Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 1 6/7/2011
FERMENTAO ALCOLICA .................................................................................... 9
Microbiologia Bsica .................................................................................................... 9
Leveduras ................................................................................................................. 9
Morfologia da clula ............................................................................................. 9
Forma da clula ................................................................................................ 9
Tamanho da clula ............................................................................................ 9
Estrutura da clula .............................................................................................. 10
Parede celular ................................................................................................. 10
Membrana citoplasmtica ou Plasmalema ..................................................... 10
Ncleo ............................................................................................................. 11
Vacolos ......................................................................................................... 11
Mitocndria .................................................................................................... 12
Citoplasma ...................................................................................................... 13
Cpsulas .......................................................................................................... 13
Reproduo ......................................................................................................... 13
Reproduo vegetativa ................................................................................... 13
Reproduo por esporos ................................................................................. 14
Fisso .............................................................................................................. 14
Leveduras contaminantes ou nativas .................................................................. 14
Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras....................... 17
Nutrio e crescimento das leveduras ................................................................ 19
Bactrias ................................................................................................................. 20
Morfologia das clulas bacterianas..................................................................... 20
Forma das bactrias ........................................................................................ 20
Dimenses da clula bacteriana ...................................................................... 21
Estrutura bacteriana ............................................................................................ 21
Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ............................................... 23
Citoplasma ...................................................................................................... 23
Material celular ............................................................................................... 23
Flagelos ........................................................................................................... 24
Cpsulas .......................................................................................................... 24
Reproduo bacteriana ....................................................................................... 24
Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana ............................................ 26
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 2 6/7/2011
Caracterizao e Classificao dos Microrganismos.......................................... 27
Classificao em Nvel de Gnero.................................................................. 28
Classificao em Nvel de Espcie ................................................................. 29
Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool ............................................ 30
Estudo do fenmeno da floculao ......................................................................... 37
Medida da Floculao ......................................................................................... 39
Monitoramento e interpretao dos dados do laboratrio industrial .......................... 40
Tabela para interpretao das anlises laboratoriais ............................................... 41
Procedimentos ........................................................................................................ 43
Fatores que afetam o desempenho fermentativo ........................................................ 47
Glicerol ................................................................................................................... 48
cido succnico ...................................................................................................... 49
cido actico .......................................................................................................... 49
Biomassa ................................................................................................................. 50
Estequiometria da fermentao .............................................................................. 50
Carboidratos de reserva .......................................................................................... 50
Espcie de levedura ................................................................................................ 51
Identificao de leveduras pela tcnica da cariotipagem .................................... 52
Permanncia de leveduras tradicionais no processo fermentativo ..................... 53
Seleo de linhagens para fermentao industrial .............................................. 53
Nutrio mineral da levedura ................................................................................. 54
Principais nutrientes e suas funes ................................................................... 55
Potssio ........................................................................................................... 55
Magnsio ........................................................................................................ 55
Clcio .............................................................................................................. 55
Zinco ............................................................................................................... 56
Mangans ........................................................................................................ 56
Ferro ............................................................................................................... 56
Cobre .............................................................................................................. 56
Molibidenio, Cobalto e Boro .......................................................................... 56
Nitrognio ....................................................................................................... 56
Fsforo ............................................................................................................ 57
Enxofre ........................................................................................................... 58
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 3 6/7/2011
Inibidores da fermentao ...................................................................................... 58
Alumnio ............................................................................................................. 58
Sulfito ................................................................................................................. 59
Temperatura ........................................................................................................ 59
pH ....................................................................................................................... 60
Contaminao bacteriana .................................................................................... 61
MATRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAO ALCOLICA ................................. 62
Caldo: composio, pr-tratamento, controle de qualidade ....................................... 62
Composio ............................................................................................................ 62
Pr-tratamento do caldo .......................................................................................... 63
Processos de tratamento ......................................................................................... 63
Processo de tratamento do caldo para destilaria 1 ........................................... 63
Processo de tratamento do caldo para destilaria 2 ........................................... 64
Processo de tratamento do caldo para destilaria 3 ........................................... 64
Processo de tratamento do caldo para destilaria 4 ........................................... 64
Controle de qualidade do caldo .............................................................................. 65
Mel final: composio, armazenamento e controle de qualidade. .............................. 65
Composio ............................................................................................................ 65
Armazenamento ...................................................................................................... 66
Controle de qualidade ............................................................................................. 66
CONTROLE MICROBIOLGICO MICROSCOPIA ............................................... 67
Microscpio tico ....................................................................................................... 67
Microscopia de Campo Claro ................................................................................. 67
Parte mecnica .................................................................................................... 68
Parte ptica ........................................................................................................ 68
Recomendaes para uso do microscpio tico ................................................. 68
Antes de iniciar o uso. .................................................................................... 68
Ajuste da Dioptria ........................................................................................... 69
Manuteno do equipamento .............................................................................. 69
Mtodo de determinao da viabilidade celular de leveduras .................................... 70
Especificaes da cmara de NEUBAUER............................................................ 71
Preparo das solues ............................................................................................... 72
Soluo estoque de Eritrosina............................................................................. 72
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 4 6/7/2011
Tampo Fosfato .................................................................................................. 72
Soluo de trabalho ............................................................................................ 73
Procedimento analtico ........................................................................................... 73
Clculos .................................................................................................................. 74
Viabilidade celular .............................................................................................. 74
Contagem de clulas em brotamento .................................................................. 74
Populao de Leveduras ..................................................................................... 74
Exerccios ........................................................................................................... 75
Mtodo para contagem de bactrias ao microscpio tico ......................................... 75
Preparo das solues ............................................................................................... 77
Soluo A - sulfato azul de nilo - 2,0% .............................................................. 77
Soluo B - azul de metileno - 0,20% ................................................................ 77
Soluo de trabalho ............................................................................................ 77
Procedimento analtico ........................................................................................... 78
Amostras de caldos, PCTS, primrio e misto ..................................................... 78
Amostras de vinho bruto e levedo tratado .......................................................... 78
Clculos .............................................................................................................. 79
Exerccios ........................................................................................................... 79
Teste de Gram ............................................................................................................. 80
Preparo das solues ............................................................................................... 80
Soluo de cristal violeta .................................................................................... 80
Soluo de safranina ........................................................................................... 81
Soluo de iodo-lugol ......................................................................................... 81
Procedimento analtico ........................................................................................... 81
Para Microrganismos em Suspenso Lquida ..................................................... 81
Para Microrganismos de Cultivos Slidos ......................................................... 82
Tcnica de Colorao ......................................................................................... 82
Interpretao ........................................................................................................... 83
Quantificao .......................................................................................................... 84
Deteco de esporos ................................................................................................... 84
Preparo das solues ............................................................................................... 85
Soluo de verde malaquita .................................................................................... 85
Soluo de safranina ............................................................................................... 85
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 5 6/7/2011
Procedimento analtico ............................................................................................... 85
Interpretao/Quantificao dos Esporos ............................................................... 86
Teste de Floculao .................................................................................................... 87
Procedimento Analtico .......................................................................................... 87
Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos, atravs da variao da acidez .. 88
Preparo das solues ............................................................................................... 89
Soluo estoque de actidiona (inibidor de leveduras). ....................................... 89
