Viviani Olivastro Bressani

Viviani Olivastro Bressani

Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e

ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação

de células tumorais de mama.

SÃO PAULO

2015

Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de

Doutora em Ciências da Saúde.

Viviani Olivastro Bressani

Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e

ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação

de células tumorais de mama.

SÃO PAULO

2015

Tese apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências

Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Titulo de

Doutora em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde

Orientador: Prof. Dr. Wagner Ricardo Montor

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da

Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Bressani, Viviani Olivastro Investigação do efeito dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 e seus derivados na inibição de proliferação de células tumorais de mama./ Viviani Olivastro Bressani. São Paulo, 2015.

Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Wagner Ricardo Montor 1. Ácidos graxos 2. Câncer de mama 3. Morte celular 4. Espécies

reativas de oxigênio 5. Ácidos graxos insaturados BC-FCMSCSP/48-15

Oração a Bezerra de Menezes

Nós te rogamos, Pai de infinita bondade e justiça, as graças de

Jesus Cristo, através de BEZERRA DE MENEZES e suas legiões de

companheiros.

Que eles nos assistam, Senhor, consolando os aflitos, curando

aqueles que tiverem suas provas e expiações a passar, esclarecendo aos

que desejarem conhecer a verdade e assistindo a todos quantos apelarem

ao teu infinito amor.

Jesus, divino portador da graça e da verdade, estende tuas mãos

dadivosas em socorro daqueles que te reconhecem o despenseiro fiel e

prudente; faze-o, divino Mestre, através de tuas legiões consoladoras, de

teus santos espíritos, a fim de que a fé se eleve, a esperança aumente, a

bondade se expanda e o amor triunfe sobre todas as coisas.

BEZERRA DE MENEZES, apóstolo do bem e da paz, amigo dos

humildes e dos enfermos, movimenta as tuas falanges amigas em

benefício daqueles que sofrem, sejam dos males físicos ou espirituais.

Santos espíritos, dignos obreiros do Senhor, derramem as graças e as

curas sobre a humanidade sofredora, a fim de que as criaturas se

tornem amigas da paz e do conhecimento, da harmonia e do perdão,

semeando pelo mundo os divinos exemplos de JESUS CRISTO.

QUANDO A BOCA CALA...O CORPO GRITA!!!

A enfermidade é um conflito entre a personalidade e a alma.

O resfriado escorre quando o corpo não chora.

A dor de garganta entope quando não é possível comunicar as

aflições.

O estômago arde quando as raivas não conseguem sair.

O diabetes invade quando a solidão dói.

O corpo engorda quando a insatisfação aperta.

A dor de cabeça deprime quando as duvidas aumentam.

O coração desiste quando o sentido da vida parece terminar.

A alergia aparece quando o perfeccionismo fica intolerável.

As unhas quebram quando as defesas ficam ameaçadas.

O peito aperta quando o orgulho escraviza.

A pressão sobe quando o medo aprisiona.

As neuroses paralisam quando a “criança interna” tiraniza.

A febre esquenta quando as defesas detonam as fronteiras da

imunidade.

Os joelhos doem quando o orgulho não se dobra.

O câncer mata quando não se perdoa e/ou cansa de viver.

E as dores caladas? Como falam em nosso corpo?

A enfermidade não é má, ela avisa quando erramos a direção.

O caminho para a felicidade não é reto, existem curvas chamadas

Equívocos, existem semáforos chamados Amigos, luzes de

precaução chamadas Família, e ajudará muito ter no caminho

uma peça de reposição chamada Decisão, um potente motor

chamado Amor, um bom seguro chamado Fé, abundante

combustível chamado Paciência.

Mas principalmente um maravilhoso Condutor chamado Deus, ou

como O queiram chamar.

Preste atenção!!!!

O plantio é livre, a colheita, é obrigatória..... Preste atenção

no que você está plantando, pois será a mesma coisa que irá

colher!

Dedicatória

Dedico este trabalho a Deus, aos Anjos de Luz, aos meus pais, irmãos, tia

Célia e meu marido Amaury por me apoiarem e me estimularem com palavras e

exemplos de vida a cada etapa deste projeto. Sem vocês minha vida não vale nada.

Em especial a minha querida e amada avó Maria Antônia Braga dos Santos

(In Memoriam), pelo carinho, pelos exemplos de vida, por incentivos, pelas alegrias,

pelas palavras de sabedoria e amor que sempre nos presenteaste. Amo-te muito,

por toda a eternidade.

Agradecimentos

Primeiramente agradeço a Deus por estar presente e morar em meu coração,

em cada passo da minha, pela oportunidade em me presentear e poder realizar mais

um sonho de fazer o Doutorado e poder contribuir com a ciência com este trabalho

rico de amor e competência.

Agradeço a Deus, a Jesus e a Mestra Maria, por colocarem em minha

caminhada Anjos de Luz que me guiaram com palavras, exemplos de vida para que

eu nunca desistisse.

Ao Profº. Dr. Wagner Ricardo Montor por me orientar, confiar e esclarecer as

minhas dúvidas durante a realização do projeto. E principalmente por ter muita

paciência para mostrar o caminho durante toda a realização do projeto. Você me

permitiu realizar outro sonho, estudar e entender muitos mecanismos sobre essa

doença. Aprendi muito, obrigada por me ensinar a caminhar com minhas próprias

pernas.

A meus pais Paulo Gilberto Bressani e Maria Regina dos Santos Bressani,

pela educação que me deram, pelas orações, por acreditarem em mim e pelas

orientações maravilhosas de como saber lidar com a vida, sem esquecer Deus,

Jesus e Maria, aprendendo com humildade, simplicidade, equilíbrio, determinação,

respeito, fé e muito amor. Obrigada por tudo! Amo vocês!!!!

Aos meus irmãos Paulo Henrique Bressani, Paulo Vinícius Bressani e

Regiane Bressani por serem pessoas importantes em minha vida e que me

ajudaram com palavras de amor em todos os sentidos da minha vida. Amo mais que

tudo!

Aos meus sobrinhos Raphael Santos Bressani, Gabriella Braga Bressani e

Arthur de Oliveira Bressani por enriquecerem a minha vida de alegrias, aprendizados

e muito amor. Vocês são meus amores!!!!

À minha tia Célia Maria Braga dos Santos e as minhas cunhadas Andréa

Correia de Oliveira e Angela Panseri pelas orações, por acreditarem em mim, por

palavras de incentivo e por conselhos cheios de amor.

Ao meu marido Amaury César Derrè Sartorelli por fazer parte da mina vida,

por me trazer alegrias, por me orientar com palavras de sabedoria e amor, por me

ouvir nos meus momentos mais difíceis e saber lidar comigo nesses momentos

complicados da minha vida, pela cumplicidade, respeito e amor, e por ser um

homem de grandes qualidades. Amo-te muito!!!!

À Dalva Sartorelli e Wagner Sartorelli, por serem meus segundos pais, me

orientando e orando para a realização do meu doutorado. Muito obrigada!

Aos meus amigos Dr. Wanderley Granja Affonso e Elza Silva Affonso que me

estimularam a entrar na vida de pesquisa acadêmica e que não me deixaram

desistir. Obrigada por serem meus Anjos de Luz e por serem meus exemplos de

vida, principalmente ao Dr. Wanderley excelente médico que exerce sua função com

amor, humildade, simplicidade e fé. Obrigada por ser o meu exemplo!

Aos amigos: Ariadiny de Lima Caetano, Danielle Vieira Sobral, Karla Cristina

Monteiro da Silva, Nélia Araújo, Janaína Balthazar, Ana Flávia Laureano, Rafael

Sutti, Carla Sant’Anna Corrêa.

À minha grande amiga Bianca Gamberini, por ter sido a responsável por me

apresentar o Prof. Dr. Wagner Ricardo Montor, por me ouvir nos meus momentos

difíceis e por me encorajar, para que este sonho fosse realizado.

À Profª Dra. Mirian Galvona Jasiulionis, por permitir realizar uma parte dos

experimentos no Laboratório de Ontogenia e Epigenética da Universidade Federal

de São Paulo.

Ao Diego de Assis Gonçalves e a Jéssica Domingues Gonçalves, por me

auxiliarem nos experimentos finais.

A todos os integrantes e colegas do Departamento de Ciências Fisiológicas

pela força e orientação que cada um passou a mim.

Ao grupo de Bases Moleculares da Proliferação Celular, em especial a Profª.

Dra. Fabiana Henriques de Melo Machado, a Thiara Alves Matos, a Andréia Rangel

pela oportunidade de aprender profissionalmente e pessoalmente, e por me

ajudarem na realização do projeto.

Ao Fundo de Amparo à Pesquisa (FAP), a CAPES, a Irmandade da Santa

Casa de São Paulo e a Faculdade de Medicina da Santa Casa de São Paulo, por

permitirem a realização deste sonho.

Sumário

Lista de Abreviaturas

Lista de Símbolos

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

1. Introdução 22 1.1 Câncer de Mama 22 1.2 Subtipos de Câncer de mama 23 1.3 Quimioprevenção 26 1.4 Ácidos Graxos Ômega 3 e 6 27 1.5 Espécies Reativas de Oxigênio 32 1.6 Mitocôndria e Câncer 33 1.7 Morte Celular 34 1.8 Modelos Celulares e Estratégia de Estudo 36

2. Objetivos 38 2.1 Objetivo Geral 38 2.2 Objetivos específicos 38

3. Materiais e Métodos 39 3.1 Descrição da Linhagem Celular 39 3.2 Reagentes 41 3.3 Cultivo Celular 41 3.4 Congelamento Celular 42 3.5 Ensaio de Viabilidade Celular (ensaio MTT) 42 3.6 Avaliação das alterações fenotípicas induzidas pelo tratamento 43 3.7 Determinação das curvas de crescimento em substrato sólido 43 3.8 Crescimento em suspensão de agarose 44 3.9 Avaliação do Potencial de Migração pela técnica de “Scratch” 44 3.10 Imunocitoquímica para detecção de Superóxido Dismutase 2 (SOD2)

45

3.11 Análise das Lâminas após imunocitoquímica 47 3.12 Atividade de Superóxido Dismutase (OD) 47 3.13 Espécies Reativas de Oxigênio 48 3.14 Morte Celular por Apoptose 48 3.15 Análise Estatística dos Dados 49

4. Resultados 50 4.1 Preparação da solução de ácidos graxos 50 4.2 Padronização da Curva de Crescimento em Substrato Sólido 50 4.3 Efeito do tratamento com ácidos graxos sobre as curvas de crescimento em substrato sólido

54

4.4 Tabelas comparativas do efeito do tratamento com ácidos graxos sobre diferentes linhagens celulares

73

4.5 Viabilidade Celular 79 4.6 Experimento de “scratch” para análise do potencial de migração das células

81

4.7 Crescimento celular em suspensão de agarose 85

4.8 Análise da expressão de superóxido dismutase-2 (SOD2), por imunocitoquímica

89

4.9 Análise da atividade de superóxido dismutase 94 4.10 Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS) 96 4.11 Análise de Morte Celular 102 4.12 Análise do efeito dos ácidos graxos descritos sobre a curva de crescimento das linhagens Hs578t e MDA-MB-435

106

5. Discussão 112 6. Conclusões 128 7. Referências Bibliográficcas 130 8. Resumo 140 9. Abstrac 142 10. Anexos 144

10.1 Anexos I 144 10.2 Anexo II 145

Lista de Abreviaturas

Akt – Proteína quinase

Ais – Inibidores de aromatase

ATCC – American Type Culture Collection

ATP – Trifosfato de Adenosina

Bcl-2 – Linfoma de célula B do tipo 2

BRCA – 1 - Gene de reparo de DNA, usado como marcador de predisposição

a câncer

BRCA – 2 – Gene de reparo de DNA, usado como marcador de predisposição

a câncer

CD105 - Glicoproteína homodimérica da membrana celular ligada por

dissulfeto

CK1 – Proteína quinase caseína do tipo 1

CLA – Ácido Linoleico Conjugado

c-Myc – proto - oncogene

CO3•‾ - Carbonato

COX – Ciclooxigenase

Cu - Cobre

DHA – Ácido Docohexaenóico

DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DMSO – Dimetilsufóxido

EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGF – Fator de Crescimento Epidermal

EPA – Ácido Eicosapentaenóico

ER-α – Receptor de Estrógeno alfa

ER+ - Receptor de Estrógeno Positivo

EROS – Espécie Reativa de Oxigênio

EUA – Estados Unidos da América

FaOOH – Ácido graxo hidroperóxido

Fe - Ferro

GLA – Ácido Gamalinolênico

HER-2 – Fator de Crescimento Epidermal Humano do tipo 2

HLA – Antígeno Leucocitário Humano

HOCl – Cloreto de hidrogênio

HO• - Radical hidroxila

H2O2 – Peróxido de hidrogênio

HR – Receptor de Hormônio

IGFBP – Fator de Crescimento Ligado a Insulina Ligante de Proteína

IGFBP – 2 – Fator de Crescimento Ligado a Insulina Ligante de Proteína do

tipo 2

IGFBP – 4 – Fator de Crescimento Ligado a Insulina Ligante de Proteína do

tipo 4

IGFBP – 5 - Fator de Crescimento Ligado a Insulina Ligante de Proteína do

tipo 5

INCA – Instituto Nacional do Câncer

KCl – Cloreto de potássio

KH2PO4 – Fosfato monopotássico

Ki-67 – Proteína de marcador de proliferação celular

LA – Ácido Linoleico

LOX – Lipoxigenase

MAPK – Proteína quinase ativado por mitógeno

Mg - Magnésio

MTT – (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)

NaCl – Cloreto de Sódio

NADH - Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina

Na2HPO4 – Fosfato dissódico

NBT – Nitro Blue Tratazolium

n-3 – Ômega da família 3

n-6 – Ômega da família 6

O2•‾ - Ânion superóxido

PAI - 1 – Plasminogênio tipo 1

PBSA – Tampão Fosfato Salina

PGE – 2 – Prostaglandina do tipo 2

PI – Iodeto de Propídeo

PI3K – Fosfatidiinositol 3-kinase

PKA – Proteína quinase A

PKC – Proteína quinase C

PMS – Metasulfato de Fenazina

PR+ - Receptor de Progesterona Positivo

PUFAS – Ácidos Graxos Poliinsaturados

p53 – Proteína tumoral

pRb – Proteína retinoblastoma

Ras – Proteína do sarcoma Rat

RO2• - Peroxil

RPM – rotação por minuto

RPMI – Meio suplementado (de Roswell Park Memorial Institute)

SBF – Soro Bovino Fetal

SERM – Moduladores Específicos do Receptor de Estrógeno

SOD – Superóxido Dismutase

TGFα – Fator de Crescimento Transformador alfa

TGFβ – 1 – Fator de Crescimento Transformador do tipo 1

TGFβ – 3 – Fator de Crescimento Transformador do tipo 3

uPA – Ativador de Plasminogênio do tipo uroquinase

USP – Universidade de São Paulo

Zn - Zinco

Lista de Símbolos

g – Grama

G – Medida equivalente a força Gravitacional na superfície terrestre, ao nível

do Mar.

mL – Mililitro

mg – Miligrama

mM - Milimolar

pH – Potencial hidrogênico

rpm – Rotação por minuto

µg – Micrograma

µL - Microlitro

µM – Micromolar

Lista de Figuras

Figura 1: Figura 1: Estrutura química do ácido linoleico e dos isômeros c9,t11 e

t10,c12........................................................................................................................29

Figura 2: Análise gráfica da duplicata da curva de crescimento de MDA-MB-231 em

diferentes placas (24 e 12 poços), partindo de diferentes inóculos (5X103, 1X104 e

2X104), para padronização das condições a serem utilizadas na curva de

crescimento................................................................................................................52

Figura 3: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com

aumento de 10X, da linhagem MDA-MB-231 controle negativo (apenas meio de

cultura), nos dias 1, 3, 5, 7 e 9, plaqueada na densidade de 5x103 em placa de 24

poços..........................................................................................................................53


aumento de 10X, da linhagem MDA-MB-231 controle negativo (meio de cultura e

veículo hexano na concentração de 200µL), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e

9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24

poços..........................................................................................................................56


aumento de 10X, da linhagem MDA-MB-231 tratada com EPA/DHA na concentração

de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular

de 5X103 na placa de 24 poços..................................................................................57


aumento de 10X, da linhagem MCF-7 controle negativo (apenas meio de cultura),

nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular 5X103 na

placa de 24 poços......................................................................................................58


aumento de 10X, da linhagem MCF-7 controle negativo (meio de cultura e veículo

hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a

partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24

poços..........................................................................................................................59


aumento de 10X, da linhagem MCF-7 tratada com EPA/DHA na concentração de

200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de

5X103 na placa de 24 poços.......................................................................................60

Figura 9: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços......................................................................................................61


aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 controle negativo (meio de cultura e veículo

hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a

partir da densidade celular 5X103 na placa de 24

poços..........................................................................................................................62


aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 tratada com EPA/DHA na concentração de

200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de

5X103 na placa de 24 poços.......................................................................................63

Figura 12: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM,

100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem

celular MDA-MB-231, nos 5 pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9

dias.............................................................................................................................65

Figura 13: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações

de 50µM, 100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da

linhagem celular MDA-MB-231, nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9

dias.............................................................................................................................66


100µM e 200µM, em placa de 24 poços sobre a curva de crescimento da linhagem

celular MCF-7, nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.............................................68



linhagem celular MCF-7 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9

dias.............................................................................................................................69


100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem

celular SKBR-3 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias............................................71



linhagem celular SKBR-3 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9

dias.............................................................................................................................72

Figura 18: Análise em quadruplicata de alguns pontos da curva de crescimento,

para confirmar o efeito inibitório de ácidos graxos específicos em tempos definidos

de tratamento, para as linhagens celulares indicadas. Nas figuras “a” e “b”, observa-

se diferença estatisticamente significante em relação ao efeito de ácido linolênico e

CLA 100µM, no dia 9, para a linhagem MCF-7. Nas figuras c e d, embora se observe

uma tendência de inibição exercida por ácido linolênico e linoleico 50µM no dia 9,

para a linhagem MDA-MB-231, esta diferença não é estatisticamente significante..78

Figura 19: Efeito dos ácidos graxos sobre a viabilidade celular das linhagens MDA-

MB-231, MCF-7, e SKBR-3 pelo ensaio de MTT. Análise estatistica feita por ANOVA

de duas vias...............................................................................................................80

Figura 20: Experimento de “scratch” mostrando potencial de migração celular da

linhagem MDA-MB-231, crescendo na presença de ácidos graxos específicos.

Microscopia de luz; Aumento de 10X.........................................................................84

Figura 21: Células sem nenhum tipo de tratamento ou veículo (hexano e albumina),

crescendo em suspensão de agarose, ao longo de três semanas. Microscópio óptico

invertido; Aumento

10X.............................................................................................................................86

Figura 22: Análise da expressão de SOD2 nas células tumorais MDA-MB-231 e

MCF-7, tratadas com os referidos ácidos graxos na concentração de 100µM por 24

horas. Análise estatística foi feita por ANOVA de uma via. A quantificação de 4

campos diferentes foi feita utilizando o sistema MCID de análise de imagens

(Interfocus Europe, UK)..............................................................................................90

Figura 23: Imunocitoquímica evidenciando a expressão de SOD2 nos diferentes

tratamentos, para a linhagem MDA-MB-231. Todos os ácidos foram utilizados na

concentração de 100μM, por 24 horas. Painel ilustrativo da quantificação mostrada

anteriormente. Imagens obtidas através do software MCID. Aumento 40X..............92

Figura 24: Imunocitoquímica evidenciando a expressão de SOD2 nos diferentes

tratamentos, para a linhagem MCF-7. Todos os ácidos foram utilizados na

concentração de 100μM, por 24 horas. Painel ilustrativo da quantificação mostrada

anteriormente. Imagens obtidas através do software MCID. Aumento 40X..............93

Figura 25: Padronização da atividade de SOD nas linhagens celulares MDA-MB-

231, MDA-MB-435, MCF-7, Hs-578t e SKBR-3. Análise estatística feita por ANOVA

de uma via..................................................................................................................94

Figura 26: Quantificação da atividade de SOD, sob efeito do tratamento com ácidos

graxos EPA/DHA, CLA e linolênico na concentração de 100µM por 24 horas. Análise

estatística feita por ANOVA de duas vias...................................................................95

Figura 27: Quantificação da atividade de SOD, sob efeito do tratamento com ácido

linoleico na concentração de 100µM, por 24 horas. Análise estatística feita por

ANOVA de duas vias..................................................................................................96

Figura 28: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-231

tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico no período de 24 e 48 horas. Análise

estatística feita por ANOVA de duas vias...................................................................97

Figura 29: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-231

tratada com ácido linoleico no período de 24 e 48 horas. Análise estatística feita por

ANOVA de duas vias..................................................................................................97

Figura 30: Ensaio de quantificação relativa de EROS nas linhagens MDA-MB-231,

tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico no período de 2 horas. Análise

estatística feita por ANOVA de uma via.....................................................................98

Figura 31: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-231,

tratada com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann

Whitney U...................................................................................................................98

Figura 32: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MCF-7, tratada

com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 24 horas. Análise estatística feita por

ANOVA de uma via....................................................................................................99

Figura 33: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MCF-7, tratada

com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney

U.................................................................................................................................99

Figura 34: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada


ANOVA de uma via..................................................................................................100

Figura 35: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U. ..................................................................................................................................100



ANOVA de uma via..................................................................................................101


com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U. ..................................................................................................................................101

Figura 38: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os

ácidos graxos EPA/DHA, CLA e Ácido linolênico por 8 dias na concentração de

100µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas

vias...........................................................................................................................103

Figura 39: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com o ácido

graxo linoleico com albumina por 8 dias na concentração de 100µM. Análise

estatística feita por ANOVA de duas vias.................................................................103

Figura 40: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os

ácidos graxos EPA/DHA, CLA e linolênico por 24 horas na concentração de 200µM.

