VIVIAN TRAGANTE DO Ó · Holoprosencefalia [dissertação]. Bauru: Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais, Universidade de São Paulo; 2014. Introdução: A Holoprosencefalia

UNIVERSIDADE DE SAtildeO PAULO

HOSPITAL DE REABILITACcedilAtildeO DE ANOMALIAS CRANIOFACIAIS

VIVIAN TRAGANTE DO Oacute

Anaacutelise por MLPA das regiotildees subtelomeacutericas de pacientes com

Holoprosencefalia

BAURU

2014

2



Holoprosencefalia

Dissertaccedilatildeo apresentada ao Hospital de Reabilitaccedilatildeo de

Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo Paulo para a

obtenccedilatildeo do tiacutetulo de MESTRE em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo

Aacuterea de concentraccedilatildeo Prevenccedilatildeo e Geneacutetica

Orientadora Profordf Drordf Lucilene Arilho Ribeiro Bicudo

BAURU

2014

3



Rua Silvio Marchione 3-20

Caixa Postal 1501

CEP 17012-900 ndash BauruSP ndash Brasil

Telefone (14)3235-8000

Prof Dr Marco Antocircnio Zago - Reitor da USP

Prof Dra Regina Ceacutelia Bortoleto Amantini ndash Superintendente do HRAC-USP

Tragante Vivian

Anaacutelise por MLPA das regiotildees subtelomeacutericas de

pacientes com Holoprosencefalia Vivian Tragante do Oacute

ndash Bauru 2014

85 p il 31cm

Dissertaccedilatildeo (Mestrado ndash Aacuterea de concentraccedilatildeo

prevenccedilatildeo e geneacutetica) ndash Hospital de Reabilitaccedilatildeo de

Anomalias Craniofaciais Bauru-SP Universidade de Satildeo

Paulo

Orientador Profa Dra Lucilene Arilho Ribeiro

Bicudo

1 Holoprosencefalia 2DNA 3Regiatildeo

subtelomeacuterica 4MLPA 5Deleccedilatildeo

6Duplicaccedilatildeo

CDD 61442

Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa do HRAC-USP

Protocolo nordm 375234

Data 27082013

Autorizo exclusivamente para fins acadecircmicos e cientiacuteficos a

reproduccedilatildeo total ou parcial desta dissertaccedilatildeo

Vivian Tragante do Oacute

Bauru ___ de ________________ de _______

T765a

4

FOLHA DE APROVACcedilAtildeO



Holoprosencefalia


Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo Paulo

para a obtenccedilatildeo do tiacutetulo de MESTRE em Ciecircncias da

Reabilitaccedilatildeo


Aprovado em ____________

Banca examinadora

Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________

Instituiccedilatildeo _______________________________________________________

Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________


Profa Dra Lucilene Arilho Ribeiro Bicudo ndash Orientadora

Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais ndash USP

Prof Dra Daniela Gamba Garib Carreira

Presidente da Comissatildeo de Poacutes-Graduaccedilatildeo do HRACUSP

Data de depoacutesito da dissertaccedilatildeo junto agrave SPG ____________

5


Nascimento 08 de Agosto de 1988 ndash BauruSP

FORMACcedilAtildeO ACADEcircMICA

2007-2011 Graduaccedilatildeo em Nutriccedilatildeo e Metabolismo pela Faculdade de Medicina

de Ribeiratildeo Preto - FMRP-USP Ribeiratildeo Preto ndash SP

2012-2014

Curso de Poacutes-graduaccedilatildeo em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo niacutevel Mestrado

Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais Aacuterea de

concentraccedilatildeo Prevenccedilatildeo e geneacutetica

ATIVIDADES PROFISSIONAIS

2012 Nutricionista de produccedilatildeo na Prefeitura Municipal de Birigui

2013 - atual Nutricionista do Programa de Sauacutede da Famiacutelia no Municiacutepio de

Bauru SP Sorri-Bauru

6

ldquoGanhamos forccedila coragem e confianccedila a cada experiecircncia na qual verdadeiramente paramos para enfrentar o medordquo

(Elleanor Roosevelt You Learn by Living 1960 p 29)

7

AGRADECIMENTOS

Agrave Deus sem o qual simplesmente nada seria possiacutevel Por iluminar meus caminhos e

minhas escolhas

Agrave minha orientadora Prof Dra Lucilene Arilho Ribeiro Bicudo por me aceitar

como aluna por trazer tranquilidade e serenidade nos momentos em que eu jaacute natildeo imaginava

haver uma saiacuteda Pelas conversas e a motivaccedilatildeo pela busca de novas aventuras e novos

horizontes Agradeccedilo a orientaccedilatildeo deste trabalho

Aos Pacientes e suas famiacutelias que ao longo da vida encaram a luta diaacuteria pelo seu

bem estar e sem os quais este trabalho natildeo teria sido realizado

Ao HRAC que cuida apoia reabilita e proporciona melhores oportunidades para

seus pacientes incentivando a pesquisa e a descoberta de novas estrateacutegias para a garantia de uma

vida saudaacutevel

As Professoras Doutoras Edi Luacutecia Sartorato e Nancy Mizue Kokitsu Nakata

pelas pertinentes consideraccedilotildees no exame de qualificaccedilatildeo

Aos meus pais Silvia e Edson que sempre me ensinaram a importacircncia da retidatildeo

dos estudos de buscar sempre o melhor com honestidade e lealdade e que neste momento

devem estar orgulhosos de mim (rs)

Ao meu futuro marido Wilian Silveirinha pelos cinco minutos de desabafo todos

os dias ao telefone pelas palavras de conforto pelas broncas mais educadas e serenas que eu jaacute

vivenciei pelo carinho e muito amor aleacutem de todos os sonhos sonhados juntos na espera pela

realizaccedilatildeo Amo vocecirc muito

Ao co-orientador Bruno Gamba pela importantiacutessima colaboraccedilatildeo para que este

trabalho fosse finalizado pela paciecircncia disponibilidade responsabilidade e amizade

8

Ao co-co-orientador(natildeo oficial) meu irmatildeo Vinicius Tragante do Oacute que me passa

uma enorme seguranccedila quando sugere cada passo que eu devo dar Agradeccedilo cada sugestatildeo cada

criacutetica cada bronca e cada ldquoOcirc Ferardquo

Agrave minha irmatilde Vanessa Tragante do Oacute pelo carinho apoio momentos de

descontraccedilatildeo Pela companhia de sempre pela correccedilatildeo agraves 23h pela forccedila e pelas broncas

tambeacutem porque natildeo

Agraves amigas Ana Laiacutes Bignotto Ana Luiacutesa Gaspar Juliana Mercado e Priscila

Padilha Moura pelas boas risadas pelo apoio pelas idas ao fumoacutedromo pelas tapiocas

horrorosas Pela grande torcida ldquoBinaaaaaaaa chame ela Quero falar com BINArdquo Ou

ateacute mesmo ldquoVivian calma Vai dar tudo certo VAI FICAR LINDOrdquo senatildeo

ldquoALGO BOM VAI ACONTECER ALGO BOM DEUS TEM PARA NOacuteSrdquo

Aos amigos da Citogeneacutetica Rubatildeo Rocirc Tacircnia Cris e Cibele pelos conselhos e

sorrisos carinhosos

Aos funcionaacuterios da SPG Andreia Rogeacuterio Zezeacute e Tatiana pelos vaacuterios capiacutetulos

de uma eterna novela mexicana E ao Rafael da UEP que sempre me ajudou nos eternos envios

de arquivos agrave Plataforma Brasil

Aos meus amigos e amigas que sempre me acompanharam Silvia Nicole Juliane

Ana Paula Ana Caroline Especialmente a Lidiane que me alertou quanto a esta oportunidade

junto ao HRACUSP e ao G8 do qual eu sinto uma saudade imeeensa obrigada pela paciecircncia e

por entenderem a minha falta de tempo muitas vezes Rick vocecirc em especial eacute um gecircnio

Aos amigos e colegas de trabalho do PSF que tambeacutem participaram de uma parte

desta etapa meu muito obrigado

9

RESUMO

TRAGANTE V Anaacutelise por MLPA das regiotildees subtelomeacutericas de pacientes com

Holoprosencefalia [dissertaccedilatildeo] Bauru Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais

Universidade de Satildeo Paulo 2014

Introduccedilatildeo A Holoprosencefalia (HPE) eacute uma malformaccedilatildeo craniofacial decorrente de falhas

no processo de formaccedilatildeo do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionaacuterio Sua

etiologia eacute heterogecircnea e complexa envolvendo fatores ambientais e geneacuteticos Estudos

recentes sugerem que alteraccedilotildees subtelomeacutericas possam ser um dos fatores etioloacutegicos para o

aparecimento da HPE Objetivos Investigar possiacuteveis alteraccedilotildees (microdeleccedilotildeesduplicaccedilotildees)

nas regiotildees subtelomeacutericas em indiviacuteduos com diagnoacutestico de HPE Metodologia Avaliaccedilatildeo

geneacutetica de 25 amostras de DNA de indiviacuteduos matriculados no HRAC-USP com

diagnoacutestico de HPE atraveacutes da teacutecnica de MLPA (Multiplex ligation-dependent probe

amplification) segundo protocolo proposto por Schouten et al (2002) Estes indiviacuteduos jaacute

foram previamente triados para mutaccedilotildeesdeleccedilotildees nos genes candidatos agrave HPE (SHH ZIC2

TGIF GLI2 e PTCH1) atraveacutes do sequenciamento direto de Sanger e da teacutecnica de MLPA

sem resultado positivo para qualquer alteraccedilatildeo Resultados Dentre os 25 indiviacuteduos

analisados o fenoacutetipo predominante foi a microforma da doenccedila Os principais achados

cliacutenicos da amostra estudada foram hipotelorismo microcefalia e fissura de laacutebio e palato

(100) nariz achatado (84) presenccedila de um incisivo central uacutenico (24) e ponte nasal

baixa (64) Quatro pacientes apresentaram comprometimento no SNC (16) Nenhum

indiviacuteduo apresentou quaisquer alteraccedilotildees como microdeleccedilotildees eou duplicaccedilotildees nos genes

contidos nas regiotildees subtelomeacutericas atraveacutes da anaacutelise pela teacutecnica de MLPA Dessa forma

estes permanecem sem diagnoacutestico geneacutetico definido Discussatildeo A natildeo detecccedilatildeo de

alteraccedilotildees subtelomeacutericas sugere que o fenoacutetipo predominante na amostra microforma possa

natildeo apresentar alteraccedilotildees subtelomeacutericas relacionadas ao aparecimento da doenccedila Entretanto

deve-se salientar que o universo amostral eacute relativamente pequeno de forma que este possa

natildeo ser um exemplo fiel dos casos de microforma da HPE Reforccedila-se ainda a grande

variedade de fatores envolvidos no surgimento desta patologia bem como o envolvimento de

outros genes ainda natildeo estabelecidos aleacutem das causas ambientais ainda natildeo completamente

elucidadas Conclusotildees Natildeo foram encontradas alteraccedilotildees subtelomeacutericas nos pacientes com

diagnoacutestico de HPE estudados A teacutecnica de MLPA consiste em uma metodologia raacutepida

sensiacutevel eficaz e de baixo custo quando comparada a outras teacutecnicas sendo indicada para o

uso em laboratoacuterios de diagnoacutestico geneacutetico uma vez que diversos estudos jaacute mostraram que

consiste em um meacutetodo confiaacutevel de diagnoacutestico Devido ao tamanho relativamente pequeno

da amostra utilizada neste estudo e os dados ainda inconsistentes da literatura atual estudos

adicionais satildeo necessaacuterios para que seja possiacutevel a realizaccedilatildeo de um diagnoacutestico diferencial

explicando o amplo espectro fenotiacutepico observado nesta doenccedila conforme sugerido pela

hipoacutetese dos muacuteltiplos fatores

Descritores Holoprosencefalia DNA Regiatildeo subtelomeacuterica MLPA Deleccedilatildeo Duplicaccedilatildeo

10

ABSTRACT

TRAGANTE V MLPA analysis of subtelomeric regions of patients with holoprosencephaly

[dissertation] Bauru Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais Universidade de

Satildeo Paulo 2014

Introduction Holoprosencephaly (HPE) a craniofacial malformation results from flaws in

formation process of the nervous system during embryonic development The etiology is

heterogeneous and complex involving environmental and genetic factors Recent studies

suggest that subtelomeric aberrations could be an etiological factor to the onset of HPE

Objectives Investigate possible changes (microdeletionsduplications) in subtelomeric

regions in individuals diagnosed with HPE Methodology Genetic evaluation of 25 DNA

samples from individuals enrolled at HRAC-USP diagnosed with HPE (performed by

Syndromology Division ndash HRACUSP) by MLPA technique as proposed by Schouten et al

(2002) Patients were previously screened for mutationsdeletions in HPE candidate genes

(SHH ZIC2 TGIF GLI2 and PTCH1) by direct Sanger sequencing and MLPA technique

without any match Analyses were performed at the Laboratory of Molecular Genetics

Hospital for Rehabilitation of Craniofacial Anomalies HRAC-USP Results Among the 25

individuals analyzed the predominant phenotype was HPE microform The main clinical

findings of the study sample were hypotelorism microcephaly and cleft lippalate (100)

flat nose (84) presence of a single central incisor (24) and low nasal bridge (64) Four

patients had CNS commitment (16) No subtelomeric mutations were found in our sample

such as microdeletionsduplications of genes analyzed by MLPA technique Thus they

remain without defined genetic diagnosis Discussion Subtelomeric changes were not found

suggesting that the predominant sample phenotype microform HPE could not be related with

subtelomeric changes associated to the disease outbreak However it should be noted that the

sample universe is relatively small so this may not be a true example of HPE microform

cases It should also be reinforced the wide variety of factors involved in the onset of this

pathology as well as the involvement of other genes not yet established and environmental

causes not completely understood Conclusions No subtelomeric mutations were found in

the HPE individuals studied MLPA technique consists in a rapid sensitive and cost effective

methodology when compared to other techniques being suitable for use in genetic diagnostic

laboratories since several studies have shown that consists of a reliable method of diagnosis

Due to the relatively small sample size used in this study and even inconsistent data in

literature further studies are needed to make it possible to perform a differential diagnosis

explaining the wide phenotypic spectrum observed in this disease as suggested by the

multiple hit hypothesis

Descriptors Holoprosencephaly DNA Subtelomeric region MLPA Deletion Duplication

11

LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES

Figura 1 Algumas caracteriacutesticas fenotiacutepicas em HPE 24

Figura 2 A via de sinalizaccedilatildeo de Hedgehog 29

Figura 3 Via de sinalizaccedilatildeo de Hh delineada no site geneManiaorg 31

Figura 4 Organizaccedilatildeo dos telocircmeros 32

Figura 5 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da localizaccedilatildeo das deleccedilotildees de genes da HPE e

candidatos de HPE em bandeamento G 36

Figura 6 Etapas da reaccedilatildeo de MLPA 39

Figura 7 Perfil normal de anaacutelise das sondas em quatro pacientes no software

GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Classificaccedilatildeo da gravidade e caracteriacutesticas anatocircmicas nos diferentes

tipos de HPE 22

Tabela 2 Sondas do Kit SALSA MLPA P036-E1 Human-telomere-3 50

Tabela 3 Caracterizaccedilatildeo da casuiacutestica estudada 53

13

LISTA DE GRAacuteFICOS

Graacutefico 1 Grupo amostral e suas formas cliacutenicas de HPE 50

Graacutefico 2 Caracteriacutesticas fenotiacutepicas da amostra estudada 55

14

ABREVIATURAS E SIGLAS

ADNPM Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor

arrayCGH Array comparative genomic hybridization

BMP Bone morphogenetic protein

DHCRT Hypocretin (oregin) neuropepitide precursor

DHH Desert Hedgehog

DNA Deoxyribonucleic acid

FAST1 Forkhead Activin Signal Transducer-1

FISH Fluorescence in situ hybridization (Hibridizaccedilatildeo in situ por fluorescecircncia)

GAS1 Growth Arrest-Specific 1

GLI2 GLI family zinc finger 2

Hh Via de sinalizaccedilatildeo Hedgehog

HPE Holoprosencefalia

HPE-like Holoprosencefalia-like

HRAC-USP Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo

Paulo

IHH Indian Hedgehog

MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification (Amplificaccedilatildeo Multiplex de

Sondas Dependente de Ligaccedilatildeo)