Soluo estoque de Antimicrobianos ................................................................. 89
Procedimento analtico ........................................................................................... 89
Determinao da acidez .......................................................................................... 90
Determinao da acidez sulfrica (inicial e final) das amostras. ...................... 90
Clculo ................................................................................................................ 91
Interpretao dos resultados ............................................................................... 91
Exemplo .................................................................................................................. 92
Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos por spectrofotometria ............... 92
Preparo das Solues Estoque ................................................................................ 92
Meios de Cultivo .................................................................................................... 93
Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer, 1961) ..................................................... 93
Meio de Cultivo ( GLT) ..................................................................................... 93
Preparo do Inculo ................................................................................................. 94
Realizao do Teste ................................................................................................ 94
Leitura da Densidade ptica ( D. O . ) ................................................................... 95
Interpretao dos Resultados .................................................................................. 95
Relao de materiais necessrios para instalao do laboratrio de controle
microbiolgico microscopia .................................................................................... 96
Equipamentos ......................................................................................................... 96
Vidraria ................................................................................................................... 96
Reagentes ................................................................................................................ 96
Outros ..................................................................................................................... 97
Pipetadores automticos ......................................................................................... 97
Modelos de boletim para o controle microbiolgico por microscopia ....................... 97
Matria-prima ......................................................................................................... 97
Moenda ................................................................................................................... 98
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 6 6/7/2011
Fermentao ........................................................................................................... 98
CONTROLE MICROBIOLGICO PLAQUEAMENTO .......................................... 99
Introduo ................................................................................................................... 99
Esterilizao ............................................................................................................... 99
Esterilizao por Calor mido - Autoclave ........................................................... 99
Constituio da Autoclave ................................................................................ 101
Operao da autoclave .......................................................................................... 101
Esterilizao por Calor Seco ................................................................................ 102
Esterilizao por calor seco Estufa ................................................................ 103
2.1.2 Operao da estufa .............................................................................. 103
Esterilizao por Filtrao .................................................................................... 103
MEIOS de CULTIVO .................................................................................................. 104
Plate Count Agar (P C A - Agar Padro) Bactrias Aerbios Mesfilas Totais .. 104
gar- Man, Rogosa & Sharpe (MRSA) - Bactrias Lcticas Totais .................... 105
Extrato de Levedura- Peptona- Dextrose - gar (YEPD + A) Leveduras .......... 105
Meio Mayeux & Colmer Teste de Sensibilidade ............................................... 105
Meio de Cultivo G. L .T. Teste de Sensibilidade .................................................. 106
INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO Solues Estoque ............... 106
Bactrias ................................................................................................................... 106
Leveduras ................................................................................................................. 106
MTODOS PARA CONTAGEM DE CLULAS VIVEIS: LEVEDURAS E
BACTRIAS ................................................................................................................ 107
Plaqueamento por Incorporao ou Profundidade (Mtodo Pour Plate) .............. 107
Diluio em srie ...................................................................................................... 107
Tcnica de plaqueamento ......................................................................................... 108
Clculo do nmero UFC/ml. .................................................................................... 108
Plaqueamento de Superfcie (Mtodo Spread Plate) ............................................. 109
Clculo do nmero de UFC/ml ............................................................................. 110
Avaliao da Populao Microbiana por Filtrao em Membrana. ......................... 110
Procedimento analtico ......................................................................................... 112
Clculo do nmero de UFC/ml ............................................................................. 112
Cultivo por Estrias .................................................................................................... 113
Procedimento analtico ......................................................................................... 113
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 7 6/7/2011
Cultivo em PetriFilm ............................................................................................. 114
Procedimento analtico ......................................................................................... 114
Clculo do nmero de UFC/ml ............................................................................. 115
OUTRAS ANLISES .................................................................................................. 115
Avaliao da Floculao da Levedura ...................................................................... 115
Procedimento Analtico .................................................................................... 116
FLOCULAO DAS CLULAS DE LEVEDURAS ................................................ 117
Floculao da levedura pela bactria Lactobacillus fermentum ............................... 119
Aspectos gerais ..................................................................................................... 120
Aspectos genticos ............................................................................................... 122
Ao de ons ......................................................................................................... 123
Aspectos fsico-qumicos ...................................................................................... 124
Aspectos qumicos ................................................................................................ 124
Mecanismos de floculao ................................................................................... 124
Hidrofobicidade celular .................................................................................... 124
Ligao tipo-lectina .......................................................................................... 125
Reconciliao dos dois mecanismos ................................................................ 125
Cofloculao levedura-bactria ............................................................................ 125
Ao de bactrias .................................................................................................. 126
Consideraes importantes ................................................................................... 127
CIDO LTICO .......................................................................................................... 128
Produo de cidos por microrganismos .................................................................. 128
Histrico ............................................................................................................... 128
Consideraes Gerais ........................................................................................... 129
Bactrias lticas ................................................................................................ 129
Requerimentos nutricionais .............................................................................. 130
Caractersticas da colnia ................................................................................. 130
Tolerncia acidez: .......................................................................................... 130
Padres de fermentao de carboidratos em bactrias lticas .............................. 130
Bactrias homofermentativas ........................................................................... 130
Bactrias heterofermentativas .......................................................................... 131
Principais bactrias lticas .................................................................................... 131
TIPOS DE FERMENTAO ALCOLICA .............................................................. 131
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 8 6/7/2011
Fermentao descontnua ou batelada ...................................................................... 131
Conduo da fermentao .................................................................................... 131
Providencias preliminar para partida ................................................................ 131
Partida e sistemas de partida ............................................................................. 132
Partida com tubo de cultura pura .................................................................. 133
Partida com leite de fermento selecionado ................................................... 135
Partida com fermento prensado .................................................................... 137
Controle operacional da fermentao contnua ........................................................ 138
Introduo e estratgias ........................................................................................ 138
Interpretao dos parmetros do laboratrio ........................................................ 139
Critrios de dimensionamento da fermentao alcolica ......................................... 140
Dornas ................................................................................................................... 140
Resfriamento de dornas ........................................................................................ 142
Centrfugas de fermento ....................................................................................... 144
Tratamento do fermento p-de-cuba.................................................................. 145
PERDAS DURANTE O PROCESSO .......................................................................... 145
Qualidade da cana-de-acar .................................................................................... 146
Lavoura ................................................................................................................. 146
Carregamento, transporte e recepo .................................................................... 147
Armazenamento: ptio e barraco ........................................................................ 147
Lavagem ............................................................................................................... 148
Preparo e extrao ................................................................................................ 148
Caldo e mosto ........................................................................................................... 149
Aquecimento e decantao ................................................................................... 149
Resfriamento do mosto ......................................................................................... 151
Fermentao ............................................................................................................. 151
Centrifugao ........................................................................................................... 151
Tempo de aproveitamento ........................................................................................ 152
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 9 6/7/2011
FERMENTAO ALCOLICA
Microbiologia Bsica
Leveduras
A palavra levedura traz imediatamente mente a idia "fermentao", pois os dois
termos tm sido muito associados atravs da histria. Entretanto, o desenvolvimento
do conceito de levedura pode ser considerado como tendo tido incio por volta de 1680
(Van Leeuwenhoek). Mas foi somente aps os estudos do gnio Pasteur, em 1876,
que se caracterizou a individualidade da levedura como um organismo vivo com
caractersticas prprias.
Morfologia da clula
Forma da clula
A clula da levedura pode apresentar vrias formas, as quais podem ser os resultados
da maneira de reproduo vegetativa bem como das condies de cultivo e idade da
cultura. As formas que mais comumente so encontradas so esfrica, globosa,
ovide e alongada, embora existam certas leveduras com formas altamente
caractersticas. Entretanto, dizer que uma determinada forma de clula caracterstica
de uma dada espcie ou gnero, no significa que em uma populao de leveduras
todas as clulas apresentaro aquela forma, mas pelo menos em um determinado
perodo do desenvolvimento celular as clulas tero uma forma caracterstica.
Tamanho da clula
O tamanho da clula de levedura tambm variado, mas numa cultura jovem o
tamanho da clula pode ser bem uniforme em algumas espcies ou extremamente
heterogneo em outras. Estas disparidades podem ser usadas para diferenciao
entre espcies e algumas vezes at mesmo entre linhagens da mesma espcie. De
uma maneira geral as leveduras industriais variam consideravelmente no que se refere
s suas dimenses, com limites desde 1 a 5 m de largura e 5 a 30 m de comprimento.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 10 6/7/2011
Estrutura da clula
A maioria das investigaes feitas sobre as estruturas da clula de levedura
baseada em trabalhos feitos com Saccharomyces cerevisiae. As informaes sobre a
citologia da levedura tm sido obtidas por observaes diretas com o microscpio
ptico, tcnicas de colorao da clula para componentes especficos, microscopia
eletrnica de transmisso de cortes ultrafinos das clulas, bem como atravs da
microscopia de varredura.
As principais micro-estruturas da clula de levedura so: a parede celular, a
membrana citoplasmtica ou plasmalema, o ncleo, um ou mais vacolos e a
mitocndria.
