infecção (MATHUSA et al., 2010).
Como em qualquer infecção de via fecal-oral, após ser ingerido, STEC necessita
ultrapassar os mecanismos de defesa do organismo hospedeiro, para sobreviver e conseguir
estabelecer a infecção no sítio pelo qual tem tropismo. A colonização por STEC ocorre de
forma localizada no cólon, os danos fora do sítio intestinal são causados, principalmente, pela
atuação de Stx (GYLES, 2007).
O ácido estomacal (ácido clorídrico) é uma barreira para os microrganismos, no
entanto, a resistência ao ácido é uma característica típica de E. coli. Para sobreviver ao pH
extremamente ácido do estômago (pH 2 a 2,5), E. coli possui três mecanismos de resistência
ao ácido, sendo eles o sistema oxidativo, induzido pelo ácido que é mediado pelo fator RpoS,
o sistema dependente de arginina e o sistema glutamato dependente (FOSTER, 2004). Esses
sistemas além de permitirem que STEC sobreviva à condição ácida do estômago humano,
anteriormente possibilitam sua passagem pelo estômago dos ruminantes e a estabilidade em
alimentos ácidos mesmo por períodos longos. Além disso, a exposição a ambientes ácidos
antes da infecção induz maior resistência à acidez estomacal (FARROKH et al., 2013).
Ao chegar ao cólon, sinais ambientais ativam a expressão de genes de virulência de
STEC que, como primeiro passo para colonização, precisa aderir ao epitélio do cólon evitando
sua saída com o movimento peristáltico (LAW, 2000; GYLES, 2007). O grau dessa aderência
da bactéria ao epitélio tem relação com a habilidade de causar doenças mais ou menos graves
(PATON; VOSS; MANNING, 1997).
Na infecção por STEC, a interação com o epitélio é diferente entre as cepas que
integram o subgrupo EHEC e as demais cepas. Como citado anteriormente, EHEC é
altamente relacionada com desenvolvimento SHU, sendo capaz de causar a lesão A/E
(attaching-effacing) que ocorre divido à íntima ligação da bactéria com a célula epitelial,
levando ao aplainamento e destruição das microvilosidades. Essa ligação íntima está
relacionada a um conjunto de fatores de virulência apresentados pelas EHEC cujos genes que
os expressam se encontram na Ilha de Patogenicidade chamada LEE (Locus of Enterocyte
18
Effacement) (LAW, 2000; GYLES, 2007; BOLTON, 2011; FARROKH et al., 2013; SMITH;
FRATAMICO; GUNTER, 2014).
A diarreia aquosa resultante da lesão A/E pode vir acompanhada de cólicas
abdominais e posteriormente se tornar sanguinolenta, devido aos danos causados por Stx aos
vasos locais, havendo o desenvolvimento de CH (KARMALI, 1989). Na CH as fezes não
apresentam exsudato inflamatório e não há febre significativa, o que a diferencia da colite
inflamatória (KARMALI, 1989). Edema de lâmina própria, hemorragia, necrose focal e
infiltração de neutrófilos podem ser observados no epitélio colônico ao exame histológico
(NATARO; KAPER, 1998).
Outros fatores de virulência expressos por STEC são os codificados por genes
localizados em plasmídeos (pO157 e pO113), porém não é clara a exata importância desses
fatores no desenvolvimento de doenças, uma vez que tanto cepas portadoras desses genes
quanto outras em que estes estão ausentes, têm sido associadas ao desenvolvimento de SHU
(FARROKH et al., 2013).
Nas cepas LEE-negativas o mecanismo de adesão são menos conhecidos (GYLES,
2007), embora LEE seja importante, não é considerada indispensável no desenvolvimento de
doença, uma vez que algumas cepas LEE-negativas foram anteriormente relacionadas ao
desenvolvimento de SHU (DYTOC et al., 1994). Paton et al. (2001) descreveu um gene,
denominado saa (STEC autoagglutinating adhesin) responsável pela aderência de cepas LEE-
negativas (O113:H21) envolvidas em SHU. No entanto, Jenkins et al. (2003) não observaram
associação significante entre cepas saa positivas com as isoladas de pacientes com SHU ou
diarreia.
A Toxina Shiga (Stx) é o principal fator de virulência de STEC, principalmente por
estar envolvida na evolução da infecção para doenças mais graves como a CH e SHU
(FARROKH et al., 2013). Stx de STEC é codificada por bacteriófagos temperados e possui
dois tipos imunologicamente diferentes, Stx1 e Stx2 e suas variantes (SCHEUTZ et al., 2012).
A potência e a probabilidade de desenvolvimento de doença grave variam entre os tipos e
subtipos de Stx, sendo as cepas que produzem Stx2 mais frequentemente relacionadas à
evolução da infecção para SHU do que as que produzem Stx1 ou ambos, sendo os subtipos
Stx2a, Stx2c e Stx2d clinicamente mais importantes (FARROKH et al., 2013). As Stx são
halotoxinas de aproximadamente 70 kDa, apresentando uma subunidade A (32kDa) ligada
não covalentemente à 5 subunidades B idênticas (7,7 kDa cada). O pentâmero de subunidades
B é a porção da toxina que se liga ao receptor na célula alvo. A subunidade A da toxina é
clivada dando origem ao fragmento A1 cataliticamente ativo. A atividade catalítica do
19
fragmento A1 ativo leva à inibição da síntese de proteínas ao interagir com a unidade 60S
ribossomal interrompendo a síntese proteica e, como consequência, levando a morte celular
(PATON; PATON, 1998). Com a morte das células endoteliais, induzida por Stx, a liberação
de multímetros de fator de Von Willebrand na circulação leva à formação de trombos de
plaquetas dentro da circulação, além de necrose no local acometido (POLITO; KIRSZTAJN,
2010).
Stx1 e Stx2 utilizam como receptor a globotriasilceramida (Gb3), moléculas presentes
principalmente na superfície de células epiteliais dos túbulos proximais renais e células
endoteliais dos glomérulos renais. Por essa razão os rins são os principais órgãos acometidos
levando ao desenvolvimento de SHU após infecção por STEC. Com exceção para a toxina
Stx2e que se liga preferencialmente à globotetracilceramica (Gb4). Outros tecidos, além dos
rins, também apresentam Gb3, porém, em menores proporções, como tecido linfoide
associado ao intestino, células sinusoidais do fígado, macrófagos alveolares, leucócitos
periféricos séricos, assim como coração, pulmões e sistema nervoso central podem ser
acometidos (BOLTON, 2011; SMITH; FRATAMICO; GUNTER, 2014).
3.1.3 Quadro Clínico
A infecção por STEC pode apresentar desde diarreia leve à colite hemorrágica (CH),
podendo também desenvolver complicações fora do sítio intestinal como SHU e púrpura
trombocitopênica trombótica (PTT). Os sintomas da doença se iniciam com uma diarreia
aquosa acompanhada de forte cólica abdominal, que pode evoluir para diarreia sanguinolenta.
Os sintomas clínicos podem desaparecer dentro de uma semana, mas cerca de 6 a 10% dos
pacientes podem apresentar as complicações extraintestinais citadas, podendo resultar na
morte do indivíduo ou em sequelas crônicas (POLITO; KIRSZTAJN, 2010; SMITH;
FRATAMICO; GUNTER, 2014). O período de incubação dura, em média, 3 a 4 dias, com
taxa de evolução para diarreia sanguinolenta de 90%, e para SHU entre 5 a 15% após 5 a 13
dias de diarreia com sangue (SMITH; FRATAMICO; GUNTER, 2014).
A infecção por STEC é a maior causa de SHU em crianças pequenas e idosos, sendo a
PTT mais comum em adultos. A mortalidade dos pacientes que desenvolvem SHU em terapia
de suporte é em torno de 3% e a permanência de sequelas é mais frequente em pacientes
adultos, porém, ocorre melhora total da insuficiência renal em cerca de 70% dos pacientes.
20
Das crianças que desenvolvem SHU, 90% apresentaram diarreia sanguinolenta previamente,
mas este grupo apresenta um bom prognóstico (POLITO; KIRSZTAJN, 2010).
SHU é a principal complicação que pode ocorrer na infecção por STEC, podendo
também haver o desenvolvimento de uma forma variante da doença, a PTT, sendo ambas
denominadas Microangiopatias Trombóticas (MATs), sendo difíceis de serem diferenciadas a
partir de dados laboratoriais (POLITO; KIRSZTAJN, 2010). As MATs são definidas por
Moake (2002) como “desordens microvasculares oclusivas caracterizadas por agregação
sistêmica ou intra-renal de plaquetas, trombocitopenia e injúria mecânica aos eritrócitos”.
Sendo assim, SHU e PTT são caracterizadas por anemia hemolítica microangiopática,
oclusão vascular generalizada, e trombocitopenia, estando a diferença entre elas no sítio mais
acometido em cada uma, sendo a insuficiência renal mais característica da SHU e o
acometimento neurológico da PTT (POLITO; KIRSZTAJN, 2010). Além disso, na PTT a
ocorrência de quadro febril é mais comum. Ambas as complicações podem ocorrer por outras
razões como, por exemplo, defeitos genéticos, no entanto, a diarreia precedente a esses
quadros clínicos é o indicativo da associação com STEC (POLITO; KIRSZTAJN, 2010). A
importância de distinguir entre uma e outra síndrome está nos diferentes métodos de
tratamento indicadas para cada situação (POLITO; KIRSZTAJN, 2010).
3.1.4 Transmissão de STEC
STEC pode causar doença em humanos em diferentes níveis de gravidade, sendo a
colonização do intestino o primeiro passo, havendo posterior liberação da bactéria nas fezes
(GYLES, 2007). Alguns animais não desenvolvem doença ao terem seus intestinos
colonizados por estes microrganismos, funcionando como reservatório de STEC, que é
liberada normalmente nas fezes (FARROKH et al., 2013). Uma vez que STEC é liberada nas
fezes, pode contaminar a pele dos animais, seu ambiente, a água e os alimentos, direta ou
indiretamente. Assim, a transmissão de STEC se dá via fecal-oral, podendo ocorrer através do
consumo de água ou alimentos contaminados por material fecal, por contato direto com
animais portadores da bactéria e seu ambiente, ou por indivíduos infectados (SMITH;
FRATAMICO; GUNTER, 2014).
Os ruminantes são reconhecidamente o principal reservatório de STEC, e os alimentos
derivados destes animais são os mais relacionados às infecções por esta categoria de bactéria.
Carne bovina mal cozida, leite e produtos lácteos estão entre os veículos descritos mais
21
importantes. Além destes, a água e, mais recentemente, produtos hortícolas contaminados têm
sido implicados na infecção por STEC (FARROKH et al., 2013; SMITH; FRATAMICO;
GUNTER, 2014).
A carcaça bovina pode ser contaminada durante o abate a partir da pele contaminada
ou do conteúdo do trato gastrointestinal. Já os produtos hortícolas, podem se contaminar a
partir de irrigação com água contaminada, solo e poeira, fertilização orgânica com material
contaminado e, por contaminação cruzada a partir de produtos de origem animal (FARROKH
et al., 2013; SMITH; FRATAMICO; GUNTER, 2014).
Dentre os produtos lácteos, o leite cru e laticínios produzidos a partir dele são as fontes
mais estabelecidas na transmissão de STEC, porém, o leite pasteurizado e seus derivados,
possivelmente contaminados pós-processamento, também estão relatados como fontes de
STEC (FARROKH et al., 2013; SMITH; FRATAMICO; GUNTER, 2014).
3.1.5 Epidemiologia de STEC
3.1.5.1 STEC em doença humana
Indivíduos de todas as idades podem se infectar com STEC, sendo os grupos mais
susceptíveis crianças pequenas, idosos, imunossuprimidos e pessoas que tem contato direto
com animais portadores, (SMITH; FRATAMICO; GUNTER, 2014). Pico de casos de
infecção se dá, principalmente, nos meses mais quentes do ano (ANTMAN et al., 2014; CDC,
2014) que são os meses em que a bactéria é mais prevalente nas fezes dos animais
reservatórios (FARROKH et al.,2013).
No período de 2005 a 2009, 16.263 casos de infecção por STEC foram reportados por
países membros da União Europeia (UE) e outros Estados da Europa (EE), sendo que, entre
2008 e 2009, cerca de 52% dos casos foram causados pelo sorogrupo O157 (EFSA; ECDC,
2011). No ano de 2014, 5.955 novos casos foram confirmados, contabilizando 930
hospitalizações e 7 mortes. O157 foi, novamente, o sorogrupo mais comum entre os
infectados (46,3%), porém com redução da proporção em relação aos demais sorogrupos.
STEC O26, O103, O145, O91, O146 e O111 foram, nessa ordem, os principais causadores de
infecção (EFSA; ECDC, 2015).
Nos Estados Unidos (EUA), 4.756 casos de infecção foram reportados em 2012. O
sorogrupo O157 foi responsável por 51,7% dos casos, sendo os sete sorogrupos mais
22
importantes, O26, O103, O111, O121, O45, O145 (CDC, 2014). Dados preliminares mais
atuais, demostram queda no número de casos, em 2014 ocorreu cerca de 1.135 casos de
infecção por STEC nos EUA, agora com maior proporção de casos por cepas não-O157
(690/1135; 60,8%) (STACY et al., 2015).
