UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA PS-GRADUAO EM CINCIAS BIOLGICAS
IMUNOLOGIA E DIP
Juliana Melo
AVALIAO DA INFLUNCIA DAS MOLCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAO INDUZIDA PELA INFECO COM
A BACTRIA Brucella abortus
Juiz de Fora 2017
JULIANA MELO
AVALIAO DA INFLUNCIA DAS MOLCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAO INDUZIDA PELA INFECO COM
A BACTRIA Brucella abortus
Dissertao de Mestrado do Curso de
Ps-Graduao em Cincias Biolgicas:
rea: Imunologia e Doenas Infecto-
Parasitrias para obteno do Ttulo de
Mestre em Cincias Biolgicas: rea:
Imunologia e Doenas Infecto-
Parasitrias. .
Orientador: Prof. Dr. Gilson Costa Macedo
Juiz de Fora 2017
JULIANA MELO
AVALIAO DA INFLUNCIA DAS MOLCULAS PD-1, CD39 E CD73 NA IMUNOMODULAO INDUZIDA PELA INFECO COM
A BACTRIA Brucella abortus
Dissertao de Mestrado do Curso de
Ps-Graduao em Cincias Biolgicas:
rea: Imunologia e Doenas Infecto-
Parasitrias para obteno do Ttulo de
Mestre em Cincias Biolgicas: rea:
Imunologia e Doenas Infecto-
Parasitrias.
Exame de Qualificao aprovado em:
_____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________ Dr Priscila de Faria Pinto
Universidade Federal de Juiz de Fora.
__________________________________________________________ Dr Michele Cristine Ribeiro de Freitas
Universidade Federal de Juiz de Fora.
__________________________________________________________ Prof. Dr. Gilson Costa Macedo (orientador)
Universidade Federal de Juiz de Fora.
Dedico esse trabalho a Deus que em sua infinita bondade e amor me permitiu dar mais esse passo em minha jornada.
AGRADECIMENTOS
Seria impossvel no iniciar os agradecimentos sem citar inicialmente Aquele que foi
o grande pilar para a concluso de mais uma etapa importante da vida. Meu muito
obrigada a Deus por ter me amparado e sustentado at aqui.
Agradeo a minha famlia, em especial aos meus pais Regina e Ivamar por todo
amor, oraes, confiana e suporte. Obrigada por me amarem e entenderem a
ausncia.
Agradeo ao Professor Dr. Gilson Macedo pela orientao e suporte na realizao
dessetrabalho.
Aos amigos do laboratrio de imunologia da UFJF que forneceram auxlio e fizeram
esses ltimos anos mais leves.
Agradeo tambm a professora Dra. Priscilla Pinto e sua aluna Danielle Merconato
pelo acolhimento no laboratrio de Bioqumica da UFJF bem como pelo auxlio em
experimentos.
Agradeo aos amigos de Resende por todo amor, apoio, torcida alm da
compreenso pela ausncia.
Aqueles que passam por ns, no vo ss, no nos deixam ss. Deixam um pouco de si, levam um pouco de ns.
Antoine de Saint-Exupry, 1943.
RESUMO
A brucelose uma doena infectocontagiosa causada por bactrias do gnero
Brucella que acometem o homem e uma grande variedade de animais domsticos,
resultando em prejuzos econmicos significativos aos sistemas de produo. Em
humanos essa infeco pode causar febre ondulante, endocardite, artrite,
osteomielite e complicaes neurolgicas enquanto em animais leva ao aborto e
infertilidade. Sabe-se que a resposta imunolgica a bactrias intracelulares como a
Brucella ocorre essencialmente atravs da imunidade mediada por clulas, sendo
macrfagos especialmente importantes no combate infeco. Entretanto, apesar
da efetividade da resposta, a B. abortus conta com diversos mecanismos de evaso,
o que garante a sua sobrevivncia no organismo hospedeiro. Dentre estes
mecanismos, a modulao de clulas apresentadoras de antgenos tem sido
apontada como um dos mais relevantes. Recentemente, diversos trabalhos tm
evidenciado a importncia das NTPDases e da molcula PD-1 na modulao da
resposta imune. As NTPDases esto envolidas com a produo de adenosina que
apresenta relevante carter imunomodulador. J a molcula PD-1 est associada a
induo de um perfil anti-inflamatrio com diminuio de IL-12 e aumento de IL-10.
