UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO
SEMIÁRIDO
FERNANDA PIRES RODRIGUES DE ALMEIDA RIBEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOGÊNICA DE
Erythroxylum caatingae Plowman EM ÚTERO ISOLADO DE
RATA
PETROLINA – PE
2013
FERNANDA PIRES RODRIGUES DE ALMEIDA RIBEIRO
INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOGÊNICA DE
Erythroxylum caatingae Plowman EM ÚTERO ISOLADO DE
RATA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Recursos Naturais do Semiárido, da Universidade
Federal do Vale do São Francisco, UNIVASF, Campus
Petrolina-PE, como requisito para a obtenção do título
de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido. Área de
concentração: Fisiologia e Farmacologia
Orientador: Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima
Co-Orientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo
Ribeiro
PETROLINA – PE
2013
Ribeiro, Fernanda Pires Rodrigues de Almeida
R484i Investigação da atividade espasmogênica de Erythroxylum caatingae
Plowman em útero isolado de rata / Fernanda Pires Rodrigues de
Almeida Ribeiro. – – Petrolina, 2013.
xix, 134 f. ; il. ; 29 cm.
Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) –
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina,
Petrolina-PE, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima.
Co-orientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro
Banca Examinadora: Marcos Antônio Alves de Medeiros,
Raimundo Campos Palheta Júnior
1. Plantas Medicinais. 2. Erythroxylum caatingae Plowman. 3.
Farmacologia. 4. Contrações uterinas. 5. Rata - útero isolado de rata. I.
Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 581.19 Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF
Bibliotecário: Maria Betânia de Santana da Silva CRB4-1747.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais,
Pelo apoio em todas as etapas desde o início. Por terem norteado minha formação ética e
moral, a qual servirá como exemplo que tentarei repassar ao meu filho.
Aos meus irmãos,
Mesmo a distância pude sempre contar com suas mensagens de carinho e afeto.
Ao meu marido,
Pela paciência, convivência, ensinamentos, orientações e pelo companheirismo durante todo
esse tempo.
Ao meu filho Kaio,
Por sempre me tirar do raciocínio na hora certa. Obrigada meu amor, mamãe te ama!
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida e por colocar no meu caminho pessoas tão especiais.
Ao Prof. Dr. Julianeli Tolentino de Lima, por acreditar e me proporcionar a sua orientação.
Ao Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro, pela co-orientação durante essa etapa.
Aos meus queridos amigos do Laboratório de Farmacologia Cardiorespiratória: Morganna,
Pedrita, Ayla e Fernando pelo companheirismo, amizade, risadas, e pelos momentos
agradáveis dentro e fora do laboratório.
Às companheiras de mestrado e laboratório, Raquel, Stefânia e Martapolyana, pela companhia
durante os experimentos e pela amizade.
À Juliane Cabral e Camila Souza, pelo auxilio mútuo durante essa caminhada, pela amizade
conquistada, pelas descobertas, pelas conversas e desabafos.
Aos demais colegas e amigos da turma do mestrado, do Programa de Pós-Graduação em
Recursos Naturais do Semiárido.
À Profª. Drª. Edigênia e seus orientados de iniciação científica, José Marcos Teixeira e
Luciana Costa por terem me cedido o extrato, contribuindo de maneira inestimável para o
andamento deste trabalho.
Aos técnicos de laboratório, Roniere e Fernando, pela ajuda nos procedimentos bioquímicos.
Às técnicas de laboratório Amanda e Ana Paula, pela amizade, pela disponibilidade e pelo
auxílio técnico de muita valia nesse processo.
À Leonardo Neves, pela sua amizade, competência e auxílio técnico que foram de extrema
importância no desenvolvimento de algumas fases desse trabalho. Além dele, os demais
funcionários do biotério, Euda, Helenildo e Jean por serem sempre prestativos quando
solicitados e dedicados ao trabalho. Obrigada pela ajuda!
À Coordenação da Pós-Graduação em Recursos Naturais do Semiárido pela dedicação,
empenho e competência para com todos.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo suporte e
apoio financeiro na concessão da minha bolsa.
À Universidade Federal do Vale do São Francisco, instituição maior, pela oportunidade e por
promover o desenvolvimento técnico-científico.
À todos que de maneira direta ou indireta contribuíram nessa etapa
Muito Obrigado!
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o
melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não
sou o que era antes”.
Marthin Luther King
RESUMO
Investigação da atividade espasmogênica de Erythroxylum caatingae Plowman em útero isolado de rata.
Ribeiro, F.P.R.A (2013). Dissertação de Mestrado, PGRNSA/UNIVASF.
Em todas as partes do mundo as plantas medicinais são amplamente empregadas pela
população para o tratamento de uma infinidade de doenças. No que concerne as mulheres,
muitas delas costumam usar plantas medicinais como alternativa terapêutica, visto que um
grande número delas são acometidas por patologias associadas às contrações uterinas, sendo
essas anormalidades de grande interesse clínico e constituindo alvos de constantes buscas por
novas entidades terapêuticas. A família Erythroxylaceae compreende quatro gêneros
(LOIOLA et al., 2007), entre eles o Erythroxylum P. Browne, um dos mais estudados por
apresentar espécies, com potencial terapêutico, ricas em alcalóides tropânicos e pirrolidínicos,
taninos, terpenos e fenilpropanóides principalmente em suas folhas e frutos (ZUANAZZI et
al., 2001). Pertencente a esse gênero temos a espécie Erythroxylum caatingae Plowman, que
não possui relatos na literatura de seu uso na medicina popular, entretanto por possuir
distribuição endêmica desperta interesse quanto a possíveis efeitos farmacológicos. Devido a
ausência de maiores informações na literatura, objetivou-se a realização de um estudo sobre o
efeito do extrato etanólico bruto (Ec-EtOH) dessa espécie sobre o útero isolado de rata. O Ec-
EtOH (729 µg/mL), per si, induziu contrações de magnitudes significativas, com valores de
68,4±6,1% e 61,50±9,0%, comparando com as amplitudes das contrações induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina (Oci) e 10-5
M de acetilcolina (ACh), usados como padrões
uterotônicos. Além disso, o Ec-EtOH não foi capaz de inibir as contrações promovidas pelos
mesmos agonistas. Entretanto, quando adicionado sobre o tônus da contração induzida pela
ACh ou Oci, o Ec-EtOH induziu relaxamento de 108,3±4,2% e 60,9±15,2%, respectivamente.
Avaliando-se o efeito de administrações consecutivas do Ec-EtOH, para comparar o padrão de
resposta sobre tecidos uterinos não gravídicos e no período pós-parto, observou-se que em
tecido uterino não gravídico o Ec-EtOH induziu contrações com Emax de 71,1±15,1% na
primeira e 48,8±6,5% na segunda aplicação, comparando as contrações induzidas pela Oci, e
com Emax de 72,3±7,5% de contração na primeira e 57,0±6,5% na segunda aplicação,
comparando as contrações induzidas pela ACh. Já em tecido uterino pós-parto, a amplitude
máxima de contração do Ec-EtOH foi de 47,4±10,5% de contração, na primeira aplicação, e
76,5±6,7% de contração na segunda aplicação, comparando as contrações induzidas pela Oci.
Como o Ec-EtOH apresentou características uterotônicas, buscou-se investigar os possíveis
mecanismos de ação envolvidos. Usando a atropina (10µM), um antagonista não seletivo dos
receptores muscarínicos, o valor do Emax induzido pelo Ec-EtOH foi reduzido
significativamente, sendo ele de 58,4±9,4% de contração na ausência da atropina e
34,47±7,34% de contração na sua presença. Quando utilizou-se a indometacina (60µM), um
inibidor não seletivo da COX, o Emax de contração do Ec-EtOH foi de 68,1±6,3% na
ausência da indometacina e de 31,5±12,5% na sua presença, também apresentando uma
redução significativa. Por fim, quando utlizou-se o atosiban (0,1 µM), um antagonista dos
receptores para ocitocina, o Emax de contração induzido pelo Ec-EtOH foi de 68,12 ± 6,32%
na ausência do atosiban e de 30,54 ± 4,29% na sua presença. Como a contração uterina está
associada ao aborto, indução de parto pré-maturo e malformação, foi investigado se o Ec-
EtOH, na dose de 250 mg/kg (v.o.), seria capaz de causar algum desses efeitos em ratas
prenhas. Entretanto, o uso do Ec-EtOH, por cindo dias consecutivos, não ocasionou quaisquer
das alterações citadas. Conclui-se que o Ec-EtOH é uterotônico, tanto em tecido uterino não
gravídico e pós-parto, estando seu efeito relacionado a uma possível ativação dos receptores
muscarínicos, a liberação de prostaglandinas e a ativação dos receptores para ocitocina.
Palavras-chaves: Erythroxylum caatingae; efeito uterotônico; útero isolado de rata.
ABSTRACT
Investigation of the spasmogenic activity of Erythroxylum caatingae Plowman in isolated rat uterus
Ribeiro, F.P.R.A (2013). Dissertação de Mestrado, PGRNSA/UNIVASF
In all parts of the world medicinal plants are widely used by the population to treat a
multitude of diseases. Regarding women, many of them often use medicinal plants as an
alternative therapy, since a large number of them are affected by diseases associated with
uterine contractions, being these abnormalities of great clinical interest, and constituting the
target of constant search for new therapeutic entities. The Erythroxylaceae family comprises
four genera (LOIOLA et al., 2007), including Erythroxylum P. Browne, one of the most
studied for displays species with therapeutic potential, rich in alkaloids and tropanic
pirrolidinic, tannins, phenylpropanoids and mainly terpenes in their leaves and fruits
(ZUANAZZI et al., 2001). Belonging to this genus have species Erythroxylum caatingae
Plowman, which has no published reports of its use in folk medicine, since that species has
endemic distribution arouses interest for possible pharmacological effects. Due to lack of
further information in the literature, the aim of this work was to conduct a study on the effect
of ethanol extract (Ec-EtOH) of this species on the isolated rat uterus. The Ec-EtOH
(729µg/mL), per si, induced contractions of significant magnitude, with values of 68.4±6.1%
and 61.50±9.0%, comparing with the amplitude of contractions induced by 10-2
UI/mL
oxytocin (OCI) and 10-5
M acetylcholine (ACh), used as standards uterotonics. In addition, the
Ec-EtOH was not able to inhibit the contractions promoted by the same agonists. However,
when added upon tone contraction induced by ACh or OCI, Ec-EtOH induced relaxation of
108.3±15.2 % and 60.9±4.2%, respectively. Evaluating the effect of consecutive
administrations of the Ec-EtOH, to compare the pattern of response on not-gravid uterine
tissues and the postpartum uterine tissues, it was observed that in the gravid uterine tissue Ec-
EtOH induced contractions with Emax of 71,1±15.1% in the first and 48.8±6.5% in the second
administration, comparing with the contractions induced by OCI, and Emax of 72.3±7.5 %
contraction in the first and 57.0±6.5% in the second administration , comparing the
contractions induced by ACh. In postpartum uterine tissue, the Emax of Ec-EtOH was
47.4±10.5% contraction in the first and 76.5±6.7% contraction in the second administration,
comparing contractions induced by OCI. As the Ec- EtOH showed uterotonic features, we
sought to investigate the possible mechanisms involved. Using atropine (10 µM) a non-
selective antagonist of muscarinic receptors, the Emax value of Ec-EtOH was reduced
significantly, from 58.4±9.4 % in the absence of atropine to 34.5 ± 7,3% in its presence.
When indomethacin was used (60μM) a nonselective COX inhibitor, the Emax of Ec-EtOH
was 68.1±6.3% in the absence of indomethacin and 31.5±12.5% its presence, also showing a
significant reduction. Finally, when was used atosiban (0.1µM), an oxytocin antagonist, the
Emax induced by Ec- EtOH was 68.1 ± 6.3% in the absence of atosiban and 30,5±4.3 % in its
presence. As uterine contraction is associated with abortion, induction of premature labor and
malformation, we investigated whether Ec-EtOH at a dose of 250 mg/kg (p.o.), could cause
some of these effects in pregnant rats. However, the use of Ec- EtOH by five consecutive days
did not cause any changes therein. We conclude that the Ec- EtOH is uterotonic, both in non
gravid uterine tissue and postpartum, their effect being related to a possible activation of
muscarinic receptors, the release of prostaglandins and oxytocin receptor activation.
Keywords: Erythroxylum caatingae; uterotonic effect; isolated rat uterus.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Foto de partes das folhas e flor de Erythroxylum caatingae Plowman 29
Figura 2 – Foto das folhas e fruto de Erythroxylum caatingae Plowman 30
Figura 3 – Anatomia do útero humano 31
Figura 4 – Camadas uterinas 32
Figura 5 – Útero de rata 33
Figura 6 – Anatomia do útero de rata 34
Figura 7 – Influência da ocitocina nas células do miométrio 45
Figura 8 – Exsicata da espécie Erythroxylum caatingae Plowman 58
Figura 9 – Esquema do protocolo a ser realizado para investigar o efeito do
Ec-EtOH (729 µg/mL) frente às contrações fásicas induzidas por 10-2
UI/mL de
ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
63
Figura 10 – Esquema do protocolo a ser realizado para investigar o efeito do
Ec-EtOH (729 µg/mL) sobre às contrações tônicas induzidas por 10-2
UI/mL de
ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
64
Figura 11 – Registro original do efeito espasmogênico do Ec-EtOH (729 µg/mL)
sobre o útero isolado de rata pré-contraído com 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M
de acetilcolina
73
Figura 12 – Registro original do efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL) sobre o tônus da
contração em útero isolado de rata pré-contraído com 10-2
UI/mL de ocitocina e
10-5
M de acetilcolina
77
LISTA DE TABELAS
Quadro 1 – Substâncias, sais e seus fornecedores 60
Tabela 1 – Composição da solução Locke Ringer. 61
Tabela 2 – Parâmetros bioquímicos obtidos das ratas do grupo do 1° dia de
prenhez tratadas com o Ec-EtOH durante 5 dias.
105
Tabela 3 – Parâmetros bioquímicos obtidos das ratas do grupo do 14° dia de
prenhez tratadas com o Ec-EtOH durante 5 dias.
105
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL) frente às contrações fásicas induzidas
por 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M de acetilcolina em útero isolado de rata.
74
Gráfico 2 – Frequência das contrações induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) pré-
incubado frente aos agonistas ocitocina (10-2
UI/mL) e acetilcolina (10-5
M) em
útero isolado de rata.
75
Gráfico 3 – Efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL) sobre às contrações fásicas induzidas
por 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M de acetilcolina em útero isolado de rata.
78
Gráfico 4 – Frequências de contrações induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) sob o
tônus das contrações fásicas induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M de
acetilcolina em útero isolado de rata.
79
Gráfico 5 – Amplitude máxima (Emax) do Ec-EtOH (729 µg/mL) comparado aos
agonistas ocitocina (10-2
UI/mL) e acetilcolina (10-5
M) em útero isolado de rata.
81
Gráfico 6 – Amplitude média induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª
aplicações comparado ao efeito contrátil de 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M de
acetilcolina em útero isolado de ratas.
82
Gráfico 7 – Frequência de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua
1ª e 2ª aplicações na presença de ocitocina (10-2
UI/mL de) e acetilcolina (10-5
M)
em útero isolado de ratas.
83
Gráfico 8 – Tmax para atingir o Emax do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª
aplicações na presença de ocitocina (10-2
UI/mL) e acetilcolina (10-5
M) em útero
isolado de ratas.
84
Gráfico 9 – Duração do efeito contrátil do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª
aplicações na presença de 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M de acetilcolina em útero
isolado de ratas.
85
Gráfico 10 – Amplitude máxima (Emax) do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª
aplicações comparado a ocitocina (10-2
UI/mL) em útero isolado de rata no pós-
parto.
86
Gráfico 11 – Amplitude média induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª
aplicações comparado a ocitocina (10-2
UI/mL) em útero isolado de ratas no pós-
parto.
87
Gráfico 12 – – Frequência da contração induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em
sua 1ª e 2ª aplicações na presença de ocitocina (10-2
UI/mL) em útero isolado de
ratas no pós-parto.
88
Gráfico 13 – Comparações entre as amplitudes máximas (Emax) do Ec-EtOH
(729 µg/mL) em suas 1ª e 2ª aplicações com a ocitocina (10-2
UI/mL) em útero
isolado de rata não grávido e pós-parto.
89
Gráfico 14 – Comparação entre as amplitudes médias induzidas pelo Ec-EtOH
(729 µg/mL) em suas 1ª e na 2ª aplicações com o efeito contrátil de 10-2
UI/mL de
ocitocina em útero isolado de rata não grávido e pós-parto.
90
Gráfico 15 – Comparação entre as frequências de contrações induzidas pelo
Ec-EtOH (729 µg/mL) em suas 1ª e 2ª aplicações na presença de 10-2
UI/mL de
ocitocina em útero isolado de rata não grávido e pós-parto.
91
Gráfico 16 – Amplitude média de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL)
na ausência e na presença da atropina na concentração de 10 µM em útero isolado
de rata.
93
Gráfico 17 – Emax induzido pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de atropina nas concentração10 µM em útero isolado de rata.
93
Gráfico 18 – Frequência das contrações induzidas pelo do Ec-EtOH (729 µg/mL)
na ausência e na presença da atropina na concentração de 10 µM em útero isolado
de rata.
94
Gráfico 19 – Amplitude média de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL)
na ausência e na presença de indometacina na concentração de 60 µM em útero
isolado de rata.
96
Gráfico 20 – Emax induzido pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de indometacina na concentração de 60 µM em útero isolado de rata.
97
Gráfico 21 – Frequência de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na
ausência e na presença de indometacina na concentração de 60 µM em útero
isolado de rata.
97
Gráfico 22 – Amplitude média de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL)
na ausência e na presença de atosiban na concentração de 10 -7
M em útero isolado
de rata.
99
Gráfico 23 – Emax induzido pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de atosiban na concentração de 10 -7
M em útero isolado de rata.
100
Gráfico 24 – Frequência de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na
ausência e na presença de atosiban na concentração de 10 -7
M em útero isolado de
ratas.
100
Gráfico 25 – Média do número de nascimentos entre os grupos controle e teste
1°dia de prenhez e controle e teste 14° dia de prenhez.
102
Gráfico 26 – Padrão do peso das ratas durante os dias de gavagem. 103
Gráfico 27 – Média do peso dos filhotes ao nascer entre os grupos controle e teste
1° dia de prenhez e controle e teste 14° dia de prenhez.
104
LISTA DE ABREVIATURAS
AA Ácido araquidônico
ACh Cloridrato de Acetilcolina
ALT Alanina transaminase
AMPc Monofosfato cíclico de adenosina
AST Aspartato transaminase
ATP Adenosina trifosfato
BKca Canais para potássio de grande condutância ativados pelo cálcio
Ca2+
Cálcio
Ca2+
i Cálcio intracelular
Cav Canais para cálcio abertos por voltagem
CaM Calmodulina
[(Ca2+
)4-CaM] Complexo cálcio-calmodulina
COX Ciclooxigenase
COX-1 Ciclooxigenase-1
COX-2 Ciclooxigenase-2
DAG Diacilglicerol
DMSO Dimetilsulfóxido
E. caatingae Erythroxylum caatingae Plowman
Ec-EtOH Extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae Plowman
Emax Amplitude máxima
E.P.M Erro Padrão da Média
GMPc Monofosfato cíclico de guanosina
GPCRs Receptores acoplados à proteína G
GTP Trifosfato de guanosina
HCl Ácido clorídrico
HCN Canais ativados por hiperpolarização e nucleotídeos cíclicos
5-HT 5-hidroxitriptamina
5-HT1 Receptor para serotonina do tipo 1
IP3 1,4,5-trisfosfato de inositol
IP3R Receptores de 1,4,5-trisfosfato de inositol
kg Quilogramas
K+ Potássio
Kir Canais para potássio retificadores de entrada
K2P Canais para potássio de dois poros
Kv Canais para potássio abertos por voltagem
M Concentração molar (mol/L)
Mg+ Magnésio
mg Miligramas
mL Mililitros
MLC Cadeia leve da miosina
MLCK Cinase da cadeia leve da miosina
MLCK-P Cinase da cadeia leve da miosina fosforilada
Na+ Sódio
Nav Canais para sódio abertos por voltagem
NaOH Hidróxido de Sódio
nM Nanomolar
OECD Organização para a Cooperação e o Desenvolvimento Econômico
Oci Ocitocina
OTR Receptores de ocitocina
PGE’s Prostaglandinas
PGE2 Prostaglandina E2
PGF2α Prostaglandina F2α
PGI2 Prostaciclina
PKA Proteína cinase dependente de AMPc
PKC Proteína cinase C
PKG Proteína cinase dependente de GMPC
PIP2 4,5 bisfosfato de fosfatidilinositol
PLC Fosfolipase C
RNAm RNA mensageiro
RS Retículo Sarcoplasmático
RyR Receptores de Rianodina
TCP Canais de potencial transiente
Tmax Tempo máximo
TRP Canais receptores de potencial transiente
UI Unidades Internacionais
UNIVASF Universidade Federal do Vale do São Francisco
Vm Potencial de membrana
vs Versus
µg Microgramas
µM Micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral 24
2.2 Objetivos específicos 24
3 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Plantas medicinais 26
3.2 Considerações sobre a família Erythroxylaceae e o gênero Erythroxylum 27
3.3 Considerações sobre a espécie Erythroxylum caatingae Plowman 29
3.4 Fisiologia do útero e do músculo liso uterino 31
3.4.1 O útero 31
3.4.1.1 O útero humano 31
3.4.1.2 O útero de ratas 33
3.5 Considerações sobre a contração e o relaxamento da musculatura lisa 34
3.6 Patologias associadas à motilidade uterina anormal 41
3.7 Fármacos uterotônicos e tocolíticos 44
3.7.1 Fármacos uterotônicos 44
3.7.2 Fármacos tocolíticos 49
3.8 Plantas com ações uterotônicas e tocolíticas 52
3.8.1 Plantas com ação uterotônica 53
3.8.2 Plantas com ação tocolítica 54
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material 57
4.1.1 Material Botânico 57
4.1.2 Animais 59
4.1.3 Aspectos éticos 59
4.1.4 Substâncias e Sais 60
4.1.5 Soluções Nutritivas 60
4.1.6 Aparelhos 61
4.1.7 Preparo dos extratos da espécie vegetal, bem como das drogas e reagentes
para os ensaios farmacológicos.
61
4.1.7.1 Extratos 61
4.1.7.2 Drogas e Reagentes 62
4.2 Métodos 62
4.2.1 Estudo da possível atividade espasmogênica do extrato etanólico bruto de
Erythroxylum caatingae Plowman (Ec-EtOH) em útero isolado de rata.
62
4.2.1.1 Preparação do útero para a realização do experimento. 62
4.2.1.2 Investigação do efeito do Ec-EtOH frente às contrações fásicas induzidas
por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
63
4.2.1.3 Investigação do efeito do Ec-EtOH sobre as contrações tônicas induzidas
por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina..
64
4.2.1.4 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo
de dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas do extrato frente
às contrações fásicas induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de
acetilcolina.
65
4.2.1.5 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo
de dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas do extrato frente à
contração fásica induzida por 10-2
UI/mL de ocitocina em tecido uterino de ratas
após o parto.
65
4.2.2 Investigação do possível mecanismo de ação espasmogênica do Ec-EtOH em
útero isolado de rata.
66
4.2.2.1 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença
de atropina.
66
4.2.2.2 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença
de indometacina.
67
4.2.2.3 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença
de atosiban.
67
4.2.3 Investigação da possível atividade espasmogênica do Ec-EtOH, em
diferentes períodos de gestação das ratas.