NODAL Nodal growth differentiation factor

PATCH1PTCH1 Patched 1

PCR Polymerase Chain Reaction

PCT Patched gene

RDNPM Retardo do Desenvolvimento Neuropsicomotor

SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened

SNC Sistema Nervoso Central

SNP Single nucleotide polymorphism

SUFU Supressor of Fused Homolog

15

TDGIF Putative adenylate cyclase

TGIF TGFB-induced factor homeobox 1

ZIC2 Zic family member 2

WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO

1 INTRODUCcedilAtildeO 17

2 REVISAtildeO DE LITERATURA 19

21 EMBRIOLOGIA DO SISTEMA NERVOSO CENTRAL 19

22 HOLOPROSENCEFALIA 21

23 IMPORTAcircNCIA DA VIA DE SINALIZACcedilAtildeO SONIC HEDGEHOG NO

DESENVOLVIMENTO CRANIOFACIAL E HOLOPROSENCEFALIA 27

24 REGIAtildeO SUBTELOMEacuteRICA E SUA IMPLICACcedilAtildeO CLIacuteNICA 31

25 TEacuteCNICA DE MLPA ndash MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE

AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42

31 OBJETIVO GERAL 42

32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 42

4 MATERIAL E MEacuteTODOS 43

41 GRUPO AMOSTRAL 43

42 ANAacuteLISE MOLECULAR 44

43 MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION 46

5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 49

51 CARACTERIacuteSTICAS DA AMOSTRA ESTUDADA 50

52 ANAacuteLISE DAS REGIOtildeES SUBTELOMEacuteRICAS PELA TEacuteCNICA DE MLPA 57

6 CONCLUSAtildeO 63

7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 64

ANEXOS

ANEXO 1 ndash Parecer consubstanciado do CEP- HRAC-USP 77

ANEXO 2 - Ofiacutecio 2892006 82

ANEXO 3 ndash Ofiacutecio 1112011 83

ANEXO 4 ndash TCLE elaborado para a pesquisa atual 84

17

1 INTRODUCcedilAtildeO

As anomalias craniofaciais resultam de alteraccedilotildees durante o processo de formaccedilatildeo

do cracircnio e da face ao longo do desenvolvimento intra-uterino podendo ou natildeo estar

associadas a malformaccedilotildees estruturais eou funcionais do SNC Estas constituem a quarta

causa mais frequente dentre as anomalias congecircnitas em receacutem-nascidos

Assim como outros tipos de malformaccedilotildees congecircnitas as anomalias craniofaciais

apresentam etiologia multifatorial envolvendo fatores ambientais e geneacuteticos o que

determina uma grande variedade de formas abrangendo desde quadros de fissura isolada de

laacutebio com grau miacutenimo de comprometimento ateacute quadros sindrocircmicos altamente complexos

com comprometimento cognitivo anatocircmico e esteacutetico

Dentre as anomalias craniofaciais encontra-se a Holoprosencefalia (HPE)

caracterizada por uma malformaccedilatildeo craniofacial decorrente de problemas no processo de

formaccedilatildeo do sistema nervoso durante o desenvolvimento embrionaacuterio Abrange diferentes

graus de acometimento apresentando um espectro fenotiacutepico que varia desde indiviacuteduos

aparentemente normais ateacute casos extremamente graves Sua etiologia tambeacutem estaacute relacionada

a fatores ambientais e geneacuteticos e a interaccedilatildeo entre estes provavelmente seja a causa do

amplo e contiacutenuo espectro fenotiacutepico descrito para esta anomalia Embora sua etiologia

permaneccedila ainda indefinida avanccedilos nas aacutereas de neuroimagem geneacutetica e embriologia

experimental trouxeram contribuiccedilotildees importantes no entendimento da etiologia desta

malformaccedilatildeo do ceacuterebro

Com o avanccedilo das teacutecnicas de citogeneacutetica e biologia molecular ao longo das

uacuteltimas deacutecadas houve uma melhora importante no entendimento natildeo soacute da estrutura e funccedilatildeo

do DNA como tambeacutem maiores possibilidades de investigaccedilatildeo detecccedilatildeo e compreensatildeo de

diversas doenccedilas e siacutendromes geneacuteticas Considerando a questatildeo da hereditariedade envolvida

nestas malformaccedilotildees eacute de suma importacircncia a investigaccedilatildeo das possiacuteveis causas geneacuteticas

relacionadas principalmente para o aconselhamento geneacutetico

A Divisatildeo de Sindromologia do Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias

Craniofaciais da Universidade de Satildeo Paulo (HRAC-USPBauru) atende um grande nuacutemero

de pacientes com hipoacutetese diagnoacutestica de HPE dos quais grande parte permanece ainda sem

diagnoacutestico geneacutetico definido ou seja exames de carioacutetipo de rotina e anaacutelises de mutaccedilatildeo

para os genes candidatos natildeo foram suficientes para se definir a causa geneacutetica envolvida

18

Atualmente evidecircncias citogeneacuteticas microscoacutepicas vecircm sendo relacionadas

como fatores etioloacutegicos para HPE No intuito de se investigar tais alteraccedilotildees projetos em

execuccedilatildeo no HRAC e em colaboraccedilatildeo com o Instituto de Biociecircncias da USP-Satildeo Paulo

(Ofiacutecio n 1112011-SVAPEPE-CEP) possibilitaram a realizaccedilatildeo de anaacutelises geneacuteticas nos

principais genes envolvidos na HPE (TGIF SIX3 SHH ZIC2 GLI2 PTCH e GAS1) e em

outras regiotildees do genoma na busca por deleccedilotildees de ponto eou microdeleccedilotildeesduplicaccedilotildees

(Processos Fapesp Ndeg0660973-9 e Ndeg 201107012-9) Esses estudos tecircm contribuiacutedo para

uma descriccedilatildeo cliacutenica e molecular mais compreensiva da HPE Entretanto apesar destes

avanccedilos a etiologia a patogenia e qualquer explicaccedilatildeo para as causas geneacuteticas e ambientais

permanecem incompletas Salienta-se que o Laboratoacuterio de Geneacutetica Molecular do

HRACUSP possui uma coleccedilatildeo de mais de 150 amostras de DNA de pacientes com

diagnoacutestico cliacutenico da HPE das quais 33 apresentaram variaccedilatildeo no genoma Portanto a

maior parte permanece sem uma causa geneacutetica determinada

Pesquisas recentes tecircm associado alteraccedilotildees subtelomeacutericas a casos de atraso no

desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM) deficiecircncia intelectual e mais recentemente

HPE Sendo assim a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees nestas regiotildees eacute importante pois propotildee

ampliar o conhecimento do genoma de indiviacuteduos com diagnoacutestico cliacutenico de HPE buscando

a determinaccedilatildeo do possiacutevel componente geneacutetico contido em sua etiologia

Devido agrave escassez de dados na literatura relacionando HPE a alteraccedilotildees nas

regiotildees subtelomeacutericas este estudo teve como foco a ampliaccedilatildeo de dados a respeito das

investigaccedilotildees dessas regiotildees cromossocircmicas visando auxiliar a identificaccedilatildeo de possiacuteveis

alteraccedilotildees que pudessem ser relacionadas agrave HPE em indiviacuteduos com diagnoacutestico cliacutenico da

doenccedila Esta abordagem se mostra muito importante para o aconselhamento geneacutetico e

planejamento familiar de casais em que haacute um portador da doenccedila

Sendo assim o presente estudo sugeriu a investigaccedilatildeo de possiacuteveis microdeleccedilotildees

eou microduplicaccedilotildees nas regiotildees subtelomeacutericas de 25 indiviacuteduos diagnosticados como

portadores de HPE Foi possiacutevel analisar as regiotildees subtelomeacutericas obtendo bons resultados

na amostra estudada Os dados deste projeto complementaratildeo dados jaacute obtidos em projetos

concluiacutedos e outros ainda em desenvolvimento pela equipe da Divisatildeo de Sindromologia

19

2 REVISAtildeO DA LITERATURA

21 Embriologia do sistema nervoso central

O sistema nervoso central (SNC) eacute fundamental para o desenvolvimento do

complexo craniofacial Ele eacute originado a partir da placa neural uma aacuterea espessa composta

homogeneamente de ceacutelulas epiteliais diferenciadas a partir do ectoderma o qual constitui a

superfiacutecie dorsal do embriatildeo no estaacutegio de gaacutestrula Agrave medida que a placa neural dobra-se

para a formaccedilatildeo do tubo neural a porccedilatildeo anterior alargada se subdivide nas trecircs vesiacuteculas

encefaacutelicas primordiais prosenceacutefalo (enceacutefalo anterior) mesenceacutefalo (enceacutefalo meacutedio) e

rombenceacutefalo (enceacutefalo posterior) (SOM amp NAIDICH 2014) A crista neural uma massa

celular que se desprende das extremidades da placa neural no momento da fusatildeo para a

formaccedilatildeo do tubo neural eacute derivada da regiatildeo do rombenceacutefalo e daraacute origem agrave maior parte

do mesecircnquima do arco fariacutengeo (CORDERO et al 2011) A migraccedilatildeo das ceacutelulas da crista

neural resulta em uma relocaccedilatildeo ventral para dentro dos arcos fariacutengeos O centro

prosencefaacutelico derivado do mesoderma precordal apoacutes a divisatildeo do prosenceacutefalo induz o

aparato visual parte da orelha interna meacutedia e externa aleacutem do terccedilo meacutedio superior da face

Sabe-se que o desenvolvimento das regiotildees meacutedia e baixa do complexo craniofacial estaacute

intimamente associado a essas regiotildees fariacutengeas ficando claro portanto que a crista neural

derivada do rombenceacutefalo eacute essencial para a formaccedilatildeo normal de face e pescoccedilo Alteraccedilotildees

que ocorrem nestas etapas do desenvolvimento embrionaacuterio podem resultar em anomalias

diversas envolvendo as fitas olfativas o desenvolvimento das narinas o globo ocular germes

dentaacuterios orelhas entre outras (CHAI et al 2000 MOORE amp PERSAUD 2008

SANTIAGO 2006)

As anomalias craniofaciais satildeo alteraccedilotildees do desenvolvimento do cracircnio e da face

que podem ou natildeo estar acompanhadas de malformaccedilotildees estruturais eou funcionais do SNC

20

Estas representam a quarta causa mais frequente dentre as anomalias congecircnitas em receacutem-

nascidos Durante muito tempo considerou-se que grande parte dessas alteraccedilotildees resultava da

formaccedilatildeo insuficiente ou migraccedilatildeo inadequada do mesecircnquima da base do cracircnio e da face

(MAZZOLA 1976) Entretanto com o avanccedilo do conhecimento principalmente no que diz

respeito ao domiacutenio da geneacutetica molecular identificou-se que a construccedilatildeo craniofacial

resulta de mecanismos diversos dependentes de uma grande quantidade de genes em

permanente interaccedilatildeo dentre eles os genes SHH SIX3 TGIF ZIC2 GLI2 PATCHED 1

(LOWE et al 2000 MARTI amp BOVOLENTA 2002 MARAZITA amp MOONEY 2004

MERRITT 2005 HEDLUNG 2006 SANTIAGO 2006)

Quando comprometidos os mecanismos geneacuteticos ndash que satildeo muacuteltiplos e

complexos ndash envolvidos nos diversos processos do desenvolvimento craniofacial resultam em

uma imensa variedade de siacutendromes sequecircncias associaccedilotildees ou mesmo anomalias isoladas

Define-se siacutendrome como um padratildeo de anomalias (sinais e sintomas) sendo pelo menos uma

delas morfoloacutegica conhecida ou aparentemente relacionada com a causa Sequecircncias satildeo

definidas como uma ou mais anomalias morfoloacutegicas conhecidas resultantes de uma uacutenica

malformaccedilatildeo perturbaccedilatildeo deformaccedilatildeo ou displasia Jaacute associaccedilotildees se referem a um padratildeo de

anomalias das quais pelo menos duas satildeo morfoloacutegicas ocorrendo em conjunto com mais

frequecircncia do que seria esperado pelo acaso poreacutem sem relaccedilatildeo causal identificada

Finalmente anomalias isoladas relacionam-se com um fenoacutetipo anatocircmico (micro e

macroscoacutepico) que representa uma mudanccedila substancial da populaccedilatildeo de referecircncia A

classificaccedilatildeo de pacientes por siacutendromes especiacuteficas eacute difiacutecil e muitas vezes confusa

resultando em certos quadros dispostos dentro de um espectro contiacutenuo no qual diferentes

mecanismos etioloacutegicos e patoloacutegicos tambeacutem se interpotildeem (COHEN 1997 HENNEKAM et

al 2013)

21

22 Holoprosencefalia

Em 1964 DeMeyer et al propuseram o termo Holoprosencefalia (HPE) definido-

a como o comprometimento estrutural e funcional de componentes do prosenceacutefalo

(telenceacutefalo e dienceacutefalo) caracterizando o defeito embrionaacuterio de linha meacutedia e como sendo

o resultado da falha no crescimento ou segmentaccedilatildeo da regiatildeo final anterior do tubo neural

ocorrendo entre o 18deg e o 24deg dia da gestaccedilatildeo (MING amp MUENKE 1998 SWATEK 2013)

A HPE eacute a malformaccedilatildeo craniofacial mais comum em humanos e apresenta uma alta

incidecircncia de 1250 durante a embriogecircnese (MATSUNAGA e SHIOTA 1977) mas devido

agrave letalidade intra-uterina a frequecircncia eacute de 116000 nascidos vivos (ROACH et al 1975

MUSTACCHI amp PERES 2000 DUBOURG 2007)

De acordo com a gravidade das malformaccedilotildees cerebrais a HPE pode ser

classificada em quatro tipos 1) HPE alobar 2) HPE semilobar 3) HPE lobar e 4) fusatildeo inter-

hemisfeacuterica meacutedia A classificaccedilatildeo dos quatro tipos de HPE de acordo com seus respectivos

achados anatocircmicos encontra-se na Tabela 1

22

Tabela 1 - Classificaccedilatildeo e caracteriacutesticas anatocircmicas dos diferentes tipos de HPE de acordo

com a gravidade (modificado de DUBOURG et al 2007)

TIPOS DE HPE CARACTERIacuteSTICAS ANATOcircMICAS

HPE-ALOBAR

Forma mais grave

Presenccedila de um uacutenico e pequeno ventriacuteculo prosenceacutefalico

Ausecircncia de divisatildeo inter-hemisfeacuterica

Ausecircncia dos bulbos olfatoacuterios ou de suas vias tratos oacutepticos e

seio sagital

Ausecircncia de corpo caloso

Fusatildeo de taacutelamo

Natildeo separaccedilatildeo dos nuacutecleos cinzentos profundos

HPE-SEMI LOBAR

Loacutebulos frontais e parietais fusionados ou seja rudimentares

Fissura inter-hemisfeacuterica posteriormente incompleta

Ausecircncia ou hipoplasia dos bulbos olfatoacuterios ou de suas vias


Variaccedilatildeo da separaccedilatildeo dos nuacutecleos cinzentos profundos

HPE-LOBAR

Loacutebulo cerebral totalmente desenvolvido

Distinta divisatildeo inter-hemisfeacuterica

Linha meacutedia do neocoacutertex frontal contiacutenua

Corpo caloso tratos e bulbos olfatoacuterios podem estar ausentes

hipoplaacutesicos ou normais

Separaccedilatildeo dos nuacutecleos cinzentos profundos

Associado a manifestaccedilotildees faciais menos graves

FIHM

(fusatildeo inter-hemisfeacuterica meacutedia)

Malformaccedilatildeo rara

Falha da separaccedilatildeo dos lobos frontal e parietal posterior

Joelho do corpo caloso e muacutesculo esplecircnio-cervical normalmente

formados

Hipotaacutelamo e nuacutecleos lentiformes normalmente separados

Massa cinzenta heterotoacutepica

Vaacuterias anomalias craniofaciais estatildeo comumente associadas agrave HPE e assim

sendo utiliza-se em geneacutetica cliacutenica o termo ldquosequecircncia da HPErdquo para designaacute-las Do ponto

de vista geneacutetico pode natildeo ser apropriado o uso de uma definiccedilatildeo fixa de HPE pois eacute sabido

que uma mesma causa geneacutetica pode trazer como consequecircncia tanto a HPE em qualquer

uma de suas formas quanto microformas da mesma (SANTIAGO 2006) Em relaccedilatildeo ao

fenoacutetipo a doenccedila eacute bastante variaacutevel abrangendo um espectro contiacutenuo desde manifestaccedilotildees

23

graves envolvendo anomalias do ceacuterebro e face ateacute indiviacuteduos clinicamente normais

(COHEN 1989)

De acordo com DeMeyer et al (1964) em aproximadamente 80 dos casos mais

graves de HPE ldquoa face prediz o ceacuterebrordquo Entretanto a severidade das malformaccedilotildees faciais

nem sempre condiz com as cerebrais A maior parte dos portadores de HPE possui pelo

menos uma anomalia facial poreacutem acredita-se que 20 dos indiviacuteduos que apresentam

malformaccedilotildees cerebrais podem natildeo apresentar nenhum sinal facial Indiviacuteduos com

desenvolvimento cerebral e cognitivo normal podem gerar filhos com HPE Desta maneira eacute

sugestivo que as microformas de HPE sejam indicativas de alerta para avaliaccedilatildeo de riscos e

precauccedilatildeo para o possiacutevel nascimento de filhos afetados (DEMEYER et al 1963

SANTIAGO 2006 SAVASTANO et al 2014b)