Neste contexto, o objetivo deste estudo foi determinar se a infeco com B. abortus
capaz de alterar a expresso destas molculas e assim limitar a ao do sistema
imune, favorecendo a sobrevivncia do patgeno. Para isso, clulas RAW 264.7
foram infectadas com B.abortus e a modulao das molculas CD80, CD86, CD40,
MHCII, foi avaliada por citometria de fluxo. Em seguida, a expresso de CD39
tambm foi determinada por citometria de fluxo e por Western Blot. Por fim
analisamos possveis alteraes na expresso da molcula PD-1 induzidas pela
bactria. Como resultados, foi confirmado que a infeco capaz de inibir a
expresso de CD80, CD86 e CD40, embora o mesmo no tenha sido observado
com o MHCII. Alm disso, a expresso de CD40 se mostrou diminuda mesmo aps
o estmulo com LPS. De forma surpreendente, foi observada uma diminuio na
expresso das molculas CD39 e PD-1, o que pode ser explicado pela menor
ativao celular induzida pela infeco. Assim, os dados obtidos at o momento
demonstram que as molculas CD39 e PD-1 no so utilizadas pela Brucella para
modular as APCs, mas so influenciados pela menor ativao celular induzida pelo
patgeno.
Palavras chave: Brucella.abortus. Imunomodulao. PD-1. CD39. CD73
ABSTRACT
Brucellosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Brucella that
affect humans and a wide variety of domestic animals, resulting in significant
economic losses to production systems. In humans the infection can cause undulant
fever, endocarditis, arthritis, osteomyelitis and neurological complications while in
animals leads to abortion and infertility. It is known that the immune response to
intracellular bacteria such as Brucella occurs primarily by cell-mediated immunity,
macrophage being especially important in fighting infection. However, despite the
effectiveness of the response, B. abortus has several avoidance schemes, which
ensures their survival in the host organism. Among these mechanisms, modulation of
antigen-presenting cells has been identified as one of the most relevant. Recently,
several studies have shown the importance NTPDase and PD-1 molecule to
modulate the immune response. The NTPDase are envolidas with the production of
adenosine which presents immunomodulatory relevant character. Since PD-1
molecule is associated with induction of an anti-inflammatory profile with decreased
IL-12 and IL-10 increase. In this context, the aim of this study was to determine
whether infection with B. abortus is able to alter the expression of these molecules
and thus limit the action of the immune system, favoring the survival of the pathogen.
To this end, RAW 264.7 cells were infected with B.abortus and modulation of CD80
molecules, CD86, CD40, MHCII, was evaluated by flow cytometry. Then the CD39
expression was also determined by flow cytometry and Western blot. Finally, we
analyze possible changes in PD-1 molecule expression induced by bacteria. As a
result, it was confirmed that the infection is capable of inhibiting expression of CD80,
CD86 and CD40, although this has not been observed with MHCII. Additionally,
CD40 expression showed decreased even after the stimulation with LPS.
Surprisingly, it was observed a decrease in the expression of CD39 and PD-1
molecules, which can be explained by the lower cellular activation induced by the
infection. Thus, the data obtained so far show that the PD-1 and CD39 molecules are
not used by Brucella Modular APCs but are less influenced by cellular activation
induced by the pathogen.