68
4.3 Análise estatística 70
5 RESULTADOS
5.1 Estudo da possível atividade espasmogênica do Ec-EtOH em útero isolado
de rata.
72
5.1.1 Investigação do efeito do Ec-EtOH frente às contrações fásicas induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
72
5.1.2 Investigação do efeito do Ec-EtOH sobre as contrações tônicas induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
76
5.1.3 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo de
dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas do extrato frente às
contrações induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
80
5.1.4 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo de
dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas do extrato frente à
contração induzida por 10-2
UI/mL de ocitocina em tecido uterino de ratas após o
parto.
86
5.2. Investigação do possível mecanismo de ação espasmogênica do Ec-EtOH
em útero isolado de rata.
92
5.2.1 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença
de atropina.
92
5.2.2 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença
de indometacina.
95
5.2.3 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença
de atosiban.
98
5.3 Investigação da possível atividade espasmogênica do Ec-EtOH em
diferentes períodos de gestação das ratas.
101
6 DISCUSSÃO 107
7 CONCLUSÃO 119
8 PERSPECTIVAS 121
REFERÊNCIAS 123
ANEXO A – Certificado de aprovação do CEEHA 135
INTRODUÇÃO
I N T R O D U Ç Ã O | 21
Embora a medicina moderna esteja bem desenvolvida na maior parte do mundo, a OMS
reconhece que grande parte da população dos países em desenvolvimento depende da
medicina tradicional para sua atenção primária, tendo em vista que 80% desta população
utiliza práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde e destes 85% utilizam plantas
ou preparações destas (BRASIL, 2006).
De fato, em todas as partes do mundo as plantas medicinais são amplamente
empregadas pela população para o tratamento de uma infinidade de doenças, e as mulheres
costumam ser frequentes usuárias desse tipo de alternativa terapêutica. Das patologias que
mais acometem o sexo feminino, as associadas aos órgãos do sistema reprodutor, em especial
o útero, são alvos de constantes buscas terapêuticas.
Muito progresso tem sido feito nos últimos anos para o entendimento da base fisiológica
da contratilidade uterina (WRAY et al., 2001). Anormalidades no processo de contração
muscular desse órgão durante as fases do ciclo menstrual, gravidez e parto podem ter
importantes implicações clínicas, incluindo dismenorréias, trabalho de parto prematuro,
atonias e hemorragias pós-parto, alguns desses fatores estão entre as causas de mortalidade
materna pré-natal no mundo ocidental (BRASIL, 2002; WHO, 2007). Em contraste, a indução
de contrações uterinas, principalmente durante o trabalho de parto pode ser necessária em
certas condições.
As terapias farmacológicas usadas para tratar as condições anormais de contratilidade
uterina variam desde efeitos para suprimir as contrações (agentes tocolíticos), aliviando os
sintomas típicos como as cólicas menstruais, enxaquecas e náuseas, que estão diretamente
relacionadas às disfunções do ciclo menstrual ou para induzir as contrações uterinas (agentes
uterotônicos), tratando sintomas próprios do período da gravidez como, induzir ao parto,
auxiliar durante as etapas do trabalho de parto, remoção da placenta retida e regulação da
hemorragia pós-parto (GRUBER; O’BRIEN, 2011).
Avaliando esse aspecto é interessante enfatizar que há a necessidade de aprofundar os
estudos sobre as plantas medicinais que afetem diretamente os órgãos do sistema reprodutor
feminino, especificamente o útero, visto que se pretende introduzir no mercado dos
fitoterápicos produtos que tenham ação comprovadamente eficaz sobre as complicações
associadas as contrações uterinas, e para isso é preciso estudos aprofundados que possam
comprovar a segurança para o uso das plantas, ervas e seus constituintes como agentes
terapêuticos.
É observável que o estudo de plantas, com intuito de descobrir seu potencial
terapêutico, tem demonstrado avanços notáveis no meio acadêmico e científico. Esse avanço
I N T R O D U Ç Ã O | 22
tem como objetivo primordial obter novos compostos com propriedades terapêuticas que
possam ser significativamente interessantes para o desenvolvimento da química de produtos
naturais de plantas, da farmacologia de produtos naturais entre outras áreas relacionadas
(CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; YUNES; PEDROSA; CECHINEL FILHO, 2001). A
integração destas áreas na pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho promissor e
eficaz para descobertas de novos medicamentos.
O gênero Erythroxylum, é um dos gêneros mais estudados por possui constituintes
químicos em algumas de suas espécies com amplo espectro de atividade farmacológica a
exemplo dos alcalóides tropânicos, pirrolidínicos, entre outros (ZUANAZZI et al., 2001). Há
registros recentes na literatura sobre o potencial terapêutico de plantas pertencentes ao gênero
como os estudos realizados por Santos et al. (2013) que investigou a ação do extrato etanólico
bruto obtido de espécies do gênero Erythroxylum sobre a musculatura lisa de traquéia de
cobaia e os estudo realizados por Aguiar et al. (2012) e Oliveira et al. (2011). Entretanto, a
espécie Erythroxylum caatingae Plowman possui poucos registros na literatura a respeito das
ações dos extratos, fases ou substâncias isoladas da mesma sobre a musculatura uterina, por
isso, o objetivo desse estudo foi o de investigar os possíveis efeitos do extrato de
Erythroxylum caatingae sobre a contração da musculatura lisa uterina de ratas.
Com isso, o desenvolvimento de estudos científicos na área da farmacologia baseados
na ação de plantas medicinais e principalmente as que são provenientes da biodiversidade
brasileira, sobretudo da região nordeste com ações espasmogênicas e/ou espasmolíticas sobre
o útero, a exemplo da espécie Erythroxylum caatingae Plowman do gênero Erythroxylum tem
grande relevância e visa à descoberta de novas aplicações terapêuticas para os recursos
naturais oriundos dessa região. A investigação de produtos naturais e de seus diversos
metabólitos continua sendo uma fonte potencial para o desenvolvimento de novas substâncias
com uso terapêutico, assim, os dados obtidos com este trabalho, além de serem inéditos,
servirão de início como ferramenta farmacológica para o entendimento do possível
mecanismo de ação dessa espécie sobre o útero isolado de rata.
OBJETIVOS
O B J E T I V O S | 24
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Contribuir para o estudo farmacológico de espécies vegetais presentes no Semiárido
Nordestino, especialmente do gênero Erythroxylum e da espécie Erythroxylum caatingae
Plowman com a finalidade de descobrir substâncias potencialmente terapêuticas ou que
sirvam como ferramentas farmacológicas para o melhor entendimento dos processos
fisiopatológicos envolvendo a contração uterina.
2.2 Específicos
2.2.1 - Estudar o possível efeito espasmogênico do extrato etanólico bruto da espécie
Erythroxylum caatingae Plowman (Erythroxylaceae) sobre o músculo liso de útero isolado de
rata, utilizando como parâmetros de medida as forças de contração;
2.2.2 - Verificar o efeito do extrato sobre a atividade contrátil de útero isolado de rata
nas condições não gravídicas e pós-parto;
2.2.3 - Caracterizar farmacologicamente o possível mecanismo de ação espasmogênica
do extrato da espécie em estudo;
2.2.4 - Verificar o efeito do extrato em ratas adultas e sua prole durante os períodos
gestacionais (pré-implantação e organogênese).
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 26
3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
3.1 Plantas medicinais
O conhecimento sobre plantas medicinais representa muitas vezes o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos. O uso de plantas no tratamento e na cura
de enfermidades é tão antigo quanto a espécie humana (VEIGA JÚNIOR et al., 2005). Ainda
hoje, mesmo com o surgimento de medicamentos benéficos e mais acessíveis, nas regiões
mais carentes do país e até mesmo nas grandes cidades brasileiras, plantas medicinais são
comercializadas em feiras livres, mercados populares e encontradas em quintais residenciais
(MACIEL et al., 2002).
Como dito anteriormente, ao longo do processo evolutivo, o homem foi aprendendo a
selecionar plantas para a sua alimentação e para o alívio de seus males e doenças. Como
resultado desse processo muitos povos passaram a dominar o conhecimento do uso de plantas
medicinais e até hoje, alguns ainda fazem uso consciente de medicamentos fitoterápicos
tradicionais relacionados com saberes e práticas que foram adquiridas ao longo dos séculos
(FERREIRA; PINTO, 2010).
As plantas medicinais são partes constituintes da biodiversidade, que é definida como a
variedade e variabilidade existentes entre organismos vivos e as complexidades ecológicas
nas quais eles ocorrem. Compreende não só uma associação de vários componentes
hierárquicos como ecossistemas, comunidades, espécies, populações e genes de uma área
definida (DOBSON, 1998).
A biodiversidade e seus componentes podem fornecer uma ampla gama de produtos de
importância econômica tanto para a indústria alimentícia quanto para a farmacêutica. Dentre
eles, o reino vegetal é o que tem contribuído de forma mais significativa principalmente para
a indústria farmacêutica, destacando-se assim os fitoterápicos e os fitofármacos, originados
dos recursos genéticos vegetais. Fitoterápicos são aqueles medicamentos preparados
exclusivamente à base de plantas medicinais. Fitofármacos são substâncias extraídas de
plantas, que apresentam atividades farmacológicas, podendo ter aplicações terapêuticas
(SIMÕES et al., 2010).
Neste sentido, é sabido que o Brasil é o país com a maior diversidade genética vegetal,
hospeda entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial, sendo considerado o maior do
planeta em número de espécies endêmicas. Essa riqueza biológica nacional manifesta-se
também na diversidade entre os ecossistemas presentes, sendo eles, amazônia, cerrado, mata
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 27
atlântica, caatinga, pantanal e pampa (GANEM, 2010). Essa biodiversidade associada a uma
rica diversidade étnica e cultural detém um valioso conhecimento tradicional associado ao uso
de plantas medicinais, além do potencial necessário para desenvolvimento de pesquisas com
resultados em tecnologias e terapêuticas apropriadas (BRASIL, 2006).
A escolha da planta para uso e avaliação do seu potencial químico e farmacológico na
maioria das vezes é baseada em seu uso na medicina popular, porém, a falta de conhecimento
sobre a forma de uso pode vir a trazer sérios riscos à saúde do homem.
O estudo farmacológico das drogas vegetais, além de constituir-se um campo quase
inesgotável de novos conhecimentos científicos, pode contribuir notavelmente para o
aprimoramento da medicina tradicional (SIXEL; PENICALLI, 2005). Vale ressaltar que a
idéia essencial na indicação do uso de fitoterápicos na medicina humana não é de substituir os
medicamentos já comercializados, mas sim aumentar as opções terapêuticas tanto para
profissionais de saúde, ofertando medicamentos equivalentes, quanto para a população,
ofertando uma terapia de custo mais acessível (SIMÕES et al., 2010).
3.2 Considerações sobre a família Erythroxylaceae e o gênero Erythroxylum
A família Erythroxylaceae compreende 4 gêneros e cerca de 240 espécies apresentando
distribuição pantropical, tendo como seus principais centros de diversidade e endemismo no
Brasil, Madagascar e Venezuela. A maioria das espécies pertence ao gênero Erythroxylum P.
Browne, de distribuição ampla e encontrado nos quatro continentes, principalmente na
américa tropical. Os outros gêneros, Aneulophus Benth., Nectaropetalum Engl. e
Pinacopodium Exell & Mendonça, possuem poucas espécies com distribuição exclusiva na
áfrica (LOIOLA et al., 2007).
O gênero Erythroxylum, com cerca de 230 espécies, é o único representado na região
neotropical, onde aproximadamente 187 espécies são exclusivas, tendo como principal centro
de diversidade e endemismo a américa do sul, principalmente no Brasil e Venezuela
(PLOWMAN; HENSOLD, 2004). É um grupo de grande versatilidade ecológica, com
espécies encontradas em ambientes úmidos como a floresta amazônica e a floresta atlântica, e
nas regiões semiáridas, ocorrendo em diferentes níveis de elevações, desde o nível do mar até
hábitats montanhosos (LOIOLA et al., 2007).
Esse gênero caracteriza-se pela presença de plantas lenhosas, arbustos ou árvores,
glabras, com catafilos geralmente semelhantes às estípulas. As folhas são alternas e inteiras,
com estípulas intrapeciolares. As flores são monoclinas, diclamídeas, pentâmeras e
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 28
heterostílicas, com 10 estames de filetes unidos na base, formando um tubo que circunda o
pistilo. O ovário é súpero, tricarpelar, trilocular, mas geralmente com apenas um óvulo
desenvolvido. O fruto é uma drupa com coloração de vermelha a púrpura (LOIOLA et al.,
2007).
No Brasil são encontradas cerca de 114 espécies das 187 pertencentes ao gênero
Erythroxylum registradas para a américa tropical. Destas, aproximadamente 74 possuem
distribuição restrita ao Brasil, correspondendo a cerca de 40% das espécies da região
neotropical, ocorrendo em áreas como, por exemplo, na amazônia, floresta atlântica, no
cerrado e caatinga (PLOWMAN; HENSOLD, 2004), entre elas E. caatingae, E.
subrotundum, E. catuaba, E. vacciniifolium e E. subracemosum, sendo as três últimas muito
utilizadas na medicina popular (ZANOLARI et al., 2003 a, b).
Diversas espécies têm sido investigadas quanto à atividade farmacológica, a exemplo de
E. vacciniifolium, que apresentou efeito contra infecções oportunas em pacientes com HIV e
forneceu alcalóides tropânicos da série catuabina (A, B e C) (ZANOLARI et al., 2003 a),
E. pervillei apresentando alcalóides pervilleinas A e B, que inibiram o crescimento de
carcinoma de pele em células KB-VI. Alcalóides extraídos de E. rotundifolium também
apresentaram a mesma atividade antitumoral (CHÁVEZ et al., 2002). E. moonii apresentou
atividade antimicrobiana frente a cepas de bactérias, fungos e leveduras, fornecendo os
alcalóides tropânicos mooniina A e B (RAHMAN, 1998).
Em regiões específicas do nordeste brasileiro já foram registradas mais de 12 espécies,
como: E. caatingae Plowman, E. citrifolium A. St.-Hil, E. nummularia Peyr., E. pauferrense
Plowman, E. passerinum Mart., E. pulchrum A. St.-Hil., E. pungens O. E. Schulz, E.
revolutum Mart., E. simonis Plowman, E. suberosum var denudatum O. E. Schulz, E.
subrotundum A. St.-Hil. e E. squamatum Sw., encontradas nas mais diversas formações
(LOIOLA et al., 2007).
Dentro da família Erythroxylaceae o gênero Erythroxylum é o mais estudado, por
apresentar alcalóides tropânicos e pirrolidínicos, taninos, terpenos e fenilpropanóides
principalmente em suas folhas e frutos (ZUANAZZI et al., 2001), além disso, em espécies
coletadas no estado da Bahia, observou-se a presença de ácidos graxos esterificados e
triterpenos (CHÁVEZ et al., 1996). Os alcalóides tropânicos são uma grande classe de
produtos naturais devido aos seus efeitos analgésico, anticolinérgico, antiemético e
antihipertensivo (KHATTAK et al., 2002).
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 29
3.3 Considerações sobre a espécie Erythroxylum caatingae Plowman.
A árvore pode chegar até 3 m altura. Possui distribuição restrita ao nordeste do Brasil,
sendo registrada para os estados da Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco e Rio Grande do Norte
(Figura 1 e 2) (PLOWMAN; HENSOLD, 2004).
Figura 1 – Foto de partes das folhas e flor de Erythroxylum caatingae Plowman
Fonte: J.A. SIQUEIRA-FILHO.
Até o momento não há relatos do uso de Erythroxylum caatingae na medicina popular,
porém, estudos vêm sendo realizados com essa espécie em busca de identificar possíveis
ações terapêuticas de seus extratos. O estudo realizado Santos et al. (2013) investigou a ação
do extrato etanólico obtido das partes aéreas das espécies E. caatingae, E. subrotundum e E.
revolutum em músculo liso isolado de traquéia de cobaia. Aguiar et al. (2012) mostrou que o
extrato metanólico do caule de E. caatingae e todas as frações testadas, com exceção da
fração hexânica, apresentou atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e
fungos. Outro estudo realizado por Oliveira et al. (2011) avaliou as atividades citotóxicas do
extrato metanólico do caule de E. caatingae frente a uma linhagem de células de cancro
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 30
humanas (HEp-2, NCI-H292 e KB), bem como o efeito antitumoral do extrato metanólico
frente a células tumorais de sarcoma 180, em ratos.
Figura 2 – Foto das folhas e fruto de Erythroxylum caatingae Plowman
Fonte: J. G. CARVALHO-SOBRINHO.
A
B
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 31
3.4 Fisiologia do útero e do músculo liso uterino
3.4.1 O útero
3.4.1.1 O útero humano
O útero humano é um órgão muscular piriforme de paredes espessas e musculares,
normalmente situado entre a bexiga urinária e o reto. Mede cerca de 7,5 cm de comprimento e
5 cm de largura, porém, no período gestacional, ele se adapta em tamanho e estrutura às
necessidades de crescimento do feto (JACOB; FRANCONE; LOSSOW, 1990; GRAY;
WILLIAMS, 1995) e está dividido morfologicamente em três seções, a saber, o colo do útero,
o istmo e o corpo uterino (Figura 3).
Figura 3 – Anatomia do útero humano
Fonte: http://ticsnaescola.zip.net
O útero é um dos principais órgãos do sistema reprodutor feminino. É o local de
recepção, implantação e nutrição do óvulo, quando fecundado por um espermatozoide, e de
desenvolvimento do feto durante o período da gestação (SNELL, 1999).
O útero humano é composto de camadas longitudinal e circular de músculo liso,
organizadas perpendicularmente umas as outras. As fibras musculares são arranjadas em
forma de folhetos ou feixes com membranas celulares aderidas entre si em múltiplos pontos
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 32
de modo que a força gerada em uma fibra muscular pode ser transmitida à seguinte. A camada
longitudinal externa consiste de uma rede de feixes de células musculares lisas orientadas no
eixo longitudinal do órgão e a camada circular interna, na qual as fibras estão dispostas
concentricamente em torno do eixo longitudinal do órgão. A contração da camada
longitudinal faz com que o órgão dilate-se e encurte-se, ao passo que a contração da camada
circular faz com que o órgão alongue-se, resultando em redução do diâmetro e do
comprimento (PAYTON; BRUCKER, 1999; WEBB, 2003; YOUNG, 2007; GUYTON;
HALL, 2011).
A parede uterina é formada por três camadas distintas (Figura 4). A camada mais
externa chamada de perimétrio é responsável pelo revestimento epitelial do órgão. O
miométrio é a camada muscular intermediária e mais espessa, consiste em feixes entrelaçados
de fibras musculares lisas envoltas em tecido conjuntivo organizado em camadas indefinidas
onde forças contráteis podem ocorrer em qualquer direção permitindo que o útero possa
assumir praticamente qualquer forma. Durante a gravidez, o crescimento e alongamento dessa
camada fornece o ambiente protetor para o feto em desenvolvimento e em seguida, com o
início do trabalho contrai ritmicamente para expelir o feto e a placenta. O endométrio é a
camada mais interna formada por um revestimento epitelial e um tecido conjuntivo chamado
de estroma endometrial (JACOB; FRANCONE; LOSSOW, 1990; GRUBER; O’BRIEN,
2011).
Figura 4 – Camadas uterinas
Fonte: adaptada de https://www.lookfordiagnosis.com
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 33
3.4.1.2 O útero de ratas
O sistema reprodutor das ratas é formado pela vagina, um par de ovários e um conjunto
de ductos sexuais (oviduto, cornos uterinos, corpo uterino), nos quais ocorre o transporte dos
oócitos, o desenvolvimento dos embriões em caso de fertilização e a saída dos fetos por
ocasião do parto (Figura 5) (ANDERSEN et al., 2004).
O útero dos roedores consiste em tubos pares que se abrem separadamente na vagina, e
é denominado útero duplo ou duplex. Nas ratas de laboratório (Rattus norvegicus) o útero é
duplo, contínuo possuem dois canais cervicais distintos e a vagina simples (MARTINS et al.,
2011) e há uma importante camada muscular longitudinal em cada corno uterino, a qual se
torna transversa caudalmente na junção dos dois cornos uterinos (COOPER; SCHILLER,
1975 apud MARTINS, 2009). Nos mamíferos, o útero compreende uma camada miometrial
externa e uma camada interna denominada endométrio que se encontra imediatamente
adjacente ao miométrio (Figura 6). Em espécies não primatas, o miométrio é constituído por
duas camadas distintas, uma camada longitudinal exterior e uma camada interna circular com
origem, estrutura, função e padrões de contração diferentes. Em animais com um útero
bipartido, por exemplo, na rata, o músculo circular interior e longitudinal exterior são mais
facilmente separados do que em útero humano (VEALE; OLIVER; HAVLIK, 2000;
AGUILAR; MITCHELL, 2010).
Figura 5 – Útero de rata
Fonte: http://www.efdeportes.com/efd142/exercicio-fisico-na-prevencao-01.jpg
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Figura 6 – Anatomia do útero de rata
Fonte: adaptado de:
http://professor.ucg.br/SiteDocente/admin/arquivosUpload/4400/material/Reprodutor%20A.pdf
3.5 Considerações sobre a contração e o relaxamento da musculatura lisa
A regulação da contração do músculo liso apresenta um papel importante em muitos
processos fisiopatológicos. Alterações nesses processos podem contribuir para o
desencadeamento de eventos contráteis anormais em células musculares lisas de vários órgãos
importantes como vasos sanguíneos, estômago, intestinos, bexiga, útero, vias respiratórias,
entre outros (WEBB, 2003).
A contração do músculo liso uterino em especial possui um papel crítico na regulação e
no controle da atividade contrátil do miométrio (WORD, 1995; WRAY et al., 2001;
SHMYGOL, WRAY, 2004), sendo que muitos problemas como abortos, partos prematuros,
hemorragias pós-parto e cólicas uterinas estão associados a uma regulação anormal da
contratilidade desse músculo (WRAY et al., 2001; SHMYGOL; WRAY, 2004; LIMA et al.,
2005).
Fisiologicamente, o espasmo, isto é, a contração, muito comum neste tipo de músculo, é
conduzida principalmente pelo desenvolvimento de potenciais de ação através da membrana
plasmática, ou potenciais de membrana (Vm), resultante de um aumento transitório da
concentração do cálcio (Ca2+
) citosólico livre. Esse mecanismo pode ser desencadeado, tanto
pela liberação dos estoques de cálcio intracelulares (Ca2+
i), provenientes principalmente do
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 35
retículo sarcoplasmático (RS) muito importante nesse tipo de músculo, quanto pela sua
entrada através de canais para Ca2+
na membrana plasmática (SOMLYO; SOMLYO, 1994;
RANG et al., 2007; GRUBER; O’BRIEN, 2011).
O Ca2+
desempenha um papel fundamental na sinalização celular. A sua concentração
no meio celular se altera em resposta a uma variedade de sinais, que diferem em sua origem
(extracelular ou intracelular), natureza química, mecânica ou elétrica (BRINI, 2003).
A excitabilidade das células do músculo liso, incluindo os miócitos uterinos, depende
também do movimento de outros íons além do Ca2+
, como por exemplo, o sódio (Na+) o
potássio (K+), pelo fato de que muitos processos necessitam de uma transmissão rápida e
precisa de informações entre suas células e tecidos (RIBEIRO, 2007). Nesse sentido, a
participação de outros canais iônicos desempenha papel crucial para essa rápida transmissão
de informações traduzindo os sinais na forma de mudanças no Vm, compreendendo dois
processos: a despolarização e a hiperpolarização da membrana (YU; CATTERALL, 2004).