O público mais acometido por infecções por STEC tem sido crianças menores de
cinco anos, segundo relatórios oficiais da Argentina, EUA e EU/EE (ANTMAN et al., 2014;
CDC,2014; EFSA; ECDC, 2011). Cerca de dois terços (63,2%) dos casos de SHU
confirmados na UE/EE (cuja idade foi informada) foram referentes á esse grupo etário
(EFSA; ECDC, 2011). Na Argentina, país com a maior incidência de SHU em crianças
menores de cinco anos, ocorrem cerca de 300 a 500 casos da doença por ano e, STEC,
principalmente o sorogrupo O157, foi a mais frequente causadora da doença (ANTMAN et
al., 2014).
Existe o registro de apenas um surto de infecção por STEC no Brasil, ocorrido em São
Paulo em 2001, devido ao consumo de carne moída, acometendo duas pessoas (SES/SP;
CCD; CVE, 2011). No entanto, vários casos (desde diarreia leve a SHU) de doença humana
foram descritos no país, envolvendo diferentes sorotipos de STEC (Quadro 1).
Quadro 1. Ocorrência de STEC em doença humana no Brasil.
Local Indivíduo
Investigado
Sorogrupo ou
Sorotipo Quadro Clínico Referência
Porto Alegre
(RS)
criança de 2 anos O91:H21 Diarreia sem
progressão para
CH ou SHU
Cantarelli et
al., 2000
São Paulo Jovem 18 anos HIV-
positivo
O157:H7 diarreia Irino et al.,
2002
São Paulo criança 4 anos
adulto
O157:H7 diarreia
sanguinolenta
diarreia severa
Irino et al.,
2002
São Paulo
(1989-1990)
505 crianças com
diarreia (com e sem
sangue)
505 crianças (1-4
anos) sem histórico
3 cepas
O111ac: NM
Encontrados
em menores de
Vômito, tosse e
coriza
Guth et al.,
2002b
23
de hospitalização
recente (controle)
dois anos sem
hospitalização
São Paulo Menino de 8 meses
do Nordeste
O26:H11 SHU precedida de
diarreia
Guth et al.,
2002a
São Paulo
(1976-1999)
2.549 crianças < 5
anos e 58 adultos
imunossuprimidos
(principalmente HIV
positivos)
29 sorotipos
O111: NM -
44,8%
O111:H8 -24%
O26:H11-
13,8%
O111:H11,
O55:H19,
O93:H19,
O118:H16a,
O157:H7a
Diarreia Vaz et al.,
2004
Salvador
(BA)
1.233 pré-escolares O26:H11,
O21:H21
Diarreia aguda Franzolin et
al., 2005
Paraná 306 escolares com
diarreia
6 STEC
O69:H11,
O178:H19
Diarreia sem
complicações
Toni et al.,
2009
São Paulo
(2001-2005)
13 Crianças de 8
meses a 6 anos e 3
meses
3 STEC
O26:H11,
O157:H7,
O165:H-
SHU precedida de
diarreia
Souza et al.,
2011
aIsolado de adultos.
O primeiro caso de isolamento de O157:H7 em humanos no Brasil foi relatado por
Irino et al. (2002). Tratava-se de um adolescente de 18 anos HIV positivo apresentando
apenas diarreia. Posteriormente, STEC O157 foram isoladas de dois pacientes que deram
entrada em um hospital em São Paulo, uma menina de 4 anos com diarreia sanguinolenta e
um adulto com diarreia severa (IRINO et al., 2002). Mais recentemente imunoglobulinas
contra O157 foram detectadas no soro de crianças com SHU, precedida de diarreia, sem a
bactéria ser isolada das fezes dos mesmos (SOUZA et al., 2011).
24
Nos casos apresentados no Quadro 1, houve predominância de cepas não-O157, com
destaque para os sorotipos O26:H11 e O111:NM. Principalmente crianças pequenas foram
acometidas, com o desenvolvimento mais frequente de doença leve, exceto pelas cepas
O26:H11 e O165:NM que levaram ao desenvolvimento de SHU (SOUZA et al., 2011; GUTH
et al., 2002b). Cepas de STEC O157 foram detectadas em 10 casos de diarreia com sangue,
reportados em São Paulo, no período de 1990 a 2011 (SES/SP; CCD; CVE, 2011).
Não existem dados epidemiológicos oficiais para outros Estados do Brasil, nem para o
país como um todo, em relação à STEC. Como as cepas não-O157 são as que mais circulam
no país e estas, em geral, causam sintomas mais brandos, é possível que os casos de infecção
por STEC sejam subnotificados. Além disso, a maior parte dos casos de gastrenterites
notificados no país não tem o agente etiológico identificado (BRASIL, 2015) e os métodos de
detecção ideais para essa categoria de bactéria não estão totalmente estabelecidos e não
podem ser realizados em todos os laboratórios.
Mesmo infecções brandas trazem prejuízos aos indivíduos e sociedade, seja
economicamente, ou se ocorrerem de forma crônica, podem afetar o estado de nutricional em
longo prazo. E ainda que poucos casos de doença grave ocorram, como SHU, a vigilância não
se torna menos importante, uma vez que, os mais acometidos são indivíduos de saúde mais
frágil e por se tratar de uma infecção em que há risco de morte ou de desenvolver sequelas
crônicas.
3.1.5.2 STEC no leite bovino
Alimentos de origem bovina e outros que possam ter contato com STEC (a partir de
água, poeira ou vetores, por exemplo) têm grande chance de contaminação. No Brasil STEC
já foi detectada em carne bovina moída, em moedor de carne, leite cru, queijo minas frescal, e
em água de consumo humano e animal de propriedades leiteiras (CALDORIN et al., 2013).
Farrokh et al. (2013) realizaram uma revisão a fim de observar a importância dos
produtos lácteos em relação a categoria STEC. Em leite cru bovino, a prevalência de STEC na
África variou de 0 a 0,8%, na América de 0 a 12,2%, na Ásia de 0,4 a 1,7% e na Europa de
0,4 a 21%. Em leite bovino pasteurizado, STEC esteve presente em apenas 1% das amostras
(FARROK et al.,2013). No Brasil a ocorrência de STEC no leite cru variou entre 3,3 a 18,1%
(VICENTE, AMARAL E CERQUEIRA, 2005; SANDRINI et al.,2007; STELLA, 2009;
VENDRAMIN et al., 2014).
25
3.1.5.3 STEC no reservatório bovino
O gado bovino tem se apresentado como o principal reservatório de STEC. Dados da
presença de STEC no gado bovino foram revisados (HUSSEIN; BOLLINGER, 2005;
HUSSEIN; SAKUMA, 2005) e a proporção de STEC O157 e não-O157 observada nesses
animais se encontra no Quadro 2. Muitos dos sorotipos isolados em reservatórios bovinos são
relacionados à doença humana (HUSSEIN; BOLLINGER, 2005; HUSSEIN; SAKUMA,
2005).
Quadro 2. STEC O157 e não-O157 no gado bovino de corte e de leite.
Tipo de
Gado
Sorotipos
Referência
O157 % não-O157 % Relacionados à
doença humana
Leite 0,2%-48,8% 0,4%-74% 24 (SHU)
Hussein;
Bollinger,
2005
Corte 0,2%-27,8% 2,1-70,1% 44 (SHU)
37 (Diarreia ou CH)
Hussein;
Sakuma,
2005
A ocorrência de STEC no Brasil foi recentemente revisada por Caldorin et al. (2013).
Tal revisão demostrou que STEC já foi detectada no país em carcaça e fezes de bovinos
(sadios ou com diarreia, de corte ou de leite) de diferentes faixas etárias, com taxas que
variaram de 1,4 a 71%. Considerando apenas a pesquisa de STEC nas fezes bovinas a
variação encontrada entre os estudos levantados por Caldorin et al. (2013) foi de 5,2 a 82% no
gado de leite e de 10 a 57% no de corte, como mostra o Quadro 3.
26
Quadro 3. Isolamento de STEC em fezes de bovino leiteiro e de corte no Brasil, no período
de 1999 a 2012.
Local Tipo de Gado Isolamento de STEC
Referência n %
Rio de Janeiro Leiteiro Sadio
Corte Sadio
Total
99/121
40/76
139/197
82%
53%
71%
Cerqueira et al.,
1999
São Paulo Bezerros de Corte:
Com diarreia
Sadio
Total
28/139
16/205
44/344
20%
7,8%
12,7%
Leomil et al.,
2003
Rio Grande do
Sul
Leiteiro Sadio
119/243 49% Moreira et al.,
2003
Região
Centro-Oeste
Corte com diarreia 102/205 49,8% Salvadori et al.,
2003
São Paulo Leiteiro Sadio 39/153 25,5% Irino et al., 2005
Noroeste do
Estado de São
Paulo
Leiteiro (bezerros)
com diarreia
9/173 5,2% Rigobelo et al.,
2006
Pelotas/RS Leiteiro Sadio 119/243 48,9% Sandrini et al.,
2007
Paraná Corte Sadio 61/107 57% Farah et al., 2007
São Paulo Corte:
Com diarreia
Sadio
Total
31/264
24/282
55/546
12%
8,5%
10%
Aidar-
Ugrinovich et al.,
2007
Paraná Corte Sadios 70/190 37% Pigatto, 2008
Ribeirão
Preto/SP
Leiteiro Sadio 86/466 18,45% Stella, 2009
São Paulo Corte Sadio 42/100 42% Carvalho et al.,
2012
27
n: número de amostras positivas para STEC/número de amostras investigadas.
Adaptado de CALDORIN et al., 2013.
A importância do gado bovino como reservatório não está somente no fato de
bactérias desta categoria ser amplamente detectadas nesses animais, mas, principalmente,
devido ao fato de várias cepas isoladas estarem relacionadas ao desenvolvimento de doença
grave em humanos (HUSSEIN; BOLLINGER, 2005; HUSSEIN; SAKUMA, 2005).
Dados sugerem que a excreção de STEC por ruminantes pode ser influenciada por
vários fatores como estação do ano (clima), apresentando pico nos meses mais quentes, área
geográfica, idade do animal, tipo de dieta, estresse, tamanho e tipo de alojamento do rebanho,
saúde dos animais, e contaminação prévia dos mesmos (FARROKH et al., 2013). Até mesmo
a localização da colonização de STEC no animal influencia na persistência e excreção da
bactéria pelos bovinos, sendo que a colonização da junção reto-anal estaria relacionada com
uma elevada eliminação de STEC nas fezes de alguns animais (ETCHEVERRÍA; PADOLA,
2013).
A idade dos animais tem impacto na prevalência de O157:H7, se apresentado mais alta
entre animais com 2 a 24 meses de idade do que no bovino mais velho, no entanto para STEC
não-O157 o impacto da idade na prevalência não está claro, sendo dados em que a prevalência
de não-O157 foi maior em bovinos mais velhos (HUSSEIN; SAKUMA, 2005). Já os estudos
avaliando o efeito de diferentes tipos de alimentos e formas de alimentação na excreção de
STEC por bovinos dão enfoque apenas ao sorogrupo O157 e apresentam resultados
conflitantes e inconclusivos (SMITH; FRATAMICO; GUNTHER, 2014).
STEC pode sobreviver por longos períodos nas fezes e em superfícies inorgânicas
(FUKUSHIMA; HOSHINA; GOMYODA, 1999; RANDALL; WRAY; DAVIES, 1999).
Uma vez que o bovino despeja a bactéria em suas fezes, estas podem contaminar o ambiente.
A contaminação do gado pode se dar de forma indireta, a partir de água ou outras fontes
ambientais contaminadas, ou de forma direta animal-animal, sendo a introdução de novos
animais no rebanho um ponto crítico (FARROKH, 2013). STEC já foi detectada
contaminando vários pontos dentro das fazendas como o chão e divisores das baias, na
alimentação dos animais, água e manipuladores, podendo servir como fontes de transmissão
desse patógeno aos animais (COBBOLD; DESMARCHELIER, 2002; FAITH et al., 1996;
RAHN et al., 1997; SHERE; BARTLETT; KASPAR, 1998).
McGee et al. (2004) ao estudarem a transmissão horizontal de STEC O157:H7 durante
o alojamento do gado no inverno observaram rápida contaminação do ambiente. Novilhos
foram agrupados em seis baias com cinco animais cada, onde um animal anteriormente
28
inoculado com uma cepa marcada de O157:H7 e, comprovadamente apresentando excreção
da bactéria, foi colocado em cada baia. Após 24 horas foram observadas as primeiras
amostras de água, de pele dos animais e das barreiras separando as baias contaminadas pela
cepa O157:H7 marcada. Em três dias o primeiro animal não inoculado apresentou resultado
positivo para STEC nas fezes, sendo que ao final de 23 dias, 15 dos 30 animais não
inoculados apresentaram, em algum momento, a cepa marcada de STEC (MCGEE et al.,
2004). A alimentação dos animais foi analisada uma vez e apresentou resultado negativo. Em
algumas baias todos os animais apresentaram STEC na pele, após 24 horas. Segundo os
autores, embora tenha ocorrido a disseminação da bactéria rapidamente no ambiente, o
número de amostras positivas para os mesmos sítios diminuiu com o tempo. Porém, mesmo
nos últimos dias de estudos, quando as amostras dos sítios pesquisados eram negativas, alguns
animais começaram a excretar STEC, sugerindo a contaminação da pele dos animais como
provável fonte de contaminação entre os animais (MCGEE et al., 2004).
A forma de alojamento desses animais também parece interferir na disseminação do
patógeno e na contaminação do ambiente. Cobbold e Desmarchelier (2002) observaram maior
taxa de disseminação de STEC (O136:H16 marcada) entre bezerros que estavam alojados em
grupos, do que entre os que ficavam em baias individuais. No mesmo estudo o chão da baia e
a pele dos animais foram os pontos ambientais mais contaminados, havendo maior
contaminação ambiental na fazenda com o alojamento em grupo (COBBOLD;
DESMARCHELIER, 2002).