Análise estatística feita por ANOVA de duas

vias...........................................................................................................................104

Figura 41: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com o ácido

linoleico por 24 horas na concentração de 200µM. Análise estatística feita por

ANOVA de duas vias................................................................................................104

Figura 42: Ensaio de morte celular da linhagem SKBR-3, tratada com o ácido graxo

CLA por 8 dias nas concentrações de 100µM e 200µM. Análise estatística feita por

ANOVA de duas vias................................................................................................105

Figura 43: Ensaio de morte celular da linhagem SKBR-3, tratada com os ácidos

graxos EPA/DHA e linolênico por 24 horas nas concentrações de 100µM e 200µM.

Análise estatística feita por ANOVA de duas

vias...........................................................................................................................105

Figura 44: Efeito do tratamento com ácidos graxos EPA/DHA e CLA em diferentes

concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem

Hs578-t, em placa de 24 poços nos 5 pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9

dias...........................................................................................................................108

Figura 45: Efeito dos ácidos linolênico e linoleico em diferentes concentrações

(50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem Hs578-t em

placa de 24 poços nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.....................................109

Figura 46: Efeito do tratamento com ácidos EPA/DHA e CLA em diferentes


MDA-MB-435 em placa de 24 poços nos pontos de coletas 1, 3, 5, 7 e 9

dias...........................................................................................................................110

Figura 47: Efeito do tratamento com ácidos linolênico e linoleico em diferentes


MDA-MB-435 em placa de 24 poços nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9

dias...........................................................................................................................111

Lista de Tabelas

Tabela 1: Compilação de dados dos gráficos acima e das imagens microscópicas

das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das

linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com EPA/DHA.....74



linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com CLA..............75



linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com ácido

linolênico.....................................................................................................................76



linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com ácido

linoleico.......................................................................................................................77

Tabela 5: Efeito de EPA/DHA sobre a densidade celular da área submetida à

raspagem no dia zero.................................................................................................82

Tabela 6: Efeito de CLA sobre a densidade celular da área submetida à raspagem

no dia zero..................................................................................................................82

Tabela 7: Efeito de ácido linolênico sobre a densidade celular da área submetida à


Tabela 8: Efeito de ácido linoleico sobre a densidade celular da área submetida à


Tabela 9: Efeito de EPA/DHA sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3

e MCF-7, em suspensão de agarose.........................................................................87

Tabela 10: Efeito de CLA sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e

MCF-7, em suspensão de agarose............................................................................88

Tabela 11: Efeito de ácido linolênico sobre o crescimento celular de MDA-MB-231,

SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose...........................................................88

Tabela 12: Efeito de ácido linoleico sobre o crescimento celular de MDA-MB-231,

SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose...........................................................89

Tabela 13: Análise global dos efeitos dos quatro ácidos graxos testados, sobre a

expressão de SOD2, atividade de SOD, formação de EROS e crescimento celular

das três principais linhagens celulares testadas......................................................106

22

1. Introdução

1.1 Câncer de Mama

O Câncer é uma doença que pode ser causada por fatores hereditários,

físicos, químicos e biológicos, atingindo uma grande parte da população mundial e

apresentando-se de maneira altamente heterogênea tanto nos aspectos

moleculares, quanto morfológicos e clínicos [1, 2]. O câncer de mama é o segundo

tipo de tumor mais frequente no mundo, acometendo tanto homens quanto

mulheres, no entanto, sendo bastante raro entre os primeiros, mas correspondendo

anualmente por cerca de 20% dos novos casos entre essas. Segundo estudos feitos

pelo INCA, a estimativa de novos casos de câncer de mama em 2014 no Brasil foi

de 57.120 [3, 4].

Trata-se da primeira causa de morte por câncer entre as mulheres, em

números absolutos, e registrou-se uma variação percentual relativa de mais de 80%

na incidência em pouco mais de duas décadas. No Brasil, a taxa de mortalidade

padronizada por idade, por 100.000 mulheres, aumentou de 5,77 em 1979, para

9,74 em 2000. O aumento da incidência tem sido acompanhado pelo aumento da

mortalidade, o que pode ser atribuído principalmente, ao diagnóstico tardio [5].

O câncer, de modo geral, origina-se por meio de alterações genômicas, em

que se observa expressão alterada de genes envolvidos na regulação da

proliferação celular. Dentre as alterações genômicas conhecidas podemos citar, a

inativação de genes supressores de tumor, a inibição de genes envolvidos no reparo

do DNA (ácido desoxirribonucleico), a ativação de proto-oncogenes que então se

tornam oncogenes, a instabilidade cromossômica, as alterações epigenéticas, a

reativação da telomerase, as falhas no mecanismo de apoptose e algum grau de

insuficiência do sistema imune, tudo isso, conjuntamente podendo resultar no

descontrole da proliferação celular, seleção clonal e formação tumoral, além de

auxiliar nos processos de invasão local e metástase [3, 6].

Uma série de alterações em vias de transdução de sinal já foram apontadas

como envolvidas no processo de tumorigênese e progressão tumoral. Sabemos que

há mecanismos compensatórios e que raramente alterações em uma única via são

responsáveis pelo processo tumoral. De modo geral, um fator importante para a

tumorigênese é que as células se tornem independentes da regulação por fatores de

23

crescimento para proliferar, o que passam a fazer descontroladamente. Estas

alterações podem ocorrer em genes que controlam a abundância e disponibilização

de fatores de crescimento, em genes que codificam para os próprios receptores dos

referidos fatores, em genes que codificam para proteínas envolvidas com a

transdução de sinal entre a membrana e o núcleo, ou genes que codificam para

fatores de transcrição, além de alteração nas próprias sequências promotoras onde

tais fatores de transcrição se ligam [6, 7, 8].

Diversos estudos evidenciam o papel de células multipotentes na origem e

progressão de tumores mamários. Há evidências de que os tumores se originam de

tais células multipotentes que fazem parte da constituição mamária normal e seriam

as primeiras a sofrerem o descontrole da proliferação se transformando em tumores.

Apesar de haver dificuldade de isolamento dessas, devido à sua baixa abundância

relativa, já há marcadores moleculares específicos [9, 10].

A descoberta dessas células veio da observação de que algumas células

isoladas de tumores mamários apresentam potencial de diferenciação mioepitelial e

não apenas epitelial, além de se dividirem de maneira assimétrica in vitro, o que é

característico de células tronco ou multipotentes [11, 12].

Na glândula mamária, células multipotentes, orquestram o desenvolvimento

da glândula durante a embriogênese, e a sua modificação na vida pós-natal, de

acordo com as necessidades de desenvolvimento, incluindo adaptações durante o

processo de amamentação. A citoarquitetura da glândula é aparentemente simples,

composta de uma camada interna de células epiteliais luminais e uma camada

externa de células mioepiteliais, no entanto, há grande diversidade de fenótipos de

câncer de mama, mostrando que, apesar da simplicidade, a glândula mamária é

funcionalmente complexa e molecularmente heterogênea em potencial [13].

Essas células mamárias multipotentes estão diretamente envolvidas com

resistência a quimioterapia e radioterapia, além de recidiva e metástase [14].

1.2 Subtipos de Câncer de mama

Embora existam outros tipos de câncer que acometem a mama, 80% dos

casos são de carcinomas, especialmente ductais, que podem se dividir em subtipos

de acordo com seu padrão de expressão molecular [15, 16].

24

Pelo interesse clínico, comumente são mais exploradas as características

moleculares que permitem diagnóstico, prognóstico e servem de alvo para terapia.

Desta forma, embora saibamos que nos cânceres de mama exista uma vasta gama

de alterações, estes tumores são subdivididos com base no resultado final desta

somatória de alterações, entre aqueles em que ocorre expressão sustentada dos

receptores hormonais como de estrógeno (ER) e progesterona (PR), além de

expressão irregular, incluindo amplificação genômica de um receptor da família dos

fatores de crescimento epidermal (EGFs), chamado Her-2 [17].

A caracterização molecular permite a definição da conduta terapêutica,

disponibilizando alternativas, como o uso dos moduladores seletivos do receptor de

estrógeno, dos quais o tamoxifeno é o mais conhecido ou a inibição do receptor Her-

2, com o anticorpo monoclonal trastuzumab, comercialmente conhecido como

Herceptin [12, 17, 13, 18].

Com base na expressão destes receptores e na sua taxa de proliferação, os

tumores de mama são geralmente classificados como luminal A, luminal B, Her-2

positivos ou triplo-negativos.

O St. Gallen International Expert Consensus 2011 propôs um novo sistema de

classificação para câncer de mama promovendo uma divisão em cinco grupos. De

acordo com a Conferência de 2013, os critérios de identificação dos subtipos de

expressão molecular foram mudados, reconhecendo que a expressão de receptor de

progesterona e os níveis de Ki-67, são importantes para a definição do subtipo

luminal. De acordo com esse critério, os subtipos em questão são definidos como

luminal A quando são ER positivos, HER-2 negativos, apresentam baixo Ki-67 e alta

expressão de PR; luminal B quando são ER positivos, HER-2 negativos, apresentam

alto Ki-67 ou baixo PR; luminal B-like quando são ER positivos, apresentam HER-2

superexpresso ou amplificado, qualquer nível de Ki-67 e qualquer PR; HER-2

positivos, quando apresentam HER-2 superexpresso ou amplificado, mas ausência

de ER e PR e triplo-negativos quando não apresentam nenhum dos três receptores

referidos (ER, PR e HER-2) [19, 20, 21].

Em um estudo utilizando microarrays de DNA, foi feita uma análise do perfil

de expressão gênica geral de tumores ou linhagens pré-classificadas em

determinados subtipos. Através deste perfil, foi possível classificar estes tumores

nestes mesmos subtipos ou em subtipos específicos, independente do seu padrão

25

de expressão de receptores hormonais, mostrando que há muito mais alterações

gênicas do que a simples expressão de um receptor de superfície para determinar a

que subgrupo pertence um tumor [22].

Estes estudos mostram que embora um conjunto de tumores seja classificado

como luminal A, por exemplo, há diversas alterações moleculares que os

diferenciam, explicando a diferente resposta à terapia, dentro de cada subgrupo.

Dada a dificuldade de lidar com a doença metastática, do ponto de vista

terapêutico, um importante determinante do controle do tumor, no caso do câncer de

mama, assim como para a grande maioria dos tumores, é a detecção precoce, pré-

metastatização. Estudos mostram que há lesões benignas da mama que podem ser

consideradas marcadores indicativos de maior propensão de desenvolvimento de

doença maligna [1].

Em casos extremos, quando são identificados na paciente marcadores

genéticos de alterações sabidamente predisponentes ao desenvolvimento de

câncer, como é o caso dos marcadores BRCA-1 e BRCA-2, que se apresentam

mutados em menos de 10% dos cânceres de mama, pode-se recorrer a uma

mastectomia profilática e até a uma ooforectomia, o que estudos não-randomizados

já relataram ser benéfico do ponto de vista de prevenção [23].

A caracterização molecular do tumor pode ser um marcador de prognóstico e

definidor de conduta clínica. Existe atualmente a possibilidade de se fazer análise de

expressão de menos de uma centena de genes, para definir potencial de resposta à

quimioterapia, em alguns tipos específicos de tumores, através de testes como o

MammaPrint e o Oncotype DX, e frequentemente novos indicadores de prognóstico

vêm sendo estudados, como o ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA),

o inibidor do ativador de plasminogênio (PAI-1), a prostaglandina E2 (PGE2), a

atividade de ciclooxigenase (COX), a endoglina (CD105) além de diversos outros [24,

25, 26].

O desenvolvimento de novos marcadores moleculares pode ainda auxiliar no

diagnóstico, complementando as informações obtidas por imagem, permitindo a

diferenciação de lesões benignas e malignas, ou mesmo permitindo a identificação

de moléculas circulantes (biomarcadores), antes mesmo que haja massa tumoral

suficiente para serem detectados pelos métodos tradicionais [27].

26

1.3 Quimioprevenção

A quimioprevenção pode ser definida como o uso de moléculas de origem

natural ou sintética, para reverter, suprimir ou prevenir a progressão de lesões pré-

malignas para o carcinoma invasivo [28].

Pacientes que já foram diagnosticados com lesões benignas que são

marcadores de um possível processo maligno são alvo direto da quimioprevenção,

no entanto, populações inteiras podem se beneficiar, caso sejam encontrados

produtos naturais, comuns na dieta e que apresentem este potencial, podendo ser

utilizados por longos períodos, sem toxicidade [29, 23].

Em 1998, o conceito de quimioprevenção do câncer de mama se tornou uma

realidade com a aprovação pelo Food And Drug Adminstration (EUA), da primeira

geração de moduladores específicos do receptor de estrógeno (SERMs) [30]. O

Tamoxifeno é um SERM com ambos efeitos antagonista e agonista. Na mama, o

tamoxifeno inibe a atividade de estrogênio. No entanto, apresenta atividade similar

ao estrogênio no útero, resultando em hiperplasia endometrial e um risco aumentado

de câncer endometrial [3].

Complementar à ação dos SERMs, foram desenvolvidos os inibidores de

aromatase (AIs), incluindo anastrozol, letrozol e exemestano, que inibem

seletivamente a atividade enzimática da aromatase nos tecidos periféricos

responsáveis pela síntese de estrogênio a partir de androgênio, em mulheres na

pós-menopausa. Anastrozol e letrozol são inibidores não-esteroidais e exemestano é

um inibidor esteroidal com uma diferença na ligação local da enzima aromatase.

Alternativas melhoradas foram desenvolvidas, como por exemplo, o Fulvestrant, um

puro antagonista do ER sem a parcial atividade de agonista, que resulta em redução

significante dos níveis do receptor de estrógeno celulares [19, 31, 32, 33].

Um estudo clínico realizado na década de 90 para demonstrar o efeito de

tamoxifeno na redução do risco de câncer de mama, recrutou cerca de 13.000

mulheres, que foram randomizadas para receber 20mg da droga ou placebo por

cinco anos, e o resultado foi 49% de redução do risco geral, o que é bastante

significativo. Diversos outros estudos se seguiram a esse [34].

Produtos naturais apresentam muitas propriedades importantes e estão

presentes na dieta do ser humano. O papel dos alimentos na manutenção do bom

funcionamento do organismo vem sendo explorado por pesquisadores das mais

27

variadas áreas. Propriedades anti-inflamatórias, antitumorais, antioxidantes ou pró-

oxidantes de produtos naturais como o limoneno, o açafrão, ácidos graxos da família

ômega-3 e ômega-6, além de diversos outros, têm sido exploradas pelo seu papel

regulador de proliferação celular in vitro e in vivo [25, 35, 36, 37, 38, 39].

1.4 Ácidos Graxos Ômega 3 e 6

Os ácidos graxos são constituídos de cadeias carbônicas de vários

tamanhos, contendo um grupo carboxila na extremidade. Estes podem ser saturados

ou insaturados e a posição das dupla-ligações determinam se pertencem à família

ômega-3 ou ômega-6, por exemplo. Quando a primeira dupla-ligação dista 3

carbonos da extremidade oposta à carboxila, este pertence à família ômega-3 e

quando a dupla-ligação dista 6 carbonos da extremidade oposta à carboxila, este

pertence à família ômega-6.

Os seres humanos utilizam fontes dietéticas para obter os precursores destas

famílias, com os quais moléculas mais complexas são sintetizadas. O principal

precursor da família ômega-3 é o ácido linolênico e o principal precursor da família

ômega-6 é o ácido linoleico.

Somos capazes de produzir derivados destes ácidos, utilizando enzimas do

tipo dessaturase e elongase, mas nunca interconvertemos ômega-3 em ômega-6 e

vice-versa. De qualquer modo, a nossa capacidade de modificação destes ácidos é

baixa e diminui com a idade, sendo necessário também ingerir as formas

modificadas através da dieta [40].

Os principais membros da família ômega-3, derivados do ácido linolênico são

o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido docosahexaenóico (DHA), ambos

abundantes em óleo de peixe [41].

Os principais membros da família ômega-6, derivados do ácido linoleico, são

o ácido linoleico conjugado (CLA) e o ácido araquidônico. Embora CLA seja

estruturalmente pertencente à família ômega-6, por apresentar ligações conjugadas

ele não desempenha o mesmo papel que os outros membros da mesma família e

geralmente se classifica funcionalmente como membro da família ômega-3. CLA é

encontrado em leite e derivados, além da carne de ruminantes.

É reconhecido que o CLA exerce um efeito protetor contra a carcinogênese

em diferentes tecidos, particularmente na glândula mamária, sendo extensivamente

28

estudado em modelos in vivo e in vitro, como um possível anticarcinógeno [42, 43]. O

CLA consiste de um grupo de estereoisômeros posicionais e geométricos (cis-trans)

de ácidos linoleicos, formados durante a biohidrogenação do ácido linoleico por

animais ruminantes ou comercialmente sintetizados a partir de óleos vegetais (figura

1). O isômero CLA cis-9-trans-11 (c9, t11) é a forma mais prevalente encontrada em

alimentos derivados de ruminantes (leite, e carne). A citotoxicidade (inibição do

crescimento e indução de morte celular) dos isômeros de CLA em vários modelos

animais e modelos de câncer mamário em cultura celular estão bem estabelecidos.

Os isômeros de CLA c9,t11 e t10,c12 têm sido utilizados em modelo animal para

inibir os tumores mamários, nas fases de iniciação, promoção e progressão, e para

reduzir o crescimento de linhagens de células de mama humana in vitro. Muitas

dessas pesquisas em animais utilizam a mistura dos isômeros de CLA, embora o

trabalho in vitro sugira que os principais isômeros (c9,t11 e t10, c12) são os que

apresentam efeito citotóxico contra as células tumorais. O mecanismo pelo qual os

isômeros de c9,t11 e t10,c12 inibem o crescimento do tumor mamário não está claro

[44, 45, 46]. Quando nos referimos genericamente a CLA, assumimos que há uma

mistura destes dois isômeros principais.

29

Figura 1: Estrutura química do ácido linoleico e dos isômeros c9,t11 e t10,c12.

Ao comparar dietas de 100-200 anos atrás, com nossa dieta ocidental atual,

observamos que houve uma modificação da proporção de ômega-3/6. No passado,

a proporção era de 1:1 e atualmente observamos uma proporção de 1:15. Dado que

estes ácidos graxos exercem importante papel sobre a expressão gênica, podemos

imaginar que o nossa composição molecular é diferente daquele de nossos

ancestrais, devido a esta mudança e inúmeras outras. Minimamente sabemos que

temos mais ácido araquidônico em nossas membranas do que no passado [47].

A primeira constatação de que o tipo de ácido graxo poli-insaturado pode ter

relação com padrões de saúde, foi cerca de 50 anos atrás, quando se observou que

entre os inuites da Groenlândia, que consomem muito peixe, havia menor incidência

de doenças cardiovasculares [48].

Diversos estudos foram realizados desde então, e para a prevenção de

doenças cardiovasculares, está claro o papel da dieta [49, 50, 51]. No entanto, para a

quimioprevenção de câncer, ainda existe bastante dúvida, pois os estudos

epidemiológicos em humanos são discrepantes dos estudos in vitro.

30

Estudos epidemiológicos, realizados principalmente na Europa, mostraram

fraca associação entre a ingestão de ácido linoleico conjugado (CLA) e a incidência

de câncer de mama ou sua metastatização, em estudos do tipo coorte, em que

centenas ou milhares de mulheres foram acompanhadas por aproximadamente sete

anos. No entanto, há uma série de críticas que podem ser feitas sobre estes

estudos, porque alguns se basearam apenas na resposta de questionários sobre

hábitos alimentares para evidenciar a quantidade de CLA e outros ácidos graxos

poli-insaturados ingerida e também não foi feita suplementação, esperando-se

exclusivamente o efeito de CLA contido regularmente nos alimentos [43].

Estes estudos levam em consideração a ingestão de laticínios e carnes de

ruminantes, no caso de CLA, e peixes no caso de derivados do ácido linolênico,

como EPA (ácido eicosapentaenoico) e DHA (ácido docosahexahenoico).