Estes sinais elétricos resultam, na sua maioria, em oscilações na concentração de Ca2+
i, dessa
forma, promovendo o controle de inúmeros processos fisiológicos, como: secreção hormonal,
transmissão e processamento de informações pelo sistema nervoso central, sensações
somáticas e a própria contração muscular. Todos esses processos são mediados, pelo menos
em parte, por membros da superfamília de canais controlados por voltagem, dentre eles,
canais para K+ abertos por voltagem (Kv), canais para K
+ retificadores de entrada (Kir) e
canais para K+ de dois poros (K2P), canais para K
+ de grande condutância ativados por Ca
2+
(BKca), canais para Na+ abertos por voltagem (Nav), canais ativados por hiperpolarização e
nucleotídeos cíclicos (HCN), canais receptores de potencial transiente (TRP), canais de
potencial transiente (TPC), e canais para Ca2+
abertos por voltagem (Cav) (YU;
CATTERALL, 2004; WRAY; SHMYGOL, 2007; AGUILAR; MITCHELL, 2010).
A importância desses canais iônicos está relacionada ao fato de que a abertura/ativação
de alguns canais que levam ao processo de despolarização da membrana celular tende a ativar
principalmente os Cav e assim permitir a entrada de Ca2+
, de tal forma aumentando a
concentração de Ca2+
i, o que leva a ativação da maquinaria contrátil, enquanto o
abertura/ativação de outros canais que causam o processo de repolarização/hiperpolarização
na membrana celular tende a inativar os Cav, reduzindo assim a concentração de Ca2+
i
(SOMLYO; SOMLYO, 1994; 2003).
Como discutido, o aumento da concentração de Ca2+
i é um fator chave para muitas
respostas celulares dependentes da ligação a íons Ca2+
e para um vasto número de moléculas
efetoras, tais como algumas enzimas, proteínas contráteis e canais iônicos presentes na
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 36
membrana. Enquanto o retículo sarcoplasmático representa a principal fonte de Ca2+
i, onde a
liberação de Ca2+
desta organela é decorrente principalmente da ativação de receptores de
1,4,5-trisfosfato de inositol (IP3R) e também de receptores de rianodina (RyR), a fonte de
Ca2+
extracelular é o líquido intersticial, onde o influxo de Ca2+
se deve à presença de canais
para esse íon na membrana plasmática (SOMLYO et al., 2004).
Assim, a contração se deve a ativação dos mecanismos contráteis que, sobretudo, são
ativados pelo aumento da concentração de Ca2+
i, e o relaxamento do músculo liso se dá pelo
retorno dos níveis de Ca2+
livre no citosol aos níveis basais (SOMLYO; SOMLYO, 1994).
Contudo, para que o relaxamento muscular ocorra é preciso ter havido um processo de
contração anterior e esse mecanismo que proporciona o aumento da concentração de Ca2+
i
levando à contração da musculatura lisa pode ocorrer, basicamente, por dois mecanismos, o
eletromecânico, que causa a despolarização levando a uma mudança no Vm, onde ocorre
influxo de Ca2+
por meio dos Cav, ou o fármacomecânico, onde a contração pode ser
promovida pela ligação de um agonista com o receptor e apresentar-se maior que a observada
apenas com a mudança de Vm (REMBOLD, 1996; SOMLYO; SOMLYO, 2003; RANG et al,
2007) e em alguns casos, os agonistas também podem inibir a bomba de extrusão de Ca2+
(VAN BREEMEN; SAIDA, 1989).
O mecanismo eletromecânico para a contração do músculo liso é originado a partir da
despolarização ou mudança de Vm induzida inicialmente por estimulação elétrica
(HERMSMEYER; STUREK; RUSCH, 1988, apud DEOCLECIANO JUNIOR, 2008) ou pelo
aumento na concentração extracelular de K+ que leva ao aumento do influxo de Ca
2+ por meio
de canais específicos para Ca2+
, em especial os Cav. O aumento da concentração de Ca2+
i
favorece a ligação do Ca2+
à calmodulina (CaM) e o complexo originado dessa junção, cálcio-
calmodulina ([(Ca2+
)4-CaM]), ativa a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK) para
fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC) e promover a interação da actina com a miosina,
levando a contração (REMBOLD, 1996; WRAY et al., 2001; NOBLE et al., 2009).
Os Cav que predominantemente apresentam-se na musculatura uterina são os canais
para Ca2+
tipo L, canais de grande condutância operados por voltagem, que são ativados à
medida que o Vm altera desencadeando todo o processo citado anteriormente. Além desse, o
miométrio ainda possui outros tipos de Cav, incluindo nesse grupo os canais para Ca2+
tipo T
que aparentam ter uma maior capacidade de condutância do que os do tipo L, sugerindo que
esse tipo de canal desempenha um papel importante na propagação de potenciais de ação,
além disso, eles apresentam uma cinética mais rápida talvez por serem ativados em tensões
mais baixas do que os canais para Ca2+
tipo L, o que pode ajudar a elevar o potencial para o
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 37
limiar necessário para a ativação dos canais para Ca2+
tipo L e consequentemente desencadear
o processo contrátil (WRAY et al., 2001; NOBLE et al., 2009; AGUILAR; MITCHELL,
2010).
O processo de contração fármacomecânico ocorre através da ligação do agonista a
receptores acoplados à proteína G (GPCRs) em especial àqueles acoplados às proteínas Gq ou
G11 e, por meio da subunidade α, promovem a ativação da fosfolipase C (PLC) que, por sua
vez, hidrolisa fosfolipídios específicos na membrana, como o 4,5 bisfosfato de
fosfatidilinositol (PIP2) que produz como segundo mensageiro importante o 1,4,5-trisfosfato
de inositol (IP3), e o diacilglicerol (DAG) (OGUT; BROZOVICH, 2003; RANG et al., 2007).
A partir dessa hidrólise, o IP3 formado liga-se ao seu receptor no retículo sarcoplasmático,
IP3R, permitindo a liberação de Ca2+
i, a presença do íon no meio externo do RS desencadeia o
processo de liberação de mais Ca2+
pelo próprio Ca2+
(CICR) por meio da ativação dos RyR
que também estão presentes na membrana do RS promovendo a liberação de mais Ca2+
i
(WRAY et al., 2001; AGUILAR; MITCHELL, 2010), permitindo a formação do
[(Ca2+
)4-CaM], responsável pelo início do mecanismo contrátil. A ligação do agonista ao seu
receptor também aumenta o influxo de Ca2+
através da abertura de canais para Ca2+
do tipo L
promovida pelo DAG, que por sua vez fosforila a proteína cinase C (PKC) ativando um
mecanismo que não implica na alteração no Vm (WEBB, 2003; WILLETS et al., 2009).
Agonistas indutores de contração, por exemplo, ocitocina, acetilcolina, carbacol, entre outros,
medeiam à contração do músculo liso por meio desse processo descrito anteriormente.
Nas células do músculo liso miometrial, como em outros tipos de células, os agonistas
exercem a sua ação através da ativação dos receptores que promovem a liberação de Ca2+
via
mensageiros secundários intracelulares. O útero possui ambos os receptores, IP3R e RyR,
porém, são fisiologicamente mais importantes para a sua função os IP3R que promovem o
aumento da concentração de Ca2+
i desencadeando a resposta fisiológica (WRAY;
SHMYGOL, 2007).
Independente dos processos iniciais para a contração serem de origem eletromecânica
ou fármacomecânica, ambos consistem em um aumento da concentração de Ca2+
i que
favorece a formação [(Ca2+
)4-CaM] e este complexo por sua vez ativa a MLCK para fosforilar
a MLC promovendo a interação das pontes cruzadas e o deslizamento entre os filamentos de
actina e miosina, levando a contração (SOMLYO; SOMLYO, 1994; 2003).
No entanto, a elevação da concentração de Ca2+
i é transitória e dependente do estado de
fosforilação da MLC, que é regulada principalmente pelo [(Ca2+
)4-CaM] e nem sempre é
paralela a fosforilação da MLC ou ao grau de ativação contrátil. Em alguns casos,
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 38
particularmente após a estimulação com um agonista endógeno, um aumento na concentração
de Ca2+
i pode proporcionar uma força de contração maior do que a esperada, sendo este
processo conhecido como sensibilização de Ca2+
(FUKATA; AMANO; KAIBUCHI, 2001;
AGUILAR; MITCHELL, 2010). Este mecanismo sensibilizador de Ca2+
envolve a ativação
da RhoA, uma proteína de ligação ao trifosfato de guanosina (GTP) que inibe a atividade da
fosfatase da MLC pela Rho-quinase (Rho-K) (WEBB, 2003; SOMLYO; SOMLYO, 2000).
Isto promove um aumento no tempo do estado contrátil, uma vez que ocorre a diminuição na
atividade da fosfatase da MLC (SANDERSON et al., 2008).
É certo que os canais para Ca2+
, sejam eles do tipo L, tipo T, Cav, entre outros,
participam do processo de contração do músculo liso, e para que o relaxamento possa ocorrer
o aumento do Ca2+
i deve ser reduzido à níveis de repouso. Este mecanismo pode ser
desencadeado pelo transporte para fora da célula e reabsorção do Ca2+
i pelo RS (WRAY et al.,
2001).
Assim, estabelecida a contração, o relaxamento é o passo seguinte no processo. Esse
mecanismo, assim como a contração, pode acontecer por meio de processos semelhantes que
resultam, ao contrário de todo o processo descrito anteriormente, na diminuição da
concentração do Ca2+
i. De grande importância para tal fenômeno é o movimento dos íons K+,
através de canais presentes na membrana plasmática, contribuindo para a regulação do influxo
de Ca2+
através dos Cav (THORNELOE; NELSON, 2005).
Os canais para K+ desempenham um papel chave na regulação do Vm e na
excitabilidade celular, o qual depende do balanço entre o aumento da condutância ao K+,
levando a uma hiperpolarização, e a diminuição da condutância ao K+, levando a uma
despolarização. O retorno ao nível basal da célula lisa se dá pela remoção dos estímulos
contráteis (agonistas ou despolarização) o que promove a hiperpolarização, resultando na
redução da excitabilidade da membrana, ocorrendo o fechamento dos canais de Cav e, em
seguida o relaxamento muscular (WRAY et al., 2003).
O mecanismo eletromecânico que leva ao relaxamento muscular ocorre devido à
repolarização da membrana, ao contrário do que provoca a despolarização, que pode ocorrer
em função da liberação em especial do fator relaxante derivado do endotélio (óxido nítrico -
NO). Este fator ativa diretamente a ciclase de guanilil (GC) solúvel ou, no caso dos agonistas
que induzem relaxamento, a ligação aos seus receptores ativa diretamente uma GC ou ciclase
de adenilil (AC), resultando na formação do monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) e
monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), respectivamente. O aumento na concentração de
GMPc ativa a proteína cinase dependente de GMPC (PKG), enquanto que o aumento na
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 39
concentração de AMPc ativa tanto uma proteína cinase dependente de AMPc (PKA) como a
PKG, que resultam na ativação de canais de K+ (REMBOLD, 1996).
Os mecanismos que podem resultar em relaxamento e que estão diretamente
relacionados com o acoplamento fármacomecânico incluem a fosforilação de proteínas-alvo
via PKG ou PKA de vários substratos, podendo promover: (1) o aumento na atividade da
Ca2+
-ATPase tanto do RS, como da membrana plasmática, promovendo aumento do sequestro
e o efluxo de Ca2+
, respectivamente, reduzindo a concentração de Ca2+
i; (2) a inativação dos
IP3R e redução da sua capacidade de liberar Ca2+
do RS; (3) a diminuição da formação do
IP3R e, consequentemente, redução da liberação de Ca2+
do RS; (4) a inibição da MLCK,
reduzindo sua afinidade pelo complexo [(Ca2+
)4-CaM], e a fosforilação de teloquina, que
promove a ativação da MLCK, ambos os processos causando uma redução nos níveis de
MLC fosforilada e da própria contração; (5) a inibição dos CaV, promovendo uma redução da
concentração de Ca2+
i por diminuição do influxo de Ca2+
; (6) a ativação de canais para K+
que, indiretamente, por repolarização ou hiperpolarização causam a desativação dos CaV
(WOODRUM; BROPHY, 2001; DUTTA et al., 2002; DANILA; HAMILTON, 2004).
Quando se pesquisa especificamente a atividade uterina, sabe-se que o Vm é ajustado
pela variação da condutância do íon K+ pela membrana, pelo fato desse órgão ser composto
de músculo liso, e essa musculatura lisa uterina tem um padrão de manutenção da atividade
contrátil apresentando um período de descanso com discretas contrações intermitentes com
variação de frequência, amplitude e duração dependendo da fase em que se encontra
(AGUILAR; MITCHELL, 2010). A origem do impulso elétrico que inicia uma contração no
miométrio e a regulamentação da sua direção de propagação são objetos de estudos
constantes. A passagem direta de excitação elétrica de uma célula para outra é o mecanismo-
chave através do qual a excitação se espalha por todo o músculo (MIYOSHI et al., 1998).
Como citado anteriormente, o estado da contratilidade é regulado predominantemente
pela concentração de Ca2+
i e essa regulação apresenta-se em três fases: manutenção de
concentrações basais, que desempenham um papel importante durante o período de repouso
do músculo liso, o aumento acentuado na concentração de Ca2+
i que ocorre tanto com a
estimulação agonista quanto com a mudança do Vm e a restauração da concentração de Ca2+
i
ao estado de repouso após a estimulação que, no geral, esses processos são controlados por
canais iônicos. Além disso, a entrada de Ca2+
, pelo menos em útero de rata, ocorre quase
exclusivamente através dos canais para Ca2+
do tipo L e em miométrio humano tem sido
sugerido que pode haver alguma atividade dos canais para Ca2+
do tipo T, além dos canais do
tipo L (AGUILAR; MITCHELL, 2010).
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 40
Existem muitos mecanismos envolvidos na regulação da contratilidade uterina
principalmente quando se investiga a conversão da contratilidade do miométrio,
especialmente durante a gravidez, do estado de quietude para um estado ativo e reativo
durante o parto. É uma condição que exige vários fatores associados e esse conjunto pode ser
resultado de uma complexa interação de sistemas e eventos (GARFIELD et al., 1995). Young
(2007); Garfield et al.(1995); Sakai et al.(1995) apresentam como um sistema que aparenta ser
de grande importância na regulação da contratilidade uterina durante a gravidez, constituído
por vias de condução célula-célula denominadas "junções-gap", que, quando presentes,
aumentam a excitação do miométrio. Muitos estudos têm demonstrado que a formação e a
presença dessas junções entre as células miometriais são considerados os principais locais
para a regulação da contratilidade uterina e, em muitas espécies, as “junções-gap” aumentam
antes do parto fornecendo assim caminhos intercelulares que permitem a sincronização da
atividade elétrica e metabólica e sendo assim, acredita-se que a ausência ou encerramento
destes contatos especializados favorece a inatividade, ou seja, a manutenção da quiescência
durante gravidez.
A atividade uterina pode ser modulada também por diversos receptores acoplados à
proteína G (GPCRs). Por exemplo, os receptores acoplados a Gαq como os receptores de
ocitocina (OTR), prostanóides FP e TP, receptores da endotelina que estimulam a
contratilidade ativando a PKC via presença de Ca2+
e os receptores acoplados a Gαs,
β2-adrenérgicos, prostanóides EP2 e IP, alguns receptores de 5-hidroxitriptamina (5-HT) que
podem estar participando do processo de relaxamento uterino através do aumento dos níveis
de AMP cíclico do miométrio. Além desse, os receptores acoplados a Gαi, os
alfa-2-adrenérgicos, muscarínicos, receptores de serotonina (5-HT1) podem potencializar a
contratilidade, provavelmente por inibir a produção de AMPc (BERNAL, 2003).
Assim como ocorre no músculo liso, a excitabilidade dos miócitos uterinos também está
relacionada com o movimento de íons como Na+, Ca
2+ e cloreto (Cl
-) no compartimento
citosólico a partir do espaço extracelular, e de K+ na direção oposta, esse último constitui o
principal fator para o estabelecimento do Vm. No útero, há diferentes tipos de canais para K+
e algumas isoformas desse tipo de canal incluindo os voltagem-dependentes, dependentes de
Ca2+
e os que são modulados pelo ATP, apresentam mudança de distribuição e expressão com
o início da gestação e no seu término. Estas alterações de expressão desses canais podem
influenciar no controle da contratilidade uterina além de que, todos estes tipos de canais para
K+ foram detectados no miométrio humano, porém quais canais desempenham papéis
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 41
predominantes e como interagem entre si ainda não foi correlacionado (WRAY et al., 2001;
WRAY et al., 2003; AGUILAR; MITCHELL, 2010).
3.6 Patologias associadas à motilidade uterina anormal
O útero é um órgão único em muitos aspectos e é funcional para apenas uma pequena
porção da vida de uma mulher, a principal função a que se destina é a de preservação da
espécie. É sensível ao meio ambiente local e muda de função em resposta a estímulos
endócrinos. Contudo, a verdadeira singularidade do útero está nas alterações funcionais
sequenciais que esse órgão desempenha e que são necessárias para a conclusão de uma
gravidez normal (YOUNG, 2007).
O início da atividade contrátil do útero ainda é alvo de estudos aprofundados por
possuir caráter complexo em relação à identificação dos fatores desencadeantes. Um grande
número de mulheres são acometidas por patologias associadas às contrações uterinas e essas
desempenham um papel importante em muitas e variadas funções reprodutivas, incluindo
transporte de esperma e embriões, implantação, menstruação, gestação e parto. A
contratilidade anormal pode estar por trás de doenças comuns e importantes, tais como
infertilidade, falhas de implantação, dismenorréias, endometriose, aborto, parto prematuro
espontâneo (AGUILAR; MITCHELL, 2010) ou ainda associados a condições como distocias,
que são classificadas como dificuldades no trabalho de parto caracterizado pelo progresso
anormalmente lento que pode ocorrer por diversos fatores, dentre eles: anormalidades nas
contrações uterinas apresentando-se como contrações inadequadas ou contrações
descoordenadas (LEVENO, 2007); e a hemorragia pós-parto que é uma das complicações
mais temida em obstetrícia e uma das três causas mais comuns de morbidade e mortalidade
materna (WHO, 2007).
Dismenorréias
As dismenorréias ou menstruações dolorosas são condições específicas do ciclo
menstrual feminino que pode ser de origem patológica, tais como tumores fibróides do útero,
endometriose, doença pélvica inflamatória ou considerada como dismenorréia primária por
ser provocada por causas não óbvias. Cerca de 30% a 50% das mulheres apresentam
dismenorréia primária que tende a diminuir com a idade e após a gestação (JACOB;
FRANCONE; LOSSOW, 1990; LIMA, 2004). A causa da dismenorréia primária acredita-se
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 42
ser devido ao aumento da produção endometrial de prostaglandinas (PGEs) que resulta a
partir da diminuição dos níveis de progesterona no final da fase lútea promovendo ação
enzimática com liberação de fosfolipídios, produção do ácido araquidônico e ativação da via
da ciclooxigenase (COX) (NOVAK; BEREK, 2005).
Aborto
O aborto, seja ele inevitável incompleto ou completo, é considerado quando ocorre
eliminação do tecido da gravidez antes da 20ª semana de gestação, sendo assim tipicamente
apresentados no primeiro trimestre da gravidez e acometem cerca de 15% a 20% das
mulheres, sendo em sua maioria abortos espontâneos causados por problemas cromossômicos
que impossibilitam o desenvolvimento fetal ou por complicações trombóticas (NOVAK;
BEREK, 2005). Também pode ser provocado por uso de substâncias que promovem o
aumento na contratilidade uterina. O aborto é um método muito antigo de controle de
natalidade, praticado em todas as civilizações e que em diversos países é uma prática
reconhecida, contudo é proibido em quase toda a américa latina, o que não impede a prática
no Brasil, com número próximo a meio milhão por ano tendo como recursos mais comumente
utilizados os chás e infusões de plantas medicinais (RODRIGUES et al., 2011).
Trabalho de parto prematuro
O trabalho de parto prematuro é aquele que ocorre depois da 20ª e antes da 38ª semana
de gestação, considerado uma importante causa de doença e mortalidade neonatal. Ocorrem
em cerca de 8% a 10% das gestações e possui causa desconhecida, porém há indícios de que
alterações emocionais fortes podem desencadear o processo (LIMA, 2004). A prematuridade
é responsável por 75% a 95% dos óbitos neonatais, quando excluídas as malformações
congênitas, e 50% das anormalidades neurológicas. Recém-nascidos prematuros têm um risco
40 vezes maior de óbito neonatal quando comparados com os recém-nascidos a termo
(DÓRIA; SPAUTZ, 2011).
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 43
Hemorragia pós-parto
A hemorragia pós-parto é caracterizada por uma perda de sangue estimada de mais de
500 mL após parto vaginal ou maior que 1000 mL após cesariana durante as primeiras
24 horas pós-parto e, dentre as principais causas de hemorragia pós-parto, a atonia uterina, ou
seja, o fracasso do útero em contrair totalmente após a saída da placenta continua a ser a de
maior incidência (MUÑOZ et al., 2012). A hemorragia pós-parto é apresentada como
imediata (primária) e tardia (secundário). A hemorragia pós-parto primária ocorre dentro das
primeiras 24 horas após o parto, enquanto a hemorragia pós-parto secundária ocorre entre
24 horas e 6 semanas após o parto (CHELMOW, 2011). A OMS relata que a hemorragia
obstétrica é responsável por cerca de 127 mil mortes por ano em todo o mundo e é a principal
causa mundial de mortalidade materna.
Os casos citados acima estão diretamente relacionados às atividades anormais da
musculatura uterina. Sabe-se que a atividade muscular uterina é independente da inervação
extrínseca, e essa atividade contraturante pode ser desencadeada por diversos mecanismos
como os citados anteriormente, no entanto, são considerados também como fatores
importantes nesses processos a influência hormonal, dentre elas a ação do estrógeno,
progesterona, prostaglandinas, ocitocina, entre outros (SNELL, 1999; JACOB; FRANCONE;
LOSSOW, 1990; LIMA, 2004). Nesse aspecto, agentes que promovam contrações ou que as
iniba tem seu valor significativo quando destinado ao tratamento específico nas diversas fases
das contrações miometriais.
Alterações associadas à anormalidade da motilidade uterina variam relativamente entre
gravidades menores e as que levam ao risco de morte (BRODY; MINNEMAN; WECKER,
2006). O foco para a terapia farmacológica é escolhido de acordo com a necessidade
primordial apresentada. Os fármacos utilizados na terapêutica para tratar as complicações
decorrentes das contrações uterinas anormais podem ser classificados funcionalmente como:
drogas que promovem a contração uterina utilizadas para a indução e aumento do trabalho de
parto, para tratar a hemorragia pós-parto e atonia uterina denominadas de drogas uterotônicas
ou espasmogênicas; enquanto que as drogas que promovem a latência uterina ou relaxamento,
inibe as contrações uterinas para impedir o trabalho de parto prematuro e diminui as
contrações miometriais que provocam as cólicas uterinas, são denominadas como drogas
tocolíticas ou espasmolíticas (PAYTON; BRUCKER, 1999; MOHAN; BENNETT, 2006).
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 44
3.7 Fármacos uterotônicos e tocolíticos
3.7.1 Fármacos uterotônicos
Agentes uterotônicos são definidos como fármacos que produzem contração uterina e
estes fármacos podem ser utilizados na terapêutica ou profilaxia de distúrbios uterinos.
Existem três principais usos clínicos para os estimulantes uterinos: induzir aborto terapêutico,
induzir ou aumentar as contrações durante o parto e diminuir a perda sanguínea após
eliminação da placenta a fim de prevenir ou interromper a hemorragia pós-parto (LIMA,
2004; BRODY; MINNEMAN; WECKER, 2006).
