FERMENTACAO-ALCOOLICA-V2

Fermentacaoalcoolica v2.0.doc 1 6/7/2011

FERMENTAO ALCOLICA .................................................................................... 9

Microbiologia Bsica .................................................................................................... 9

Leveduras ................................................................................................................. 9

Morfologia da clula ............................................................................................. 9

Forma da clula ................................................................................................ 9

Tamanho da clula ............................................................................................ 9

Estrutura da clula .............................................................................................. 10

Parede celular ................................................................................................. 10

Membrana citoplasmtica ou Plasmalema ..................................................... 10

Ncleo ............................................................................................................. 11

Vacolos ......................................................................................................... 11

Mitocndria .................................................................................................... 12

Citoplasma ...................................................................................................... 13

Cpsulas .......................................................................................................... 13

Reproduo ......................................................................................................... 13

Reproduo vegetativa ................................................................................... 13

Reproduo por esporos ................................................................................. 14

Fisso .............................................................................................................. 14

Leveduras contaminantes ou nativas .................................................................. 14

Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras....................... 17

Nutrio e crescimento das leveduras ................................................................ 19

Bactrias ................................................................................................................. 20

Morfologia das clulas bacterianas..................................................................... 20

Forma das bactrias ........................................................................................ 20

Dimenses da clula bacteriana ...................................................................... 21

Estrutura bacteriana ............................................................................................ 21

Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ............................................... 23

Citoplasma ...................................................................................................... 23

Material celular ............................................................................................... 23

Flagelos ........................................................................................................... 24

Cpsulas .......................................................................................................... 24

Reproduo bacteriana ....................................................................................... 24

Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana ............................................ 26


Caracterizao e Classificao dos Microrganismos.......................................... 27

Classificao em Nvel de Gnero.................................................................. 28

Classificao em Nvel de Espcie ................................................................. 29

Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool ............................................ 30

Estudo do fenmeno da floculao ......................................................................... 37

Medida da Floculao ......................................................................................... 39

Monitoramento e interpretao dos dados do laboratrio industrial .......................... 40

Tabela para interpretao das anlises laboratoriais ............................................... 41

Procedimentos ........................................................................................................ 43

Fatores que afetam o desempenho fermentativo ........................................................ 47

Glicerol ................................................................................................................... 48

cido succnico ...................................................................................................... 49

cido actico .......................................................................................................... 49

Biomassa ................................................................................................................. 50

Estequiometria da fermentao .............................................................................. 50

Carboidratos de reserva .......................................................................................... 50

Espcie de levedura ................................................................................................ 51

Identificao de leveduras pela tcnica da cariotipagem .................................... 52

Permanncia de leveduras tradicionais no processo fermentativo ..................... 53

Seleo de linhagens para fermentao industrial .............................................. 53

Nutrio mineral da levedura ................................................................................. 54

Principais nutrientes e suas funes ................................................................... 55

Potssio ........................................................................................................... 55

Magnsio ........................................................................................................ 55

Clcio .............................................................................................................. 55

Zinco ............................................................................................................... 56

Mangans ........................................................................................................ 56

Ferro ............................................................................................................... 56

Cobre .............................................................................................................. 56

Molibidenio, Cobalto e Boro .......................................................................... 56

Nitrognio ....................................................................................................... 56

Fsforo ............................................................................................................ 57

Enxofre ........................................................................................................... 58


Inibidores da fermentao ...................................................................................... 58

Alumnio ............................................................................................................. 58

Sulfito ................................................................................................................. 59

Temperatura ........................................................................................................ 59

pH ....................................................................................................................... 60

Contaminao bacteriana .................................................................................... 61

MATRIAS-PRIMAS PARA FERMENTAO ALCOLICA ................................. 62

Caldo: composio, pr-tratamento, controle de qualidade ....................................... 62

Composio ............................................................................................................ 62

Pr-tratamento do caldo .......................................................................................... 63

Processos de tratamento ......................................................................................... 63

Processo de tratamento do caldo para destilaria 1 ........................................... 63




Controle de qualidade do caldo .............................................................................. 65

Mel final: composio, armazenamento e controle de qualidade. .............................. 65

Composio ............................................................................................................ 65

Armazenamento ...................................................................................................... 66

Controle de qualidade ............................................................................................. 66

CONTROLE MICROBIOLGICO MICROSCOPIA ............................................... 67

Microscpio tico ....................................................................................................... 67

Microscopia de Campo Claro ................................................................................. 67

Parte mecnica .................................................................................................... 68

Parte ptica ........................................................................................................ 68

Recomendaes para uso do microscpio tico ................................................. 68

Antes de iniciar o uso. .................................................................................... 68

Ajuste da Dioptria ........................................................................................... 69

Manuteno do equipamento .............................................................................. 69

Mtodo de determinao da viabilidade celular de leveduras .................................... 70

Especificaes da cmara de NEUBAUER............................................................ 71

Preparo das solues ............................................................................................... 72

Soluo estoque de Eritrosina............................................................................. 72


Tampo Fosfato .................................................................................................. 72

Soluo de trabalho ............................................................................................ 73

Procedimento analtico ........................................................................................... 73

Clculos .................................................................................................................. 74

Viabilidade celular .............................................................................................. 74

Contagem de clulas em brotamento .................................................................. 74

Populao de Leveduras ..................................................................................... 74

Exerccios ........................................................................................................... 75

Mtodo para contagem de bactrias ao microscpio tico ......................................... 75


Soluo A - sulfato azul de nilo - 2,0% .............................................................. 77

Soluo B - azul de metileno - 0,20% ................................................................ 77

Soluo de trabalho ............................................................................................ 77


Amostras de caldos, PCTS, primrio e misto ..................................................... 78

Amostras de vinho bruto e levedo tratado .......................................................... 78

Clculos .............................................................................................................. 79

Exerccios ........................................................................................................... 79

Teste de Gram ............................................................................................................. 80


Soluo de cristal violeta .................................................................................... 80

Soluo de safranina ........................................................................................... 81

Soluo de iodo-lugol ......................................................................................... 81


Para Microrganismos em Suspenso Lquida ..................................................... 81

Para Microrganismos de Cultivos Slidos ......................................................... 82

Tcnica de Colorao ......................................................................................... 82

Interpretao ........................................................................................................... 83

Quantificao .......................................................................................................... 84

Deteco de esporos ................................................................................................... 84


Soluo de verde malaquita .................................................................................... 85

Soluo de safranina ............................................................................................... 85


Procedimento analtico ............................................................................................... 85

Interpretao/Quantificao dos Esporos ............................................................... 86

Teste de Floculao .................................................................................................... 87

Procedimento Analtico .......................................................................................... 87

Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos, atravs da variao da acidez .. 88


Soluo estoque de actidiona (inibidor de leveduras). ....................................... 89

Soluo estoque de Antimicrobianos ................................................................. 89


Determinao da acidez .......................................................................................... 90

Determinao da acidez sulfrica (inicial e final) das amostras. ...................... 90

Clculo ................................................................................................................ 91

Interpretao dos resultados ............................................................................... 91

Exemplo .................................................................................................................. 92

Teste de sensibilidade de bactrias aos antibiticos por spectrofotometria ............... 92

Preparo das Solues Estoque ................................................................................ 92

Meios de Cultivo .................................................................................................... 93

Meio de Cultivo (Mayeux & Colmer, 1961) ..................................................... 93

Meio de Cultivo ( GLT) ..................................................................................... 93

Preparo do Inculo ................................................................................................. 94

Realizao do Teste ................................................................................................ 94

Leitura da Densidade ptica ( D. O . ) ................................................................... 95

Interpretao dos Resultados .................................................................................. 95

Relao de materiais necessrios para instalao do laboratrio de controle

microbiolgico microscopia .................................................................................... 96

Equipamentos ......................................................................................................... 96

Vidraria ................................................................................................................... 96

Reagentes ................................................................................................................ 96

Outros ..................................................................................................................... 97

Pipetadores automticos ......................................................................................... 97

Modelos de boletim para o controle microbiolgico por microscopia ....................... 97

Matria-prima ......................................................................................................... 97

Moenda ................................................................................................................... 98