Gautam et al. (2015) observaram um aumento significativo na taxa de transmissão de
STEC O157:H7 entre bezerros com o aumento dos níveis de contaminação ambiental. A
transmissão direta pareceu ter um papel mínimo na transmissão, demostrando a importância
de reduzir a bactéria no ambiente (GAUTAM et al., 2015). No entanto, essa carga de
contaminação do ambiente teria maior importância em locais onde existe baixo número de
infectados (WANG; GAUTAM; PINEDO et al., 2014).
Segundo Gautam et al. (2011) a água de beber contaminada é a principal fonte de
transmissão de STEC O157:H7 em bovinos, principalmente em meses mais quentes.
Temperaturas ambientes mais altas favoreceriam a replicação mais rápida da bactéria, fator
que somado a taxas de reposição da água mais lentas aumentariam a carga de STEC na água
(GAUTAM et al., 2011). Desse modo, melhorias nas medidas de limpeza no ambiente das
propriedades se apresentariam como ponto importante no controle de STEC no bovino, ao
proporcionar uma diminuição na concentração da bactéria no ambiente e assim reduzindo a
taxa de propagação da contaminação (WANG; GAUTAM; PINEDO et al., 2014).
29
3.2 O LEITE
O leite é considerado um alimento completo. É fonte de proteínas de alto valor
biológico necessárias à formação e manutenção de tecidos corporais, enzimas e de outras
proteínas funcionais; é rico em vitaminas, principalmente a vitamina A, importante na
manutenção de tecidos de rápida proliferação, como pele e células imunes; bem como em sais
minerais como o fósforo, magnésio e principalmente cálcio, que além de ser o principal
constituinte da massa óssea apresenta atuação na contração muscular, transmissão de
impulsos nervosos, coagulação sanguínea, regulação hormonal, de sistemas enzimáticos e na
formação da estrutura dentária (SHILLS, 2009). Ao mesmo tempo, o leite e seus derivados
estão na lista de principais alimentos atribuídos ao desenvolvimento de surtos de doenças de
origem alimentar no Brasil (BRASIL, 2015). A maior importância do leite na dieta está
principalmente relacionada ao seu teor de cálcio, uma vez que este grupo alimentar é
considerado a principal fonte deste micronutriente na alimentação humana (FAO, 2013).
O nível de consumo de leite e derivados varia com a idade, o sexo, nível de renda,
grau de escolaridade, entre outros fatores, porém, é um grupo de alimentos amplamente
consumido e, apenas uma pequena parcela da população não consumiria nenhum alimento
desse grupo (MUNIZ; MADRUGA; ARAÚJO, 2013).
O leite cru é matéria-prima para produção do leite e dos derivados que chegam ao
consumidor e sua qualidade irá interferir no produto final. Em muitos países o leite cru e
produtos produzidos a partir dele têm sido atribuídos à ocorrência de surtos de doença
alimentar, inclusive por STEC (FARROKH, 2013; SMITH; FRATAMICO; GUNTHER,
2014). No Brasil a comercialização do leite cru para consumo é proibida (BRASIL, 1969), no
entanto, o leite pasteurizado também pode ser veículo de doenças se não for processado
corretamente. O consumo de leite pasteurizado no Brasil é muito pequeno, sendo mais comum
em áreas rurais (IBGE, 2010), no entanto, muitos derivados do leite são produzidos a partir do
leite pasteurizado.
O Brasil é um dos maiores produtores de leite cru no mundo, porém, o gado do país é
pouco produtivo. A maior parte dos produtores é de pequenos proprietários com pouca
capacitação técnica, sendo que o maior volume de leite é produzido por uma minoria de
grandes produtores (IBGE, 2011). Assim, uma parte do leite cru produzido nas pequenas
propriedades não atinge níveis satisfatórios de qualidade tanto sensorial quanto sanitária, o
que além de oferecer risco à saúde torna a produção brasileira pouco competitiva (BRASIL,
2014a).
30
Diante da importância da pecuária bovina (de leite e de corte) no país, não apenas para
produção de alimentos, mas também na geração de empregos e na economia nacional, os
órgãos públicos responsáveis pela regulamentação da atividade pecuária, vêm, ao longo dos
anos, procurado formas de melhorar a qualidade do leite cru no Brasil, tendo também planos
de fomentar o consumo e aumentar a produtividade do leite no país (BRASIL, 2014a). Assim,
em busca da melhoria continua no setor, o Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA) publicou, em 2011, a Instrução Normativa nº 62, em substituição a
Normativa nº 51, regulamentando a produção, identidade, qualidade, coleta e transporte do
leite tipo A, leite cru refrigerado e leite pasteurizado (BRASIL, 2011). A IN nº2 dispõe, entre
outras coisas, sobre as condições higiênico-sanitárias gerais e específicas que devem ser
seguidas na obtenção do leite cru, sendo de grande importância na obtenção de uma matéria
prima de qualidade e na prevenção da contaminação do leite cru por bactéria patogênicas
como STEC.
3.2.1 Boas práticas para obtenção do leite cru
A qualidade do leite cru pode ser afetada por diversos fatores como raça do gado,
alimentação oferecida, manejo, cuidado e saúde dos animais, assim como pela carga
microbiológica inicial que depende de procedimentos de higiene e controle antes, durante e
após a ordenha (RODRIGUES, 2013). Ao ser sintetizado e secretado nos alvéolos da glândula
mamária o leite é estéril, o manuseio e armazenamento podem contaminá-lo com
microrganismos presentes em várias fontes do ambiente da fazenda. Os microrganismos
contaminantes podem ser patogênicos e deterioradores e essa contaminação microbiana
prejudica a qualidade do leite, interfere na industrialização, reduz o tempo de prateleira do
leite fluido, dos derivados lácteos e pode colocar em risco a saúde do consumidor
(MADALENA et al., 2001).
A contaminação fecal, que pode ocorrer de forma direta ou indireta, e é a principal
forma de contaminação do leite cru por STEC; outra via menos comum de contaminação do
leite cru com STEC, seria a via intramamária por animais apresentando mastite subclínica
(FARROKH et al., 2013).
A mastite, que é a inflamação do úbere, pode ter origem contagiosa, passada do úbere
de um animal para outro através das mãos ou equipamentos de ordenha, ou origem ambiental,
que ocorre, principalmente, quando os esfíncteres dos tetos ainda estão abertos (após a
31
ordenha) e tem contato com solo, piso dos currais ou outros pontos onde existem
microrganismos que vão causar inflamação ao entrarem no canal das tetas, sendo E.coli uma
das espécies de microrganismos mais envolvidos no desenvolvimento de mastite ambiental
(FLORIÃO, 2013). Por isso, a higiene no procedimento de ordenha é importante, assim como
recomenda-se que os animais sejam mantidos de pé até, no mínimo, uma hora após a ordenha
para evitar o contato dos tetos com o solo/piso quando os esfíncteres ainda estão abertos
(RODRIGUES, 2013), estando esta recomendação na própria legislação (BRASIL, 2011).
Como STEC está comumente presente no gado sendo eliminada nas fezes, erradicar
este microrganismo nas fazendas é praticamente impossível. Logo, medidas preventivas ou
curativas devem ser encontradas e adotadas a fim de manter um nível de STEC aceitável na
fazenda e impedir a contaminação do leite com material fecal (FARROKH et al., 2013). O
contato do leite cru com microrganismos provenientes de material fecal pode ocorrer durante
e após a ordenha, através de contaminação na superfície das tetas, do úbere, utensílios e
equipamentos de ordenha, manipulador, bem como outros pontos ambientais contaminados.
Outros pontos importantes são a higiene e estrutura do local em que o procedimento de
ordenha é realizado, o uso de água tratada bem como a saúde e o manejo dos animais. Assim,
todos esses pontos necessitam de medidas sanitárias que evitem contaminação por
microrganismos no leite (DÜRR, 2012; FLORIÃO, 2013; RODRIGUES, 2013).
Os cuidados na obtenção do leite cru não compreendem apenas a rotina de ordenha em
si, mas também se estendem ao local de realização e aos procedimentos antes e após a
ordenha. A saúde dos animais deve ser constantemente monitorada, havendo controle de
parasitoses, bruceloses, tuberculose, das mastites, bem como sinais de outras doenças. A
entrada de novos animais deve ser criteriosa e o rebanho não deve ter contado com animais
desconhecidos. Para evitar a proliferação de microrganismos (inclusive STEC) o ambiente da
propriedade deve ser limpo havendo remoção frequente das fezes dos animais; bebedouros e
comedouros devem ser de fácil limpeza, sendo higienizados e reabastecidos periodicamente.
A compostagem do esterco realizada de forma correta destrói ao menos STEC não-O157
(SMITH; FRATAMICO; GUNTHER, 2014).
A área de espera e a sala de ordenha devem ser cobertos e arejados, conectados com
trajeto retilíneo; o dimensionamento deve ser adequado a acomodação de cada animal, com
pisos e paredes de material durável, de fácil higienização e ásperos para proporcionar
segurança. A água de consumo e de higienização do ambiente deve ser potável e
constantemente avaliada. Sendo importante o controle de pragas que podem contaminar o
ambiente e utensílios e o próprio leite se mal armazenado. Todo o manejo dos animais deve
32
ser feito de forma que não cause estresse, bem como devem ser estabelecidos horários fixos
para toda a rotina do gado que se adapta facilmente (DÜRR, 2012; FLORIÃO, 2013;
RODRIGUES, 2013).
Quanto à rotina de ordenha em si, os animais devem ser conduzidos e alocados na sala
de ordenha tranquilamente, sem agressões por um indivíduo diferente daquele que irá
ordenhar o animal para evitar contaminação. O ordenhador deve estar saudável, sem
ferimentos nas mãos, os cabelos presos e protegidos, com vestimentas e botas limpas; deve
lavar as mãos e os antebraços com sabão neutro antes de higienizar as tetas da vaca, antes de
iniciar a ordenha e após ordenhar cada animal, recomendando-se o uso de luvas durante a
ordenha (DÜRR, 2012; FLORIÃO, 2013; RODRIGUES, 2013). Segundo a legislação, antes
da ordenha, as tetas devem ser lavadas com água corrente e secas com papel toalha
descartável. O procedimento de assepsia após ordenha deve ser obrigatoriamente realizado em
todas as propriedades (BRASIL, 2011). Os procedimentos de higiene na ordenha se
encontram no Quadro 4. Os utensílios e equipamentos (ordenha mecânica e manual) devem
ser lavados com água aquecida após cada ordenha usando detergentes regularizados, inodoros
e de acordo com a recomendação dos fabricantes (DÜRR, 2012; FLORIÃO, 2013;
RODRIGUES, 2013). Após a ordenha o leite cru deve ser coado e refrigerado conforme
estabelecido na legislação (BRASIL, 2011).
Quadro 4. Procedimentos de higiene na rotina de ordenha.
Momento Procedimento
Pré -Ordenha
Lavagem das tetas com água tratada corrente; o úbere só deve ser
lavado quando houver excesso de sujidades como lama ou fezes.
Desinfecção das tetas com solução desinfetante adequada (pré-
dripping) por 30 segundos; de preferência utilizando aplicador sem
retorno para não contaminar o conteúdo desinfetante ou realizar a
troca ou desinfecção do aplicador.
Secagem das tetas com papel toalha descartável.
Ordenha Com as mãos higienizadas proceder a ordenha descartando os
primeiros jatos em recipiente de fundo escuro; na ordenha
33
mecânica após o descarte dos primeiros jatos posicionar
adequadamente as teteiras higienizadas.
Pós- Ordenha Desinfecção das tetas com solução desinfetante adequada (pós-
dripping) por 30 segundos; de preferência utilizando aplicador sem
retorno para não contaminar o conteúdo desinfetante ou realizar a
troca ou desinfecção do aplicador.
Os animais devem ser mantidos de pé por tempo necessário para os
esfíncteres se fecharem levando as vacas aos comedouros
(BRASIL, 2011).
DÜRR, 2012; FLORIÃO, 2013; RODRIGUES, 2013.
Segundo Dürr (2012) mesmo em condições máximas de higiene algum nível de
contaminação vai ocorrer. No entanto, todos estes procedimentos irão fazer com que o
número inicial de microrganismos no leite cru seja baixo e diminuirão as chances de contato
com material fecal onde STEC e outras bactérias patogênicas podem estar presentes. Dados
de estudos sugerem que, com adequadas medidas higiênicas é possível, mesmo havendo
animais infectados com STEC na propriedade, que o leite cru não apresente STEC (CHUEH
et al., 2002). Além disso, as Boas Práticas Pecuárias têm se mostrado eficazes na melhoria da
qualidade microbiológica do leite cru (GUERREIRO et al.,2005; LEITE JUNIOR et al.,2011;
BELOTI et al., 2012).
No Brasil, a pasteurização deve ser realizada sob aquecimento à 72 - 75ºC por 15 - 20
segundos (BRASIL, 2011), sendo esta temperatura considerada eficiente em eliminar
microrganismos patogênicos do leite (OLIVER et al., 2009), inclusive STEC (D’AOUST et
al., 1988). Para isso, o processamento do leite deve ser adequadamente realizado sendo
atingidos o tempo e temperatura preconizados, além de apresentar adequada higiene dos
equipamentos utilizados a fim de evitar contaminação cruzada após a pasteurização. Assim,
uma vez que STEC entre na cadeia produtiva do leite, seja na ordenha ou em qualquer outro
ponto e chegue até a planta da indústria de beneficiamento, existe a possibilidade de
contaminação do leite pasteurizado por STEC caso não sejam seguidos rigorosos padrões
higiênicos do processamento ao envase, ou caso não se atinjam as condições de aquecimento
estabelecidas.