De acordo com a literatura existem diversos agentes uterotônico, além de efetores
intracelulares que são conhecidos por serem cruciais para desencadear uma contração
eficiente no músculo liso uterino como os agonistas dos receptores muscarínicos, a ocitocina,
bem como o seu análogo, a carbetocina, as prostaglandinas das famílias E (PGE2) ou F
(PGF2α) além dos seus análogos, alcalóides do ergot como a ergometrina e a metilergonovina
(methergine) e antagonistas dos receptores de progesterona, dos quais a mifepristona é a mais
amplamente utilizada e alguns desses são medicamentos específicos ou grupos de
medicamentos utilizados clinicamente para estimular a contratilidade uterina (DITTRICH et
al., 2009; MUÑOZ et al., 2012).
Ocitocina
A ocitocina é o mais potente e específico dos estimulantes uterinos é um hormônio
sintetizado no hipotálamo e estocado na pituitária, é conhecido por agir direta e indiretamente
estimulando a contração do músculo liso uterino e é amplamente utilizado para estimular as
contrações uterinas durante o trabalho de parto bem como para evitar hemorragia pós-parto
(WILLETS, 2009). Como um agente farmacológico a ocitocina pode produzir efeitos
similares à ocitocina endógena, aumentando a força e duração das contrações do miométrio
(MOHAN; BENNETT, 2006).
A ocitocina promove contrações uterinas, aumentando a concentração de Ca2+
i na célula
do miométrio (PAYTON; BRUCKER, 1999) (Figura 7). Os efeitos fisiológicos da ocitocina
são primariamente mediados através de um GPCR específico, por meio do receptor da
ocitocina (OTR). O peptídeo liga-se a uma proteína G, preferencialmente a da classe Gαq/11,
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na superfície do miócito uterino, resultando na geração de DAG e IP3, através da ação da PKC
sobre o PIP2. DAG estimula a síntese de prostaglandina (PG), seguido por fluxo de Ca2+
extracelular através dos Cav e o IP3 estimula a libertação de cálcio do retículo sarcoplasmático
(WILLETS, 1999; DYER; VAN DYK; DRESNER, 2010). A ocitocina também estimula um
aumento de fosfolipase A2 (PLA2) no citoplasma e induz a atividade de ciclooxigenase-2
(COX-2), as duas principais enzimas de biossíntese de PG (DYER; VAN DYK; DRESNER,
2010; GRUBER; O’BRIEN, 2011).
A ocitocina geralmente é utilizada para induzir ou estimular o trabalho de parto no final
da gestação, sendo bem menos útil no início da gestação, fato esse associado ao aumento da
concentração dos OTR no miométrio à medida que avança a gestação, aumentando a
sensibilidade à ocitocina por meio da regulação positiva dos níveis de RNA mensageiro
(RNAm) do receptor da ocitocina (BRODY; MINNEMAN; WECKER, 2006; MOHAN;
BENNETT, 2006; DYER; VAN DYK; DRESNER, 2010).
Figura 7 – Influência da ocitocina nas células do miométrio
Fonte: adaptada de DYER; VAN DYK; DRESNER, 2010.
Prostaglandinas
As prostaglandinas (PGs) são ramificações de uma grande família de compostos
endógenos biologicamente ativos (PAYTON; BRUCKER, 1999), membros da família dos
eicosanóides, derivados do ácido araquidônico (AA) por meio da conversão do AA pela
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enzima ciclooxigenase (COX) que possui duas isoformas, a COX-1, forma constitutiva,
promove a produção de eicosanóides que são responsáveis por processos fisiológicos,
enquanto que a COX-2, forma induzida, é responsável por alterações observadas com a
inflamação (RANG et al., 2007). As PGs são sintetizadas dentro das membranas fetais
humanas (âmnio e córion), além do miométrio, particularmente durante a segunda fase do
ciclo menstrual, capazes de modular contrações uterinas (GROOM, 2007; ARROWSMITH;
KENDRICK; WRAY, 2010) e, por isso, desempenham um papel importante no trabalho de
parto atuando na estimulação da contratilidade do miométrio, amadurecimento do colo uterino
e vasoconstrição tendo também participações sobre as cólicas uterinas na fase menstrual, mais
conhecida como dismenorréias (NOVAK; BEREK, 2005). Sendo as membranas fetais uma
fonte importante de PGs, eventos que levam ao início da contratilidade uterina, seja
dismenorréia ou trabalho de parto prematuro, são caracterizados pelo aumento significativo de
PGs, tendo como percursor o AA e pensa-se que a isoforma COX-2 é de importância na
produção dessas PGs intrauterinas. Seus efeitos são mediados através da ligação com GPCR e
a ativação dos canais para Ca2+
na membrana celular e, dentro desse grupo, as prostaglandinas
de maior interesse, tanto relacionado com a contratilidade, quanto com o relaxamento uterino,
são as prostaglandinas E2 (PGE2), prostaglandinas F2α (PGF2α) e prostaciclina (PGI2).
(MOHAN; BENNETT, 2006; GROOM, 2007; SU, 2012).
As ações das PGs são mediadas por receptores específicos nas membranas plasmáticas
de células alvo que levam à estimulação do segundo mensageiros distintos. Os receptores de
prostaglandinas são classificados em cinco subtipos (DP, EP, FP, IP e TP) com base na sua
sensibilidade para os cinco prostanóides primários (PGD2, PGE2, PGF2α, PGI2, e TXA2),
respectivamente (PALLISER et al., 2005). O acoplamento dos receptores de PGs ao seu
ligante específico, ativa vias intracelulares distintas podendo levar desde à resposta contrátil
(EP1, EP3, FP, TX) ou ao relaxamento (EP2, EP4, IP, DP). O efeito contráctil das PGs é
baseado na mobilização do Ca2+ e na inibição da atividade da AMPc e além disso, elas agem
mais eficazmente perto de seu local de produção. PGF2α promovem liberação de Ca2+
do RS
por meio da ativação do receptor acoplado à proteína G (Gq/11) ativando a PLC, estimulando a
produção de IP3 e resultando em liberação de Ca2+i acarretando aumento da contratilidade
uterina através do seu próprio receptor. Além disso, dentro do miométrio, a PGF2α promove a
formação da junção-gap e aumenta a expressão dos OTR. A PGI2 atua com vasodilatador,
podendo correlacionar a doença hipertensiva específica da gravidez (DHEG) a uma
deficiência da PGI2. Já a PGE2 exerce efeito por meio de aumento dependente da
concentração de Ca2+i mediado através dos receptores Gαq, tendo como resultado final o
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 47
amadurecimento do colo do útero, seguido de amolecimento, apagamento e dilatação do colo
durante as contrações uterinas. Os efeitos de PGE2 e PGF2α são conduzidos principalmente
através dos receptores EP e os subtipos de receptores FP, respectivamente (VAN GEIJN,
2007; GRUBER; O’BRIEN, 2011). Segundo Mohan; Bennett (2006) a contratilidade in vitro
do miométrio é modulada por meio das PGs via aumento da expressão da junção-gap e do
acoplamento célula-célula.
As principais classes de prostaglandinas utilizadas na terapêutica são dinoprostona
(PGE2), gemeprost, análogo da PGE1, dinoprost (PGF2α), carboprost, análogo da PGF2α e
misoprostol, análogo da PGE1 (MOHAN; BENNETT, 2006).
As prostaglandinas assim como a ocitocina atuam promovendo a contratilidade uterina,
no entanto, as prostaglandinas podem promover aumento da contratilidade uterina em
qualquer período da gestação dessa forma é possível utilizá-la para esvaziamento uterino na
presença de aborto nas primeiras semanas de gravidez, no segundo trimestre e nos casos de
morte fetal intra-uterina (PAYTON; BRUCKER, 1999; RANG et al., 2007).
Alcalóides do ergot (derivado da ergotamina)
Alcalóides do Ergot, ou alcalóides derivados da cravagem do centeio, originados a partir
do fungo Claviceps purpurea, foi a primeira droga ocitócita eficaz. Quando a ocitocina não
consegue produzir tônus uterino adequado, uma terapia de segunda escolha, não havendo
contra-indicação, é iniciada principalmente na terceira fase do trabalho de parto para o
tratamento das complicações associadas à contração muscular lisa uterina como a hemorragia
pós-parto e atonia uterina. Dentre eles, metilergonovina (Metergin) e ergometrina são
utilizados como uma nova alternativa visto que eles promovem rapidamente fortes contrações
uterinas do tipo tônico-sustentadas, sendo desaconselhável para utilização durante o início do
trabalho de parto. Ergometrina e metilergonovina são agonistas parciais dos receptores
α-adrenérgicos, 5HT-1, e os receptores de dopamina, contudo, pouco se sabe acerca do
mecanismo de ação, o que se sugere que seja feito através de canais para Ca2+
ou um receptor
do tipo α-adrenérgico no miométrio (BREATHNACH; GEARY, 2009; DYER; VAN DYK;
DRESNER, 2010; SU, 2012).
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 48
Antagonistas dos receptores de progesterona
A progesterona é um hormônio esteróide, produzido principalmente pelo corpo lúteo
dos ovários e placenta, responsável por preparar o revestimento do útero para a implantação
de um óvulo fertilizado (GRUBER; O’BRIEN, 2011) e importante regulador para o
estabelecimento e manutenção da gravidez (LEE et al., 2006) atuando através de receptores
intracelulares, receptores de progesterona (RP) que fazem parte da "super família" de
reguladores ligante ativadores de transcrição (PAŘÍZEK; KOUCKÝ; DUŠKOVÁ, 2013).
Tanto em animais quanto em humanos, a progesterona tem sido estabelecida como um dos
principais agentes inibidores responsáveis pela quiescência uterina e estudos em animais
demonstram que a retirada ou diminuição dos níveis da progesterona é o fator responsável
pela iniciação do trabalho de parto (MOHAN; BENNETT, 2006). Diferente da maioria das
outras espécies, o parto em seres humanos ocorre sem uma diminuição nos níveis de
progesterona seja nos fluidos maternos, fetal ou líquido amniótico, sugerindo que a retirada da
progesterona não é necessária. No entanto, estudos mostram que o uso de um antagonista dos
RP induz ao trabalho de parto em todas as fases da gravidez humana podendo ser utilizado
com agente abortivo, sugerindo que o trabalho de parto humano envolve uma forma de
retirada de progesterona que não depende de uma diminuição dos níveis circulantes da mesma
e outros mecanismos (MESIANO; WELSH, 2007).
Mifepristona (RU486) é um antagonista competitivo nos receptores de progesterona,
seu uso consiste na retirada farmacológica da progesterona consequentemente associada com
o inicio do trabalho de parto, e tem sido utilizada clinicamente para facilitar a interrupção da
gravidez no primeiro trimestre. A mifepristona atua na síntese de PG e é conhecida por
diminuir os níveis de prostaciclina (PGI2), consequentemente, promovendo um aumento na
contratilidade uterina (MOHAN; BENNETT, 2006; ZAKAR; HERTELENDY, 2007). Para
indução do aborto terapêutico é utilizada juntamente com um análogo de prostaglandina,
normalmente o misoprostol (GEMZELL-DANIELSSON; BYGDEMAN; ARONSSON,
2006).
Agonista dos receptores muscarínicos
Em muitos tecidos musculares lisos populações mistas de receptores muscarínicos do
tipo M2 e M3 estão presentes. Por outro lado, tem havido pouca investigação sobre os
principais tipos de receptores muscarínicos presentes em útero de ratos e humanos. A
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 49
contração uterina em resposta, por exemplo, a acetilcolina (ACh), um agonista dos receptores
muscarínicos, tem sido observado em vários mamíferos, incluindo ratos, suínos e humanos.
Este efeito é mediado através da interação de acetilcolina com os receptores muscarínicos e
sabe-se que existem vários subtipos de receptores muscarínicos (M1, M2, M3, M4, M5), que
são expressos em muitos tecidos. O músculo liso de muitas espécies mostra que populações
heterogéneas de receptores muscarínicos tanto M2 quanto o M3 estão envolvidos na função
contrátil. Em membranas de útero de rato, os receptores muscarínicos do tipo M2 e do tipo M3
foram detectados, no entanto, os receptores muscarínicos que medeia a contração no tecido
miometrial humano não é bem caracterizado (PENNEFATHER; GILLMAN;
MITCHELSON, 1994; DITTRICH et al., 2009).
Embora os receptores muscarínicos do tipo M2 e M3 sejam mais numerosos dentro no
músculo liso, estudos farmacológicos indicaram que a sinalização do receptor do tipo M3 é o
responsável pela maior parte da contração desencadeada no músculo liso induzida por
agonista muscarínico no trato urogenital inferior, incluindo a bexiga e o útero. A ativação dos
receptores muscarínicos do tipo M3 acoplados a proteína Gq/11 estimula a contração do
músculo liso dependente do Ca2+
através da cascata de PIP2, o que resulta na geração de IP3.
O IP3 por sua vez estimula a liberação de Ca2+
dos estoques intracelulares do RS essa
liberação promove um aumento na concentração de Ca2+
i promovendo a fosforilação da
cinase da cadeia leve de miosina, que leva ao evento da contração do músculo liso (BASHA
et al., 2008).
3.7.2 Fármacos tocolíticos
Ao contrário dos agentes uterotônicos, os tocolíticos são medicamentos utilizados para
inibir as contrações uterinas. Eles são usados para relaxar o útero no caso das dismenorréias,
para prevenir ou atrasar o parto prematuro, para retardar o trabalho de parto quando há
necessidade de transporte da mãe para uma unidade de cuidados especializados ou para
permitir tempo suficiente para implementação de outras modalidades de tratamento tal como
administração de esteróides para maturação do pulmão fetal. A maioria dos tocolíticos
promove sua ação por meio da estimulação do AMPC que, por sua vez, inibe a MLCK e essa
redução diminui a concentração de cálcio intracelular, produzindo o relaxamento do
miométrio (PAYTON; BRUCKER, 1999).
Apesar dos inúmeros estudos desenvolvidos nessa área, ainda não há um consenso sobre
qual dentre eles é o melhor agente tocolítico para a terapêutica. Entre os tocolíticos utilizados
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 50
atualmente estão os agonistas dos receptores β-adrenérgicos, bloqueadores dos canais para
cálcio, inibidores da síntese de PG/anti-inflamatórios não esteroidais (AINE), antagonista dos
receptores para ocitocina (atosiban) e sulfato de magnésio (GYETVAI, et al., 1999; OEI,
2006; GROOM, 2007; ARROWSMITH; KENDRICK; WRAY, 2010).
Agonistas dos receptores β-adrenérgicos
Os agonistas β-adrenérgicos, incluem fenoterol, ritodrina, salbutamol e terbutalina, são
agonistas não seletivos, atuando em ambos receptores β1 e β2. Porém, no miométrio, os
receptores do tipo β2 estão presentes com mais predominância, mediando o relaxamento pela
ativação da adenilil cilcase, promovendo aumento do AMPc resultando em alterações no
balanço de cálcio, em conjunto com a inibição da MLCK (MOHAN; BENNETT, 2006), ou
seja, as interações com os receptores locais específicos causam aumento na produção
intracelular de AMPc, resultando na redução da concentração de Ca2+
i, onde os níveis mais
baixos de Ca2+ inibem a ativação do mecanismo contrátil das proteínas actina e miosina que,
por sua vez, resulta no relaxamento do miométrio (LAM; GILL, 2005). Embora
β-adrenérgicos reduzam as contrações uterinas, eles parecem não ter qualquer efeito sobre o
amadurecimento do colo do útero ou das membranas fetais (GROOM, 2007). O uso desse tipo
de medicamento necessita de avaliação prévia e monitoramento contínuo devido ao fato de
que os receptores β-adrenérgicos estão presentes em vários tecidos humanos, além do
miométrio uterino, e a consequente falta de especificidade do útero significa que algumas
dessas drogas podem exercer efeitos em outros locais do corpo e, por isso, diversos estudos
têm destacado questões de segurança ao usar esses medicamentos para tratamento do parto
prematuro, particularmente com relação a eventos cardiovasculares maternos (OEI, 2007).
Sulfato de magnésio
O sulfato de magnésio atua promovendo o relaxamento da musculatura tendo sido
utilizado desde há muito em obstetrícia como tocolítico ou como profilaxia para a eclampsia,
quando a pré-eclâmpsia existe (PAYTON; BRUCKER, 1999). Embora o mecanismo de ação
não esteja completamente esclarecido fisiologicamente, existe um antagonismo entre
magnésio (Mg2+
) e Ca2+
, o Mg2+
promove uma redução na entrada de Ca2+
através do
bloqueio na membrana dos canais para Ca2+
, dentre eles o do tipo L e consequentemente
redução desse íon no meio intracelular, esse antagonismo causa diminuição da disponibilidade
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 51
de Ca2+
o que diminui a contratilidade do miométrio e talvez essa seja uma das suas principais
ações (ARROWSMITH; KENDRICK; WRAY, 2010).
Outros bloqueadores dos canais para cálcio – nifedipina
Bloqueadores dos canais para cálcio são normalmente usados no tratamento da
hipertensão e exercem o seu efeito através do bloqueio do influxo transmembranar de Ca2+
por meio dos Cav do tipo L e também pela ligação a proteínas de ligação de cálcio intracelular
(MOHAN; BENNETT, 2006; GROOM, 2007). Como se sabe, a contração no músculo liso é
decorrente no aumento da concentração de Ca2+
i, portanto, um decréscimo resultante na
concentração de Ca2+
i leva a inibição da interação actina-miosina e, por conseguinte,
diminuição da contratilidade do miométrio. Devido a sua capacidade em relaxar o músculo
liso, os bloqueadores do canal para Ca2+
, em particular a nifedipina, são amplamente
utilizados como agentes tocolíticos (ABRAMOVICI; CANTU; JENKINS, 2012).
Inibidores da síntese de prostaglandinas – indometacina; inibidores seletivos da COX
Como citado anteriormente, as PGs desempenham um papel importante nos
mecanismos que levam a iniciação e manutenção do trabalho de parto, seja ele a termo ou pré-
termo. Fármacos que inibem a produção das prostaglandinas funcionam como tocolíticos,
inibindo o mecanismo de ação que leva a contração uterina por meio da participação das PGs,
ou seja, inibição da enzima COX responsável pela conversão do ácido araquidônico em
prostaglandinas, nesse caso, a indometacina, um inibidor não seletivo da COX, bem como os
inibidores seletivos da COX, funcionam como importantes agentes tocolíticos (GROOM,
2007).
Indometacina
A indometacina atua como inibidor não seletivo da COX mais amplamente utilizado
como tocolítico e tem efeito inibidor reversível na contratilidade do miométrio. Foi o primeiro
anti-inflamatório não-esteroidal a ser utilizado e por ser não seletivo e esta classe de drogas
potencialmente inibe tanto a COX-1 e COX-2. A indometacina também pode inibir a
contratilidade do miométrio através do bloqueio direto dos canais para cálcio nesse tecido
(MOHAN; BENNETT, 2006).
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 52
Inibidores seletivos da COX
Inibidores seletivos da COX, particularmente da COX-2, foram inicialmente
desenvolvidos e comercializados pela indústria farmacêutica para tratar condições tais como
artrite reumatóide e osteoartrite. Estudos recentes têm sido desenvolvidos para comparar os
efeitos causados pelos dos inibidores seletivos da COX-2 com os causados pela indometacina,
sendo essa um inibidor não seletivo da COX. Dentre os fármacos estudados estão a
nimesulida, celecoxib (Celebrex®) e rofecoxib (Vioxx
®), que foram testados quanto ao uso
como agente tocolítico (GROOM, 2007; ABRAMOVICI; CANTU; JENKINS, 2012).
Antagonista dos receptores para ocitocina – atosiban
A ocitocina tem um papel fundamental quando se trata do início do trabalho de parto
tanto a termo quanto na atividade uterina prematura. Mulheres em situação de trabalho de
parto prematuro estão mais suscetíveis a uma maior sensibilidade à ocitocina e uma maior
concentração de OTR em comparação com as mulheres em idade gestacional semelhante, mas
que não estão em trabalho de parto (ARROWSMITH; KENDRICK; WRAY, 2010).
Atosiban, é um peptídeo sintético, atua como antagonista competitivo dos OTR e
vasopressina, se ligando aos OTR no miométrio e potencialmente também nas membranas
fetais (MOHAN; BENNETT, 2006), portanto, a inibição do receptor para ocitocina conduz a
uma redução no influxo de Ca2+
extracelular, bem como a liberação das reservas de Ca2+i
causando a inibição da contratilidade. Assim como os β-adrenérgicos, o modo de ação do
atosiban é na contratilidade do miométrio e não tem nenhum efeito sobre outros aspectos do
processo de trabalho de parto (GROOM, 2007).
3.8 Plantas com ações uterotônicas e tocolíticas
Por mais que algumas plantas sejam usadas pela medicina tradicional como adjuvante
em problemas de saúde, alguns destes medicamentos têm efeitos prejudiciais secundários. A
natureza dessas ações pode envolver a modulação, por exemplo, das contrações uterinas,
resultando quer na estimulação (uterotônico) ou inibição (tocolítico) de contrações musculares
miometriais (GRUBER; O’BRIEN, 2011).
Desse ponto de vista, o uso de medicamentos fitoterápicos, em casos específicos como a
gravidez pode causar danos irreversíveis tanto à mãe quanto ao feto. Além disso, as
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 53
informações sobre a segurança de utilização destes produtos durante esse período ou estudos
que comprovem sua eficácia ainda são escassas (CLARK; RATES; BRIDI, 2007).
Em países onde a medicina tradicional é inacessível para a população rural ou muito
cara para a comunidade, a maioria dos habitantes depende de remédios tradicionais à base de
plantas. Não diferente quando se trata da população feminina, cujo costume popular leva ao
uso dessas preparações em situações que vão desde doenças comuns até no tratamento de
desordens menstruais, auxílio no trabalho de parto e prevenção de complicações relacionadas
ao pós-parto.
3.8.1 Plantas com ação uterotônica
A utilização de fitoterapia para aliviar problemas associados com condições
ginecológicas da menstruação e menopausa, para apoiar a saúde durante a gravidez e para
facilitar o parto é comum entre muitas culturas tradicionais (GRUBER; O’BRIEN, 2011).
Contudo, essas mesmas plantas utilizadas para fins terapêuticos podem apresentar efeitos que
são desconhecidos e que podem gerar transtornos para as mulheres principalmente durante a
gestação (RODRIGUES et al., 2011). O fato de os medicamentos tradicionais poderem ter
efeitos uterotônicos é uma consideração importante de saúde pública.
As plantas medicinais com propriedades uterotônicas possuem a mesma finalidade
quando do uso de fármacos que promovem a contratilidade uterina. Muitas preparações são
usadas com finalidade de provocar abortos, tratar problemas menstruais ou para conduzir o
trabalho de parto prolongado. Decocções de Agapanthus africanus e Clivia miniata são
usadas como agentes uterotônicas na medicina tradicional da África do Sul (VEALE;
OLIVER; HAVLIK, 2000); concentrações altas de Ficus exasperata foram utilizadas para
estimular o aumento da contratilidade uterina in vitro em ratas (BAFOR; OMOGBAI;
OZOLUA, 2009); o extrato obtido de Plumeria rubra (Linn) foi testado quanto à atividade
abortiva em ratas albinas (DABHADKAR; ZADE, 2012); Ricinus communis e Euclea
divinorum são tradicionalmente usados por parteiras do Quênia para induzir ou aumentar o
trabalho de parto, conduzir o trabalho de parto prolongado, como também reter hemorragia
pós-parto (KAINGU; ODUMA; KANUI, 2012).