Parede celular
A parede celular pode ser vista com um simples microscpio ptico (campo claro)
como uma linha externa da clula. Embora um pouco elstica, sua rigidez
responsvel pela forma particular que a clula apresenta. Com o microscpio
eletrnico de varredura, quando a clula ntegra observada pode-se verificar
perfeitamente a presena das cicatrizes dos brotamentos na parede celular.
A parede celular das leveduras fina nas clulas jovens, espessando-se com a idade.
Os principais constituintes da parede celular de Saccharomyces cerevisiae so os
polissardeos glicano (30 a 34%) e manano (30%).
Basicamente a parede celular do gnero Saccharomyces consiste de trs camadas: a
camada interna de glucana insolvel em alcali; a camada intermediria de glucana solvel em alcali e a camada exterior de glicoprotena na qual o carboidrato a
manana fosforilada. Na parede celular so encontrados ainda outros compostos, como
lipdeos e heteropolissacardeos, dependendo do gnero e espcie considerados.
As protenas so constituintes constantes das paredes celulares das leveduras.
Saccharomyces cerevisiae apresenta 6 a 8% de protenas, parte das quais
provavelmente enzimas, j que invertases e outras hidrolases foram identificadas na
parede celular. As concentraes em lipdeos variam de 8,5 a 13,5%.
A quantidade de quitina tambm varia com a espcie sendo que Saccharomyces
cerevisiae apresenta entre 1 a 2% deste composto; j a glicosamina foi encontrada em
pequenas quantidades nas paredes das leveduras.
Membrana citoplasmtica ou Plasmalema
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 11 6/7/2011
Esta estrutura localizada diretamente abaixo da parede celular e tem uma importante
funo na entrada seletiva de nutrientes do meio de crescimento. Ela protege tambm
a clula de perder compostos de baixo peso molecular por vazamento do citoplasma e
ela representa a "matriz" sobre a qual os compostos da parede celular so
depositados durante o crescimento da clula. Na composio qumica do plasmalema
encontrada uma mistura complexa de lipdeos neutros (mono, di e triglicerdeos),
esterois livres e esterificados (principalmente ergosterol), esfingolipdeos complexos,
glicerofosfatideos, neutro e cido glicolipdeos. Os cidos graxos nos vrios
componentes so de cadeia longa (C16 - C26) com o cido olico (C18:1) sendo o
cido graxo mais importante.
Ncleo
O ncleo das clulas de levedura no facilmente visto ao microscpio ptico (campo
claro) quando as clulas so preparadas para observao em suspenso aquosa. Por
outro lado, ao microscpio de contraste de fase, o ncleo pode ser observado em
leveduras desenvolvidas em meio nutritivo contendo 18-21% de gelatina.
Os exames de cortes ultrafinos mostram que o ncleo das leveduras uma organela
bem definida, circundada por uma membrana nuclear semipermevel, com funes
metablicas e reprodutivas.
O ncleo composto de uma parte opticamente densa, o nuclolo, e uma poro
menos densa que contm o material cromatnico. Alm do DNA, o ncleo contm
vrias categorias de RNA e um tipo de polifosfato com uma cadeia de 20 a 40
resduos de ortofosfato.
Durante a formao do brotamento das leveduras a diviso do ncleo acompanhada
por alongamento e constrio deste, a qual acontece naturalmente no pescoo do
broto. Ambos, nuclolo e a poro contendo cromatina se dividem e so incorporados
no ncleo das duas novas clulas.
Vacolos
Quando as clulas de levedura so vistas ao microscpio de contraste, usualmente
pode-se observar um ou mais vacolos de diferentes tamanhos (0,3 - 3,0 m de dimetro). Eles tm geralmente aparncia (forma) esfrica e so mais transparentes a
um feixe de luz que o citoplasma que os circunda. Quando as clulas so colocadas
em meio nutritivo e comeam a emitir brotamentos os grandes vacolos se dividem
por constrio em numerosos pequenos vacolos. Durante o desenvolvimento do
broto os vacolos so distribudos entre as clulas me e filha (brotamento). Depois de
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 12 6/7/2011
completado o processo de brotamento os pequenos vacolos podem se fundir para
formar novamente grandes vacolos.
Ao microscpio eletrnico pode-se observar que o vacolo cercado por uma simples
membrana, a qual dada a sua constituio est relacionada ao transporte de
substncias armazenadas no vacolo. Uma grande variedade de compostos de alto e
baixo peso molecular pode entrar no vacolo. Por exemplo, no vacolo podem ser
encontrados polimetafosfatos (volutina), purinas, derivados de purina de baixa
solubilidade formando cristais, os quais apresentam ativo movimento Brawniano e,
portanto conhecidos como "dancing bodies". Tambm uma grande poro dos
aminocidos livres da levedura armazenada no vacolo e tem sido sugerida inclusive
a presena de lipdeos nos vacolos.
Os vacolos servem tambm como vesculas de armazenamento para vrias enzimas
hidrolticas, incluindo proteases, ribonucleases e esterases. Quando em condies
adversas, o vacolo pode se romper e o processo de autlise da clula acontecer. A
existncia de hidrolases nos vacolos tambm sugere que estes sejam os lisossomos
celulares (compartimento onde se do a ciso e sntese de macromolculas). Os
vacolos tambm funcionam como reservatrio energtico, com os materiais acima
temporariamente no metabolizados.
Mitocndria
As mitocndrias ocorrem como organelas membranas-limitadas que, ao exame
microscpico tm a aparncia de filamentos pregueados com dimetro de 0,3 a 1 m e comprimento de at 3 m. Em Saccharomyces elas esto geralmente localizadas bem prximas periferia da
clula, mas em leveduras aerbias obrigadas elas esto mais distribudas atravs do
citoplasma. O nmero de mitocndria pode variar de um a vinte por clula.
Durante o brotamento celular as mitocndrias tambm se dividem e so distribudas
entre a clula me e a filha. Estas organelas so envolvidas por uma membrana
externa e outra interna as quais formam as cristas que se estendem dentro do estroma
mitocondrial.
As mitocndrias so ricas em lipdeos, fosfolipdeos e ergosterol. Elas contm tambm
DNA, RNA e protenas, incluindo RNA polimerase e um grande nmero de enzimas
respiratrias participando no ciclo do TCA e transporte de eltrons.
Uma vez que as mitocndrias contm as enzimas respiratrias, sua principal funo
a de converso aerbia de energia.
Sob condies anaerbias de fermentao de glucose ou mesmo sob condies
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 13 6/7/2011
aerbias em altas concentraes de glucose (5-10%) as mitocndrias parecem se
degenerar, transformando-se na chamada promitocndria, com cristas pouco
desenvolvidas, o que faz com que diminua a capacidade respiratria. Por outro lado, a
respirao pode ser restabelecida facilmente pela diminuio da concentrao de
glucose e arejamento das clulas.
Citoplasma
O citoplasma a matriz na quais todas as organelas discutidas at agora esto
localizadas. Ele contm grandes quantidades de ribosoma, polifosfato e os
polissacardeos de reserva, glicognio e trealose, enzimas glicolticas, etc. De 1,0 a
5,0% de DNA da levedura podem estar presentes no citoplasma.
Cpsulas
Algumas leveduras so cobertas por um material extracelular limoso, viscoso e
aderente, que a substncia capsular. A maior parte das cpsulas de leveduras tem
composio polissacardica, incluindo heteropolissacardeos e substncias
semelhantes ao amido.
Reproduo
Reproduo vegetativa
As leveduras podem se reproduzir por esporulao, por gemulao (brotamento) ou
por fisso. O mtodo mais comum o da gemulao onde forma-se um tubo a partir
do vacolo nuclear, adjacente ao ncleo da clula-me, orientando para um ponto da
parede celular mais prxima do vacolo. Ali, forma-se uma pequena protuberncia na
superfcie mais externa da clula, produzida por um enfraquecimento local da parede
celular existente. O tubo passa para a protuberncia, que aumenta de volume e se
enche com material nuclear e citoplasmtico da clula-me. A parede do broto contm
apenas material recentemente sintetizado. Quando a gmula estiver com tamanho
aproximado ao da clula-me, o aparelho nuclear de ambas as clulas se reorienta, de
modo que os entrossomos de cada unidade sejam vistos no ponto de unio.