Fermentao ........................................................................................................... 98

CONTROLE MICROBIOLGICO PLAQUEAMENTO .......................................... 99

Introduo ................................................................................................................... 99

Esterilizao ............................................................................................................... 99

Esterilizao por Calor mido - Autoclave ........................................................... 99

Constituio da Autoclave ................................................................................ 101

Operao da autoclave .......................................................................................... 101

Esterilizao por Calor Seco ................................................................................ 102

Esterilizao por calor seco Estufa ................................................................ 103

2.1.2 Operao da estufa .............................................................................. 103

Esterilizao por Filtrao .................................................................................... 103

MEIOS de CULTIVO .................................................................................................. 104

Plate Count Agar (P C A - Agar Padro) Bactrias Aerbios Mesfilas Totais .. 104

gar- Man, Rogosa & Sharpe (MRSA) - Bactrias Lcticas Totais .................... 105

Extrato de Levedura- Peptona- Dextrose - gar (YEPD + A) Leveduras .......... 105

Meio Mayeux & Colmer Teste de Sensibilidade ............................................... 105

Meio de Cultivo G. L .T. Teste de Sensibilidade .................................................. 106

INIBIDORES de CRESCIMENTO MICROBIOANO Solues Estoque ............... 106

Bactrias ................................................................................................................... 106

Leveduras ................................................................................................................. 106

MTODOS PARA CONTAGEM DE CLULAS VIVEIS: LEVEDURAS E

BACTRIAS ................................................................................................................ 107

Plaqueamento por Incorporao ou Profundidade (Mtodo Pour Plate) .............. 107

Diluio em srie ...................................................................................................... 107

Tcnica de plaqueamento ......................................................................................... 108

Clculo do nmero UFC/ml. .................................................................................... 108

Plaqueamento de Superfcie (Mtodo Spread Plate) ............................................. 109

Clculo do nmero de UFC/ml ............................................................................. 110

Avaliao da Populao Microbiana por Filtrao em Membrana. ......................... 110

Procedimento analtico ......................................................................................... 112


Cultivo por Estrias .................................................................................................... 113



Cultivo em PetriFilm ............................................................................................. 114



OUTRAS ANLISES .................................................................................................. 115

Avaliao da Floculao da Levedura ...................................................................... 115

Procedimento Analtico .................................................................................... 116

FLOCULAO DAS CLULAS DE LEVEDURAS ................................................ 117

Floculao da levedura pela bactria Lactobacillus fermentum ............................... 119

Aspectos gerais ..................................................................................................... 120

Aspectos genticos ............................................................................................... 122

Ao de ons ......................................................................................................... 123

Aspectos fsico-qumicos ...................................................................................... 124

Aspectos qumicos ................................................................................................ 124

Mecanismos de floculao ................................................................................... 124

Hidrofobicidade celular .................................................................................... 124

Ligao tipo-lectina .......................................................................................... 125

Reconciliao dos dois mecanismos ................................................................ 125

Cofloculao levedura-bactria ............................................................................ 125

Ao de bactrias .................................................................................................. 126

Consideraes importantes ................................................................................... 127

CIDO LTICO .......................................................................................................... 128

Produo de cidos por microrganismos .................................................................. 128

Histrico ............................................................................................................... 128

Consideraes Gerais ........................................................................................... 129

Bactrias lticas ................................................................................................ 129

Requerimentos nutricionais .............................................................................. 130

Caractersticas da colnia ................................................................................. 130

Tolerncia acidez: .......................................................................................... 130

Padres de fermentao de carboidratos em bactrias lticas .............................. 130

Bactrias homofermentativas ........................................................................... 130

Bactrias heterofermentativas .......................................................................... 131

Principais bactrias lticas .................................................................................... 131

TIPOS DE FERMENTAO ALCOLICA .............................................................. 131


Fermentao descontnua ou batelada ...................................................................... 131

Conduo da fermentao .................................................................................... 131

Providencias preliminar para partida ................................................................ 131

Partida e sistemas de partida ............................................................................. 132

Partida com tubo de cultura pura .................................................................. 133

Partida com leite de fermento selecionado ................................................... 135

Partida com fermento prensado .................................................................... 137

Controle operacional da fermentao contnua ........................................................ 138

Introduo e estratgias ........................................................................................ 138

Interpretao dos parmetros do laboratrio ........................................................ 139

Critrios de dimensionamento da fermentao alcolica ......................................... 140

Dornas ................................................................................................................... 140

Resfriamento de dornas ........................................................................................ 142

Centrfugas de fermento ....................................................................................... 144

Tratamento do fermento p-de-cuba.................................................................. 145

PERDAS DURANTE O PROCESSO .......................................................................... 145

Qualidade da cana-de-acar .................................................................................... 146

Lavoura ................................................................................................................. 146

Carregamento, transporte e recepo .................................................................... 147

Armazenamento: ptio e barraco ........................................................................ 147

Lavagem ............................................................................................................... 148

Preparo e extrao ................................................................................................ 148

Caldo e mosto ........................................................................................................... 149

Aquecimento e decantao ................................................................................... 149

Resfriamento do mosto ......................................................................................... 151

Fermentao ............................................................................................................. 151

Centrifugao ........................................................................................................... 151

Tempo de aproveitamento ........................................................................................ 152


FERMENTAO ALCOLICA

Microbiologia Bsica

Leveduras

A palavra levedura traz imediatamente mente a idia "fermentao", pois os dois

termos tm sido muito associados atravs da histria. Entretanto, o desenvolvimento

do conceito de levedura pode ser considerado como tendo tido incio por volta de 1680

(Van Leeuwenhoek). Mas foi somente aps os estudos do gnio Pasteur, em 1876,

que se caracterizou a individualidade da levedura como um organismo vivo com

caractersticas prprias.

Morfologia da clula

Forma da clula

A clula da levedura pode apresentar vrias formas, as quais podem ser os resultados

da maneira de reproduo vegetativa bem como das condies de cultivo e idade da

cultura. As formas que mais comumente so encontradas so esfrica, globosa,

ovide e alongada, embora existam certas leveduras com formas altamente

caractersticas. Entretanto, dizer que uma determinada forma de clula caracterstica

de uma dada espcie ou gnero, no significa que em uma populao de leveduras

todas as clulas apresentaro aquela forma, mas pelo menos em um determinado

perodo do desenvolvimento celular as clulas tero uma forma caracterstica.

Tamanho da clula

O tamanho da clula de levedura tambm variado, mas numa cultura jovem o

tamanho da clula pode ser bem uniforme em algumas espcies ou extremamente

heterogneo em outras. Estas disparidades podem ser usadas para diferenciao

entre espcies e algumas vezes at mesmo entre linhagens da mesma espcie. De

uma maneira geral as leveduras industriais variam consideravelmente no que se refere

s suas dimenses, com limites desde 1 a 5 m de largura e 5 a 30 m de comprimento.


Estrutura da clula

A maioria das investigaes feitas sobre as estruturas da clula de levedura

baseada em trabalhos feitos com Saccharomyces cerevisiae. As informaes sobre a

citologia da levedura tm sido obtidas por observaes diretas com o microscpio

ptico, tcnicas de colorao da clula para componentes especficos, microscopia

eletrnica de transmisso de cortes ultrafinos das clulas, bem como atravs da

microscopia de varredura.

As principais micro-estruturas da clula de levedura so: a parede celular, a

membrana citoplasmtica ou plasmalema, o ncleo, um ou mais vacolos e a

mitocndria.

Parede celular

A parede celular pode ser vista com um simples microscpio ptico (campo claro)

como uma linha externa da clula. Embora um pouco elstica, sua rigidez

responsvel pela forma particular que a clula apresenta. Com o microscpio

eletrnico de varredura, quando a clula ntegra observada pode-se verificar

perfeitamente a presena das cicatrizes dos brotamentos na parede celular.

A parede celular das leveduras fina nas clulas jovens, espessando-se com a idade.

Os principais constituintes da parede celular de Saccharomyces cerevisiae so os

polissardeos glicano (30 a 34%) e manano (30%).