Na cultura brasileira, diversas substâncias que são isoladas de vegetais considerados por
muitos como medicinal possuem inúmeras atividades não compatíveis com sua função
primária podendo ser citotóxicas ou genotóxicas e/ou mostram relação com a incidência de
tumores e abortos. Exemplos práticos são a arruda (Ruta graveolens), que pode provocar
F U N D A M E N T A Ç Ã O T E Ó R I C A | 54
aborto e fortes hemorragias e é considerada a planta de maior uso para prática do aborto; alho
(Allium sativum), aloe (Aloe ferox), cânfora (Cinnamomum canphora), confrei (Symphitum
officinalis), eucalipto (Eucaliptus globulus), gengibre (Zingiber officinalis) e sene (Cassia
angustifolia e Cassia acutifolia) podem ser abortivas por estimularem a motilidade uterina.
Além dessas, alguns óleos essenciais também devem ser evitados principalmente no primeiro
trimestre da gravidez como, os provenientes de bétula (Betula alba), cedro (Cedrela
brasiliensis), erva-doce (Pimpinella anisum), jasmim (Jasminum officinalis), manjericão
(Origanum basilicum), manjerona (Majorana hortensis), tomilho (Thymus vulgaris), rosa
(Rosa sp.) e lavanda (Lavanda angustifolia) (VEIGA Jr. et al., 2005; CLARK; RATES;
BRIDI, 2007).
3.8.2 Plantas com ação tocolítica
Quando se trata de ações espasmolítica ou tocolítica a medicina tradicional busca a
utilização de compostos ativos que promovam essa ação no organismo com objetivo de
prevenir ou tratar complicações decorrentes da contratilidade uterina. A maioria das pesquisas
sobre plantas com ação tocolítica direciona-se para obter compostos farmacologicamente
ativos que produzam o efeito desejado.
As cólicas uterinas e partos pré-maturos são problemas que acometem muitas mulheres
no mundo inteiro. Tentar descobrir alguma substância que possa prevenir ou até curar esses
problemas é de extrema importância.
A ampla gama de tocolíticos em uso é um testemunho do fato de que ainda não se
possui uma droga ideal. Portanto, o desenvolvimento de novos agentes tocolíticos seguros e
eficazes é um importante tema de pesquisas que vem sendo desenvolvidas continuamente.
Pesquisas realizadas para comprovar o uso das plantas como ferramentas terapêuticas
medicinais mostram que algumas espécies possuem compostos promissores com propriedades
tocolíticas como, por exemplo, o estudo realizado por Alencar Cunha et al. (2003)
identificando que o óleo de Copaifera langsdorfii, possui um diterpeno com atividades
relaxante sobre o músculo liso uterino de ratas frente a contrações induzidas por agonistas
como ocitocina e acetilcolina; o chá das folhas de Duguetia furfuraceae (At. Hil) B. et. H.,
conhecida como marolinho, araticum-do-campo, ata brava, é indicado para combater
dismenorréia (TOLEDO, 2006); Agave americana L é utilizada para tratar dismenorréia,
Matricaria chamomilla, ou camomila, usada para tratar cólicas uterinas (OSOSKI et al.,
2002). Pesquisas feitas por Shih; Hsu; Yang (2009) evidenciaram o efeito tocolítico das raízes
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da erva chinesa Scutellaria baicalensis; o extrato metanólico e clorofórmio de Curcuma
aeruginosa Roxb. exerceram efeito tocolítico sobre o útero de ratas pré-tratadas com
estrogênio (THAINA et al., 2009).
Novas alternativas de tratamento médico continuam sendo alvos de interesses e estudos,
principalmente quando essas alternativas consistem no uso de plantas medicinais em suas
diversas apresentações, visto que muitos pacientes ainda preferem de certa forma essa
modalidade de tratamento.
O músculo liso é o principal tipo de músculo que controla o funcionamento da maioria
dos órgãos ocos do organismo, assim uma droga que venha a interferir em quaisquer dos
mecanismos que levam à contração nos músculos lisos, poderá vir a ser bastante útil, uma vez
que substâncias espasmogênicas têm uma aplicação funcional e importante em vários
processos fisiopatológicos, tais como: auxilio na promoção de contrações uterinas em trabalho
de parto prolongado, na prevenção da hemorragia pós-parto por fatores como atonia uterina,
na expulsão da placenta quando os mecanismos fisiológicos não contemplam a realização do
processo, e todas as outras ações que necessitem de contrações musculares.
A pesquisa por produtos naturais pode dar contribuições substanciais para inovação das
drogas, uma vez que o estudo das plantas medicinais poderá provê não só o entendimento dos
mecanismos de ação, como a descoberta de novas estruturas químicas e consequentemente o
desenvolvimento de novos fármacos.
MATERIAL E MÉTODOS
M A T E R I A L E M É T O D O S | 57
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
4.1.1 Material Botânico
A espécie Erythroxylum caatingae Plowman foi coletada no povoado de Caboclo,
latitude 08°28’44,70’’S, longitude 040°56’09,50’’W, altitude 582 m, na estrada para a
Fazenda Boqueirão no município de Afrânio, estado de Pernambuco. O material botânico foi
identificado pelo Prof. Dr. José Alves Siqueira Filho, da Universidade Federal do Vale do São
Francisco (UNIVASF) e uma exsicata da planta está depositada no Herbário da UNIVASF –
HVAFS, sob o n°13965 (Figura 8 A e B).
Foram utilizados extratos brutos obtidos das partes aéreas (folhas) da espécie
Erythroxylum caatingae Plowman, fornecidos pelos nossos colaboradores do setor de química
do Núcleo de Estudos e Pesquisas de Plantas Medicinais (NEPLAME), do Laboratório de
Pesquisas do Vale do São Francisco (LAPEVALE) e do Instituto de Pesquisas em
Substâncias Bioativas (IPESB) da Universidade Federal do Vale do São Francisco
(UNIVASF).
M A T E R I A L E M É T O D O S | 58
Figura 8 – Exsicata da espécie Erythroxylum caatingae Plowman.
Foto: Fernanda Ribeiro.
B
A
M A T E R I A L E M É T O D O S | 59
4.1.2 Animais
Foram utilizadas ratas Wistar virgens (Rattus norvegicus) pesando entre 150 e 250 g,
procedentes do Biotério Central da UNIVASF.
Antes dos experimentos todos os animais eram mantidos em gaiolas de polipropileno
com ventilação e temperatura (22 1 C) controladas e constantes, submetidos diariamente a
um ciclo claro-escuro de 12 horas, com a fase de luz iniciando às 6:00 horas e terminando às
18:00 horas, sob rigoroso controle alimentar com uma dieta balanceada a base de ração tipo
“pellets” com livre acesso a água (disponível em frascos de vidro com bicos apropriados) até
60 minutos antes dos experimentos. Todos os experimentos foram realizados no período entre
7:00 horas às 19:00 horas.
4.1.3 Aspectos éticos
Todos os protocolos experimentais propostos respeitaram os critérios éticos de
experimentação animal preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório (SBCAL/COBEA), International Council for Laboratory Animal Science
(ICLAS) e pela Lei no. 11.794, de 8 de outubro de 2008. Além disso, o presente projeto foi
submetido à análise pelo Comitê de Ética e Deontologia em Estudos e Pesquisa da
Universidade Federal do Vale do São Francisco (CEDEP-UNIVASF), de acordo com o
Protocolo nº 0002/131211 (Anexo A).
M A T E R I A L E M É T O D O S | 60
4.1.4 Substâncias e Sais
Todas as substâncias e sais utilizados estão descritos no quadro a seguir.
Quadro 1 – Substâncias, sais e seus fornecedores.
SUBSTÂNCIAS FORNECEDORES
Atosiban
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Cloridrato de Acetilcolina (ACh)
Cremofor EL
Dietilestilbestrol
Indometacina
Sulfato de atropina
Cloreto de Cálcio Di-hidratado
(CaCl2.2H2O)
Isofar, Brasil
Cloreto de sódio (NaCl) Vetec, Brasil
Glicose (C6H12O6),
Cloreto de potássio (KCl) Dinâmica
Dimetilsulfóxido (DMSO) Cromato produtos químicos
Bicarbonato de sódio (NaHCO3) Proquímicos
Etanol Absoluto
Ocitocina União Química
4.1.5 Soluções Nutritivas
Para os experimentos de contração e relaxamento do músculo liso isolado utilizou-se
solução nutritiva de Locke Ringer, aerada com mistura carbogênica (95 % de O2 e 5 % de
CO2). O pH era ajustado para valores entre 7,2 e 7,4 com solução de HCl ou NaOH (1N) e
mantida a temperatura constante de 32 ± 1ºC. A composição desta solução está descrita a
seguir (Tabela 1).
M A T E R I A L E M É T O D O S | 61
Tabela 1 – Composição da solução Locke Ringer.
Substâncias Concentração (mM)
NaCl
KCl
CaCl2.2H2O
Glicose
NaHCO3
154,0
5,63
2,16
5,55
5,95
4.1.6 Aparelhos
Para registro das contrações isotônicas os segmentos de útero isolado foram suspensos
em cubas (10 mL) de um sistema de banho para órgãos isolados modelo EFF-321 (Insight
Instruments, Brasil). Para o monitoramento das contrações foram utilizados transdutores de
força modelo TRO015 (Panlab
, s.l., Espanha) e Fort 15 (WPI
, USA) acoplados a um
amplificador de força do tipo “bridge system” (Insight
, Brasil), conectado a um computador.
Para aferição do pH das soluções nutritivas utilizou-se um pHmetro digital modelo
pH250 (Policontrol
, Brasil). Todas as substâncias foram pesadas em balança analítica
modelo FA2104N (Celtac
, Brasil) ou semi-analítica modelo MARK300 (Bel
, Brasil) e os
animais em balança comum modelo 9094C/4 (Toledo
, Brasil).
4.1.7 Preparo dos extratos da espécie vegetal, bem como das drogas e reagentes para os
ensaios farmacológicos.
4.1.7.1 Extratos
Os extratos foram solubilizados em cremofor EL na concentração de 3 % (P/V) e
diluídos em água destilada (pH 7,0) para obtenção da solução-estoque (10 mg/mL) a qual foi
armazenada em um “freezer”, entre -18° e -20° C, sendo novamente diluída em água destilada
de acordo com a necessidade de cada protocolo experimental. A concentração final de
cremofor na cuba nunca excedeu 0,01 % (V/V). Nessa concentração, o cremofor não
apresenta efeito relaxante significante em útero isolada de rata, de acordo com dados obtidos
em experimentos anteriores realizados em nosso laboratório.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 62
4.1.7.2 Drogas e Reagentes
Todas as drogas e reagentes foram armazenadas na temperatura padrão exigida,
dissolvidos e diluídos em água destilada e as soluções-estoque armazenadas a -20°C na
concentração de 10-2
M, sendo diluídas conforme a necessidade dos protocolos. Exceto a
indometacina foi dissolvida e diluída em solução de DMSO a 0,6% para obtenção da solução
estoque com concentração de 10-2
M. O dietilestilbestrol foi dissolvido em etanol para
obtenção da solução estoque (10 mg/mL) e diluído novamente em etanol para obtenção da
solução final (1 mg/mL).
4.2 MÉTODOS
4.2.1 Estudo da possível atividade espasmogênica do extrato etanólico bruto de
Erythroxylum caatingae Plowman (Ec-EtOH) em útero isolado de rata.
4.2.1.1 Preparação do útero para a realização do experimento
As ratas, 24 h antes do início dos experimentos, foram tratadas com dietilestilbestrol,
administrado por via subcutânea, na dose de 1 mg/kg para indução do estro. Decorrido este
tempo, eram eutanasiados por deslocamento cervical e a cavidade abdominal aberta para
dissecção do útero, o qual era colocado em uma placa de Petri contendo solução nutritiva de
Locke Ringer a 32 C aerada com mistura carbogênica (95% O2 e 5 % CO2) para retirada de
tecido conectivo e limpeza. Em seguida, os dois cornos uterinos eram separados por meio de
uma incisão, abertos longitudinalmente para obter tiras de tecido uterino de 2 centímetros de
comprimento, e suspensos verticalmente, por meio de um fio de algodão em cubas de vidro
(10 mL), ligados a transdutores de força acoplados a um sistema de banho de órgãos.
Para estabilização da preparação, esta era mantida em repouso por 60 minutos antes do
contato com qualquer agente, sob tensão de 1 g, efetuando-se, neste período, a renovação da
solução nutritiva da cuba a cada 15 minutos.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 63
4.2.1.2 Investigação do efeito do Ec-EtOH frente às contrações fásicas induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
O útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização de
60 minutos duas contrações isotônicas de magnitudes similares do tipo concentração-resposta
foram induzidas com 10-2
UI/mL de ocitocina ou com 10-5
M de acetilcolina em
concentrações submáximas (controle). Em seguida, na ausência da ocitocina ou acetilcolina, o
Ec-EtOH foi incubado por 15 minutos na concentração de 729 µg/mL. Após esse período e
ainda na presença do Ec-EtOH uma nova curva concentração-resposta foi induzida utilizando
um dos agonistas (Figura 9).
Figura 9 – Esquema do protocolo a ser realizado para investigar o efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL)
frente às contrações fásicas induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 64
4.2.1.3 Investigação do efeito do Ec-EtOH sobre as contrações tônicas induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
O útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização de
60 minutos duas contrações isotônicas de magnitudes similares do tipo concentração-resposta
foram induzidas com 10-2
UI/mL de ocitocina ou com 10-5
M de acetilcolina em
concentrações submáximas (controle). Após lavagem seguida de um período de 30 minutos
uma nova curva-resposta foi induzida com um dos agonistas e passados 10 minutos da
indução da contração, sobre o tônus da contração, o extrato foi adicionado na cuba na mesma
concentração inicial (729 µg/mL) (Figura 10).
Figura 10 – Esquema do protocolo a ser realizado para investigar o efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL)
sobre às contrações tônicas induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 65
4.2.1.4 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo de
dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas do extrato frente às
contrações induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
O útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização de
60 minutos duas contrações isotônicas de magnitudes similares do tipo concentração-resposta
foram induzidas com 10-2
UI/mL de ocitocina ou com 10-5
M de acetilcolina em
concentrações submáximas (controle). Em seguida, na ausência da ocitocina ou acetilcolina, o
Ec-EtOH foi incubado na concentração de 729 µg/mL e avaliado os parâmetros como
amplitude máxima (Emax), amplitude média, tempo máximo para se atingir o Emax (Tmax),
frequência das contrações e duração do efeito. Decorrido o tempo de avaliação das contrações
espontâneas produzida pela primeira aplicação do Ec-EtOH e seguida de dois períodos de 15
minutos para lavagem do tecido, uma nova aplicação do Ec-EtOH foi feita e observado
novamente os mesmo parâmetros avaliado na primeira aplicação do Ec-EtOH na mesma
concentração inicial (729 µg/mL).
4.2.1.5 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo de
dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas frente à contração induzida
por 10-2
UI/mL de ocitocina em tecido uterino de ratas após o parto.
Para realização desse protocolo, as ratas foram eutanasiadas 24 horas após o parto
natural e o útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização
de 60 minutos uma contração isotônica do tipo concentração-resposta foi induzida com
10-2
UI/mL de ocitocina em concentração submáxima (controle). Em seguida, na ausência da
ocitocina, o Ec-EtOH foi adicionado na cuba na concentração de 729 µg/mL por 30 minutos e
os parâmetros avaliados foram o Emax, amplitude média e frequência das contrações.
Decorrido o tempo de avaliação da primeira aplicação do Ec-EtOH e seguida de dois períodos
de 15 minutos para lavagem do tecido, uma nova aplicação do Ec-EtOH foi feita para
observar novamente os parâmetros citados anteriormente para a segunda aplicação do
Ec-EtOH na mesma concentração inicial (729 µg/mL).
M A T E R I A L E M É T O D O S | 66
4.2.2 Investigação do possível mecanismo de ação espasmogênica do Ec-EtOH em útero
isolado de rata.
4.2.2.1 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença de
atropina.
O útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização de
60 minutos uma contração isotônica foi induzida com 10-5
M de acetilcolina na concentração
submáxima (controle). Em seguida, na ausência da acetilcolina, a atropina foi pré-incubada na
concentração de 10 µM, segundo Kwan et al. (2003) nessa concentração a atropina atua como
um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos. Passado um período de 15 minutos
após pré-incubação das concentrações de atropina, adicionou-se acetilcolina às cubas.
Seguindo o protocolo, após adição de acetilcolina, foram realizadas duas lavagem com espaço
de tempo de 15 minutos entre elas e, em seguida, o Ec-EtOH foi adicionado às cubas na
concentração de 729 µg/mL e avaliado por 30 minutos para observar a presença de possíveis
contrações induzidas pelo extrato. Decorrido o tempo de contato do Ec-EtOH com os tecidos,
seguida de lavagem dos mesmos, uma nova pré-incubação de atropina (10 µM) foi feita por
um período de 15 minutos e, em seguida, adicionado Ec-EtOH (729 µg/mL), observando por
30 minutos se houve contração induzida pelo extrato na presença do antagonista competitivo
dos receptores muscarínicos.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 67
4.2.2.2 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença de
indometacina.
O útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização de
60 minutos uma contração isotônica foi induzida com 10-2
UI/mL de ocitocina na
concentração submáxima (controle). Em seguida, na ausência da ocitocina, foi pré-incubado
indometacina na concentração de 60 µM, baseado no protocolo feito por Shih et al. (2009),
nessa concentração e indometacina atua como um inibidor não seletivo da ciclooxigenase
(COX). Passado um período de 15 minutos, após pré-incubação da indometacina, adicionou-
se ocitocina às cubas. Seguido de dois períodos de lavagem de 15 minutos de intervalo entre
elas o Ec-EtOH foi adicionado nas cubas na concentração de 729 µg/mL e avaliado por
30 minutos para observação de possíveis contrações induzidas pelo extrato. Decorrido o
tempo contato do Ec-EtOH com o tecido e seguido de lavagem do mesmo, uma nova pré-
incubação de indometacina na concentração de 60 µM foi feita por um período de 15 minutos
e em seguida adicionado Ec-EtOH (729 µg/mL), observando por 30 minutos se houve
contração induzida pelo extrato na presença do inibidor não seletivo da COX.
4.2.2.3 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença de
atosiban.
O útero foi montado como descrito no item 4.2.1.1. Após o período de estabilização de
60 minutos uma contração isotônica foi induzida com 10-2
UI/mL de ocitocina na
concentração submáxima (controle). Em seguida, na ausência da ocitocina, foi pré-incubado
atosiban, um antagonista competitivo dos receptores para ocitocina, na concentração de
10-7
M, nessa concentração o atosiban é capaz de inibir 50% da contração no tecido em estado
basal (DORET et al., 2003). Passado um período de 15 minutos após pré-incubação do
atosiban, adicionou-se ocitocina as cubas. Seguido de um período de lavagem de 15 minutos o
Ec-EtOH foi adicionado nas cubas na concentração de 729 µg/mL e avaliado por 30 minutos
a presença de contrações induzidas pelo extrato. Decorrido o tempo de observação da ação do
Ec-EtOH sobre o tecido e seguido de lavagem do mesmo, uma nova pré-incubação de
atosiban na concentração de 10-7
M foi feita por um período de 15 minutos e em seguida
adicionado Ec-EtOH (729 µg/mL), observando por 30 minutos se houve contração induzida
pelo extrato na presença do antagonista dos receptores para ocitocina.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 68
4.2.3 Investigação da possível atividade espasmogênica do Ec-EtOH, em diferentes
períodos de gestação das ratas.
Para investigar a atividade espasmogênica do Ec-EtOH, um grupo de ratas Wistar
virgens com idade em torno de três meses, pesando entre 150 e 250 g, em fase pró-estro foram
selecionadas. Os animais foram divididos em gaiolas de polipropileno, passaram pelo período
de adaptação e, em seguida, foram separadas para o acasalamento com machos de fertilidade
comprovada na proporção de duas fêmeas para cada um macho (2:1).
Para avaliar a ação do Ec-EtOH nos diferentes períodos de prenhez das ratas, elas
foram divididas em outros dois grupos distintos, o grupo do 1° dia de prenhez e o grupo do
14° dia de prenhez. Cada grupo recebeu por gavagem o veículo correspondente, o grupo teste
recebeu extrato na dose de 250 mg/kg de peso corporal e o grupo controle recebeu o
equivalente a 1 mL de água. O protocolo para investigação do efeito do Ec-EtOH sobre as
diferentes fases da prenhez, o período de administração e a dose administrada, foi adaptado
dos estudos desenvolvidos por Almeida; Lemonica (2000), Costa-Silva et al. (2007), Sandeep
et al. (2011) e Dabhadkar; Zade (2012).
As ratas foram acasaladas com os machos durante a noite e examinadas no dia
seguinte para evidenciar a cópula por meio da observação do esfregaço vaginal. As ratas que
apresentaram esfregaço contendo espermatozóides foram consideradas fecundadas e esse dia
foi considerado como o 1° dia de prenhez (SANDEEP et al., 2011; DABHADKAR; ZADE,
2012). Após comprovação da prenhez, as fêmeas foram separadas em caixas individuais e
divididas em grupo controle (10 animais) e grupo teste (10 animais).
Nos grupos correspondentes ao 1° dia de prenhez, as ratas do grupo teste receberam
por gavagem o extrato na dose de 250 mg/kg de peso durante cinco dias, iniciando no
primeiro dia da prenhez, ou seja, no dia de confirmação pelo esfregaço vaginal da presença de
espermatozóides na vagina até o 5° dia após o coito e os animais do grupo controle receberam
o veículo (água) por via oral da mesma forma e no mesmo período de tempo. O primeiro dia
após o coito corresponde à presença do zigoto (uma célula no oviduto) e o quinto dia
corresponde à implantação do blastocisto no útero, ou seja, esse período é considerado como
pré-implantação (ALMEIDA; LEMONICA, 2000; CARMO; PETERS; GUERRA, 2007).
No segundo grupo correspondente ao 14° dia de prenhez o mesmo protocolo foi
repetido, os animais do grupo teste receberam por gavagem o extrato na dose de 250 mg/kg de
peso durante cinco dias, porém nesse grupo a administração foi feita a partir do décimo quarto
(14°) dia de prenhez até o décimo oitavo (18°) (SANDEEP et al., 2011; DABHADKAR;
M A T E R I A L E M É T O D O S | 69
ZADE, 2012) e os animais do grupo controle receberam o veículo (água) por via oral da
mesma forma e no mesmo período de tempo. De acordo com Carmo; Peters; Guerra (2007)
esse período corresponde ao desenvolvimento da fase embrionária até próximo ao início do
segundo estágio fetal e nascimento, considerado como o período de organogênese (19-22 dias
de prenhez).
Durante a fase de administração no primeiro grupo, os animais foram monitorados
para detecção de quaisquer anormalidades principalmente quanto à presença de sangramentos
vaginais e os animais do segundo grupo foram monitorados quanto a um possível parto
prematuro. Todos os animais foram a termo e observados até três (3) dias após o nascimento
dos filhotes.
Ao final, os seguintes parâmetros foram avaliados e comparados com o padrão
controle, dentre eles, número de abortos ou partos prematuros, quantidade de nascimento e
peso dos filhotes ao nascer, presença de malformações externas, variações de peso das ratas
durante a aplicação do extrato e veículo, e parâmetros bioquímicos como níveis de AST, ALT
e creatinina foram observados para avaliar possíveis alterações que indicassem toxicidade
após o tratamento nesses animais.