Completada a diviso nuclear, forma-se uma parede transversal, de modo semelhante
ao que ocorre nas leveduras em diviso. Durante sua vida uma clula madura produz,
por gemulao, uma mdia de 24 clulas-filhas. As gemulaes sucessivas so
sempre formadas em locais diferentes na superfcie celular, permanecendo cicatrizes
das gmulas como resultado deste processo de reproduo.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 14 6/7/2011
Reproduo por esporos
A formao de esporos sexuados em leveduras de grande importncia biolgica. A
esporulao constitui uma fase do ciclo sexual da levedura, isto , alternncia da
condio haplide (1n cromossomos) e diplide (2n cromossomos). Este ciclo permite
a levedura sofrer recombinaes genticas, mutao, hibridao e seleo; processos
esses que levam as mudanas evolucionrias (melhoramento gentico).
geralmente conhecido que condies de aerobiose so essenciais para
esporulao, uma vez que pouco ou nenhum esporo so formados sob condies
anaerbias (fermentao).
O nmero de esporos pode variar para uma espcie particular, embora a maioria das
leveduras forme um nmero mximo definido de esporos em cada asco. Em algumas
leveduras o nmero mximo oito. Mas na maioria das leveduras ascosporogenas
(Saccharomyces cerevisiae) o nmero mximo de esporos quatro por asco, embora
ascos com dois ou trs esporos sejam comuns nesta espcie.
Fisso
Durante este processo reprodutivo a levedura aumenta de tamanho ou se alonga,
o ncleo se divide e as duas clulas-filhas so formadas. Durante os perodos de
rpida multiplicao, as clulas podem se dividir sem se separarem, formando-se
cadeias de clulas. Este processo de reproduo caracterstico para o gnero
Schizosaccharomyces.
Leveduras contaminantes ou nativas
A presena de leveduras contaminantes (selvagem) tem trazido srios problemas para
a fermentao, tanto na produo de vinhos como na fabricao de cerveja, e, at
mesmo na produo de fermento prensado para panificao. Esses contaminantes
podem trazer problemas graves no que se refere ao processo fermentativo e,
principalmente a deteriorao do produto final, provocando o aparecimento de sabores
e aromas que descaracterizam totalmente a bebida.
Na produo de lcool a partir do melao e/ou do caldo de cana-de-acar a presena
de leveduras contaminantes tem sido pouco ou raramente mencionada. Entretanto,
nas safras 84/85 at 88/89, embora no se tenha feito testes especficos, em algumas
destilarias a presena de clulas de levedura com caractersticas diferentes (forma,
tamanho, tipo de colnias) daquelas da levedura alcolica foi constatada.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 15 6/7/2011
A proporo destas leveduras em relao levedura alcolica tem variado bastante,
desde algumas clulas at quase total dominncia. A origem destas leveduras
contaminantes (selvagem) varivel, destacando-se como principais, o melao, o
xarope, a gua de lavagem de cana e o prprio solo. Essas leveduras podem chegar
as dornas de fermentao tanto na forma vegetativa como de esporos. A
predominncia de uma ou de outra forma vai depender do tipo de processo
empregado pela indstria, ou seja, com ou sem tratamento trmico do caldo
(aquecimento, decantao, concentrao, etc.).
Os efeitos da presena de leveduras contaminantes na fermentao alcolica podem
ser sentidos pelo abaixamento do rendimento da fermentao, maior tempo de
fermentao, maior formao de espumas pelo aumento da viscosidade, etc. A maior
ou menor intensidade desses fatores vai depender das caractersticas fisiolgicas da
espcie de levedura contaminante, ou seja, se Saccharomyces ou no
Saccharomyces.
O caso encontrado por ns (Fermentec) mais impressionante, foi na fermentao
contnua da Usina Vale do Rosrio (Morro Agudo), onde a levedura selvagem
provocou srios prejuzos. Sua forma era diferente da levedura industrial (TA, no caso)
e as clulas filhas no se soltavam da clula me, formando verdadeiros cachos.
A quantidade de espuma era intensa e foi necessrio modificar todo o processo para
poder continuar produzindo lcool. Esta levedura foi identificada (Barre, Montpellier,
Frana) como sendo uma Candida krusei.
Esta levedura foi encontrada no caldo, na gua de refrigerao das dornas, e por
incrvel que parea, na vinhaa. A passagem pelo aparelho de destilao no
conseguia elimin-la completamente.
Assepsia rigorosa, monitoramento constante, controle da temperatura de aquecimento
do caldo e controle da temperatura da fermentao foram as maneiras que
conjuntamente se conseguiu contornar o problema.
Na safra 88/89, ocorreram dois casos de contaminao com levedura selvagem entre
os clientes da Fermentec, com srios problemas para o processo. Em ambas as
indstrias houve um grande aumento do tempo de fermentao e uma sensvel
diminuio do rendimento, uma vez que a levedura contaminante dominou
completamente o processo.
Um levantamento feito por plaqueamento, mostrou que esta levedura se encontrava
disseminada em todo o processo, que era oriunda da cana e que estava passando
pelo tratamento trmico uma vez que a temperatura de aquecimento era igual ou
inferior a 100C.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 16 6/7/2011
As caractersticas bsicas diferenciais desta levedura contaminante eram clulas
alongadas com brotamento exclusivamente unipolar (apical).
O problema foi resolvido pela troca de todo o fermento em processo e a elevao da
temperatura de aquecimento do caldo para 105 - 110C.
Testes realizados com meios diferenciais pelo setor de Microbiologia da Fermentec e
pelo Instituto National De La Recherche Agronomique da Frana (INRA) mostraram
que esta levedura no pertencia ao gnero Saccharomyces, e segundo Barre, era uma
Candida krusei de linhagem diferente da encontrada na Vale do Rosrio.
Durante as safras 91/92 a 97/98 vrias outras leveduras contaminantes foram isoladas
e caracterizadas de amostras de mosto de alimentao e vinho bruto de clientes da
Fermentec. Atravs de testes de assimilao e fermentao de carboidratos, segundo
o procedimento da taxonomia numrica descrito por GRIFFITHS (1981) foram
encontradas Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces capensis, Saccharomyces
bayanus, Candida krusei, Pichia ohmeri, Trichosporum brassicae, Torulaspora
pretoriensis e Kluyveromyces vanudenii entre outras.
FOTO - 1 e 2: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces cerevisiae
FOTO - 3 e 4: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces chevalieri
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 17 6/7/2011
FOTO - 5 e 6: Clulas vegetativas e colnias de Kluyveromyces vanudenii
FOTO - 7 e 8: Clulas vegetativas e colnias de Candida krusei
Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras.
Em biotecnologia corrente o emprego do termo fermentao para definir reaes
microbianas. No conceito bioqumico, se o substrato for completamente oxidado diz-se
que h respirao e se o substrato for parcialmente degradado acarretando a
formao de metablitos diz-se que h fermentao.
A levedura como entidade viva independente, realiza a fermentao do acar com o
objetivo de conseguir a energia qumica necessria sua sobrevivncia, sendo o
etanol apenas e to somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende
beneficiar-se dessa habilidade metablica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe
permitam propiciar s leveduras, condies ideais para que as mesmas trabalhem a
seu favor, isto , com maior eficincia na produo de etanol. A clula de levedura
possui compartimentaes para adequao de sua atividade metablica. A
fermentao alcolica (gliclise anaerbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a
oxidao total do acar (respirao) se d na mitocndria.
A transformao do acar (glicose) at resultar em etanol e CO2 envolve 12 reaes
em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica. Tais
enzimas sofrem aes de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores,
substncias do prprio metabolismo, pH, temperatura, etc.), alguns que estimulam,
outros que reprimem a ao enzimtica, afetando assim o desempenho do processo.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 18 6/7/2011
O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o acar, gerar
uma forma de energia qumica (ATP) que ser empregada na realizao dos diversos
trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo, etc.) e biossnteses, necessrios
manuteno da vida, crescimento e multiplicao, perpetuando assim a espcie. O
etanol e o CO2 resultantes se constituem em produtos de excreo, sem utilidade
metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto o etanol e outros produtos de
excreo podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas
apenas em condies de aerobiose.
Em termos energticos a respirao muito mais eficiente (produo de ATP) do que
a fermentao, motivo pelo qual, a oxigenao permite uma maior multiplicao da
levedura.