Não podemos nos esquecer que embora presentes na dieta, a frequência

pode ser irregular ou não reportada de maneira adequada, além do que como optou-

se por não fazer suplementação nestes estudos, pode ser que a dose atingida tenha

sido menor do que a geralmente utilizada em estudos in vitro. Um fator a ser levado

em consideração é a possível presença de fatores carcinogênicos, como pesticidas,

encontrados em algumas fontes dietéticas, como o salmão de criadouros [52].

Em relação à suplementação, o ácido gama-linolênico, por exemplo, é

prescrito para casos de eczema atópico na Inglaterra, Irlanda, Dinamarca,

Alemanha, Itália, África do Sul e Austrália. O mesmo é também utilizado para

tratamento de tensão pré-menstrual e mastalgia na Inglaterra e outros países. Em

outros países tem sido utilizado como complemento nutricional [53, 54].

Diferente do que se observou em estudos epidemiológicos com humanos, o

efeito inibitório de ácidos graxos poli-insaturados, como EPA, DHA e CLA sobre o

desenvolvimento e promoção tumoral foi bem estabelecido em modelos murinos de

câncer de mama e também linhagens celulares estabelecidas a partir de tumores

mamários humanos. As dietas provenientes do óleo de peixe diminuem a incidência,

assim como o crescimento e metástases de tumores induzidos quimicamente em

animais [55].

O que se observa quando linhagens celulares estabelecidas de câncer de

mama são tratadas com ácidos graxos poli-insaturados é inibição de proliferação,

seguida de morte celular por apoptose, geralmente acompanhada de formação de

31

espécies reativas de oxigênio (EROS). O mecanismo através do qual ocorre a

inibição de proliferação não está claro, mas uma das hipóteses é a substituição de

lipídeos das membranas celulares pelos lipídeos suplementados ou seus derivados

[56, 57]. Desta maneira, haveria uma substituição do ácido araquidônico,

frequentemente ocupando a posição C2 dos lipídeos da membrana, pelos ácidos

graxos suplementados, que ao serem metabolizados pelas enzimas ciclooxigenase

(COX) e lipoxigenase (LOX), geram produtos diferentes, chamados de resolvinas [58,

59, 60]. Assim, cascatas pró-inflamatórias iniciadas pela produção de prostaglandinas

seriam interrompidas por falta de substrato, mudando o destino da célula em relação

à sua participação em processos inflamatórios e ou tumorigênicos.

Não está claro na literatura se tanto ácidos graxos da família ômega-3 quanto

ômega-6 exercem este mesmo efeito, e como se comportam as células tratadas com

derivados destes. Comumente se encontra trabalhos em que um dado ácido graxo

foi testado em uma linhagem específica, mas não há estudos abrangentes em que

vários ácidos graxos diferentes foram testados em diversas linhagens celulares

diferentes, permitindo uma análise comparativa do efeito. Ainda, há dados

discrepantes, que mostram efeitos opostos, não permitindo que um estudo de

caracterização do mecanismo de ação destas moléculas seja realizado antes de

analisar de maneira comparativa qual o verdadeiro efeito.

Um estudo específico mostrou que a utilização de uma dieta rica em ácido

linoleico estimulou o crescimento e a metastatização de células derivadas de

linhagens tumorais humanas injetadas em camundongos nude, enquanto dietas

proporcionando altos níveis de ácidos graxos ômega-3 exerceram efeitos opostos,

suprimindo a progressão tumoral [61]. A vasta maioria dos estudos utiliza um tipo de

ácido graxo ou outro, não permitindo maiores inferências globais.

De um modo geral, um parâmetro que é frequentemente observado é a

alteração dos níveis de espécies reativas de oxigênio, induzida pelo tratamento com

ácidos graxos poli-insaturados, além de alteração da expressão e atividade das

enzimas do sistema antioxidante.

32

1.5 Espécies Reativas de Oxigênio

Os radicais livres de oxigênio, ou as Espécies Reativas de Oxigênio (EROS)

são produtos naturais do metabolismo, sendo bem conhecidos por apresentar um

papel duplo no sistema celular. EROS apresenta uma redução parcial da molécula

de oxigênio, que compreende espécies de radicais, como ânion superóxido (O2•‾),

radical hidroxila (HO•), carbonato (CO3•‾), peroxil (RO2•), que são radicais livres, e há

espécies não-radicais, como peróxido de hidrogênio (H2O2), cloreto de hidrogênio

(HOCl), ácido graxo hidroperóxidos (FaOOH), aldeídos reativos e oxigênio singlete,

podem ser facilmente reduzidas em espécies contendo elétrons livres [62, 63].

A produção celular de EROS aumentada tem sido sugerida por ser

responsável pela despolarização mitocondrial e consequente morte celular [63].

Células cancerosas são caracterizadas pelo aumento da glicólise aeróbica

(efeito Warburg) e altos níveis de estresse oxidativo, sendo uma consequência de

alterações em várias vias de sinalização, a qual afeta o metabolismo celular e

contribui para a transformação neoplásica e progressão tumoral. Esses níveis de

EROS são neutralizados pelo elevado mecanismo de defesa antioxidante em células

cancerosas [64].

Níveis aumentados de EROS nas células malignas podem também surgir a

partir da alteração ou inativação do sistema de defesa antioxidante composto por

múltiplas enzimas, como o superóxido dismutase (SOD) e aqueles envolvidos no

ciclo de redox glutationa e o ciclo tioredoxina [62, 65].

Os ácidos poliinsaturados n-3 (n-3 PUFAS) exercem citotoxicidade seletiva

contra vários tipos de células tumorais. Múltiplos mecanismos celulares foram

propostos para explicar os efeitos antitumorais de n-3 PUFAS, incluindo a inibição

do ácido araquidônico, gerador de eicosanóides, influencia sobre fatores de

transcrição e expressão gênica, modificação de vias de transdução de sinal, indução

da diferenciação de células cancerosas, e aumento da peroxidação lipídica [65].

Em algumas células, o estresse oxidativo induzido por DHA mostrou

concomitante diminuição de glutationa peroxidase. Já foi observado que a ação de

oxidantes aumenta a morte celular induzida por DHA e os antioxidantes fazem o

oposto, no entanto, isto depende do tipo de célula tumoral, algumas sendo mais

susceptíveis do que outras [56, 65, 66, 67].

33

Deve-se levar em consideração que DHA, por exemplo, leva à formação de

resolvinas, que inibem a apoptose induzida por EROS [59].

Os hormônios esteroides tais como estrógeno, iniciam um papel importante

no desenvolvimento de câncer de mama, o qual está envolvido na carcinogênese,

através da indução de EROS, que é esperado neste tipo de tumor [68, 69].

1.6 Mitocôndria e Câncer

As mitocôndrias são organelas endosimbióticas que caracterizam quaisquer

células eucarióticas, participando em muitos aspectos da fisiologia celular, tais como

produção de ATP, sinalização de Ca2+ intracelular, metabolismo lipídico, produção

de espécies reativas de oxigênio (EROS), ativação da inflamossoma e regulação de

morte celular [70]. As mitocôndrias eliminam células anormais e policia o crescimento

desenfreado das mesmas. Além de serem organelas vitais que abrigam a

maquinaria necessária para executar a fosforilação oxidativa, possuem uma

complexa cadeia de transporte de elétrons. Este processo requer um componente

redutor aeróbico, que vem sob a forma de elétrons transportados por NADH e

FADH2. [71; 72].

O estresse oxidativo parece ser um dos fatores determinantes da

transformação tumoral. A principal via de produção de EROS citotóxico é a

respiração mitocondrial, a sua emissão exacerbada causando a abertura de poros

na membrana interna, gerando inchaço descontrolado da organela e liberação das

proteínas mitocondriais no citosol [71].

A disfunção mitocondrial está associada com o desenvolvimento e progressão

do câncer. Durante a carcinogênese, a sinalização mitocondrial de Ca2+ é

remodelada, comprometendo suas funções, como a evasão de morte celular,

reprogramação metabólica, invasão e metástase [70].

. As espécies reativas de oxigênio (EROS) são produtos do metabolismo

aeróbico e importantes mediadores de uma série de processos celulares, incluindo

adesão celular, apoptose e sistema imune, assim como crescimento e diferenciação

celular, além de serem importantes mensageiros secundários na sinalização

intracelular. Existe uma proporcionalidade entre a produção e eliminação de EROS,

e a interrupção desta proporcionalidade leva ao acúmulo aberrante de EROS, o que

34

contribui para o desenvolvimento de inúmeras doenças como distúrbios neurológicos

e câncer [73].

Os radicais superóxidos podem participar da produção de outros radicais,

incluindo as espécies reativas de nitrogênio (ERN), a peroxinitrito. EROS pode

alterar a função celular por afetar a atividade de inúmeras proteínas, incluindo

MAPK, serina/treonina quinases, tirosina e serina/treonina fosfatases, e múltiplos

fatores de transcrição, incluindo AP-1, NFκB, HIF e p-53. Enzimas localizadas na

mitocôndria são suscetíveis a ataque por EROS devido a sua proximidade do local

de produção. Mudanças na atividade metabólica podem ter consequências na

homeostasia da célula. EROS é importante para a atividade celular normal e a

modulação da concentração basal seja por aumento da produção, a partir de vias

endógenas ou exógenas, ou diminuição da capacidade antioxidante celular ou uma

combinação destes, pode ter um efeito contribuinte para a origem de doenças.

A superóxido dismutase dependente de manganes (MnSOD) é a principal

enzima eliminadora de EROS nas células, devido à sua localização na mitocôndria.

A função alterada ou a expressão de MnSOD pode ter consequencias notáveis

sobre a função mitocondrial e a saúde geral das células, devido aos danos

oxidativos de vários processos metabólicos, levando ao desenvolvimento de

diferentes doenças [73].

1.7 Morte Celular

Apoptose é o suicídio celular ou morte celular programada a qual é mediada

pela ativação de via intracelular. A relação de apoptose e câncer tem sido enfatizada

e evidências sugerem que o processo de transformação neoplásica, progressão e

metástase envolvem alterações nesta via. Há duas vias de sinalização, a extrínseca

que é ativada por receptores da superfamília do fator de necrose tumoral, e a

intrínseca, que é iniciada por drogas antitumorais, hipóxia, ou via indução de

oncogenes, que ativa a via mitocondrial [74].

A morte celular por apoptose é um fenômeno complexo caracterizado por

condensação da cromatina, fragmentação do DNA e formação dos corpos

apoptóticos, sendo que a morte e proliferação celular estão intimamente conectadas.

Alguns reguladores do ciclo celular podem influenciar tanto a divisão quanto a morte

35

celular programada, devido às funções de c-Myc, p53, pRb, Ras, PKA, PKC, Bcl-2,

ciclinas e CK1. A fosforilação e desfosforilação de proteínas controlada por quinases

e fosfatases constitui um dos principais mecanismos que regulam uma variedade de

processos celulares incluindo a morte celular [43, 44].

Necrose secundária é uma morte celular, que pode ocorrer pela perda de

glutationa citoplasmática, que seria um dos eventos característicos de morte celular

por apoptose, através da influência na capacidade redox, tornando-a intolerante à

presença de agentes oxidantes. Quando há uma diminuição nos níveis de glutationa

mitocondrial, a produção de ATP é afetada e a célula sofre “necrose secundária”

(apoptose tardia). Estudos demostraram que a morte celular por apoptose pode

sofrer uma transição para a morte por necrose durante uma situação de estresse

oxidativo através de dois mecanismos principais. O primeiro é desencadeado pela

inativação de caspases devido à oxidação do grupo tiol de seus sítios ativos por

agentes oxidantes. No segundo mecanismo ocorre uma redução nos níveis de ATP,

devido à diminuição de função mitocondrial causada pela ação de agentes

oxidantes, levando à liberação de citocromo C e alteração de permeabilidade de

membrana mitocondrial [75,76].

No caso da morte celular induzida pelo tratamento com ácidos graxos poli-

insaturados, ao mesmo tempo em que há ativação de apoptose, o que em alguns

artigos é mostrado como sendo mediado por EROS, mas não sempre, há inibição de

vias pró-proliferação clássica, como as mediadas por MAPK, PI3K/Akt e outras [32, 34].

Já foi demonstrado que DHA e EPA, isolados ou em combinação, podem

induzir apoptose em uma variedade de linhagens celulares, incluindo mama [77].

Quando há peroxidação lipídica, há aumento da expressão do receptor de

morte (death receptor) e supressão do inibidor de apoptose Bcl-2, ambos eventos

induzindo apoptose. A formação de EROS pode alterar a permeabilidade da

membrana mitocondrial e também lesar DNA, levando as células à morte, mas neste

caso, tanto membros da família ômega-3 quanto ômega-6 teriam o mesmo efeito, o

que é diferente do descrito na literatura, sugerindo que a formação de EROS não

seja o único mecanismo indutor de morte celular nesse caso.

36

1.8 Modelos Celulares e Estratégia de Estudo

Encontrar modelos in vitro para o estudo de tumores é algo muito valioso, pois

permite que inferências de causa e efeito sejam feitas, no entanto, temos que estar

cientes da limitação, pois na maioria das vezes temos apenas um tipo celular e fica

impossível contar com as múltiplas interações que existem entre as células tumorais

e outras do entorno.

Também é difícil termos uma linhagem representativa de tumores in vivo, uma

vez que, embora estas células sejam obtidas a partir de tumores, o tumor é sempre

heterogêneo, apresentando diferentes composições, que não são representadas em

cultura.

No entanto, embora seja uma representação simplificada da realidade, é a

que dispomos e inúmeras descobertas realizadas em cultura já foram confirmadas

em sistemas mais complexos.

Graças a trabalhos significativos de caracterização de linhagens, hoje temos

boa correlação entre estas e os tumores clínicos que representam [12]. Logo,

encontramos linhagens representativas de tumores in situ, alguns pouco invasivos,

outros altamente invasivos, uns não metastáticos, outros altamente metastáticos,

alguns representantes de tumores positivos para os receptores hormonais e Her-2,

outros não, ou seja, toda a gama possível de tumores encontrados na clínica estão

representados simplificadamente na forma de linhagens celulares [41].

As linhagens de células neoplásicas de mama são utilizadas mundialmente

com o intuito de investigar a patobiologia desta doença, revelar e caracterizar novas

terapias. Avanços envolvendo linhagens celulares incluem uma relativa facilidade de

manipulação farmacológica e genética e a possibilidade de testar moléculas e

procedimentos em ampla variedade de modelos funcionais com relativa

caracterização clínica. No desenvolvimento deste trabalho, foram utilizadas as

linhagens MCF-7, MDA-MB-231 e SK-BR-3, correspondendo, respectivamente, ao

câncer de mama luminal A, triplo negativo e HER-2+.

Em paralelo, foram feitos estudos com a linhagem Hs578t, correspondente a

um fibrossarcoma e com a linhagem MDA-MB-435, correspondente a um melanoma

metastático em mama. A ideia de incluir estas linhagens foi verificar se os resultados

37

observados em carcinomas mamários também são comuns a outros tumores que

acometem a mama.

Os ácidos graxos testados foram os dois precursores das famílias ômega-3 e

ômega-6, respectivamente os ácidos linolênico e linoleico e duas preparações

contendo seus derivados metabolizados em animal, uma sendo uma mistura de

isômeros de CLA e a outra um derivado de óleo de peixe, rico em EPA e DHA.

Desta forma, pudemos observar o efeito de ácidos graxos poli-insaturados

pertencentes às duas famílias de interesse (ômega-3 e ômega-6), em diferentes

concentrações, tanto precursores quanto derivados, sobre linhagens celulares

representativas dos três principais carcinomas mamários encontrados na clínica,

além de outras duas linhagens derivadas de tumores mamários não-carcinoma.

38

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Analisar de maneira comparativa o efeito de ácidos graxos das famílias

ômega-3 e ômega-6, incluindo seus precursores e derivados, em diferentes

concentrações, sobre linhagens celulares representativas de tumores de grande

importância clínica, de modo a centralizar informações, permitindo conclusões mais

globais que sirvam de base para a definição de projetos subsequentes de

caracterização molecular de mecanismos antitumorais.

2.2 Objetivos Específicos

Verificar o potencial antitumoral de cada um dos ácidos graxos

testados, em cada linhagem celular;

Verificar se o efeito anti-proliferativo é exclusivo da família ômega-3 ou

ômega-6, quando utilizados nas mesmas condições;

Verificar se células tumorais com perfis de expressão diferentes

respondem da mesma maneira aos ácidos graxos;

Verificar o efeito mais tardio (9 dias) do tratamento com estes ácidos

graxos, uma vez que a maioria dos resultados existentes são de

períodos curtos;

Verificar se o tratamento com ácidos graxos de ambas famílias

desencadeia a formação de espécies reativas de oxigênio ou altera a

expressão e atividade de enzimas antioxidantes;

Verificar se o mecanismo principal de morte celular observado é a

apoptose.

39

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Descrição da Linhagem Celular

As linhagens celulares abaixo são todas estabelecidas em cultura

(imortalizadas), disponíveis para compra na ATCC (American Type Culture

Collection), e foram doadas para a realização deste trabalho pela Profa. Dra. Mari

Sogayar, do Instituto de Química da USP.

MDA-MB231 – Linhagem derivada de efusão pleural metastática de um

adenocarcioma de glândula mamária humana, de uma mulher caucasiana de 51

anos. Apresenta uma aneuploidia (número modal de cromossomos = 64, variação =

52 a 68). Expressa receptor EGF e TGF-α, mas é negativo para os receptores de

estrógeno e progesterona. Expressa o oncogene WNT7B. Essa linhagem é

tumorigênica em animais. Tipo Celular epitelial, com morfologia epitelial e aspecto

fusiforme. Cresce em monocamada. Cultivada em RPMI suplementado com 10% de

soro bovino fetal. [78; 79].

MCF-7 – Linhagem derivada da efusão pleural de um adenocarcinoma ductal da

glândula mamária humana, de uma mulher caucasiana de 69 anos. O número de

cromossomos varia de hipertriploidia para hipotetraploidia. Número modal de

cromossomos = 82; = 66 a 87. Expressa os genes das proteínas ligantes de IGF

(IGFBP2, IGFBP4, e IGFBP5); expressa o oncogene WNT7B, além do antígeno do

grupo sanguíneo tipo O e fator Rh+, e receptor de estrógeno. Essa linhagem celular

não é tumorigênica. Tipo e morfologia epitelial. Cultivada em DMEM suplementado

com 10% de soro bovino fetal [80, 81].

SKBR-3 – Linhagem derivada da efusão pleural de um adenocarcinoma de glândula

mamária, e uma mulher de 43 anos. O número de cromossomos apresenta uma

hipertriploidia. Número modal de cromossomos = 84, ocorrendo em 34% das células.

Apresenta expressão antigênica do grupo sanguíneo tipo A e fator Rh+;

superexpressa o gene HER2/c-erb-2. Cultivada em DMEM suplementado com 10%

de soro bovino fetal [82].

40

Hs578t – Linhagem derivada de carcinoma de glândula mamária humana de uma

mulher caucasiana de 74 anos. Trata-se de uma hipotriploidia com um número

modal de 59. Não expressa os receptores de estrógeno, progesterona e fator de

crescimento epidérmico humano 2 (HER-2). Tipo celular fibroblastóide. Morfologia

celular epitelial. Cresce em monocamada e em suspensão, em meio semi-sólido,

mas não é tumorigênica em camundongos nude [83]. Cultivado em DMEM

suplementado cm 10% de soro bovino fetal.

MDA-MB435 – Previamente classificada como linhagem derivada de uma efusão

pleural de adenocarcinoma de humano, foi recentemente reclassificada como

melanócito/melanoma, obtido de uma mulher caucasiana de 31 anos de idade,

após estudos de expressão por microarray. Apresenta aneuploidia número modal

de cromossomos = 56, variação = 55 a 62). Expressa o gene da tubulina e actina

e negativo para o receptor de estrógeno e progesterona e HER-2. Essa linhagem

celular não é tumorigênica em animais, mas cresce em suspensão em meio-semi-

sólido. Tipo celular melanócito, melanoma, com morfologia celular fusiforme.

Cultivada em RPMI suplementado com 10% d soro bovino fetal [84; 85].

41

3.2 Reagentes

a) Ácido Linoleico com Albumina 5mL, solução estoque 3mM, obtido da empresa

Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA).

b) Ácido Linoleico Conjugado (CLA) 250mg, solução estoque 100mM, preparado em

hexano a partir do óleo puro obtido da empresa Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA).

c) Ácido Linolênico 500mg, solução estoque 100mM, preparado em hexano a partir

do óleo puro obtido da empresa Sigma- Aldrich (Saint Louis, USA).

d) Mistura EPA/DHA na concentração estoque 200mg/100mg, preparada em

hexano, a partir de cápsulas da empresa Herbarium.

e) Albumina, obtido da empresa Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA).

f) Hexano - obtido da empresa Qhemis (BRA)

g) DMEM alta glicose sem L-glutamina 1X, obtido da empresa Lifetechnologies

(Califórnia – USA)

h) RPMI com L-glutamina 1X, obtido da empresa Lifetechnologies (Califórnia – USA)

i) Tripsina 0,25% com EDTA tetrasódico 1X, obtido da empresa Lifetechnologies

(Califórnia – USA)

j) Soro Bovino Fetal obtido da empresa Cultilab (Campinas - BRA)

k) PBSA (NaCl; KCl; Na2HPO4 e KH2PO4 – obtidos da empresa Sigma-Aldrich (Saint

Louis, USA).

l) Formol 37% - obtido da empresa Synth (São Paulo, BRA)

3.3 Cultivo celular

As células foram cultivadas em frascos do tipo T25 e T75 para manutenção

das linhagens e expansão para os experimentos. Os meios de cultura utilizados

foram os especificados para cada linhagem celular.