Basicamente a parede celular do gnero Saccharomyces consiste de trs camadas: a

camada interna de glucana insolvel em alcali; a camada intermediria de glucana solvel em alcali e a camada exterior de glicoprotena na qual o carboidrato a

manana fosforilada. Na parede celular so encontrados ainda outros compostos, como

lipdeos e heteropolissacardeos, dependendo do gnero e espcie considerados.

As protenas so constituintes constantes das paredes celulares das leveduras.

Saccharomyces cerevisiae apresenta 6 a 8% de protenas, parte das quais

provavelmente enzimas, j que invertases e outras hidrolases foram identificadas na

parede celular. As concentraes em lipdeos variam de 8,5 a 13,5%.

A quantidade de quitina tambm varia com a espcie sendo que Saccharomyces

cerevisiae apresenta entre 1 a 2% deste composto; j a glicosamina foi encontrada em

pequenas quantidades nas paredes das leveduras.

Membrana citoplasmtica ou Plasmalema


Esta estrutura localizada diretamente abaixo da parede celular e tem uma importante

funo na entrada seletiva de nutrientes do meio de crescimento. Ela protege tambm

a clula de perder compostos de baixo peso molecular por vazamento do citoplasma e

ela representa a "matriz" sobre a qual os compostos da parede celular so

depositados durante o crescimento da clula. Na composio qumica do plasmalema

encontrada uma mistura complexa de lipdeos neutros (mono, di e triglicerdeos),

esterois livres e esterificados (principalmente ergosterol), esfingolipdeos complexos,

glicerofosfatideos, neutro e cido glicolipdeos. Os cidos graxos nos vrios

componentes so de cadeia longa (C16 - C26) com o cido olico (C18:1) sendo o

cido graxo mais importante.

Ncleo

O ncleo das clulas de levedura no facilmente visto ao microscpio ptico (campo

claro) quando as clulas so preparadas para observao em suspenso aquosa. Por

outro lado, ao microscpio de contraste de fase, o ncleo pode ser observado em

leveduras desenvolvidas em meio nutritivo contendo 18-21% de gelatina.

Os exames de cortes ultrafinos mostram que o ncleo das leveduras uma organela

bem definida, circundada por uma membrana nuclear semipermevel, com funes

metablicas e reprodutivas.

O ncleo composto de uma parte opticamente densa, o nuclolo, e uma poro

menos densa que contm o material cromatnico. Alm do DNA, o ncleo contm

vrias categorias de RNA e um tipo de polifosfato com uma cadeia de 20 a 40

resduos de ortofosfato.

Durante a formao do brotamento das leveduras a diviso do ncleo acompanhada

por alongamento e constrio deste, a qual acontece naturalmente no pescoo do

broto. Ambos, nuclolo e a poro contendo cromatina se dividem e so incorporados

no ncleo das duas novas clulas.

Vacolos

Quando as clulas de levedura so vistas ao microscpio de contraste, usualmente

pode-se observar um ou mais vacolos de diferentes tamanhos (0,3 - 3,0 m de dimetro). Eles tm geralmente aparncia (forma) esfrica e so mais transparentes a

um feixe de luz que o citoplasma que os circunda. Quando as clulas so colocadas

em meio nutritivo e comeam a emitir brotamentos os grandes vacolos se dividem

por constrio em numerosos pequenos vacolos. Durante o desenvolvimento do

broto os vacolos so distribudos entre as clulas me e filha (brotamento). Depois de


completado o processo de brotamento os pequenos vacolos podem se fundir para

formar novamente grandes vacolos.

Ao microscpio eletrnico pode-se observar que o vacolo cercado por uma simples

membrana, a qual dada a sua constituio est relacionada ao transporte de

substncias armazenadas no vacolo. Uma grande variedade de compostos de alto e

baixo peso molecular pode entrar no vacolo. Por exemplo, no vacolo podem ser

encontrados polimetafosfatos (volutina), purinas, derivados de purina de baixa

solubilidade formando cristais, os quais apresentam ativo movimento Brawniano e,

portanto conhecidos como "dancing bodies". Tambm uma grande poro dos

aminocidos livres da levedura armazenada no vacolo e tem sido sugerida inclusive

a presena de lipdeos nos vacolos.

Os vacolos servem tambm como vesculas de armazenamento para vrias enzimas

hidrolticas, incluindo proteases, ribonucleases e esterases. Quando em condies

adversas, o vacolo pode se romper e o processo de autlise da clula acontecer. A

existncia de hidrolases nos vacolos tambm sugere que estes sejam os lisossomos

celulares (compartimento onde se do a ciso e sntese de macromolculas). Os

vacolos tambm funcionam como reservatrio energtico, com os materiais acima

temporariamente no metabolizados.

Mitocndria

As mitocndrias ocorrem como organelas membranas-limitadas que, ao exame

microscpico tm a aparncia de filamentos pregueados com dimetro de 0,3 a 1 m e comprimento de at 3 m. Em Saccharomyces elas esto geralmente localizadas bem prximas periferia da

clula, mas em leveduras aerbias obrigadas elas esto mais distribudas atravs do

citoplasma. O nmero de mitocndria pode variar de um a vinte por clula.

Durante o brotamento celular as mitocndrias tambm se dividem e so distribudas

entre a clula me e a filha. Estas organelas so envolvidas por uma membrana

externa e outra interna as quais formam as cristas que se estendem dentro do estroma

mitocondrial.

As mitocndrias so ricas em lipdeos, fosfolipdeos e ergosterol. Elas contm tambm

DNA, RNA e protenas, incluindo RNA polimerase e um grande nmero de enzimas

respiratrias participando no ciclo do TCA e transporte de eltrons.

Uma vez que as mitocndrias contm as enzimas respiratrias, sua principal funo

a de converso aerbia de energia.

Sob condies anaerbias de fermentao de glucose ou mesmo sob condies


aerbias em altas concentraes de glucose (5-10%) as mitocndrias parecem se

degenerar, transformando-se na chamada promitocndria, com cristas pouco

desenvolvidas, o que faz com que diminua a capacidade respiratria. Por outro lado, a

respirao pode ser restabelecida facilmente pela diminuio da concentrao de

glucose e arejamento das clulas.

Citoplasma

O citoplasma a matriz na quais todas as organelas discutidas at agora esto

localizadas. Ele contm grandes quantidades de ribosoma, polifosfato e os

polissacardeos de reserva, glicognio e trealose, enzimas glicolticas, etc. De 1,0 a

5,0% de DNA da levedura podem estar presentes no citoplasma.

Cpsulas

Algumas leveduras so cobertas por um material extracelular limoso, viscoso e

aderente, que a substncia capsular. A maior parte das cpsulas de leveduras tem

composio polissacardica, incluindo heteropolissacardeos e substncias

semelhantes ao amido.

Reproduo

Reproduo vegetativa

As leveduras podem se reproduzir por esporulao, por gemulao (brotamento) ou

por fisso. O mtodo mais comum o da gemulao onde forma-se um tubo a partir

do vacolo nuclear, adjacente ao ncleo da clula-me, orientando para um ponto da

parede celular mais prxima do vacolo. Ali, forma-se uma pequena protuberncia na

superfcie mais externa da clula, produzida por um enfraquecimento local da parede

celular existente. O tubo passa para a protuberncia, que aumenta de volume e se

enche com material nuclear e citoplasmtico da clula-me. A parede do broto contm

apenas material recentemente sintetizado. Quando a gmula estiver com tamanho

aproximado ao da clula-me, o aparelho nuclear de ambas as clulas se reorienta, de

modo que os entrossomos de cada unidade sejam vistos no ponto de unio.

Completada a diviso nuclear, forma-se uma parede transversal, de modo semelhante

ao que ocorre nas leveduras em diviso. Durante sua vida uma clula madura produz,

por gemulao, uma mdia de 24 clulas-filhas. As gemulaes sucessivas so

sempre formadas em locais diferentes na superfcie celular, permanecendo cicatrizes

das gmulas como resultado deste processo de reproduo.