Os principais macromicrossinais dentro deste espectro heterogecircneo incluem

- Diminuiccedilatildeo do periacutemetro craniano

- Agenesia ou hipoplasia da espinha nasal anterior

- Ausecircncia ou diminuiccedilatildeo do acircngulo frontonasal

- Agenesia de preacute-maxila

- Anomalias oculares diversas como hipotelorismo ocular (aproximaccedilatildeo excessiva dos olhos)

ciclopia (olho uacutenico ou parcialmente dividido na mesma oacuterbita neste caso caracterizando a

sinoftalmia) e coloboma da iacuteris (defeito da iacuteris em forma de buraco de fechadura)

- Maxila asas nasais e nariz hipoplaacutesicos

- Proboacutescide (apecircndice tubular situado acima dos olhos)

- Ausecircncia de ponta nasal

- Estenose da abertura nasal

- Filtro hipodesenvolvido

- Incisivo central maxilar uacutenico

24

- Fissura labiopalatina mediana ou falsa mediana

- Maloclusatildeo (RICHIERI-COSTA amp RIBEIRO 2006 ab SANTIAGO 2006 HENNEKAM

et al 2008 LIPINSKI et al 2010 SOLOMON et al 2010 BANO 2012 JAVAD 2013

SWATEK et al 2013)

Alguns destes sinais caracteriacutesticos podem ser ilustrados na Figura 1

Figura 1 Algumas caracteriacutesticas fenotiacutepicas em HPE 1)Ciclopia com sinoftalmia

2)Hipotelorismo ocular e proboacutescide entre os olhos 3)Hipotelorismo ocular e nariz com narina uacutenica

4)Fissura labiopalatina ausecircncia de filtro nasal nariz achatado e agenesia de preacute-maxila 5)Leve

dismorfismo facial ponte nasal baixa (SANTIAGO 2006)

Em 2003 foi descrito ainda um fenoacutetipo singular dentro do espectro

holoprosencefaacutelico o HPE-like tambeacutem chamado de microforma de HPE que aparece

associado ou natildeo a outras anormalidades do processo de separaccedilatildeo do prosenceacutefalo As

caracteriacutesticas mais comuns satildeo hipotelorismo isolado fissura de laacutebio eou palato presenccedila

de incisivo central uacutenico e hipoplasia de face meacutedia Eacute importante salientar que associaccedilotildees

entre estes sinais feitas de forma aleatoacuteria satildeo indicativas de que ateacute o presente momento

natildeo haacute definiccedilatildeo padronizada para este fenoacutetipo Pacientes diagnosticados com HPE-like na

25

maior parte dos casos apresentam desenvolvimento cognitivo e neuropsicomotor normais

(RICHIERI-COSTA amp RIBEIRO 2005 SANTIAGO 2006)

Diversas anomalias que ateacute haacute pouco tempo natildeo eram descritas ou relacionadas

ao espectro da HPE foram incorporadas ao diagnoacutestico apoacutes o advento dos exames de

neuroimagem aumentando-se assim o arsenal cliacutenico Dentre estas anomalias destacam-se as

anomalias estruturais do corpo caloso marcadamente a agenesia as anomalias da glacircndula

pituitaacuteria as anomalias dentaacuterias nasais oculares entre outras Hoje eacute sabido que a

ampliaccedilatildeo deste universo dependia apenas de um meio mais simples e eficaz de diagnoacutestico

pois boa parte destas anomalias estava predita nos modelos experimentais com outros

vertebrados ou em achados cliacutenicos descritos posteriormente como parte integrante de

determinadas mutaccedilotildees (ROESSLER amp MUENKE 2001 RICCOMAGNO et al 2002

COHEN 2003 DAKUBO et al 2003 ROESSLER et al 2003 SCHIMMENTI et al 2003

SAVASTANO et al 2014ab)

A etiologia da HPE eacute heterogecircnea e complexa Envolve fatores ambientais tais

como o uso materno de aacutecido retinoacuteico consumo abusivo de aacutelcool e diabetes gestacional

aleacutem do uso de inibidores da biossiacutentese de colesterol ou mesmo niacuteveis maternos baixos de

colesterol uso de salicilatos anticonvulsivantes e sulfassalazina Infecccedilotildees por

citomegaloviacuterus toxoplasmose e rubeacuteola vecircm sendo postuladas tambeacutem como possiacuteveis

causas da HPE (SANTIAGO 2006 SWATEK 2013) A etiologia envolve tambeacutem formas

sindrocircmicas (siacutendrome de Smith-Lemli-Opitz) anomalias citogeneacuteticas (detectadas por

carioacutetipo de rotina de alta resoluccedilatildeo) anomalias cromossocircmicas submicroscoacutepicas

(diagnosticadas por metodologias como FISH MLPA e microarray) e mutaccedilotildees gecircnicas

tendo como principais genes envolvidos SHH (mutaccedilatildeo presente em 127 dos casos) ZIC2

(mutaccedilatildeo presente em 92 dos casos associado com face normal) SIX3 e TGIF (JOHNSON

amp RASMUSSEN 2010 ROESSLER amp MUENKE 2010 SOLOMON et al 2010)

26

Mutaccedilotildees pontuais destes quatro principais genes da HPE satildeo encontradas em

aproximadamente 20 dos casos e grandes deleccedilotildees envolvendo os mesmos genes satildeo

detectadas em 8 dos casos (SWATEK 2013)

Bendavid et al (2007) realizaram um levantamento no qual observaram que 45

da etiologia de HPE eacute cromossocircmica diagnosticada atraveacutes de carioacutetipo padratildeo 15 se

relacionam com fatores ambientais evidentes como diabetes gestacional desde o iniacutecio da

gestaccedilatildeo aleacutem de siacutendromes com muacuteltiplas malformaccedilotildees como Smith-Lemli-Opitz

Rubinstein-Taybi e Pseudotrissomia 13 Dos 40 dos casos remanescentes os chamados

HPE isolada (natildeo-cromossocircmica e natildeo-sindrocircmica) as metodologias de sequenciamento e

dosagem gecircnica dos quatro principais genes identificaram anomalias moleculares em mais de

25 Assim aproximadamente 75 dos casos de HPE isolada tecircm etiologia geneacutetica e

ambiental a ser determinada (BENDAVID et al 2007)

A variabilidade fenotiacutepica extrema da HPE pode ser observada em familiares

carregando a mesma mutaccedilatildeo O espectro fenotiacutepico varia entre indiviacuteduos natildeo afetados ou

com microformas ateacute indiviacuteduos com as caracteriacutesticas mais graves da doenccedila indicando que

uma simples mutaccedilatildeo pode natildeo ser o suficiente para provocar o fenoacutetipo de HPE e

consequentemente sua gravidade depende de uma seacuterie de fatores geneacuteticos e ambientais

acumulados a chamada ldquohipoacutetese dos muacuteltiplos fatoresrdquo (the multiple-hit hypothesis)

(COHEN 1989 MUENKE et al 1994 MING amp MUENKE 2002 MERCIER et al 2011

SWATEK et al 2013)

O principal modelo relacionado com a HPE refere-se agrave rede sinalizadora do gene

Sonic Hedgehog (SHH) o qual controla decisotildees celulares criacuteticas em relaccedilatildeo ao destino de

muacuteltiplos sistemas particularmente nas ceacutelulas tronco e a partir delas funcionando como um

ldquointerruptorrdquo ndash inibidor ou facilitador ndash ditando o destino celular desde etapas iniciais do

embriatildeo ateacute a vida adulta (NANNI et al 1999 LAI et al 2004 RYAN amp CHIANG 2012)

27

Os genes mais conhecidos relacionados agrave rede sinalizadora do SHH compreendem

ZIC2 TGIF PATCH GLI2 FAST1 TDGIF SUFU e o DHCRT Outros genes natildeo

pertencentes a esta rede incluem o gene SIX3 e uma seacuterie de outros candidatos ateacute o presente

apenas com regiotildees identificadas Diversas regiotildees cromossocircmicas tambeacutem estatildeo

supostamente implicadas na etiologia da HPE (PETEK et al 1998 STASHINKO et al

2004 KAMNASARAN et al 2005)

23 Importacircncia da via de sinalizaccedilatildeo Sonic Hedgehog no desenvolvimento

craniofacial e Holoprosencefalia

O funcionamento da via Hedgehog (Hh) foi descrito inicialmente em estudos

com Drosophila sendo grande parte dos componentes preservados em humanos

(GOODRICH et al 1997) Mutaccedilotildees em componentes da via Hedgehog e outras como

TGFbNODAL WNT e BMP podem trazer como consequecircncia o fenoacutetipo de HPE

(LIPINSKI et al 2010 RYAN amp CHIANG 2012)

A ativaccedilatildeo da via eacute realizada por trecircs proteiacutenas homoacutelogas Sonic Hedgehog

(SHH) Desert Hedgehog (DHH) e Indian Hedgehog (IHH) O gene SHH se expressa como

uma proteiacutena sinalizadora na notocorda e ceacutelulas da placa neural tendo como funccedilatildeo a

regulaccedilatildeo dos centros organizadores do prosenceacutefalo e rombenceacutefalo Este participa do

desenvolvimento de somitos e do tubo neural IHH eacute responsaacutevel pelo desenvolvimento de

condroacutecitos enquanto DHH participa do desenvolvimento de ceacutelulas germinativas

(SANTIAGO 2006 SALES 2012 PAN et al 2013)

Os membros da famiacutelia Hh satildeo proteiacutenas secretadas que agem sobre sinais

intercelulares em uma seacuterie de processos distintos O gene Hedgehog desempenha um papel

crucial no desenvolvimento embrionaacuterio normal de oacutergatildeos como pulmotildees (GRINDLEY et al

1997) e sistema nervoso e permanece ativo no indiviacuteduo adulto no qual estaacute envolvido na

28

manutenccedilatildeo de ceacutelulas estaminais Aleacutem disso no adulto um padratildeo de sinalizaccedilatildeo aberrante

nos membros da famiacutelia Hh pode levar a algumas formas de cacircncer (COHEN 2003

WETMORE 2003)

Geralmente somente o termo ldquovia de sinalizaccedilatildeo de Hhrdquo eacute comumente usado

Entretanto esta via eacute extremamente complexa englobando muitas outras o que resulta em

fenoacutetipos muito diferentes advindos de vaacuterios tipos de mutaccedilotildees em diversos componentes

das vias Os fenoacutetipos incluem dentre outros HPE Cefalopolisindactilia de Greig Siacutendrome

do Carcinoma Basocelular Nevoacuteide Siacutendrome de Pallister-Hall Meduloblastoma etc

(COHEN 2003)

A via de sinalizaccedilatildeo Hh eacute composta de duas proteiacutenas transmembrana Patched

(Ptc) uma proteiacutena composta por 12 canais de passagem que se une ao ligante de Hh e

Smoothened (Smo) uma proteiacutena transdutora de sinal composta por sete canais de passagem

Na ausecircncia do ligante Ptc interage com Smo e o inibe direta ou indiretamente Esta

repressatildeo culmina no fator de transcriccedilatildeo agindo como um repressor da transcriccedilatildeo Este fator

de transcriccedilatildeo existe em trecircs diferentes formas nos vertebrados sendo chamados de Gli e

apresenta funccedilotildees transcricionais distintas Quando Hh se liga agrave Ptc sua interaccedilatildeo com Smo

se altera de forma que Smo natildeo seja mais inibida Assim a proteiacutena Gli adentra o nuacutecleo da

ceacutelula e age como um ativador de transcriccedilatildeo para os mesmos genes que esta inibe quando Ptc

estaacute livre para interaccedilatildeo inibindo Smo conforme ilustrado na Figura 2 Estudos em

vertebrados indicam que a determinaccedilatildeo do destino da ceacutelula por vias de sinalizaccedilatildeo Hh

ocorra pela combinaccedilatildeo dos genes Gli expressos nesta ceacutelula (GOODRICH amp SCOTT 1998

JOHNSON amp SCOTT 1998 KALDERON 2000 MCMAHON 2000) Mamiacuteferos podem

expressar pelo menos duas proteiacutenas Ptc Patched-1 (Ptc-1) e Patched-2 (Ptc-2) sendo que

ambas se ligam agrave Hh com uma afinidade similar (CARPENTER et al 1998 KALDERON

2000)

29

Figura 2 A via de sinalizaccedilatildeo de Hedgehog envolve duas proteiacutenas transmembrana Patched

(Ptc) e Smoothened (Smo) Ptc liga-se agrave Shh ao passo que Smo atua como um transdutor de sinal Na

ausecircncia do ligante Pct interage com Smo e a inibe Esta inibiccedilatildeo ativa Gli o repressor de transcriccedilatildeo

Na presenccedila do ligante a interaccedilatildeo de Pct e Smo eacute alterada de forma que Smo deixa de ser inibida A

proteiacutena Gli entra no nuacutecleo celular e age como ativador de transcriccedilatildeo (MCMAHON 2000)

A importacircncia da via de sinalizaccedilatildeo Hh no desenvolvimento embrionaacuterio humano

se tornou evidente pela descoberta de que mutaccedilotildees nesta via causam HPE O sinal de SHH eacute

necessaacuterio para a manutenccedilatildeo da notocorda a induccedilatildeo da placa ventral e de neurocircnios

motores e induccedilatildeo do esqueleto axial A proteiacutena SHH secretada a partir do mesoderma preacute-

cordal normalmente sinaliza para inibir a formaccedilatildeo de olhos centrais rudimentares e quando

este sinal se apresenta defeituoso o resultado eacute a formaccedilatildeo de um olho ciacuteclope (CHIANG et

al 1996 MOORE amp PERSAUD 2008)

A funccedilatildeo da proteiacutena SHH foi determinada em estudos experimentais preacutevios por

meio da induccedilatildeo de ciclopamina em cultura celular uma substacircncia alcaloide-esteroidal

(anaacuteloga ao colesterol) advinda da planta Veratrum californicum A ciplopamina foi descrita

pela primeira vez na deacutecada de 1960 por causar defeitos associados agrave HPE em ovelhas e

30

desde entatildeo tem sido utilizada em estudos de teratogecircnese envolvendo diferentes vertebrados

Esta substacircncia atua como antagonista da atividade morfogeneacutetica da via Hh pela inibiccedilatildeo da

ligaccedilatildeo e consequente prevenccedilatildeo da ativaccedilatildeo de proteiacutenas transmembrana Smo Na ausecircncia

do ligante de Hh o seu receptor Ptc-1 inibe a atividade de Smo provavelmente atraveacutes de

uma pequena moleacutecula mediadora Apoacutes a ligaccedilatildeo de Hh com Ptc1 desfaz-se a inibiccedilatildeo de

Smo provocando a ativaccedilatildeo de uma complexa cascata downstream que culmina na expressatildeo

do gene alvo atraveacutes da famiacutelia dos fatores de transcriccedilatildeo Gli (LIPINSKI et al 2010 RYAN

amp CHIANG 2012)

Atualmente existem bancos de dados disponiacuteveis online que inter-relacionam

vias de sinalizaccedilatildeo gerando mapas que permitem visualizar a interaccedilatildeo entre redes de genes

que participam de atividades metaboacutelico-celulares especiacuteficas Neste caso a via de sinalizaccedilatildeo

de Hh relacionada com o desenvolvimento do SNC pocircde ser delineada no site

geneMANIAorg e observada abaixo na Figura 3

31

Figura 3 Via de sinalizaccedilatildeo de Hh delineada no site geneMANIAorg

24 Regiatildeo subtelomeacuterica e sua implicaccedilatildeo cliacutenica

Os telocircmeros (do grego telos = teacutermino + meros = parte) correspondem agraves regiotildees

terminais dos cromossomos sendo complexos e ricos em genes Jaacute os subtelocircmeros satildeo

regiotildees excepcionais do genoma formando a zona de transiccedilatildeo entre as sequecircncias

cromossocircmicas de coacutepia uacutenica e as repeticcedilotildees telomeacutericas (TTAGGG)n de cada cromossomo

Satildeo estruturas dinacircmicas e tem como funccedilotildees garantir a estabilidade dos cromossomos

garantir a replicaccedilatildeo completa do genoma regulaccedilatildeo do ciclo celular controle do

envelhecimento celular garantindo sua longevidade movimentaccedilatildeo e localizaccedilatildeo de

32

cromossomos dentro do nuacutecleo e regulaccedilatildeo transcricional de genes subtelomeacutericos (BLASCO

et al 1999 FEUERBACH et al 2002 MARTINS 2010)

Em todos os cromossomos eucarioacuteticos as regiotildees subtelomeacutericas contecircm

sequecircncias repetidas in tandem (TTAGGG) com extensatildeo variaacutevel de 2 a 15 Kb sendo um

domiacutenio distal subtelomeacuterico composto de famiacutelias complexas de DNA repetitivo com

diferentes padrotildees de homologia dentro dos cromossomos como mostrado na Figura 4

Algumas sequecircncias subtelomeacutericas incluem genes natildeo funcionais e aleacutem disso sem a

sequecircncia terminal repetitiva os cromossomos satildeo instaacuteveis e passiacuteveis de fusotildees terminal-

terminal e de degradaccedilatildeo exonucleoliacutetica representando siacutetios de instabilidade genocircmica