As células foram mantidas em estufa com 5,0% de CO2 e temperatura de

37ºC. Para repique e expansão, a monocamada celular foi lavada com PBSA e

após remoção do PBSA, uma alíquota de tripsina foi adicionada para soltar as

células da parede da garrafa, durante cerca de 3 minutos. Para inativação da

tripsina, foi adicionado meio de cultura suplementado com 10% de soro bovino fetal.

42

Assim as células foram redistribuídas em placas ou em frascos de cultura, de acordo

com a necessidade.

3.4 Congelamento celular

O congelamento celular foi realizado para manutenção de estoque das

linhagens celulares. Para tanto, após a tripsinização, como descrito acima no item

“cultivo celular”, a estas foi adicionado DMSO para concentração final de 10% e a

suspensão foi transferida para criotubos e congelada em freezer -80º diretamente ou

em etapas, de acordo com as exigências de cada linhagem.

3.5 Ensaio de Viabilidade Celular (ensaio MTT)

O ensaio de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) foi

realizado em placa de 96 poços, em triplicata utilizando como um dos controles

apenas as células sem nenhum tratamento, como outro controle, as células tratadas

com o veículo hexano ou albumina, em igual volume usado para diluir os ácidos

graxos (EPA/DHA, CLA, linolênico e linoleico) nas concentrações de 50µM, 100µM e

200µM. As células foram plaqueadas em meio de cultura próprio, suplementado com

5% de soro bovino fetal e mantidas em estufa para adesão da monocamada. Após

24 horas, o meio foi trocado por outro contendo uma concentração de 0,2% de SBF,

para carenciamento e sincronização do ciclo celular por mais 24 horas. Após este

período, as células foram tratadas com os ácidos graxos por 24 horas.

Quatro horas antes do término da incubação, foram adicionados a cada poço,

10µL de MTT, as placas foram envolvidas com papel alumínio e incubadas até o

momento da leitura.

Ao término do tempo de incubação, os sobrenadantes foram retirados e foram

adicionados 100µL de DMSO por poço, sendo as placas incubadas a 37ºC na

estufa novamente, por uma hora. Após este período, a leitura da absorbância foi

feita a 595nm.

43

3.6 Avaliação das alterações fenotípicas induzidas pelo tratamento

As alterações morfológicas e funcionais sofridas pelas células por efeito dos

tratamentos, como distribuição em monocamada, empilhamento, refringência e

outros parâmetros, foram observadas sob microscópio óptico invertido (Primo Vert –

Zeiss - Alemanha) e as imagens foram capturadas (Axion Cam – ERC 5s) para

documentação e análise.

3.7 Determinação das curvas de crescimento em substrato sólido

O efeito dos ácidos graxos sobre a taxa de proliferação celular foi observado

através da determinação das curvas de crescimento em substrato sólido. Para tanto,

foi feito um plaqueamento com número definido de células (5 x 103), em duplicata,

para coleta nos dias 0, 1, 3, 5, 7 e 9, em placas de 24 poços, após a padronização

da quantidade de células a ser utilizada no dia 0, para cada tipo de placa. Foram

plaqueadas células para os dois controles negativos (nenhum tratamento e

tratamento com veículo de diluição dos ácidos graxos) e para o tratamento com cada

ácido graxo, nas concentraçãoes de 50µM, 100µM e 200µM. As células foram

previamente subcultivadas em frascos T75cm2, tripsinizadas e contadas em câmara

de Neubauer. A média de quatro quadrantes da câmara foi feita para definir a média

do número de células, que multiplicado por 104 e o fator de diluição, forneceu o

número de células por ml de solução. Em cada ponto da curva, a duplicata foi

tripsinizada, fixada em meio de cultura suplementado com 10% de soro bovino fetal

contendo formaldeído 10% e imediatamente contada manualmente utilizando a

câmara de Neubauer ou um contador automático na fase de padronização para

comparação. Os resultados foram utilizados para traçar gráficos de linha no

programa Excel e GraphPad Prism 5. O elevado número de condições (linhagens,

ácidos graxos, concentrações e controles) não permitiu a realização deste

experimento em número maior do que duplicata, dificultando análise estatística.

Portanto, a análise inicial deste experimento foi apenas descritiva e não quantitativa.

Os pontos de interesse observados nestas curvas, isto é, os pontos a partir dos

quais havia evidente inibição de proliferação, foram repetidos em quadruplicata, para

análise estatística.

44

3.8 Crescimento em suspensão de agarose

Para este experimento, é necessário preparar uma agarose dura (0,6%) para

revestir o fundo da placa e impedir contato das células com a matriz sólida e uma

agarose mole (0,3%) em meio à qual as células crescem. Para tanto, foi preparado o

meio de cultura 2X concentrado e agarose nas concentrações 1,2% e 0,6% em água

bidestilada Esta preparação de agarose foi autoclavada antes do uso. Após preparo,

esta agarose foi derretida e mantida em banho-maria a 45ºC, juntamente com o

meio de cultura (2x) e o soro bovino fetal. A concentração maior de agarose, foi

utilizada para mistura com meio de cultura 2X para preparação da agarose dura

(0,6%) em meio de cultura 1X, que foi distribuída no volume de 0,5mL/poço em uma

placa de 24 poços. Foram preparadas suspensões das células de interesse, de

modo que foram plaqueadas sobre esta agarose dura o número de 103 e 104 células

por poço. Imediatamente após o plaqueamento estas células foram cobertas pela

agarose mole, preparada da mesma forma que a anterior, porém com concentração

final de agarose de 0,3% em meio de cultura 1X. Estas placas foram mantidas na

estufa de CO2 a 37ºC, com freqüente troca de meio líquido suplementado com soro

e adição dos ácidos graxos de interesse (a cada 2 ou 3 dias, conforme indicador de

pH), para avaliar a influência destes na formação de colônias celulares, o que é um

indicativo do potencial tumorigênico das células nas dadas condições.

3.9 Avaliação do Potencial de Migração pela técnica de “Scratch”

Para avaliar o potencial de migração das células sob o efeito dos ácidos

graxos, foi feito o plaqueamento numa densidade celular de 5x104 células em placa

de 6 poços e foram mantidas em estufa de CO2 a 37ºC até que fosse obtida uma

confluência de 70%, sendo o meio trocado a cada três dias. Após atingir a

confluência desejada, foi realizada a remoção das células de uma faixa em cruz da

placa, com o auxílio de uma ponteira estéril em cada poço e as culturas foram

tratadas com os ácidos graxos ou veículo. A cada três dias, o meio destas células foi

trocado e foram obtidas as imagens desta área de remoção a cada dia de

tratamento, por uma semana, para verificar o preenchimento da área com células

migrando.

45

3.10 Imunocitoquímica para detecção de Superóxido Dismutase 2

(SOD2)

As linhagens celulares foram tratadas por 24 horas com os ácidos graxos

EPA/DHA, CLA, ácido linolênico e ácido linoleico com albumina na concentração de

100µM. Após o período de tratamento, as células foram lavadas duas vezes com

PBSA, e adicionou-se tripsina para que as células soltassem da garrafa, e então o

volume de células foi transferido para um tubo cônico de 15mL e centrifugado a

1300 rpm por 5 minutos. Foram realizadas duas lavagens com PBSA, sendo que na

última o pellet foi ressuspendido em PBSA e transferido para um tubo de

microcentrífuga. Em seguida, foi adicionado 1 mL de formol tamponado, o qual foi

trocado após 24 horas. No dia seguinte da última troca de formol tamponado, as

amostras foram centrifugadas por um minuto a 4000 rpm. O sobrenadante foi

retirado e foi adicionado um 1mL de etanol 70% para incubação por 10 minutos.

Após esse período, o tubo foi centrifugado novamente por 1 minuto a 4000 rpm. O

sobrenadante foi descartado e foi adicionado 1mL de etanol 96% por 10 minutos, o

tubo sendo centrifugado por um minuto a 4000 rpm novamente. O sobrenadante foi

descartado e foi adicionado 1mL de etanol 100% para incubação por 10 minutos. As

amostras foram centrifugadas por um minuto a 4000 rpm, o sobrenadante foi

descartado e os passos 96% e 100% foram repetidos mais duas vezes.

Posteriormente, foi adicionado 1mL de xilol para incubação por 15 minutos, e após

esse período, as amostras foram centrifugadas por um minuto a 4000 rpm. Esse

passo foi repetido mais uma vez. Finalmente, o sobrenadante foi descartado e foi

adicionado 1 mL de parafina líquida à amostra, para incubação por 15 minutos. Após

este período de incubação, foi descartada a parafina líquida, e então esta etapa foi

repetida por mais duas vezes. Após essas duas passagens, foi adicionado 1 mL de

parafina líquida e deixou-se solidificar por cerca de 24 horas. No dia seguinte, as

amostras foram colocadas no freezer por 20 minutos, o tubo foi cortado para liberar

o cilindro de parafina e a região contendo o pellet foi emblocada em parafina líquida

como se fosse um tecido. Após emblocamento e secagem, as amostras foram

cortadas em micrótomo na espessura de 4µm e os cortes montados em lâminas de

microscopia, para ensaio de imunocitoquímica. As lâminas foram desparafinizadas

em estufa a 65ºC por uma hora e então tratadas duas vezes por 10 minutos em xilol

46

por dois períodos de incubação, para remover totalmente a parafina. Em seguida, as

lâminas foram incubadas por 10 minutos no etanol 100%, por 5 minutos no etanol

95%, por 5 minutos no etanol 70% por 5 minutos e lavar 2 vezes por 5 minutos em

água deionizada. A próxima etapa foi colocar as lâminas no citrato de sódio 10mM

(pH 6) por 10 minutos em 95ºC em banho-maria. Foram retiradas do banho-maria e

deixadas esfriar por 20 minutos em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas

mergulhando-as 10 vezes em água destilada. As etapas seguintes foram realizadas

utilizando-se o kit Novolink™ Polymer Detection Systems (Leica Biosystems,

Newcastle – UK) de acordo com as instruções do fabricante. Inicialmente, foi feito o

bloqueio da peroxidase endógena (Peroxidase Block - peróxido de hidrogénio a 3–

4%(v/v), Leica Biosystems, Newcastle, UK) por 5 minutos, seguido por duas etapas

de lavagem em PBS (pH 7.4) por 5 minutos. Posteriormente, foi adicionado o

bloqueio das ligações inespecíficas (Protein Block - Caseína a 0,4%, Leica

Biosystems, Newcastle, UK), por 5 minutos, e então as lâminas foram lavadas duas

vezes em PBS (pH 7.4) por 5 minutos. Após as lavagens, foi adicionado o anticorpo

primário anti-SOD2 (abcam ab13533-USA) na concentração 1:3000 e as lâminas

foram incubadas de um dia para outro, em câmara úmida a 4ºC. No dia seguinte, as

lâminas forma lavadas duas vezes por 5 minutos em PBS (pH 7.4) e foi adicionado

um reagente contendo anticorpos anti-Fc de camundongo, para que anticorpos

primários feitos em camundongos pudessem ser detectados ao final da reação (Post

Primary – IgG de coelho anti-Fc de camundongo, Leica Biosystems, Newcastle, UK).

As lâminas foram incubadas por 30 minutos a temperatura ambiente e lavadas duas

vezes em PBS (pH 7.4). Foi adicionado, então, o anticorpo secundário anti-Fc de

coelho marcado com peroxidase (Novolink™ Polymer- Poly-HRP-IgG anti-coelho

(<25 μg/mL), Leica Biosystems, Newcastle, UK) e as lâminas incubadas por 30

minutos a temperatura ambiente. Estas foram, então enxaguadas duas vezes em

PBS por 5 minutos, sob agitação leve. Após essas duas lavagens, foi aplicado o

cromógeno 3,3’-diaminobenzidina (DAB) (DAB Chromogen, Leica Biosystems,

Newcastle, UK), diuído em tampão de DAB (Novolink™ DAB Substrate Buffer –

solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio ˂ 0,1%, Leica Biosystems,

Newcastle, UK) por 1 minuto e 30 segundos e então, as lâminas foram lavadas com

água destilada para interromper a coloração. Em seguida foi feita a contra-coloração

com hematoxilina (Merck), por 40 segundos, e após este período, as lâminas foram

47

lavadas em água abundante. Foi feita a desidratação das laminas mergulhando-as

10 vezes em etanol 70%, etanol 95%, etanol 100%, Xilol 1, Xilo 2 e Xilol de

montagem. Para montar as lâminas foi adicionada uma gota de Entellan ou

Permount e estas foram cobertas com a lamínula para análise ao microscópio. Este

ensaio foi feito em colaboração com a Dra. Lara Termini do INCT-HPV da Santa

Casa de São Paulo.

3.11 Análise das Lâminas após imunicitoquimica

As colorações citoquímicas foram analisadas com o uso do microscópio Nikon

Eclipse E-600. Para determinar a quantidade de SOD2, foram escolhidos quatro

campos aleatórios, e cada região foi determinada subtraindo-se os valores da

quantidade total de marcação da região que não expressou a enzima. As

imunomarcações foram quantificadas por densidade óptica relativa (ROD), usando-

se um sistema MCID de análise de imagens (Interfocus Europe, UK).

3.12 – Atividade de Superóxido Dismutase (SOD)

Preparação básica para suspensão de citoplasma celular (SCC)

Células foram cultivadas para obter-se a quantidade de 107 e então foram

suspendidas em 5mL de PBS e sonicadas por três pulsos de 30 segundos cada. Os

tubos foram centrifugados a 3000g por três minutos e o sobrenadante armazenado

como citoplasma e o pellet como membrana. A enzima superóxido dismutase é uma

metaloproteína que catalisa a dismutação do ânion superóxido (O2-.) em peróxido de

hidrogênio (H2O2).Três isoformas da SOD são encontradas: a Cu/Zn-SOD, a Mg-

SOD e a Fe-SOD, sendo que apenas a Fe-SOD não é encontrada em metazoários.

A Cu/Zn-SOD e a Mg-SOD possuem diferentes localizações celulares, porém no

presente trabalho a atividade das duas isoformas foi analisada em conjunto.

Método NADH-Metasulfato de fenazina para placa de 96 poços.

Reagentes:

Tampão fosfato 0,05M pH7,4 com EDTA 1mM

NBT (nitro blue tetrazolium) - Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA).........2,0 mg p/ 1 mL

Tampão

48

NADH-Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA)..........................................2,5 mg/ 1 mL

Tampão

PMS (metasulfato de fenazina) (50x) - Sigma-Aldrich (Saint Louis, EUA)....2,0 mg/

1mL Tampão

Para o ensaio foram destinados poços para reação livre, amostras e branco.

Para a reação livre, foram adicionados 220µL de tampão fosfato 0,05M + 5µL de

NBT + 5µL de NADH + 10µL de PMS por poço. As amostras foram analisadas em

triplicata. Para estas foram adicionados 200µL de tampão fosfato + 20µL da amostra

+ 5µL de NBT + 5µL de NADH + 10µL de PMS por poço. Para o branco foi

adicionado a mesma quantidade que o da reação livre menos o PMS. Foi feito o

monitoramento da cinética em 560nm por 3 minutos.

3.13 – Espécies Reativas de Oxigênio

Para avaliar a quantidade de Espécie Reativa de Oxigênio produzida pelas

células, estas foram plaqueadas na densidade de 3x105 células/mL, e mantidas em

incubadora a 37ºC com 5% de CO2. As linhagens foram tratadas por 24 e 48 horas

com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA, ácido linolênico e ácido linoleico com

albumina e seus respectivos veículos (hexano e albumina) na concentração de

100µM e 200µM.

Após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS,

tripsinizadas e passadas para tubo eppendorf de 2mL, sendo centrifugados por

2000rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e lavado mais uma vez com

PBSA a 2000rpm por 5 minutos. Após as lavagens, o Dihidroetídeo (DHE) foi

adicionado e incubado por 45 minutos em estufa a 37ºC, protegido da luz. As células

foram lavadas com PBS e centrifugadas a 2000rpm por 5 minutos. Foram

adicionados 200µL de PBS e realizada a leitura no citômetro de fluxo, no filtro FITC

excitação de 488nm e emissão de 525nm.

3.14 Morte Celular por Apoptose

As células foram cultivadas em placas de 6 poços em densidade celular de

5x103/mL, e mantidas em incubadora a 37ºC com 5% de CO2. A linhagem celular

49

MDA-MB-231 foi tratada por 8 dias na concentração de 100µM e por 24 horas na

concentração de 200µM com os ácidos EPA/DHA, CLA, ácido linolênico e ácido

linoleico com albumina e seus respectivos veículos (hexano e albumina). A linhagem

SKBR-3 foi tratada por 8 dias nas concentrações de 100µM e 200µM para o CLA e

por 24 horas nas concentrações de 100µM e 200µM para os ácidos EPA/DHA e

ácido linolênico.

Após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS,

tripsinizadas e passadas para tubo eppendorf de 2mL, sendo centrifugados por

2000rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet de células foi

lavado mais uma vez com PBSA gelado a 2000rpm por 5 minutos. Após as

lavagens, foram adicionadas anexina V e iodeto de propídeo (PI) na concentração

de 100µg/mL e incubadas por 15 minutos em temperatura ambiente, protegido da

luz. Após o período de incubação, foram adicionados 200µL por amostra do tampão

de ligação de anexina, estas foram homogeneizadas cuidadosamente e as amostras

foram colocadas no gelo, até a realização da leitura. As células foram analisadas em

citometria de fluxo, na fluorescência de 530nm, utilizando a excitação de 488nm.

3.15 Análise Estatística dos Dados

Os resultados foram expressos como média ± desvio-padrão das médias.

Quando o número de observações era suficiente, foi feita Anova de uma via e Anova

de duas vias com pós-teste de Bonferroni. Somente valores para p menor do que

0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

50

4. Resultados

4.1 Preparação da solução de ácidos graxos

Na literatura há referência de utilização de etanol e hexano como solvente

para diluição dos ácidos graxos. A estabilidade da solução preparada com estes dois

solventes foi testada, com base em separação de fase e miscibilidade no meio de

cultura. Embora etanol seja potencialmente menos tóxico do que hexano para as

células, ao diluir os ácidos graxos em etanol e deixar a solução em repouso por 1

hora, ocorreu separação de fase entre a fração oleosa e a fração aquosa,

comprometendo a reprodutibilidade dos experimentos. Nas soluções preparadas em

hexano, não ocorre separação ou formação de gotículas de óleo no meio de cultura,

portanto as soluções estoque foram preparadas nesse solvente, com exceção do

ácido linoleico, que foi adquirido em um tampão fosfato contendo albumina.

Para diminuir a interferência do solvente no sistema, foram preparados

estoques de solução, na concentração de 100mM, minimizando o volume de

estoque a ser utilizado nas soluções de trabalho 50µM, 100µM e 200µM. O maior

volume de hexano utilizado, para a concentração de 200µM, equivale a 0,2% (v/v)

em meio de cultura.

No caso de EPA/DHA, como foi utilizado óleo de peixe como fonte, a solução

estoque foi preparada com base na concentração de EPA, de modo a gerar

soluções de trabalho 50µM, 100µM e 200µM deste. A solução estoque apresenta

132mM de EPA e 46mM de DHA.

Como controle, foram utilizados os mesmos volumes de hexano ou solução

tampão contendo albumina, conforme o ácido graxo testado.

4.2 Padronização da Curva de Crescimento em Substrato Sólido

Para definir o número de células a serem plaqueadas no dia zero da curva de

crescimento, foi feito um teste com duas quantidades em dois tipos de placas

diferentes. Foram utilizadas placas de 24 poços e placas de 12 poços. Nestas duas

foram plaqueadas 5x103, 1x104 ou 2x104 células, no dia zero, e estas foram

acompanhadas por nove dias, para verificar se havia saturação da densidade celular

antes do período completo de avaliação. Há uma dificuldade técnica ao se analisar

51

proliferação em pontos tardios, acima de 7 dias, sem nenhuma influência de

saturação, pois para esta não ocorrer por volta do dia 9, é necessário partir de um

plaqueamento inicial pouco denso, que impediria a proliferação, dado que células

em muito baixa densidade não encontram estímulo parácrino para proliferar.

Avaliando as curvas de proliferação (Figura 1) e também a densidade celular

em cada dia, microscopicamente (Figura 2), observou-se que não há saturação nas

condições testadas, todas podendo ser utilizadas e optou-se pela concentração de

5x103 células por poço, na placa de 24 poços, por necessitar de menos células na

expansão e permitir análise em maior escala do que na placa de 12 poços.