Reproduo por esporos

A formao de esporos sexuados em leveduras de grande importncia biolgica. A

esporulao constitui uma fase do ciclo sexual da levedura, isto , alternncia da

condio haplide (1n cromossomos) e diplide (2n cromossomos). Este ciclo permite

a levedura sofrer recombinaes genticas, mutao, hibridao e seleo; processos

esses que levam as mudanas evolucionrias (melhoramento gentico).

geralmente conhecido que condies de aerobiose so essenciais para

esporulao, uma vez que pouco ou nenhum esporo so formados sob condies

anaerbias (fermentao).

O nmero de esporos pode variar para uma espcie particular, embora a maioria das

leveduras forme um nmero mximo definido de esporos em cada asco. Em algumas

leveduras o nmero mximo oito. Mas na maioria das leveduras ascosporogenas

(Saccharomyces cerevisiae) o nmero mximo de esporos quatro por asco, embora

ascos com dois ou trs esporos sejam comuns nesta espcie.

Fisso

Durante este processo reprodutivo a levedura aumenta de tamanho ou se alonga,

o ncleo se divide e as duas clulas-filhas so formadas. Durante os perodos de

rpida multiplicao, as clulas podem se dividir sem se separarem, formando-se

cadeias de clulas. Este processo de reproduo caracterstico para o gnero

Schizosaccharomyces.

Leveduras contaminantes ou nativas

A presena de leveduras contaminantes (selvagem) tem trazido srios problemas para

a fermentao, tanto na produo de vinhos como na fabricao de cerveja, e, at

mesmo na produo de fermento prensado para panificao. Esses contaminantes

podem trazer problemas graves no que se refere ao processo fermentativo e,

principalmente a deteriorao do produto final, provocando o aparecimento de sabores

e aromas que descaracterizam totalmente a bebida.

Na produo de lcool a partir do melao e/ou do caldo de cana-de-acar a presena

de leveduras contaminantes tem sido pouco ou raramente mencionada. Entretanto,

nas safras 84/85 at 88/89, embora no se tenha feito testes especficos, em algumas

destilarias a presena de clulas de levedura com caractersticas diferentes (forma,

tamanho, tipo de colnias) daquelas da levedura alcolica foi constatada.


A proporo destas leveduras em relao levedura alcolica tem variado bastante,

desde algumas clulas at quase total dominncia. A origem destas leveduras

contaminantes (selvagem) varivel, destacando-se como principais, o melao, o

xarope, a gua de lavagem de cana e o prprio solo. Essas leveduras podem chegar

as dornas de fermentao tanto na forma vegetativa como de esporos. A

predominncia de uma ou de outra forma vai depender do tipo de processo

empregado pela indstria, ou seja, com ou sem tratamento trmico do caldo

(aquecimento, decantao, concentrao, etc.).

Os efeitos da presena de leveduras contaminantes na fermentao alcolica podem

ser sentidos pelo abaixamento do rendimento da fermentao, maior tempo de

fermentao, maior formao de espumas pelo aumento da viscosidade, etc. A maior

ou menor intensidade desses fatores vai depender das caractersticas fisiolgicas da

espcie de levedura contaminante, ou seja, se Saccharomyces ou no

Saccharomyces.

O caso encontrado por ns (Fermentec) mais impressionante, foi na fermentao

contnua da Usina Vale do Rosrio (Morro Agudo), onde a levedura selvagem

provocou srios prejuzos. Sua forma era diferente da levedura industrial (TA, no caso)

e as clulas filhas no se soltavam da clula me, formando verdadeiros cachos.

A quantidade de espuma era intensa e foi necessrio modificar todo o processo para

poder continuar produzindo lcool. Esta levedura foi identificada (Barre, Montpellier,

Frana) como sendo uma Candida krusei.

Esta levedura foi encontrada no caldo, na gua de refrigerao das dornas, e por

incrvel que parea, na vinhaa. A passagem pelo aparelho de destilao no

conseguia elimin-la completamente.

Assepsia rigorosa, monitoramento constante, controle da temperatura de aquecimento

do caldo e controle da temperatura da fermentao foram as maneiras que

conjuntamente se conseguiu contornar o problema.

Na safra 88/89, ocorreram dois casos de contaminao com levedura selvagem entre

os clientes da Fermentec, com srios problemas para o processo. Em ambas as

indstrias houve um grande aumento do tempo de fermentao e uma sensvel

diminuio do rendimento, uma vez que a levedura contaminante dominou

completamente o processo.

Um levantamento feito por plaqueamento, mostrou que esta levedura se encontrava

disseminada em todo o processo, que era oriunda da cana e que estava passando

pelo tratamento trmico uma vez que a temperatura de aquecimento era igual ou

inferior a 100C.


As caractersticas bsicas diferenciais desta levedura contaminante eram clulas

alongadas com brotamento exclusivamente unipolar (apical).

O problema foi resolvido pela troca de todo o fermento em processo e a elevao da

temperatura de aquecimento do caldo para 105 - 110C.

Testes realizados com meios diferenciais pelo setor de Microbiologia da Fermentec e

pelo Instituto National De La Recherche Agronomique da Frana (INRA) mostraram

que esta levedura no pertencia ao gnero Saccharomyces, e segundo Barre, era uma

Candida krusei de linhagem diferente da encontrada na Vale do Rosrio.

Durante as safras 91/92 a 97/98 vrias outras leveduras contaminantes foram isoladas

e caracterizadas de amostras de mosto de alimentao e vinho bruto de clientes da

Fermentec. Atravs de testes de assimilao e fermentao de carboidratos, segundo

o procedimento da taxonomia numrica descrito por GRIFFITHS (1981) foram

encontradas Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces capensis, Saccharomyces

bayanus, Candida krusei, Pichia ohmeri, Trichosporum brassicae, Torulaspora

pretoriensis e Kluyveromyces vanudenii entre outras.

FOTO - 1 e 2: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces cerevisiae

FOTO - 3 e 4: Clulas vegetativas e colnias de Saccharomyces chevalieri


FOTO - 5 e 6: Clulas vegetativas e colnias de Kluyveromyces vanudenii

FOTO - 7 e 8: Clulas vegetativas e colnias de Candida krusei

Fisiologia, metabolismo oxidativo e fermentativo das leveduras.

Em biotecnologia corrente o emprego do termo fermentao para definir reaes

microbianas. No conceito bioqumico, se o substrato for completamente oxidado diz-se

que h respirao e se o substrato for parcialmente degradado acarretando a

formao de metablitos diz-se que h fermentao.

A levedura como entidade viva independente, realiza a fermentao do acar com o

objetivo de conseguir a energia qumica necessria sua sobrevivncia, sendo o

etanol apenas e to somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende

beneficiar-se dessa habilidade metablica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe

permitam propiciar s leveduras, condies ideais para que as mesmas trabalhem a

seu favor, isto , com maior eficincia na produo de etanol. A clula de levedura

possui compartimentaes para adequao de sua atividade metablica. A

fermentao alcolica (gliclise anaerbia) ocorre no citoplasma, enquanto que a

oxidao total do acar (respirao) se d na mitocndria.

A transformao do acar (glicose) at resultar em etanol e CO2 envolve 12 reaes

em seqncia ordenada, cada qual catalisada por uma enzima especfica. Tais

enzimas sofrem aes de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas, inibidores,

substncias do prprio metabolismo, pH, temperatura, etc.), alguns que estimulam,

outros que reprimem a ao enzimtica, afetando assim o desempenho do processo.


O objetivo primordial da levedura ao metabolizar anaerobicamente o acar, gerar

uma forma de energia qumica (ATP) que ser empregada na realizao dos diversos

trabalhos fisiolgicos (absoro, excreo, etc.) e biossnteses, necessrios

manuteno da vida, crescimento e multiplicao, perpetuando assim a espcie. O

etanol e o CO2 resultantes se constituem em produtos de excreo, sem utilidade

metablica para a clula em anaerobiose. Entretanto o etanol e outros produtos de

excreo podem ser oxidados metabolicamente, gerando mais ATP e biomassa, mas

apenas em condies de aerobiose.

Em termos energticos a respirao muito mais eficiente (produo de ATP) do que

a fermentao, motivo pelo qual, a oxigenao permite uma maior multiplicao da

levedura.