Durante a fermentao, na seqncia de reaes de produo de ATP, intrnsecas
formao de etanol, rotas metablicas alternativas aparecem para propiciar a
formao de materiais necessrios produo da biomassa (polissacardeos,
protenas, cidos nuclicos, etc.) bem como para a formao de outros produtos de
interesse metablico, relacionados direta ou indiretamente com a adaptao e
sobrevivncia, os quais desviam esqueletos carbnicos provenientes do acar,
reduzindo a produo de etanol. ele, o glicerol, os cidos orgnicos (principalmente
o succnico e o actico), que conjuntamente com a biomassa so quantitativamente os
principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilbrio do redox celular em
anaerobiose.
A fermentao alcolica um processo no oxidativo, sem a participao do oxignio
molecular (O2), e, portanto, para se manter o equilbrio de redox celular, todo NADH
formado (em reaes de oxidao) deve ser consumido em reaes de reduo,
acopladas produo de etanol e de glicerol.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 19 6/7/2011
Denise '95
RESPIRAO
CICLODE
KREBS
CADEIA RESPIRATRIA
Figura 3: Esquema da fermentao (em anaerobiose) e da respirao, quando a clula
est sob aerobiose e aparecem as mitocndrias ativas (no destaque).
Nutrio e crescimento das leveduras
As leveduras exigem diversos ons inorgnicos (minerais) em concentraes tanto
micro como milimolar para manifestarem timos crescimento e rendimento
fermentativo. Deficincias ou concentraes elevadas de tais minerais, ou seja, um
desequilbrio entre os nutrientes minerais, provoca alteraes metablicas
significativas. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns so
considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo
da composio do meio no qual a levedura cresceu.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 20 6/7/2011
As necessidades de N, P e S so as mais facilmente justificveis por integrarem
constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. J os ons
minerais esto predominantemente implicados na atividade enzimtica. Assim o
mineral pode funcionar como o centro cataltico de uma enzima (Zn, Co, Mn e Cu),
como ativador ou estabilizador da funo enzimtica (K, NH4, Mg), como mantenedor
de um controle fisiolgico (pela ao antagnica exercida entre ons), e ainda do ponto
de vista estrutural, atuando como neutralizador de foras eletrostticas em diversas
unidades celulares aninicas (K, Ca, Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA,
RNA, protenas, membranas fosfolipdicas e fosfomananas da parede celular).
Embora se possam postular concentraes timas para cada elemento, existe uma
vasta gama de interaes entre os nutrientes minerais resultando que tal concentrao
tima altamente dependente da concentrao de outros minerais no meio.
Para tornar a situao mais complexa, alguns ons atuam como antagnicos
minimizando efeitos inibitrios de outras espcies inicas e por outras inter-relaes
metablicas que determinam a quantidade absorvida do on e os efeitos
conseqentes.
Igualmente, pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser
diminuda, se o mosto empregado na indstria, geralmente complexo, apresentar o
produto final de uma reao catalizada por uma metalo-enzima. Isso ocorre quando o
mosto apresenta aminocidos, bases nitrogenadas e outros compostos orgnicos e
que so utilizados pela levedura, tornando desnecessria a sntese dos mesmos.
Por outro lado, os mostos empregados na indstria podem conter agentes quelantes,
sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentrao efetiva de espcies
inicas. Assim, minerais de argila, cidos hmicos, aminocidos, protenas, cidos
orgnicos, polifenis, cido ftico, polifosfatos e outros materiais coloidais, complexam
diversos ons com diferentes afinidades. Os elementos minerais que afetam
negativamente a levedura podem ser classificados como elementos txicos, como o
caso do alumnio.
Bactrias
Morfologia das clulas bacterianas
Das caractersticas principais das clulas bacterianas destacam-se suas dimenses,
forma, estrutura e arranjo celular, os quais constituem a morfologia da clula.
Forma das bactrias
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 21 6/7/2011
Apesar de existirem milhares de espcies bacterianas, os organismos isolados podem
apresentar uma das trs formas gerais: elipsoidal/esfrica, bastonetes e
espiralada/helicoidal.
As clulas bacterianas elipsoidal-esfricas denominadas de cocos podem apresentar
os seguintes tipos de arranjos:
As clulas bacterianas cilndricas ou em bastonetes (bacilos) no se dispem de
acordo com os padres encontrados entre os cocos, mas podem se apresentar
isolados, aos pares (diplobacilos) e em cadeias (estrepto bacilos). Em alguns casos
esses arranjos no constituem padres morfolgicos caractersticos, mas devida a
etapa de crescimento ou s condies de cultura.
De um modo geral essas duas formas de bactrias so as mais comuns entre os
contaminantes nas indstrias do acar e do lcool.
Dimenses da clula bacteriana
A unidade de medida da clula bacteriana o micro, que equivale a 10-3 mm. As
formas esfricas (cocos) variam de tamanho de 0,5 m a 1,0 m de dimetro. J as bactrias em forma de bastonetes (bacilos) variam de 1,0 m a 5,0 m de comprimento de 0,3 m a 1,0 m de largura. Estas caractersticas podem ser usadas para a caracterizao das espcies bacterianas.
Estrutura bacteriana
O exame da clula bacteriana mostra estruturas, as quais so esquematizadas abaixo.
Algumas dessas estruturas aparecem apenas em certas espcies, outras so mais
caractersticas de uma espcie de que de outra, mas a parede celular e o citoplasma
so naturalmente comuns a maioria das clulas bacterianas.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 22 6/7/2011
Parede celular
Esta se encontra externamente delicada membrana citoplasmtica e devido a sua
rigidez prpria mantm a forma caracterstica da clula mesmo quando esta
submetida a condies fsicas extremas (altas presses osmticas ou temperaturas
abaixo de zero). A parede celular representa uma poro significativa do peso seco
total da clula, podendo ser responsvel por 10 a 40% do peso seco do
microrganismo.
Ela parece ter uma funo importante na diviso e crescimento celulares, uma vez que
a clula bacteriana desprovida de parede celular (protoplasto) incapaz de promover
a diviso ou crescimentos normais.
Vrias substncias so encontradas na parede celular bacteriana como, por exemplo,
o cido diaminopimlico (DPA), o cido murmico e o cido teicico. Estas
substncias so tpicas das bactrias.
Outros compostos principais da parede celular das bactrias so aminocidos,
acares aminados, carboidratos e lipdeos. Todas estas substncias so reunidas
para formar substncias polimricas complexas que formam a estrutura da parede
celular, como o caso do composto polimrico conhecido como peptidoglicano,
responsvel pela rigidez da parede celular. Nas bactrias Gram negativas o
peptoglicano constitui uma frao menor do total da parede celular do que nas
bactrias Gram positivas, mas de um modo geral a parede celular das clulas Gram
negativas quimicamente mais complexa. O contedo lipdico das bactrias Gram
negativas consideravelmente maior do que a dos organismos Gram positivos.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 23 6/7/2011
Acredita-se que a funo da parede celular seja a de proporcionar uma moldura rgida
que suporte e proteja as entidades protoplasmticas mais sensveis.
Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica
A membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ou simplesmente membrana
plasmtica est situada imediatamente abaixo da parede celular, separando esta do
material citoplasmtico. Trata-se de uma membrana de real importncia e sendo
semipermevel e seletiva, controla a passagem de nutrientes e de resduos para
dentro e para fora da clula, respectivamente. Nesta so encontrados tambm vrias
enzimas responsveis por diversas funes celulares, como transporte de eltrons e
fosforilao oxidativa. Desta forma qualquer modificao (leso) da membrana
citoplasmtica poder resultar em morte da clula, sem, contudo, provocar alteraes
morfolgicas que possam ser verificadas ao microscpio comum.
Citoplasma
Este representa todo o material celular contido dentro da membrana citoplasmtica.
Nele pode-se distinguir uma rea de aparncia granular rica em cido ribonucleico
(rea citoplasmtica), uma rea rica em cido desoxiribonucleico (ADN) (rea nuclear
ou cromatnica) e uma rea fluida com nutrientes dissolvidos. O cido ribonucleico
juntamente com protenas forma corpsculos ou macromolculas densamente
aglomeradas por todo o citoplasma. Estas partculas ribonucleoproteicas so
denominadas de ribossomos.