A contagem de células foi feita em câmara de Neubauer, manualmente, e em

contador automático (Casy Cell Counter and Analyzer, da Roche). Uma comparação

dos resultados obtidos no contador automático e na câmara de Neubauer mostrou

que não há diferença em valores absolutos ou reprodutibilidade entre os dois

métodos e por conveniência, a contagem manual passou a ser utilizada

exclusivamente, já que o contador automático se encontra no laboratório de um

colaborador, na USP.

52

Figura 2: Análise gráfica da duplicata da curva de crescimento de MDA-MB-231 em diferentes placas (24 e 12 poços), partindo de diferentes inóculos (5X103, 1X104 e 2X104), para padronização das condições a serem utilizadas na curva de crescimento.

53

Figura 3: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X,

da linhagem MDA-MB-231 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9), plaqueada na densidade celular de 5x103 em placa de 24 poços

54

. 4.3. Efeito do tratamento com ácidos graxos sobre as curvas de

crescimento em substrato sólido das diferentes linhagens celulares

Para garantir a correta avaliação do efeito dos ácidos graxos sobre a

proliferação das células, inclusive o possível efeito de saturação no dia 9, em todos

os tratamentos, foram analisados em paralelo, dois controles, um deles consistindo

de células sem nenhum tratamento, recebendo apenas trocas regulares de meio de

cultura e o outro controle, sendo tratado com volumes equivalentes de veículo

diluído em meio.

Nas figuras de 2 a 10, pode-se observar como varia a densidade celular ao

longo dos dias de preparo da curva, para cada linhagem celular estudada, em três

condições diferentes, como exemplo (apenas meio de cultura, veículo e EPA/DHA

na concentração 200μM.

Observe nas figuras de 11 a 16, o comportamento das células nas três

condições padrão de manutenção: apenas meio de cultura, meio de cultura com

veículo e meio de cultura com diferentes ácidos graxos (ácido linoleico, ácido

linolênico, EPA/DHA e CLA) em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM).

Para os tratamentos com ácido linoleico conjugado, ácido linolênico e

EPA/DHA, o veículo utilizado foi o hexano. Para o tratamento com ácido linoleico, o

veículo utilizado foi uma solução tampão contendo albumina, pois o ácido linoleico

obtido já veio diluído previamente em um tampão contendo albumina.

Quando nas figuras se identifica a condição como hexano - 200μM -2μL, por

exemplo, não quer dizer que foi utilizado hexano em concentração 200μM, mas sim

que o volume utilizado de 2μL é o mesmo volume de hexano utilizado para preparar

o meio de cultura suplementado com ácido graxo na concentração final de 200μM. O

cuidado foi utilizar volumes equivalentes de veículo no controle e no tratado.

Nas imagens das figuras 2, 3 e 4, observa-se que para a linhagem celular

MDA-MB-231 representante de tumores triplo-negativos, a saturação da densidade

celular só ocorreu em torno do nono dia de cultivo, quando apenas meio de cultura

ou veículo foram utilizados e não houve influência do veículo hexano, nem na

densidade celular e nem na morfologia das células. No caso do tratamento com

EPA/DHA 200μM, apresentado na figura 4, pareceu haver menor densidade celular

já no quinto dia. No sétimo dia observou-se grande número de debris e células

soltas, indicativo de morte e no nono dia observamos que a densidade celular era

55

bem menor do que nos controles, porém havia células vivas, aderidas e não

brilhantes, em número semelhante ao do dia do plaqueamento, mostrando que

poderia haver células resistentes.

Nas imagens 5, 6 e 7, observa-se para a linhagem celular MCF-7,

representante de tumores positivos para o receptor de estrógeno, que não houve

saturação da densidade celular nem no dia 9 e que não houve influência do veículo

sobre a densidade ou morfologia. Estas células, naturalmente crescem em núcleos

que se expandem até haver confluência, mas a aparência da monocamada não é

regular, apresentando células polimórficas. Na figura 7 observa-se que o tratamento

em questão induziu morte celular já nos primeiros dias, chegando à totalidade no

nono dia, onde se observaram apenas debris celulares.

Nas figuras 8, 9 e 10, observa-se que a linhagem SKBR-3, representante de

tumores positivos para o receptor HER-2, que não houve saturação da densidade

celular nem no nono dia e que esta célula apresenta morfologia semelhante à MCF-

7. No entanto, aqui, notou-se alguma sensibilidade ao veículo, com a presença de

debris celulares e alteração do padrão de proliferação a partir do dia 5. Na

impossibilidade de utilizar outro veículo, dado que etanol não dissolveu bem os

ácidos graxos e as outras possibilidades de solventes orgânicos testados foram

igualmente tóxicos para estas células, optou-se por trabalhar nesta condição, mas

sempre fazendo todas as inferências com base no comportamento do veículo

utilizado no controle negativo. A influência citotóxica de EPA/DHA ficou evidente nas

imagens da Figura 10, quando se observou significativa abundância de debris a

partir de 24 horas de tratamento. A morte celular foi total bastante precocemente.

56

Figura 4: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem

MDA-MB-231 controle negativo (meio de cultura e veículo hexano na concentração de 200µL), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.

57


MDA-MB-231 tratada com EPA/DHA na concentração de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.

58

Figura 6: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem MCF-

7 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular 5X103 na placa de 24 poços.

59

Figura 7: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem MCF-7

controle negativo (meio de cultura e veículo hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.

60

Figura 8: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da

linhagem MCF-7 tratada com EPA/DHA na concentração de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.

61


SKBR-3 controle negativo (apenas meio de cultura), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.

62

Figura 10: Fotografia obtida em microscópio invertido (Primo Vert, Carl Zeiss), com aumento de 10X, da linhagem SKBR-3 controle negativo (meio de cultura e veículo hexano na concentração de 200µM), nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular 5X103 na placa de 24 poços.

63


SKBR-3 tratada com EPA/DHA na concentração de 200uM, nos 5 pontos de coleta (dias 1, 3, 5, 7 e 9) a partir da densidade celular de 5X103 na placa de 24 poços.

64

Embora tenham sempre sido utilizadas células que não receberam veículo,

como um dos controles, todas as comparações foram feitas com base na diferença

observada entre o tratamento com os ácidos graxos e o tratamento com o veículo.

Aqui temos uma análise descritiva, pois devido ao grande número de variáveis

testadas inicialmente e a impossibilidade de se fazer tal experimento em placa de 96

poços, este experimento foi feito apenas em triplicata, impedindo análise estatística

confiável.

No caso de MDA-MB-231, nas figuras 11 e 12, observa-se nos gráficos que

EPA/DHA já exerceu efeito inibitório de proliferação na menor concentração, porém

tardiamente. Quando a concentração passou de 50 para 100 e 200μM, o efeito foi

evidenciado mais precocemente. Até o quinto dia de tratamento, pareceu não haver

diferença entre controle e tratado. No caso do ácido linoleico conjugando, CLA, o

efeito foi observado apenas para as concentrações maiores e houve inibição de

proliferação para a concentração de 200μM, mas não morte total, pois permaneceu

o mesmo número de células que inicialmente plaqueado. O ácido linolênico exerceu

um efeito muito semelhante ao de CLA e o ácido linoleico também exerceu efeito

inibidor de proliferação.

65

Figura 12: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM, 100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular MDA-MB-231, nos 5 pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

66

Figura 13: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações de 50µM, 100µM e

200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular MDA-MB-231, nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

67

No caso da linhagem MCF-7, nas figuras 13 e 14, observa-se inibição de

proliferação para EPA/DHA, que se tornou mais precoce com o aumento da

concentração, a concentração mais alta induzindo abundante morte celular e

inibição de proliferação para CLA apenas na maior concentração, o mesmo padrão

sendo observado quando ácido linolênico foi usado. O ácido linoleico não exerceu

efeito inibidor sobre MCF-7.

68

Figura 14: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM, 100µM e

200µM, em placa de 24 poços sobre a curva de crescimento da linhagem celular MCF-7, nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

69

Figura 15: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações de 50µM, 100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular MCF-7 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

70

No caso da linhagem SKBR-3, nas figuras 15 e 16, observa-se efeito do

veículo inibindo proliferação, mas um efeito de EPA/DHA bastante superior ao do

veículo, provocando a morte de todas as células já nos primeiros dias e nas

menores concentrações. Esta célula se mostrou resistente ao efeito de CLA e

também de ácido linoleico, mas foi sensível ao ácido linolênico, porém não tanto

quanto para EPA/DHA.

71

Figura 16: Efeito do tratamento com EPA/DHA e CLA nas concentrações de 50µM, 100µM e

200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular SKBR-3 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

72

Figura 17: Efeito do tratamento com ácido linolênico e linoleico nas concentrações de 50µM,

100µM e 200µM, em placas de 24 poços, sobre a curva de crescimento da linhagem celular SKBR-3 nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

73

4.4 Tabelas comparativas do efeito do tratamento com ácidos graxos

sobre diferentes linhagens celulares.

Com o objetivo de facilitar a visualização dos resultados, foram construídas

tabelas (tabelas 1, 2, 3 e 4), que mostram o comportamento de cada linhagem

celular, em cada momento do tratamento, para um ácido graxo específico em uma

concentração específica. O símbolo (+) indica que não houve inibição de proliferação

e o símbolo (-) indica que houve inibição de proliferação, em relação ao controle

negativo (veículo).

Estes resultados refletem a análise descritiva da triplicata de experimentos

feita e a observação visual tanto dos gráficos, quanto das culturas, que foram

cuidadosamente feitas durante a coleta de pontos para a curva de crescimento.

Através destas tabelas, foi possível avaliar de forma comparativa o efeito de

cada ácido graxo, em cada concentração diferente, em cada uma das linhagens

celulares testadas.

Estas tabelas permitiram visualizar de modo comparativo que a linhagem

MDA-MB-231 sofreu inibição de proliferação por EPA/DHA apenas tardiamente (dias

7 e 9) e nas maiores concentrações (100 e 200μM), o mesmo acontecendo com CLA

e ácido linolênico. Apenas o ácido linoleico inibiu sua proliferação mais

precocemente (d5), para a concentração de 200μM.

A linhagem MCF-7 sofreu inibição de proliferação por EPA/DHA apenas

tardiamente (dias 7 e 9), mas já a partir da menor concentração (50μM) e foi

sensível a CLA e ácido linolênico apenas na concentração de 200μM. Na

concentração de 100μM, a inibição de proliferação foi bem pequena nos dias 7 e 9

para CLA e ácido linolênico, sendo resistente ao ácido linoleico em todas as

concentrações testadas.

A linhagem SKBR-3 foi extremamente sensível ao EPA/DHA, já a partir de

50μM, sensível ao ácido linolênico nos dias 7 e 9 para a menor concentração e já no

primeiro dia para as concentrações de 100 e 200μM, mas foi resistente ao efeito de

CLA e ácido linoleico nas três concentrações.

Por outro lado, fizemos a análise ao contrário e observa-se nas tabelas que

EPA/DHA inibiram as três linhagens celulares, o ácido linolênico também inibiu as

três linhagens, CLA inibiu MDA-MB-231 e MCF-7, mas não inibiu SKBR-3, e o ácido

74

linoleico inibiu apenas a linhagem MDA-MB-231, sendo que este último resultado, foi

observado novamente em uma quadruplicata independente, que pode ser vista na

figura 17.


das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com EPA/DHA. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo).

EPA/DHA - 50µM (0,5µL)

1º Dia 3º Dia 5º Dia 7º Dia 9º Dia

MDA-MB-231 + + + + +

MCF-7 + + + + -

SKBR-3 - - - - -

EPA/DHA - 100µM (1µL)


MDA-MB-231 + + + + -

MCF-7 + + + - -

SKBR-3 - - - - -



MDA-MB-231 + + + - -

MCF-7 + + + - -

SKBR-3 - - - - -

75


das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com CLA. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo). (+*) indica que foi testado novamente no experimento da figura 17 e se mostrou negativo.

CLA - 50µM (0,5µL)


MDA-MB-231 + + + + +

MCF-7 + + + + +

SKBR-3 + + + + +

CLA - 100µM (1µL)


MDA-MB-231 + + + - -

MCF-7 + + + - +*

SKBR-3 + + + + +

CLA - 200µM (2µL)


MDA-MB-231 + + + - -

MCF-7 + + + - -

SKBR-3 + + + + +

76


das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com ácido linolênico. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo). (+*) indica que foi testado novamente no experimento da figura 17 e se mostrou negativo.

Ácido Linolênico - 50µM (0,5µL)


MDA-MB-231 + + + + +

MCF-7 + + + + +

SKBR-3 + + + - -

Ácido Linolênico - 100µM (1µL)


MDA-MB-231 + + + - -

MCF-7 + + + - +*

SKBR-3 - - - - -



MDA-MB-231 + + + - -

MCF-7 + + + - -

SKBR-3 - - - - -

77


das culturas celulares durante a coleta dos pontos da curva de crescimento das linhagens especificadas em diferentes condições de tratamento com ácido linoleico. A classificação de proliferação normal (+) ou inibida (-) foi feita com base na comparação com o controle negativo (veículo).

Ácido Linoleico - 50µM (0,5µL)


MDA-MB-231 + + + + -

MCF-7 + + + + +

SKBR-3 + + + + +

Ácido Linoleico – 100µM (1µL)


MDA-MB-231 + + + + -

MCF-7 + + + + +

SKBR-3 + + + + +

Ácido Linoleico - 200µM (2µL)


MDA-MB-231 + + - - -

MCF-7 + + + + +

SKBR-3 + + + + +

Para confirmar alguns pontos que deixaram dúvida, pois houve inibição no dia

7 e não houve no dia 9, por exemplo, o que seria impossível, foi feita uma

quadruplicata específica destes e de seus controles, porém, como a diferença de

proliferação entre as condições não era muito grande numericamente, não foi

possível obter diferença estatisticamente significante para todas as condições

testadas, mas para algumas, embora os gráficos e a análise microscópica indiquem

a inibição de proliferação. Observe na figura 16, uma amostra deste experimento

feito em quadruplicata para alguns pontos de interesse.

78

Figura 18: Análise em quadruplicata de alguns pontos da curva de crescimento, para confirmar o efeito inibitório de ácidos

graxos específicos em tempos definidos de tratamento, para as linhagens celulares indicadas. Nas figuras “a” e “b”, observa-se diferença estatisticamente significante em relação ao efeito de ácido linolênico e CLA 100µM, no dia 9, para a linhagem MCF-7. Nas figuras c e d, embora se observe uma tendência de inibição exercida por ácido linolênico e linoleico 50µM no dia 9, para a linhagem MDA-MB-231, esta diferença não é estatisticamente significante.

79

4.5. Viabilidade Celular

Este ensaio foi realizado em triplicata. O ensaio foi feito em placa de 96

poços, em todas as condições apresentadas nos gráficos abaixo. A análise

estatística foi feita por ANOVA de duas vias, seguida por um pós-teste de

Bonferroni.

Foi feito o tratamento por 24 horas com os referidos ácidos graxos e

controles, após as células terem sido carenciadas, com 0,2% de soro bovino fetal

por 24 horas, para se observar o efeito agudo do tratamento com cada ácido. O

controle com o qual todos os tratamentos foram comparados para a análise

estatística foram as células mantidas pelo mesmo tempo em meio de cultura

contendo apenas veículo. Alterações da atividade metabólica das células foram

vistas precocemente, ao final de 24h de tratamento.

Na concentração de 50μM dos ácidos graxos notou-se uma tendência, que foi

exacerbada na concentração de 100μM. Em 24 horas, EPA/DHA aumentou a

viabilidade de MDA-MB-231 e MCF-7, enquanto diminui a de SKBR-3. CLA apenas

inibiu a viabilidade de SKBR-3, ácido linolênico aumentou a viabilidade de MCF-7 e

diminui de SKBR-3, enquanto ácido linoleico não exerceu nenhum efeito sobre

nenhuma das três linhagens.

80

Figura 19: Efeito dos ácidos graxos sobre a viabilidade celular das linhagens MDA-MB-231,

MCF-7, e SKBR-3 pelo ensaio de MTT. Análise estatistica feita por ANOVA de duas vias.

81

4.6 Experimento de “scratch” para análise do potencial de migração das

células

Este ensaio é bastante simples e permitiu inferir sobre a capacidade

migratória das células, através da observação da sua habilidade de repovoar uma

região que foi depletada de células fisicamente por raspagem da placa. No caso do

controle negativo, após 4 dias em cultura, sempre houve o desaparecimento da

região raspada, por confluência celular de 100%, ou até antes do quarto dia. Quando

as linhagens celulares foram tratadas com os ácidos graxos, existiu inibição deste

repovoamento, com exceção do ácido linoleico, como pode ser visto nas tabelas 5,

6, 7 e 8. A seguinte escala foi utilizada para indicar o comportamento observado, em

comparação com o controle negativo (veículo) e a Figura 19 mostra como o

repovoamento foi observado ao microscópio, para a linhagem MDA-MB-231. Este

experimento não foi realizado para a linhagem celular SKBR-3, por problemas

técnicos. Restringimos a análise para a linhagem representante dos tumores luminal

A e triplo-negativos.

Os resultados mostraram que houve inibição de repovoamento da área

depletada nas duas linhagens testadas, quando os ácidos graxos EPA/DHA, CLA e

linolênico foram usados, mas não para o ácido linoleico, que gerou confluência de

100% para as duas linhagens testadas. O maior grau de inibição foi observado para

EPA/DHA na concentração de 200μM.

82

(-) Dia do corte, canais depletados de células, por raspagem; (+) Baixa densidade celular na área raspada, menos de 20% de confluência; (++) Média densidade celular na área raspada, em torno de 20 a 30% de confluência; (+++) Alta densidade celular na área raspada, em torno de 30 a 70% de confluência; (--) Morte celular generalizada induzida pelo tratamento;

Tabela 5: Efeito de EPA/DHA sobre a densidade celular da área submetida à

raspagem no dia zero

EPA/DHA - 50µM (0,5µL)

1º Dia 2º Dia 3º Dia 4º Dia

MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - ++ ++ +++



MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - + ++ +++



MCF-7 - + + ++

MDA-MB-231 - + + --

Tabela 6: Efeito de CLA sobre a densidade celular da área submetida à raspagem

no dia zero

CLA - 50µM (0,5µL)


MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - ++ ++ +++

CLA - 100µM (1µL)


MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - ++ ++ +++

CLA - 200µM (2µL)


MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - ++ ++ ++

83

Tabela 7: Efeito de ácido linolênico sobre a densidade celular da área submetida à

raspagem no dia zero



MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - ++ ++ +++



MCF-7 - + ++ ++

MDA-MB-231 - + ++ ++



MCF-7 - + + ++

MDA-MB-231 - ++ ++ ++

Tabela 8: Efeito de ácido linoleico sobre a densidade celular da área submetida à raspagem no dia zero


1º Dia 2º Dia

Tratamento 3º Dia

Tratamento 4º Dia

Tratamento

MCF-7 - ++ +++ +++

MDA-MB-231 - +++ +++ +++



MCF-7 - ++ +++ confluência

100%

MDA-MB-231 - ++ confluência

100% confluência

100%



MCF-7 - ++ +++ confluência

100%

MDA-MB-231 - ++ confluência

100% confluência

100%

84

Figura 20: Experimento de “scratch” mostrando potencial de migração celular da linhagem MDA-MB-231, crescendo

na presença de ácidos graxos específicos. Microscopia de luz; Aumento de 10X.

85

4.7 Crescimento celular em suspensão de agarose

Este experimento é o experimento in vitro mais próximo do ensaio de

tumorigênese em animal, pois avalia a capacidade de uma única célula formar

colônias, em suspensão.

Primeiramente foi feito um ensaio com as diferentes linhagens celulares para

avaliar sua capacidade de crescimento em suspensão de agarose, partindo-se de

inóculos contendo 103 células e 104 células, como pode ser visto na figura 20 e na

tabela 9.

A linhagem MCF-7 formou colônias em suspensão, as quais foram vistas

macroscopicamente, enquanto as linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3 formaram

colônias diminutas, observáveis ao microscópio, mesmo após 4 semanas de cultivo.

86

Figura 21: Células sem nenhum tipo de tratamento ou veículo (hexano e albumina), crescendo em suspensão de agarose, ao longo de três semanas. Microscópio óptico invertido; Aumento 10X.

87

Em uma segunda etapa, os controles foram repetidos e as linhagens MCF-7,

MDA-MB-231 e SKBR-3 foram tratadas com os diferentes ácidos graxos, nas

concentrações de 50µM, 100µM e 200µM. Os resultados se encontram nas tabelas

9, 10, 11 e 12. Nestas tabelas, avaliamos se houve ou não formação de colônias na

presença dos referidos ácidos graxos.