Durante a fermentao, na seqncia de reaes de produo de ATP, intrnsecas

formao de etanol, rotas metablicas alternativas aparecem para propiciar a

formao de materiais necessrios produo da biomassa (polissacardeos,

protenas, cidos nuclicos, etc.) bem como para a formao de outros produtos de

interesse metablico, relacionados direta ou indiretamente com a adaptao e

sobrevivncia, os quais desviam esqueletos carbnicos provenientes do acar,

reduzindo a produo de etanol. ele, o glicerol, os cidos orgnicos (principalmente

o succnico e o actico), que conjuntamente com a biomassa so quantitativamente os

principais subprodutos metabolicamente relacionados ao equilbrio do redox celular em

anaerobiose.

A fermentao alcolica um processo no oxidativo, sem a participao do oxignio

molecular (O2), e, portanto, para se manter o equilbrio de redox celular, todo NADH

formado (em reaes de oxidao) deve ser consumido em reaes de reduo,

acopladas produo de etanol e de glicerol.


Denise '95

RESPIRAO

CICLODE

KREBS

CADEIA RESPIRATRIA

Figura 3: Esquema da fermentao (em anaerobiose) e da respirao, quando a clula

est sob aerobiose e aparecem as mitocndrias ativas (no destaque).

Nutrio e crescimento das leveduras

As leveduras exigem diversos ons inorgnicos (minerais) em concentraes tanto

micro como milimolar para manifestarem timos crescimento e rendimento

fermentativo. Deficincias ou concentraes elevadas de tais minerais, ou seja, um

desequilbrio entre os nutrientes minerais, provoca alteraes metablicas

significativas. De todos os elementos encontrados na levedura apenas alguns so

considerados essenciais sendo que muitos deles aparecem fortuitamente dependendo

da composio do meio no qual a levedura cresceu.


As necessidades de N, P e S so as mais facilmente justificveis por integrarem

constituintes celulares tanto estruturais quanto metabolicamente ativos. J os ons

minerais esto predominantemente implicados na atividade enzimtica. Assim o

mineral pode funcionar como o centro cataltico de uma enzima (Zn, Co, Mn e Cu),

como ativador ou estabilizador da funo enzimtica (K, NH4, Mg), como mantenedor

de um controle fisiolgico (pela ao antagnica exercida entre ons), e ainda do ponto

de vista estrutural, atuando como neutralizador de foras eletrostticas em diversas

unidades celulares aninicas (K, Ca, Mg e Zn neutralizando cargas negativas do DNA,

RNA, protenas, membranas fosfolipdicas e fosfomananas da parede celular).

Embora se possam postular concentraes timas para cada elemento, existe uma

vasta gama de interaes entre os nutrientes minerais resultando que tal concentrao

tima altamente dependente da concentrao de outros minerais no meio.

Para tornar a situao mais complexa, alguns ons atuam como antagnicos

minimizando efeitos inibitrios de outras espcies inicas e por outras inter-relaes

metablicas que determinam a quantidade absorvida do on e os efeitos

conseqentes.

Igualmente, pode-se considerar que a necessidade de um elemento qualquer pode ser

diminuda, se o mosto empregado na indstria, geralmente complexo, apresentar o

produto final de uma reao catalizada por uma metalo-enzima. Isso ocorre quando o

mosto apresenta aminocidos, bases nitrogenadas e outros compostos orgnicos e

que so utilizados pela levedura, tornando desnecessria a sntese dos mesmos.

Por outro lado, os mostos empregados na indstria podem conter agentes quelantes,

sequestrantes e absorventes os quais reduzem a concentrao efetiva de espcies

inicas. Assim, minerais de argila, cidos hmicos, aminocidos, protenas, cidos

orgnicos, polifenis, cido ftico, polifosfatos e outros materiais coloidais, complexam

diversos ons com diferentes afinidades. Os elementos minerais que afetam

negativamente a levedura podem ser classificados como elementos txicos, como o

caso do alumnio.

Bactrias

Morfologia das clulas bacterianas

Das caractersticas principais das clulas bacterianas destacam-se suas dimenses,

forma, estrutura e arranjo celular, os quais constituem a morfologia da clula.

Forma das bactrias


Apesar de existirem milhares de espcies bacterianas, os organismos isolados podem

apresentar uma das trs formas gerais: elipsoidal/esfrica, bastonetes e

espiralada/helicoidal.

As clulas bacterianas elipsoidal-esfricas denominadas de cocos podem apresentar

os seguintes tipos de arranjos:

As clulas bacterianas cilndricas ou em bastonetes (bacilos) no se dispem de

acordo com os padres encontrados entre os cocos, mas podem se apresentar

isolados, aos pares (diplobacilos) e em cadeias (estrepto bacilos). Em alguns casos

esses arranjos no constituem padres morfolgicos caractersticos, mas devida a

etapa de crescimento ou s condies de cultura.

De um modo geral essas duas formas de bactrias so as mais comuns entre os

contaminantes nas indstrias do acar e do lcool.

Dimenses da clula bacteriana

A unidade de medida da clula bacteriana o micro, que equivale a 10-3 mm. As

formas esfricas (cocos) variam de tamanho de 0,5 m a 1,0 m de dimetro. J as bactrias em forma de bastonetes (bacilos) variam de 1,0 m a 5,0 m de comprimento de 0,3 m a 1,0 m de largura. Estas caractersticas podem ser usadas para a caracterizao das espcies bacterianas.

Estrutura bacteriana

O exame da clula bacteriana mostra estruturas, as quais so esquematizadas abaixo.

Algumas dessas estruturas aparecem apenas em certas espcies, outras so mais

caractersticas de uma espcie de que de outra, mas a parede celular e o citoplasma

so naturalmente comuns a maioria das clulas bacterianas.


Parede celular

Esta se encontra externamente delicada membrana citoplasmtica e devido a sua

rigidez prpria mantm a forma caracterstica da clula mesmo quando esta

submetida a condies fsicas extremas (altas presses osmticas ou temperaturas

abaixo de zero). A parede celular representa uma poro significativa do peso seco

total da clula, podendo ser responsvel por 10 a 40% do peso seco do

microrganismo.

Ela parece ter uma funo importante na diviso e crescimento celulares, uma vez que

a clula bacteriana desprovida de parede celular (protoplasto) incapaz de promover

a diviso ou crescimentos normais.

Vrias substncias so encontradas na parede celular bacteriana como, por exemplo,

o cido diaminopimlico (DPA), o cido murmico e o cido teicico. Estas

substncias so tpicas das bactrias.

Outros compostos principais da parede celular das bactrias so aminocidos,

acares aminados, carboidratos e lipdeos. Todas estas substncias so reunidas

para formar substncias polimricas complexas que formam a estrutura da parede

celular, como o caso do composto polimrico conhecido como peptidoglicano,

responsvel pela rigidez da parede celular. Nas bactrias Gram negativas o

peptoglicano constitui uma frao menor do total da parede celular do que nas

bactrias Gram positivas, mas de um modo geral a parede celular das clulas Gram

negativas quimicamente mais complexa. O contedo lipdico das bactrias Gram

negativas consideravelmente maior do que a dos organismos Gram positivos.


Acredita-se que a funo da parede celular seja a de proporcionar uma moldura rgida

que suporte e proteja as entidades protoplasmticas mais sensveis.

Membrana citoplasmtica ou protoplasmtica

A membrana citoplasmtica ou protoplasmtica ou simplesmente membrana

plasmtica est situada imediatamente abaixo da parede celular, separando esta do

material citoplasmtico. Trata-se de uma membrana de real importncia e sendo

semipermevel e seletiva, controla a passagem de nutrientes e de resduos para

dentro e para fora da clula, respectivamente. Nesta so encontrados tambm vrias

enzimas responsveis por diversas funes celulares, como transporte de eltrons e

fosforilao oxidativa. Desta forma qualquer modificao (leso) da membrana

citoplasmtica poder resultar em morte da clula, sem, contudo, provocar alteraes

morfolgicas que possam ser verificadas ao microscpio comum.

Citoplasma

Este representa todo o material celular contido dentro da membrana citoplasmtica.