(DrsquoANGELO 2009 MARTINS 2010)

Figura 4 Organizaccedilatildeo dos telocircmeros (adaptado de KNIGHT amp FLINT

2000)

33

As regiotildees adjacentes aos telocircmeros possuem vaacuterias caracteriacutesticas que as tornam

candidatas agrave ocorrecircncia de rearranjos tais como a quase ausecircncia de histonas e nucleossomos

riqueza de genes e ilhas CpG e alta probabilidade de recombinaccedilatildeo (SACCONE et al 1992

KNIGHT amp FLINT 2000) Embora os rearranjos subtelomeacutericos descritos em muitos estudos

envolvam regiotildees especiacuteficas eacute provaacutevel que a grande interaccedilatildeo entre sequecircncias

subtelomeacutericas homoacutelogas inicie o processo de recombinaccedilatildeo nessas regiotildees Apesar do

mecanismo de duplicaccedilatildeo e separaccedilatildeo das regiotildees cromossocircmicas terminais ainda natildeo estar

totalmente elucidado jaacute se sabe que erros podem ocorrer e que mutaccedilotildees envolvendo essas

regiotildees podem ser herdadas com ou sem consequecircncias cliacutenicas (MEFFORD amp TRASK

2002)

O emparelhamento errocircneo de telocircmeros entre cromossomos natildeo homoacutelogos eacute

uma das principais causas de rearranjos cromossocircmicos tais como deleccedilotildees e duplicaccedilotildees

embora o mecanismo exato natildeo seja totalmente compreendido (MEFFORD amp TRASK

2002)

Rearranjos cromossocircmicos envolvendo telocircmeros ou extremidades dos

cromossomos podem ser uma provaacutevel causa de deficiecircncia intelectual idiopaacutetica

acometendo de 5 a 10 dos casos (FLINT amp KNIGHT 2003) Os telocircmeros satildeo

relativamente ricos em genes e desta maneira rearranjos nestas regiotildees podem

possivelmente resultar em anormalidades cliacutenicas Deleccedilotildees subtelomeacutericas especiacuteficas

podem resultar em siacutendromes conhecidas como Siacutendrome da alfa-TalassemiaSiacutendrome da

deleccedilatildeo 16pter Siacutendrome de Miller-Dieker (del17pter) siacutendrome de Wolf-Hirschorn

(del4pter) e siacutendrome do Cri-du-chat (del5pter) No entanto a maioria das deleccedilotildees das

extremidades dos cromossomos natildeo eacute clinicamente reconheciacutevel Devido agrave sua importacircncia

cliacutenica muitos laboratoacuterios analisam as regiotildees subtelomeacutericas em indiviacuteduos com atraso no

desenvolvimento neuropsicomotor (ADNPM) de causa desconhecida (MEDINA et al 2014)

34

Considerando o aspecto multigecircnico envolvido na HPE a investigaccedilatildeo nos loci

conhecidos de HPE e a busca constante por novos loci candidatos devem continuar Uma

oacutetima estrateacutegia para se identificar loci candidatos para afecccedilotildees geneacuteticas eacute atraveacutes da

investigaccedilatildeo das alteraccedilotildees cromossocircmicas

A anaacutelise cromossocircmica constitui uma excelente ferramenta para a identificaccedilatildeo

das causas das siacutendromes geneacuteticas particularmente aquelas envolvidas com malformaccedilotildees

do SNC (SHAFFER et al 2007) As primeiras alteraccedilotildees citogeneacuteticas encontradas em HPE

foram trissomia 13 trissomia 18 e triploidias (NORMAN 1995 ROESSLER amp MUENKE

1998) Alteraccedilotildees citogeneacuteticas em HPE permitiram a identificaccedilatildeo de 12 loci candidatos a

partir dos quais foram identificados os quatro principais genes associados (SHH ZIC2 SIX3 e

TGIF) (BELLONI et al 1996 BROWN et al 1998 WALLIS et al 1999 GRIPP et al

2000 BROWN et al 2001)

Bendavid et al (2006a b) demonstraram que teacutecnicas como Hibridizaccedilatildeo in situ

por Fluorescecircncia (FISH) e Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase quantitativo (qPCR) satildeo

ferramentas uacuteteis na busca por alteraccedilotildees nos loci conhecidos para HPE

O desenvolvimento da reaccedilatildeo de amplificaccedilatildeo multiplex de sondas dependentes

de ligaccedilatildeo (MLPA) na busca por rearranjos submicroscoacutepicos permitiu a realizaccedilatildeo de

screening geneacutetico com maior praticidade e menor tempo uma vez que consegue analisar

muacuteltiplas amostras em uma mesma reaccedilatildeo aleacutem de ser pouco onerosa Sendo assim eacute uma

importante ferramenta na investigaccedilatildeo de possiacuteveis arranjos associados agraves malformaccedilotildees

congecircnitas (HOGERVORST et al 2003 ROOMS et al 2004 BENDAVID et al 2007

BENDAVID et al 2010) Atualmente existem vaacuterios kits de sondas para este tipo de anaacutelise

disponiacuteveis comercialmente (MRC-Holland 2008)

A anaacutelise das regiotildees subtelomeacutericas em indiviacuteduos com ADNPM de causa

desconhecida algumas siacutendromes conhecidas bem como em indiviacuteduos com HPE deve ser

35

estimulada Koolen et al (2004) demonstraram que alteraccedilotildees subtelomeacutericas estatildeo

relacionadas ao ADNPM Evidecircncias deste trabalho levantaram a hipoacutetese de que alteraccedilotildees

subtelomeacutericas poderiam estar atuando como causa para HPE Assim Bendavid et al (2007)

observaram que dos 12 loci candidatos previamente descritos oito situavam-se em regiotildees

subtelomeacutericas inclusive os genes SHH e TGIF atualmente os mais importantes relacionados

agrave HPE Aleacutem disso acreditava-se que um screening das regiotildees subtelomeacutericas poderia

refinar os genes candidatos jaacute conhecidos aleacutem de identificar novos Bendavid et al (2007)

analisaram 181 casos de HPE os quais apresentavam carioacutetipo normal e natildeo possuiacuteam

mutaccedilotildees em nenhum dos quatro principais genes de HPE atraveacutes da teacutecnica de MLPA Os

resultados mostraram rearranjos em loci candidatos para HPE conhecidos (1q 20p e 21q)

bem como a identificaccedilatildeo de novos loci subtelomeacutericos (1p 5q 8p 17q 18q 22q e Xq) e um

subcentromeacuterico (15q) Associaccedilotildees entre ganho e perda subtelomeacuterica tambeacutem foram

encontradas e podem ser herdadas por translocaccedilatildeo parental equilibrada o que eacute importante

para o aconselhamento geneacutetico Estes achados reforccedilam a teoria de muacuteltiplos fatores para a

origem da HPE contribuindo para a explicaccedilatildeo da grande variabilidade do espectro

fenotiacutepico descrito nesta doenccedila Dos 181 pacientes oito apresentaram anormalidades

subtelomeacutericas o que caracterizou 44 da amostra analisada mostrados em verde na Figura

5 (BENDAVID et al 2007)

Em 2010 Bendavid et al publicaram uma revisatildeo acerca da HPE e as

anormalidades citogeneacuteticas jaacute descritas na literatura Neste artigo foi desenhado um mapa

cromossocircmico ndash mostrado na Figura 5 ndash em que foram documentadas as mudanccedilas e

descobertas recentes esquematizando as posiccedilotildees de genes jaacute validados para HPE e regiotildees

citogeneacuteticas anormais em que nenhum gene candidato especiacutefico havia sido identificado

36


candidatos de HPE em bandeamento G Barras marrom-caqui na lateral esquerda representam

deleccedilotildees detectadas por carioacutetipo de rotina Barras verdes do lado direito representam rearranjos

identificados pela teacutecnica de MLPA subtelomeacuterica em que linhas tracejadas identificam deleccedilotildees natildeo

delimitadas Barras azuis do lado direito representam deleccedilotildees submicroscoacutepicas identificadas pela

teacutecnica de hibridizaccedilatildeo genocircmica comparativa (array-CGH) O azul escuro denota deleccedilotildees de novo

enquanto o azul claro determina deleccedilotildees herdadas Para demonstrar um repertoacuterio exaustivo de genes

possivelmente envolvidos com a HPE foram posicionados os principais em vermelho e os menores

em laranja (BENDAVID et al 2010)

37

Baseado no trabalho de Bendavid et al (2007) com o intuito de se investigar

possiacuteveis alteraccedilotildees geneacuteticas nos indiviacuteduos com HPE cadastrados no HRAC para os quais

as anaacutelises citogeneacuteticas e moleculares preacutevias foram negativas utilizamos a teacutecnica de

MLPA na expectativa de se determinar a presenccedila de microdeleccedilotildeesduplicaccedilotildees nas regiotildees

subtelomeacutericas desses indiviacuteduos

25 Teacutecnica de MLPA ndash Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

A teacutecnica de MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification ou

Amplificaccedilatildeo Multiplex de Sondas Dependente de Ligaccedilatildeo) foi inicialmente descrita por

Schouten et al (2002) em um trabalho no qual foram investigadas em uma mesma reaccedilatildeo

alteraccedilotildees no nuacutemero de coacutepias de 50 sequecircncias diferentes de aacutecidos nucleicos em um uacutenico

experimento (SCHOUTEN et al 2002 SORENSEN et al 2008 KONIALIS et al 2014)

Esta teacutecnica tem como base a hibridizaccedilatildeo de sondas especiacuteficas em regiotildees de

interesse do genoma A interpretaccedilatildeo dos resultados eacute feita de acordo com a quantificaccedilatildeo

dessas sondas jaacute que apoacutes sua hibridizaccedilatildeo no DNA estas sofrem amplificaccedilatildeo pela teacutecnica

de Reaccedilatildeo em Cadeira da Polimerase (PCR) Os fragmentos finais satildeo separados e lidos em

aparelho de eletroforese capilar sendo possiacutevel a quantificaccedilatildeo relativa de coacutepias gecircnicas

determinando se haacute maior nuacutemero de coacutepias de forma a ser caracterizada uma duplicaccedilatildeo ou

menor nuacutemero caracterizando uma deleccedilatildeo da sequecircncia alvo (MRC-Holland 2008 AacuteVILA

2009)

A empresa holandesa MRC-Holland patenteou a teacutecnica e as possibilidades de

aplicaccedilatildeo satildeo variadas verificaccedilatildeo de alteraccedilotildees no nuacutemero de coacutepias (deleccedilotildees ou

duplicaccedilotildees) busca de mutaccedilotildees anaacutelise de metilaccedilatildeo do DNA (imprinting e epigeneacutetica)

quantificaccedilatildeo relativa de mRNA detecccedilatildeo de pontos de mutaccedilatildeo conhecidos e SNPs

(polimorfismo de nucleotiacutedeo uacutenico) identificaccedilatildeo de aberraccedilotildees cromossocircmicas em

38

linhagens celulares e amostras tumorais pesquisa de siacutendromes relacionadas agrave microdeleccedilotildees

e de distrofias musculares e triagem subtelomeacuterica Segundo a fabricante as vantagens dessa

teacutecnica em relaccedilatildeo a outras utilizadas na identificaccedilatildeo de alteraccedilotildees genocircmicas

compreendem a detecccedilatildeo de muitas sequecircncias do DNA genocircmico em uma mesma reaccedilatildeo

utilizando apenas 20ng de DNA (alto rendimento) a disponibilizaccedilatildeo de resultados em 24

horas empregando um termociclador e um sistema de eletroforese capilar (alta praticidade e

rapidez) a possibilidade de inclusatildeo de muitas amostras em um mesmo ensaio

(reprodutibilidade) a capacidade de detectar sequecircncias que diferem em apenas um

nucleotiacutedeo e o uso de protocolo uacutenico para muitas aplicaccedilotildees diferentes com custo

relativamente baixo Entretanto a teacutecnica natildeo permite identificar rearranjos cromossocircmicos

equilibrados ou alteraccedilotildees externas agrave regiatildeo de anelamento das sondas (MRC-Holland 2008)

O termo ldquoSALSArdquo (Selective Adaptor Ligation Selective Amplification) do kit

de MLPA refere-se ao adaptador seletivo de ligaccedilatildeo e amplificaccedilatildeo aplicado para estudos em

regiotildees subtelomeacutericas que permite o teste simultacircneo de todas as suas regiotildees necessitando

de uma menor quantidade de DNA sendo uma teacutecnica de mais faacutecil anaacutelise quando

comparado agrave teacutecnica de FISH (BENDAVID et al 2007)

As principais etapas da reaccedilatildeo de MLPA satildeo desnaturaccedilatildeo e hibridizaccedilatildeo das

sondas reaccedilatildeo de ligaccedilatildeo reaccedilatildeo de PCR e anaacutelise de dados conforme ilustrado na Figura 6

39

Figura 6 Etapas da reaccedilatildeo de MLPA ilustraccedilatildeo esquemaacutetica do mecanismo de hibridizaccedilatildeo

do DNA alvo por sondas de MLPA seguido de amplificaccedilatildeo Em preto satildeo apresentadas as

sequecircncias de primer universal em verde a sequecircncia stuffer responsaacutevel pela produccedilatildeo do

fragmento em tamanho preacute-definido e em azul a sequecircncia complementar ao DNA alvo (MRC-

Holland 2008 AacuteVILA 2009)

Inicialmente o DNA sofre desnaturaccedilatildeo e incubaccedilatildeo com um mix de sondas

Cada sonda eacute composta por dois oligonucleotiacutedeos separados sendo que cada uma conteacutem

uma das sequecircncias dos primers da PCR Sequecircncias alvo imediatamente adjacentes satildeo

hibridizadas pelos dois oligonucleotiacutedeos de cada sonda Dessa forma somente as sondas que

foram hibridizadas sofrem a reaccedilatildeo de ligaccedilatildeo e consequentemente seratildeo amplificadas

durante a reaccedilatildeo de PCR Seus produtos satildeo separados por eletroforese capilar As sondas que

40

natildeo hibridizaram e por consequecircncia natildeo sofreram reaccedilatildeo de ligaccedilatildeo apresentam apenas um

primer natildeo sofrendo amplificaccedilotildees e natildeo gerando nenhum sinal Uma das grandes facilidades

observadas na execuccedilatildeo da teacutecnica do MLPA eacute que natildeo haacute necessidade de remoccedilatildeo das

sondas que natildeo sofreram ligaccedilatildeo (SCHOUTEN et al 2002 PALOMARES et al 2006

MRC-Holland 2008)

Atualmente satildeo encontrados na literatura diversos estudos demonstrando que a

teacutecnica de MLPA possui vantagens quando comparada a outras metodologias moleculares

pelo fato de permitir que muacuteltiplos fragmentos sejam analisados em um mesmo ensaio

apresentando menor custo relativo ser uma teacutecnica de raacutepida execuccedilatildeo com alto grau de

especificidade e confiabilidade apresentar baixa taxa de falso-positivos e ser apropriada para

uso em rotinas de laboratoacuterios de diagnoacutestico geneacutetico e de pesquisas (HOGERVORST et al

2003 SLATER et al 2003 ROOMS et al 2004 PALOMARES et al 2006 BENDAVID et

al 2007) Em comparaccedilatildeo ao meacutetodo de FISH por exemplo a MLPA eacute uma boa ferramenta

diagnoacutestica cerca de 115 de seu valor e facilmente usada em grandes grupos de pacientes jaacute

que pode ser realizado um screening de amostras de 13 pacientes por corrida em apenas 48

horas O screening subtelomeacuterico por FISH precisa de 15 preparaccedilotildees multicores por

paciente tornando difiacutecil a anaacutelise de mais de dois pacientes em 48 horas No futuro o kit de

FISH subtelomeacuterico poderaacute ser usado como uma segunda linha de testes orientado pelos

resultados obtidos pela MLPA podendo ser aplicado nos pais de indiviacuteduos acometidos

buscando detectar anomalias cromossocircmicas que natildeo puderem ser detectadas pela teacutecnica de

MLPA (BENDAVID et al 2007)

Palomares et al (2006) compararam as teacutecnicas de FISH e MLPA no estudo de

regiotildees subtelomeacutericas de pacientes com deficiecircncia intelectual idiopaacutetica De 50 pacientes

analisados apenas um paciente apresentou resultados distintos na comparaccedilatildeo entre as duas

teacutecnicas demonstrando um alto niacutevel de concordacircncia entre as duas metodologias estudadas

41

Ressaltam ainda que a teacutecnica eacute recente e ateacute aquele momento havia sido utilizada em apenas

um nuacutemero limitado de estudos Desta forma os pesquisadores sugeriram que qualquer

resultado anormal deveria ser interpretado com cuidado e verificado com ferramentas

alternativas de diagnoacutestico como a proacutepria teacutecnica de FISH

A validaccedilatildeo dos resultados da MLPA por meio de array CGH por exemplo

possibilita encontrar outras possiacuteveis alteraccedilotildees no genoma que neste caso poderiam tambeacutem

estar associadas ao fenoacutetipo conforme a hipoacutetese dos muacuteltiplos fatores que prevecirc a

possibilidade de ocorrecircncia simultacircnea de muacuteltiplas alteraccedilotildees geneacuteticas para a HPE dado o

amplo espectro fenotiacutepico observado (BENDAVID et al 2007 BENDAVID et al 2009)