Os descritores utilizados foram os seguintes: (-) morte celular, evidenciado

por grande quantidade de debris; (+) até 50 células = micro-colônias; (++) 50-200

células = colônias pequenas; (+++) 200-600 células = colônias médias; (++++) ≥ 600

células = colônias grandes

Tabela 9: Efeito de EPA/DHA sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose

EPA /DHA - 50µM (0,5µL)

DMEM/RPMI Veículo EPA/DHA

MDA-MB-231 ++ ++ ++

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ +++ +++



MDA-MB-231 ++ + +

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ +++ ++



MDA-MB-231 ++ ++ -

SKBR-3 + ++ -

MCF-7 ++++ ++ ++

88

Tabela 10: Efeito de CLA sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e

MCF-7, em suspensão de agarose CLA - 50µM (0,5µL)

DMEM/RPMI Veículo CLA

MDA-MB-231 ++ ++ ++

SKBR-3 + + ++

MCF-7 ++++ +++ +++

CLA - 100µM (1,0µL)


MDA-MB-231 ++ + ++

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ +++ +++

CLA - 200µM (2,0µL)


MDA-MB-231 ++ ++ +

SKBR-3 + ++ -

MCF-7 ++++ ++ ++

Tabela 11: Efeito de ácido linolênico sobre o crescimento celular de MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose


DMEM/RPMI Veículo Ácido Linolênico

MDA-MB-231 ++ ++ ++

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ +++ +++



MDA-MB-231 ++ + ++

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ +++ ++



MDA-MB-231 ++ ++ ++

SKBR-3 + ++ +

MCF-7 ++++ ++ +++

89

Tabela 12: Efeito de ácido linoleico sobre o crescimento celular de MDA-MB-231,

SKBR-3 e MCF-7, em suspensão de agarose Ácido Linoleico - 50µM (0,5µL)

DMEM/RPMI Veículo Albumina Ácido Linoleico

MDA-MB-231 ++ ++ ++

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ ++++ +++



MDA-MB-231 ++ + ++

SKBR-3 + + +

MCF-7 ++++ ++++ +++



MDA-MB-231 ++ ++ ++

SKBR-3 + ++ -

MCF-7 ++++ +++ +++

EPA/DHA inibiu a formação de colônias de MDA-MB-231 e SKBR-3 na

concentração de 200μM, mas não inibiu MCF-7. CLA inibiu apenas a formação de

colônias de SKBR-3, também na concentração de 200μM, ácido linolênico não

exerceu efeito inibitório sobre nenhuma linhagem e ácido linoleico inibiu SKBR-3 na

concentração de 200μM.

Apenas a concentração mais alta dos ácidos graxos inibiu formação de

colônias e nenhuma condição inibiu a formação de colônias de MCF-7.

4.8 Análise da expressão de superóxido dismutase-2 (SOD2), por

imunocitoquímica

Este experimento foi feito para avaliar o nível de expressão de SOD2 nas

linhagens celulares tratadas com os ácidos graxos na concentração de 100μM por

24 horas e seus controles. Esta análise foi feita em duplicata e foram quantificados

quatro campos de cada uma das duplicatas para análise comparativa com o veículo.

A significância estatística foi analisada através de ANOVA de uma via, seguido por

um pós-teste de Bonferroni. Por limitações técnicas, não foi possível fazer a mesma

análise para a linhagem SKBR-3, o que está em andamento.

90

Figura 22: Análise da expressão de SOD2 nas células tumorais MDA-MB-231 e MCF-7, tratadas com os referidos ácidos graxos na concentração de 100µM por 24 horas. Análise estatística foi feita por ANOVA de uma via. A quantificação de 4 campos diferentes foi feita utilizando o sistema MCID de análise de imagens (Interfocus Europe, UK).

91

O ácido linolênico diminuiu a expressão de SOD2 para MCF-7, enquanto

praticamente dobrou a expressão da enzima para MDA-MB-231. CLA exerceu o

mesmo efeito sobre MDA-MB-231, mas não atuou sobre a expressão de SOD2 em

MCF-7. O ácido linoleico diminuiu a expressão de SOD2 para MCF-7. De um modo

geral, todos os tratamentos aumentaram a expressão de SOD2 em MDA-MB-231 e

os ácidos linolênico e linoleico diminuíram a expressão de SOD2 em MCF-7, mas

apenas as alterações acima foram estatisticamente significantes.

Nas figuras 22 e 23 estão imagens que foram utilizadas para a

quantificação e geração dos gráficos acima.

92

Figura 23: Imunocitoquímica evidenciando a expressão de SOD2 nos diferentes tratamentos, para a linhagem MDA-MB-231. Todos os ácidos foram utilizados na concentração de 100μM, por 24 horas. Painel ilustrativo da quantificação mostrada anteriormente. Imagens obtidas através do software MCID. Aumento 40X.

93

Figura 24: Imunocitoquímica evidenciando a expressão de SOD2 nos diferentes tratamentos, para a linhagem MCF-7. Todos os ácidos foram utilizados na concentração de 100μM, por 24 horas. Painel ilustrativo da quantificação mostrada anteriormente. Imagens obtidas através do software MCID. Aumento 40X.

94

4.9 Análise da atividade de superóxido dismutase

O método de quantificação da atividade de SOD não diferencia o tipo de

superóxido dismutase, logo os resultados foram globais para a atividade geral

de SOD nas células. Para padronização do método de análise de atividade de

SOD, foi feita a quantificação relativa desta atividade, em diferentes linhagens,

incluindo as três de nosso interesse, sem serem submetidas a nenhum

tratamento, o que pode ser visto na Figura 24.

Houve grande diferença na atividade de SOD entre as linhagens

testadas. A que mais se destacou foi a linhagem MDA-MB-435, correspondente

a um melanoma humano, metastático em mama.

Atividade de SOD

Bra

nco

Con

trol

MD

A-M

B-2

31

MD

A-M

B-4

35

MC

F-7

Hs-5

78t

SK

BR

-3

-50

0

50

100

150*

* p < 0.05

Po

rcen

tag

em

(%

)

Figura 25: Padronização da atividade de SOD nas linhagens celulares MDA-MB-231, MDA-MB-435, MCF-7, Hs-578t e SKBR-3. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.

Após padronização, as linhagens celulares MDA-MB-231, MCF-7 e

SKBR-3 foram então tratadas com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA, linolênico

e linoleico e seus respectivos controles (hexano ou albumina) na concentração

de 100µM, por 24 horas, e os resultados podem ser vistos nas figuras 25 e 26.

A quantificação foi realizada em triplicata para análise comparativa com o

95

veículo. A significância estatística foi analisada através de ANOVA de uma via,

seguida por um pós-teste de Bonferroni.

Na linhagem MDA-MB-231 apenas ocorreu alteração da atividade de

SOD quando CLA ou ácido linoleico foram utilizados, promovendo aumento

significante desta atividade. Na linhagem MCF-7, ao contrário, ocorreu

diminuição da atividade de SOD, mas quando ácido linolênico foi utilizado.

Atividade SOD

MDA-M

B-2

31

MCF-7

SKBR-3

0.00

0.05

0.10

0.15Branco

Controle

Hexano - 100M (1L)

EPA/DHA - 100M (1L)

CLA - 100M (1L)

Ácido Linolênico - 100M

(1L)

*

* p < 0,05*** p < 0,001

***

*

Ab

so

rbân

cia

(%

)

Figura 26: Quantificação da atividade de SOD, sob efeito do tratamento com

ácidos graxos EPA/DHA, CLA e linolênico na concentração de 100µM por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

96

Atividade SOD

MDA-M

B-2

31

MCF-7

SKBR-3

0.00

0.05

0.10

0.15Branco

Controle

Albumina - 100M (1uL)***

Ácido Linoleico - 100M

(1L)

*** p < 0.001

Ab

so

rbân

cia

(%

)

Figura 27: Quantificação da atividade de SOD, sob efeito do tratamento com

ácido linoleico na concentração de 100µM, por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

4.10 – Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROS)

Para o ensaio foi feita a quantificação de formação de EROS nas

linhagens MDA-MB-231, MCF-7 e SKBR-3 tratadas com os ácidos graxos

EPA/DHA, CLA, linolênico e linoleico na concentração de 100µM e 200µM nos

períodos de tempos especificados nos gráficos de 27 a 36.

Na linhagem MDA-MB-231 ocorreu a diminuição significativa dos níveis

de formação de EROS, quando tratada com os ácidos EPA/DHA, CLA e ácido

linoleico, na concentração de 100µM no período de 24 horas (figuras 27 e 28) e

na concentração de 200µM, no período de 2 horas para o ácido linoleico (figura

30).

97

EROS - MDA-MB-231 - 100M - 24 e 48 horas

24 H

oras

48 H

oras

0

50

100

150Veículo Hexano - 100M (1L)

EPA/DHA - 100M (1L)

CLA - 100M (1L)

Ácido Linolênico - 100M (1L)

*

* p < 0.05

*

DH

E-c

élu

las p

osit

ivas (

%)

Figura 28: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MDA-MB-

231 tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico no período de 24 e 48 horas. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

MDA-MB-231 - Ácido Linoleico - 100uM 24 e 48 horas

DH

E -

24 h

ora

s

DH

E -

48 h

ora

s

0

20

40

60

80

100

Veículo Albumina - 100uM

Ácido Linoleico - 100uM

**

** p < 0.01

DH

E-c

élu

las

po

sit

iva

s (

%)


231 tratada com ácido linoleico no período de 24 e 48 horas. Análise estatística

feita por ANOVA de duas vias.

98

MDA-MB-231 - 200M - 2 horas

2 hora

s

0

50

100


EPA/DHA - 200M (2L)

CLA - 200M (2L)


p > 0.05

DH

E-c

élu

las p

osit

ivas (

%)

Figura 30: Ensaio de quantificação relativa de EROS nas linhagens MDA-MB-

231, tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico no período de 2 horas.

Análise estatística feita por ANOVA de uma via.

EROS - MDA-MB-231 - 200M - 2 horas

2 hora

s

0

50

100

150Veículo Albumina - 200M (2L)

Ácido Linoleico - 200M (2L)

* p < 0.05

*

DH

E-c

élu

las

po

sit

iva

s (

%)


231, tratada com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.

99

EROS - MCF-7 - 100M - 24 horas

24 h

oras

0

50

100

150

Veículo Hexano - 100M (1L)

EPA/DHA - 100M (1L)

CLA - 100M (1L)


p > 0.05

DH

E-c

élu

las p

os

itiv

as (

%)

Figura 32: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MCF-7, tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.

EROS - MCF-7 - 100M - 24 horas

24 h

oras

0

50

100

150

Veículo Albumina - 100M (1L)

Ácido Linoleico 100M (1L)

p > 0.05

DH

E-c

élu

las p

osit

ivas (

%)

Figura 33: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem MCF-7, tratada com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.

100

EROS - SKBR-3 - 100M - 24 horas

24 h

oras

0

50

100

150


EPA/DHA - 100M (1L)

CLA - 100M (1L)


p > 0.05

DH

E-c

élu

las p

osit

ivas (

%)

Figura 34: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 24 horas. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.


24 h

oras

0

50

100

150Veículo Albumina 100M (1L)

Ácido Linoleico 100M (1L)

p > 0.05

DH

E-c

élu

las p

osit

ivas (

%)

Figura 35: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3,

tratada com ácido linoleico por 24 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.

101


2 hora

s

0

50

100


EPA/DHA - 200M (2L)

CLA - 200M (2L)


p > 0.05

DH

E-c

élu

las

po

sit

iva

s (

%)

Figura 36: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3,

tratada com EPA/DHA, CLA e ácido linolênico por 2 horas. Análise estatística feita por ANOVA de uma via.


2 hora

s

0

50

100

150Veículo Albumina - 200M (2L)

Ácido Linoleico - 200M (2L)

p > 0.05

DH

E-c

élu

las

po

sit

iva

s (

%)

Figura 37: Ensaio de quantificação relativa de EROS na linhagem SKBR-3, tratada com ácido linoleico por 2 horas. Análise estatística feita por Teste Mann Whitney U.

102

4.11 Análise de Morte Celular

O ensaio de apoptose foi feito com as linhagens MDA-MB-231 e SKBR-

3. O experimento com a linhagem MCF-7 e também em outras condições está

em andamento. A linhagem MDA-MB-231 foi tratada com os quatro ácidos

graxos, na concentração de 100μM, por oito dias e 200μM por 24 horas, que

avaliou o efeito tardio e agudo. O mesmo foi feito com as células SKBR-3. Ao

final do tratamento, as células foram marcadas com Anexina V e Iodeto de

Propídeo (IP) na concentração de 100µg/mL e procedeu-se à leitura em

citometro de fluxo (colaboração UNIFESP).

Os dados foram apresentados como % de apoptose e % de necrose

secundária, que na verdade é a fase final da apoptose e embora se apresente

como necrose, é um indicador da taxa de apoptose, pois foi iniciada por esta.

No caso de MD-MBA-231, podemos ver que a taxa de necrose

secundária foi alta, para o tratamento com EPA/DHA e CLA. Ácido linoleico não

induziu apoptose nestas células e nem o ácido linoleico.

A análise da resposta aguda de MDA-MB-231 aos ácidos graxos, isto é,

o efeito do tratamento com 200μM destes ácidos por 24 horas, mostrou que só

houve indução de apoptose para o tratamento com CLA.

No caso das células SKBR-3, não houve aumento de apoptose em

nenhuma das condições testadas.

103

Morte Celular - MDA-MB-231 - 100M - 8 dias

Apopto

se

Nec

rose

Sec

undária

0

20

40

60

80


EPA/DHA - 100M (1L)

CLA - 100M (1L)


**

* p < 0.05** p < 0.01

*** p < 0.001

**

****

Po

rce

nta

ge

m (

%)

Figura 38: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA e Ácido linolênico por 8 dias na concentração de 100µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

Morte Celular - MDA-MB-231 - 100uM - 8 dias

Apopto

se

Nec

rose

Sec

undária

0

20

40

60

80


Ácido Linoléico - 100M (1L)

p > 0.05

Po

rcen

tag

em

(%

)

Figura 39: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com o

ácido graxo linoleico com albumina por 8 dias na concentração de 100µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

104

Morte Celular - MDA-MB-231 - 200M - 24 horas

Apopto

se

Nec

rose

Sec

undária

0

20

40

60

80


EPA/DHA - 200uM (2L)

CLA - 200uM (2L)


**

** p < 0.01

Po

rcen

tag

em

(%

)

Figura 40: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com os ácidos graxos EPA/DHA, CLA e linolênico por 24 horas na concentração de 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

Morte Celular - MDA-MB-231 - 200M - 24 horas

Apopto

se

Nec

rose

Sec

undária

0

20

40

60

80


Ácido Linoléico - 200M (2L)

p > 0.05

Po

rcen

tag

em

(%

)

Figura 41: Ensaio de morte celular da linhagem MDA-MB-231, tratada com o ácido linoleico por 24 horas na concentração de 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

105

Apoptose - SKBR-3 - 8 dias

Apopto

se

Nec

rose

Sec

undária

0

20

40

60

80



CLA - 100M (1L)

CLA - 200M (2L)

**

** p < 0.001

Po

rce

nta

ge

m (

%)

Figura 42: Ensaio de morte celular da linhagem SKBR-3, tratada com o ácido graxo CLA por 8 dias nas concentrações de 100µM e 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

Apoptose - SKBR-3 - 24 horas

Apopto

se

Nec

rose

Sec

undária

0

20

40

60

80



EPA/DHA - 100M (1L)


EPA/DHA - 200M (2L)


p > 0.05

Po

rce

nta

ge

m (

%)

Figura 43: Ensaio de morte celular da linhagem SKBR-3, tratada com os

ácidos graxos EPA/DHA e linolênico por 24 horas nas concentrações de 100µM

e 200µM. Análise estatística feita por ANOVA de duas vias.

106

Tabela 13: Análise global dos efeitos dos quatro ácidos graxos testados, sobre

a expressão de SOD2, atividade de SOD, formação de EROS e crescimento celular das três principais linhagens celulares testadas.

4.12 Análise do efeito dos ácidos graxos descritos sobre a curva de

crescimento das linhagens Hs578t e MDA-MB-435

Estas linhagens celulares foram obtidas e estabelecidas em cultura a

partir de tumores na mama, porém não correspondem a carcinomas clássicos

encontrados na clínica, como os descritos inicialmente. A linhagem Hs578t

corresponde a um sarcoma da mama e a MDA-MB-435 a um melanoma

metastático em mama. As duas são comercializadas através da ATCC

(American Type Culture Collection)

A linhagem Hs578t é derivada de carcinoma de glândula mamária

humana de uma mulher caucasiana de 74 anos. Trata-se de uma hipotriploidia

com um número modal de 59. Não expressa os receptores de estrógeno,

progesterona e fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER-2). Tipo

celular fibroblastóide. Morfologia celular epitelial. Cresce em monocamada e

em suspensão, em meio semissólido, mas não é tumorigênica em

camundongos nude [86]. Cultivado em DMEM suplementado cm 10% de soro

bovino fetal.

107

A linhagem MDA-MB-435 foi primeiramente classificada como derivada

de uma efusão pleural de adenocarcinoma de humano, mas foi recentemente

reclassificada como melanócito/melanoma, obtido de uma mulher caucasiana

de 31 anos de idade, após estudos de expressão por microarray. Apresenta

aneuploidia número modal de cromossomos = 56, variação = 55 a 62).

Expressa o gene da tubulina e actina e negativo para o receptor de estrógeno e

progesterona e HER-2. Essa linhagem celular não é tumorigênica em animais,

mas cresce em suspensão em meio semissólido. Tipo celular melanócito,

melanoma, com morfologia celular fusiforme. Cultivada em RPMI suplementado

com 10% d soro bovino fetal [87; 88].

Nas figuras abaixo, observa-se o efeito dos diferentes ácidos graxos em

diferentes concentrações, na curva de crescimento em substrato sólido para

estas duas linhagens.

EPA/DHA exerceram efeito inibitório de proliferação sobre Hs578-t a

partir do sétimo e nono dia de tratamento, em concentrações de 100 e 200μM.

O mesmo padrão foi apresentado por CLA. O ácido linolênico apenas inibiu

proliferação destas células na maior concentração, o mesmo acontecendo com

ácido linoleico.

Para a linhagem MDA-MB-435 o padrão de resposta a EPA/DHA e CLA

foi o mesmo, porém CLA inibiu proliferação a partir da menor concentração. O

ácido linolênico inibiu sua proliferação tardiamente para as três concentrações

testadas e o ácido linoleico inibiu proliferação nos dias 7 e 9 nas concentrações

de 100 e 200μM.

108

Figura 44: Efeito do tratamento com ácidos graxos EPA/DHA e CLA em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem Hs578-t, em placa de 24 poços nos 5 pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

109

Figura 45: Efeito dos ácidos linolênico e linoleico em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem Hs578-t em placa de 24 poços nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

110

Figura 46: Efeito do tratamento com ácidos EPA/DHA e CLA em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem MDA-MB-435 em placa de 24 poços nos pontos de coletas 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

111

Figura 47: Efeito do tratamento com ácidos linolênico e linoleico em diferentes concentrações (50µM, 100µM e 200µM), sobre a curva de crescimento da linhagem MDA-MB-435 em placa de 24 poços nos pontos de coleta 1, 3, 5, 7 e 9 dias.

112

5. Discussão

O objetivo fundamental deste trabalho foi avaliar comparativamente a

ação de ácidos graxos da família ômega-3 e 6, tanto precursores quanto

derivados, sobre a proliferação de células tumorais de mama, estabelecidas

como linhagem. Há na literatura uma grande quantidade de dados acerca dos

efeitos de alguns ácidos graxos sobre algumas linhagens celulares, no entanto

faltam trabalhos que comparem diferentes linhagens e diferentes ácidos graxos

em diferentes concentrações e que permitam análise comparativa e conclusões

mais globais sobre quais ácidos exercem inibição de proliferação e quais

células são suscetíveis a estas e quais não.

Desta maneira, os ácidos graxos escolhidos foram o ácido linolênico,

representando o precursor dietético dos ácidos graxos da família ômega-3, o

ácido linoleico, representando o precursor dietético dos ácidos graxos da

família ômega-6 e dois derivados destes, que são produzidos em animais, após

metabolização dos primeiros, que são o CLA, um derivado da família ômega-6,

encontrado em laticínios e carnes de animais ruminantes, e uma mistura de

EPA e DHA, que são encontrados nos óleos de peixes, sendo derivados do

ácido linolênico, da família ômega-3.

Utilizando estes quatro conjuntos de moléculas, podemos verificar se os

efeitos de inibição de proliferação estão restritos a uma família ômega

exclusivamente, se os precursores destas famílias já exercem tal efeito e se as

moléculas metabolizadas em animais apresentam mais ou menos efeito do que

os precursores. Embora os ácidos linoleico e linolênico sejam preparações

puras, quando se fala em CLA, a forma conjugada do ácido linoleico, temos

uma mistura de isômeros, majoritariamente composta pelos t10c12 e c9t11.

