Determinação da cafeína de uma bebida

energética por HPLC/UV

Métodos Instrumentais de Análise

5º Ano do Mestrado Integrado em Bioengenharia

Elisabete Marina Nunes Pires (bio10072@fe.up.pt)

Joana Rita Ferreira dos Santos (bio10074@fe.up.pt)

PORTO, 21 de Dezembro de 2012

1

Sumário

A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é uma técnica de separação que,

nos últimos anos, passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins

qualitativos e quantitativos. As razões que sustentam a sua ampla utilização estão

relacionadas com a sua adaptabilidade para determinações com boa sensibilidade, à

possibilidade de separar espécies não-voláteis e termicamente instáveis, com destaque

para a indústria farmacêutica, ambiental, alimentar, e em muitos outros campos da

ciência, como o da medicina.

Este trabalho está integrado na unidade curricular Métodos Instrumentais de

Análise (MIA), cujos objectivos são o estabelecimento de uma resposta apropriada para a

determinação do teor de cafeína numa bebida energética por HPLC/UV. Ou seja,

pretendeu-se implementar, compreender e validar a metodologia analítica de HPLC/UV, e

ainda avaliar o desempenho da cromatografia.

Para análise por HPLC/UV, a amostra e os padrões foram preparados a partir de

uma bebida energética e de uma solução mãe de cafeína, respectivamente. Para tal, foi

utilizado um cromatógrafo HPLC/UV, com uma coluna de fase C18 cuja fase ligada é

octadecilsílica (250-4, com partículas 5µm) e uma fase móvel composta por trietilamina,

ácido fosfórico, acetonitrilo e água. O caudal do eluente utilizado foi de 1mL/min e um loop

de 20µL. Uma vez que, se pretendeu analisar a cafeína, o comprimento de onda de

detecção no UV foi de 273 nm.

A separação cromatográfica mostrou-se ideal, pois o factor de capacidade foi de

1,52±0,02. Foi, ainda, avaliado a qualidade da separação pela eficiência (N=2334±38).

Através da reta de calibração determinou-se a concentração da amostra (3,37 ±

0,24 mg/L), considerando-se o factor de diluição, o teor de cafeína na bebida energética

foi de 337± 24 mg/L, valor este próximo do valor rotulado.

Relativamente à validação do método analítico, obteve-se uma gama de

linearidade de 0,5 mg/L a 10 mg/L e um limite de detecção e de quantificação de 0,24

mg/L e de 0,79 mg/L, respectivamente. Quanto ao estudo da exatidão, avaliada pelo erro

relativo (Er), obteve-se um Er 5%. Apresenta ainda um coeficiente de correlação de 0,999

e o desvio padrão do relativo do declive de 2% Estes parâmetros mostraram que o

método é adequado para o fim a que se destina.

2

índice

1. Introdução

4

2. Materiais e Métodos

7

2.1. Equipamento

7

2.2 Fase móvel

7

2.3. Preparação dos padrões e da amostra

7

2.4. Análise por HPLC/UV

8

3. Resultados e Discussão

9

3.1. Cromatograma

9

3.2. Desempenho da separação cromatográfica

10

3.3. Teor da cafeína na amostra

11

3.4. Validação do Método analítico: Parâmetros de quantificação e de fiabilidade

(Exatidão)

12

4. Conclusões

13

5. Referências

14

6. Apêndice

15

3

1. Introdução Teórica

A cromatografia é uma técnica poderosa e versátil, que num processo único é

capaz de separar e identificar os componentes de uma mistura e, simultaneamente,

proporciona uma estimativa quantitativa de cada constituinte da mistura [1]. O processo

de separação é obtido pela distribuição dos componentes entre duas fases, a fase móvel

e a fase estacionária. Isto é, a mistura é introduzida na fase móvel e é transportada por

esta ao longo de uma coluna que contém a fase estacionária [2,3]. A fase estacionária

estabelece as possíveis interações de afinidade com os componentes da amostra. Assim,

quanto menor for a afinidade de um componente da mistura para a fase estacionária,

menor será o tempo a percorrer a coluna, ou seja, menor o tempo que ficam retidos [3].