M A T E R I A L E M É T O D O S | 70
4.3 Análise Estatística
Para investigar o efeito espasmogênico do Ec-EtOH os seguintes parâmetros foram avaliados:
Amplitude máxima (Emax): corresponde ao pico máximo em amplitude de contração atingido
pelo Ec-EtOH após sua pré-incubação em um determinado período de tempo em comparação
a amplitude máxima de contração induzida pelo agonista;
Amplitude média: corresponde ao somatório de todos os picos de contrações induzidos pelo
Ec-EtOH após sua pré-incubação, dividido pelo número total desses picos em um
determinado período de tempo;
Tempo para se atingir a amplitude máxima (Tmax): corresponde ao tempo em que se
atingiu o pico máximo em amplitude de contração induzido pelo Ec-EtOH após sua pré-
incubação;
Frequência das contrações: corresponde ao somatório de todos os picos de contrações
induzidos pelo Ec-EtOH após sua pré-incubação, dividido por um determinado período de
tempo;
Duração do efeito: corresponde ao tempo que o Ec-EtOH foi capaz de induzir contrações
após sua pré-incubação;
Todos os resultados obtidos foram expressos como média ± erro padrão da média e
analisados estatisticamente empregando-se o teste “t” de Student pareado ou não pareado e
Teste Mann Whitney para avaliar os dados conforme a especificidade de cada protocolo, onde
os valores de p < 0,05 foram considerados significantes.
Todas as análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa Graph-Pad
Prism
versão 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA), disponível no laboratório
de farmacologia da UNIVASF.
RESULTADOS
R E S U L T A D O S | 72
5 RESULTADOS
5.1 Estudo da possível atividade espasmogênica do Ec-EtOH em útero isolado de rata.
5.1.1 Investigação do efeito do Ec-EtOH frente às contrações fásicas induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
O Ec-EtOH quando pré-incubado no tecido uterino das ratas na concentração de
729 µg/mL e na ausência dos agonistas foi capaz de produzir contrações de valor significante
apresentando 68,39 ± 6,1% de amplitude quando comparado com a contração fásica induzida
inicialmente por 10-2
UI/mL de ocitocina e 61,50 ± 9,0% de amplitude quando comparado
com a contração induzida por 10-5
M de acetilcolina como padrões uterotônicos (Figuras 11 A
e 11 B).
O Ec-EtOH quando pré-incubado e seguido de adição dos agonistas foi incapaz de
inibir as contrações promovidas pelos mesmos, chegando essas a 92,67 ± 4,49% da amplitude
de contração para ocitocina e 89,16 ± 8,15% da amplitude de contração para acetilcolina
(Gráficos 1 A e 1 B). Além disso, não houve diferença significativa entre os agonistas quanto
ao padrão da frequência de contração verificando que para a ocitocina a frequência chegou a
10 ± 1,8 contrações/15 minutos com uma média de 0,66 ± 0,12 contrações/minuto e para a
acetilcolina de 10 ± 2,25 contrações/15 minutos com uma média de 0,65 ± 0,15
contrações/minuto (Gráfico 2).
R E S U L T A D O S | 73
Figura 11 - Registro original do efeito espasmogênico do Ec-EtOH (729 µg/mL) frente às contrações
fásicas induzidas por10-2
UI/mL de ocitocina (A) e 10-5
M de acetilcolina (B) em útero isolado de rata.
Fonte: WINDAQ/DATAQ
A
B
R E S U L T A D O S | 74
Gráfico 1 – Efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL) frente às contrações fásicas induzidas por 10-2
UI/mL de
ocitocina (A) e 10-5
M de acetilcolina (B) em útero isolado de rata (n = 8). Colunas e barras verticais
representam a média ± e.p.m., respectivamente. ap < 0,05 e teste “t” de Student pareado
(agonista vs Ec-EtOH). bp < 0,05 (Ec-EtOH vs Ec-EtOH + agonista).
Oci Ec-EtOH Ec-EtOH + Oci 0
25
50
75
100 a
a, b
b
Co
ntr
açã
o (
%)
ACh Ec-EtOH Ec-EtOH + ACh 0
25
50
75
100 a
a, b
b
Co
ntr
açã
o (
%)
B
A
R E S U L T A D O S | 75
Gráfico 2 – Frequência das contrações induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) frente às contrações
fásicas induzidas pelos agonistas ocitocina (10-2
UI/mL) e acetilcolina (10-5
M) em útero isolado de
rata (n = 8). Colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. Teste “t” de
Student não pareado (Oci vs ACh).
E c -EtOH (729 g/mL)
Pré-incubado
Oci ACh 0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Fre
qu
ênci
a (
min
-1 )
R E S U L T A D O S | 76
5.1.2 Investigação do efeito do Ec-EtOH sobre as contrações tônicas induzidas por
10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
Ec-EtOH (729 µg/mL) foi capaz de promover relaxamento no tecido uterino de ratas
quando administrado sobre o tônus da contração induzido por 10-2
UI/mL de ocitocina
apresentando valores de 60,92 ± 15,24% e para a acetilcolina com 108,3 ± 4,25% (Gráficos 3
A e 3 B).
O Ec-EtOH também foi capaz de aumentar a frequência das contrações sobre o tônus
significativamente (Figuras 12 A e 12 B). Durante a pré-contração com acetilcolina os valores
da frequência de contração foram de 43 ± 5,1 contrações/30 minutos com uma média de 1,43
± 0,17 contrações/minuto comparado com a ocitocina os valores obtidos foram em torno de
15 ± 3,9 contrações/30 minutos com uma média de 0,5 ± 0,13 contrações/minuto (Gráfico 4).
R E S U L T A D O S | 77
Figura 12 – Registro original do efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL) sobre as contrações tônicas
induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina (A) e 10-5
M de acetilcolina (B) em útero isolado de rata.
A
B
R E S U L T A D O S | 78
Gráfico 3 – Efeito do Ec-EtOH (729 µg/mL) sobre as contrações tônicas induzidas por 10-2
UI/mL de
ocitocina (A) e 10-5
M de acetilcolina (B) em útero isolado de rata (n = 8). Símbolos e barras verticais
representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p < 0,05 e teste “t” de Student pareado
(agonista vs Ec-EtOH).
Controle (Oci) Ec-EtOH (729 g/mL) 0
25
50
75
100
125
*
Rel
ax
am
en
to (
%)
Controle (ACh) Ec-EtOH (729 g/mL) 0
25
50
75
100
125
*
*
Rel
ax
am
en
to (
%)
A
B
R E S U L T A D O S | 79
Gráfico 4 – Frequências de contrações induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) sobre as contrações
tônicas induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina e 10-5
M de acetilcolina em útero isolado de rata (n = 8).
Colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m., respectivamente. *p < 0,05 e teste “t” de
Student não pareado (Oci vs ACh).
Oci ACh 0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75 *
E c -EtOH (729 g/mL)
Sobre o tônus
Fre
qu
ênci
a (
min
-1 )
R E S U L T A D O S | 80
5.1.3 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo de
dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas do extrato frente às
contrações induzidas por 10-2
UI/mL de ocitocina ou 10-5
M de acetilcolina.
Na investigação do efeito do Ec-EtOH, na concentração de 729 µg/mL em duas
aplicações consecutivas frente às contrações induzidas pelos agonistas ocitocina (10-2
UI/mL)
e acetilcolina (10-5
M), os seguintes parâmetros, amplitude máxima (Emax), amplitude média,
frequência das contrações, tempo máximo (Tmax) para se atingir o Emax, e duração do efeito
contrátil foram analisados em dois momentos consecutivos, na primeira e na segunda
aplicação do extrato.
Na avaliação da amplitude máxima (Emax) promovida pelo Ec-EtOH, observa-se que o
mesmo foi capaz de induzir contrações com valores de Emax em torno de 71,1 ± 15,1% de
contração na primeira aplicação e de 48,8 ± 6,5% de contração na segunda aplicação
comparando com a contração máxima induzida pela ocitocina como padrão de controle. Para
a acetilcolina, o Ec-EtOH foi capaz de induzir contrações com valores de Emax chegando a
72,3 ± 7,5% de contração na primeira aplicação e a 57,0 ± 6,5% de contração na segunda
aplicação (Gráficos 5 A e 5 B).
Observando que a segunda aplicação do Ec-EtOH para ambos os agonistas induziu
contrações com Emax menores que a primeira.
R E S U L T A D O S | 81
Gráfico 5 – Amplitude máxima (Emax) do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações comparado
aos agonistas ocitocina (10-2
UI/mL) (A) e acetilcolina (10-5
M) (B) em útero isolado de rata (n=5). As
colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. a
p < 0,05, teste “t” de
Student pareado (agonista vs Ec-EtOH 1ª aplicação / agonista vs Ec-EtOH 2ª aplicação). bp < 0,05,
teste “t” de Student pareado (1ª vs 2ª aplicação Ec-EtOH).
Ocitocina 1ª aplicação 2ª aplicação
0
25
50
75
100a
a
Ec-EtOH
Em
ax
(% c
on
traçã
o O
ci)
Acetilcolina 1ª aplicação 2ª aplicação
0
25
50
75
100
a,b
a,b
a
Ec-EtOH
Em
ax
(% c
on
traçã
o A
Ch
)
A
B
R E S U L T A D O S | 82
Os valores da amplitude média das contrações produzidas pelo Ec-EtOH frente aos
agonista ocitocina (10-2
UI/mL) e acetilcolina (10-5
M) não apresentou diferença significativa
entre as aplicações. Quando a ocitocina foi o padrão de comparação, o Ec-EtOH produziu
contrações de amplitudes médias tanto na primeira quanto na segunda aplicação com valores
de 28,61 ± 7,13% de contração e 20,83 ± 4,40% de contração, respectivamente. Quando o
padrão utilizado foi a acetilcolina, os valores da amplitude média foram de 45,46 ± 4,36% de
contração na primeira aplicação e 35,52 ± 5,18% de contração na segunda aplicação (Gráficos
6 A e 6 B).
Gráfico 6 – Amplitude média de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª
aplicações comparado ao efeito contrátil de 10-2
UI/mL de ocitocina (A) e 10-5
M de acetilcolina (B)
em útero isolado de ratas (n=5). As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m,
respectivamente. Teste “t” de Student pareado (1ª aplicação do Ec-EtOH vs 2ª aplicação do Ec-EtOH).
1ª aplicação 2ª aplicação
0
10
20
30
40
50
Ec-EtOH
Am
pli
tud
e m
édia
(% c
on
traçã
o O
ci)
1ª aplicação 2ª aplicação
0
10
20
30
40
50
Ec-EtOH
Am
pli
tud
e m
édia
(% c
on
traçã
o A
Ch
)
B
A
R E S U L T A D O S | 83
Avaliando a frequência de contração, tanto na primeira quanto na segunda aplicação do
Ec-EtOH os valores não apresentaram diferença significativa.
Na presença de ocitocina o Ec-EtOH, na concentração de 729 µg/mL, atingiu valores
correspondentes a 24 ± 3 contrações/30 minutos correspondendo a 0,80 ± 0,10
contrações/minuto na primeira aplicação e para a acetilcolina os valores foram de 29 ± 2
contrações/30 minutos correspondendo a 0,98 ± 0,06 contrações/minuto. Na segunda
aplicação, para ocitocina os valores foram de 25,5 ± 7 contrações/30 minutos equivalendo a
0,85 ± 0,23 contrações/minuto e para a acetilcolina de 25,5 ± 5,1 contrações/30 minutos
equivalendo a 0,85 ± 0,17 contrações/minutos (Gráficos 7 A e 7 B).
Gráfico 7 – Frequência de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações
na presença de ocitocina (10-2
UI/mL de) (A) e acetilcolina (10-5
M) (B) em útero isolado de ratas
(n=5). As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de
Student pareado (1ª aplicação do Ec-EtOH vs 2ª aplicação do Ec-EtOH).
1ª aplicação 2ª aplicação0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
Ec-EtOH
Con
trole
Oci
Fre
qu
ênci
a (
min
-1)
1ª aplicação 2ª aplicação 0.0 0.1
0.2 0.3
0.4 0.5
0.6 0.7
0.8 0.9
1.0
1.1
Ec -EtOH
Co
ntr
ole
AC
h
Fre
qu
ênci
a (
min
-1
)
A
B
R E S U L T A D O S | 84
Na investigação do tempo máximo (Tmax) em que ocorreu o Emax, nos tecidos pré-
contraídos tanto com ocitocina quanto com acetilcolina, o Tmax para a primeira aplicação,
mostrou-se mais rápido que para a segunda. Na presença de ocitocina, o Tmax para atingir o
Emax na primeira aplicação do Ec-EtOH (729 µg/mL) foi de 54,00 ± 19,81 segundos e na
presença da acetilcolina a primeira aplicação do Ec-EtOH alcançou Emax em 91,20 ± 30,53
segundos. Para a segunda aplicação, o Emax obtido para o controle com ocitocina foi de 156,8
± 25,49 segundos e para acetilcolina como controle foi de 167,0 ± 70,61 segundos. Nesse
caso, o Tmax na presença da ocitocina apresentou diferença significativa em relação à
acetilcolina (Gráficos 8 A e 8 B).
Gráfico 8 – Tmax para atingir o Emax do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações na presença
de ocitocina (10-2
UI/mL) (A) e acetilcolina (10-5
M) (B) em útero isolado de ratas (n=5). As colunas e
barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. *p < 0,05, teste “t” de Student pareado
(1ª aplicação do Ec-EtOH vs 2ª aplicação do Ec-EtOH).
1ª aplicação 2ª aplicação
0
50
100
150
200
250
*
Ec -EtOH
Co
ntr
ole
Oci
T m
ax (s
)
1ª aplicação 2ª aplicação
0
50
100
150
200
250
Ec -EtOH
Co
ntr
ole
AC
h
T m
ax (
s)
A
B
R E S U L T A D O S | 85
O tempo médio de duração do efeito contrátil do Ec-EtOH tanto na primeira aplicação
quanto na segunda para a ocitocina corresponderam a 12,60 ± 4,52 minutos e
14,00 ± 4,52 minutos, respectivamente. Na presença da acetilcolina os valores foram
12,20 ± 4,52 minutos e 11,40 ± 4,73 minutos não havendo diferença significativa entre eles
(Gráficos 9 A e 9 B).
Gráfico 9 – Duração do efeito contrátil do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações na
presença de 10-2
UI/mL de ocitocina (A) e 10-5
M de acetilcolina (B) em útero isolado de ratas (n=5).
As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student
pareado (1ª aplicação do Ec-EtOH vs 2ª aplicação do Ec-EtOH).
1ª aplicação 2ª aplicação0
5
10
15
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Ec-EtOH
Con
trole
Oci
Du
raçã
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1ª aplicação 2ª aplicação0
5
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Ec-EtOH
Con
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o d
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min
-1)
A
B
R E S U L T A D O S | 86
5.1.4 Investigação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH e o possível processo de
dessensibilização de receptores após aplicações consecutivas frente à contração induzida
por 10-2
UI/mL de ocitocina em tecido uterino de ratas após o parto.
Na investigação do efeito do Ec-EtOH, na concentração de 729 µg/mL em duas
aplicações consecutivas frente à contração induzida por ocitocina (10-2
UI/mL) sobre o tecido
uterino da rata no estado de pós-parto, os seguintes parâmetros foram analisados: amplitude
máxima (Emax), amplitude média e frequência das contrações.
O Ec-EtOH na ausência do agonista (ocitocina) foi capaz de induzir contrações com
Emax chegando a 47,43 ± 10,54 % de contração durante a primeira aplicação e 76,53 ± 6,70%
de contração durante a segunda aplicação. Comparando o padrão das contrações, observou-se
que houve diferença significativa apenas entre a ocitocina e cada aplicação, não havendo
diferença significativa entre as aplicações (Gráfico 10).
Gráfico 10 – Amplitude máxima (Emax) do Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações
comparado à ocitocina (10-2
UI/mL) em útero isolado de rata no pós-parto (n=6). As colunas e barras
verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. a
p < 0,05, teste “t” de Student pareado
(agonista vs Ec-EtOH 1ª aplicação / agonista vs Ec-EtOH 2ª aplicação). Teste “t” de Student pareado
(1ª aplicação Ec-EtOH vs 2ª aplicação Ec-EtOH).
Ocitocina 1ª aplicação 2ª aplicação0
25
50
75
100a
a
a
Ec-EtOH
Em
ax (
% c
on
traçã
o O
ci)
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Quando avaliado a amplitude média das contrações produzida pelo Ec-EtOH, o mesmo
induziu contrações de 16,4 ± 4,5% na primeira aplicação e de 23,6 ± 4% na segunda não
havendo diferença significativa entre as aplicações (Gráfico 11).
Gráfico 11 – Amplitude média induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações
comparado ao efeito contrátil de 10-2
UI/mL de ocitocina em útero isolado de ratas no pós-parto (n=6).
As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student
pareado (1ª aplicação do Ec-EtOH vs 2ª aplicação do Ec-EtOH).
1ª aplicação 2ª aplicação0
10
20
30
Ec-EtOH
Am
pli
tud
e M
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(% c
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traçã
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R E S U L T A D O S | 88
Na observação do padrão da frequência das contrações produzidas pelo Ec-EtOH na
presença de ocitocina, os valores para a primeira aplicação foram de 9,3 ± 4 contrações/30
minutos correspondendo a 0,31 ± 0,12 contrações/minuto e para a segunda aplicação de
8,4 ± 3 contrações/30 minutos correspondendo a 0,28 ± 0,10 contrações/minuto, também não
demonstrando diferenças significativas entre elas (Gráfico 12).
Gráfico 12 – Frequência da contração induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª e 2ª aplicações
na presença de ocitocina (10-2
UI/mL) em útero isolado de ratas no pós-parto (n=6). As colunas e
barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student pareado
(1ª aplicação do Ec-EtOH vs 2ª aplicação do Ec-EtOH).
1ª aplicação 2ª aplicação0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Ec-EtOH
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Avaliando os protocolos realizados e os parâmetros utilizados como Emax, amplitude
média e frequência de contração, decidiu-se fazer uma comparação entres esses parâmetros
para avaliar como se comportava o Ec-EtOH em tecido uterino de ratas não grávidas com o
tecido uterino das ratas após o parto.
Na avaliação do Emax, o Ec-EtOH desencadeou contrações de amplitudes diferentes entre
os tecidos uterinos de ratas não grávidas e pós-parto tendo como agonista padrão a ocitocina.
Os valores do Emax entre os tecidos na primeira aplicação foram de 71,10 ± 15,1% para não
grávidas e 47,43 ± 10,5% para o pós-parto não havendo diferença significativa entre eles. No
entanto, a segunda aplicação do Ec-EtOH nos tecidos apresentou um aumento no padrão e
uma diferença significativa entre eles, para não grávidas o valor do Emax chegou a
48,83 ± 6,5% enquanto que para o pós-parto foi de 76,53 ± 6,7%, havendo diferença
significativa entre os tecidos (Gráfico 13).
Podendo observar que o padrão de contração do extrato muda conforme o estado
fisiológico do útero.
Gráfico 13 – Comparação entre as amplitudes máximas (Emax) do Ec-EtOH (729 µg/mL) em suas 1ª e
2ª aplicações com a ocitocina (10-2
UI/mL) em útero isolado de rata não grávido (n=5) e pós-parto
(n=6). As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. a
p < 0,05, teste “t”
de Student pareado (agonista vs não grávida 1ª aplicação/ agonista vs não grávida 2ª aplicação/
agonista vs pós-parto 1ª aplicação/ agonista vs pós-parto 2ª aplicação/ não grávida 1ª aplicação vs não
grávida 2ª aplicação/ pós-parto 1ª aplicação vs pós-parto 2ª aplicação). bp < 0,05, teste “t” de Student
não pareado (não grávida 1ª aplicação vs pós-parto 1ª aplicação / não grávida 2ª aplicação vs pós-parto
2ª aplicação).
Ocitocina 1ª aplicação 2ª aplicação 1ª aplicação 2ª aplicação0
25
50
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a, b
a, b
a
Não grávida Pós-parto
Em
ax (
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A amplitude média das contrações não apresentou diferença significativa entre as
aplicações nem entre as preparações de tecido uterino, mantendo um padrão com valores na
primeira aplicação de 28,61 ± 7,3% para o tecido uterino não gravídico e 13,64 ± 5% em
tecido uterino pós-parto, já para a segunda aplicação os valores foram de 20,83 ± 4,4% para o
não gravídico e 20,76 ± 4,2% para o pós-parto (Gráfico 14).
Gráfico 14 – Comparação entre as amplitudes médias induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em sua 1ª
e 2ª aplicações com o efeito contrátil de 10-2
UI/mL de ocitocina em útero isolado de rata não grávido
(n=5) e pós-parto (n=6). As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente.
Teste “t” de Student pareado (não grávida 1ª aplicação vs não grávida 2ª aplicação/pós-parto 1ª
aplicação vs pós-parto 2ª aplicação). Teste “t” de Student não pareado (não grávida 1ª aplicação vs
pós-parto 1ª aplicação / não grávida 2ª aplicação vs pós-parto 2ª aplicação).
1ª aplicação 2ª aplicação 1ª aplicação 2ª aplicação0
10
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Não grávida Pós-parto
Am
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A frequência das contrações apresentou diferença significativa entre as aplicações nos
tecidos não gravídico e pós-parto.
Em tecido uterino não gravídico o valor da frequência de contração durante a primeira
aplicação foi de 24 ± 3 contrações/30 minutos correspondendo a cerca de 0,80 ± 0,10
contrações/minuto e em tecido uterino pós-parto de 9,3 ± 4 contrações/30 minutos
correspondendo a 0,31 ± 0,12 contrações por minuto. Durante a segunda aplicação os valores
foram de 25,5 ± 7 contrações/30 minutos correspondendo a 0,85 ± 0,23 contrações/minuto em
tecido uterino não gravídico e de 8,4 ± 3 contrações/30 minutos correspondendo a 0,28 ± 0,10
contrações por minuto em tecido uterino pós-parto (Gráfico 15).
Gráfico 15 – Comparação entre as frequência de contrações induzidas pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) em
sua 1ª e 2ª aplicações na presença de 10-2
UI/mL de ocitocina em útero isolado de rata não grávido
(n=5) e pós-parto (n=6). As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. a,b
p < 0,05, teste “t” de Student não pareado (não grávida 1ª aplicação vs pós-parto 1ª aplicação / não
grávida 2ª aplicação vs pós-parto 2ª aplicação).
1ª aplicação 2ª aplicação 1ª aplicação 2ª aplicação0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1
a
ba
b
Não grávida Pós-parto
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min
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R E S U L T A D O S | 92
5.2. Investigação do possível mecanismo de ação espasmogênica do Ec-EtOH em útero
isolado de rata.
5.2.1 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença de
atropina.
Para a avaliação do efeito do Ec-EtOH na ausência e na presença de atropina os
seguintes parâmetros, amplitude média, Emax, e frequência de contração, foram avaliados
comparando com acetilcolina como controle. A atropina, na concentração de 10 µM
antagonizou significativamente a contração induzida por 10-5
M de acetilcolina apresentando
valores de 12,63 ± 7,03% como era previsto. O Ec-EtOH quando adicionado às cubas, e na
ausência da atropina, induziu contrações de amplitude média correspondente a 60 ± 8 %
comparando ao agonista acetilcolina como controle. Quando a atropina foi pré-incubada e
seguida de adição do Ec-EtOH, diferentemente do apresentado com acetilcolina, a atropina
não foi capaz de antagonizar de forma significativa a amplitude média das contrações
promovidas pelo Ec-EtOH chegando a valores de 39,42 ± 11,5% (Gráfico 16).
Com relação ao Emax induzido pelo Ec-EtOH, o valor obtido apresentou diferença
significativa quando comparados na ausência e na presença da atropina. O Emax na ausência da
atropina chegou a 58,40 ± 9,43% de contração enquanto que na presença esse valor chegou a
34,47 ± 7,34% de contração (Gráfico 17), sugerindo que há participação dos receptores
muscarínicos no desencadeamento das contrações induzidas pelo Ec-EtOH.
R E S U L T A D O S | 93
Gráfico 16 – Amplitude média de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na
presença da atropina na concentração de 10 µM em útero isolado de rata (n=9). As colunas e barras
verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. ap < 0,05, teste “t” de Student pareado (ACh
vs ACh + atropina /ACh vs Ec-EtOH/ACh vs Ec-EtOH+ atropina).