A opção por utilizar uma mistura de EPA/DHA, e não testar cada um

destes separadamente, foi baseada no objetivo de verificar o efeito da

composição que está presente na dieta ou suplementação. Estes são os dois

principais ácidos graxos presentes no óleo de peixe, encontrado

comercialmente em cápsulas como suplemento alimentar. As preparações de

óleo de peixe contem EPA/DHA na proporção de 46mM de DHA para cada

100mM de EPA, logo quando nos referimos a EPA/DHA sendo testado nas

113

concentrações de 50µM, 100µM e 200µM, esta concentração se refere a EPA e

o DHA está presente na proporção acima referida sendo utilizado em conjunto.

A escolha da faixa de concentração utilizada foi feita com base no

descrito na literatura e em testes prévios realizados por nós. Procuramos

utilizar um intervalo de concentração que incluísse uma concentração mais

baixa, que geralmente não provoca efeito (50µM), uma concentração

intermediária, em que o efeito varia de acordo com a linhagem e o tempo de

tratamento (100µM) e uma concentração mais alta em que os efeitos são

observados de maneira mais aguda (200µM).

O veículo foi escolhido empiricamente, com base no seu potencial de

solubilização dos ácidos graxos, entre opções já descritas na literatura como

tendo sido usadas em ensaios celulares. Testamos o etanol e o hexano.

Etanol, embora menos tóxico, teve que ser descartado, pois havia formação de

micelas de ácidos graxos (gotículas de óleo, visíveis a olho nu), após o tubo ser

deixado em repouso. Procurou-se preparar estoques em hexano em

concentração tal, que o volume adicionado às culturas fosse baixo, para evitar

ação tóxica do solvente. Em todos os experimentos, o veículo puro, em mesmo

volume que o usado na preparação dos ácidos, foi utilizado como controle

negativo e todas as comparações foram sempre feitas em relação a esta

condição, embora sempre tivéssemos mantido também células sem nenhum

tratamento como um segundo controle.

A escolha das linhagens celulares foi feita com base na necessidade de

avaliar o efeito dos ácidos graxos sobre células tumorais molecularmente e

comportamentalmente distintas, mas de relevância clínica. Deste modo, foram

escolhidas três linhagens de carcinoma mamário, especificamente as linhagens

MCF-7, representante dos tumores luminais A, os menos agressivos

encontrados clinicamente e que por serem positivos para o receptor de

estrógeno, podem ser tratados por hormonioterapia; a linhagem SKBR-3,

representante dos tumores positivos para o receptor HER-2, que apresentam

como recurso terapêutico o uso do trastuzumab; e a linhagem MDA-MB-231,

representando os tumores triplo-negativos, por não expressarem nenhum dos

receptores comumente testados (Her-2, estrógeno e progesterona),

representando os tumores mais difíceis do ponto de vista de tratamento.

114

Como o volume de análise foi muito grande, dado que foram testadas

muitas condições e os experimentos de Biologia Celular são sempre muito

lentos, devido à necessidade de expansão das células, nos concentramos em

comparar os efeitos dos ácidos graxos nas linhagens MCF-7 e MDA-MB-231,

que representam os dois opostos neste espectro de tumores encontrados na

clínica. Quando possível e de interesse, avaliamos também os efeitos sobre

SKBR-3.

Uma das opções feitas precocemente no desenho detes projeto foi a de

não inclusão de uma linhagem representando células mamárias normais, como

é o caso da linhagem MCF-10A, por três motivos principais: se é uma linhagem

estabelecida e que se mantem em cultura, assumimos que não é um bom

representante de célula normal; existe uma série de trabalhos publicados

mostrando que os ácidos graxos tanto das famílias ômega-3 quanto ômega-6,

não exercem efeito nenhum sobre a taxa de proliferação de células normais,

mas apenas das tumorais e; as necessidades de suplementação do meio de

cultura para as células MCF-10A, como a presença de estrógeno e EGF, além

de outros fatores de crescimento, tornaria a análise comparativa mais difícil de

ser feita, pois partiríamos de condições diferentes. Como o objetivo deste

trabalho foi verificar se os diferentes ácidos graxos atuam de forma diferente

sobre diferentes linhagens celulares provenientes de tumores, não julgamos

ser necessário comparar os efeitos com os evidenciados em uma linhagem

“normal” e pudemos utilizar as próprias linhagens diferentes como controle

umas das outras.

Dado que a MCF-7, expressa receptor de estrógeno e progesterona,

mas não Her-2; a MDA-MB-231 é negativa para os três receptores clássicos e

a SKBR-3 é negativa para os receptores de estrógeno e progesterona, mas é

positiva para o receptor Her-2 temos um painel variado que permite saber se o

espectro de ação dos ácidos graxos é célula-específico ou não, permitindo

talvez até fazer-se alguma inferência sobre o suposto mecanismo de ação

destes.

Em paralelo, foi feita uma análise do efeito dos ácidos graxos sobre o

padrão de proliferação de duas linhagens celulares derivadas de tumores

encontrados na mama, mas que não são os carcinomas clássicos. Uma delas,

a MDA-MB-435, corresponde a um melanoma mestastático e a outra, Hs578t,

115

corresponde a um sarcoma de mama. O objetivo foi apenas observar se em

células não-carcinoma, o padrão de inibição de proliferação é diferente.

O interesse inicial era verificar se estas preparações de ácidos graxos

influenciariam a curva de crescimento das linhagens celulares testadas. Para

padronizar o ensaio, foi feita uma curva de crescimento com cada uma das

linhagens, sem nenhum tratamento, em duas concentrações celulares distintas

e em duas placas distintas. Esta padronização deve ser feita, para evitar que

antes do termino do experimento, haja morte das células por terem atingido a

densidade de saturação. Definidos estes parâmetros, de modo a ter uma

cultura crescendo exponencialmente até o nono dia de tratamento.

Embora seja um experimento trivial, não foi simples testar tantas

condições. Ensaios que fizemos inicialmente para acompanhar o

comportamento das células na presença dos ácidos graxos até o quinto dia de

tratamento, durante a padronização, não resultaram em efeitos observáveis, o

que nos fez estender o ensaio até o nono dia.

A dificuldade de se testar tantas condições ao mesmo tempo (4 ácidos

graxos, 3 concentrações, 3 linhagens) é o que faz com que geralmente estes

ensaios de proliferação sejam feitos em placas de 96 poços, pelo método de

redução de MTT. No entanto, aqui optamos por fazer curvas de crescimento,

pois o ensaio de MTT tão comumente encontrado, não reflete necessariamente

proliferação, uma vez que ele mede atividade metabólica e esta pode variar

nas células, especialmente quando tratadas com ácidos graxos.

O ensaio de MTT mede diretamente a viabilidade celular, através da

redução do MTT, um sal de coloração amarelada e solúvel em água, a

formazan, um sal de coloração arroxeada e insolúvel, o que é mediado por

enzimas celulares, provavelmente mitocondriais. A atividade metabólica da

célula pode variar ao longo do ensaio e gerar um viés de interpretação. Se o

tratamento aumenta a atividade metabólica das células, tem-se a falsa

impressão de que houve proliferação e se o tratamento diminui a atividade

celular, mas deixa as células quiescentes, observa-se o resultado falso-positivo

para morte celular. Tal viés pode ser visto nos nossos resultados, quando

alguns ácidos graxos aumentam a redução de MTT nas primeiras horas de

tratamento, o que não é um reflexo real da taxa de proliferação.

116

Neste trabalho pudemos observar que embora encontrássemos os

mesmos resultados descritos na literatura no ensaio de MTT, inclusive com

significância estatística, quando assume-se inibição de proliferação, esta

inibição ainda não havia acontecido, quando as células foram contadas,

mostrando que uma série de informações e conclusões já obtidas nesta área,

estão equivocadas.

A vantagem do ensaio de MTT, que justifica sua preferência, é ser

realizado em placas de 96 poços, facilmente permitindo que triplicatas ou mais,

sejam feitas em todos os ensaios. No ensaio de construção das curvas de

crescimento, dado o volume de variáveis e a necessidade de se fazer

minimamente em placas de 24 poços, foi possível fazer apenas triplicatas, o

que permitiu apresentar os dados como média e desvio padrão, mas sem

análise estatística, uma vez que é um pressuposto teórico que ANOVA só pode

ser feita quando há no mínimo seis observações distintas de um mesmo

fenômeno. Dado que nossa intenção era apenas uma análise descritiva e não

uma confirmação matemática, para este tipo de resultado, consideramos que

esta análise foi suficiente.

Todos os pontos de interesse, onde houve dúvida na análise inicial,

foram repetidos em quadruplicata, para confirmação. Este foi um trabalho

inicial, de verificação do perfil de ação dos ácidos graxos. A partir destes dados

iniciais, novos projetos estão sendo executados, para exploração e

aprofundamento de informações obtidas neste.

O volume de contagem de células na realização destes experimentos foi

bastante grande e em nosso laboratório dispunhamos apenas de câmara de

Neubauer para a contagem manual. Para tanto, as contagens foram todas

feitas desta maneira, logo após a tripsinização, e as suspensões celulares

foram fixadas em formalina, para uma eventual recontagem confirmatória, caso

necessário. Como controle, algumas das suspensões foram levadas até o

NUCEL (Núcleo de Terapia Celular e Molecular), da USP (Universidade de São

Paulo), para confirmação da contagem em método automatizado, utilizando um

citômetro. Dado que os resultados obtidos nesta comparação foram bastante

reprodutíveis, optamos por proceder a contagem de maneira manual em nosso

laboratório.

117

As curvas de crescimento obtidas a partir de ensaio feito em placas de

24 poços, conforme padronização apresentada nas figuras 1 e 2, e os

resultados do tratamento, foram representados em gráficos de linha (número

de células x dias de tratamento), nas figuras de 11 a 16, mas para facilitar a

comparação do efeito dos diferentes ácidos graxos, nas diferentes

concentrações, sobre as diferentes linhagens, foram elaboradas as tabelas, de

1 a 4, evidenciando os efeitos apresentados nos gráficos e também

confirmados pela visualização da densidade celular na microscopia.

Com base nestas tabelas, pudemos verificar que o efeito dos ácidos

graxos é ácido-dependente, linhagem-depedente, concentração-dependente e

tempo-dependente. Deste modo, é praticamente impossível propor um

mecanismo único para justificar a inibição de proliferação induzida por estes

ácidos graxos.

Quando pensamos em linhagem, observamos que MDA-MB-231 é

inibida tardiamente pelas maiores concentrações de EPA/DHA, CLA e ácido

linolênico, mas já é inibida precocemente pela maior concentração de ácido

linoleico.

A linhagem MCF-7 é resistente ao ácido linoleico, mais sensível do que

MDA-MB-231 ao EPA/DHA, já que sofre inibição mesmo na menor

concentração e só responde a CLA e ácido linolênico na maior concentração.

A linhagem SKBR-3 é resistente a CLA e ácido linoleico, mas ultra-

sensível a EPA/DHA e responsiva a ácido linolênico.

Este padrão de resposta é muito interessante, pois classicamente o

ácido linoleico é usado nos trabalhos como controle, pois este não altera o

resultado de MTT, conforme observamos aqui também. No entanto, embora

não tenha ocorrido alteração do resultado de MTT quando este ácido foi usado

em MDA-MB-231, ele exerceu importante efeito inibitório sobre esta linhagem,

que representa o tumor mais agressivo entre os três testados e para a qual não

há recursos terapêuticos específicos.

Diversos trabalhos, assumindo o potencial inibitório de ácidos graxos,

com base no resultado de MTT, utilizam CLA como inibidor e ácido linoleico

como controle, para caracterizar o mecanismo de inibição, ou simplesmente

não estudam o efeito de ácido linoleico, já assumido como não tendo efeito [24,

43, 55].

118

Embora a célula SKBR-3 tenha aparentemente sofrido efeito do hexano,

usado como veículo dos ácidos graxos, não houve alteranativa, além de

minimizar o efeito, usando o menor volume possível deste veículo. As

comparações foram todas feitas com este controle e de maneira muito

interessante, embora estas células sejam sensíveis ao veículo e tão sensíveis

a EPA/DHA, são resistentes a CLA, um clássico inibidor de proliferação e que

também foi dissolvido no mesmo veículo. Trabalhos já publicados, como o de

Flowers et al 89, mostram o efeito de CLA inibindo expressão de HER-2 na

superfície de SKBR-3, mas se baseiam na inibição de proliferação observada

por MTT.

Observamos então que a linhagem MDA-MB-231 é sensível tanto a

ômega-3 quanto ômega-6, assim como a MCF-7, mas a linhagem SKBR-3 é

sensível a ômega-3 e resistente a ômega-6.

Esta afirmação, no entanto, é complexa de ser feita, pois quimicamente

CLA pertence à família ômega-6, mas fisiologicamente pode ser classificado

como um não-6, o que faz com que se comporte como se fosse ômega-3. Isto

se dá porque estruturalmente ele é um membro da família ômega-6, mas ele

não gera seus clássicos derivados, como o ácido araquidônico. Logo, ao se

inserir na membrana das células, na posição C-2 dos triglicerídeos, ele não

fornece substrato para a formação das prostaglandinas clássicas. Da mesma

maneira se comportam os membros da família ômega-3. Deste modo,

podemos dizer que a linhagem SKBR-3 é resistente a um ácido graxo que é

estruturalmente ômega-6, mas funcionalmente ômega-3, e inferir que o

mecanismo de competição com ácido araquidônico na membrana, não é o

mecanismo que justifica sua inibição de proliferação. Logo, sua proliferação

não deve ser dependente de prostaglandinas, mecanismo clássico e esperado,

que foi descrito na introdução [58,59,60].

Quando fazemos a análise a partir dos ácidos graxos, observamos que

EPA/DHA inibe as três linhagens celulares; CLA apenas não inibe SKBR-3 e o

ácido linoleico inibe apenas a linhagem MDA-MB-231. Embora esta ação de

ácido linoleico sobre MDA-MB-231 seja inesperada, o mesmo padrão inibitório

foi observado na quadruplicata que fizemos dos pontos de interesse. Todos os

pontos que geraram dúvidas foram repetidos em quadruplicata e estes que

estão aqui descritos nas tabelas são os já retestados. Dependendo do grau de

119

inibição, a quadruplicata foi suficiente para obter resultados estatisticamente

significantes, mas em alguns casos, mesmo em quadruplicata, observa-se a

tendência, porém sem significância estatística.

Com o objetivo de observar o efeito destes ácidos graxos sobre

parâmetros celulares que vão além de proliferação, foi realizado o experimento

de scratch e o experimento de crescimento em suspensão de agarose. O

experimento de scratch consiste em remover uma área de células da placa,

após confluência de 70% e tratar as células por quatro dias para observar a

capacidade destas células de se redistribuirem pela área que foi raspada.

Neste ensaio foram utilizadas apenas as linhagens MCF-7 e MDA-MB-231 e

observou-se que ácido linolênico, CLA e EPA/DHA, inibem o deslocamento das

células, podendo chegar a 100% no caso de EPA/DHA, porém ácido linoleico,

em quatro dias de tratamento, não inibiu esta redistribuição, permitindo que

100% de confluência fosse atingido na área raspada.

Na curva de crescimento observamos efeitos inibitórios de ácido linoleico

sobre MDA-MB-231 apenas a partir do quinto dia e neste experimento de

scratch, não foi possível ver nenhum efeito, pois ele se estende até o quarto dia

apenas. No entanto, é possível concluir que inicialmente, nos três primeiros

dias, este efeito inibitório não está presente.

Uma das hipóteses é que os ácidos graxos, independente de tipo, são

mais susceptíveis a lipoperoxidação, podendo iniciar o processo de lesão da

membrana e inibição de proliferação quando o fenômeno ocorre. Este

fenômeno pode iniciar tardiamente, quando as células são mantidas por mais

tempo e é muito difícil de ser evitado nas condições de cultivo celular.

O ensaio de crescimento em suspensão de agarose é utilizado para

mimetizar a capacidade de colonização de uma área a partir de uma única

célula, sem necessidade de ancoragem, já que essa está impedida, devido à

camada de agarose que separa as células do fundo da placa e representa, in

vitro, o experimento mais próximo possível do ensaio de tumorigênese em

animal utilizando camundongos nude. Células normais necessitam de

ancoragem a uma matriz sólida para se manterem vivas e proliferarem. As

células normais, mantidas em suspensão, sem esta possibilidade de

ancoragem, porque existe uma matriz semi-sólida que impede sua adesão a

uma superfície, sofrem um processo especial de morte, chamado de anoikia.

120

As células tumorais, especialmente as mais invasivas, não sofrem anoikia e

formam colônias em suspensão, derivadas das diversas mitoses da célula

inicial.

Nas condições que testamos, as células MCF-7 formam colônias

macroscópicas, e as MDA-MB-231 e SKBR-3 formam microcolônias

microscópicas, mas que ficam viáveis por quatro semanas ou mais, permitindo

análise.

Pudemos observar que EPA/DHA inibiu a formação de colônias para

MDA-MB-231 e SKBR-3, mas não inibiu MCF-7. CLA inibiu a formação de

colônias de SKBR-3, assim como ácido linoleico, e ácido linolênico não exerceu

efeito inibitório.

Foi interessante observar que as inibições ocorreram apenas para a

maior concentração (200μM) dos ácidos graxos, o que nos faz pensar que

como se trata de uma cultura tridimensional, o volume e concentração de ácido

graxo testado deveria ser maior, para refletir o que é visto em monocamada,

onde a célula fica em contato com muito mais ácido graxo, por ser

bidimensional. Acreditamos que o efeito de CLA sobre SKBR-3, observado na

maior concentração e tardiamente, se dá porque as células ficam em

experimentação por 4 semanas, logo trata-se de um efeito tardio. De qualquer

maneira, estes experimentos, que foram realizados em duplicata, estão sendo

repetidos, para confirmação.

Um dos mecanismos propostos para a ação dos ácidos graxos testados

inibirem a proliferação celular, é através da indução da formação de espécies

reativas de oxigênio, por mecanismo pouco compreendido. É sabido que

quando as células são tratadas com estes tipos de ácidos graxos livres, esses

passam a ser incorporados nas suas membranas, cuja composição é então,

alterada, alterando a fisiologia celular. A maneira como a alteração desta

composição induz a formação de radicais livres e consequentemente a morte

celular por apoptose, ainda não foi detalhado, embora estes sejam geralmente

os mecanismos de inibição de proliferação propostos.

Com o objetivo de avaliar se o tratamento com os ácidos graxos altera o

equilíbrio redox das diferentes linhagens celulares, três experimentos foram

propostos. Um deles, é a avaliação da expressão de superóxido dismutase 2

(SOD-2), e foi feito por imunocitoquímica. Outro ensaio proposto é o da

121

quantificação da atividade de SOD e o outro, de quantificação de EROS. Um

compilado destes resultados se encontra na tabela 13.

No ensaio de expressão de SOD-2, há uma grande dificuldade que é o

fato de qualquer manipulação já alterar a expressão da enzima, como pode ser

visto nos próprios controles. É inevitável isso acontecer, mas comparando os

tratamentos com os controles, observamos que houve diminuição da expressão

em MCF-7 tratada com ácido linolênico e linoleico e aumento da expressão da

mesma em MDA-MB-231 quando tratada com EPA/DHA, CLA e ácido

linolênico, mas não linoleico. Esta resposta de expressão de superóxido

dismutase pode estar diretamente relacionada com a resposta de inibição de

proliferação das células frente ao tratamento com os ácidos. A capacidade de

aumentar expressão e atividade de SOD e portanto, não produzir EROS/ENOS

ou eliminar rapidamente o produzido, pode ser a chave que garante resposta

diferencial das células e na literatura é abordado como o possível motivo pelo

qual células normais não sofrem efeito inibitório com os ácidos graxos, mas

células tumorais sim[90]. Não podemos deixar de citar que o efeito é

quantitativo, já que uma pequena quantidade de EROS funciona como estímulo

para proliferação celular e o excesso tem o efeito oposto, gerando morte

celular. No entanto, é difícil fazer esta análise de maneira simplificada, uma vez

que existem outras enzimas com papel semelhante a SOD que participam do

equilíbrio redox.

Seria de se esperar que as células que sofrem inibição de proliferação

pelo tratamento com os ácidos graxos, tivessem diminuição da expressão de

SOD, mas não foi isso que foi visto em todos os casos. Funcionou para MCF-7

com ácido linolênico, mas não para os outros. Se o mecanismo de morte é

induzido por EROS, então uma diminuição de expressão de SOD deixaria as

células mais susceptíveis.

Para verificar se além da expressão de SOD2, havia alguma alteração

na atividade de SOD presente, foi feito o ensaio de atividade enzimática e de

maneira interessante, encontramos que em MCF-7, além da expressão estar

diminuida, a atividade global de SOD está diminuida. Os dados se confirmam

um ao outro, mostrando que realmente estas células, ao serem tratadas com

ácido linolênico têm menor potencial de detoxificação via superóxido dismutase

e sofrem inibição de proliferação. O mesmo acontece para estas células

122

quando tratadas com EPA/DHA, no entanto a linhagem MDA-MB-231

apresenta aumento de atividade de SOD quando tratada com CLA e com ácido

linoleico. Ambos ácidos inibem proliferação e provavelmente geram mais

EROS nas células, tendo aumento de atividade de SOD como resposta.