Keywords: Brucella.abortus. Immunomodulation. PD-1. CD39. CD73
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Marcadores de superfcie envolvidos no desenvolvimento de respostas imunolgicas ................................................................................................................................................. 24
Figura 2. Exemplificao da produo de adenosina aps degradao sequencial de ATP/ ADP via CD39 e CD73 em macrfagos ............................................................................... 28
Figura 3. Determinao da zona de macrfagos ........................................................................ 35
Figura 4. Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD80 ........................... 38
Figura 5. Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD86 ........................... 39
Figura 6. Anlise da expresso de molculas MHC II ............................................................. 41
Figura 7. Avaliao da expresso de molculas CD40 .......................................................... 43
Figura 8. Anlise da expresso de molculas CD39 ............................................................... 45
Figura 9 Identificao da NTPDase 1/ CD39 em macrfagos pela tcnica de Western blotting .......................................................................................................................................... 47
Figura 10. Avaliao da expresso de molculas PD-1 ......................................................... 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Anticorpos utilizados nos ensaios de citometria .................................................... 34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADP Adenosina difosfato
AMP Adenosina monofosfato
APC Antigen presented cell - Clulas apresentadora de antgenos
ATP Adenosina trifosfato
BB Meio Brucella Broth
CTLA-4 Cytotoxic T-Lymphocyte-Associated Protein 4 Antgeno 4 associado
a linfcito T citotxico
DMSO Dimetilsulfxido
DNA Desoxyribonucleic acid
FoxP3 Fator de transcrio Forkhead Box P3
IDO Indoleamine-pyrrole 2,3dioxygenase
IFN- Interferon-gama
IL Interleucina
LPS lipopolissacardeo
MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
MCP-1 Monocyte chemoattractant protein-1 - Protena quimiottica de
moncitos-1
MHC Major Histocompatibility Complex Complexo de histocompatibilidade
principal
MOI Multiplicity of infection Multiplicidade de infeco
NK Natural Killer
NO Nitric Oxide Oxido ntrico
PAMPs Pathogen associated molecular patterns - Padres moleculares
associados a patgenos
PBS Phosphate buffered saline - Tampo salina fosfato
PD-1 Programador de morte celular-1
PNCEBT Programa Nacional de Controle e Erradicao da Brucelose e
Tuberculose
PRRs Pattern recognition receptor - Receptores de reconhecimento de
padres
SFB Soro fetal bovino
TCR T cell receptor Receptor de clula T
TGF- Transforming growth factor beta Fator-beta de transformao do
crescimento
TH1 T helper 1 Linfcitos T auxiliar 1
TH2 T helper 2 Linfcitos T auxiliar 2
TLR Toll Like Receptor - Receptores do tipo Toll
TNF- Tumor necrosis fator alpha - Fator alfa de Necrose Tumoral
UFC Unidades formadoras de colnias
SUMRIO
1. INTRODUCO .................................................................................................................................... 13
1.1. EPIDEMIOLOGIA .................................................................................................................... 15
1.2. CARACTERSTICAS PATOGNICAS........................................................................... 16
1.3. RESPOSTA IMUNOLGICA CONTRA Brucella sp................................................. 19
1.4. REGULAO E IMUNOMODULAO .......................................................................... 22
1.5. SINALIZAO PURINRGICA ......................................................................................... 25
1.5.1. AS NTPDases ............................................................................................................... 26
1.6. Brucella sp. E EVASO DA RESPOSTA IMUNOLGICA ................................... 28
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 31
2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................................. 31
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................................ 31
3. MATERIAL E MTODOS ............................................................................................................. 32
3.1. LINHAGEM BACTERIANA E CONDIES DE CULTIVO .................................. 32
3.2. LINHAGEM CELULAR ............................................................................................................ 32
3.3. CULTURA DE CLULAS....................................................................................................... 32
3.4. CITOMETRIA DE FLUXO ..................................................................................................... 33
3.5. CULTURA DE MACRFAGOS E PREPARO DE HOMOGENEIZADO
CELULAR ............................................................................................................................................... 35
3.5.1. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E
IDENTIFICAO PELA TCNICA WESTERN BLOTTING .................................... 36
3.6. ANLISE ESTATSTICA ........................................................................................................ 36
4. RESULTADOS .................................................................................................................................. 37
5. CONCLUSO..................................................................................................................................... 51
6. PERSPECTIVAS .............................................................................................................................. 52
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................................. 53
1. INTRODUO
A brucelose uma doena infectocontagiosa causada por bactrias do gnero
Brucella, que acometem o homem e uma grande variedade de animais domsticos
(NICOLETTI, 1989). Apresenta-se na forma endmica em muitos pases, resultando
em prejuzos econmicos significativos aos sistemas de produo, alm de srias
implicaes na sade animal e pblica, visto seu carter zoontico (BRASIL, 2006).