Nele pode-se distinguir uma rea de aparncia granular rica em cido ribonucleico

(rea citoplasmtica), uma rea rica em cido desoxiribonucleico (ADN) (rea nuclear

ou cromatnica) e uma rea fluida com nutrientes dissolvidos. O cido ribonucleico

juntamente com protenas forma corpsculos ou macromolculas densamente

aglomeradas por todo o citoplasma. Estas partculas ribonucleoproteicas so

denominadas de ribossomos.

Nenhum vacolo tem sido observado no contedo citoplasmtico, mas vrias outras

incluses podem ser encontradas atravs de tcnicas microscpicas especiais. Dentre

estas se incluem grnulos de amido, de pigmentos, polmero de fsforo inorgnico,

etc. Acredita-se que geralmente os grnulos podem servir como fonte de material

nutritivo de reserva.

Material celular

Embora as bactrias no possuam o ncleo tpico das clulas de animais e

vegetais superiores, dentro do citoplasma so encontrados corpsculos que so

considerados como estrutura nuclear, onde encontrado o ADN da clula

bacteriana.

Entretanto deve-se usar o termo ncleo, uma vez que se trata de uma forma

primitiva de ncleo. O ncleo da clula bacteriana pode ser revelado pelo corante


de Feulgen, o qual especfico para ADN, ou pela microscopia eletrnica, uma

vez que menos denso que o citoplasma. No h evidncia de uma membrana

separando o ncleo do citoplasma e durante a replicao do ncleo bacteriano

no se tem observado o aparelho mittico, tpico das clulas superiores.

Flagelos

Os apndices muito finos, semelhantes a cabelos, que se exteriorizam atravs da

parede celular e se originam de uma estrutura granular imediatamente abaixo da

membrana citoplasmtica so denominados de flagelos. Nem todas as bactrias

possuem flagelos, mas pode-se generalizar que muitas espcies de bacilos o

apresentam e raramente eles ocorrem em cocos e lactobacilos.

Os flagelos so muito pequenos para serem vistos em seu estado natural, pelo

microscpio ptico. Uma vez que os flagelos so responsveis pela mobilidade das

bactrias e que nem todas as bactrias so flageladas, conclui-se que existem

espcies mveis e imveis. O mtodo exato pelo quais os flagelos movimentam a

clula bacteriana no conhecido. Uma das hipteses diz que as cadeias proticas se

contraem e se relaxam produzindo um movimento ondulatrio que puxa ou empurra o

organismo. Outra sugere um mecanismo rotatrio, a partir de uma extremidade fixa, de

uma hlice relativamente rgida.

A mobilidade pode ser facilmente observada pela microscopia com preparao em

gota pendente.

Cpsulas

Algumas bactrias esto envoltas por uma substncia viscosa que forma uma camada

de cobertura ou envelope ao redor da clula. Estas estruturas so designadas como

cpsula ou camada limosa. As cpsulas representam um envoltrio protetor e podem

servir tambm como reservatrio de alimentos armazenados e como locais de despejo

de substncias de escria. As bactrias capsuladas so responsveis pelo

aparecimento de certos prejuzos em processos industriais uma vez que este material

de natureza polissacardica pertencentes a diversos tipos como o dextrano, a

dextrina, o levano e a celulose.

Reproduo bacteriana

Durante o crescimento bacteriano o processo mais comum de diviso celular

(multiplicao) a fisso binria, onde uma nica clula se divide em duas, aps o


desenvolvimento de uma parede celular transversal. Essa diviso da clula um tipo

de reproduo assexual. O tempo necessrio para que a clula se divida ou para que

a populao duplique conhecido por tempo de gerao, o qual pode variar de 15 a

20 minutos at algumas horas. O tempo de gerao depende da espcie bacteriana e

das condies ambientais, ou seja, as bactrias so capazes de crescer numa ampla

faixa de condies fsicas, podendo utilizar alimentos muito diferentes, mas seu

crescimento timo requer condies especficas para uma dada espcie.

Entretanto a fisso binria no o nico processo de reproduo das bactrias.

Muitas espcies bacterianas pertencentes a vrios gneros (Bacillus, Clostridium) so

capazes de formar, sob certas condies, ou como meio de disseminao da espcie,

unidades celulares conhecidas como esporos. Esses esporos so formados no interior

das clulas e portanto so denominados de endosporos. Eles contm somente parte

dos constituintes celulares e a sua posio e forma na clula so importantes critrios

na classificao dos bacilos.

Nas espcies do gnero Bacillus somente um esporo formado por clula, e quando

este germina resulta uma nica clula bacteriana. A germinao dos esporos

geralmente requer a presena de um aminocido especfico e pode ocorrer somente

aps o esporo ter sofrido a ao de fatores fsicos (choque trmico).

A resistncia dos esporos bacterianos as altas temperaturas varivel de espcie

para espcie, e de um modo geral, temperaturas ao redor de 80C ou mais so

apenas suficientes para provocar a germinao dos mesmos.

importante mencionar que as bactrias capazes de formar esporos, podem crescer e

multiplicar-se por muitas geraes como clulas vegetativas, mas num determinado

momento do desenvolvimento pode ocorrer no interior do citoplasma vegetativo, a

sntese de um novo protoplasma, que dar origem ao esporo.


A composio qumica do esporo tpica e todos os esporos bacterianos contm

grandes quantidades de cido dipicolnico (5 a 10%), grandes quantidades de clcio,

peptidoglicano, os quais formam um complexo Ca- cido dipicolnico-peptoglicano que

constitui a camada cortical do esporo. Comparados com as formas vegetativas, os

esporos so extremamente resistentes aos agentes fsicos e qumicos adversos. Esta

capacidade de sobrevivncia pode ser atribuda sua parede ou capa impermevel a

qual por sua vez est associada ao complexo cido dipicolnico-clcio.

Ciclo normal de crescimento da cultura bacteriana

Quando se inocula um meio de cultura com certo nmero de bactrias e se observa o

nmero de clulas a intervalos regulares por mais ou menos 24 horas, verifica-se que

inicialmente parece no haver crescimento, em seguida h um rpido aumento da

populao e depois h uma diminuio do nmero de clulas. Esses perodos so

conhecidos como fases do crescimento bacteriano, e so assim denominados: lag

fase, fase logartmica ou exponencial, fase estacionria e fase de declnio ou de morte.

A - lag fase

B - fase exponencial

C - fase estacionria

D

C

B

A

Log donmero debactrias

Tempo (h)


D - fase de declnio

Fig. 8. Curva de crescimento tpica das bactrias. (A) fase lag; (B) fase log

(logartmica); (C) fase estacionria; (D) fase de morte ou de declnio.

(Pelczar, Reid, Chan - 1981, vol. 1)

Na fase lag no significa que as clulas estejam em repouso ou dormentes; ao

contrrio durante esta fase as clulas aumentam de tamanho, so fisiologicamente

ativas e esto sintetizando novo protoplasma. As bactrias no novo meio podem ser

deficientes em enzimas ou coenzimas que devem ser sintetizadas em quantidades

suficientes para o funcionamento timo da maquinaria qumica da clula. Ao final da

fase lag cada organismo se divide, no entanto como nem todos os indivduos

completaram sua etapa lag simultaneamente ocorre um aumento gradual da

populao at o trmino desta fase, quando todas as clulas passam a ter capacidade

de diviso em tempos regulares.

Na fase logartmica ou exponencial as clulas se dividem firmemente, num ritmo

constante. A populao grandemente uniforme em termos de composio qumica,

atividade metablica e outras caractersticas fisiolgicas.

Na fase estacionria a populao permanece constante durante certo tempo, talvez

como resultado da completa cessao das divises ou do equilbrio entre o ritmo de

reproduo e o equivalente ritmo da morte. A tendncia para o fim do crescimento

pode ser atribuda a uma srie de cirscuntncias, particularmente exausto de

alguns nutrientes e, com menos freqncia, a produo de produtos txicos.

Na fase de declnio ou de morte, as bactrias passam a morrer mais rapidamente do

que a produo de novas clulas. Vrias condies contribuem para a morte

bacteriana; as mais importantes so a depleo de nutrientes essenciais e o acmulo

de substncias inibidoras como os cidos.