No presente estudo pacientes com diagnoacutestico cliacutenico para Holoprosencefalia

com causa ainda desconhecida foram analisados atraveacutes da teacutecnica de MLPA com kit

especiacutefico delineado para o estudo de regiotildees subtelomeacutericas com o intuito de se determinar

possiacuteveis alteraccedilotildees geneacuteticas que possam estar relacionadas ao fenoacutetipo da doenccedila

42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral

Investigar a presenccedila de microdeleccedilotildeesduplicaccedilotildees nas regiotildees subtelomeacutericas

em indiviacuteduos com diagnoacutestico de Holoprosencefalia

32 Objetivos especiacuteficos

1- Identificar novas etiologias para HPE de causa desconhecida

2- Identificar novos genes responsaacuteveis pela HPE

3- Fazer correlaccedilatildeo genoacutetipofenoacutetipo dos casos envolvidos no estudo

43

4 MATERIAL E MEacuteTODOS

Este estudo foi realizado apoacutes aprovaccedilatildeo do Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa do

Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo PauloBauru-SP

(HRACUSP-Bauru) aprovado sob o protocolo nordm 375234 ndash UEP-CEP (ANEXO 1)

41 Grupo Amostral

O grupo amostral foi composto por 25 amostras de DNA de indiviacuteduos

matriculados no Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo

Paulo ndash HRACUSP - BauruSP com hipoacutetese diagnoacutestica de Holoprosencefalia tendo como

criteacuterio de inclusatildeo a triagem preacutevia para mutaccedilatildeodeleccedilatildeoduplicaccedilatildeo dos genes candidatos agrave

HPE (SHH ZIC2 TGIF GLI2 e PTCH1) atraveacutes do sequenciamento direto de Sanger e da

teacutecnica de MLPA com o uso do kit P187

Estes pacientes fizeram parte de um projeto anterior (Fapesp Proc Ndeg 0660973-

9) para o qual foram coletados 2mL de sangue para a extraccedilatildeo do DNA segundo protocolo

da Qiagenreg tendo o mesmo sido aprovado pelo Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa do HRAC

(Ofiacutecio nordm 2892006-SVAPEPE-CEP - ANEXO 2) Na ocasiatildeo estes pacientes foram

avaliados pelos profissionais do Setor de Geneacutetica Cliacutenica do HRAC e diagnosticados como

pertencentes ao espectro fenotiacutepico da HPE

A casuiacutestica selecionada para o presente trabalho inclui amostras de DNA de

indiviacuteduos com diagnoacutestico de HPE claacutessica e microforma da HPE provenientes do projeto

citado anteriormente sem restriccedilatildeo a nenhum fenoacutetipo especiacutefico da HPE Essas mesmas

amostras foram utilizadas em outro projeto intitulado ldquoAnaacutelise geneacutetica em indiviacuteduos com

holoprosencefalia atraveacutes das teacutecnicas de MLPA e ArrayCGHrdquo (Ofiacutecio n 1112011-

SVAPEPE-CEP - ANEXO 3) onde foi investigada a presenccedila de microarranjos no DNA

44

destes indiviacuteduos Assim foram selecionados para o presente estudo os casos em que natildeo

foram detectadas alteraccedilotildees geneacuteticas nos estudos preacutevios

Apoacutes serem devidamente esclarecidos sobre o novo estudo os pacientes foram

incluiacutedos na casuiacutestica mediante a concordacircncia e a assinatura do Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido referente ao presente estudo no momento de um retorno ao hospital

(ANEXO 4)

42 Anaacutelise Molecular

As amostras de DNA foram submetidas agrave anaacutelise molecular atraveacutes da teacutecnica de

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Amplificaccedilatildeo Multiplex de

Sondas Dependentes de Ligaccedilatildeo) Para tal anaacutelise foi utilizado o kit SALSA MLPA KIT

P036 Human-telomere-3 (MRC Hollandreg Amsterdam Holanda) que conteacutem uma sonda para

cada regiatildeo subtelomeacuterica Na Tabela 2 estatildeo listadas as sondas correspondentes agrave posiccedilatildeo

dos fragmentos na regiatildeo subtelomeacuterica dos cromossomos e seus respectivos tamanhos

contemplados pelo kit

45

Tabela 2 Sondas do Kit SALSA MLPA probemix P036-E1 Human-telomere-3

Comprimento Posiccedilatildeo

cromossocircmica Gene detectado

SALSA MLPA

probe Map View build 36 position

64-70-76-82 Q-fragments DNA quantity only visible less than 100ng sample DNA

88-92-96 D-fragments low signal of 88 or 96 nt fragment indicates incomplete denaturation

100 X-fragment Specific for the X chromosome

105 Y-fragment Specific for the Y chromosome


130 sect plusmn 1p TNFRSF4 02269-L01761 01-00114

136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017

219 + plusmn 13q-cen PSPC1 02399-L01847 13-01924 (Acrocentric chromosome)

227 + 14q-cen CONB1IP1 (HEI10) 01732-L01318 14-01986 (Acrocentric chromosome)

235 + 15q-cen MKRN3 07291-L08858 15-02136 (Acrocentric chromosome)

242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026

283 + 21q-cen RBM11 01739-L01311 21-01451 (Acrocentric chromosome)

289 + 22q-cen BID 01740-L01310 22-01661 (Acrocentric chromosome)

298 XpYp

(PAR1) SHOX 01148-L01331 XY-00052 (PAR1 region)

307 1q SH3BP5L

(KIAA1720) 02392-L02149 01-247-08 (02 Mb from telomere)

313 2q CAPN10 01742-L01308 02-24118 (16 Mb from telomere)

322 3q BDH1 02013-L02052 03-19876 (07 Mb from telomere)

330 sect 4q TRIML2 12050-L11446 04-18926 (20 Mb from telomere)

337 5q GNB2L1 03319-L02737 05-18060 (02 Mb from telomere)

346 6q PSMB1 01746-L01304 06-17069 (05 Mb from telomere)

355 6q VIPR2 01747-L01303 07-15860 (03 Mb from telomere)

361 7q ZC3H3 (KIAA0150) 01748-L01302 08-14469 (16 Mb from telomere)

372 9q EHMT1 08205-L08170 09-13983 (02 Mb from telomere)

379 10q PAOX (PAO) 09142-L09953 10-13505 (02 Mb from telomere)

386 11q NCAPD3 (KIAA0056) 01751-L01299 11-33360 (12 Mb from telomere)

395 12q ZNF10 02687-L02154 12-13224 (02 Mb from telomere)

402 13q F7 01753-L01297 13-11282 (13 Mb from telomere)

411 plusmn 14q MTA1 02778-L02201 14-10500 (13 Mb from telomere)

418 plusmn 15q ALDH1A3 01755-L01295 15-09926 (10 Mb from telomere)

426 16q GAS8 (GAS11) 03201-L02669 16-08863 (02 Mb from telomere)

434 17q TBCD 01757-L01293 17-07845 (05 Mb from telomere)

441 18q RBFA (C18orf22) 01758-L01292 18-07590 (02 Mb from telomere)

450 plusmn 19q CHMP2A (BC-2) 09143-L10626 19-06375 (09 Mb from telomere)

458 plusmn 20q OPRL1 02688-L02884 20-06219 (02 Mb from telomere)

466 21q PRMT2 (HMT1) 02586-L02059 21-04689 (01 Mb from telomere)

475 22q RABL2B 01762-L08761 22-04955 (01 Mb from telomere)

483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150

XY-15478 (PAR2 01 Mb from

telomere)

46

43 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

A anaacutelise pela teacutecnica de MLPA foi realizada no Laboratoacuterio de Geneacutetica

Molecular do Hospital de Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo

Paulo ndash Bauru que conta com a infraestrutura e os equipamentos necessaacuterios conforme

protocolo original descrito por Schouten et al (2002)

I) Desnaturaccedilatildeo do DNA e hibridaccedilatildeo das sondas As amostras de DNA foram

diluiacutedas (para ser obtida uma concentraccedilatildeo de 50 a 200 ng de DNA) em 5 mL de TE (tris-HCl

+ EDTA) Os DNAs diluiacutedos foram submetidos a uma temperatura de 95degC por cinco

minutos e em seguida a 25degC antes de serem retirados do termociclador Apoacutes a

desnaturaccedilatildeo foram acrescentados 15 microL do SALSA Probemix e 15 microL do MLPA buffer em

cada tubo O mix foi incubado a 95degC por um minuto e em seguida permaneceu a 60degC por 16

horas

II) Reaccedilatildeo de ligaccedilatildeo No termociclador a uma temperatura de 54degC foram

adicionados 32 microL de mix ligase-65 agraves amostras que foram incubadas a 54degC por 15 minutos

e em seguida a 98degC por cinco minutos

III) Reaccedilatildeo em Cadeia da Polimerase (PCR) Em um novo tubo foram

adicionados 4 microL de SALSA PCR buffer 26 microL de aacutegua esteacuteril e 10 microL do produto da reaccedilatildeo

de ligaccedilatildeo A uma temperatura de 60degC foi adicionada a enzima (Polymerase mix) e

imediatamente iniciou-se a reaccedilatildeo de PCR nas seguintes condiccedilotildees 35 ciclos da sequecircncia -

30 segundos a 95degC 30 segundos a 60degC 60 segundos a 72degC E ao final dos ciclos 20

minutos a 72degC

IV) Separaccedilatildeo dos produtos amplificados Em uma placa de sequenciamento

foram adicionados de 06 a 10 microL do produto da PCR 025 mL de ET-550R (sizer) e 7 microL de

Tween-20 01 A leitura dos produtos amplificados foi feita em sequenciador automaacutetico

ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)

47

V) Visualizaccedilatildeo e anaacutelise dos resultados A visualizaccedilatildeo e anaacutelise dos resultados

foi realizada com o software SoftGenetics GeneMarker

V220 (SoftGenetics LLC) com base

em planilhas fornecidas on line no site lt httpwwwsoftgeneticscom gt Este software

permite a visualizaccedilatildeo normalizaccedilatildeo e comparaccedilatildeo de perfis de eletroforese baseados em um

tamanho padratildeo e potecircncia do sinal emitido (BENDAVID et al 2007)

Diversos estudos jaacute demonstraram a capacidade de detecccedilatildeo da metodologia de

MLPA (SCHOUTEN et al 2002 KOOLEN et al 2004 ROOMS et al 2004) Aleacutem disso

satildeo escassos na literatura atual dados que correlacionem alteraccedilotildees em regiotildees

subtelomeacutericas e o aparecimento de HPE justificando-se assim a escolha desta metodologia

para a execuccedilatildeo deste trabalho

A teacutecnica de MLPA caracteriza-se por ser uma anaacutelise comparativa Assim as

amostras em estudo foram analisadas concomitantemente entre si Utilizou-se tambeacutem um

controle negativo (reaccedilatildeo sem amostra de DNA) para garantir a ausecircncia de contaminaccedilatildeo

assegurando-se assim a qualidade da teacutecnica Alteraccedilotildees esperadas como resultados de

anaacutelises de MLPA satildeo de dois tipos duplicaccedilotildees quando os picos referentes agrave sonda

apresentam um valor entre uma vez ndash para alteraccedilotildees heterozigotas ndash ou duas vezes o seu

tamanho para alteraccedilotildees homozigotas deleccedilotildees quando os picos apresentam a metade do

valor do pico de referecircncia ndash para alteraccedilotildees heterozigotas ndash ou natildeo apresentam sinal no caso

de alteraccedilotildees homozigotas

As planilhas on line consistem em graacuteficos com picos correspondentes a cada uma

das sondas que constituem o kit SALSA MLPA probemix P036-E1 Human-telomere-3 (MRC

Holland

) e com duas curvas uma curva controle e a curva de interesse correspondente ao

paciente a ser estudado Os resultados obtidos com esse tipo de anaacutelise permitem verificar se

o paciente eacute portador ou natildeo de alguma alteraccedilatildeo nas regiotildees contempladas pelas sondas do

kit a ser utilizado Se alteraccedilotildees forem detectadas uma maior precisatildeo no direcionamento em

48

anaacutelises subsequentes pode ser alcanccedilada a fim de se determinar a alteraccedilatildeo em si e suas

possiacuteveis consequecircncias

49

5 RESULTADOS E DISCUSSAtildeO

A HPE uma anomalia estrutural que acontece durante o desenvolvimento do

ceacuterebro anterior e da linha meacutedia da face eacute a malformaccedilatildeo mais comum que acomete seres

humanos Com etiologia complexa e heterogecircnea acredita-se que a presenccedila de muacuteltiplos

fatores incidindo sobre o aparecimento da doenccedila seja a responsaacutevel pelo amplo espectro

fenotiacutepico observado que varia desde olho ciclope e proboacutescide ateacute a presenccedila de apenas um

incisivo central com ou sem acometimento do SNC (MING amp MUENKE 1998 RICHIERI-

COSTA amp RIBEIRO 2006 ab BENDAVID et al 2010 SOLOMON et al 2010)

As primeiras alteraccedilotildees citogeneacuteticas encontradas em HPE foram a trissomia do

13 (Siacutendrome de Patau) trissomia 18 (Siacutendrome de Edwards) aleacutem de triploidias

(NORMAN 1995 ROESSLER amp MUENKE 1998 SWATEK et al 2013) A partir de

entatildeo muitos loci e genes candidatos vecircm sendo estudados Ateacute o momento satildeo quatro os

principais genes associados agrave doenccedila SHH ZIC2 SIX3 e TGIF os quais satildeo responsaacuteveis por

aproximadamente 25 dos casos (BELLONI et al 1996 BROWN et al 1998 WALLIS et

al 1999 GRIPP et al 2000 BROWN et al 2001 BENDAVID et al 2010) Assim

aproximadamente 75 dos casos de HPE continuam sem um diagnoacutestico geneacutetico definido

Dessa forma a busca por meacutetodos alternativos de anaacutelises de regiotildees cromossocircmicas pode ser

fundamental para a determinaccedilatildeo de sua etiologia ou ateacute mesmo parte dela Portanto uma

opccedilatildeo alternativa foi a anaacutelise de regiotildees subtelomeacutericas pela teacutecnica de MLPA proposta por

este trabalho

50

51 Caracteriacutesticas da amostra estudada

Fizeram parte deste estudo 25 indiviacuteduos com idades entre dois e 43 anos sendo

que a idade meacutedia entre estes foi de 159 anos plusmn 1116 A razatildeo sexual foi de 17 indiviacuteduos do

gecircnero feminino (68) e oito do gecircnero masculino

Dentre os 25 indiviacuteduos estudados o tipo de HPE diagnosticado natildeo foi um fator

de inclusatildeo ou exclusatildeo e sendo assim a amostra se apresentou heterogecircnea 21 indiviacuteduos

(84) eram portadores da microforma da doenccedila tambeacutem chamada de HPE-like apenas dois

indiviacuteduos (8) apresentaram a forma lobar da doenccedila e outros dois indiviacuteduos (8)

apresentaram a forma semilobar como pode ser observado no Graacutefico 1

Graacutefico 1 Grupo amostral e suas formas cliacutenicas de HPE

Algumas caracteriacutesticas foram observadas em todos os indiviacuteduos como

microcefalia hipotelorismo ocular e fissura de laacutebiopalato Todos os pacientes que

apresentaram a forma lobar e semilobar da doenccedila apresentaram algum comprometimento do

SNC contabilizando 16 da amostra total

0

5

10

15

20

25

Lobar Semilobar HPE-like

21

22

51

A caracteriacutestica de nariz achatado foi observada em 21 pacientes (84 da

amostra) sendo que 17 pacientes (68) eram portadores da microforma dois portadores da

forma lobar (8) e outros dois da forma semilobar (8)

A presenccedila de um incisivo central maxilar uacutenico foi observada em 6 indiviacuteduos

(24 da amostra) os quais apresentavam a microforma de HPE

Ponte nasal baixa foi observada em 16 pacientes caracterizando 64 da amostra

Destes 12 pacientes (48) apresentavam a microforma da doenccedila dois (8) exibiam a forma

semilobar e outros dois (8) a forma lobar

Quanto agraves fissuras de laacutebio e palato os grupos apresentaram grande

heterogeneidade nos tipos analisados Neste trabalho os tipos de fissura somente seratildeo

citados

Nos pacientes com a microforma da doenccedila cinco apresentaram fissuras do tipo

transforame incisivo unilateral esquerda totalizando 20 do total da amostra enquanto

outros cinco (20) apresentaram fissura transforame incisivo unilateral direita Cinco (20)

pacientes foram diagnosticados com fissura transforame incisivo bilateral Apenas um

indiviacuteduo (4) apresentou fissura transforame incisivo mediana outro indiviacuteduo (4)

apresentou fissura preacute-forame incisivo unilateral esquerda completa Trecircs pacientes

apresentaram fissura poacutes-forame incisivo incompleta (12) e apenas um caso (4) de fissura

transforame incisivo bilateral incompleta foi observado

Pacientes com a forma lobar de HPE apresentaram fissuras transforame incisivo

(4) sendo uma unilateral esquerda e outra da forma mediana (4)