A classificação da cromatografia depende do estado das fases (móvel e

estacionária). A fase móvel poderá ser um gás ou um líquido, dando origem a dois a tipos

de cromatografia: cromatografia gasosa, em que a fase móvel é gás e cromatografia

líquida, sendo a fase móvel um líquido. Da mesma forma, a fase estacionária será

normalmente um líquido ou um sólido, o qual dá origem a quatro subgrupos de

cromatografia: cromatografia de gás-líquido; cromatografia de gás-sólido; cromatografia

líquido-líquido; e cromatografia líquido-sólido [2]. A cromatografia pode ainda ser

classificada, segundo o modo de separação (adsorção, partição, exclusão molecular e

troca iónica) [4]

Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, sigla inglesa de High Performance

Liquid Chromatography) distingue-se da cromatografia líquida convencional pelo uso de

instrumentação sofisticada e colunas de alta eficiência. As principais vantagens da HPLC

recaem sobre a redução do tempo de análise, elevada resolução, sensibilidade,

seletividade e reprodutibilidade [5].

A HPLC pode ser dividida em dois grupos, cromatografia em fase normal e

cromatografia em fase reversa. Quando a fase estacionária (normalmente sílica) é polar a

cromatografia é de fase normal. Na situação inversa, ou seja, quando a fase estacionária

apresenta menor polaridade que o eluente a cromatografia é denominada de fase reversa.

Nesta, fase estacionária é normalmente constituída por substâncias polares quimicamente

ligadas a grupos funcionais apolares. É de salientar que a cromatografia em fase reversa

é a mais recorrida para análises por HPLC [6].

Um sistema de HPLC consiste, essencialmente, nos seguintes constituintes: uma

bomba, um sistema de injeção, uma coluna de separação e um detetor (Figura 1) [6]. A

bomba tem como finalidade superar a resistência exercida pela coluna ao escoamento da

4

fase móvel, permitindo um fluxo contínuo e constante da fase móvel, independentemente

da sua viscosidade e da contrapressão da coluna [7]. O constituinte seguinte, o injetor,

baseia-se essencialmente num sistema de válvulas que permitem introduzir a amostra

num volume preciso e exato, loop, sendo o excesso de amostra descartado. Ou seja, não

é necessário que o volume seja preciso. A injeção é conseguida pela rotação da válvula

da posição de carga (load) para a posição de injeção (inject) [8]. Relativamente à coluna,

pode afirmar-se que esta é o coração do equipamento HPLC, porque é aqui que a

separação ocorre [7,8]. A coluna é instalada entre as válvulas do injetor e o detetor, sendo

o espaço onde se dá o contacto entre a fase móvel e a fase estacionária. As colunas mais

comuns em HPLC são de enchimento, quer de partículas sólidas (cromatografia de

adsorção) ou de partículas revestidas com filme líquido (cromatografia de partição) [4]. No

que diz respeito ao detetor, este equipamento regista continuamente propriedades, físicas

ou físico-químicas, á medida que os componentes da mistura saem da coluna. Um detetor

apropriado tem de ter a capacidade para detetar a presença de um composto e enviar o

sinal elétrico correspondente para um sistema de aquisição de dados. A escolha do

detetor é feita de entre diferentes tipos de detetores (seletivos e universais), dependendo

das características e concentrações dos compostos que têm de ser separados e

analisados. Dos detetores existentes destacam-se, pela sua basta aplicação, os detetores

ultravioleta (UV), de índice de refração e de fluorescência [7,8].

Figura 1 Representação esquemática dos constituintes do HPLC [9].

Resumidamente, na análise por HPLC, a amostra é injetada no sistema de injeção

e arrastada pela fase móvel, sendo forçada a percolar através da coluna cromatográfica,

com o auxílio de uma bomba. Os componentes deslocam-se ao longo da coluna com

velocidades diferentes e, à medida que saem da coluna a sua passagem é registada por

5

um detetor que vai transmitir um sinal elétrico necessário para gerar o cromatograma. O

cromatograma obtido relaciona a resposta do detetor com o tempo de retenção de cada

componente [9].

A partir de um cromatograma podem obter-se vários parâmetros que irão permitir

caracterizar a separação cromatográfica. O primeiro pico de um cromatograma

corresponde à eluição do componente não retido, e ao tempo que este demora a sair da

coluna designa-se por tempo morto (t0). Por outro lado, o tempo que os componentes

retidos na coluna demoram a sair denota-se por tempo de retenção (tr). É de salientar que

este tempo permite a identificação dos compostos. Uma outra informação a retirar do

cromatograma é a largura do pico (w) ou a largura do pico a meia altura (w1/2), referente

ao componente retido [6,7].