Aparentemente, se o mecanismo de morte é por formação de EROS, o

aumento observado de atividade de SOD não é suficiente para debelar os

EROS formados.

Avaliando a formação de EROS, que esperava-se estar aumentada em

diversas situações, observamos que ao contrário, ela está diminuida nestas e

ai fica a dúvida do que é causa e do que é consequência. Por exemplo, houve

aumento da atividade de SOD quando MDA-MB-231 foi tratada com CLA e

ácido linoleico e esperáva-se que este aumento de SOD fosse devido a um

aumento de EROS, mas ao contrário, encontramos menor quantidade de

EROS nestas. Nossa hipótese é que em um momento muito inicial, EROS se

eleva, estimula a produção de SOD, que então elimina estes EROS. Tudo é

uma questão de cinética e nossa observação foi tardia, pós atividade de SOD.

Esta hipótese se confirma quando no gráfico da figura 29, observamos

nível normal de EROS para estas células, quando tratadas com EPA/DHA por

2 horas. CLA mostra diminuição nesta fase aguda, mas provavelmente porque

seu efeito é mais agudo ainda. Neste período de 2 horas, ainda não foi possível

a SOD atuar para eliminar todos os EROS formados pelo tratamento com ácido

linoleico (figura 30), o que ocorre quando o tratamento persiste por 24 horas

(figura 28).

O ácido linolênico diminui a atividade de SOD em MCF-7, mas não se

observa alteração do conteúdos de EROS nestas células, pelo menos em 24

horas.

Não observamos diferenças estatisticamente significantes na produção

de EROS ou atividade de SOD quando a linhagem SKBR-3 foi analisada,

embora pareça haver uma tendência de aumento de formação de EROS

quando EPA/DHA são usados, justamente quando morte acontece

intensamente para estas células.

Aparentemente, para compreender melhor o papel da formação de

EROS e ativação de enzimas como SOD nestas células e seu envolvimento

com proliferação celular, teremos que fazer um estudo mais detalhado,

123

incluindo uma cinética, com múltiplas medições, pois as alterações são muito

rápidas e fica difícil avaliar se as alterações de expressão e atividade de SOD,

bem como de formação de EROS são causa ou consequência umas das outras

e de que forma influenciam o processo de morte celular.

É descrito na literatura que embora se associe da formação de espécies

reativas de oxigênio com a morte celular induzida pelos ácidos graxos, em

algumas linhagens, como MCF-7 e MDA-MB-231, o uso de antioxidantes, como

vitamina E e C, não reverteu o processo de morte celular induzido por

EPA/DHA, evidenciando que o mecanismo é mais complexo ou novamente,

que tudo é uma questão de cinética [55, 66].

Para completar esta série de dados foi realizado também um ensaio de

apoptose, pelo método da detecção de anexina V e iodeto de propídeo. O

iodeto de propídeo mostra se houve morte celular e a anexina V mostra se esta

morte foi por apoptose ou necrose, uma vez que durante o processo de

apoptose, alterações específicas da membrana celular fazem esta se ligar à

anexina V marcada com fluorescência, o que pode ser facimente observado em

um microscópio de fluorescência ou citômetro de fluxo.

No resultado de morte celular, pudemos observar que na linhagem MDA-

MB-231 ocorre morte por apoptose quando tratada com EPA/DHA na

concentração de 100µM e também CLA quando tratada por 8 dias, ou mesmo

24 horas na concentração de 200μM.

Para a linhagem SKBR-3, houve um problema, pois como esta é

bastante sensível, ao avaliar se havia apoptose ou não nas condições

descritas, a grande maioria das células já estava morta, na forma de debris e

não foi contada. As células restantes eram na sua maioria resistentes a

apoptose. Este ajuste cinético terá que ser levado em consideração para refinar

este experimento.

De qualquer modo, observamos que em todas as situações em que

ocorreu morte, esta se deu por apoptose ou necrose secundária à apoptose,

mas não necrose primária. Portanto, este experimento contribuiu para ilustrar

que o mecanismo de morte celular impresso pelos ácidos graxos é realmente a

apoptose.

Seria intuitivo observar apoptose no tratamento de MDA-MB-231 com

ácido linoleico, mas ao mesmo tempo, se observarmos a curva de crescimento

124

destas células para a concentração de 200μM, notamos que nunca chega a

haver proliferação celular. Ao longo dos 9 dias de tratamento a concentração

de células é a mesma, mostrando um potencial efeito citostático e não

citotóxico. Pensando desta maneira, é aceitável pensar que o mecanismo de

parada de crescimento não se dá por morte celular, mas por inibição de

proliferação e quiescência, o que só pode ser afirmado se experimentos mais

detalhados forem feitos, o que é de grande interesse, já que esta linhagem

representa um tumor órfão de tratamento específico na clínica e que

apresentou esta resposta a ácido linoleico que nenhuma outra linhagem

apresenta.

De maneira interesante, as linhagens de melanoma (MDA-MB-435) e

sarcoma (Hs578t), também embora não fossem carcinoma, também

apresentaram um padrão de inibição de proliferação muito semelhante ao dos

carcinomas testados, inclusive sofrendo inibição de proliferação quando ácido

linoleico foi utilizado. É surpreendente que justamente os tumores mais

agressivos apresentem resposta ao ácido linoleico que geralmente é usado

como controle. Uma possibilidade é que sendo precursor de ácido

araquidônico, este disponibilize mais substrato para ciclooxigenase (COX) e

lipoxigenase (LOX), gerando um ambiente abundante em prostaglandinas,

leucotrienos e tromboxanas, que podem exercer diversos efeitos sobre as

células, inclusive parada de crescimento. É nítido nas curvas de proliferação

celular, que enquanto EPA/DHA induzem morte celular e chega-se ao final com

menos células do que foi plaqueado, o ácido linoleico apenas inibe proliferação,

a população celular flutuando em número ao redor do que foi plaqueado.

O mecanismo mais lógico para explicar a alteração da fisiologia celular

frente ao tratamento com ácidos graxos é a modificação da composição

lipídica, disponibilizando diferentes ácidos graxos no citoplasma durante

processos em que há ativação de fosfolipase A2 (PLA2), por exemplo, como os

processos inflamatórios. Comumente, a ação de PLA2 libera intracelularmente

o ácido araquidônico, da família ômega-6 e que serve de substrato

principalmente para as enzimas COXe LOX, produzindo uma série de

prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanas, com importante papel fisiológico.

Na medida em que temos ácido linolênico, CLA, linoleico, ou EPA e DHA

substituindo o carbono 2 dos triglicerídeos de membrana, a ação da PLA2 não

125

disponibiliza o substrato clássico das enzimas COX e LOX e altera-se a

resposta celular frente a estimulos inflamatórios ou mesmo proliferativos. Há

trabalhos citados aqui na introdução sobre as resolvinas, mostrando que as

células tratadas com ácidos graxos específicos ficam resistentes a agentes pró-

inflamatórios, não produzindo prostaglandinas específicas.

Entre os estudos disponibilizados na literatura, em que se estuda um

ácido graxo ou outro, em uma linhagem ou outra, encontramos estudos que

testaram EPA e DHA isoladamente sobre MDA-MB-231 e observaram inibição

de proliferação da ordem de 30-40%, com diminuição de fosforilação de Akt e

indução de atividade de caspase[55]. Bocca et al.,[42] mostrou que CLA inibe

proliferação de MCF-7 e MDA-MB-231, também diminuindo a atividade da via

de MAPK e induzindo apoptose.

Amarù et al., [44] testou isômeros isolados de CLA (t10c12 e c9t11) e

observou que ambos têm efeito inibitório de proliferação sobre MCF-7, mas que

t10c12 inibe mais fortemente. Huot et al.,[91] tratou MCF-7 com CLA e observou

diminuição da expressão de caveolina-1, tentando correlacionar a inibição de

proliferação com alteração na disponibilização de receptores na membrana.

Há poucos trabalhos abrangentes sobre o efeito global destes ácidos

graxos sobre linhagens celulares tumorais ou não. Em 2011, Magdolon et al.,

[92] fez o proteoma de células normais NIH-3T3 tratadas e não tratadas com

alguns destes, mas não obteve resultados conclusivos. Dos poucos resultados,

nenhum foi confirmado por Western Blot. Este trabalho, relativamente recente,

mostra que o mecanismo ainda está sendo explorado em diversos trabalhos.

Os trabalhos mais convincentes de que o efeito anti-proliferativo é

dependente de formação de EROS/ENOS são aqueles em que a inibição

exercida pelos ácidos graxos é bloqueada ao se tratar as células

concomitantemente com antioxidantes, como vitamina C e E [92].

Um trabalho muito interessante de 2004, de Ding et al.,[93] , mostra que

a resposta a DHA de várias linhagens tumorais diferentes é diversa, algumas

apresentando IC50 de 5,2µM e outras IC50 de 300µM. Nestas mais sensíveis

houve grande aumento de EROS e diminuição da expressão de SOD, não

acontecendo o mesmo nas mais resistentes. Ao manipular geneticamente a

expressão de SOD nas células, foi possível inverter estes comportamentos.

126

Estudos em animais, contribuem para este cenário fragmentado,

elucidando alguns pontos interessantes. Por exemplo, Hardman em 1997 [94]

demonstrou que ao injetar MDA-MB-231 em camundongos, induzir

lipoperoxidação com ferro e tratar os animais com óleo de peixe, rico em

EPA/DHA, há diminuição significativa do tumor, por ação dos ácidos graxos,

mesmo in vivo, mas nenhum outro tecido é afetado, mostrando a especificidade

da inibição dos ácidos graxos sobre células tumorais, poupando as células

normais.

Este trabalho é apenas o primeiro de muitos que precisam ser realizados

para elucidar o papel dos ácidos graxos como inibidores de proliferação. Sem

estes dados iniciais fica difícil lançar projetos dirigidos por hipóteses, mas

acreditamos que com o término deste, diversas hipóteses a serem exploradas

poderão ser desenhadas.

Os interesses iniciais são aprofundar os estudos da linhagem MDA-MB-

231 que representa um tumor para o qual não há terapia específica. O fato de

estas células terem sido inibidas por todos os ácidos graxos testados, não só

abre possibilidades de exploração terapêutica, como permite inferir que o

mecanismo de ação não é dependente de uma família específica de ácidos

graxos.

Há grande interesse também em profundar os estudos sobre o

mecanismo de ação através do qual os ácidos graxos exercem inibição de

proliferação. No caso da linhagem MDA-MB-231, houve diminuição de

formação de EROS em todos os tratamentos, indicando possível ativação de

enzimas antioxidantes pelos ácidos graxos. No entanto, apenas em algumas

condições a superóxido dismutase foi ativada, indicando que deve haver outras

enzimas ativadas por estas moléculas, como glutationa peroxidase e outras;

A diminuição de EROS provavelmente é um efeito secundário.

Imaginamos que de início, há aumento de formação de EROS, que ativam as

enzimas antioxidantes, gerando o efeito observado. Uma cinética mais

detalhada será realizada para verificar o ponto em que há diminuição da

formação de EROS e quais as enzimas antioxidantes envolvidas no processo.

Por não haver especificidade de família de ácido graxo atuando como

inibidor de proliferação, é possível que o haja vários mecanismos diferentes

envolvidos, inclusive com a possibilidade de que o efeito seja provocado por

127

alterações físico-químicas da membrana celular, por substituição dos ácidos

graxos originais pelos ácidos graxos utilizados no tratamento.

128

6. Conclusões

As curvas de crescimento, tanto em substrato sólido quando em

suspensão de agarose, foram uma maneira eficiente de demonstrar o efeito

dos ácidos graxos sobre o padrão de proliferação de diferentes linhagens

celulares.

A resposta destas células é heterogênea e depende da concentração do

ácido graxo e do tempo de tratamento. Ao contrário do que diz a literatura,

tanto ácidos graxos da família ômega-3 quanto ômega-6 são capazes de inibir

a proliferação celular e tanto os precursores dietéticos quanto os metabolizados

em animal exercem este tipo de efeito.

Observamos também que células com perfis diferentes de expressão de

receptores de superfície respondem de maneira diferente a um mesmo ácido

graxo e que a maior parte das respostas é obtida em tratamentos mais tardios

e nas maiores concentrações de ácidos graxos, embora tenha havido

sensibilidades especificas em que uma determinada linhagem apresentou

efeitos precocemente e em resposta a baixas concentrações dos ácidos

graxos.

Observamos que há alteração do equilíbrio redox, no que diz respeito a

expressão e atividade de SOD e formação de EROS, no entanto, estas

respostas são muito imediatas e para melhor caracterizar o papel deste

mecanismo de controle, outras enzimas, como catalase e glutationa peroxidase

precisam ser analisadas e também em outros tempos de tratamento, para

definir o que é causa e o que é efeito. Algumas condições que induziram

inibição de proliferação não tiveram o reflexo de maior formação de EROS ou

diminuição de expressão e atividade de superóxido dismutase, como seria

esperado.

Observou-se que nos casos em que há morte celular, esta se dá por

apoptose, gerando necrose secundária, mas não necrose diretamente. Em

algumas situações em que houve inibição de proliferação, não foi detectada

apoptose, provavelmente porque as células nunca proliferaram para morrer e

permaneceram em estado de quiescência desde o início do tratamento.

129

Este trabalho foi a base para o desenvolvimento de diversos outros que

se seguirão, agora com melhor direcionamento, para resolver os pontos de

interesse.

Um dos principais interesses advindos desta tese é o aprofundamento

do efeito de ácido linoleico sobre a linhagem MDA-MB-231, como mencionado,

representante de um tumor órfão de tratamento específico, podendo resultar

grande benefício clínico do aprofundamento dos estudos sobre esta linhagem

específica.

Não foi possível desvendar o mecanismo de ação dos ácidos graxos e

nem era o proposto inicialmente, mas foi possível concluir que provavelmente

há múltiplos mecanismos envolvidos, pois nenhum dos possíveis explicaria o

comportamento observado em todas as condições, de maneira global.

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140

8. Resumo

Introdução: Tem sido cada vez mais comum a busca por potenciais

agentes antitumorais em nossa dieta, para que possam ser oferecidos como

suplementos alimentares, principalmente em quimioprevenção, ou seja, para

proteger indivíduos que apresentam risco aumentado de desenvolvimento de

tumor. Entre os diversos produtos dietéticos explorados, estão os ácidos

graxos das famílias ômega-3 e ômega-6, cujo potencial inibidor de proliferação

é conhecido, mas controverso, porque faltam estudos sistemáticos que

caracterizam o efeito de ácidos graxos diferentes sobre células tumorais

diferentes, permitindo uma conclusão mais global sobre o espectro de ação

destes e mesmo o mecanismo de ação, ainda pouco conhecido.

Objetivo: Verificar o efeito de quatro ácidos graxos diferentes, das

famílias ômega-3 (ácido linolênico, EPA/DHA) e ômega-6 (ácido linoleico,

CLA), sobre três linhagens celulares diferentes, representativas de carcinomas

mamários comumente encontrados na clínica (MCF-7/luminal A, SKBR-3/HER-

2, MDA-MB-231/triplo negativo), além de duas linhagens não-carcinoma

(Hs578t/sarcoma de mama, MDA-MB-435/melanoma), de modo comparativo,

para evidenciar se o efeito é restrito a uma família de ácidos graxos apenas e

se é o mesmo para todas as linhagens tumorais testadas.

Material e Métodos: Os ácidos graxos foram obtidos da empresa Sigma-

Aldrich ou no caso de EPA/DHA, extraídos de cápsulas de óleo de peixe,

disponíveis comercialmente, e foram testados sobre as culturas celulares nas

concentrações de 50µM, 100 µM e 200 µM, em um intervalo que variou de 1 a

9 dias. As linhagens celulares foram doadas pelo NUCEL-USP e os ensaios

realizados foram os seguintes: curva de crescimento em substrato sólido,

crescimento em suspensão de agarose, viabilidade celular por MTT, ensaio de

“scratch” para migração celular, imunocitoquímica para expressão de SOD-2,

ensaio enzimático para atividade de SOD e citometria de fluxo com marcadores

específicos para formação de EROS e apoptose.

Resultados: Foi possível observar que a resposta das células varia de

acordo com o ácido graxo utilizado e a resposta ao ácido varia de acordo com

a célula testada. A resposta é concentração e tempo dependente e não há

como generalizar dizendo que apenas ômega-3 exerce efeito anti-proliferativo,

141

o que é comum de se encontrar na literatura. Há envolvimento de alterações no

equilíbrio redox, sendo que tanto a expressão de SOD quanto sua atividade e a

taxa de formação de EROS apresentam flutuações ao longo do tratamento, nos

períodos observados. Estas respostas também são célula-dependente, ácido

graxo-dependente e concentração-dependente. O mecanismo de morte celular

quando esta acontece, é a apoptose, mas nem sempre essa está presente.

Conclusão: Diferentes células derivadas de carcinomas mamários, além

de um sarcoma e um melanoma sofrem inibição de proliferação por ação de

ácidos graxos das famílias ômega-3 e -6, mas não há especificidade de efeito

para uma família ou outra. Este efeito é célula-dependente, tempo-dependente

e dose-dependente. O mecanismo envolve, em alguns casos, alterações no

equilíbrio redox, mas estas não explicam todos os fenômenos de inibição de

proliferação observados, além do que não foi possível estabelecer a relação de

causa e consequência. O mecanismo de morte celular induzido pelos

tratamentos é a apoptose, mas nem sempre os tratamentos induzem morte.

Observou-se tanto efeito citotóxico quanto citostático. O ácido linoleico

despontou como alternativa terapêutica a ser explorada para tumores triplo

negativos, uma vez que inibiu a proliferação de MDA-MB-231.

Palavras-chave: ácidos graxos poli-insaturados, proliferação celular,

câncer de mama, morte celular, espécie reativa de oxigênio

142

9. Abstract

Introduction: The search for potential antitumor agents, that can be given

as food supplements, has been more and more common, mainly for

chemoprevention, that is, protecting individuals that present higher risk of tumor

development. Among the several diet products explored, we find the omega-3

and omega-6 fatty acids, whose proliferation inhibition potential is known,

although controversial, because we lack systematic studies which characterize

the effect of different fatty acids on different tumor cells, allowing a more global

conclusion on their inhibitory potential and also their mechanism of action, still

mostly unknown.

Objective: To verify the effect of four different fatty acids, from omega-3

(linolenic acid, EPA/DHA) and omega-6 (linoleic acid, CLA) families, on three

different cell lines, representing breast carcinomas which are commonly found

in the clinics (MCF-7/luminal A, SKBR-3/HER-2, MDA-MB-231/triple-negative),

besides two non-carcinomatous cell lines (Hs578t/breast sarcoma, MDA-MB-

435/melanoma), in a comparative way, to evidence if the effect is restricted to

one family of fatty acids and if it is the same for all tumor cell lines tested.

Material and methods: Fatty acids were obtained from Sigma-Aldrich, or

in the case of EPA/DHA, extracted from commercially available fish oil

capsules, and were tested on the cell cultures in the concentrations of 50µM,

100µM and 200µM, in an interval that ranged from one to nine days. Cell lines

were transferred to our group from the NUCEL-USP and the following assays

were performed: growth curve in solid substrate, growth in semi-solid medium,

MTT, scratch assay for cell migration, immunocytochemistry for SOD-2

expression, enzyme assay for SOD activity and flow cytometry using specific

markers to detect ROS and apoptosis/necrosis.

Results: It was possible to observe that the cells response varies

according to the fatty acid used and that the response to the acid varies

according to the cell line tested. The response is concentration- and time-

dependent and it is not possible to make general assumptions such as saying

that only omega-3 fatty acids exert anti-proliferative effects, which is commonly

found in the literature. An involvement in the redox equilibrium is present, since

both SOD expression and activity, plus ROS formation present fluctuations

143

during treatment in the observed periods. These responses are also cell-

dependent, fatty acid-dependent and concentration-dependent. The mechanism

of cell death, when it is happens, is apoptosis, but it is not always present.

Conclusions: Different cell lines derived from breast carcinomas, besides

a sarcoma and a melanoma, suffer proliferation inhibition due to the action of

fatty acids from omega-3 and omega-6 families, but there is no specificity of

effect from one family or the other. This effect is cell-dependent, time-

dependent and dose-dependent. The mechanism involves, in some cases,

alterations in the redox equilibrium, but these do not explain all the phenomena

of proliferation inhibition observed, besides the fact that it was not possible to

establish the cause and consequence relation. The mechanism of cell death

induced by the treatment is apoptosis and secondary necrosis, but it is not

always that the treatment conditions promote death. Both a cytotoxic and a

cytostatic effect were observed. Linoleic acid showed to be a potential

therapeutic alternative to be explored for triple-negative tumors, since it

surprisingly inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells.

Keywords: polyunsaturated fatty acids, cell proliferation, breast cancer,

cell death, reactive oxygen species

144

10. Anexos

Anexo I

145

Anexo II

Documents

Viviani Olivastro Bressani