Caracterizao e Classificao dos Microrganismos

As comparaes das caractersticas de grande nmero de microrganismos resultam

num sistema de agrupamento das espcies semelhantes. Por fim, cria-se um grupo

com caractersticas muito semelhantes, que considerado como uma espcie e

recebe um nome especfico, isto , o microrganismo adquire um nome.

Por serem individualmente to pequenos que no podem ser visualizados sem ajuda

de um microscpio, no prtico trabalhar com um nico microrganismo.


Por esta razo comum se trabalhar com culturas puras, ou seja, cultura que consiste

de uma nica espcie de microrganismos, originada do crescimento de uma nica

clula microbiana. Se dois ou mais tipos crescem juntos tem-se uma cultura mista.

Antes de se identificar e classificar um microrganismo, suas caractersticas devem ser

determinadas com detalhes adequados. As principais a serem determinadas ou

observadas, incluem as seguintes:

a) caractersticas culturas: os nutrientes exigidos para o crescimento e as condies fsicas do ambiente que favorecem o desenvolvimento.

b) caractersticas morfolgicas: as dimenses das clulas, seus arranjos, a diferenciao e a identificao de suas estruturas.

c) caractersticas metablicas: a maneira pela qual o microrganismo desenvolve os processos qumicos vitais.

d) caractersticas de composio qumica: a identificao dos principais e tpicos constituintes qumicos da clula.

e) caractersticas antignicas: a deteco de componentes especiais da clula que fornecem evidncia de semelhana entre as espcies.

f) caractersticas genticas: a anlise da composio do cido desoxiribonucleico (ADN), assim como a determinao das relaes entre o ADN isolado de diferentes

microrganismos.

Uma vez que as caractersticas de um microrganismo tenham sido adequadamente

determinadas e catalogadas, possvel identific-lo pela consulta a livros de

referncia que contm descries das espcies microbianas (exemplo: Bergeys

Manual of Determinative Bacteriology). Entretanto comum, mesmo hoje, descobrir

que o organismo que est sendo pesquisado muito diferente de qualquer um dos

que foram descritos anteriormente e pode, de fato, tratar-se de uma nova espcie.

Alm disso, quanto mais informaes forem coletadas sobre os microrganismos

existentes, as idias a respeito de seus agrupamentos podem sofrer modificaes.

Classificao em Nvel de Gnero


A morfologia celular ainda uma caracterstica muito importante na descrio dos

gneros de bactrias. Assim as bactrias so divididas em bastonetes e cocos. A

diviso celular em um ou dois planos importante na diferenciao dos cocos.

Uma caracterstica importante na diferenciao de bactrias em nvel de gnero o

tipo de fermentao da glicose em condies padronizadas ( suprimento ilimitado de

glicose e de fatores de crescimento como aminocidos, vitaminas e disponibilidade

limitada de oxignio). Nessas condies as bactrias so divididas em dois grupos: (1)

homofermentativo, envolvendo aquelas que convertem glicose quase exclusivamente

a cido lctico e (2) heterofermentativa, as que formam, alm de cido lctico , cido

actico, gs carbnico e etanol.

Crescimento a determinadas temperaturas usado pra distinguir cocos. Enterococcus

crescem a 10C e 45C, Lactococcus e Vagococcus a 10C, mas no a 45C e

Estreptococcus no cresce a 10C e a 45C varivel conforme a espcie. A

tolerncia a 6,5% de sal pode ser usada para distino entre Enterococcus,

Lactococcus e Estreptococcus.

A tolerncia a acidez e alcalinidade pode ser usada para distino entre os gneros.

Os Enterococcus so considerados bem tolerantes a pH extremos. A formao de

diferentes ismeros de cido lctico na fermentao da glicose pode ser usada para

distinguir Leuconostoc e Lactobacillus heterofermentativos. Os Leuconostoc produzem

apenas cido D - lctico e os Lactobacillus DL-lctico. Os Pediococcus e Aerococcus

so morfologicamente idnticos, mas os Pediococcus so mais tolerantes a cidos e

crescem em condies estritamente anaerbias.

Deve-se considerar que h superposio nos fentipos entre os diferentes gneros, e

exees as caractersticas consideradas tpicas so bastante freqentes entre as

bactrias. Assim a identificao segura destas bactrias requer mtodos sofisticados,

envolvendo um nmero grande de provas bioqumicas.

Classificao em Nvel de Espcie

As anlises das caractersticas fenotpicas so ainda importantes na classificao

preliminar e no conhecimento de algumas propriedades importantes do ponto de vista

industrial. Algumas caractersticas importantes em nvel de classificao de espcie

so: (1) tolerncia a pH e sal, (2) crescimento a determinadas temperaturas, (3)

configurao do cido lctico produzido, (4) fermentao de diferentes carboidratos,

(5) hidrlise da arginina, (6) formao de acetona (teste Voges Proskauer), (7)

tolerncia a sais de bile, (8) tipo de hemlise, (9) produo extracelular de

polissacardeos, (10) demanda de fatores de crescimento, (11) presena de certas


enzimas, (12) caractersticas de crescimento no leite e (13) tipificao sorolgica.

Outras caractersticas incluem a taxonomia molecular e quimiotaxonomia, como (1)

tipo de peptidoglicanas de cido diamnicos, (2) presena e tipo de cidos teicicos,

(3) presena e tipo de menaquinonas, (4) relao de G + C no DNA, (5) composio

de cidos graxos e (6) mobilidade eletrofortica de desidrogenase do lactato.

Grupos Relevantes em Usinas de Acar e lcool

Veremos a seguir a descrio de algumas espcies dos diferentes gneros de

bactrias que frequentemente so encontradas como contaminantes do processo de

produo de acar e lcool.

Espcie Bacteriana

Caractersticas Morfolgicas e Citolgicas

Caractersticas Fisiolgicas - Produtos do metabolismo

Bacillus subtilis Bastonetes (2,0-3,0 m x 0,7-0,8 m), isolados e raramente em cadeias, esporulados,

esporo elptico central, Gram

(+) e com mobilidade.

Aerbios ou anaerbios

facultativos, catalase (+), T

tima 30-37c (mnima 5-20C).

Fermentao da glucose com

produo de 2,3 butanodiol +

acetona + CO2, levana

extracelularmente de sacarose,

ativo em pH 5,5 - 8,5.

Bacillus brevis Bastonetes (1,5-4,0 m x 0,8-1,2 m), isolados e raramente em cadeias, esporulados,

esporo elptico central ou

terminal, Gram (+) e com

mobilidade.

Aerbios, catalase (+), T tima

30-35C (mnima 10-35C e mxima 40-60C), cido de

glucose (v).

Bacillus megaterium Bastonetes (2,0-5,0 m x 1,2-1,5 m), tendncia formar pequenas cadeias tranadas,

esporulados, esporos elptico

central, Gram (+) e com

mobilidade.


30C (mnima 3-20C e mxima

35-45C). cido de glucose.

Espcie Bacteriana




Bacillus coagulans Bastonetes (2,5-5,0 m x 0,6-1,0 m), principalmente isolados, esporulados, esporo

elptico central ou terminal,

Gram (+) e com motilidade.

Aerbios ou anaerbios facult.,

catalase (+), T tima 35-40C

(mnima 15-25C e mxima 55-

60C, pH mnimo p/ cresc. 4,0-

5,0, c. de glucose,

fermentao de glucose com

produo de c. ltico + 2,3

butanodiol + acetona + c.

actico + etanol.

Bacillus stearothermophilus Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,5-1,0 m) isolados e em cadeias, esporulados, esporo oval

terminal, Gram (+) e com

motilidade.


45-50C (mnima 35C e

mxima 65C). cido de

glucose.

Lactobacillus fermentum Bastonetes (0,5-0,9 m de largura e comprimento muito

varivel), isolados e/ou aos

pares, Gram (+), no

esporulados, raramente com

motilidade.

Anaerbios facultativos,

catalase (-), T tima 30-40C

(15C (-) e 45C (+)) pH timo

5,5-5,9, heterofermentativos:

produo de c. ltico +

acetato + etanol + CO2 de

glucose, frutose e sacarose..