34
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
O presente estudo foi conduzido em cinco propriedades rurais situadas na Região
Noroeste do Estado do Rio de Janeiro, no período de agosto a outubro de 2014. Das cinco
propriedades estudadas, duas trabalhavam em regime de ordenha manual e três em regime de
ordenha mecânica. Foram realizadas três viagens para coleta de amostras. Cada propriedade
rural fornece diariamente à indústria em torno de 30 a 80 litros de leite cru, obtidos através de
ordenha mecânica ou manual.
Este estudo foi desenhado para investigar a presença de STEC nas fezes do gado
leiteiro, a partir de swab retal, e no leite cru recém-ordenhado. Este projeto foi aprovado pela
Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa (CEUA) da Universidade Federal
Fluminense sob o registro de n° 558.
4.2 AMOSTRAGEM
Nas duas propriedades que trabalham em regime de ordenha manual foi obtida uma
amostra de leite correspondente a cada animal cujo swab retal foi coletado (23 swabs e 23
amostras de leite cru), pois, o leite de cada animal era ordenhado individualmente. Nas
propriedades com regime de ordenha mecânica, o leite de mais de um animal era depositado
no mesmo recipiente. Assim, as amostras de leite destas propriedades corresponderam a uma
mistura do leite de mais de um animal avaliado, resultando em 40 amostras de swab retal e 12
amostras de leite cru, pois mais de um animal era ordenhado em um mesmo momento, indo o
leite destes animais para um único recipiente.
35
4.3 COLETA DAS AMOSTRAS
4.3.1 Material fecal
O material fecal foi coletado a partir de swab retal, sendo transferido imediatamente
para o meio de transporte Cary & Blair (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), armazenado
em caixa isotérmica, com espaço amplo, com sachês de gelo, para manter a temperatura
uniforme entre 1°C e 8°C (ISO 7218, 2007) e transportado até o Laboratório de Higiene e
Microbiologia de Alimentos, na Faculdade de Farmácia, da Universidade Federal Fluminense.
No laboratório as amostras foram mantidas à 4ºC, sendo estas analisadas em, até, no máximo,
7 dias após a coleta.
4.3.2 Leite cru recém-ordenhado
As amostras de leite cru foram coletadas a partir do recipiente onde o leite era
depositado, logo após a ordenha. Foram coletados 50 mL de leite, em tubos plásticos cônicos
estéreis, identificados no local, sendo acondicionados e transportados em caixa isotérmica,
com espaço amplo, com sachês de gelo, para manter a temperatura uniforme entre 1°C e 8°C
(ISO 7218, 2007). Todo material foi mantido sob refrigeração, por até no máximo 24 horas
entre a coleta e o momento das análises.
4.4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
A pesquisa de STEC, a partir de cada swab retal, contendo a amostra fecal, foi
realizada deslizando o próprio swab por toda a superfície do meio ágar CLED (Cystine
Lactose Eletrolyte Deficient Agar, Difco, USA) e incubado a 35ºC por 18 a 20 h.
Uma alíquota de 25 mL de cada amostra de leite foi adicionada a 225 mL de caldo
BHI (Brain Heart Infusion, Acumedia, Michigan, USA), sendo incubados por 3 h a 35°C.
Após este período, 100 µl da cultura em caldo BHI foi semeada em ágar CLED e incubadas a
35°C por 18 a 20 h.
O crescimento polimicrobiano em CLED, a partir de cada amostra de leite e swab
retal, foi suspenso em PBS (Phosphate Buffered Saline) 0,01M (pH 7,2). Uma alíquota de 0,5
36
mL de cada suspensão polimicrobiana foi adicionada a 0,5 mL de caldo TSB (Tryptone Soya
Broth, BBL, USA) adicionado de 20% (v/v) de glicerol (TSB-G), sendo congelada a -20°C, e
outra alíquota foi submetida a extração do DNA.
4.5 EXTRAÇÃO DO DNA DA CULTURA POLIMICROBIANA
Uma alíquota de 100 µl da suspensão polimicrobiana em PBS foi adicionada a 900 µl
de água ultra pura, sendo submetido a aquecimento a 100°C por 10 min, seguido de
resfriamento em gelo, ocorrendo a lise celular e a desnaturação do Trifosfato
Desoxinucleótido (DNA). Após a desnaturação do DNA a suspensão foi centrifugada a 1000
rpm x por 1 minuto, sendo o sobrenadante utilizado como fonte de DNA molde.
4.6 PESQUISA DO GENE stx
A pesquisa do gene stx, marcador da categoria STEC, foi realizada através da PCR
uniplex, utilizando os primers M1 (5’ATACAGAG(GA)G(GA)ATTCCGT3’) e M2
(5’TGATG(AG)CAATTCAGTAT3’), como descrito por Paton et al. (1993), com algumas
modificações. Este par de primers permite a amplificação da sequência de gene que codifica a
subunidade A em stx1 (215 pares de base -nucleotídeos 586-800) e em stx2 (212 pares de base
- nucleotídeos 583-794). A reação da PCR, denominada mix foi realizada em um volume final
de 30 µL, composto por tampão PCR (10 X) (Sinapse®, USA), MgCl2 1,5 mM (Sinapse®,
USA), 10 mM de cada iniciador (Invitrogen®, USA), 2,5 mM de dNTP (Invitrogen®, USA) e
2 U de Taq DNA polimerase (Sinapse®, USA) e 5 µL da amostra de DNA alvo. Foram
utilizadas as cepas E. coli DH5 como controle negativo e E.coli EDL 933 como controle
positivo. A água foi utilizada como controle da reação. Os tubos foram levados ao
termociclador (Veriti® 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems®) sendo as condições
de amplificação de, 1 ciclo de 94°C por 5 min, 30 ciclos de 94°C por 1 min, 47°C por 1 min,
72°C por 1,30 e 1 ciclo final de 72°C por 5 min. Após amplificação, o produto da PCR
(amplicon) foi submetido a eletroforese em gel de agarose a 1,5% (p/v). Nos slots do gel
foram aplicados os controles, as amostras em teste e o marcador de peso molecular 1 Kb DNA
Ladder (Invitrogen®, USA). À todas as amostras e controles, foram adicionados previamente
3 µL do corante azul de bromofenol com a finalidade de aumentar a densidade do DNA,
facilitando a dispersão das bandas e o acompanhamento da corrida. A voltagem utilizada foi
37
de 90 V mantendo-se a amperagem em torno de 80 mA, condições em que a “corrida” durava
90 min.
4.7 PESQUISA DO GENE rfbO157
Foi pesquisado, através da PCR uniplex, em todas as suspensões polimicrobianas stx-
positivas, o gene rfbO157 (PATON; PATON, 1999), que codifica para os polissacarídeo
O157. Em um volume final de 50 µL composto por tampão PCR (10 X) (Sinapse, USA),
MgCl2 1,5 mM (Sinapse, USA), 10 nM de cada iniciador (Invitrogen, USA), 2,5 mM de
dNTP (Invitrogen, USA) e 2 U de Taq DNA polimerase (Sinapse, USA) foi adicionado 5,0
µL de DNA alvo. As condições de amplificação ocorreram em 10 ciclos a 95°C por 60 seg,
65°C por 120 seg, 72°C por 90 seg, seguido de 15 ciclos de 95°C por 60 seg, 60°C por 120
seg, 72°C por 90 seg, finalizando com 10 ciclos de 95°C por 60 seg, 60°C por 120 seg, 72°C
por 150 seg. O produto amplificado com tamanho de 259 pares de base foi submetido à
eletroforese e fotografado.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A diferença entre ocorrência do gene stx entre as amostras fecais e amostras de leite
cru e entre as amostras coletadas nas propriedades com regime de ordenha manual e ordenha
mecânica foi analisada e comparada pelo teste exato de Fisher, utilizando o programa
GraphPad Prisma 5.0. Todos os testes estatísticos com valor de P < 0,05 foram considerados
estatisticamente significativos.
38
5 RESULTADOS
Do total de 63 amostras de swab retal (amostras fecais) analisadas, 56 (88,9%)
apresentaram o gene stx, enquanto que das 35 amostras de leite cru recém-ordenhado, 17
(48,6%) apresentaram o gene marcador da categoria STEC (Tabela 1).
Tabela 1. Pesquisa do gene stx nas amostras fecais (swab retal) e leite cru recém-ordenhado
por propriedade rural, segundo o tipo de ordenha.
Propriedade Tipo de
ordenha
N° de amostras
fecais fecais stx+
(%) leite cru
leite cru stx+
(%)
A manual 14 14 (100) 14 3 (21,4)
B manual 9 8 (88,9) 9 8 (88,9)
C mecânica 10 9 (90) 5 1(20)
D mecânica 14 11(78,6) 2 1(50)
E mecânica 16 14 (87,5) 5 4(80)
Total 63 56 (88,9) 35 17 (48,6)
STEC foi detectada em todas as propriedades rurais avaliadas, tanto em amostras
fecais quanto em amostras de leite cru recém-ordenhado, independente do tipo de ordenha. O
percentual de amostras fecais stx-positivo nas propriedades rurais variou entre 78,6 e 100%,
enquanto o percentual de amostras de leite cru recém-ordenhado stx-positivo variou entre 20 e
88,9%. A propriedade rural A, com regime de ordenha manual, apresentou o maior percentual
(100%) de amostras fecais stx-positivas, seguida da propriedade C (90%), com regime de
ordenha mecânica. No entanto, quando avaliamos as amostras de leite cru recém-ordenhado,
observamos que estas propriedades apresentaram os menores percentuais (propriedade A,
21,4% e propriedade C, 20%) de amostras stx-positivas (Tabela1).
O gene stx pode ser detectado em um total de 73 amostras (fecais e leite cru recém-
ordenhado). Entre estas amostras, podemos observar que a ocorrência do gene stx foi muito
maior entre as amostras fecais, sendo essa diferença significativa (p< 0,0001) (Figura 1).
39
stx + stx -0
20
40
60
80
swab retal
leite cru76,7%
23,3%
28%
72%
n°
de a
mo
str
a
Figura 1. Pesquisa do gene stx nas amostras fecais (swab retal) e leite cru recém-ordenhado.
Foi observado que, nas propriedades com regime de ordenha manual, 22 (95,7%)
amostras fecais e 11 (47,8%) amostras de leite cru recém-ordenhado apresentaram o gene stx.
Enquanto nas propriedades com regime de ordenha mecânica, observou-se que 34 (85%)
amostras fecais e seis (50%) amostras de leite cru recém-ordenhado apresentaram este gene
(Tabela 2). Nas propriedades com ordenha manual cada uma das amostras de leite cru recém-
ordenhado (retirado do balde) era correspondente a um único animal, cujo material fecal foi
coletado através de swab retal. Já nas propriedades com ordenha mecânica cada amostra de
leite cru recém-ordenhado (retirada do galão) correspondeu entre 2 e 8 animais, sendo
também coletado material fecal destes animais através de swab retal. Cada amostra de leite
cru das propriedades com ordenha mecânica estava relacionada a pelo menos um animal
infectado por STEC (material fecal stx-positivo). Em uma propriedade com ordenha manual
(propriedade B) uma das amostras de leite cru recém-ordenhado apresentou o gene stx, no
entanto, o swab retal correspondente ao animal ordenhado, se mostrou negativo para este
gene.
40
Tabela 2. Número de amostras fecais (swab retal) e amostras de leite cru recém-ordenhado
quanto a pesquisa do gene stx, segundo o tipo de ordenha.
Tipo de
ordenha
N° de amostras fecais N° de amostras de leite cru
stx + (%) stx - (%) Total stx + (%) stx - (%) Total
manual 22 (95,7) 1 (4,3) 23 11 (47,8) 12 (52,2) 23
mecânica 34 (85) 6 (15) 40 6 (50) 6 (50) 12
Total 56 (88,9) 7 (11,1) 63 17 (48,6) 18 (51,4) 35
stx +: stx-positivo; stx-: stx-negativo
Não houve diferença significativa na ocorrência do gene stx entre as propriedades com
ordenha manual e mecânica, tanto entre as amostras fecais (p =0,04) quanto de leite cru
recém-ordenhado (p=1,0) (Figura 2).
Figura 2. Presença do gene stx entre as amostras de swab retal e leite cru recém-ordenhado de
acordo com o tipo de ordenha (manual e mecânica).
As 56 suspensões polimicrobianas de origem fecal stx-positivas e as 17 suspensões
polimicrobianas obtidas a partir das amostras de leite cru recém-ordenhado, foram submetidas
a PCR uniplex para pesquisa do gene rfbO157. Observamos sete (12,5%) suspensões
polimicrobianas de origem fecal positivas para o gene rfbO157 (Figura 3). Nenhuma
swab retal leite cru0
20
40
60
ordenha manual
ordenha mecânica
39,3%
60,7%
64,7%
35,3%n°
de a
mo
str
a
41
suspensão polimicrobiana obtidas a partir das amostras de leite cru recém-ordenhado
apresentou o gene rfbO157.
Figura 3. Distribuição dos sorogrupos O157 e não-O157 entre as amostras fecais bovina.
12,50%
87,50%
O157 não-O157
42
6 DISCUSSÃO
Neste trabalho adotamos a PCR para a triagem das amostras carreadoras do gene stx,
com grande economia de recursos e tempo. Devido a sua alta sensibilidade, especificidade e
rapidez, a técnica da PCR pode desempenhar com sucesso o papel de método de triagem,
tornando-se uma importante ferramenta para estudos epidemiológicos. A detecção de genes a
partir de amostras de alimentos não garante o isolamento de células viáveis, no entanto, a
presença do gene stx é indicativa da ocorrência de STEC.