O desempenho de uma cromatografia pode ser avaliado pelo fator de capacidade

(K), eficiência (N), seletividade (α) e resolução (R) [6,7,8]. Sendo que o fator de

capacidade e a eficiência são determinados para caracterizar os parâmetros

cromatográficos referentes a um componente. Por outro lado, a resolução e seletividade

relacionam características entre dois componentes da mistura.

O K obtido pela equação 1, definido como a medida da retenção de um

componente na fase estacionária, é um parâmetro adimensional, característico de cada

componente eluído para uma determinada fase e independente de outros parâmetros [7].

A eficiência avalia a qualidade de separação e expressa a eficiência de uma coluna

cromatográfica. Quanto menor for a banda cromatográfica, isto é, quanto mais estreito for

o pico do componente, maior será a capacidade de separar um maior numero de

componentes num determinado tempo, e mais eficiente é a coluna. Considerando que o

pico representa uma distribuição aproximadamente gaussiana, a obtenção experimental

da eficiência é dada pela equação 2.1 e 2.2 dependendo da largura de banda [4,8].

(

)

(

)

A seletividade (equação 3) descreve a capacidade do método separar dois

componentes de uma mistura, depende da temperatura, da natureza do analíto, da fase

estacionária e fase móvel sendo independente do fluxo [6].

6

Por fim, a resolução mede como dois picos adjacentes são separados,

considerando as larguras dos picos na linha de base, bem como os respetivos tempos de

retenção (equação 4) [4,7].

A HPLC é aplicada em vários ramos da ciência, nomeadamente, na indústria

alimentar, por forma a determinar a composição real de uma dada substância num

produto. A cafeína (1,3,7-trimetilxantina), presente na dieta humana, pode ser encontrada

em diversos produtos: chá, café, coca-cola, bebidas energéticas, entre outros [10,11].

Este trabalho, integrado na unidade curricular de Métodos Instrumentais de

Análise, tem como objetivo, primeiro, implementar, compreender e validar a metodologia

analítica de HPLC/UV, aplicada na determinação do teor de cafeína numa bebida

energética. O segundo objetivo consiste em avaliar o desempenho da cromatografia,

através do cálculo do fator de capacidade e da eficiência.

7

2. Material e Métodos

2.1. Equipamento

As amostras foram analisadas por HPLC (figura 2). Utilizou-se um HPLC com um

detetor UV-Vis (Knauer, modelo A0293) de comprimento de onde variável, ligado a um

sofware de aquisição e processamento de dados. Possuí uma bomba de alta

pressão(Knauer, Well chrom Maxi-Ster K-1000). A coluna cromatográfica usada foi uma

coluna C18, LichoCart ®, cuja fase ligada é de octadecilsílica com tamanho de partícula

de 5 µm, 250mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro.

2.2. Fase móvel

A fase móvel, composta por trietilamina, ácido fosfórico, acetonitrilo e água, já tinha

sido previamente preparada. Esta solução encontrava-se filtrada e tinha sido

desgazificada durante 15 minutos.

2.3. Preparação dos padrões e da amostra

Para a preparação dos padrões de calibração, fizeram-se os cálculos de diluição

necessários e procedeu-se à preparação dos padrões em balões volumétricos de 100 ±

0,1 mL, medindo os volumes necessários de solução mãe com uma micropipeta (figura 3).

A solução mãe de cafeína de concentração 500 mg/L, já preparada antes da elaboração

deste trabalho experimental, deu origem aos padrões de concentrações 0,5 mg/L; 0,75

mg/L; 1,00 mg/L; 5,00 mg/L e 10,00 mg/L.

Figura 3 Representação esquemática da preparação dos padrões de calibração

Solução mãe

(500mg/L) 0,50mg/L 0,75mg/L 1,00mg/L 5,00mg/L 10,00mg/L

V=0,10 mL V=0,50 mL V=0,20 mL V=1 mL V=2 mL

Figura 2 Fotografia do equipamento de HPLC/UV do laboratório de MIA

do DEQ.

8

A amostra foi preparada num balão de 100±0,1 mL, a partir de uma bebida

energética, numa diluição de 1:100 (figura 4). O volume da amostra foi medido com

auxílio de uma micropipeta.

Por fim, a amostra e os padrões foram filtrados por uma membrana com

porosidade de 0,45 µm.

Figura 4 Representação esquemática da preparação da amostra a partir de uma bebida energética.