Nenhum vacolo tem sido observado no contedo citoplasmtico, mas vrias outras
incluses podem ser encontradas atravs de tcnicas microscpicas especiais. Dentre
estas se incluem grnulos de amido, de pigmentos, polmero de fsforo inorgnico,
etc. Acredita-se que geralmente os grnulos podem servir como fonte de material
nutritivo de reserva.
Material celular
Embora as bactrias no possuam o ncleo tpico das clulas de animais e
vegetais superiores, dentro do citoplasma so encontrados corpsculos que so
considerados como estrutura nuclear, onde encontrado o ADN da clula
bacteriana.
Entretanto deve-se usar o termo ncleo, uma vez que se trata de uma forma
primitiva de ncleo. O ncleo da clula bacteriana pode ser revelado pelo corante
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 24 6/7/2011
de Feulgen, o qual especfico para ADN, ou pela microscopia eletrnica, uma
vez que menos denso que o citoplasma. No h evidncia de uma membrana
separando o ncleo do citoplasma e durante a replicao do ncleo bacteriano
no se tem observado o aparelho mittico, tpico das clulas superiores.
Flagelos
Os apndices muito finos, semelhantes a cabelos, que se exteriorizam atravs da
parede celular e se originam de uma estrutura granular imediatamente abaixo da
membrana citoplasmtica so denominados de flagelos. Nem todas as bactrias
possuem flagelos, mas pode-se generalizar que muitas espcies de bacilos o
apresentam e raramente eles ocorrem em cocos e lactobacilos.
Os flagelos so muito pequenos para serem vistos em seu estado natural, pelo
microscpio ptico. Uma vez que os flagelos so responsveis pela mobilidade das
bactrias e que nem todas as bactrias so flageladas, conclui-se que existem
espcies mveis e imveis. O mtodo exato pelo quais os flagelos movimentam a
clula bacteriana no conhecido. Uma das hipteses diz que as cadeias proticas se
contraem e se relaxam produzindo um movimento ondulatrio que puxa ou empurra o
organismo. Outra sugere um mecanismo rotatrio, a partir de uma extremidade fixa, de
uma hlice relativamente rgida.
A mobilidade pode ser facilmente observada pela microscopia com preparao em
gota pendente.
Cpsulas
Algumas bactrias esto envoltas por uma substncia viscosa que forma uma camada
de cobertura ou envelope ao redor da clula. Estas estruturas so designadas como
cpsula ou camada limosa. As cpsulas representam um envoltrio protetor e podem
servir tambm como reservatrio de alimentos armazenados e como locais de despejo
de substncias de escria. As bactrias capsuladas so responsveis pelo
aparecimento de certos prejuzos em processos industriais uma vez que este material
de natureza polissacardica pertencentes a diversos tipos como o dextrano, a
dextrina, o levano e a celulose.
Reproduo bacteriana
Durante o crescimento bacteriano o processo mais comum de diviso celular
(multiplicao) a fisso binria, onde uma nica clula se divide em duas, aps o
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 25 6/7/2011
desenvolvimento de uma parede celular transversal. Essa diviso da clula um tipo
de reproduo assexual. O tempo necessrio para que a clula se divida ou para que
a populao duplique conhecido por tempo de gerao, o qual pode variar de 15 a
20 minutos at algumas horas. O tempo de gerao depende da espcie bacteriana e
das condies ambientais, ou seja, as bactrias so capazes de crescer numa ampla
faixa de condies fsicas, podendo utilizar alimentos muito diferentes, mas seu
crescimento timo requer condies especficas para uma dada espcie.
Entretanto a fisso binria no o nico processo de reproduo das bactrias.
Muitas espcies bacterianas pertencentes a vrios gneros (Bacillus, Clostridium) so
capazes de formar, sob certas condies, ou como meio de disseminao da espcie,
unidades celulares conhecidas como esporos. Esses esporos so formados no interior
das clulas e portanto so denominados de endosporos. Eles contm somente parte
dos constituintes celulares e a sua posio e forma na clula so importantes critrios
na classificao dos bacilos.
Nas espcies do gnero Bacillus somente um esporo formado por clula, e quando
este germina resulta uma nica clula bacteriana. A germinao dos esporos
geralmente requer a presena de um aminocido especfico e pode ocorrer somente
aps o esporo ter sofrido a ao de fatores fsicos (choque trmico).
A resistncia dos esporos bacterianos as altas temperaturas varivel de espcie
para espcie, e de um modo geral, temperaturas ao redor de 80C ou mais so
apenas suficientes para provocar a germinao dos mesmos.
importante mencionar que as bactrias capazes de formar esporos, podem crescer e
multiplicar-se por muitas geraes como clulas vegetativas, mas num determinado
momento do desenvolvimento pode ocorrer no interior do citoplasma vegetativo, a
sntese de um novo protoplasma, que dar origem ao esporo.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 26 6/7/2011
A composio qumica do esporo tpica e todos os esporos bacterianos contm
grandes quantidades de cido dipicolnico (5 a 10%), grandes quantidades de clcio,
peptidoglicano, os quais formam um complexo Ca- cido dipicolnico-peptoglicano que
constitui a camada cortical do esporo. Comparados com as formas vegetativas, os
esporos so extremamente resistentes aos agentes fsicos e qumicos adversos. Esta
capacidade de sobrevivncia pode ser atribuda sua parede ou capa impermevel a
qual por sua vez est associada ao complexo cido dipicolnico-clcio.
Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana
Quando se inocula um meio de cultura com certo nmero de bactrias e se observa o
nmero de clulas a intervalos regulares por mais ou menos 24 horas, verifica-se que
inicialmente parece no haver crescimento, em seguida h um rpido aumento da
populao e depois h uma diminuio do nmero de clulas. Esses perodos so
conhecidos como fases do crescimento bacteriano, e so assim denominados: lag
fase, fase logartmica ou exponencial, fase estacionria e fase de declnio ou de morte.
A - lag fase
B - fase exponencial
C - fase estacionria
D
C
B
A
Log donmero debactrias
Tempo (h)
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 27 6/7/2011
D - fase de declnio
Fig. 8. Curva de crescimento tpica das bactrias. (A) fase lag; (B) fase log
(logartmica); (C) fase estacionria; (D) fase de morte ou de declnio.
(Pelczar, Reid, Chan - 1981, vol. 1)
Na fase lag no significa que as clulas estejam em repouso ou dormentes; ao
contrrio durante esta fase as clulas aumentam de tamanho, so fisiologicamente
ativas e esto sintetizando novo protoplasma. As bactrias no novo meio podem ser
deficientes em enzimas ou coenzimas que devem ser sintetizadas em quantidades
suficientes para o funcionamento timo da maquinaria qumica da clula. Ao final da
fase lag cada organismo se divide, no entanto como nem todos os indivduos
completaram sua etapa lag simultaneamente ocorre um aumento gradual da
populao at o trmino desta fase, quando todas as clulas passam a ter capacidade
de diviso em tempos regulares.
Na fase logartmica ou exponencial as clulas se dividem firmemente, num ritmo
constante. A populao grandemente uniforme em termos de composio qumica,
atividade metablica e outras caractersticas fisiolgicas.
Na fase estacionria a populao permanece constante durante certo tempo, talvez
como resultado da completa cessao das divises ou do equilbrio entre o ritmo de
reproduo e o equivalente ritmo da morte. A tendncia para o fim do crescimento
pode ser atribuda a uma srie de cirscuntncias, particularmente exausto de
alguns nutrientes e, com menos freqncia, a produo de produtos txicos.
Na fase de declnio ou de morte, as bactrias passam a morrer mais rapidamente do
que a produo de novas clulas. Vrias condies contribuem para a morte
bacteriana; as mais importantes so a depleo de nutrientes essenciais e o acmulo
de substncias inibidoras como os cidos.
Caracterizao e Classificao dos Microrganismos
As comparaes das caractersticas de grande nmero de microrganismos resultam
num sistema de agrupamento das espcies semelhantes. Por fim, cria-se um grupo
com caractersticas muito semelhantes, que considerado como uma espcie e
recebe um nome especfico, isto , o microrganismo adquire um nome.