Gráfico 17 – Emax induzido pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença de atropina na
concentração de 10 µM em útero isolado de rata (n=9). As colunas e barras verticais representam a
média ± e.p.m, respectivamente. *p< 0,05 e Teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-EtOH +
Atropina).
ACh ACh + Atropina Ec-EtOH Ec-EtOH + Atropina 0
25
50
75
100
a
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a
Am
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(% c
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tração A
Ch
)
a
Ec-EtOH Ec-EtOH + Atropina 0
10
20
30
40
50
60
70
*
E m
ax (
%)
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Nesse mesmo protocolo a frequência de contração produzida pelo Ec-EtOH na ausência
e na presença da atropina também foi comparada. Na ausência da atropina, a frequência das
contrações desencadeadas após a administração do Ec-EtOH correspondeu a
18 ± 3,9 contrações/30 minutos equivalendo a 0,60 ± 0,13 contrações/minuto enquanto que na
presença da atropina os valores corresponderam a 18,3 ± 9,3 contrações/30 minutos
equivalendo a 0,61 ± 0,31 contrações/minuto, não havendo diferença significativa entre as
frequências tanto na ausência quanto na presença de atropina (Gráfico 18).
Gráfico 18 – Frequência das contrações induzidas pelo do Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na
presença da atropina na concentração de 10 µM em útero isolado de rata (n=9). As colunas e barras
verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-
EtOH + atropina).
Ec-EtOH Ec-EtOH + atropina 0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
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R E S U L T A D O S | 95
5.2.2 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença de
indometacina.
Para investigar o efeito do Ec-EtOH na ausência e na presença de indometacina, usando
a ocitocina (10-2
UI/mL) como controle, os seguintes parâmetros de avaliação como a
amplitude média, Emax e a frequência de contração foram observados. A indometacina na
concentração de 60 µM não foi capaz de inibir a contração induzida por 10-2
UI/mL de
ocitocina apresentando valores de 101 ± 16,23% de contração. Na avaliação da amplitude
média das contrações os valores apresentaram diferença significativa. Na ausência da
indometacina o Ec-EtOH (729 µg/mL) induziu contrações com amplitude média
correspondente a 68,12 ± 6,32% enquanto que, na presença, os valores alcançados foram de
31,48 ± 12,54% (Gráfico 19).
Avaliando o Emax produzido pelo Ec-EtOH, os valores obtidos tanto na ausência quanto
na presença da indometacina não apresentaram uma diferença significativa. O Ec-EtOH
atingiu 74,52 ± 5,22% de contração máxima na ausência da indometacina e 50,29 ± 14,21%
na presença (Gráfico 20). Quanto à frequência de contração produzida pelo Ec-EtOH, na
ausência da indometacina chegou a 19,5 ± 6 contrações/30 minutos correspondendo a
0,65 ± 0,2 contrações/minuto enquanto que na presença chegou a 12 ± 4,5 contrações/30
minutos correspondendo a 0,40 ± 0,15 contrações/minuto não havendo diferença entre elas
(Gráfico 21). Analisando os dados em conjunto, podemos concluir que a contração induzida
pelo Ec-EtOH parece estar relacionada com a produção de prostaglandinas no tecido uterino.
R E S U L T A D O S | 96
Gráfico 19 – Amplitude de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de indometacina na concentração de 60 µM em útero isolado de rata (n=7). As colunas e barras
verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. ap< 0,05 e teste “t” de Student pareado
(Oci vs Ec-EtOH) bp< 0,05 e teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-EtOH + indometacina).
Oci Oci + indo Ec-EtOH Ec-EtOH + indo 0
25
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125
b
a
a, b
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Gráfico 20 – Emax induzido pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença de indometacina na
concentração de 60 µM em útero isolado de rata (n=7). As colunas e barras verticais representam a
média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-EtOH + indometacina).
Gráfico 21 – Frequência de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de indometacina na concentração de 60 µM em útero isolado de rata (n=7). As colunas e barras
verticais representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs
Ec-EtOH + indometacina).
Ec-EtOH Ec-EtOH + indo 0
10
20
30
40
50
60
70
80
E m
ax (%
)
Ec-EtOH Ec-EtOH + indo 0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
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min
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5.2.3 Avaliação do efeito espasmogênico do Ec-EtOH na ausência e na presença de
atosiban.
Para a investigação do efeito do Ec-EtOH tanto na ausência quanto na presença de
atosiban na concentração de 10-7
M usando 10-2
UI/mL de ocitocina como padrão de
contração, os parâmetros: amplitude média de contração, amplitude máxima (Emax) e
frequência de contração foram avaliados. O atosiban reduziu a amplitude de contração
induzida por 10-2
UI/mL de ocitocina, o que era esperado apresentando 62,22 ± 4,35% de
contração comparando com o controle inicial (100%). Na avaliação da amplitude média das
contrações, na ausência e na presença do atosiban, os valores apresentaram diferença
significativa. Na adição do Ec-EtOH, na concentração de 729 µg/mL às cubas, o mesmo
induziu contrações de amplitudes médias correspondentes a 68,12 ± 6,32% de contração na
ausência do atosiban enquanto que na presença do antagonista dos receptores para ocitocina, a
amplitude de contração promovida por Ec-EtOH foi reduzida por volta de 50% quando
comparado com a contração inicial induzida pelo extrato na ausência do antagonista,
chegando a valores de 30,54 ± 4,29% de contração, sugerindo que o padrão de contração
induzido pelo Ec-EtOH pode ser pela a ativação dos receptores para ocitocina no útero
(Gráfico 22).
No entanto, comparando o Emax promovido pelo Ec-EtOH, os valores obtidos na
ausência e na presença do atosiban foram de 44,90 ± 5,50% de contração e 51,23 ± 4,76% de
contração respectivamente não apresentando diferença significativa (Gráfico 23). Os valores
para o padrão da frequência de contração produzido pelo Ec-EtOH na ausência e na presença
do atosiban também não apresentaram diferença significativa entre eles chegando a
10,2 ± 3 contrações/30 minutos correspondendo a 0,34 ± 0,1 contrações/minuto e de
15 ± 4 contrações/30 minutos correspondendo a 0,5 ± 0,13 contrações/minuto,
respectivamente (Gráfico 24).
R E S U L T A D O S | 99
Gráfico 22 – Efeito da Ocitocina (10-2
UI/mL) e do Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de atosiban na concentração de 10-7
M em útero isolado de rata (n=7). As colunas e barras verticais
representam a média ± e.p.m, respectivamente. ap < 0,05, teste “t” de Student pareado (Oci vs Oci +
atosiban/ Oci vs Ec-EtOH). bp < 0,05, teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-EtOH + atosiban).
Oci Oci + atosiban Ec-EtOH Ec-EtOH + atosiban 0
25
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a
a, b
a
b
Am
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(% c
on
tração O
ci)
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Gráfico 23 – Emax induzido pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença de atosiban na
concentração de 10-7
M em útero isolado de rata (n=7). As colunas e barras verticais representam a
média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-EtOH + atosiban).
Gráfico 24 – Frequência de contração induzida pelo Ec-EtOH (729 µg/mL) na ausência e na presença
de atosiban na concentração de 10-7
M em útero isolado de ratas (n=7). As colunas e barras verticais
representam a média ± e.p.m, respectivamente. Teste “t” de Student pareado (Ec-EtOH vs Ec-EtOH +
atosiban).
Ec-EtOH Ec-EtOH + atosiban 0
10
20
30
40
50
60
E m
ax (
%)
Ec-EtOH Ec-EtOH + atosiban 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65
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min
-1 )
R E S U L T A D O S | 101
5.3 Investigação da possível atividade espasmogênica do Ec-EtOH em diferentes
períodos de gestação das ratas.
O Ec-EtOH administrado por gavagem na dose de 250mg/kg de peso nos dois grupos de
animais testes não foi capaz de promover aborto ou antecipar o parto nem induziu má
formação nos filhotes. O número de animais nascidos vivos foi superior ao número de
animais nascidos mortos ou que morreram após o nascimento e nenhum deles apresentou
algum tipo de malformação aparente. Todas as ratas, tanto do grupo controle quanto do grupo
teste levaram a prenhez a termo.
No grupo controle, a média de dias para o nascimento dos filhotes foi de
21,6 ± 0,68 dias e a média de nascimentos entre as ratas foi de 10,00 ± 0,82 filhotes e dentre
eles houveram 4 mortes após o nascimento.
No grupo teste do 1º dia de prenhez, a média de dias para o nascimento dos filhotes foi
de 21,80 ± 0,73 dias com uma média de 7 ± 1,5 filhotes por rata sem mortes entre eles e não
houve diferença significativa entre o numero de nascimentos comparando com o grupo
controle. Nesse aspecto, acredita-se na hipótese de que o Ec-EtOH, na dose administrada, é
incapaz de induzir o aborto ou de diminuir consideravelmente o número de implantações no
período inicial da prenhez.
No grupo teste do 14° dia de prenhez, a média de dias para o nascimento dos filhotes foi
de 21,20 ± 0,58 dias e a média de nascimento entre as ratas foi de 8,80 ± 2,01 filhotes dentre
eles 2 filhotes morreram após o nascimento. Não houve diferença significativa entre o número
de nascimentos comparado ao controle, sugerindo assim que a dose administrada (250mg/kg)
do Ec-EtOH também não influenciou no desenvolvimento da gestação e nem causou o parto
prematuro desses animais (Gráficos 25 A e 25 B).
R E S U L T A D O S | 102
Gráfico 25 – Média do número de nascimentos entre os grupos controle e teste 1°dia de prenhez e
controle e teste 14° dia de prenhez. As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m,
respectivamente. Teste Mann Whitney (controle vs tratamento).
Controle Tratado (1º-5º dias)0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
N°
de
filh
ote
s (t
rata
dos
1º
dia
)
Controle Tratado (14º-18º dias)0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
N°
de
filh
ote
s (t
rata
dos
14º
dia
)
A
B
R E S U L T A D O S | 103
O peso das ratas foi mensurado durante os dias de aplicação do extrato e do veículo e a
média do peso foi calculada comparando os animais teste com os animais controle. O peso,
não apresentou diferença significativa entre os grupos controle e tratado. No grupo
correspondente ao1° dia de prenhez a média do peso do grupo controle foi de 272 ± 7 g e para
o grupo teste de 259 ± 10 g. No grupo correspondente ao 14° dia de prenhez a média de peso
do grupo controle foi de 281,4 ± 4,2 g e para o grupo teste de 279 ± 5,3 g, podendo sugerir
que o Ec-EtOH não influencia o ganho ou a perda de peso na dose administrada (Gráficos 26
A e 26 B).
Gráfico 26 – Padrão do peso das ratas durante os dias de gavagem. Símbolos e barras verticais
representam a média ± e.p.m., respectivamente. Teste “t” de Student não pareado (controle 1º dia vs
tratamento1º dia/ controle 14º dia vs tratamento14º dia).
0 1 2 3 4 5 6 7 8
220
240
260
280
300Controle
Tratado 1° dia Prenhez
Dias de gavagem
Pes
o (
g)
13 14 15 16 17 18 19 20 21
225
250
275
300
325Controle
Tratado 14° Dia Prenhez
Dias de gavagem
Pes
o (
g)
A
B
R E S U L T A D O S | 104
Quanto ao peso corporal dos filhotes, a média registrada para o grupo controle foi de
5,6 ± 0,13 gramas e quando avaliado os dois grupos testados, houve diferenças significativa,
com aumento de peso apenas no grupo do 1º dia de prenhez, onde a média de peso ao nascer
foi de 6,19 ± 0,22 gramas, enquanto que a média do grupo correspondente ao 14º dia de
prenhez foi de 5,95 ± 0,12 gramas quando comparados com o controle (Gráficos 27 A e 27
B).
Gráfico 26 – Média do peso dos filhotes ao nascer entre os grupos contorle e tteste 1° dia de prenhez e
controle e teste 14° dia de prenhez. As colunas e barras verticais representam a média ± e.p.m,
respectivamente. Teste “t” Student não pareado (controle vs tratado).
Controle Tratado (1º-5º dias)0
1
2
3
4
5
6
7
8
*
Pes
o d
os
filh
ote
s (g
)
Controle Tratado (14º-18º dias)0
1
2
3
4
5
6
7
8
Pes
o d
os
filh
ote
s (g
)
A
B
R E S U L T A D O S | 105
Os parâmetros bioquímicos como AST, ALT e creatinina foram analisados para avaliar
possíveis alterações que indicassem toxicidade após o tratamento nas ratas dos grupos testes
de acordo com as tabelas abaixo. Quando comparando entre eles, após análise dos resultados,
foi possível concluir os grupos testados não apresentaram diferença significativa quando
comparado ao controle indicando assim não haver toxicidade induzida pelo Ec-EtOH na dose
administrada (Tabelas 2 e 3).
Tabela 2: Parâmetros bioquímicos obtidos das ratas do grupo do 1° dia de prenhez tratadas com o Ec-
EtOH durante 5 dias.
Parâmetros Tratamento
Controle Experimental
AST/TGO (U/L) 182,4 ± 47,92 142,5 ± 30,44
ALT/TGP (U/L) 122,3 ± 25,29 173,9 ± 39,29
CREATININA (mg/dL) 0,80 ± 0,07 0,78 ± 0,02
Os valores estão expressos como média ± e.p.m. (n = 5). Teste “t” de Student não pareado.
Tabela 3: Parâmetros bioquímicos obtidos das ratas do grupo do 14° dia de prenhez tratadas com o
Ec-EtOH durante 5 dias.
Parâmetros Tratamento
Controle Experimental
AST/TGO (U/L) 213,5 ± 45,48 215,3 ± 19,31
ALT/TGP (U/L) 150,8 ± 20,90 116,3 ± 16,19
CREATININA (mg/dL) 0,44 ± 0,12 0,42 ± 0,11
Os valores estão expressos como média ± e.p.m. (n = 10). Teste “t” de Student não pareado.
DISCUSSÃO
D I S C U S S Ã O | 107
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho teve como objetivo investigar o possível efeito espasmogênico do
extrato etanólico bruto de Erythroxylum caatingae Plowman (Ec-EtOH) em útero isolado de
rata. O principal resultado obtido nesse estudo é que o Ec-EtOH apresenta efeito
espasmogênico semelhante ao de agonistas usados na terapêutica tradicional e parece que esse
efeito é mediado, pelo menos em parte, pela ativação dos receptores muscarínicos, pela
liberação de prostaglandinas e ativação dos receptores para ocitocina (OTR) no útero.
Os ensaios preliminares realizados, utilizando o tecido uterino de ratas virgens pré-
tratadas com dietilestilbestrol, tiveram como objetivo determinar se o Ec-EtOH de fato
apresentava efeito espasmogênico ou espasmolítico sobre esse órgão em comparação com os
agonistas, ocitocina e acetilcolina, usados como padrão. Os resultados obtidos inicialmente
mostraram que o Ec-EtOH apresentou efeito espasmogênico significativo quando comparado
às contrações iniciais induzidas pelos agonistas utilizados como padrão uterotônico.
Para avaliação da ação espasmolítica do Ec-EtOH no tecido uterino investigou-se a
possível ação inibitória do extrato frente às contrações induzidas pelos agonistas citados
anteriormente, sendo então observado que o Ec-EtOH na presença de ocitocina ou acetilcolina
não foi capaz de inibir a contração promovida por esses agonistas, além disso, o extrato não
exibiu diferença no padrão da contração independentemente do agente uterotônico utilizado
bem como da ausência ou presença dos mesmos (Gráfico 1).
No mesmo protocolo analisou-se o padrão de resposta Ec-EtOH utilizando como
parâmetro de avaliação a frequência de contrações produzidas pelo extrato tanto na ausência
quanto na presença dos agonistas. Uma vez que não existiu qualquer diferença no padrão da
contração durante a avaliação inicial da ação do Ec-EtOH, independentemente do agente
uterotônico utilizado, seria de se esperar o mesmo para as frequências de contração nas
mesmas condições. Como pode ser observado no gráfico 2 que há semelhança entre os
padrões das frequências produzidas pelo extrato entre os agonistas.
Diversos estudos mostram a ação de plantas medicinais com atividade uterotônica ou
ocitócita como os estudos com Agapanthus africanus e Pentanisia prunelloides que
apresentam atividade contracturante do músculo liso uterino quando administradas
diretamente no tecido e quando os extratos foram pré-incubados, aumentaram a resposta
inicial do útero principalmente frente à ocitocina (KAIDO et al., 1997). Os extratos de Euclea
divinorum e Ricinus communis aumentaram as frequências de contrações em tiras uterinas de
coelhas (KAINGU; ODUMA; KANUI, 2012). Outras inúmeras espécies de plantas têm sido
D I S C U S S Ã O | 108
descritas na literatura também como uterotônicas ou uterotônicas, por exemplo, Matricaria
chamomilla, Calendula officinalis, Celosia cristata, Plantago lanceolata L., Plantago major
L., Symphytum officinale, Capsella bursa pastoris, Hypericum perforatum e Clivia miniata
(GRUBER; O'BRIEN, 2011; SHIPOCHLIEV, 1981, VEALE; OLIVER; HAVLIK, 2000).
Fisiologicamente a contração do músculo liso se dá por intermédio do Ca2+
, onde o
aumento desse íon no meio intracelular é responsável por induzir os mecanismos que levam a
contração (SOMLYO; SOMLYO, 1994), nesse aspecto, comparando os efeitos do Ec-EtOH
podemos sugerir que o modo de atuação do extrato é semelhante ao que causa a ativação da
mecânica contrátil com aumento do íon Ca2+
no meio intracelular. Sabe-se que muitos tipos
diferentes de receptores acoplados à proteína G (GPCR), além de outros processos com a
mudança no Vm, estão envolvidos diretamente na inicialização da contração uterina,
desencadeando todo um processo que permeia a hidrólise do IP3, a ligação ao seu receptor no
RS, a liberação de Ca2+
i, e assim sucedendo aos demais eventos que levam a contração do
músculo liso (AGUILAR; MITCHELL, 2010; WRAY et al., 2001).
Em ambos os casos descritos acima a contração é promovida ou por meio do
acoplamento entre o agonista e seus receptores na membrana celular e dentre os principais
receptores associados ao útero estão a prostaglandina FP e receptores EP3 (CHEN et al.,
1998; TUNARU et al., 2012), receptores de endotelina ETA (RAE; CALIXTO;
D'ORLEANS-JUSTE, 1993), receptores M3 muscarínicos (DORJE et al., 1990) e receptores
de ocitocina (OTR) (MacDONALD, 2013), ou a partir da despolarização ou mudança de Vm
induzida inicialmente por estimulação elétrica levando ao aumento na concentração
extracelular de K+ e causando aumento do influxo de Ca
2+ por meio dos Cav (NOBLE et al.,
2009; REMBOLD, 1996; WRAY et al., 2001), mecanismos estes que, inicialmente, não se
pode determinar por qual deles o Ec-EtOH estaria diretamente relacionado.
Outro aspecto importante é que a contração no músculo liso em resposta a vários
agentes contráteis pode se apresentar frequentemente composta por duas fases: um
componente fásico caracterizado pela condição rápida, sendo essa condição atribuída a uma
liberação de Ca2+
do RS e um componente tônico que, por sua vez, apresenta-se mais lento,
dependendo da entrada de Ca2+
após a despolarização (McCARRON et al., 2002).
O útero é verdadeiramente um dos únicos órgãos que possuem os dois componentes
atuando de forma distinta, em determinadas fases ele exibe contrações do tipo fásicas e em
outras exibe contrações do tipo tônicas (YOUNG, 2007), e esta resposta bifásica pode ser
devido à fonte de Ca2+
no músculo liso, proveniente dos estoques intracelulares e do líquido
extracelular.
D I S C U S S Ã O | 109
Com base no mecanismo de ação da contração uterina, ora fásico, ora tônico, decidiu-se
investigar o possível efeito do Ec-EtOH sobre o tônus da contração induzida por ocitocina e
acetilcolina. Observou-se que o Ec-EtOH (729 µg/mL) apresentou efeito relaxante
significativo sobre as contrações induzidas por ocitocina (60,92 ± 15,24% de relaxamento
máximo) e acetilcolina (108,3 ± 4,25% de relaxamento máximo), mostrando uma diferença
estatística significativa entre esses valores, sendo menos efetivo quando o agonista padrão foi
a ocitocina (Gráfico 3) da mesma forma o padrão da frequência de contração também foi
alterado, observando que o extrato aumentou a frequência de contração quando o agonista foi
a acetilcolina (Gráfico 4). Nesse aspecto, como a composição do Ec-EtOH ainda está sendo
elucidada, espera-se que os vários componentes contidos no extrato bruto de Erythroxylum
caatingae Plowman possam ter alvos farmacológicos diversificados e, assim, apresentar
diferentes efeitos, simultaneamente uterotônico e relaxante.
Exemplos de extrato de uma mesma planta que apresenta ações diversificadas têm sido
descritos na literatura, como o extrato hidroalcoólico das partes aéreas de Dendrophthoe
falcata, que apresentam atividade estrogênica quando administrado sozinho, e quando
administrado concomitantemente com etinilestradiol exibe ligeira atividade antiestrogênica
(PATTANAYAK; MAZUMDER, 2009).
O papel das plantas medicinais com ações contracturantes vem despertando inúmeros
estudos científicos com intuito de descobrir possíveis agentes uterotônicos que apresentem
como ponto positivo efeitos colaterais reduzidos em relação aos fármacos comumente usados
e em alguns estudos o papel dessas terapias alternativas têm demonstrado efeitos
significativos. Os experimentos in vitro utilizando o útero de ratas mostraram que os extratos
aquosos de folhas de Bidens pilosa e Luffa cylindrica aumentaram a motilidade uterina,
sugerindo que ambos possuem ação ocitócita, sendo um aspecto a ser considerado para o uso
terapêutico dos fitoterápicos no parto (KAMATENESI-MUGISHA et al., 2007).
Seguindo o estudo, em outro protocolo desenvolvido buscou-se avaliar como Ec-EtOH
se comportava diante de aplicações consecutivas com a mesma concentração e o efeito que
essa administração causava sobre o tecido uterino não gravídico e no pós-parto usando como
parâmetros de avaliação a amplitude máxima (Emax) e amplitude média das contrações
comparando com a contração inicial induzida por ocitocina ou acetilcolina, o tempo máximo
(Tmax) para se atingir o Emax e a duração desse efeito sobre o tecido entre as aplicações do
extrato.
Na avaliação dos parâmetros citados anteriormente, em tecido uterino não gravídico o
Ec-EtOH atingiu valores de Emax significativos durante a primeira aplicação quando
D I S C U S S Ã O | 110
comparado com os agonistas ocitocina e acetilcolina, entretanto, na segunda aplicação o
Ec-EtOH produziu contrações com amplitudes menores em relação à primeira parecendo
haver algum mecanismo de dessensibilização nesse processo (Gráficos 5). Nesse sentido,
decidiu-se avaliar o Tmax para se atingir a amplitude máxima da contração e se o mesmo
apresentaria o padrão desenvolvido pelo Emax nas duas etapas de aplicação do extrato e, como
se previa, o Tmax para se atingir o Emax na primeira aplicação foi mais rápido que para a
segunda, confirmando a suposição quanto ao processo de dessensibilização entre as
aplicações consecutivas, além disso, o padrão de comparação entre os agonistas mostrou que
o Tmax quando o tecido foi contraído inicialmente com ocitocina apresentou-se mais rápido
que para a acetilcolina (Gráficos 8).