2.4. Análise por HPLC/UV

Inicialmente houve o cuidado de efetuar a purga da fase móvel para

eliminação de eventuais bolhas de ar no sistema cromatográfico, bem como garantir uma

linha de base estável. Este processo também foi sucedido antecipadamente.

Antes da injeção a seringa foi lavada com água destilada e, posteriormente, lavada

várias vezes com a solução que se pretende analisar. Iniciou-se a injeção dos padrões,

por ordem crescente de concentrações, de modo a obter a curva de calibração. Por fim,

injetou-se a nossa amostra, solução diluída da bebida energética.

A análise cromatográfica, tanto dos padrões como da amostra, foi feita por injeção

das soluções com a válvula na posição load. Para que introduzir a amostra na coluna

mudou-se a posição da válvula para inject e, simultaneamente inicia-se o registo do

cromatograma. Este é fornecido pelo programa de aquisição e tratamento de dados.

O volume de solução injetado não necessitava de ser exato, uma vez que apenas

passava para a coluna o volume do loop, 20µL. O caudal de eluente foi 1 mL/min e o

comprimento de onda de deteção no UV foi 273 nm. A escolha deste comprimento esta

intimamente relacionado com o espetro de absorção da cafeína, onde a sua absorção é

máxima a 273 nm [10].

Amostra Bebida energética

V=1 mL

9

3. Resultados e Discussão

3.1 Cromatograma

À medida que os componentes da mistura saem da coluna, já separados, chegam

ao detetor, onde é registada a sua passagem gerando um cromatograma (figura 5). Como

foi dito anteriormente, o primeiro pico num cromatograma é alusivo dos compostos não

retidos, neste caso o primeiro pico do cromatograma obtido é relativo à água (solvente). O

outro pico presente no cromatograma identifica a cafeína pelo tempo de retenção que lhe

é característico.

Figura 5 Cromatograma da amostra obtido por HPLC/UV.

A partir do cromatograma, o programa permitiu que se retirasse informação

referente ao tempo de retenção, ao tempo morto e à largura do pico a meia altura (tabela

I). É de salientar que o tempo de retenção médio para a cafeína foi de 7,10 min, e com

base em seis determinações, o desvio padrão do tempo de retenção foi de 0,07 min.

Tabela I Informação fornecida pelo programa de

aquisição e processamento de dados.

tr (min) t0 (min) W1/2 (min)

Média 7,10 2,81 0,35

Desvio padrão 0,07 0,01 0,01

10

Além do valor médio do tempo morto obtido experimentalmente, foi possível

estimar o seu valor teoricamente. O valor teórico para o tempo morto foi calculado tendo

em conta o caudal usado, a área e o comprimento da coluna (Apêndice 1. Cálculo do

tempo morto teórico). O valor obtido para o tempo morto teórico foi de 3,14 min.

Comparando o valor teórico com o valor obtido experimentalmente verifica-se que é estes

são semelhantes. Este facto poderá levar a concluir que a coluna é muito porosa, assim o

caminho percorrido experimentalmente é semelhante ao comprimento da coluna. Ou seja,

pressupõem-se que o trajeto percorrido é aproximadamente linear devido à elevada

porosidade da coluna.

3.2 Desempenho da separação cromatográfica

O desempenho da separação cromatográfica foi avaliado pela determinação do

factor de capacidade e da eficiência. Pelos valores da tabela I foi possível calcular o factor

de capacidade e a eficiência, tendo em conta a equação 1 e a equação 2.1,

respectivamente (Apêndice 2. Cálculo factor de capacidade e eficiência). Na tabela II

apresenta-se os respectivos valores médios e o desvio padrão associados.

Tabela II Factor de capacidade (K) e eficiência (N) cromatográfica.

K N

Média 1,52 2334

Desvio padrão 0,02 38

O factor de capacidade descreve a migração dos componentes da amostra ao

longo da coluna, se este valor for muito baixo (inferior a 1) significa que a eluição dá-se de

uma forma rápida que torna difícil determinar qual o tempo de retenção, por lado se K for

superior muito elevado (superior a 20) a o tempo de retenção é muito elevado, levando a

uma análise excessivamente demorada. Assim define-se como um factor de capacidade

ideal compreendido entre 1 e 10 [12]. O valor de K obtido (1,52±0,02) nesta análise

encontra-se na gama ideal.