STEC é amplamente detectada em fezes bovinas ao redor do mundo e no Brasil. No
presente estudo, um elevado percentual (88,9%) de amostras fecais carreadoras do gene stx,
marcador da categoria STEC, foi observado. Em revisão realizada por Caldorin et al. (2013),
observou-se que o percentual de STEC em fezes do gado de leite no Brasil, no período entre
1999 e 2012, variou de 5,2 a 82%.
No Rio de Janeiro, Cerqueira et al. (1999), avaliando a prevalência de STEC nas fezes
do gado bovino, observaram que 82% do gado bovino leiteiro de 10 propriedades rurais
carreavam STEC. Tristao et al. (2007) identificaram stx em 65% das amostras de fezes
oriundas de bovinos do estado Rio de Janeiro e em 28% de bovinos do estado do Rio Grande
do Sul.
Também no Rio Grande do Sul, Moreira et al. (2003) relataram STEC em 49% dos
animais e em 95% das pequenas propriedades rurais estudadas. Em São Paulo, vários autores
descreveram a ocorrência de STEC em fezes de bovinos. Leomil et al. (2003) identificaram
STEC em 20% das amostras fecais de bezerros diarreicos e em 7,8% de bezerros saudáveis,
em 12 fazendas de diferentes regiões do estado. Irino et al. (2005) identificaram STEC em
amostras fecais bovinas de 25,5% dos animais nas seis fazendas avaliadas. Vicente et al.
(2005) detectaram STEC em 72,16% das amostras fecais de bovinos leiteiros de propriedades
de Jaboticabal. Aidar-Ugrinovich et al. (2007) isolaram STEC em 8,5% das amostras fecais
coletadas de bezerros saudáveis e em 12 % dos animais com diarreia em várias fazendas de
gado de corte de diferentes regiões do estado.
Sandrini et al. (2007) na Região de Pelotas, Rio Grande do Sul, detectaram STEC em
48,9% das amostras de fezes bovinas avaliadas. Estes autores identificaram que a temperatura
mensal média (> 22,5ºC), o índice pluviométrico (< 70mm ou > 140mm), o tamanho da
43
propriedade (< 20 hectares) e a aglomeração dos animais são fatores de risco para a
contaminação do gado por STEC. Em Minas Gerais, Andrade et al. (2012) relataram STEC
em 68,75% das amostras de fezes de bezerros em 12 fazendas do triângulo mineiro. Ferreira
et al. (2014), em Goiás, identificaram STEC em 72,73% dos animais e em 97% das fazendas
pesquisadas em Jataí.
Em estudos realizados em outros países como Austrália, França, Escócia, Espanha,
Argentina, Noruega e EUA a ocorrência de STEC em fezes bovinas variaram de 16,7% a 70%
(COBBOLD; DESMARCHELIER, 2000; FERNÁNDEZ et al., 2009; JENKINS et al.,2002;
LEJAUNE et al., 2006; OPORTO et al., 2008, PRADEL et al., 2000). Em outro estudo na
Noruega, Urdhal et al. (2003) relataram alta prevalência (64,6%) de STEC em amostras de
fezes bovinas de uma propriedade rural.
Sendo o gado bovino um importante reservatório de STEC, alimentos de origem
bovina têm grande chance de contaminação. No Brasil STEC já foi detectada em carne moída,
em moedor de carne, leite cru, queijo minas frescal, e em água de consumo humano e animal
de propriedades leiteiras (CALDORIN et al.,2013).
STEC circula no ambiente das fazendas da região estudada, visto que em todas as
propriedades rurais foi possível observar amostras fecais e de leite cru contaminadas por
STEC. Falhas de higiene durante a ordenha nas propriedades rurais avaliadas podem ter
levado à contaminação do leite cru por STEC. Neste estudo, um importante percentual
(48,6%) de amostras de leite cru recém-ordenhado apresentou contaminação por STEC.
No Brasil, existem poucos trabalhos descrevendo a ocorrência de STEC em leite.
Alguns autores descrevem percentuais de STEC em leite muito menores do que os observados
neste estudo como Vicente, Amaral e Cerqueira (2005) na região de Jaboticabal-SP (3,3% -
1/30), Sandrini et al. (2007) em Pelotas-RS (5% - 3/60), Stella (2009) na Região de Ribeirão
Preto – SP (18,1% - 4/22) e Vendramin et al. (2014) no Estado do Rio Grande do Sul (31,1 %
- 16/101).
Em outros países, alguns autores descreveram frequências variadas de STEC em leite
e derivados. Trevisani et al. (2014), nas províncias de Bolonha e Parma, Itália, encontraram o
gene stx em 12,5% do leite cru a granel coletado em tanques de refrigeração. Rantsiou,
Alessandria e Cocolin (2012), na Itália, relataram a prevalência de STEC em 42% das
amostras de laticínios produzidos com leite não pasteurizado. Martin e Beutin (2011), na
Alemanha, observaram a prevalência de STEC em 67,2% das amostras de leite cru. Em
Bangladesh, Islam et al. (2010) detectaram o gene stx em 10% das amostras de leite cru
analisadas.
44
Nas visitas às propriedades rurais foi possível observar que não haviam condições
adequadas para ordenha. O procedimento era realizado no estábulo, em chão de terra, as
vestimentas dos ordenadores eram inadequadas à função, e os equipamentos mal higienizados.
A presença de uma amostra de leite cru recém-ordenhado, positiva para o gene stx,
proveniente de um animal que não era carreador do gene stx nas fezes, demostra que pode ter
havido contaminação indireta do leite com fezes bovina (contaminação cruzada),
possivelmente através de algum utensílio, contaminação das tetas ou mãos contaminadas do
ordenhador.
No entanto, apesar das más condições higiênicas no local e procedimento de ordenha
nas propriedades avaliadas, foi também observado que entre todas as amostras stx-positivas,
somando-se amostras de swab retal e de leite cru recém-ordenhado (73 amostras), houve
maior ocorrência do gene stx entre as amostras de swab (76,7%) do que entre as amostras de
leite cru recém-ordenhado (23,3%), sendo essa diferença significativa (p<0,0001). Com a
aplicação de Boas Práticas de higiene nestas propriedades, a presença de STEC no leite cru
poderia ser ainda mais reduzida. Eliminar contaminação do leite cru é importante, uma vez
que a presença de STEC em pelo menos uma amostra de leite cru faz com que todo leite
produzido nesta propriedade seja contaminado, pois o leite de cada animal de uma mesma
propriedade será misturado em um só galão. Além disso, os leites de todas as propriedades
rurais se misturam durante as etapas da cadeia produtiva (tanque de refrigeração comunitário,
carro-tanque isotérmico, tanque de refrigeração da indústria). STEC apresenta característica
psicrotrófica podendo se multiplicar em temperatura de 8 °C (FROZI et al., 2015). Com isso,
este microrganismo pode se desenvolver no leite cru refrigerado chegando à indústria de
beneficiamento. O leite cru pode ser contaminado em vários pontos do processo de obtenção,
armazenamento e transporte, assim procedimentos de higiene empregados em toda cadeia
produtiva do leite constituem pontos de controle para a obtenção de uma matéria-prima de
qualidade.
STEC circula nas fezes do gado nas fazendas, podendo ser transmitidas de animal para
animal e estão muito presentes nas tetas dos animais de rebanhos contaminados, podendo
contaminar o ambiente, os equipamentos e mãos dos ordenhadores (FARROKH et al., 2013),
assim como, botas, roupas e água usada na limpeza do animal (CDC, 2014). O contato do
leite cru com microrganismos provenientes de material fecal pode ocorrer a partir destes
pontos contaminados, na deficiência de procedimentos adequados de higiene. Assim, todos
esses pontos necessitam de medidas sanitárias que evitem contaminação por microrganismos
no leite (DÜRR, 2012; FLORIÃO, 2013; RODRIGUES, 2013).
45
Para a produção de matéria-prima de melhor qualidade devem ser priorizadas
melhorias nas propriedades rurais, como por exemplo, no ambiente de ordenha, onde deve ser
priorizado a instalação de água corrente sob pressão e potável para a limpeza e sanitização do
ambiente de ordenha, utensílios, equipamentos e higienização das tetas e couro do animal
antes de se iniciar a ordenha, visto que STEC são excretadas nas fezes e contaminam
principalmente as tetas, couros (NASTASIJEVIC; MITROVIC; BUNCIC, 2008), e o
ambiente da fazenda (FRÉMAUX et al., 2006).
Neste estudo, observamos que STEC está presente no reservatório bovino e no leite
cru de todas as cinco propriedades rurais. Isso facilita a disseminação desta bactéria pela
região, pois a prática de venda e/ou troca de animais de leite entre as propriedades é
frequente. Erradicar STEC do gado bovino é praticamente impossível, no entanto, a aplicação
de medidas de higiene adequadas durante a ordenha pode prevenir a contaminação do leite
cru.
O percentual de amostras fecais stx-positivas de propriedades rurais com regime de
ordenha manual foi ligeiramente superior ao percentual de amostras de propriedades rurais
com regime de ordenha mecânica, no entanto, a diferença quanto ao tipo de ordenha não foi
significativa (p = 0,4). Já o percentual de amostras de leite cru recém-ordenhado stx-positivo
foi ligeiramente superior nas propriedades rurais com regime de ordenha mecânica, mas a
diferença também não foi significativa (p = 1,0). Isso demonstra que a contaminação por
STEC provavelmente está relacionada à higiene no processo de obtenção do leite empregada
em cada propriedade individualmente, independente do tipo de ordenha.
No Brasil, a maior parte das propriedades leiterias (91,5%) são compostas de pequenos
produtores, que juntos contribuem com 46,9% do leite produzido no país, estando a maior
parcela da produção (53,1%) concentrada em uma minoria de propriedades (8,5%) (IBGE,
2011). Fatores como baixo nível de instrução dos produtores, falta de assistência técnica,
manejo alimentar, reprodutivo e sanitário inadequado, são alguns dos pontos relacionados a
essa baixa produtividade do pequeno produtor (IBGE, 2006). De acordo com Simioni et al.
(2013) o aumento do nível de especialização da atividade leiteira proporciona a obtenção de
leite de melhor qualidade, menores índices de contagem de células somáticas (CCS) e
contagem bacteriana total (CBT), associadas principalmente, à maior renda proporcionada
pela atividade, apresentando maior importância econômica, o que estimula o produtor a adotar
melhores práticas de higiene na ordenha e de reprodução do rebanho.
A aplicação de Boas Práticas de Higiene na Ordenha tem se demonstrado eficaz na
diminuição da contaminação do leite cru, melhora da qualidade e adequação aos padrões
46
exigidos por lei (GUERREIRO et al., 2005; LEITE JUNIOR et al.,2011; BELOTI et al.,
2012). Porém, ao longo dos anos muitos produtores têm demonstrado dificuldades em se
adequar às legislações vigentes (NERO et al., 2005), e a cada atualização dessas legislações o
padrão de qualidade exigido se eleva.
STEC tem sido apontada, desde a década de 80, como um importante patógeno
envolvido em doença intestinal humana, capaz de evoluir para graves sequelas como SHU e
PTT. O sorotipo de STEC mais comumente envolvido em doença é O157:H7, mas outros
sorotipos podem prevalecer em certas áreas geográficas (KARMALI, 1989). As suspensões
polimicrobianas de todas as amostras de leite e fezes bovinas que apresentaram o gene stx
foram submetidas a PCR para pesquisa do gene rfbO157. Nenhuma amostra de leite cru
apresentou o gene rfbO157. Vicente et al. (2005), no estado de São Paulo, também não
encontraram STEC O157 a partir das amostras de leite cru analisadas. Em São Paulo, Ribeiro
et al. (2006) não detectaram nenhuma cepa de STEC O157 a partir de leite cru de animais
com mastite. Vicenti et al. (2008), em Jaboticabal, São Paulo, detectaram STEC O157 em três
amostras de leite cru através da PCR, porém não conseguiram isolar o microrganismo. No
Brasil, apenas um trabalho, na Bahia, descreve o isolamento de STEC O157:H7 a partir de
uma amostra de leite de leite cru (BATISTA et al., 2014).
Em outros países STEC O157 não tem sido isolada, ou tem sido isolada com baixa
frequência, a partir de amostras de leite cru. Hill et al. (2012), na Nova Zelândia, também não
detectaram STEC O157:H7 a partir de amostras de leite cru. Al-Zogibi et al. (2015), na
Arábia Saudita, isolaram STEC O157:H7 a partir de 4,81% das amostras de leite. Ivbade, Ojo
e Dipeolu (2014), na Nigéria, estudando 50 amostras de leite cru, isolaram STEC O157:H7 a
partir de uma amostra. Schoder et al. (2013), na Tanzânia, observaram que 9% das amostras
de leite cru analisadas estavam contaminadas com STEC O157:H7.
Apesar de não ter sido possível identificar o gene rfbO157 a partir das amostras de
leite, 12,5% das amostras fecais carreavam este gene. Podemos considerar que, na região
investigada, STEC O157 está presente em um importante percentual do gado bovino.
