Aplicações da Biotecnologia na Agricultura
Cultura de Células e Tecidos
Anticorpos Monoclonais e Sondas de Ácidos Nucléicos para diagnóstico
Engenharia genética de plantas para a introdução de novas características
Mapeamento de genes
Genômica
Usos da Transformação de Plantas
A. Testar a função de genes ou partes de genes
B. Modificar a expressão de genes endógenos- Desligar genes- Aumentar a expressão- Modificar a expressão
C. Mover genes entre organismos
Tecnologia Multidisciplinar
•Biologia Celular – cultura de tecidos
•Biologia Molecular – clonagem, estrutura e função de genes
•Melhoramento – desenvolvimento e testes de produtos
•Direito- temas regulatórios
•Marketing – aceitação pública
Requerimentos para produção de plantas Requerimentos para produção de plantas transformadastransformadas
A. DNA a ser introduzido1. gene marcador2. promotor (constitutivo ou induzido),
região codificadora e sítio de poliadenilação
B. Cultura de células e protocolo de regeneração
C. Método de introdução do DNA na célula
D. Prova da transformação da planta
Produção de Plantas Transgênicas
Isolar e clonar o gene de interesse
Adicionar segmentos de DNA para iniciar ou aumentar expressão do gene
Introduzir a construção gênica em células de plantas (transformação)
Seleção de células ou tecidos transformados
Regeneração de plantas
86 Genomas microbianos:
Archaea - 16 espécies Bacteria - 70 espécies
42 Genomas de eucariontes:
Completos - 8 espécies Em andamento - 35 espécies
Isolamento de genesIsolamento de genes
GENEBANK já incorporou seqüências de mais de 105.000 organismos
Período de um ano - 4,6 milhões de novas seqüências
Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA
Estrutura molecular do gene
Exon Exon Exon
Intron
Região codificadora
Exon Exon ExonGppp Poly AhnRNA
Gppp Poly A
Translação
mRNAORF
Terminador
CCAAT TATA
Região promotora
Específicos Gerais
Construção de vetores para transformação
35S promoterACC oxi
35S polyA
35S promoter
35S polyAbar
EcoRIHindIIIT-Border T-Border
pIBI 23
Hind III KpnI BamHI
EcoRI NcoI 35S e + 35S pr ACC oxi 35S polyA
pIBI 21
Kpn I BamHI
SacI SacI HindIII
pIBI 11
ACC oxi
Promotores constitutivos
CaMV 35S : expressão de genes exógenos em dicots. Ubiquitin: promotor constitutivo em monocots.
Promotores Orgão/ tecido específico
Vicilina, glutenina: específicos para expressão em sementes -amilase: aleurona de cereais Patatin: tubérculos de batata RuBisCo: tecido clorofilado
Promotores mais comumente utilizados
Alguns transgenes têm impacto negativo; portanto transcrição somente quando necessário.
Indução de macho-esterilidade para produção de híbridos
Genes de resistência a doenças quando patógeno aparecer
Atraso na expressão de genes quando interfere com desenvolvimento inicial da planta
Induzido: alcool desidrogenase Etanol Transiente: Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV)
Promotores induzidos e expressão transiente
FATORES INFLUENCIANDO A TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
Protocolo de cultura de tecidos
Fisiologia do explante
Método de introdução do DNA
Genes marcadores e indicadores
Protocolo de seleção
Cultura de Tecidos❧ Microprogação❧ Cultura de células❧ Variação somaclonal❧ Cultura de haplóides ❧ Transformação
❧ Sementes artificiais❧ Híbridos Interespecíficos
● Resgate de embriões● Fusão de protoplastos
PROTOCOLOS DE CULTURA DE TECIDOS
Protoplastos
Calos
Meristemas
Brotos adventícios
Embriões somáticos
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS EM MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
•Reprodutibilidade
•Eficiência
•Rapidez
•Baixo custo
•Simplicidade
•Ampla aplicação
Agrobacterium
❧ Bactéria de solo❧ Transferência natural
de DNA para plantas, causando doença
❧ Substituição de DNA da bactéria (T-DNA) por DNA de interesse
❧ Agrobacterium transferirá novo DNA
Bactéria com o Ti -plasmídio
Ti -plasmídio (responsável pela virulência)
Infecção de plantas feridas e transferência do DNA para as células
Planta com agrobactérias vivendo em galhas
Indução pelo T-DNA de: 1 - crescimento independente de hormônios, 2 - síntese de opinas (compostos de carbono e N
dos quais a bactéria se alimenta
Transformação via vetor natural
AGROBACTERIUM
Método bastante conhecido e estudado
Eficiente
Plantas com limitado número de transgenes
Vantagens
AGROBACTERIUM
Genótipo-específico (planta-bactéria)
Monocot X Dicot
Dependência do sistema de regeneração
Desvantagens
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
PROTOPLASTO
Eletroporação
Transferência de DNA via química
Microinjeção
ELETROPORAÇÃO
Bio-Rad®
Vantagens
Rápido e eficiente
Grande controle das condições experimentais
Desvantagens
Necessidade de protoplastos
Custo equipamento
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
MÉTODOS DE TRANSFERÊNCIA DIRETA
Parede Celular Intacta
Vácuo
Biobalística
Vortex (fibras)
Sonicação
Embebição de sementes
Eletroforese
Antes Depois
Tubo de aceleraçãoDisco de ruptura
MacrocarrierPartículas + DNA
Tela
Tecido vegetal
BIOBALÍSTICA
PDS-1000/HeBio-Rad
Parâmetros Físicos
Velocidade das partículas
Tipo de partícula
Propelente e vácuo
Precipitação do DNA
Parâmetros Biológicos
Fisiologia do explante
Tamanho e densidade das células
Parede celular
Osmolaridade
VantagensDiversos protocolos de cultura de tecidos
Não exige vetores especializadosTransformação de organelas
Rapidez e simplicidade
DesvantagensEquipamento especializado
Integração múltipla de transgenesVariabilidade do processo
GENES MARCADORES E INDICADORES
-GlucuronidaseLuciferaseGFPAntocianina
NPT IIbar - glufosinatoBXN - bromoxinilEPSPS - glifosatoALS - sulfonilureias, imidazolinonas
Indicadores
Marcadores
Identificação e seleção de explantes
Genes indicadores
gus A- glucuronidase
gfpproteína de
fluorescência verde
Crescimento e enraizamento
Transferência para solo em condições controladas
Explantes em meio seletivo