1.1. HISTRICO
O grupo bacteriano responsvel pela transmisso da brucelose foi descrito no
homem pela primeira vez por Marston, em 1859, a partir de casos de febre
ondulante seguidos de morte, ocorridos na Ilha de Malta, no Mar Mediterrneo,
sendo por isso denominada tambm de Febre de Malta (NICOLETTI, 2002;
POESTER et al., 2009).
Em 1887, o mdico ingls, Sir David Bruce, isolou pela primeira vez uma
bactria do bao de soldados britnicos mortos na Ilha de Malta, denominando-a
como Micrococcus melitensis (VIEIRA, 2004; GODFROID et al., 2005; POESTER et
al., 2009). J em 1895, Bernhard Bang, um patologista veterinrio
dinamarqus,isolou um microrganismo do tero e de membranas fetais resultantes
do aborto de vacas, identificando-o como Bacillus abortus (NICOLETTI, 2002;
POESTER et al., 2009).
Nos EUA, em 1918, Alice Evans demonstrou que os microrganismos isolados
por Bruce e Bang apresentavam similaridades morfolgicas, imunolgicas e de
cultivo. Em 1920, baseados em tais evidncias, Meyer e Shaw propuseram a criao
do gnero Brucella em homenagem ao autor do primeiro isolamento do agente, alm
da designao dos dois microrganismos descobertos anteriormente por Brucella
melitensis e Brucella abortus, respectivamente (CORRA e CORRA, 1992;
VIEIRA, 2004; RIBEIRO, MOTTA e ALMEIDA, 2008).
No Brasil, o primeiro caso de brucelose humana foi descrito em 1913 por
Gonalves Carneiro e Danton Seixas, que um ano depois realizou pela primeira vez
no pas o diagnstico clnico da brucelose bovina no estado do Rio Grande do Sul
(PAULIN e FERREIRA NETO, 2003; VIEIRA, 2004).
Atualmente, dentro do gnero Brucella, so descritas dez espcies
independentes que so classificadas principalmente por diferenas de
patogenicidade, preferncia de hospedeiro e caractersticas bioqumicas e
antignicas (ALTON et al., 1988; PAJUABA, 2006; OIE, 2009). As espcies
conhecidas so classificadas da seguinte forma: B. melitensis (caprinos), B. abortus
(bovinos), B. suis (sunos), B. canis (ces), B. ovis (ovinos), B. neotomae (ratos do
deserto), B. cetceos (cetceos), B. pinnipedia (pinpedes), B. microti (ratazanas), e
B. inopinata (desconhecido). Dentre essas espcies conhecidas de Brucella, apenas B. abortus, B.melitensis, B.suis e B. canis so patognicas para os seres humanos,
sendo que as infeces causadas por B. canis so raras nos mesmos
(CLOECKAERT et al., 2003; HE, 2012). Embora a B. melitensis seja a espcie mais
patognica, a B. abortus ganha destaque por ser a principal fonte de infeco em
funo da sua maior disseminao no mundo (CORBEL, 1997).
1.2. EPIDEMIOLOGIA
A brucelose uma zoonose distribuda mundialmente, sendo endmica em
regies como Amrica Latina, Oriente Mdio, frica, sia e na bacia do
Mediterrneo. Estima-se que so registrados anualmente no mundo cerca de meio
milho de novos casos de brucelose humana (MANTUR e AMARNATH, 2008; HE,
2012; AVILA-CALDERON et al., 2013). Embora j tenha sido erradicada em diversos
pases da regio norte e central da Europa, alm da Austrlia, Japo e Nova
Zelndia, essa zoonose reemergente continua se mostrando como um grave
problema sanitrio e econmico (CORBEL, 1997; PAULIN e FERREIRA NETO,
2003; OIE, 2009), podendo apresentar em determinados pases uma taxa de
prevalncia superior a dez casos a cada cem mil habitantes, sendo ainda mais
frequente em pessoas que trabalham em fazendas (MANTUR e AMARNATH, 2008).