No Brasil, no estado do Rio de Janeiro, Cerqueira et al. (1999) isolaram cepas de
STEC O157 em apenas 1,5% dos animais do rebanho. Em São Paulo, Vicente et al. (2010)
detectaram STEC O157:H7 em 14,77% das fezes de bovinos leiteiros em propriedades
localizadas no município de Jaboticabal. Irino et al. (2005) e Stella (2009) também isolaram
STEC O157:H7 em fezes de bovinos. No Paraná, Farah et al. (2007) isolaram O157:H7 de
uma amostra fecal de bovino. Estudos conduzidos em vários países para determinar a
prevalência de STEC O157 em amostras de fezes de gado bovino demonstraram valores
47
próximos aos observados nesta pesquisa. Ojo et al. (2010) detectaram STEC O157 em 10,3%
das amostras de fezes coletadas no rebanho bovino na Nigéria. Nas cidades de Lichtenburg e
Rustenburg, noroeste da África do Sul, Ateba, Mbewe e Bezuidenhout (2008) isolaram STEC
O157 em 20% e 14% das amostras fecais de bovinos, respectivamente. Na Oceania, Fegan et
al. (2004) isolaram STEC O157 em 13% das amostras de fezes bovinas coletadas em
diferentes sistemas de produção (gado alimentado com grãos e com pastagem livre). No
Japão, Sasaki et al. (2011) ao estudarem o gado bovino de corte em diversas fazendas
localizadas em várias cidades japonesas, isolaram STEC O157 em 8,9% das amostras de fezes
bovinas. Na Jordânia, na cidade de Amman, Osaili, Alaboudi e Rahahlah (2013) detectaram
STEC O157 em 8,3% das amostras de fezes bovinas do rebanho bovino de corte. Minihan et
al. (2003) na Irlanda, relataram a prevalência de STEC O157 em fezes bovinas. Na Turquia,
em várias cidades da região sul do país, Aslantas et al. (2006) isolaram STEC O157 em
13,7% das amostras de swabs fecais bovinos. Ogden, Macrae e Strachan (2004) isolaram
STEC O157 em 11,2% das amostras fecais coletadas de bovinos em abatedouros de várias
regiões da Escócia.
Dados sobre a presença de STEC no gado bovino demostraram que cepas de STEC
não-O157 são encontradas em maiores proporções no gado bovino (HUSSEIN;
BOLLINGER, 2005; HUSSEIN; SAKUMA, 2005). O mesmo foi observado neste estudo.
STEC não-O157 corresponderam a 87,5% das amostras de material fecal stx-positivas.
Embora o sorotipo O157 seja mais atribuído ao desenvolvimento de doença grave, hoje são
conhecidas mais de 380 cepas de STEC não-O157 patogênicas (KARMALI; GANNON;
SARGEANT, 2010). O sorogrupo O157 é o sorogrupo mais pesquisado em todo mundo
devido à sua, já amplamente estabelecida, relação com desenvolvimento de doenças graves.
No entanto, nos últimos anos cepas não-O157 têm sido detectadas com maior frequência em
casos de infecção humana. A proporção elevada de casos por O157 reportados, em anos
passados, e o aumento recente da proporção de STEC não-O157 relacionadas á doença,
provavelmente, se deve ao maior foco que era dado a esse sorogrupo (EFSA; ECDC, 2011). O
grande surto de O104:H4 que ocorreu na Alemanha em 2011 também teve peso no aumento
da diversificação dos sorogrupos pesquisados, e no aumento do número de casos reportados
na UE/EE (EFSA; ECDC, 2011). Também é importante salientar que as técnicas de detecção
melhor estabelecidas são referentes ao sorogrupo O157. O sorogrupo O157 tem se mostrado o
mais incidente em casos de SHU, porém outros sorogrupos têm sido detectados em casos da
doença e por isso não devem ser ignorados. Dados referentes à UE e outros EE, mostram que
no período de 2007- 2009, os sorotipos mais implicados no desenvolvimento de SHU foram
48
O157 (71%), O26 (15%), O145 (5%), O111 (4%), O103 e O121 (2%), O128, O55, O114 e
O126 (1%), respetivamente (EFSA; ECDC, 2011).
No Brasil, não existem estatísticas oficiais sobre a prevalência de infecções por STEC,
porém, existem estudos em que esta categoria de bactéria foi atribuída a casos de doença, com
manifestações desde diarreia leve a SHU (CANTARELLI et al., 2000; GUTH et al., 2002a;
GUTH et al., 2002b; IRINO et al., 2002; VAZ et al., 2004; FRANZOLIN et al., 2005; TONI
et al., 2009; SOUZA et al., 2011). É importante considerar o fato de que há subnotificação de
casos de doenças transmitidas por alimentos (DTA) no país. Quando os sintomas são mais
brandos, muitos indivíduos não procuram assistência médica e assim não há notificação ou
investigação do caso. Além desse fato, dados epidemiológicos demostram que de 2000 a
2015, 58,1% dos surtos de DTA ocorridos no Brasil não tiveram o agente infeccioso
identificado, sendo que dentre os agentes identificados a espécie E. coli foi a terceira maior
responsável pelos surtos ocorridos, mas não existe identificação da categoria de E. coli
(BRASIL, 2015).
Dentre os sorotipos já associados ao desenvolvimento de doenças em humanos, além
de O157:H7, os sorotipos O26:NM; O111;NM, O111;H8, O113:H21, O118:H16, O91:H21,
também foram isoladas em fezes de bovinos no Brasil (CALDORIN et al., 2013). Muitos
destes sorogrupos são amplamente implicados em casos de infecção ao redor do mundo
(CDC, 2014; EFSA; ECDC, 2011). Além disso, no Brasil, parte dos casos de infecção por
STEC também foram atribuídas a cepas não–O157, sendo elas O91:H21, O111ac:NM,
O26:H11, O111:NM, O111:H8, O55:H19, O93:H19, O118:H16 (CANTARELLI et al.,
2000; GUTH et al., 2002a; GUTH et al., 2002b; IRINO et al., 2002; VAZ et al., 2004;
FRANZOLIN et al., 2005; TONI et al., 2009; SOUZA et al., 2011).
Três casos de infecção atribuídos à STEC O157 foram relatados por Irino et al. (2002)
em São Paulo. Dados oficiais do Estado de São Paulo, demostram que STEC O157 foi
detectada em 10 casos de diarreia com sangue, no período de 1990 a 2011 (SES/SP; CCD;
CVE, 2011). Mais recentemente imunoglobulinas contra O157 foram detectadas no soro de
crianças com SHU, precedida de diarreia, sem a bactéria ser isolada das fezes dos mesmos
(SOUZA et al., 2011).
STEC são a causa de CH e SHU em países industrializados dos hemisférios Norte e
Sul e na América do Sul a ocorrência de SHU tem grande relevância na Argentina (RIVAS et
al., 1998) e Chile (CORDOVEZ et al., 1992). Relatos de STEC associado à doença humana,
inclusive SHU, no Brasil, têm sido publicados. Portanto, as evidências até aqui acumuladas
despertam grandes preocupações quanto à emergência entre nós de surtos de doença humana
49
associada à STEC. Estudos futuros serão realizados a fim de detectar outros sorotipos de
STEC a partir das amostras de leite e fezes bovinas, e realizar o isolamento, assim como o
estudo fenotípico e genotípico das cepas O157 e não-O157 isoladas.
50
7 CONCLUSÃO
Os resultados apresentados e discutidos nos permitem concluir que:
1. A alta prevalência de STEC no leite cru indica que este produto é um veículo em potencial
de infecções causadas por este microrganismo.
2. O gado bovino leiteiro sadio da Região Noroeste do Estado do Rio de Janeiro é um
importante reservatório de STEC, incluindo o sorogrupo O157.
3. A ocorrência de STEC é significativamente maior nas fezes bovinas, quando comparado
com o leite cru recém-ordenhado.
4. O tipo de ordenha empregado não influenciou no percentual de amostras fecais bovinas e
amostras de leite cru recém-ordenhado contaminadas por STEC.
5. Para a obtenção de produtos lácteos seguros é necessária a adequação dos produtores rurais
às Boas Práticas de Higiene no Campo.
51
BIBLIOGRÁFICAS
AIDAR-UGRINOVICH, L. et al. Serotypes, virulence genes, and intimin types of Shiga
toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC) isolated from
calves in São Paulo, Brazil. International Journal of Food Microbiology, v. 115, n. 3, p. 297–
306, apr. 2007.
AL-ZOGIBI, O. G. et al. Molecular and serotyping characterization of shiga toxogenic
Escherichia coli associated with food collected from Saudi Arábia. Saudi Journal of
Biological Sciences, Riyaḍ, v.22, n.4, p.438–442, jul. 2015.
ANDRADE, G. I. et al. Identification of virulence factors by multiplex PCR in Escherichia
coli isolated from calves in Minas Gerais, Brazil. Tropical Animal Health and Production,
Edinburgh, v.44, n.7, p.1783–1790, oct. 2012.
ANTMAN, J. et al. Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) en Argentina, 2010-2013- Extracto
del Boletín Integrado de Vigilancia. 2014. Disponível em:< www.msal.gob.ar/...de.../2014-
08_informe-suh.pdf> Acesso em 18 dez. 2015.
ASLANTAS, O. et al. Isolation and characterization of verocytotoxin-producing Escherichia
coli O157 from Turkish cattle. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam,
v.106, n.3, p.338–342, fev. 2006.
ATEBA, C. N.; MBEWE, M.; BEZUIDENHOUT, C. C. Prevalence of Escherichia coli O157
strains in cattle, pigs and humans in North West province, South Africa South African Journal
of Science, Pretoria , v.104, n.1-2, p.7-8, jan./fev. 2008.
BATISTA, A. S. et al. Escherichia coli O 157: H7 em leite produzido no Brasil. Revista
Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, Fortaleza, v.8, n.2, p.87-111, abr./jun. 2014.
BELKUM, A. V. et al. Polymerase Chain Reaction-Mediated Genotyping in Microbial
Epidemiology. Clinical Infectious Diseases, Oxford, v.18, n. 6, p.1017-1019, jun. 1994.
BELOTI, V. et al. Impact of good hygiene practices in milking over microbiological and
physicochemical quality of raw refrigerated milk. Revista Instituto de Lacticinios Cândido
Tostes, Belo Horizonte, v. 67, n. 388, p. 5–10, set./out. 2012.
BOLTON, D. J. Verocytotoxigenic (Shiga Toxin-Producing) Escherichia coli: Virulence
Factors and Pathogenicity in the Farm to Fork Paradigm. Foodborne Pathogens and Disease,
Larchmon, v. 8, n. 3, p. 357-365, mar. 2011.
BRASIL, Instrução Normativa nº 62 de 29/12/2011 - Regulamento Técnico de Produção,
Identidade e Qualidade do Leite tipo A, o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de
Leite Cru Refrigerado, o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade de Leite
52
Pasteurizado e o Regulamento Técnico da Coleta de Leite Cru Refrigerado e seu Transporte a
Granel. Brasília. Diário Oficial da União, p.6, 31.dez. 2011. Disponível em:<
http://www.jusbrasil.com.br/diarios/33395065/dou-secao-1-30-12-2011-pg-6>. Acesso em 7
set. 2015.
BRASIL. Decreto-Lei nº 923 de 10 de Outubro de 1969. Dispõe sobre a comercialização do
leite cru. Diário Oficial da União, p. 121, 13 out. 1969. Disponível em:
http://www2.camara.leg.br/legin/fed/declei/1960-1969/decreto-lei-923-10-outubro-1969-
375274-publicacaooriginal-1-pe.html. Acesso em 25 fev. 2016.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Plano Mais Pecuária
/ Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Assessoria de Gestão Estratégica. –
Brasília: MAPA/ACS, 2014a. 32 p. Disponível em: <
www.agricultura.gov.br/arq_editor/file/Ministerio/Publicacao_v2.pdf>. Acesso em: 8 set.
2015 .
BRASIL. Ministério da Saúde (MS). Serviço de Vigilância em Saúde (SVS). Doenças
Transmitidas por Alimentos. 2015. Disponível em:
<http://u.saude.gov.br/images/pdf/2015/novembro/09/Apresenta----o-dados-gerais-DTA-
2015.pdf.> Acesso em: 4 jan. 2016.
BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção
Básica. Guia alimentar para a população brasileira / Ministério Da Saúde, Secretaria de
Atenção À Saúde, Departamento de Atenção Básica. – 2. ed. – Brasília : ministério da saúde,
2014b. 158p. Disponível em: <
http://portalsaude.saude.gov.br/images/pdf/2014/novembro/05/Guia-Alimentar-para-a-pop-
brasiliera-Miolo-PDF-Internet.pdf> Acesso em 03 de janeiro de 2016.
BUGAREL, M. et al. Micro-array for the identification of Shiga toxin-producing Escherichia
coli (STEC) seropathotypes associated with Hemorrhagic Colitis and Hemolytic Uremic
Syndrome in humans. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 142, n. 3,
p. 318–329, set. 2010.
CALDORIN, M. et al. Ocorrência de Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) no
Brasil e sua importância em saúde pública. Boletim Epidemioloógico Paulista, São Paulo, v.
10, n. 110, p. 4-20, fev. 2013.
CANTARELLI, V. et al. Isolation of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) serotype
O91:H21 from a child with diarrhea in Porto Alegre City, RS, Brazil. Brazilian Journal of
Microbiology, São Paulo, v. 31, n. 4, p. 266–270, out./dez. 2000.
CARVALHO, A. F. et al. Caracterização molecular e fenotipica de estirpes de Escherichia
coli produtoras de shiga-toxina (STEC) não-O157 de fezes e carcaças bovinas. Arquivo
Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 64, n. 4, p. 881–886, ago.
2012.
53
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION - CDC. Shiga toxin-producing
Escherichia coli (STEC) National Surveillance Annual Summary, 2012. Atlanta, Georgia: US
Department of Health and Human Services, CDC, 2014.