Comparando a eficiência obtida (2334±38) com a eficiência teórica da coluna

fornecida pelo fabricante (12500), verifica-se que o valor obtido experimentalmente é

muito inferior em relação ao esperado teoricamente. Uma possível explicação para este

facto incide sobre a redução do tempo de análise para que fosse possível fazer a análise

cromatográfica no tempo de aula.

11

3.3. Teor da cafeína na amostra

Além dos parâmetros fornecidos, já referidos (tr, t0, W1/2), é também fornecido a

área do pico. Assim, para cada concentração padrão é associada uma área do pico,

permitindo traçar uma reta de calibração que relaciona a área do pico (uv.min) com a

concentração (mg/L) (figura 6).

Figura 6 Representação gráfica da reta de calibração da cafeína por HPLC/UV.

Calculou-se o desvio padrão associado ao declive e à ordenada da origem da

equação da reta de calibração (Apêndice 3. Cálculo dos erros associados ao declive e

ordenada da origem da reta de calibração). A equação da reta, com os seus erros

associados pode ser rescrita na seguinte forma (equação 5):

Onde, o valor de y tem como unidades uv.min, o declive uv.min/ (mg/L), o x mg/L e

a ordenada da origem uv.min.

Com base na equação da reta (equação 5), e sabendo a área do pico da amostra

de concentração de cafeína desconhecida, foi possível determinar o teor de cafeína da

amostra (X0), e posteriormente, considerando-se o fator de diluição, determinar a

concentração da cafeína na bebida energética (C).

A concentração da cafeína na amostra e a respectiva incerteza (Sx0) obtidas foi de

3,37±0,24 mg/L. Por sua vez, concentração de cafeína na bebida energética obtida por

y = 25482x + 3231,8 R² = 0,9979

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00

Áre

a(u

v.m

in)

Concentração(mg/L)

Reta de calibração da cafeína por HPLC/UV

12

HPLC/UV, foi de 337±24 mg/L, este é um valor próximo do teor de cafeína rotulado, 320

mg/L. (Apêndice 4. Cálculos da concentração e incerteza associada).

3.4. Validação do Método analítico: Parâmetros de quantificação e de

fiabilidade (Exatidão)

A informação retirada da reta de calibração permite obter os parâmetros de

quantificação que possibilitam a validação do método. Estes parâmetros, o seu limite de

validação e os valores obtidos estão apresentados na tabela III. (Apêndice 5. Cálculos

para o limite de quantificação e para o limite de deteção)

Tabela III Validação do método analítico: Parâmetros de quantificação

Validação Obtido

Recta de calibração: pontos

Gama de concentrações

Limite de deteção -

Limite de quantificação( ) - 0

⁄

Ordenada da origem 5235,54

Coeficiente de correlação

Analisando a tabela acima, verifica-se que apenas um dos parâmetros não é válido,

ordenada na origem. Esta não validação pode ser devida ao ruído instrumental. É de

salientar que o valor do limite de quantificação, valor mínimo do analíto que é possível

medir, é muito mais baixo que a concentração de cafeína quantificada na amostra (X0).

Sendo por isso, o limite de quantificação válido para a para o nosso objetivo, bem como o

limite de deteção.

Além disso, foi averiguado a fiabilidade do método, através da exatidão,

nomeadamente, do erro relativo. (Apêndice 6. Cálculo da exatidão (erro relativo)).A

exatidão mede o grau de proximidade entre o resultado obtido e o resultado esperado, o

erro relativo associado ao método analítico foi de 5%. Considera-se um erro aceitável

para o objectivo em questão.

Posto isto, pode afirma-se que o método analítico é válido para o fim a que se

destina.

13

4. Conclusão

A HPLC tem um elevado poder de separação para amostras complexas. A sua

aplicação encontra-se dependente de um método de detecção sensível e selectivo. A

associação do HPLC com a detecção ultravioleta (UV) permite a obtenção de resultados

de elevada selectividade.

Este trabalho incidiu sobre a determinação do teor de cafeína de uma bebida

energética por HPLC/UV.

O desempenho da separação cromatográfica foi avaliado pelo coeficiente de

capacidade, concluindo-se que a separação é ideal (K=1,52±0,02), uma vez que o seu

valor se enquadra na gama (1-10) referenciada como ideal pela literatura. Foi ainda

averiguado a qualidade da separação cromatográfica pela eficiência. A eficiência obtida

experimentalmente (N=2334±38) é menor que a eficiência fornecida pelo fabricante (N=

12500).