Indiviacuteduos acometidos com a forma semilobar da doenccedila apresentaram um

fissura preacute-forame incisivo mediana completa (4) e outro fissura transforame incisivo

bilateral (4)

52

A Tabela 3 traz a caracterizaccedilatildeo dos 25 pacientes contidos no grupo amostral

relacionando seus achados cliacutenicos com o tipo especiacutefico de HPE diagnosticado pela divisatildeo

de Sindromologia do HRAC-USP

53

Tabela 3 Caracterizaccedilatildeo da casuiacutestica estudada

Paciente Sexo Idade

(anos)

Classificaccedilatildeo

da HPE Hipotelorismo Microcefalia

Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -

3 F 23 MF + + - + FTFI Bilateral - - +

4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

5 F 24 MF + + + + FPoacutesFI

Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -

7 M 13 MF + + - + FTFI Bilateral

Incompleta - + -

8 F 9 MF + + + + FTFI Bilateral - - +


10 F 13 MF + + + + FTFI Bilateral - + -

11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -

20 F 2 SL + + + + FTI Bilateral + - +

21 M 2 MF + + + + FTFI Bilateral - - -

22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +

FPreacuteFI Unilateral

Esquerda

Completa

- - +

F (feminino) M (masculino) + = presenccedila de sinal cliacutenico - = ausecircncia de sinal cliacutenico

L HPE Lobar SL HPE Semilobar MF HPE-like (Microforma de HPE)

FTFI Fissura Transforame Incisivo FPreacuteFI Fissura Preacute-forame Incisivo FPoacutesFI Fissura Poacutes-forame

55

De forma ilustrativa o Graacutefico 2 traz os dados contidos na Tabela 3 referentes agrave

casuiacutestica deste trabalho

Graacutefico 2 Caracteriacutesticas fenotiacutepicas da amostra estudada

Como pode ser observado relacionando as caracteriacutesticas faciais de cada um dos

pacientes com a forma de HPE presente eacute possiacutevel corroborar dados descritos anteriormente

na literatura Em 1964 DeMeyer propocircs que ldquoA face prevecirc o ceacuterebrordquo Este relata que apoacutes

revisar 75 casos de HPE na literatura e analisar clinicamente 14 pacientes natildeo foi encontrada

nenhuma exceccedilatildeo para a regra de que os padrotildees de anomalias faciais predizem o ceacuterebro

holoprosencefaacutelico

Achados cliacutenicos de nossa amostra confirmam o proposto Neste estudo

observou-se que os quatro indiviacuteduos da amostra diagnosticados com formas mais graves de

22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar

Microforma (HPE-like)

56

HPE lobar e semilobar apresentaram aleacutem de muitas caracteriacutesticas faciais o

comprometimento do SNC evidenciando sua maior gravidade Na amostra estudada em

indiviacuteduos com a microforma natildeo foi observado comprometimento do SNC Em

contrapartida apresentaram um incisivo central maxilar uacutenico (285 da amostra com a

microforma da doenccedila) caracteriacutestica frequentemente indicativa ou associada a uma

manifestaccedilatildeo menor da HPE

A microforma de HPE tem sido descrita como uma forma leve da doenccedila em que

as principais caracteriacutesticas fenotiacutepicas estatildeo relacionadas com hipoplasia ou aplasia da

espinha nasal anterior diminuiccedilatildeo ou ausecircncia do acircngulo frontonasal hipotelorismo

hipoplasia da preacute-maxila e do nariz asa e ponta nasais achatadas filtro pouco desenvolvido

incisivo central maxilar uacutenico e fissura de laacutebiopalato geralmente natildeo relacionadas a

comprometimentos do SNC O fenoacutetipo de microforma da doenccedila geralmente determina um

bom prognoacutestico para os pacientes (RICHIERI-COSTA amp RIBEIRO 2010)

Cohen (2001) defendeu que a presenccedila de um uacutenico incisivo central como

caracteriacutestica fenotiacutepica no indiviacuteduo natildeo deve ser diminuiacuteda ou desconsiderada jaacute que em

famiacutelias onde existe um indiviacuteduo gravemente afetado muitas vezes um dos pais ou ateacute

mesmo outros parentes proacuteximos podem apresentar como uacutenica manifestaccedilatildeo a presenccedila de

um uacutenico incisivo central evidenciando desenvolvimento mental normal e sobretudo um

potencial normal de sobrevida Assim sendo a investigaccedilatildeo e detecccedilatildeo de anomalias em

carioacutetipos ou mesmo a niacutevel molecular nestes indiviacuteduos reforccedila a necessidade do

aconselhamento geneacutetico pois se deve considerar a chance de descendentes serem acometidos

por formas mais graves da doenccedila

57

52 Anaacutelise das regiotildees subtelomeacutericas pela teacutecnica de MLPA

Neste trabalho apoacutes a anaacutelise pela teacutecnica de MLPA das 25 amostras de DNA de

indiviacuteduos com diagnoacutestico cliacutenico de HPE observou-se que nenhuma destas apresentou

alteraccedilotildees geneacuteticas nas regiotildees subtelomeacutericas de interesse contempladas pelo kit SALSA

MLPA P036 Human-telomere-3 A Figura 7 mostra histogramas de quatro indiviacuteduos

escolhidos aleatoriamente como exemplo da interpretaccedilatildeo dos dados gerados pelo software

GeneMarkerreg Nestes histogramas quando algum gene encontra-se alterado os pontos verdes

ultrapassam a aacuterea delimitada para cima se forem encontradas duplicaccedilotildees e para baixo se

forem observadas deleccedilotildees Salienta-se que nos casos apresentados natildeo foram encontradas

alteraccedilotildees nos picos entre pacientes e o padratildeo de referecircncia

Figura 7 Perfil normal de anaacutelise das sondas escolhidas ao acaso em quatro pacientes no

painel de anaacutelise de fragmentos do software GeneMarker Os pontos verdes dentro das linhas

demarcadas correspondem agraves sondas com padratildeo normal ou seja sem alteraccedilotildees geneacuteticas nas regiotildees

subtelomeacutericas analisadas

As regiotildees subtelomeacutericas satildeo reconhecidamente importantes uma vez que atuam

na garantia da replicaccedilatildeo completa do genoma na estabilidade dos cromossomos e no

58

envelhecimento e longevidade celular (KNIGHT amp FLINT 2000) Entretanto satildeo regiotildees de

alta instabilidade genocircmica onde ocorrem com frequecircncia interaccedilotildees intercromossocircmicas

(DrsquoANGELO 2009)

Ledbetter em 1992 foi pioneiro ao especular uma relaccedilatildeo entre rearranjos

subtelomeacutericos submicroscoacutepicos e malformaccedilotildees congecircnitas muacuteltiplas aleacutem da deficiecircncia

intelectual A arquitetura genocircmica complexa nas regiotildees subtelomeacutericas associada ao alto

iacutendice de recombinaccedilatildeo meioacutetica destes loci e agrave grande concentraccedilatildeo gecircnica nas bandas

cromossocircmicas mais distais poderiam levar a rearranjos patogecircnicos (LEDBETTER 1992

DrsquoANGELO 2009)

Em 1995 Flint et al demonstraram a contribuiccedilatildeo destes rearranjos

subtelomeacutericos criacuteticos na etiologia da deficiecircncia intelectual de forma que aproximadamente

25 dos casos foram relacionados como sendo decorrentes destes

Depois desta constataccedilatildeo inuacutemeros trabalhos descritos na literatura vecircm

demonstrando forte associaccedilatildeo entre alteraccedilotildees no desenvolvimento do SNC e rearranjos em

regiotildees subtelomeacutericas Abaixo seratildeo discutidos alguns destes estudos que incluem

deficiecircncia intelectual e ADNPM

Koolen et al (2004) analisaram 210 pacientes com diagnoacutestico de deficiecircncia

intelectual idiopaacutetica empregando o SALSA P036 Human Telomere Kit mesmo kit utilizado

no presente estudo Este foi delineado para realizaccedilatildeo de um screening de regiotildees

subtelomeacutericas na busca por alteraccedilotildees cromossocircmicas que poderiam estar relacionadas com

o aparecimento da deficiecircncia intelectual nos pacientes estudados Dos 210 pacientes

analisados 14 pacientes (67) apresentaram anormalidades subtelomeacutericas 10 deleccedilotildees e

quatro duplicaccedilotildees Aberraccedilotildees submicroscoacutepicas clinicamente relevantes foram identificadas

em nove pacientes (43) sete alteraccedilotildees de novo (cinco deleccedilotildees e duas duplicaccedilotildees) e duas

duplicaccedilotildees herdadas de pais fenotipicamente afetados como seus filhos Nos grupos de

59

pacientes com deficiecircncia intelectual leve moderada e grave anomalias relevantes

aconteceram em 63 51 e 17 dos casos respectivamente Curiosamente um indiviacuteduo

com deleccedilatildeo em 12qter aleacutem da deficiecircncia intelectual idiopaacutetica foi diagnosticado tambeacutem

com HPE semilobar atraveacutes de ressonacircncia magneacutetica com fusatildeo dos loacutebulos frontais e

agenesia do corpo caloso Os autores confirmam a confiabilidade do meacutetodo de MLPA para a

detecccedilatildeo de rearranjos subtelomeacutericos No caso de deficiecircncia intelectual estes defendem que

a triagem atraveacutes desta metodologia deve ser oferecida a todos os pacientes apesar de uma

preacute-seleccedilatildeo cliacutenica aumentar a porcentagem das anomalias detectadas Para a correta exclusatildeo

de polimorfismos os autores orientam que a interpretaccedilatildeo dos resultados deve sempre incluir

testes nos pais dos indiviacuteduos estudados aleacutem da comparaccedilatildeo de caracteriacutesticas cliacutenicas

destes pacientes com as de pacientes previamente relatados contendo rearranjos

subtelomeacutericos Aleacutem disso defendem que o meacutetodo de MLPA detecta duplicaccedilotildees

subtelomeacutericas puras que podem facilmente deixar de serem detectadas pelas anaacutelises de

rotina como FISH (KOOLEN et al 2004)

Bendavid et al propuseram em 2007 um estudo de regiotildees subtelomeacutericas

atraveacutes da utilizaccedilatildeo da teacutecnica de MLPA visando a identificaccedilatildeo ou mesmo o refinamento de

loci cromossocircmicos que poderiam conter novos genes candidatos para HPE Com a

publicaccedilatildeo de Koolen et al em 2004 descrita acima ficou claro que as regiotildees

subtelomeacutericas demonstravam ser de grande importacircncia para desordens no desenvolvimento

como a deficiecircncia intelectual Consequentemente Bendavid et al supuseram que um

screening subtelomeacuterico em amostras de pacientes com diagnoacutestico de HPE com carioacutetipos

normais poderia identificar microrrearranjos nos oito loci descritos previamente (HPE1 ndash

21q223 HPE6 ndash 3p24-pter HPE7 ndash 13q12-q14 HPE8 ndash 14q13 HPE9 ndash 20p13 HPE10 ndash

1q42-qter HPE11 ndash 5pter e HPE12 ndash 6q26-qter) ou mesmo em outras regiotildees

subtelomeacutericas De fato dos 181 pacientes analisados pelo grupo de pesquisa oito

60

apresentaram anormalidades subtelomeacutericas caracterizando 44 da amostra analisada A

amostra envolveu fetos e nascidos vivos com diagnoacutesticos de HPE nas formas claacutessica e

microforma sem alteraccedilotildees de carioacutetipo Interessantemente neste trabalho novos loci

subtelomeacutericos foram encontrados (1p 5q 8p 17q 18q 22q e Xq) ressaltando a importacircncia

de sua anaacutelise (BENDAVID et al 2007)

Recentemente pesquisadores indianos publicaram um estudo em que foi analisada

a utilidade cliacutenica da teacutecnica de MLPA na identificaccedilatildeo da etiologia da deficiecircncia intelectual

idiopaacutetica No estudo Boggula et al (2014) utilizaram diferentes kits de MLPA na busca por

explicaccedilotildees etioloacutegicas P070 e P036 para anaacutelise de regiotildees subtelomeacutericas P245-A2 para

microdeleccedilotildees e microduplicaccedilotildees comuns e P106 para cromossomos X Dentre os 203

indiviacuteduos analisados 19 (935) apresentaram alteraccedilotildees subtelomeacutericas incluindo deleccedilotildees

de 1p3633 4p 5p 9p regiotildees telomeacutericas 13q e duplicaccedilotildees em 9pter Estes defendem que

os kits utilizados apresentam bom rendimento e diagnoacutestico e apesar da MLPA natildeo poder

analisar todo o genoma ndash como teacutecnicas de microarranjos ndash devido sua facilidade de

execuccedilatildeo e sendo menos onerosa eacute uma importante ferramenta para avaliaccedilatildeo de casos de

deficiecircncia intelectual (BOGGULA et al 2014)

Com relaccedilatildeo aos resultados encontrados no presente trabalho um importante

aspecto a ser evidenciado eacute o fato de o grupo amostral ser pequeno demonstrando ser um

fator limitante para o estudo atraveacutes de teste binomial (p=028) Dessa forma

presumivelmente esperou-se que fosse encontrada pouca ou nenhuma alteraccedilatildeo

subtelomeacuterica No estudo de Bendavid et al (2007) supracitado foi necessaacuteria uma amostra

composta por 181 indiviacuteduos para que fossem encontradas 8 alteraccedilotildees subtelomeacutericas

possivelmente relacionadas ao fenoacutetipo descrito

Os resultados apresentados neste trabalho natildeo revelaram alteraccedilotildees geneacuteticas nas

regiotildees subtelomeacutericas de interesse como deleccedilotildees eou duplicaccedilotildees muito provavelmente

61

devido ao pequeno universo amostral (25 indiviacuteduos) Ressalta-se que os mesmos jaacute foram

analisados por meio de outras metodologias como sequenciamento por Sanger e MLPA de

regiotildees natildeo subtelomeacutericas (kit P187) reforccedilando ainda mais que a origem da HPE eacute

determinada por muacuteltiplos fatores

O fato dos pacientes da amostra apresentarem fenoacutetipo correspondente agrave HPE

mas sem alteraccedilotildees nos genes jaacute descritos sugere a existecircncia de fatores etioloacutegicos

adicionais como geneacuteticos ou ambientais no surgimento desta patologia O presente estudo

foi realizado com pacientes brasileiros oriundos das mais diversas regiotildees do paiacutes jaacute que o

HRAC-USP eacute um centro de referecircncia nacional no tratamento de anomalias craniofaciais

Portanto em nossa amostra haacute uma grande heterogeneidade eacutetnica implicada Assim

alteraccedilotildees gecircnicas podem estar contidas em outras regiotildees cromossocircmicas importantes que

possam contribuir para o aparecimento da doenccedila mas ainda desconhecidas para a patogecircnese

da HPE De fato Ribeiro et al (2012) encontraram alteraccedilotildees polimoacuterficas como expansatildeo

de histidina em uma coorte brasileira de HPE demonstrando consideraacutevel diferenccedila na

frequecircncia aleacutelica entre diferentes grupos eacutetnicos provavelmente resultado da miscigenaccedilatildeo

No que tange a exposiccedilatildeo a fatores ambientais eacute sabido que diversas situaccedilotildees

maternas como diabetes gestacional alcoolismo e exposiccedilatildeo a patoacutegenos satildeo causas do

aparecimento de HPE (SWATEK 2013) Aleacutem disso haacutebitos e estilos de vida maternos

tambeacutem devem ser levados em consideraccedilatildeo jaacute que estes tambeacutem podem resultar em

alteraccedilotildees cromossocircmicas no feto culminando no aparecimento da doenccedila Dentre estes tem

sido demonstrado que o uso materno de anticonvulsivantes presenccedila de diabetes mellitus

insulino-dependente a realizaccedilatildeo de dietas restritivas com aporte caloacuterico reduzido visando

perda de peso aleacutem de situaccedilotildees de pobreza e consumo excessivo de aacutelcool durante a

gestaccedilatildeo satildeo fatores predisponentes ao surgimento do fenoacutetipo de HPE (CROEN et al 1996

COHEN 2006)

62

Devido ao fato da literatura conter poucos relatos acerca do uso da teacutecnica de

MLPA em HPE e sobretudo de alteraccedilotildees subtelomeacutericas relacionadas ao aparecimento da

doenccedila o presente trabalho contribui no sentido de demonstrar que microarranjo

subtelomeacuterico natildeo eacute um fator comum na etiologia da HPE Evidentemente haacute de ser

considerado o pequeno tamanho da amostra que demonstrou ser um fator limitante De

qualquer forma era esperada pelo menos uma alteraccedilatildeo subtelomeacuterica se levarmos em

consideraccedilatildeo uma meacutedia de 5 de alteraccedilotildees encontradas nos trabalhos analisados Outro

fator a ser observado eacute o fenoacutetipo preponderante da amostra constituiacutedo pela microforma da