O Brasil est localizado na rea em que a brucelose endmica, porm sua
disseminao no territrio relativamente diferenciada, principalmente em virtude da
ampla extenso territorial e as caractersticas prprias de cada regio (POESTER et
al., 2002; RIBEIRO, MOTA e ALMEIDA, 2008; LAGE et al., 2008).
Segundo boletim epidemiolgico, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e
Abastecimento MAPA, em 2001, instituiu o Programa Nacional de Controle e
Erradicao da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), que consiste em um conjunto
de medidas sanitrias estratgicas em busca da reduo da prevalncia e incidncia
da brucelose, adotando como medida profiltica a vacinao de bezerras com idade
entre trs e oito meses em todo o pas. Dentre outras atividades previstas no
programa, destacam-se a adeso voluntria dos criadores na busca de rebanhos
livres e monitorados, a prtica de testes sorolgicos regulares em rebanhos de elite
para a participao em feiras e exposies, e o sacrifcio dos animais positivos para
brucelose (BRASIL, 2006).
Esse programa tem como intuito reduzir os impactos causados por essas
doenas na sade pblica, alm de promover a competitividade da pecuria
nacional, haja visto que o Brasil detm o maior rebanho bovino comercial do mundo
(IDAF, 2011).
Visando obter informaes acerca da prevalncia da brucelose bovina no
Brasil, foi realizado nos estados brasileiros um levantamento epidemiolgico a partir
de dados amostrais obtidos de propriedades rurais entre os anos de 2001 e 2004.
Tal estudo aponta que a prevalncia de focos da doena nessas propriedades
amostradas foi de 0,32% em Santa Catarina, 2,5% no Distrito Federal, 4,02% no
Paran, 4,2% na Bahia, 6,04% em Minas Gerais, 9% no Esprito Santo, 9,70% em
So Paulo, 12,60% em Sergipe, 15,42% no Rio de Janeiro, 17,54% em Gois,
21,22% em Tocantins e 35,18% em Rondnia (ALVES e VILLAR, 2011).
O controle dos patgenos associados doena, aliado a medidas profilticas
como a vacinao dos reservatrios animais, so fatores que contribuem de forma
satisfatria para a reduo da incidncia da brucelose humana, fato que vem sendo
observado em alguns pases como Austrlia, pases do norte Europeu e Amrica do
Norte (PAPPAS et al., 2006a).
1.3. CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DA BACTRIA Brucella sp.
As bactrias do gnero Brucella sp., patgenos causadores da brucelose, so
classificadas como cocobacilos Gram-negativos pertencentes classe
Proteobacteria. So microrganismos intracelulares facultativos, imveis e no
esporulados, e apresentam-se na forma de bastonetes curtos que medem de 0,6 a
1,5 m por 0,5 a 0,7 m de dimenso (VELASCO et al., 2000; REDKAR et al., 2001;
PROBERT et al., 2004). Com relao a obteno de energia, so classificados como
microrganismos aerbios, entretanto, sob atmosfera com tenso de 5 - 10% de CO2
h favorecimento para o isolamento de algumas espcies. Apresentam temperatura
de multiplicao de 20 a 40C, sendo 37C a temperatura ideal, e um pH timo que
varia de 6.6 a 7.4 (PAJUABA, 2006; OIE, 2009).
Classicamente, as bactrias do gnero Brucella podem ser divididas em grupos
antigenicamente distintos, sendo denominadas lisas ou rugosas. Tais grupos so
embasados em caractersticas observadas durante o crescimento bacteriano em
meios de cultura e na constituio qumica da parede celular - presena ou ausncia
da cadeia O - um dos componentes do lipopolissacardeo (LPS) localizado na
superfcie externa da Brucella spp que possui relao com a virulncia de algumas
espcies (NIELSEN et al. 2004; CARDOSO et al., 2006).