Por serem individualmente to pequenos que no podem ser visualizados sem ajuda
de um microscpio, no prtico trabalhar com um nico microrganismo.
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 28 6/7/2011
Por esta razo comum se trabalhar com culturas puras, ou seja, cultura que consiste
de uma nica espcie de microrganismos, originada do crescimento de uma nica
clula microbiana. Se dois ou mais tipos crescem juntos tem-se uma cultura mista.
Antes de se identificar e classificar um microrganismo, suas caractersticas devem ser
determinadas com detalhes adequados. As principais a serem determinadas ou
observadas, incluem as seguintes:
a) caractersticas culturas: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condies fsicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento.
b) caractersticas morfolgicas: as dimenses das clulas, seus arranjos, a diferenciao e a identificao de suas estruturas.
c) caractersticas metablicas: a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos qumicos vitais.
d) caractersticas de composio qumica: a identificao dos principais e tpicos constituintes qumicos da clula.
e) caractersticas antignicas: a deteco de componentes especiais da clula que fornecem evidncia de semelhana entre as espcies.
f) caractersticas genticas: a anlise da composio do cido desoxiribonucleico (ADN), assim como a determinao das relaes entre o ADN isolado de diferentes
microrganismos.
Uma vez que as caractersticas de um microrganismo tenham sido adequadamente
determinadas e catalogadas, possvel identific-lo pela consulta a livros de
referncia que contm descries das espcies microbianas (exemplo: Bergeys
Manual of Determinative Bacteriology). Entretanto comum, mesmo hoje, descobrir
que o organismo que est sendo pesquisado muito diferente de qualquer um dos
que foram descritos anteriormente e pode, de fato, tratar-se de uma nova espcie.
Alm disso, quanto mais informaes forem coletadas sobre os microrganismos
existentes, as idias a respeito de seus agrupamentos podem sofrer modificaes.
Classificao em Nvel de Gnero
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 29 6/7/2011
A morfologia celular ainda uma caracterstica muito importante na descrio dos
gneros de bactrias. Assim as bactrias so divididas em bastonetes e cocos. A
diviso celular em um ou dois planos importante na diferenciao dos cocos.
Uma caracterstica importante na diferenciao de bactrias em nvel de gnero o
tipo de fermentao da glicose em condies padronizadas ( suprimento ilimitado de
glicose e de fatores de crescimento como aminocidos, vitaminas e disponibilidade
limitada de oxignio). Nessas condies as bactrias so divididas em dois grupos: (1)
homofermentativo, envolvendo aquelas que convertem glicose quase exclusivamente
a cido lctico e (2) heterofermentativa, as que formam, alm de cido lctico , cido
actico, gs carbnico e etanol.
Crescimento a determinadas temperaturas usado pra distinguir cocos. Enterococcus
crescem a 10C e 45C, Lactococcus e Vagococcus a 10C, mas no a 45C e
Estreptococcus no cresce a 10C e a 45C varivel conforme a espcie. A
tolerncia a 6,5% de sal pode ser usada para distino entre Enterococcus,
Lactococcus e Estreptococcus.
A tolerncia a acidez e alcalinidade pode ser usada para distino entre os gneros.
Os Enterococcus so considerados bem tolerantes a pH extremos. A formao de
diferentes ismeros de cido lctico na fermentao da glicose pode ser usada para
distinguir Leuconostoc e Lactobacillus heterofermentativos. Os Leuconostoc produzem
apenas cido D - lctico e os Lactobacillus DL-lctico. Os Pediococcus e Aerococcus
so morfologicamente idnticos, mas os Pediococcus so mais tolerantes a cidos e
crescem em condies estritamente anaerbias.
Deve-se considerar que h superposio nos fentipos entre os diferentes gneros, e
exees as caractersticas consideradas tpicas so bastante freqentes entre as
bactrias. Assim a identificao segura destas bactrias requer mtodos sofisticados,
envolvendo um nmero grande de provas bioqumicas.
Classificao em Nvel de Espcie
As anlises das caractersticas fenotpicas so ainda importantes na classificao
preliminar e no conhecimento de algumas propriedades importantes do ponto de vista
industrial. Algumas caractersticas importantes em nvel de classificao de espcie
so: (1) tolerncia a pH e sal, (2) crescimento a determinadas temperaturas, (3)
configurao do cido lctico produzido, (4) fermentao de diferentes carboidratos,
(5) hidrlise da arginina, (6) formao de acetona (teste Voges Proskauer), (7)
tolerncia a sais de bile, (8) tipo de hemlise, (9) produo extracelular de
polissacardeos, (10) demanda de fatores de crescimento, (11) presena de certas
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 30 6/7/2011
enzimas, (12) caractersticas de crescimento no leite e (13) tipificao sorolgica.
Outras caractersticas incluem a taxonomia molecular e quimiotaxonomia, como (1)
tipo de peptidoglicanas de cido diamnicos, (2) presena e tipo de cidos teicicos,
(3) presena e tipo de menaquinonas, (4) relao de G + C no DNA, (5) composio
de cidos graxos e (6) mobilidade eletrofortica de desidrogenase do lactato.
Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool
Veremos a seguir a descrio de algumas espcies dos diferentes gneros de
bactrias que frequentemente so encontradas como contaminantes do processo de
produo de acar e lcool.
Espcie Bacteriana
Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas
Caractersticas Fisiolgicas - Produtos do metabolismo
Bacillus subtilis Bastonetes (2,0-3,0 m x 0,7-0,8 m), isolados e raramente em cadeias, esporulados,
esporo elptico central, Gram
(+) e com mobilidade.
Aerbios ou anaerbios
facultativos, catalase (+), T
tima 30-37c (mnima 5-20C).
Fermentao da glucose com
produo de 2,3 butanodiol +
acetona + CO2, levana
extracelularmente de sacarose,
ativo em pH 5,5 - 8,5.
Bacillus brevis Bastonetes (1,5-4,0 m x 0,8-1,2 m), isolados e raramente em cadeias, esporulados,
esporo elptico central ou
terminal, Gram (+) e com
mobilidade.
Aerbios, catalase (+), T tima
30-35C (mnima 10-35C e mxima 40-60C), cido de
glucose (v).
Bacillus megaterium Bastonetes (2,0-5,0 m x 1,2-1,5 m), tendncia formar pequenas cadeias tranadas,
esporulados, esporos elptico
central, Gram (+) e com
mobilidade.
Aerbios, catalase (+), T tima
30C (mnima 3-20C e mxima
35-45C). cido de glucose.
Espcie Bacteriana
Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas
Caractersticas Fisiolgicas - Produtos do metabolismo
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Bacillus coagulans Bastonetes (2,5-5,0 m x 0,6-1,0 m), principalmente isolados, esporulados, esporo
elptico central ou terminal,
Gram (+) e com motilidade.
Aerbios ou anaerbios facult.,
catalase (+), T tima 35-40C
(mnima 15-25C e mxima 55-
60C, pH mnimo p/ cresc. 4,0-
5,0, c. de glucose,
fermentao de glucose com
produo de c. ltico + 2,3
butanodiol + acetona + c.
actico + etanol.
Bacillus stearothermophilus Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,5-1,0 m) isolados e em cadeias, esporulados, esporo oval
terminal, Gram (+) e com
motilidade.
Aerbios, catalase (+), T tima
45-50C (mnima 35C e
mxima 65C). cido de
glucose.
Lactobacillus fermentum Bastonetes (0,5-0,9 m de largura e comprimento muito
varivel), isolados e/ou aos
pares, Gram (+), no
esporulados, raramente com
motilidade.
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 30-40C
(15C (-) e 45C (+)) pH timo
5,5-5,9, heterofermentativos:
produo de c. ltico +
acetato + etanol + CO2 de
glucose, frutose e sacarose..
Lactobacillus delbruecki Bastonetes (2,0-9,0 m x 0,5-0,8 m), isolados e/ou em pequenas cadeias, Gram (+)
no esporulados, raramente
com motilidade.
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 40C
(15C (-) e 45C (+)),
homofermentativos: cido ltico
de glucose, frutose e sacarose,
pH timo: 5,5-5,8.