HPE em 84 dos casos Apesar da dificuldade em se estabelecer correlaccedilatildeo entre genoacutetipo e

fenoacutetipo na HPE eacute possiacutevel que os microarranjos subtelomeacutericos estejam mais associados aos

fenoacutetipos claacutessicos da HPE do que agraves microformas

Finalmente na medida em que forem descobertas outras alteraccedilotildees no genoma

juntamente com fatores ambientais que possam tambeacutem estar associados ao fenoacutetipo da

doenccedila conforme sugerido pela hipoacutetese dos muacuteltiplos fatores seja possiacutevel a realizaccedilatildeo de

um diagnoacutestico diferencial que possa explicar o amplo espectro fenotiacutepico observado nesta

doenccedila aleacutem de oferecer aconselhamento geneacutetico adequado para os pacientes e familiares

63

6 CONCLUSOtildeES

Os resultados obtidos no presente estudo permitem concluir que

- O nuacutemero relativamente pequeno de pacientes analisados neste trabalho pode ter

impedido a observaccedilatildeo de alteraccedilotildees subtelomeacutericas em pacientes com diagnoacutestico de HPE

- Novos estudos com um maior nuacutemero de pacientes satildeo necessaacuterios para que as

conclusotildees sejam definitivas quanto agrave relaccedilatildeo entre regiotildees subtelomeacutericas e HPE

- Natildeo haacute ateacute o momento um criteacuterio uacutenico e adequado para a investigaccedilatildeo de

rotina da etiologia de HPE jaacute que esta envolve muacuteltiplos fatores geneacuteticos e ambientais

muitos destes ainda desconhecidos

- A teacutecnica de MLPA eacute um meacutetodo raacutepido sensiacutevel e relativamente de baixo custo

para nossa realidade Esta demonstrou confiabilidade oferecendo uma excelente alternativa

para a investigaccedilatildeo de microarranjos como deleccedilotildees e duplicaccedilotildees pois permitiu a anaacutelise

concomitante de muacuteltiplas regiotildees

- Devido ao fato de que nenhum microarranjo foi detectado nas regiotildees analisadas

natildeo eacute possiacutevel inferir a presenccedila de novos loci ou genes que pudessem ser associados agrave HPE

Perspectivas futuras para a elucidaccedilatildeo dos fatores etioloacutegicos envolvidos na

patogecircnese de HPE incluem a seleccedilatildeo de um conjunto de genes candidatos baseada em vias e

redes de sinalizaccedilatildeo em que poderaacute ser criado o ldquoholoprosencefalomardquo ou ldquoHPEomerdquo de

forma que atraveacutes do uso um chip contendo aproximadamente 800 genes seja realizada uma

nova estrateacutegia de mapeamento genocircmico o Next Generation Sequencing ou sequenciamento

de segunda geraccedilatildeo de forma a serem identificados novos genes associados agrave doenccedila

64

7 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS

AacuteVILA MS Rearranjos subtelomeacutericos em doentes com atraso mental idiopaacutetico Mestrado

Faculdade de Ciecircncias da Universidade de Lisboa ndash DQB 2009

BANO S CHAUDHARY V YADAV S Congenital malformations of the brain

Neuroimaging Clinical Applications 2012 Disponiacutevel em

lthttpcdnintechopencompdfs31404InTech-Congenital_malformation_of_the_brainpdfgt

BELLONI E MUENKE M ROESSLER E et al Identification of Sonic hedgehog as a

candidate gene responsible for holoprosencephaly Nature Genetics

1996(14)353-56

BENDAVID C DUBOURG C GICQUEL I et al Molecular evaluation of foetuses with

holoprosencephaly shows high incidence of microdeletions in the HPE genes

Human Genetics 2006a 119(1-2)1ndash8

BENDAVID C DUBOURG C PASQUIER L et al MLPA screening reveals novel

subtelomeric rearrangements in holoprosencephaly Human Mutation 200728

(12)1189ndash1197

BENDAVID C DUPEacute V ROCHARD L GICQUAL I DUBOURG C DAVID V

Holoprosencephaly an update on cytogenetic abnormalities Am J Med Genet C

Semin Med Genet 2010154C(1)86-92

BENDAVID C HADDAD BR GRIFFIN A et al Multicolour FISH and quantitative PCR

can detect submicroscopic deletions in holoprosencephaly patients with a normal

karyotype Journal of Medical Genetics 2006b43(6)496ndash500

65

BENDAVID C ROCHARD L DUBOURG C SEGUIN J GICQUAL I PASQUIER L et al

Array-CGH analysis indicates a high prevalence of genomic rearrangements in

holoprosencephaly an update map of candidate loci Human Mutation

200930(8)1175-1182

BLASCO MA GASSER SM LINGNER J Telomeres and telomerase Genes amp

Development 1999 132353ndash2359

BOGGULA VR SHUKLA A DANDA S et al Clinical utility of multiplex ligation-

dependent probe amplification technique in identification of aetiology of

unexplained mental retardation a study in 203 Indian patients Indian J Med Res

2014139(1)66-75

BROWN J SARACOGLU K UHRIG S SPEICHER MR EILS R KEARNEY L

Subtelomeric chromosome rearrangements are detected using an innovative 12-

color FISH assay (M-TEL) Nature Medicine 20017(4)497ndash501

BROWN SA WARBURTON D BROWN LY et al Holoprosencephaly due to mutations in

ZIC2 a homologue of Drosophila odd-paired Nature Genetics 199820(2)180-

183

CARPENTER D STONE DM BRUSH J RYAN A ARMANINI M FRANTZ G

ROSENTHAL A DE SAUVAGE FJ Characterization of two patched receptors for

the vertebrate hedgehog protein family Proc Natl Acad Sci USA 199895(23)

13630-4

CHAI Y JIANG X BRINGAS P et al Fate of the mammalian cranial neural crest during

tooth and mandibular morphogenesis Development 2000127(8)1671-9

66

CHIANG C LITINGTUNG Y LEE E et al Cyclopia and defective axial patterning in mice

lacking sonic hedgehog gene function Nature 1996383407-413

COHEN MMJR Holoprosencephaly clinical anatomic and molecular dimensions Birth

Defects Research (Part A) 200676658-673

COHEN MMJR Perspectives on holoprosencephaly Part I Epidemiology genetics and

syndromology Teratology 198940211-235

COHEN MMJR Problems in the Definition of Holoprosencephaly Am J of Medical

Genetics 2001103183-187

COHEN MMJR The Child with Multiple Birth Defects 2nd

Edition Oxford Monographs

on Medical Genetics New York ndash Oxford Oxford University Press 199731

COHEN MMJR The hedgehog signaling network Am J Med Genet A 123A5-28 Review

Erratum in Am J Med Genet 2003124A 439-40

CORDERO DR BRUGMANN S CHU Y BAJPAI R JAME M HELMS JA Cranial neural

crest cells on the move their roles in craniofacial development Am J Med Genet

A 2011155A(2)270-9

CROEN LA SHAW GM LAMMER EJ Holoprosencephaly epidemiologic and clinical

characteristics of a California population American Journal of Medical Genetics

199664465-472

DAKUBO GD WANG YP MAZEROLLE C CAMPSALL K MCMAHON AP

WALLACE VA Retinal ganglion cell-derived sonic hedgehog signaling is required

for optic disc and stalk neuroepithelial cell development Development

20031302967-80

67

DrsquoANGELO CS Pesquisa dos mecanismos de rearranjos cromossocircmicos subtelomeacutericos na

monossomia 1p36 expansatildeo do espectro da variabilidade fenotiacutepica e

comportamental diagnoacutesticos diferenciais e caracterizaccedilatildeo de uma regiatildeo criacutetica

para a obesidade Tese de doutorado ndash Instituto de Biociecircncias da Universidade de

Satildeo Paulo ndash Departamento de Geneacutetica e Biologia Evolutiva

DEMEYER W ZEMAN W PALMER CG The face predicts the brain Diagnostic

significance of median facial anomalies for holoprosencephaly (arhinencephaly)

Pediatrics 196434256-263

DUBOURG C Holoprosencephaly Orphanet Journal of Rare Diseases 200728

FEUERBACH F GALY V TRELLES-STICKEN E et al Nuclear architecture and spatial

positioning help establish transcriptional states of telomeres in yeast Nature Cell

Biology 20024214ndash221

FLINT J KNIGHT S The use of telomere probes to investigate submicroscopic

rearrangements associated with mental retardation Current Opinion in Genetics

amp Development 200313310-316

GeneMANIAorg Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research University of

Toronto 2014 Disponiacutevel em lt httpgenemaniaorg gt

GOODRICH LV MILENKOVIC L HIGGINS KM SCOTT MP Altered neural cell fates

and medulloblastoma in mouse patched mutants Science 1997277(5329)1109-

13

GOODRICH LV SCOTT MP Hedgehog and patched in neural development and disease

Neuron 199821(6) 1243-57

68

GRINDLEY JC BELLSCI S PERKINS D et al Evidence for the involvement of the Gli

gene family in embryonic mouse lung development Dev Biol 1997188(2)337-48

GRIPP KW WOTTON D EDWARDS MC et al Mutations in TGIF cause

holoprosencephaly and link NODAL signalling to human neural axis

determination Nature Genetics 200025205-208

HEDLUNG G Congenital frontonasal masses developmental anatomy malformations and

MR imaging Pediatr Radiol 200636(7)647-662

HENNEKAM RC BIESECKER LG ALLANSON JE HALL JG OPITZ JM TEMPLE IK

CAREY JC Elements of Morphology General terms for congenital anomalies Am

J Med Genet Part A 2013161(A)2726-2733

HENNEKAM RCM CORMIER-DAIRE V HALL JG MEacuteHES K PATTON M

STEVENSON RE Elements of morphology Standard terminology for the nose

and philtrum Am J Med Genet A 2009149A(1)61-76

HOGERVORST FB NEDERLOF PM GILLE JJ et al Large genomic deletions and

duplications in the BRCA1 gene identified by a novel quantitative method Cancer

Research 200363(7)1449ndash53

JAVAD H AL-YARUBI S CHACHO AP et al Semilobar holoprosencephaly with

neurogenic hypernatraemia two new cases SQU Medical Journal

201313(3)463-66

JOHNSON CY RASMUSSEN SA Non-genetic risk factors for holoprosencephaly

American Journal of Medical Genetics Part C 201015473ndash85

69

JOHNSON RL SCOTT MP Hedgehog signaling New players and perplexities join the

pathway Curr Opin Genet Devel 19988450-456

KALDERON D Transducing the hedgehog signal Cell 2000103(3)371-4

KAMNASARAM D CHEN CP DEVRIENDT K MEHTA L COX DW Defining a

holoprosencephaly locus on human chromosome 14q13 and characterization of

potential candidate genes Genomics 200585608-621

KNIGHT SJL FLINT J Perfect endings a review of subtelomeric probes and their use in

clinical diagnosis Journal of Medical Genetics 200037401ndash409

KONIALIS C SAVOLA S KARAPANOU S MARKAKI A KARABELA M

POLYCHRONUPOULOU S et al Routine application of a novel MLPA-based

first-line screening test uncovers clinically relevant copy number aberrations in

haematological malignancies undetectable by conventional cytogenetics

Hematology 201419(4)217-24

KOOLEN DA NILLESEN WM VERSTEEG MHA et al Screening for subtelomeric

rearrangements in 210 patients with unexplained mental retardation using multiplex

ligation dependent probe amplification (MLPA) Journal of Medical Genetics

200441892ndash899

LAI K ROBERTSON MJ SCHAFFER DV The sonic hedgehog signaling system as a

bistable genetic switch Biophys J 2004862748-57

LEDBETTER DH Minireview Cryptic translocations and telomere integrity Am J Hum

Genet 199251451-456

70

LIPINSKI RJ SONG C SULIK KK EVERSON JL GIPP JJ YAN D BUSHMAN W

ROWLAND IJ Cleft lip and palate results from hedgehog sinaling antagonism in

the mouse phenotypic characterization and clinical implications Birth Defects

Res A Clin Mol Teratol 201088(4)232-240

LOWE LH BOOTH TN JOGLAR JM ROLLINS NK Midface anomalies in children

Radiographics 200020907-22

MARAZITA ML MOONEY MP Current concepts in the embryology and genetics of cleft

lip and cleft palate Clinics in Plastic Surgery 200431125-40

MARTI E BOVOLENTA P Sonic hedgehog in CNS development one signal multiple

outputs Trends Neuroscience 20022589-96

MARTINS MP Regiotildees subtelomeacutericas dos cromossomas os finais (quase) perfeitos

Programa de Mestrado em Epidemiologia Faculdade de Medicina da Universidade

do Porto 2010

MATSUNAGA E SHIOTA K Holoprosencephaly in human embryos epidemiologic studies

of 150 cases Teratology 197716261-72

MAZZOLA HK Congenital malformations in the frontonasal area their pathogenesis and

classification Clinics in Plastic Surgery 19763573-609

MCMAHON AP More surprises in the Hedgehog signaling pathway Cell 2000100(2)185-

8

MEDINA A PINtildeEROS L ARTEAGA C VELASCO H IZQUIERDO A GIRALDO A

ESPINOSA E Multiplex ligation-dependent probe amplification to subtelomeric

71

rearrangements in idiopathic intellectual disability in Colombia Pediatr Neurol

201450(3)250-4

MEFFORD HC TRASK BJ The complex structure and dynamic evolution of human

subtelomeres Nature Genetics 2002391-102

MERCIER S DUBOURG C GARCELON N CAMPILLO-GIMENEZ B GICQUEL L

BELLEQUIC M et al New findings for phenotype-genotype correlations in a large

European series of holoprosencephaly cases J Med Genet 201148(11)752-60

MERRITT L Understanding the embryology and genetics of cleft lip and palate Advances

in Neonatal Care 2005564-71

MING JE MUENKE M Holoprosencephaly from Homer to Hedgehog Clinical Genetics

199853155-163

MING JE MUENKE M Multiple hits during early embryonic development digenic diseases

and holoprosencephaly American Journal of Human Genetics 2002711017-

32

MOORE KL PERSAUD TVN Embriologia baacutesica Editora Guanabara Koogan 5ordf

ediccedilatildeo 2000

MOORE KL amp PERSAUD TVN Embriologia Cliacutenica 8a ed Rio de Janeiro Elsevier

2008

MRC-HOLLAND Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPAreg) Copy

number quantification amp methylation detection Disponiacutevel em ltwwwmlpacomgt

Acesso em 05 Set 2013

72

MUENKE M GURRIERI F BAY C YI DH COLLINS AL JOHNSON VP et al Linkage

of a human brain malformation familial holoprosencephaly to chromosome 7 and

evidence for genetic heterogeneity Proceedings of the National Academy of

Sciences U S A 1994918102-6

MUSTACCHI Z amp PERES S Geneacutetica baseada em evidecircncias siacutendromes e heranccedilas Satildeo

Paulo CID Editora LTDA 2000

NANNI L MING JE BOCIAN M et al The mutational spectrum of the sonic hedgehog gene

in Holoprosencephaly SHH mutations cause a significant proportion of autosomal

dominant holoprosencephaly Hum Mol Genetics 19998(13)2479-2488

NORMAN M Congenital malformations of the brain pathological embryological clinical

radiological and genetic aspects Oxford University Press 1995187-221

PALOMARES M DELICADO A LAPUNZINA P et al MLPA vs multiprobe FISH

comparison of two methods for the screening of subtelomeric rearrangements in 50

patients with idiopathic mental retardation Clin Genet 200669228-233

PAN A CHANG L NGUYEN A JAMES AW A review of hedgehog signaling in cranial

bone development Front Physiol 20134(61)

PETEK E KROISEL PM WAGNER K Isolation of a 370 kb YAC fragment spanning a

translocation breakpoint at 3p141 associated with holoprosencephaly Clin Genet

199854406-12

RIBEIRO LA ROESSLER E HU P PINEDA-ALVAREZ et al Comparison of mutation

findings in ZIC2 between microform and classical holoprosencephaly in a Brazilian

cohort Birth Defects Research (part A) Clinical and Molecular Teratology

201294(11)912-917

73

RICCOMAGNO MM MARTINU L MULHEISEN M WU DK EPSTEIN DJ

Specification of the mammalian cochlea is dependent on Sonic hedgehog Genes

Dev 2002152365-78

RICHIERI-COSTA A RIBEIRO LA Phenotypic variability associated findings and the

changing phenotype in holoprosencephaly (HPE) due to SHH SIX3 and TGIF

mutations a short summary Am J Hum Genet 2005

RICHIERI-COSTA A RIBEIRO LA Holoprosencephaly-like phenotype Clinical and

genetics perspectives American Journal of Medical Genetics Part A

2006a1402587-2593

RICHIERI-COSTA A RIBEIRO LA PTCH mutations in four Brazilian patients with

holoprosencephaly and one with holoprosencephaly-like features and normal MRI

American Journal of Medical Genetics Part A 2006b1402584-2586

ROACH E DEMYER W CONNEALLY PM PALMER C MERRITT AD

Holoprosencephaly birth data genetic and demographic analyses of 30 families

Birth Defects Orig Artic Ser 197511294-313

ROESSLER E DU YZ MULLOR JL et al Loss-of-function mutations in the human GLI2

gene are associated with pituitary anomalies and holoprosencephaly-like features

Proc Natl Acad Sci USA 20031113424-9

ROESSLER E MUENKE M Holoprosencephaly A paradigm for the complex genetics of

brain development Journal Inheritance of Metabolism Diseases 199821481ndash

497

ROESSLER E MUENKE M Midline and laterality defects left and right meet in the middle