Disponível em: http://www.cdc.gov/ncezid/dfwed/PDFs/national-stec-surveillance-overiew-
508c.pdf>. Acesso em: 18 dez. 2015.
CERQUEIRA, A. M. F. et al. High occurrence of Shiga toxin-producing Escherichia coli
(STEC) in healthy cattle in Rio de Janeiro State, Brazil. Veterinary Microbiology,
Amsterdam, v. 70, n. 1-2, p. 111–121, out. 1999.
COBBOLD, R.; DESMARCHELIER, P. A longitudinal study of Shiga-toxigenic Escherichia
coli (STEC) prevalence in three Australian dairy herds. Veterinary Microbiology, Amsterdam,
v. 71, n. 1-2, p. 125–137, jan. 2000.
COBBOLD, R.; DESMARCHELIER, P. Horizontal Transmission of Shiga Toxin-Producing
Escherichia coli within Groups of Dairy Calves. Applied and Environmental Microbiology,
Washington DC, v. 68, n. 8, p. 4148–4152, ago. 2002.
CORDOVEZ, A. et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli associated with hemolyticuremic
syndrome in Chilean children. Journal of Clinical Microbiology, Washington DC, v.30, n.8,
p.2153-2157, ago. 1992.
D'AOUST, J. Y. et al. Thermal inactivation of Campylobacter species, Yersinia
enterocolitica, and hemorrhagic Escherichia coli O157:H7 in fluid milk. Journal of Dairy
Science, Lancaster, v.71, n.12, p.3226–3230, dez. 1988.
DÜRR, J. W. Como produzir leite de qualidade / João Walter Dürr. 4. ed. Brasília: SENAR,
2012.44 p. Disponível em: < http://ead.senar.org.br/cartilhas/133_Leite.pdf >. Acesso em 2
fev. 2016.
DYTOC, M. T. et al. Distinct Binding Properties of eaeA-Negative Verocytotoxin- Producing
Escherichia coli of Serotype 0113 : H21. Infection and Immunity, Washington DC, v. 62, n. 8,
p. 3494-3505, ago. 1994.
ESCHERICH, T. The intestinal bacteria of the newborn and infants. Fortschritte der Medizin,
v.3, p.515-522. 1885.
ETCHEVERRÍA, A. I.; PADOLA, N. L. Shiga toxin-producing Escherichia coli : Factors
involved in virulence and cattle colonization. Virulence, Austin, v. 4, n. 5, p. 366-372, jul.
2013.
EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY - EFSA; EUROPEAN CENTRE FOR
DISEASE PREVENTION AND CONTROL - ECDC. The European Union summary report
on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2009. The
EFSA Journal 3 (2090), p.1–378. 2011.
EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY - EFSA; EUROPEAN CENTRE FOR
DISEASE PREVENTION AND CONTROL - ECDC. The European Union summary report
54
on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2014. EFSA
Journal, v. 13, n. 12, 191p, dez. 2015. Disponível em: <
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/4329>. Acesso em: 8 jan. 2016.
FAITH, N. G. et al. Prevalence and clonal nature of Escherichia coli O157 : H7 on dairy
farms in Wisconsin. Applied and Environmental Microbiology, Washington DC, v. 62, n. 5, p.
1519–1525, mai. 1996.
FAO. Food and Agriculture Organization. Milk and dairy products in human nutrition. Rome;
2013. Disponível em: < www.fao.org/docrep/018/i3396e/i3396e.pdf > Acecsso em: 02 de
janeiro de 2016.
FARAH, S. M. S. S. et al. Phenotypic and genotypic traits of Shiga toxin-producing
Escherichia coli strains isolated from beef cattle from Paraná State, southern Brazil. Letters in
Applied Microbiology, Oxford, v. 44, n. 6, p. 607–612, jun. 2007.
FARROKH, C. et al. Review of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) an their
significance in dairy production. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.
162, n. 2, p. 190-2012, mar. 2013.
FEGAN, N. et al. The prevalence and concentration of Escherichia coli O157 in faeces of
cattle from different production systems at slaughter. Journal of Applied Microbiology,
Oxford, v.97, n.2, p.362–370, mai. 2004.
FERNÁNDEZ, D. et al. Seasonal variation of Shiga toxin-encoding genes (stx) and detection
of E. coli O157 in dairy cattle from Argentina. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v.
106, n. 4, p. 1260–1267, apr. 2009.
FERREIRA, M. R. A. et al. N. Isolation, prevalence, and risk factors for infection by shiga
toxin-producing Escherichia coli (STEC) in dairy cattle. Tropical Animal Health and
Production, Edinburgh, v.46, n.4, p.635–639, apr. 2014.
FLORIÃO, M. M. Boas práticas em bovinocultura leiteira com ênfase em sanidade
preventiva/Mônica Mateus Florião. -- Niterói: Programa Rio Rural, 2013. 50 p. Disponível
em: www.pesagro.rj.gov.br/.../38Boas_Praticas_Bovinocultura_Leiteira.pdf. Acesso em: 2
fev. 2016.
FOSTER, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nature
reviews Microbiology, London, v.2, n.11, p.898-907, nov. 2004.
FRANZOLIN, M. R. et al. Prevalence of diarrheagenic Escherichia coli in children with
diarrhea in Salvador, Bahia, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.
100, n. 4, p. 359–363, jul. 2005.
FRÉMAUX, B. et al. Dissemination and persistence of Shiga toxin-producing Escherichia
coli (STEC) strains on French dairy farms. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.117, n.2-
4, p.180–191,out 2006.
55
FROZI, J. B. et al. Survival of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7 in Minas
frescal cheese. Food Science and Technology, Campinas, v.35, n.1, p.108-114, jan./mar. 2015.
FUKUSHIMA, H.; HOSHINA, K.; GOMYODA, M. Long-term survival of Shiga toxin-
producing Escherichia coli O26, O111, and O157 in bovine feces. Applied and Environmental
Microbiology, Washington DC, v. 65, n. 11, p. 5177–5181, nov. 1999.
GAUTAM, R. et al. Modeling the effect of seasonal variation in ambient temperature on the
transmission dynamics of a pathogen with a free-living stage: Example of Escherichia coli
O157:H7 in a dairy herd. Preventive Veterinary Medicine, Amsterdam, v. 102, n. 1, p. 10-21,
out. 2011.
GAUTAM, R. et al. Transmission of Escherichia coli O157:H7 in cattle is influenced by the
level of environmental contamination. Epidemiology and Infection, Cambridge, v. 143, n. 2,
p. 274-287, jan. 2015.
GUERREIRO, P. K. et al. Qualidade microbiológica de leite em função de técnicas
profiláticas no manejo de produção. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 29, n. 1, p. 216–
222, jan./fev. 2005.
GUTH, B. E. C. et al. First Shiga Escherichia coli Isolate from a Patient with Hemolytic
Uremic syndrome. Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 8, n. 5, p. 535–536, mai. 2002a.
GUTH, B. E. C. et al. Phenotypic and genotypic characteristics of shiga toxin-producing
Escherichia coli strains isolated from children in São Paulo, Brazil. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 97, n. 8, p. 1085–9, dez. 2002b.
GYLES, C. L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. Journal of Animal
Science, Champaign, v. 8, n. suppl, p. 45-62, mar. 2007.
HILL, B. et al. Microbiology of raw milk in New Zealand. International Journal of Food
Microbiology, Amsterdam, v.157, n.2, p.305–308, jul. 2012.
HUSSEIN, H. S.; BOLLINGER, L. M. Prevalence of Shiga toxin- producing Escherichia coli
in beef cattle. Journal of Food Protection, Ames, v.68, n.10, p.2224-2241, out. 2005.
HUSSEIN, H. S.; SAKUMA, T. Invited Review: Prevalence of Shiga Toxin-Producing
Escherichia coli in Dairy Cattle and Their Products. Journal of Dairy Science, Champaign, v.
88, n. 2, p. 450-465, fev. 2005.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA - IBGE .Censo
Agropecuário. 2006. Disponível em:<
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/agropecuaria/censoagro/2006/> . Acesso
em: 02 jan. 2016.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA - IBGE. Tabulações
especiais do censo Agropecuário 2006. Rio de Janeiro: IBGE, 2011.
56
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICAM - IBGE. Pesquisa de
orçamentos familiares 2008 – 2009: Análise do Consumo Alimentar Pessoal no Brasil. Rio de
Janeiro: IBGE; 2010. 150p. Disponível em: <
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/populacao/condicaodevida/pof/2008_2009_analise_c
onsumo/pofanalise_2008_2009.pdf > Acesso em 02 de janeiro de 2016.
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION - ISO. ISO 7218:2007.
Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for
microbiological examinations. International Organization for Standardization, p.66, 2007.
IRINO, K. et al. O157:H7 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Strains Associated with
Sporadic Cases of Diarrhea in São Paulo, Brazil. Emerging Infectious Diseases, Atlanta, v. 8,
n. 4, p. 446–447, apr. 2002.
IRINO, K. et al. Serotypes and virulence markers of Shiga toxin-producing Escherichia coli
(STEC) isolated from dairy cattle in São Paulo State, Brazil. Veterinary Microbiology,
Amsterdam, v. 105, n. 1, p. 29–36, jan. 2005.
ISLAM, M. A. et al. Ocurrence and characterization of Shiga Toxin-Producing Escherichia
coli in raw meat, raw milk, and street vended juices in Bangladesh. Foodborne Pathogens and
Disease, Larchmont, v.7, n.11, p.1381–85, nov. 2010.
IVBADE, A.; OJO, O. E.; DIPEOLU, M. A. Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7
in milk and milk products in Ogun State, Nigéria. Veterinaria Italiana, Teramo, v.50, n.3,
p.185-191, jul./set. 2014.
JENKINS, C. et al. An eight-month study of a population of verocytotoxigenic Escherichia
coli (VTEC) in a Scottish cattle herd. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v.93, n.6, p.
944-953, nov. 2002.
JENKINS, C. et al. Distribution of the saa gene in strains of Shiga toxin-producing
Escherichia coli of human and bovine origins. Journal of Clinical Microbiology, Washington,
v.41, n.4, p. 1775-1778, abr. 2003.
KARMALI, M. A. et al. Sporadic Cases of Haemolytic-Uraemic Syndrome Associated With
FaecalCytotoxin and Cytotoxin-Producing Escherichia coli In Stools. The Lancet, London, v.
321, n. 8325, p. 619–620, mar. 1983.
KARMALI, M. A.; GANNON, V.; SARGEANT, J. M. Verocytotoxin-producing
Escherichia coli (VTEC). Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.140, n.3-4, p.360–370, jan.
2010.
KARMALY, M. A. Infection by Verocytotoxin-Producing Escherichia coli. Clinical
Microbiology Reviews, Washington DC, v. 2, n. 1, p. 15-38, jan. 1989.
57
KONOWALCHUK, J.; SPEIRS, J. I.; STAVRIC, S. Cytotoxm of Escherichia. Infection and
Immunity, Washington DC, v. 18, n. 3, p. 775–779, dez. 1977.
LAW, D. Virulence factores of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin-producing E.
coli. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 88, n. 5, p. 729-745, mai. 2000.
LEITE JUNIOR, B. R.C.L. et al. Aplicação das Boas Práticas Agropecuárias no Processo de
Ordenha em uma Propriedade Rural do Município de Rio Pomba , Minas Gerais. Revista do
Instituto de Laticínios Cândido Tostes, Juiz de Fora, v. 66, n. 380, p. 31–39, mai./ jun. 2011.
LEJEUNE, J. T. et al. Comparison of E. coli O157 and Shiga toxin-encoding genes (stx)
prevalence between Ohio, USA and Norwegian dairy cattle. International Journal of Food
Microbiology, Amsterdam, v. 109, n. 1-2, p. 19–24, mai. 2006.
LEOMIL, L. et al. Frequency of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolates
among diarrheic and non-diarrheic calves in Brazil. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.
97, n. 1-2, p. 103–109, dez. 2003.
MADALENA, F.E., et al. Produção de leite e sociedade: uma análise crítica da cadeia do leite
no Brasil. Belo Horizonte: FEPMVZ. 2001.
MARTIN, A.; BEUTIN, L. Characteristics of Shiga toxin-producing Escherichia coli from
meat and milk products of different origins and association with food producing animals as
main contamination sources. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.146,
n.1, p.99–104, mar. 2011.
MATHUSA, E.C. et al. Non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli in foods. Journal
of Food Protection, Ames, v.73, n.9, p.1721–1736, sep. 2010.
MCGEE, P. et al. Horizontal Transmission of Escherichia coli O157:H7 during Cattle
Housing. Journal of Food Protection, Ames, v. 67, n. 12, p. 2651–2656, dez. 2004.
MINIHAN, D. et al. An investigation on the effect of transport and lairage on the faecal
shedding prevalence of Escherichia coli O157 in cattle. Journal of Veterinary Medicine. B.
Infectious Diseases and Veterinary Public Health., v.50, n.8, p.378–382, out. 2003.
MOAKE, J. L. Thrombotic Microangiopathies. The New England Journal of Medicine,
Boston, v.347, n.8, p. 589-600, ago. 2002 .
MOOLENAAR, R.L. et al. Outbreak of Shiga Toxin–Producing Escherichia coli O111
Infections Associated with a Correctional Facility Dairy - Colorado, 2010. Morbidity and
Mortality Weekly Report. Atlanta, v.61, n.9, p.149-150, mar. 2012.
MOREIRA, C. N. et al. Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolated from healthy
dairy cattle in southern Brazil. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v. 93, n. 3, p. 179–183,
mai. 2003.