Lactobacillus delbruecki Bastonetes (2,0-9,0 m x 0,5-0,8 m), isolados e/ou em pequenas cadeias, Gram (+)

no esporulados, raramente

com motilidade.


catalase (-), T tima 40C

(15C (-) e 45C (+)),

homofermentativos: cido ltico

de glucose, frutose e sacarose,

pH timo: 5,5-5,8.

Lactobacillus plantarum Bastonetes (3,0-8,0 m x 0,9-1,2 m), isolados, aos pares e/ou em pequenas cadeias,

Gram (+), no esporulados,

raramente com motilidade.



(15C (+) e 45C (-)),

heterofermentativos: cidos de

glucose, frutose e sacarose, pH

timo: 5,5-5,8.

Espcie Caractersticas Morfolgicas Caractersticas Fisiolgicas -


Bacteriana e Citolgicas Produtos do metabolismo

Lactobacillus helveticus Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,6-1,0 m), isolados, aos pares e/ou em pequenas cadeias,

Gram (+), no esporulados,

raramente com motilidade.


catalase (-), T. tima 30-40C

(15C (-) e 45C (+)),

heterofermentativos: cido

ltico de glucose, frutose, pH

timo: 5,5-5,8.

Lactobacillus brevis Bastonetes (2,0-4,0 m x 0,7-1,0 m), isolados e em pequenas cadeias, Gram (+),

no esporulados, raramente

com motilidade



(15C (+) e 45C (-)),


glucose, frutose e sacarose, pH

timo: 5,5-5,8.

Lactobacillus

yamanashiensis Bastonetes (2,0-6,0 m x 0,5-1,0 m) isolados, pares e cadeias, Gram (+), no

esporulados e com motilidade



(10C (+) e 45C (-) ),

hemofermentativos: produo

de cido ltico de glucose,

frutose e sacarose.

Lactobacillus coryniformis Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,8-1,1 m) isolados, pares e cadeias, Gram (+), no

esporulados e sem motilidade

Anaerbios facultativos


(10C (+) e 45C (-) ),

heterofermentativo facultativo:

cido de glucose, sacarose,

frutose, maltose, ramnose,

manitol, galactose.

Lactobacillus vaccinostercus Bastonetes (1,0-3,0 m x 0,5-0,7 m), pares, no esporulado, Gram (+) e sem

motilidade



(15C(-) e 45C (-)),


glucose, arabinose, maltose,

xilose, galactose, ribose,

celobiose.




Lactobacillus viridescens Bastonetes (0,7-0,9 m x 2,0-5,0 m); com extremidades arredondadas; isolados ou aos

pares; no esporulados; Gram

(+); sem motilidade.

Microaerfilos; catalase

(-); oxidase (-); fermentao de

glucose (+), frutose e sacarose

(+); crescimento a 15C (+);

crescimento a 45C (-);

heterofermentativas, pH 5,5-

6,2, geralmente com

crescimento em pH < 5,0.

Lactobacillus buchneri Bastonetes (0,7-1,0 m x 2,0-4,0 m); isolados e em cadeias curtas; Gram (+); raramente

com motilidade; no

esporulados.

Anaerbios facultativos;

heterofermentativos;

fermentao da glucose (+),

frutose (+) e sacarose (V);

crescimento a 15C (+);

crescimento a 45C

(-); pH 5,5-6,2, geralmente com

crescimento em pH < 5,0.

Lactobacillus fructivorans Bastonetes (0,5-0,8 m x 15-4,0 m); isolados, aos pares e em cadeias; extremidades

arredondadas; Gram (+);

raramente com motilidade; no

esporulados.



fermentao da glucose (+),

frutose (+) e sacarose (V);

crescimento a 45C

(-); acidfilo (pH favorvel 5,0);

no cresce em pH > 6,0; pode

utilizar etanol para crescimento.

Lactobacillus fructosus Bastonetes (0,5-0,8 m x 2,0-4,0 m); isolados, aos pares e em pequenas cadeias; Gram

(+); raramente com motilidade;

no esporulados.



fermentao de glucose (+),

frutose (+) e sacarose (-);


crescimento a 45C

(-); pH favorvel 5,5-6,0, cresce

em pH < 5,0.




Lactobacillus acidophilus Bastonetes (0,6-0,9 m x 1,5-6,0 m); isolados, aos pares e em pequenas cadeias; Gram

(+); raramente com motilidade;

no esporulados.


homofermentativos com

produo de DL-cido ltico;

crescimento a 15C (-);


fermentao de glucose (+),

frutose (+), sacarose (+).

Sporolactobacillus sp Bastonetes (3,0-5,0 m x 0,7-0,8 m) isolados e pares, Gram (+), esporulados e com

motilidade, esporos elpticos

terminais.

Microaerfilos, catalase (-)


de frutose, glucose, maltose,

rafinose, sacarose, no produz

gs.

Leuconostoc mesenteroides Clulas esfricas e

frequentemente lenticulares

(0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos pares ou em cadeias, Gram (+),

sem motilidade, no

esporulados.

Anaerbios facultativos, T.

tima: 20-30C, (mnima 10C e

mxima 37C), catalase (-),

crescimento 10% etanol

(-), crescimento em pH 4,8 (-),

heterofermentativos: c. de

glucose, frutose e sacarose.

Formao de dextrana, pH

timo 5,5-6,5.

Leuconostoc dextranicum Clulas esfricas ou

lenticulares (0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m); aos pares ou cadeias; Gram (+); sem motilidade; no

esporuladas.



fermentao de carboidratos

resultando em D (-) cido ltico

e etanol ou cido actico ao

invs de etanol; catalase

(-), oxidase (-); cido de frutose

(+), glucose (+), sacarose (+);

crescimento em pH 4,8 (-);

crescimento em 10% (-).

Espcie Bacteriana




Leuconostoc lactis Clulas esfricas e

frequentemente lenticulares

(0,7-1,2 m x 0,5-0,7 m), aos pares ou em cadeias, Gram (+),

sem motilidade, no

esporulados.

Anaerbios facultativos, T

tima: 25-30C, (mnima 10C e

mxima 40C), catalase (-),

crescimento 10% etanol

(-), crescimento em pH 4,8 (-),

formao de dextrana, pH

timo 5,5-6,0,

heterofermentativos: c. de

glucose, frutose e sacarose.

Micrococcus lylae Clulas esfricas (0,8-1,6 m de ), predominante em ttrades, Gram (+), sem

motilidade, no esporuladas,

sem cpsula.

Aerbios (oxidativos), catalase

(+), temperatura tima: 30-

37C, no exibe metabolismo

fermentativo.

Micrococcus halobius Clulas esfricas (0,8-1,6 m de ) isoladas, aos pares e ocasionalmente em ttrades e

cachos, Gram (+), sem

motilidade, no esporuladas,

sem cpsula.

Aerbios (Oxidativos), catalase

(+), Temperatura tima: 30-

35C (crescimento 37C (+)),

cido de glucose.

Pediococcus parvulus Cocos (0,6-1,0 m de ), aos pares ou em ttrades, Gram

(+), sem motilidade, no

esporulado, sem cpsula.

Anaerbios facultativos, T

tima: 30C (crescimento 35C

(+), 40C (-)), catalase (-), pH

timo 5,0-6,0 (pH 4,0 (+) e 8,5

(-)), homofermentativos: cido

ltico de glucose.

Pediococcus pentosaceus Cocos (0,8-1,0 m de ), aos pares ou em ttrades, Gram

(+), sem motilidade, no

esporulado, sem cpsula.

Anaerbios Facultativos, T

tima: 35C (40C (+), 50C (-),

catalase (-), pH timo 5,0-6,0

(pH 4,0 (+) e 8,5 (v)),


de glucose e sacarose (v).




Pediococcus acidilactici Clulas esfricas (0,6-1,5 m de ); aos pares ou ttrades; isoladas so raras e nunca em

cadeias; Gram (+); sem

motilidade; no esporuladas.

Anaerbios facultativos; T

tima

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FERMENTACAO-ALCOOLICA-V2