Bioessays 200123888-900

74

ROESSLER E MUENKE M The molecular genetics of holoprosencephaly American

Journal of Medical Genetics Part C 201015452ndash61

ROOMS L REYNIERS E VAN LUIJK R et al Subtelomeric deletions detected in patients

with idiopathic mental retardation using multiplex ligation-dependent probe

amplification (MLPA) Human Mutation 200423(1)17-21

RYAN KE CHIANG C Hedgehog secretion and signal transduction in vertebrates J Biol

Chem 2012287(22)17905-13

SACCONE S DE SARIO A DELLA VG BERNARDI G The highest gene concentrations

in the human genome are in telomeric bands of metaphase chromosomes Proc

Natl Acad Sci USA 1992894913-4917

SALES CBS Expressatildeo de componentes da via de sinalizaccedilatildeo Sonic hedgehog (HHIPTCH1

e SHH) e VEGF-A em carcinoma escamocelular associaccedilatildeo com imunomarcaccedilatildeo

de VEGF-A e microdensidade vascular Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Universidade

Federal da Bahia 2012

SANTIAGO G Holoprosencefalia Cliacutenica e Linguagem Dissertaccedilatildeo para a obtenccedilatildeo do

tiacutetulo de Mestre HRACUSP Bauru-SP 2006

SAVASTANO CP BERNARDI P SEUAacuteNEZ HN MOREIRA MA ORIOLI IM Rare nasal

cleft in a patient with holoprosencephaly due to a mutation in a ZIC2 gene Birth

Defects Res A Clin Mol Teratol 2014a100(4)300-6

SAVASTANO CP EL-JAICK KB COSTA-LIMA MA ABATH CM BIANCA S

CAVALCANTI DP et al Molecular analysis of holoprosencephaly in South

America Genet Mol Biol 2014b37250-62

75

SCHIMMENTI LA DE LA CRUZ J LEWIS RA KARKERA JD MANLIGAS GS

ROESSLER E MUENKE M Novel mutation in sonic hedgehog in non-syndromic

colobomatous microphthalmia Am J Med Genet A 200330215-21

SCHOUTEN JP McELGUNN CJ WAAIJER R ZWIJNENBURG D DIEPVENS F PALS

G Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-

dependent probe amplification Nucleic Acids Research 200230(12)e57

SHAFFER LG BEJJANI BA TORCHIA B et al The identification of microdeletion

syndromes and other chromosome abnormalities cytogenetic methods of the past

new technologies for the future Am J Med Genet C Seminars in Medical

Genetics 2007145C(4)335-345

SLATER HR BRUNO DL REN H et al Rapid high throughput prenatal detection of

aneuploidy using a novel quantitative method (MLPA) J Med Genet 200340

907-12

SOLOMON BD MERCIER S VEacuteLEZ JI et al Analysis of genotype-phenotype correlations

in human holoprosencephaly Am J Med Genet C Semin Med Genet

2010154C(1)133-41

SOM PM NAIDICH TP Illustrated review of the embryology and development of the facial

region part 1 Early face and lateral nasal cavities AJNR Am J Neuroradiol

201334(12)2233-40

SOslashRENSEN KM ANDERSEN PS LARSEN LA SCHWARTZ M SCHOUTEN JP

NYGREN AO Multiplex ligation-dependent probe amplification technique for

copy number analysis on small amounts of DNA material Anal Chem

200880(23)9363-8

76

STASHINKO EE CLEGG NJ KAMMANN HA SWEET VT DELGADO MR HAHN JS

LEVEY EB A retrospective survey of perinatal risk factors of 104 living children

with holoprosencephaly Am J Med Genet A 2004128114-9

SWATEK J SZUMILO J BURDAN F Alobar holoprosencephaly with cyclopia ndash Autopsy-

based observations from one medical center Reprod Toxicol 20134180-5

WALLIS DE ROESSLER E HEHR U et al Mutations in the homeodomain of the human

SIX3 gene cause holoprosencephaly Nature Genetics 199922196-198

WETMORE C Sonic Hedgehog in normal and neoplastic proliferation insight gained from

human tumors and animals models Curr Opin Genet Dev 200313(1)34-42

77

Anexo 1

Parecer consubstanciado do Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa do HRAC-USP relativo

agrave aprovaccedilatildeo do presente projeto de pesquisa intitulado lsquoAnaacutelise por MLPA das regiotildees

subtelomeacutericas de pacientes com Holoprosencefaliarsquo

78

79

80

81

82

Anexo 2

O ofiacutecio (Ndeg 2892006) apresentado a seguir eacute relativo agrave aprovaccedilatildeo do projeto ldquoAnaacutelise

mutacional dos genes SHH TGIF SIX3 ZIC2 PTCH e GLI2 nas anomalias craniofaciais e

alteraccedilotildees do desenvolvimento do sistema nervoso centralrdquo (Fapesp Proc Ndeg 0660973-9) pelo

SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3


geneacutetica em indiviacuteduos com Holoprosencefalia atraveacutes das teacutecnicas de MLPA e arrayCGHrdquo

84

Anexo 4

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido elaborado para a pesquisa atual

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

TITULO DO ESTUDO ANAacuteLISE POR MLPA DAS REGIOtildeES

SUBTEMOLEacuteRICAS DE PACIENTES COM HOLOPROSENCEFALIA

NOME DO PESQUISADOR VIVIAN TRAGANTE DO Oacute

NOME DA RESPONSAacuteVEL DRA LUCILENE ARILHO RIBEIRO BICUDO

Pelo presente instrumento que atende agraves exigecircncias legais o Sr (a)

___________________________________________________________________________

portador da ceacutedula de identidade _______________________________ responsaacutevel pelo

paciente __________________________________________________________________

apoacutes leitura minuciosa deste documento devidamente explicado pelos profissionais em seus

miacutenimos detalhes ciente dos serviccedilos e procedimentos aos quais seraacute submetido natildeo restando

quaisquer duacutevidas a respeito do lido e explicado firma seu CONSENTIMENTO LIVRE E

ESCLARECIDO concordando em participar da pesquisa Anaacutelise por MLPA das regiotildees

subtelomeacutericas de pacientes com Holoprosencefalia realizada por Vivian Tragante do Oacute RG

43467272-5 sob orientaccedilatildeo da Dra Lucilene Arilho Ribeiro Bicudo nordm do Conselho CRM

4400 que tem como objetivo investigar a ocorrecircncia de alteraccedilotildees geneacuteticas recentemente

associadas agrave holoprosencefalia em pacientes cuja malformaccedilatildeo natildeo tem causa geneacutetica

determinada ateacute o momento Para tal seratildeo utilizadas as amostras de DNA jaacute coletadas e

armazenadas no banco de DNA do Laboratoacuterio de Geneacutetica Molecular do Hospital de

Reabilitaccedilatildeo de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo Paulo (HRACUSP -

Bauru)

Informamos que de modo geral natildeo existe nenhuma vantagem direta com a

participaccedilatildeo nesse estudo e eacute pouco provaacutevel que o tratamento seja modificado Poreacutem essa

investigaccedilatildeo poderaacute contribuir no futuro para uma melhor orientaccedilatildeo geneacutetica agraves famiacutelias

Os resultados dos exames estaratildeo disponiacuteveis no prontuaacuterio do indiviacuteduo participante e seratildeo

fornecidos ao paciente ou seu(s) responsaacutevel (is) em consulta previamente agendada no

Ambulatoacuterio de Geneacutetica Cliacutenica do HRAC-USP Bauru durante as vindas de rotina ao

Hospital Os resultados desta pesquisa poderatildeo ser divulgados para fins cientiacuteficos em

revistas e em eventos especializados na aacuterea incluindo o uso de imagens desde que a

identidade do indiviacuteduo seja preservada e que a participaccedilatildeo natildeo eacute obrigatoacuteria

Caso o sujeito da pesquisa queira apresentar reclamaccedilotildees em relaccedilatildeo a sua participaccedilatildeo na

pesquisa poderaacute entrar em contato com o Comitecirc de Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos

do HRAC-USP pelo endereccedilo Rua Silvio Marchione 3-20 no Serviccedilo de Apoio ao Ensino

Pesquisa e Extensatildeo ou pelo telefone (14) 3235-8421

85

Fica claro que o sujeito da pesquisa ou seu representante legal poderaacute a qualquer momento

retirar seu CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO e deixar de participar desta

pesquisa e ciente de que todas as informaccedilotildees prestadas tornar-se-atildeo confidenciais e

guardadas por forccedila de sigilo profissional (Art 20 do Coacutedigo de Eacutetica de Biologia)

Por estarem de acordo assinam o presente termo

Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___

Assinatura do Sujeito da Pesquisa ou

Responsaacutevel

________________________________

Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel

CAMPO A SER PREENCHIDO PELO REPRESENTANTE LEGAL DO MENOR OU

INCAPAZ

Nome do Pesquisador Responsaacutevel Vivian Tragante do Oacute

Endereccedilo Institucional (Rua Nordm) Rua Silvio Marchione 3-20 Vila Universitaacuteria

Cidade Bauru Estado Satildeo Paulo CEP 17012-900

Telefone (14) 3235-8412 E-mail vivianouspbr

2



Holoprosencefalia


Anomalias Craniofaciais da Universidade de Satildeo Paulo para a

obtenccedilatildeo do tiacutetulo de MESTRE em Ciecircncias da Reabilitaccedilatildeo


Orientadora Profordf Drordf Lucilene Arilho Ribeiro Bicudo

BAURU

2014

3




Caixa Postal 1501


Telefone (14)3235-8000



Tragante Vivian



ndash Bauru 2014

85 p il 31cm




Paulo


Bicudo




CDD 61442



Data 27082013




Bauru ___ de ________________ de _______

T765a

4




Holoprosencefalia







Banca examinadora

Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________


Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________







5






2012-2014








6



7

AGRADECIMENTOS


minhas escolhas









vida saudaacutevel












8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





3




Caixa Postal 1501


Telefone (14)3235-8000



Tragante Vivian



ndash Bauru 2014

85 p il 31cm




Paulo


Bicudo




CDD 61442



Data 27082013




Bauru ___ de ________________ de _______

T765a

4




Holoprosencefalia







Banca examinadora

Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________


Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________







5






2012-2014








6



7

AGRADECIMENTOS


minhas escolhas









vida saudaacutevel












8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





4




Holoprosencefalia







Banca examinadora

Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________


Prof(a) Dr(a) ____________________________________________________







5






2012-2014








6



7

AGRADECIMENTOS


minhas escolhas









vida saudaacutevel












8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





5






2012-2014








6



7

AGRADECIMENTOS


minhas escolhas









vida saudaacutevel












8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

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55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





6



7

AGRADECIMENTOS


minhas escolhas









vida saudaacutevel












8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





7

AGRADECIMENTOS


minhas escolhas









vida saudaacutevel












8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



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2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

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Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





8













sorrisos carinhosos










9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

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22

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2

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2 2 2 22

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21 21

17

21

0

6

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Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





9

RESUMO







































10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





10

ABSTRACT



Satildeo Paulo 2014

































11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





11










GeneMarker 57

12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





12

LISTA DE TABELAS


tipos de HPE 22



13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





13




14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









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(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










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2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

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Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

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Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

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INCAPAZ





14






DHH Desert Hedgehog










Paulo

IHH Indian Hedgehog






PCT Patched gene


SHH Sonic Hedgehog

SIX3 SIX homeobox 3

SMO Smoothened




15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























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SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















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HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










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2000)

33










2002)




2002)












34


























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36










37



















2009)






38



















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40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




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Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

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22

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2

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2 2 2 22

0 2

21 21

17

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6

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Lobar

Semilobar


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57

















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(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

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___


Responsaacutevel

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INCAPAZ





15




WNT Wingless type

16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





16

SUMAacuteRIO









AMPLIFICATION 37

3 OBJETIVOS 42










6 CONCLUSAtildeO 63


ANEXOS





17
































18






























19






















SANTIAGO 2006)



20
























al 2013)

21















22




HPE-ALOBAR

Forma mais grave




seio sagital




HPE-SEMI LOBAR






HPE-LOBAR








FIHM





formados









23


(COHEN 1989)
























24




SWATEK et al 2013)













25


























26




















SWATEK et al 2013)






27

























28



WETMORE 2003)






(COHEN 2003)
















2000)

29

















30








amp CHIANG 2012)






31










32












2000)

33










2002)




2002)












34


























35
























36










37



















2009)






38



















39












40





MRC-Holland 2008)





















41














42

3 OBJETIVOS

31 Objetivo geral







43





41 Grupo Amostral



















44






(ANEXO 4)









45




SALSA MLPA








136 2p ACP1 02274-L08758 02-00025

142 3P CHL1 01721-L01329 03-00034

151 4P PIGG (FLJ20265) 02005-L02047 04-0005

158 5P PDCD6 01723-L01327 05-00037

166 6P IRF4 01724-L02048 06-00034

172 7p ADAP1 (CENTA1) 02275-L02049 07-00093

179 8p FBXO25 02397-L01845 08-00040

186 9p DMRT1 01727-L02050 09-00084

193 10p DIP2C (KIAA0934) 02277-L01768 10-00048

202 11p RIC8A (RIC-8) 03315-L02733 11-00020

208 plusmn 12p SLC6A12 02276-L01767 12-00017




242 16p POLR3K 01734-L01316 16-00004

250 17p RPH3AL 01735-L01315 17-00017

258 18p USP14 01736-L02051 18-00019

265 plusmn 19p CDC34 01737-L01313 19-00049

274 20p SOX12 02396-L01844 20-00026



298 XpYp


307 1q SH3BP5L























483 XqYq

(PAR2) VAMP7 (SYBL1) 01763-L02150


telomere)

46












horas









minutos a 72degC





47























Holland





48



49




















este trabalho

50















0

5

10

15

20

25


21

22

51











citados













bilateral (4)

52




53


Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

1 F 16 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

2 F 26 MF + + + + FTFI Mediana - + -


4 F 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -


Incompleta - + +

6 F 22 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - -


Incompleta - + -




11 F 4 L + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda + - +

12 M 8 L + + + + FTFI Mediana + - +

13 F 20 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +

14 F 3 SL + + + +

FPreacuteFI Mediana

Completa

+ - +

54

Paciente Sexo Idade

(anos)



Nariz

achatado

Fissura

laacutebio

eou

palato

Tipo de

Fissura

apresentada

Comprometimento

do SNC

Incisivo

central

uacutenico

Ponte

nasal

baixa

15 M 5 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - + -

16 M 19 MF + + - +

FTFI Unilateral

Direita - - +

17 F 21 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - -

18 M 14 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - + +


Incompleta - - -



22 M 43 MF + + + +

FTFI Unilateral

Direita - - +

23 M 13 MF + + + +

FTFI Unilateral

Esquerda - - +


Incompleta - - +

25 F 8 MF + + - +


Esquerda

Completa

- - +




55












22

22

2

0 2

2 2 2 22

0 2

21 21

17

21

0

6

12

Lobar

Semilobar


56























57

















58



(DrsquoANGELO 2009)






DrsquoANGELO 2009)

















59


























60


























61

























COHEN 2006)

62

















63

6 CONCLUSOtildeES





















64









1996(14)353-56






(12)1189ndash1197







65




200930(8)1175-1182






2014139(1)66-75






183




13630-4



66








Genetics 2001103183-187








A 2011155A(2)270-9



199664465-472




20031302967-80

67




















13


Neuron 199821(6) 1243-57

68



















201313(3)463-66



69













Hematology 201419(4)217-24




200441892ndash899




Genet 199251451-456

70













do Porto 2010






8



71


201450(3)250-4









199853155-163



32




2008




72



















199854406-12




201294(11)912-917

73



Dev 2002152365-78






2006a1402587-2593












497


Bioessays 200123888-900

74







Chem 2012287(22)17905-13
















75










Genetics 2007145C(4)335-345



907-12



2010154C(1)133-41



201334(12)2233-40




200880(23)9363-8

76










77

Anexo 1




78

79

80

81

82

Anexo 2




SVAPEPE-CEP

83

Anexo 3



84

Anexo 4








___________________________________________________________________________


paciente __________________________________________________________________












Bauru)














85






Bauru-SP ________ de ______________________ de 20__

______________________________________

___


Responsaacutevel

________________________________



INCAPAZ





Documents

VIVIAN TRAGANTE DO Ó · Holoprosencefalia [dissertação]. Bauru: Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais, Universidade de São Paulo; 2014. Introdução: A Holoprosencefalia