Lactobacillus plantarum Bastonetes (3,0-8,0 m x 0,9-1,2 m), isolados, aos pares e/ou em pequenas cadeias,
Gram (+), no esporulados,
raramente com motilidade.
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 30-40C
(15C (+) e 45C (-)),
heterofermentativos: cidos de
glucose, frutose e sacarose, pH
timo: 5,5-5,8.
Espcie Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas -
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Bacteriana e Citolgicas Produtos do metabolismo
Lactobacillus helveticus Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,6-1,0 m), isolados, aos pares e/ou em pequenas cadeias,
Gram (+), no esporulados,
raramente com motilidade.
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T. tima 30-40C
(15C (-) e 45C (+)),
heterofermentativos: cido
ltico de glucose, frutose, pH
timo: 5,5-5,8.
Lactobacillus brevis Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,7-1,0 m), isolados e em pequenas cadeias, Gram (+),
no esporulados, raramente
com motilidade
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 30-40C
(15C (+) e 45C (-)),
heterofermentativos: cidos de
glucose, frutose e sacarose, pH
timo: 5,5-5,8.
Lactobacillus
yamanashiensis Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,5-1,0 m) isolados, pares e cadeias, Gram (+), no
esporulados e com motilidade
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 30-35C
(10C (+) e 45C (-) ),
hemofermentativos: produo
de cido ltico de glucose,
frutose e sacarose.
Lactobacillus coryniformis Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,8-1,1 m) isolados, pares e cadeias, Gram (+), no
esporulados e sem motilidade
Anaerbios facultativos
catalase (-), T tima 30-35C
(10C (+) e 45C (-) ),
heterofermentativo facultativo:
cido de glucose, sacarose,
frutose, maltose, ramnose,
manitol, galactose.
Lactobacillus vaccinostercus Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,5-0,7 m), pares, no esporulado, Gram (+) e sem
motilidade
Anaerbios facultativos,
catalase (-), T tima 30-35C
(15C(-) e 45C (-)),
heterofermentativos: cidos de
glucose, arabinose, maltose,
xilose, galactose, ribose,
celobiose.
Espcie Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas -
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Bacteriana e Citolgicas Produtos do metabolismo
Lactobacillus viridescens Bastonetes (0,7-0,9 m x 2,0-5,0 m); com extremidades arredondadas; isolados ou aos
pares; no esporulados; Gram
(+); sem motilidade.
Microaerfilos; catalase
(-); oxidase (-); fermentao de
glucose (+), frutose e sacarose
(+); crescimento a 15C (+);
crescimento a 45C (-);
heterofermentativas, pH 5,5-
6,2, geralmente com
crescimento em pH < 5,0.
Lactobacillus buchneri Bastonetes (0,7-1,0 m x 2,0-4,0 m); isolados e em cadeias curtas; Gram (+); raramente
com motilidade; no
esporulados.
Anaerbios facultativos;
heterofermentativos;
fermentao da glucose (+),
frutose (+) e sacarose (V);
crescimento a 15C (+);
crescimento a 45C
(-); pH 5,5-6,2, geralmente com
crescimento em pH < 5,0.
Lactobacillus fructivorans Bastonetes (0,5-0,8 m x 15-4,0 m); isolados, aos pares e em cadeias; extremidades
arredondadas; Gram (+);
raramente com motilidade; no
esporulados.
Anaerbios facultativos;
heterofermentativos;
fermentao da glucose (+),
frutose (+) e sacarose (V);
crescimento a 45C
(-); acidfilo (pH favorvel 5,0);
no cresce em pH > 6,0; pode
utilizar etanol para crescimento.
Lactobacillus fructosus Bastonetes (0,5-0,8 m x 2,0-4,0 m); isolados, aos pares e em pequenas cadeias; Gram
(+); raramente com motilidade;
no esporulados.
Anaerbios facultativos;
heterofermentativos;
fermentao de glucose (+),
frutose (+) e sacarose (-);
crescimento a 15C (+);
crescimento a 45C
(-); pH favorvel 5,5-6,0, cresce
em pH < 5,0.
Espcie Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas -
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Bacteriana e Citolgicas Produtos do metabolismo
Lactobacillus acidophilus Bastonetes (0,6-0,9 m x 1,5-6,0 m); isolados, aos pares e em pequenas cadeias; Gram
(+); raramente com motilidade;
no esporulados.
Anaerbios facultativos;
homofermentativos com
produo de DL-cido ltico;
crescimento a 15C (-);
crescimento a 45C (+);
fermentao de glucose (+),
frutose (+), sacarose (+).
Sporolactobacillus sp Bastonetes (3,0-5,0 m x 0,7-0,8 m) isolados e pares, Gram (+), esporulados e com
motilidade, esporos elpticos
terminais.
Microaerfilos, catalase (-)
homofermentativos: cido ltico
de frutose, glucose, maltose,
rafinose, sacarose, no produz
gs.
Leuconostoc mesenteroides Clulas esfricas e
frequentemente lenticulares
(0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos pares ou em cadeias, Gram (+),
sem motilidade, no
esporulados.
Anaerbios facultativos, T.
tima: 20-30C, (mnima 10C e
mxima 37C), catalase (-),
crescimento 10% etanol
(-), crescimento em pH 4,8 (-),
heterofermentativos: c. de
glucose, frutose e sacarose.
Formao de dextrana, pH
timo 5,5-6,5.
Leuconostoc dextranicum Clulas esfricas ou
lenticulares (0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m); aos pares ou cadeias; Gram (+); sem motilidade; no
esporuladas.
Anaerbios facultativos;
crescimento a 37C (+);
fermentao de carboidratos
resultando em D (-) cido ltico
e etanol ou cido actico ao
invs de etanol; catalase
(-), oxidase (-); cido de frutose
(+), glucose (+), sacarose (+);
crescimento em pH 4,8 (-);
crescimento em 10% (-).
Espcie Bacteriana
Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas
Caractersticas Fisiolgicas - Produtos do metabolismo
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 35 6/7/2011
Leuconostoc lactis Clulas esfricas e
frequentemente lenticulares
(0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos pares ou em cadeias, Gram (+),
sem motilidade, no
esporulados.
Anaerbios facultativos, T
tima: 25-30C, (mnima 10C e
mxima 40C), catalase (-),
crescimento 10% etanol
(-), crescimento em pH 4,8 (-),
formao de dextrana, pH
timo 5,5-6,0,
heterofermentativos: c. de
glucose, frutose e sacarose.
Micrococcus lylae Clulas esfricas (0,8-1,6 m de ), predominante em ttrades, Gram (+), sem
motilidade, no esporuladas,
sem cpsula.
Aerbios (oxidativos), catalase
(+), temperatura tima: 30-
37C, no exibe metabolismo
fermentativo.
Micrococcus halobius Clulas esfricas (0,8-1,6 m de ) isoladas, aos pares e ocasionalmente em ttrades e
cachos, Gram (+), sem
motilidade, no esporuladas,
sem cpsula.
Aerbios (Oxidativos), catalase
(+), Temperatura tima: 30-
35C (crescimento 37C (+)),
cido de glucose.
Pediococcus parvulus Cocos (0,6-1,0 m de ), aos pares ou em ttrades, Gram
(+), sem motilidade, no
esporulado, sem cpsula.
Anaerbios facultativos, T
tima: 30C (crescimento 35C
(+), 40C (-)), catalase (-), pH
timo 5,0-6,0 (pH 4,0 (+) e 8,5
(-)), homofermentativos: cido
ltico de glucose.
Pediococcus pentosaceus Cocos (0,8-1,0 m de ), aos pares ou em ttrades, Gram
(+), sem motilidade, no
esporulado, sem cpsula.
Anaerbios Facultativos, T
tima: 35C (40C (+), 50C (-),
catalase (-), pH timo 5,0-6,0
(pH 4,0 (+) e 8,5 (v)),
homofermentativos: cido ltico
de glucose e sacarose (v).
Espcie Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas -
Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 36 6/7/2011
Bacteriana e Citolgicas Produtos do metabolismo
Pediococcus acidilactici Clulas esfricas (0,6-1,5 m de ); aos pares ou ttrades; isoladas so raras e nunca em
cadeias; Gram (+); sem
motilidade; no esporuladas.
Anaerbios facultativos; T
tima