58
MUNIZ, L. C.; MADRUGA, S. W.; ARAUJO, C. L. Consumo de leite e Derivados Entre
Adultos e Idosos nenhuma Sul do Brasil: um Estudo de Base populacional. Ciência & Saúde
Coletiva, Rio de Janeiro, v. 18, n. 12, p. 3515-3522, dez. 2013.
NASTASIJEVIC, I.; MITROVIC, R.; BUNCIC, S. Occurrence of Escherichia coli O157 on
hides of slaughtered cattle. Letters in Applied Microbiology, Oxford, v.46, n.1, p.126–131,
jan. 2008.
NATARRO, J. P.; KAPER, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology
Reviews, Washington DC, v. 11, n. 1, p. 142-201, jan. 1998.
NEILL, M. A.; TARR, P. I.; TAYLOR, D. N.; TROFA, A. F. Escherichia coli. In:
Foodborne Disease Handbook, Hui, Y.H., J.R. Gorham, K.D. Murell and D.O. Cliver (Eds.).
Marcel Decker, Inc., New York, p.169-213. 1994.
NERO, L. A. et al. Leite cru de quatro regiões leiteiras brasileiras: perspectivas de
atendimento dos requisitos microbiológicos estabelecidos pela Instrução Normativa 51.
Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 25, n. 1, p. Larchmont, v.9, n.11, p.1028-
1036, nov. 2012. 191–195, jan./mar. 2005.
O’BRIEN, A. D. et al. Escherichia coli O157:H7 strains associated with haemorrhagic colitis
in the United States produce a Shigella dysenteriae 1 (Shiga) like cytotoxin. The Lancet,
Boston, v.26, n.1, p.702, mar. 1983.
O’BRIEN, A. D. et al. Productions of Shigella dysenteriae 1 –like cytotoxin by Escherichia
coli. The Journal of Infectious Diseases, Chicago, v.146, n.6, p.763-769, dez. 1982.
OGDEN, I. D.; MACRAE, M.; STRACHAN, N. J. C. Is the prevalence and shedding
concentrations of E. coli O157 in beef cattle in Scotland seasonal? FEMS Microbiology
Letters, Amstedam, v.233, n.2, p.297–300, apr. 2004.
OJO, O. E. et al. Potentially zoonotic shiga toxin-producing Escherichia coli serogroups in the
faeces and meat of food-producing animals in Ibadan, Nigeria, International Journal of Food
Microbiology, Amsterdam, v.142, n.1-2, p.214–221, ago. 2010.
OLIVER, S. P. et al. Food safety hazards associated with consumption of raw milk.
Foodborne Pathogens Disease, Larchmont, v.6, n.7, p.793–806, set. 2009.
OPORTO, B. Escherichia coli O157:H7 and Non-O157 Shiga Toxin-producing E. coli in
Healthy Cattle, Sheep and Swine Herds in Northern Spain. Zoonoses and Public Health,
Berlin, v.55, n.2, p.73-81, mar. 2008.
OSAILI, T. M.; ALABOUDI, A. R.; RAHAHLAH, M. Prevalence and antimicrobial
susceptibility of Escherichia coli O157: H7 on beef cattle slaughtered in Amman abattoir.
Meat Science, Barking, v.93, n.3, p.463–468, mar. 2013.
PATON, A. W. et al. Characterization of Saa, a novel autoagglutinating adhesin produced by
locus of enterocyte effacementnegative Shiga-toxigenic Escherichia coli strains that are
59
virulent for humans. Infection and Immunity,Washington DC, v.69, n.11, p.6999–7009, nov.
2001.
PATON, A. W. et al. Direct Detection of Escherichia coli Shiga-Like Genes in Primary Fecal
Cultures by Polymerase Chain Reaction. Journal of Clinical Microbiology, Washington DC,
v. 31, n. 11, p. 3063-3067, nov. 1993.
PATON, A. W.; PATON, J. C. Direct detection of shiga toxigenic Escherichia coli strains
belonging to serogroups O111, O157, and O113 by multiples PCR. Journal of Clinical
Microbiology, Washington DC, v.37, n.10, p.3362-3365, out. 1999.
PATON, A. W.; VOSS, E.; MANNING, P. A. Shiga toxin-producing Escherichia coli isolates
from cases of human disease show enhanced adherence to intestinal epithelial (Henle 407 )
cells. Infection and Immunity, Washington DC, v. 65, n. 9, p. 3799–3805, set. 1997.
PATON, J. C.; PATON, A. W. Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin-Producing
Escherichia coli Infections Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia
coli Infections. Clinical Microbiology Reviews, Washington DC, v. 11, n. 3, p. 450–479, jul.
1998.
PIGATTO, C. P. Caracterização fenotípica e genotípica de Escherichia Coli produtora de
toxina Shiga (STEC) isoladas de bovinos de corte do estado do Paraná [tese de doutorado].
Jaboticabal: Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista;
2008.
PINTO, C. L. O.; MARTINS, M. L.; VANETTI, M. C. D. Qualidade microbiológica de leite
cru refrigerado e isolamento de bactérias psicrotróficas proteolíticas. Ciência e Tecnologia de
Alimentos, Campinas, v. 26, n. 3, p. 645–651, jul./set. 2006.
POLITO, M. G.; KIRSZTAJN, G. M. Microangiopatias trombóticas: púrpura
trombocitopênica trombótica e síndrome hemolítica-urêmica. Jornal Brasileiro de Nefrologia,
São Paulo, v. 32, n. 3, p. 303-315, jul./set. 2010.
PRADEL, N. et al. Prevalence and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli
isolated from cattle, food, and children during a one-year prospective study in France. Journal
of Clinical Microbiology, Washington, v. 38, n. 3, p. 1023–1031, mar. 2000.
RAHN, K. et al. Persistence of Escherichia coli O157 : H7 in dairy cattle and the dairy farm
environment. Epidemiology and infection, Cambridge, v. 119, n. 2, p. 251–259, out, 1997.
RANDALL, L.P.; WRAY, C.; DAVIES, R. H. Survival of verocytotoxin-producing
Escherichia coli O157 under simulated farm conditions. The Veterinary Record , London,
v.145, n.17, p.500-501, out. 1999.
RANTSIOU, K.; ALESSANDRIA, V.; COCOLIN, L. Prevalence of Shiga toxin-producing
Escherichia coli in food products of animal origin as determined by molecular methods.
International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.154, n.1-2, p.37–43, mar. 2012.
60
RIBEIRO, M. G. et al. Fatores de virulência em linhagens de Escherichia coli isoladas de
mastite bovina. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v.
58, n. 5, p. 724–731, out. 2006.
RIGOBELO, E. C. et al. Virulence factors of Escherichia coli isolated from diarrheic calves.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 58, n. 3, p. 305–
310, jun. 2006.
RILEY, L. W. et al. Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype. The
New England Journal of Medicine, Boston, v.308, n.12, p.681–685, mar. 1983.
RIVAS, M. et al. Síndrome urémico hemolítico en niños de Mendoza: su asociación con la
infección por Escherichia coli productor de toxina Shiga. Medicina, Buenos Aires, v.58, n.1,
p.1–7, 1998.
RODRIGUES, E. Qualidade do leite e derivados: processos, processamento tecnológico e
índices/Eliane Rodrigues... [et al.]. -- Niterói: Programa Rio Rural, 2013. 53 p. disponível em
< http://www.pesagro.rj.gov.br/downloads/riorural/37_Qualidade_Leite_Derivados.pdf.>
Acesso em: 2 fev. 2016.
SALVADORI, M. R. et al. Virulence factors of Escherichia coli isolated from calves with
diarrhea in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 34, n. 3, p. 230–235,
jul./set 2003.
SANDRINI, C. N. M. et al. Escherichia coli verotoxigênica: isolamento e prevalência em 60
propriedades de bovinos de leite da região de Pelotas, RS, Brasil. Ciência Rural, Santa Maria,
v. 37, n. 1, p. 175-182, jan./fev. 2007.
SASAKI, Y. et al. Prevalence and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli
O157 and O26 in beef farms. Veterinary Microbiology, Amsterdam, v.150, n.1-2, p.140–145,
mai. 2011.
SCHAFFZIN, J. K. et al. Public health approach to detection of non-O157 Shiga toxin-
producing Escherichia coli: summary of two outbreaks and laboratory procedures.
Epidemiology and Infection, Cambridge, v. 140, n. 2, p. 283–289, fev. 2012.
SCHEUTZ, F. et al. Multicenter evaluation of a sequence-based protocol for subtyping Shiga
toxins and standardizing Stx nomenclature. Journal of Clinical Microbiology, Washington, v.
50, n. 9, p. 2951–2963, set. 2012.
SCHODER, D. et al. Microbiological Quality of Milk in Tanzania: From Maasai Stable to
African Consumer Table. Journal of Food Protection, Ames, v.76, n.11, p.1908–1915, nov.
2013.
SECRETARIA DE ESTADO DA SAÚDE DE SÃO PAULO –SES/SP; COORDENADORIA
DE CONTROLE DE DOENÇAS - CCD; CENTRO DE VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA.
CVE; Síndrome Hemolítico-Urêmica e E. coli O157:H7: Dados Estatísticos 1998-2011.
61
2011. Disponível em:< www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/dados/4Ifnet9811_SHUa.pdf>.
Acesso em 16 fev. 2016.
SHERE, J. A.; BARTLETT, K. J.; KASPAR, W. Longitudinal Study of Escherichia coli
O157 : H7 Dissemination on Four Dairy Farms in Wisconsin. Applied and Environmental
Microbiology, Washington DC, v. 64, n. 4, p. 1390–1399, apr. 1998.
SHILS, M.E. Nutrição Moderna na Saúde e na Doença.10ª ed. São Paulo: Manole, 2009.
2222p.
SIMIONI, F. J. et al. Qualidade do leite proveniente de propriedades com diferentes níveis de
especialização. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 34, n. 4, p. 1901–1912, Jul./Ago.
2013.
SMITH, J. L.; FRATAMICO, P. M.; GUNTHER IV, N. W. Shiga Toxin-Producing
Escherichia coli. Advances in Applied Microbiology, San Diego, v. 86, n. 3, p. 145-197, fev.
2014.
SOUZA, R. L. et al. Hemolytic uremic syndrome in pediatric intensive care units in são
paulo, Brazil. The Open Microbiology Journal, Hilversum, v. 5, n. 1 (supp), p. 76–82, jul.
2011.
STACY M. et al. Preliminary Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted
Commonly Through Food — Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S.
Sites, 2006–2014. Morbidity and Mortality Weekly Report, Atlanta, v.64, n.18, mai p.495-
499. 2015.
STELLA, A, E. Fatores de virulência em isolados de Escherichia coli provenientes de
amostras de água, leite e fezes de bovinos leiteiros da região de Ribeirão Preto-SP, Brasil
[tese de doutorado]. Jaboticabal: Universidade Estadual Paulista; 2009. Disponível em: <
http://base.repositorio.unesp.br/handle/unesp/103920>. Acesso em: 3 dez. 2015.
TONI, F. et al. A prospective study on Shiga toxin-producing Escherichia coli in children
with diarrhea in Paraná State, Brazil. Letters in applied microbiology, Oxford, v. 48, n. 5, p.
645–7, mai. 2009.
TREVISANI, M. et al. Detection of Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli (STEC) in
bovine dairy herds in Northern Italy. International Journal of Food Microbiology,
Amsterdam, v.1, n.184, p.45-9, ago. 2014.
TRISTÃO, L. C. S. et al. Virulence markers and genetic relationships of Shiga toxin-
producing Escherichia coli strains from serogroup O111 isolated from cattle. Veterinary
Microbiology, Amsterdam, v.119, n.2-4, p.358-365, set. 2007.
URDHAL, A. M. et al. Animal host associated differences in Shiga toxin-producing
Escherichia coli isolated from sheep and cattle on the same farm. Journal of Applied
Microbiology, Oxford, v.95, n.1, p.92-101, jul. 2003.
62
VAZ, T. M. I. et al. Virulence Properties and Characteristics of Shiga Toxin-Producing
Escherichia coli in São Paulo , Brazil , from 1976 through 1999. Journal of Clinical
Microbiology, Washington, v. 42, n. 2, p. 903–905, fev. 2004.
VENDRAMIN, T. et al. Molecular screening of bovine raw milk for the presence of Shiga
toxin-producing Escherichia coli (STEC) on dairy farms. Food Science and Technology,
Campinas, v. 34, n. 3, p. 604-608, jul./set. 2014.
VICENTE, H. I. G. et al. Escherichia coli, produtoras de Shigatoxinas detectadas em fezes de
bovinos leiteiros. Arquivos do Instituto Biológico. v.77, n.4, p.567-573, 2010.
VICENTE, H. I. G. et al. M. Isolamento de cepas de Escherichia coli shigatoxigênicas
sorogrupos O157 e O111 por separação imunomagnética após detecção por pcr (nota de
pesquisa). Ciência Animal Brasileira, v.9, n.3, p.753-758, 2008.
VICENTE, H. I. G.; AMARAL, L. A. D.; CERQUEIRA, A. D. M. F. Shigatoxigenic
Escherichia coli Serogroups O157, O111 and O113 in feces, water and milk samples from
dairy farms. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 36, n. 3, p. 217-222, jul. 2005.
WANG, X.; GAUTAM, R.; PINEDO, P. J. A stochastic model for transmission, extinction
and outbreak of Escherichia coli O157:H7 in cattle as affected by ambient temperature and
cleaning practices. Journal of Mathematical Biology, Berlin, v. 69, n. 2, p. 501-532, ago.
2014.