Com esta técnica foi possível quantificar a concentração da cafeína de uma bebida

energética, 337 ± 24 mg/L, tendo-se obtido valores de acordo com os valores rotulados

320 mg/L.

Através da avaliação e determinação de um conjunto de parâmetros, de

quantificação e de fiabilidade, que caracterizam um método, conclui-se que o método é

válido para o objetivo do trabalho.

De um modo geral, este trabalho permitiu que se adquirisse conhecimentos

técnicos sobre o modo de funcionamento de um HPLC/UV e aptidões para caracterizar a

qualidade da separação cromatográfica.

14

5. Referências

[1] Scott Raymond P.W., Principles and Practice of Chromatography, kindle edition,

Cap 1, Reese-Scott Partnership, 2012.

[2] Love Jonathan, Process Automation Handbook: A Guide to Theory and

Practice,1st Ed, Cap 18, Springer, 2007.

[3] Li Dongqing, Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics, Springer,p 260-264,

New York, 2008.

[4] Portal de Laboratórios Virtuais de Processos Químicos,

http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?option=com_content&task=view&id=10

3&Itemid=451#2, Acedido em Dezembro de 2012.

[5] Rosenberg Ian M., Protein Analysis and Purification, 2nd Ed, Cap 10, Springer,

2005.

[6] Gomes Sara, Determinação de Antioxidantes por Cromatografia Líquida de Alta

Pressão com Detecção Electroquímica, Tese de Mestrado, Universidade de Coimbra,

2010.

[7] Meyer Veronika R., Practical High-Performance Liquid Chromatograph,5th Ed, Cap

6,Wiley, 2010.

[8] Kazakevich Yuri V., LoBrutto Rosario HPLC for Pharmaceutical Scientists, 1st Ed,

Cap 1, Wiley-Interscience, 2007.

[9] Waters, http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_PT&cid=10049055,

Acedido em Novembro de 2012.

[10] Bispo M. S. et al. Simultaneous Determination of Caffeine, Theobromine, and

Theophylline by High-Performance Liquid Chromatography, J. Chromatographic

Science, 40,45-48, 2002.

[11] Thomas J. B., Yen J. H., Schantz M. M., Porter B. J., Sharpless K. E.,

Determination of Caffeine, Theobromine, and Theophylline in Standard Reference

Material 2384, Baking Chocolate, Using Reversed-Phase Liquid Chromatography, J.

Agric. Food Chem., 52, 3259-3263, 2004.

[12] Dong Michael W., Modern HPLC for practicing scientists, 1st Ed, 19-21, Wiley-

Blackwell,2006.

15

6. Apêndice

Apêndice 1. Cálculo do tempo morto teórico

Área

Velocidade

Caudal

Apêndice 2. Cálculo factor de capacidade e eficiência

K médio:

N médio: (

)

(

)

Apêndice 3. Cálculo dos erros associados ao declive e ordenada da origem

da reta de calibração

Xi(mg/L) Xi2(mg/L) yi(uv.min) yi^(uv.min) (yi-yi^)2

(uv.min) (xi-xmed)2

(mg/L)

0,50 0,25 14286,75 15972,95 2843278,39 8,70

0,75 0,56 22027,50 22343,51 99860,58 7,29

1,00 1,00 26258,00 28714,06 6032241,18 6,00

5,00 25,00 138852,25 130642,94 67392765,98 2,40

10,00 100,00 254303,00 258054,04 14070285,95 42,90

Média 3,45 91145,50

Soma 17,25 126,81 90438432,08 190,44

Nota: yi^ representa o valor de y calculado pela reta de calibração para cada xi.

Equação da recta

a 25482,22

b 3231,84

n 5,00

m 1,00

16

√∑

Substituindo-se os valores da tabela na equação acima obteve-se 5490,55.

Erro associado ao declive:

√

∑

Erro associado à ordenada na origem

√

∑

∑

Apêndice 4. Cálculos da concentração e incerteza associada

Através da equação da reta:

Sendo o factor de diluição 100 (1:100):

Incerteza associada á concentração

√

∑

Incerteza associada ao resultado final da concentração

√

√

Apêndice 5. Cálculo para o limite de quantificação e para o limite de deteção

Limite de quantificação:

↔

17

Limite de deteção:

↔

Apêndice 6. Cálculo da exatidão (erro relativo-Er)

𝑓 ê

𝑓 ê

(

)