O processo de dessensibilização dos receptores pode ser desencadeado por exposição
excessiva do tecido a ação de um agonista. A literatura exemplifica através dos ensaios feitos
sobre a pré-exposição contínua e prolongada do tecido miometrial à ocitocina, mostrando que
a partir de 3 horas de exposição a uma concentração de 10-8
mol/L in vitro, com células
cultivadas de miométrio humano, ocorria dessensibilização dos receptores de ocitocina
(OTRs) resultando em diminuição da resposta contrátil do músculo uterino por diminuição da
liberação do cálcio intracelular mediada por esse agonista e esse mecanismo era dependente
do fator tempo (ROBINSON et al., 2003).
Estudos realizados por Willets et al. (2009) indicaram que os OTRs são
dessensibilizados rapidamente nos tecidos uterinos de não grávidas mesmo em resposta a
exposições moderadas de agonistas e, recentemente, outros trabalhos confirmaram a mesma
hipótese investigando esse mesmo processo de dessensibilização na presença de
concentrações diferentes do agonista (10-10
mol/L e 10-8
mol/L) e em tempos diferentes
(1- 4 horas) com tecido miometrial de ratas, demonstrando que esta dessensibilização ocorria
com tão pouco tempo de exposição, nesse caso, em pelo menos 1 hora após o pré-tratamento,
principalmente na concentração de 10-8
mol/L de ocitocina, levando à diminuição no padrão
das contrações miometriais, mostrando nesse caso que o fator dessensibilização era
dependente da concentração e não do tempo (MAGALHÃES et al., 2009; BALKI et al.,
2012).
A dessensibilização não é desencadeada apenas por agentes uterotônicos, ocorre
também em tecidos expostos a agentes tocolíticos, por exemplo, com os β-adrenérgicos que
são agonistas amplamente utilizados para o tratamento do trabalho de parto prematuro, onde
nesse caso, a exposição contínua do miométrio à estimulação do agonista β-adrenérgico induz
a uma perda de capacidade de resposta do músculo para estes agentes demonstrando estar
D I S C U S S Ã O | 111
provavelmente relacionada com uma sub-regulação do β-receptor resultando em uma
diminuição nos possíveis locais disponíveis para a interação dos agonistas com os β-
receptores (HERMAN-GNJIDIC; MacLUSKY; LYE, 1994).
Seguindo o mesmo protocolo para avaliação das aplicações consecutivas ainda em
tecido miometrial não gravídico, o padrão da amplitude média das contrações induzidas pelo
Ec-EtOH foi comparado individualmente para cada agonista. Apesar de não apresentarem
diferença significativa, os valores numéricos para a acetilcolina na primeira aplicação do
extrato foram maiores que para a ocitocina, sendo a amplitude média a soma de todos os picos
de contrações apresentadas pelo Ec-EtOH durante um determinado período de tempo
(Gráficos 6). Nesse mesmo protocolo também não foram observadas alterações no padrão das
frequências das contrações (Gráficos 7) e nem com relação ao tempo médio de duração do
efeito contrátil do Ec-EtOH para nenhum dos agonistas (Gráficos 9). O Ec-EtOH poderia
estar promovendo a contração talvez por meio da ativação dos OTRs e, com isso levando a
uma dessensibilização de OTRs pela exposição excessiva do tecido uterino de ratas não
grávidas ao extrato de acordo com os estudos descritos anteriormente.
Ao avaliar a ação do Ec-EtOH sobre o tecido uterino de ratas no pós-parto, pode-se
observar um padrão diferente de apresentação dessas contrações em relação ao que foi
observado no protocolo anterior, no tecido não gravídico.
A diferença no padrão das contrações entre os tecidos uterinos, não grávidos e pós-
parto, pode estar relacionada ao nível de expressão dos OTR e demais receptores nos
diferentes períodos gestacionais e serem independentes da dessensibilização. As
concentrações dos receptores principalmente para a ocitocina no miométrio de rata
apresentam-se mais elevadas quanto mais próximo do parto, apresentando picos
imediatamente antes do início do trabalho de parto enquanto que os níveis de RNA
mensageiro do receptor de ocitocina em útero humano aumentam em torno de 100 vezes até
próximo a 32 semanas de gestação e 300 vezes antes do parto em comparação com o
miométrio de mulheres não grávidas (ZEEMAN; KHAN-DAWOOD; DAWOOD, 1997).
Talvez, essa variação na expressão dos receptores explique o fato do Emax e amplitude
média das contrações não apresentarem diferença significativa entre as aplicações no tecido
uterino pós-parto de ratas já que essa fase sucede ao evento do parto e, provavelmente o nível
de expressão desses receptores ainda corresponda ao que se apresenta na fase do trabalho de
parto, apesar de não serem significativa as diferenças, os valores numéricos para segunda
aplicação foram superiores em relação a primeira nos dois parâmetros (Gráficos 10 e 11).
D I S C U S S Ã O | 112
Entretanto, quando comparamos o Emax entre os tecidos uterinos não gravídicos no pós-
parto, percebe-se que houve diferença no padrão de contração produzido pelo Ec-EtOH
principalmente no tecido uterino no pós-parto, tendo o extrato produzido contrações de
amplitude máxima de valores significativos mesmo durante a segunda aplicação quando
comparados com as contrações induzidas no útero não gravídico (Gráfico 13). Outro ponto a
ser considerado é que a expressão de OTR é aumentada juntamente com outras proteínas
associadas à contração, tais como COX 2 e conexina, antes do parto, e isto pode ter papel
significativo, onde outros alvos para ação do agonista poderão estar participando do processo
de contração, assim como, mecanismos de ação diferentes podem estar envolvidos, sendo
concebível também que a reciclagem de OTRs e/ou as taxas de re-sensibilização sejam mais
rápidas durante e após o parto (WILLETS et al., 2009).
O fato do padrão da frequência de contração do Ec-EtOH ser superior em tecido uterino
não gravídico em comparação com o tecido uterino no pós-parto pode ter relação com o
estado fisiológico do tecido, o padrão de estiramento e o tipo de contração desencadeado pelo
mesmo nos diferentes estados. O útero apresenta diversas mudanças durante a fase da
gravidez, uma delas é que ele sofre um processo de estiramento necessário para conter o feto e
a placenta, e acredita-se que esse alongamento pode vir a ser um dos fatores importantes para
o controle inicial do trabalho de parto, bem como para a involução do útero no pós-parto
(WRAY, 1993). Quando o útero se torna ativo, a expulsão do feto ocorre devido a fortes
ondas contráteis organizadas e rítmicas e nesse aspecto, o nível de estiramento do miométrio
pode determinar principalmente a frequência da contração promovida por este órgão
(RIEMER; HEYMANN, 1998).
É sabido também que durante as fases de expulsão do feto e no pós-parto o útero
desenvolve padrões de contração mais predominantemente do tipo tônica que tem como
propósito, além da expulsão do feto, favorecer a involução do órgão para retorno ao estado
normal (YOUNG, 2007), nesse caso pode-se supor que a forma de atuação do Ec-EtOH no
tecido uterino pós-parto seria sobre essa fase tônica da contração promovendo contrações com
padrão semelhante as tônicas sustentadas o que levaria consequentemente a uma diminuição
na frequência das contrações (Gráfico 15). Kasai et al., (1995) mostrou em seu estudo que o
padrão de estiramento uterino foi capaz de modular as contrações rítmicas do útero, induzidas
pela ocitocina.
Existem diversos tipos de canais e correntes que atuam na atividade do miométrio,
porém nem todos esses canais e correntes foram caracterizados totalmente. Tal conhecimento
D I S C U S S Ã O | 113
poderia levar ao desenvolvimento de bloqueadores seletivos ou agonistas necessários para um
melhor controle da contratilidade uterina (WRAY et al., 2001).
Baseado nessa idéia sobre os tipos de canais e correntes que participariam da contração
do miométrio decidiu-se investigar qual possível mecanismo de ação estaria envolvido nas
contrações desencadeadas pelo Ec-EtOH. De início buscou relacionar se havia participação
dos receptores muscarínicos no desencadeamento das contrações induzidas pelo extrato. A
investigação foi baseada na ação do Ec-EtOH na presença e na ausência da atropina, na
concentração de 10 µM, um antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos.
A acetilcolina produz contrações uterinas através da ativação dos receptores
muscarínicos do tecido miometrial causando a liberação de cálcio intracelular e para que se
possa inibir essa contração, os antagonistas desses receptores são utilizados como padrão de
resposta, como foi feito no início do protocolo para confirmar a ação antagonista. Na
sequencia, o Ec-EtOH quando pré-incubado na ausência da atropina, induziu contrações de
amplitudes médias significativas apenas quando comparadas ao padrão uterotônico, a
acetilcolina (Gráfico 16). No entanto, ao avaliar o Emax após a adição do antagonista dos
receptores muscarínicos, na concentração de 10 µM, o Ec-EtOH modificou seu padrão de
contração exibindo um Emax reduzido quando comparado com o valor da contração na
ausência do antagonista, sugerindo então que um ou mais princípios ativos no extrato possuí
atividade agonista sobre os receptores muscarínicos uterinos semelhantes à acetilcolina, o que
levaria a diminuição do padrão de resposta do agonista na presença da atropina (Gráfico 17).
Dados na literatura apresentam ações semelhantes de diversos extratos frente ao
antagonista não seletivo dos receptores muscarínicos, como por exemplo, o pré-tratamento
com atropina (70 nM) não alterou a resposta contrátil do extrato de Clivia miniata, mas inibiu
a resposta do Agapanthus africanus em tiras de tecido uterino livres de endométrio, sugerindo
que a estimulação de receptores muscarínicos é um componente para a ação do Agapanthus
africanus e não da Clivia miniata no miométrio (VEALE; OLIVER; HAVLIK, 2000). O
mesmo grupo confirmou a ação da atropina frente às contrações induzidas apenas pelo
Agapanthus africanus em útero isolado de rata inibindo da mesma forma o padrão de
contração desse extrato (VEALE et al., 1999).
Sabemos que os mecanismos que levam a contratilidade do útero tem participação de
diversos agentes efetores, dentre eles, as prostaglandinas (PGs) desempenham um papel
importante na contratilidade uterina em várias fases do ciclo menstrual e reprodutivo. A
atividade uterina é estimulada principalmente pela PGE2 e PGF2α agindo em receptores do
tipo prostaglandina E (EP) e F (FP), respectivamente. A ativação dos receptores FP estimula
D I S C U S S Ã O | 114
fortemente o miométrio, enquanto que a ativação dos receptores de EP pode levar à contração
ou relaxamento, dependendo da expressão do subtipo EP (PALLISER et al., 2005).
Com objetivo de investigar a possível participação das prostaglandinas no mecanismo
contrátil desencadeado pelo Ec-EtOH, avaliamos a ação do extrato na presença e na ausência
da indometacina, um inibidor não seletivo da COX, que, por conseguinte, é uma ferramenta
útil para investigar a atividade farmacológica do extrato nesse tipo de protocolo.
Na ausência do inibidor não seletivo da COX o Ec-EtOH foi capaz de produzir
contrações de amplitudes médias com valores significativos quando comparado com o padrão
ocitocina. No entanto, na presença da indometacina (60 µM), o inibidor foi capaz de reduzir
significativamente o padrão de contração da amplitude média produzido pelo Ec-EtOH,
sugerindo assim, que as prostaglandinas podem estar diretamente envolvidas no mecanismo
de ação contracturante do Ec-EtOH (Gráfico 19).
Nesse mesmo protocolo, quando adicionada a ocitocina na presença da indometacina,
esse inibidor não produziu efeito sobre a contração induzida pela agonista contrátil. Segundo
Chan; Chen; Manning (1993), o mecanismo de ação da ocitocina no útero ocorre por duas
vias, uma através do acoplamento com seu receptor, causando contrações das células do
miométrio e a segunda por meio de um subtipo de receptor para promover a síntese e
liberação de prostaglandinas. Neste trabalho, o fato da indometacina não exibir qualquer
efeito sobre a contração induzida pela ocitocina no tecido uterino, pode ser devido a uma
maior expressão dos OTR em relação aos receptores de prostanóides no tecido uterino.
Outros estudos corroboram sobre o papel das prostaglandinas na contratilidade uterina,
onde a indometacina foi capaz de inibir as contrações induzidas pelo extrato de Ficus
asperifolia em útero de rata (WATCHO et al., 2011), o efeito uterotônico das folhas de
Monechma ciliatum também foi inibido pela indometacina (UGURU et al., 1998), indicando
assim o envolvimento das PGs nas respostas uterotônicas induzidas pelos extratos dessas
plantas.
Um outro agente importante no desencadeamento das contrações uterinas é a ocitocina,
principalmente durante a fase do trabalho de parto. O tecido miometrial é dotado de
receptores para ocitocina (OTR) que quando são ativados pela ocitocina endógena, promovem
contrações uterinas, aumentando a concentração de Ca2+
i na célula miometrial por meio da
ligação aos receptores acoplados à proteína Gq.
Observando o padrão de contração apresentado pelo Ec-EtOH decidiu-se investigar se
as contrações induzidas pelo Ec-EtOH poderiam ser desencadeadas por um mecanismo
semelhante ao da ocitocina. Nesse sentido, o atosiban, um antagonista competitivo dos
D I S C U S S Ã O | 115
receptores para ocitocina, foi utilizado como padrão de comparação para a inibição das
respostas induzidas pela ocitocina e pelo Ec-EtOH. No protocolo experimental, pode-se
perceber que o Ec-EtOH mais uma vez foi capaz de promover contrações de amplitude média
com valores significativos na ausência do atosiban e quando o antagonista dos OTRs foi
adicionado às cubas, reduziu significativamente o padrão dessas contrações chegando a mais
de 50% de redução (Gráfico 22), concluindo que o Ec-EtOH provavelmente estaria
desencadeando o mecanismo de contração no tecido uterino por meio da ativação dos OTRs.
Estudos realizados com o atosiban mostram que a sua eficácia clínica foi comparável à
terapia β-agonista convencional, ou seja, ele apresentou ação tocolítica considerável quando
comparado com agentes utilizados comumente na prática obstétrica e ainda apresentando
menores efeitos secundários tanto maternos quanto neonatais sendo esse agente tido como um
grande avanço no uso de terapias tocolíticas atualmente (LIN et al., 2009; WEX et al., 2011;
WORLDWIDE ATOSIBAN VERSUS BETA-AGONISTS STUDY GROUP, 2001).
Os estudos com o Ec-EtOH in vitro, mostraram que o extrato apresenta um padrão
uterotônico promovendo contrações de valores significativos quando pré-incubado
diretamente no tecido uterino.
Com intuito de complementar os estudos, decidiu-se investigar o efeito que o Ec-EtOH
apresentaria sobre o tecido uterino em experimentos in vivo e se o mesmo seria capaz de
provocar aborto, parto prematuro, más-formações nos filhotes ou toxicidade nesses animais.
Usando uma dose de 250mg/kg de peso, o Ec-EtOH foi administrado por gavagem nas
ratas em períodos distintos de prenhez para avaliar os parâmetros citados anteriormente. A
escolha do período de administração do extrato foi baseada no estudo de Carmo; Peters;
Guerra (2007), sobre o período de desenvolvimentos dos embriões em ratas, onde a
organogênese, inicia-se entre o 6º e 8º dia e termina entre o 15º e 18º. Após o período de
organogênese, inicia-se a fetogênese, onde ocorre o crescimento e o amadurecimento das
estruturas formadas no período anterior e que se estende até o nascimento, no 21º ou 22º dia
da prenhez, esses períodos correspondem desde a implantação até a fase de crescimento e
nascimento.
Os experimentos demonstraram que o Ec-EtOH na dose administrada (250mg/kg peso)
não foi capaz de induzir o aborto nem provocar malformações ou parto pré-maturo em
nenhuma das fases do teste, não alterou o padrão do peso das ratas e observou-se também que
a média entre o número de filhotes nascidos no grupo controle e nos grupos teste não variou
de forma significativa indicando que o Ec-EtOH não exerceu influência no processo de
implantação (Gráficos 25 e 26). Em relação ao peso dos filhotes, os pertencentes às ratas do
D I S C U S S Ã O | 116
grupo do 1º dia de prenhez apresentaram aumento de peso corporal significativo quando
comparado ao controle e ao grupo das ratas do 14º dia de prenhez (Gráfico 27). Mesmo não
havendo diferença significativa estatisticamente, algumas ratas tiveram menos filhotes que
outras e esse fator pode ter sido o influenciador quanto à oferta da alimentação aos seus
filhotes e o ganho de peso em relação aos demais grupos.
O potencial de toxicidade dos remédios empregados na medicina popular, apesar de
muitos serem utilizados há séculos, ainda necessita de avaliação para se determinar o possível
efeito.
Nos últimos anos, a atenção tem sido focada na terapia tradicional, a base
medicamentos derivados de plantas medicinais onde muitos ainda presumem que esse tipo de
medicamento apresente menos efeitos secundários em comparação com as drogas alopáticas,
por isso, uma atenção considerável tem sido dirigida para a identificação de plantas atóxicas
que possam ser utilizadas para consumo humano (LOBO; PHATAK; CHANDRA, 2010).
A investigação da toxicidade de plantas medicinais na literatura é comum e busca
avaliar os possíveis os efeitos dos extratos e/ou substâncias sobre os órgãos e tecidos para que
essas plantas possam ser usadas como possíveis agentes terapêuticos. Para avaliar o potencial
de toxicidade de qualquer substância, os parâmetros bioquímicos são ferramentas
fundamentais na investigação dos possíveis efeitos tóxicos. Nesse estudo, apenas os níveis de
AST, ALT e creatinina, normalmente utilizados para detectar lesão hepática e para avaliar a
função renal, respectivamente, foram avaliados com intenção de se observar uma possível
ação tóxica do Ec-EtOH nos animais durante um determinado período da prenhez.
Nesse estudo, particularmente para a dose utilizada (250mg/kg de peso) nas diferentes
fases de prenhez, não houve alterações significativas entre o grupo controle e os grupos
tratados em todos os parâmetros avaliados. O Ec-EtOH, especificamente nessa dose, não foi
capaz de causar alterações hepáticas ou renais consideradas tóxicas para os animais (Tabelas 2
e 3). Assim, seria considerável então, que essa dose do extrato utilizada poderá ser usada
como um possível meio de comparação ou controle para futuros estudos baseado nesse
mesmo tipo de protocolo e utilizando o mesmo extrato, com o objetivo de coletar dados mais
aprofundados sobre outras dosagens, período de tempo mais longo, além de outros parâmetros
bioquímicos para confirmar se esse padrão se confirma em outras apresentações do extrato de
forma a garantir a sua utilização segura na prática terapêutica.
Alguns estudos consideram que para avaliar a toxicidade pré-natal, ou mesmo in vivo,
muitos fatores devem ser considerados, tais como o período de gestação, as doses
administradas, mutagenicidade, embriofetotoxicidade, alterações de fertilidade,
D I S C U S S Ã O | 117
carcinogenicidade, entre outros, sendo importante considerar esses fatores para que possa se
estabelecer protocolos experimentais apropriados (BEDNARCZUK et al., 2011).
A seleção da dose para este estudo baseou-se nos estudos feitos por outros autores que
buscaram identificar a melhor resposta do organismo comparada às doses administradas dos
extratos em estudo e se esses seriam tóxicos ou não. Dabhadkar; Zade, (2012), utilizou como
um dos parâmetros para avaliação da toxicidade aguda de Plumeria rubra (Linn), os valores
sugeridos pela diretriz da OECD 423, que discute sobre a toxicidade aguda de classes.
Avaliando os dados obtidos nesse trabalho, percebe-se o quanto é importante à
descoberta de fármacos que atuam sobre a motilidade uterina e sobre a regulação do tônus
desse músculo, uma vez que contrações de padrão anormal, provocadas ou inibidas podem
desencadear situações agravantes levando desde o surgimento de condições como trabalho de
parto prematuro a hemorragia pós-parto por não regressão do órgão ao estado normal.
Portanto, a ação descrita neste trabalho sobre o extrato etanólico bruto de Erythroxylum
caatingae Plowman em útero isolado de rata, pela primeira vez na literatura revelou uma
possível atividade ocitócita, mostrando que os mecanismos de ação pelos quais o extrato atua
tem padrão semelhante aos apresentados pelos agonistas conhecidos e já utilizados na
terapêutica médica ou os agonistas utilizados como padrão uterotônico. Outras vias de
sinalização intracelular que não foram investigadas, podem ter um papel importante no efeito
contracturante do Ec-EtOH sobre o músculo liso uterino, ainda sendo necessárias futuras
investigações para a obtenção de uma visão total sobre o mecanismo de ação pelo qual o
extrato exerce seus efeitos.
Espera-se que os resultados aqui apresentados contribuam como ferramenta
farmacológica para um melhor entendimento do mecanismo excitação-contração do músculo
liso uterino ou como um potencial agente terapêutico para os problemas de saúde relacionados
a esse órgão.
CONCLUSÃO
C O N C L U S Ã O | 119
7 CONCLUSÃO
A investigação farmacológica da atividade do extrato etanólico bruto de Erythroxylum
caatingae Plowman sobre útero isolado de rata em estro forneceu evidências de que o Ec-
EtOH atua, principalmente, como agente contracturante.
Quanto aos possíveis mecanismos de ação investigados nesse trabalho, o efeito
contrátil desencadeado pelo Ec-EtOH pode estar relacionado a uma possível ativação dos
receptores muscarínicos, a liberação de prostaglandinas ou, a uma ativação dos receptores de
ocitocina presentes no tecido uterino.
O Ec-EtOH in vivo na dose de 250 mg/kg administrado por via oral não causou aborto,
malformação ou parto prematuro, nos grupos testados, podendo essa dose vir a ser
considerada como um padrão para comparações em investigações futuras.
PERSPECTIVAS
P E R S P E C T I V A S | 121
8 PERPESCTIVAS
Com estudo in vitro:
Caracterizar farmacologicamente o mecanismo de ação espasmogênica do Ec-EtOH em
útero isolado de rata utilizando outros agentes contracturantes da musculatura lisa uterina
como os alcalóides do ergot (metilergonovina) e antagonistas dos receptores de progesterona;
Avaliar a ação do extrato na presença de outros agentes tocolíticos, como os agonistas
dos receptores β-adrenérgicos, bloqueadores de canais para Ca2+
e inibidores seletivos da
COX.
Com estudo in vivo:
Avaliar o grau de toxicidade do Ec-EtOH, bem como a possível ação abortiva ou
indutora de parto prematuro de outras doses do extrato;
Avaliar o efeito do Ec-EtOH sobre a contração uterina in vivo.
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ANEXOS
A N E X O S | 134
ANEXO A – Folha de aprovação do Comitê de Ética em Estudos Humanos e Animais
(CEEHA).
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO Comitê de Ética em Estudos Humanos e Animais
CERTIFICADO Certificamos que o projeto intitulado “INVESTIGAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA DE ESPÉCIES DO GÊNERO ERYTHROXYLUM: UM ESTUDO COMPARATIVO”, Protocolo nº 0002/131211, sob a responsabilidade de JULIANELI TOLENTINO DE LIMA, está de acordo com os princípios éticos de experimentação animal adotados pelo Comitê de Ética em Estudos Humanos e Animais da Universidade Federal do Vale do São Francisco. We certify that the Research “INVETSIGATION OF THE SPASMOLYTIC ACTIVITY OF ERYTHROXYLUM SPECIES: ACOMPARATIVE STUDY” protocol number 0002/131211, under the responsibility of JULIANELI TOLENTINO DE LIMA, is agree with Ethical Principles in Animal Research adopted by The Ethics Committee in Human and Animal Studies of Universidade Federal do Vale do São Francisco.
Petrolina, 24 de fevereiro de 2011.
______________________________________________________________ Prof. Alexandre H. Reis
Coordenador do Comitê de Ética em Estudos Humanos e Animais UNIVASF
___________________________________________________________________
Av. José de Sá Maniçoba, s/n – Centro – Petrolina - PE
CEP 56.304-205 - Petrolina – PE Tel/Fax: (87) 2101-6797 E-mail: [email protected]