1.4. CARACTERSTICAS PATOGNICAS DA BACTRIA Brucella sp. E MANIFESTAES CLNICAS DA ZOONOSE
A patogenicidade das bactrias do gnero Brucella est intimamente
relacionada a suas caractersticas morfolgicas, aliadas aos mecanismos de evaso
do microrganismo que favorecem a penetrao, sobrevivncia e multiplicao no
hospedeiro (ARSTEGUI et al., 2001; NIELSEN et al., 2004; XAVIER, 2009).
Em humanos, a brucelose pode ser veiculada pela ingesto de produtos de
origem animal contaminados, principalmente leite e derivados que no passaram por
processamento trmico. Essa doena transmitida tambm atravs do contato
direto ou indireto com animais infectados, fetos abortados ou anexos fetais, alm da
manipulao de carcaas e vsceras provenientes de animais infectados, sem a
utilizao de equipamentos de segurana (PAULIN e FERREIRA, 2008). Em regies
endmicas, a via de infeco mais comum o consumo de produtos lcteos no
pasteurizados, principalmente o leite e o queijo (JONG; ROLAN e TSOLIS, 2010;
EKICI et al., 2012; AVILA-CALDERON et al., 2013).
Uma vez no interior do hospedeiro, seja em humanos ou outros animais, as
bactrias do gnero Brucella podem persistir nas clulas do sistema monoctico
fagocitrio, nas secrees uterinas, na glndula mamria e na medula ssea. Sendo
assim, o descarte adequado dos tecidos que concentram um grande nmero de
bactrias pode reduzir e evitar a contaminao de carcaas e vsceras durante o
abate (CARVALHO et al., 1995; PESSEGUEIRO, BARATA e CORREIA, 2003;
PARDI et al., 2006).
A capacidade de penetrao pela pele lesada ou ntegra e pelas membranas
mucosas favorece a classificao dessa zoonose como uma enfermidade de carter
ocupacional, visto que acomete profissionais que desenvolvem atividades com maior
risco de exposio ao agente causador da doena, sendo estes, consequentemente,
mais propcios infeco conforme tem sido observado em veterinrios,
laboratoristas e trabalhadores de matadouros e frigorficos (LAGE et al., 2008;
MINHARRO, 2009; OIE, 2009). Corroborando esses dados, estudos apontam a
brucelose como a doena bacteriana mais comumente adquirida em laboratrio no
mundo (LUNAMARTNEZ e MEJA-TERN, 2002; PAPPAS et al., 2006a).
As bactrias do gnero Brucella sp podem apresentar dose infecciosa at
mesmo em baixas quantidades, alm de possurem grande potencial de disperso
pelo ar facilitando assim sua transmisso, visto que so bactrias facilmente
aerossolizadas. Sabe-se tambm que infeces humanas com estas bactrias so
debilitantes e difceis de tratar (FRANZ et al., 1997; PAPPAS e PAPADIMITRIOU,
2007). Em funo dessas caractersticas, estas bactrias encontram-se na lista dos
agentes etiolgicos que requerem ateno com relao ao seu potencial uso em
bioterrorismo (GREENFIELD et al., 2002; PAPPAS et al., 2006b).
Em diversos grupos animais, a brucelose apresenta-se como uma infeco
crnica que persiste por toda a vida. O tropismo da bactria pelos rgos
reprodutores responsvel por suas principais manifestaes que so o aborto, a
infertilidade e falhas reprodutivas (PESSEGUEIRO; BARATA e CORREIA, 2003;
FRANCO et al., 2007).
Com relao aos seres humanos, essa infeco pode causar sintomas como
febre ondulante, endocardite, artrite, osteomielite alm de complicaes
neurolgicas. Tem sido relatado que formas agudas e crnicas da brucelose podem
afetar tambm a coluna vertebral (PAPPAS et al., 2005) causando uma derivao da
doena conhecida como brucelose espinhal que afeta principalmente idosos. A
brucelose tambm pode levar inflamao das articulaes causando artrite,
geralmente registrada nos pacientes com at 30 anos (ALP e DOGANAY, 2008).
A doena raramente fatal em seres humanos, apresentando um percentual
de cerca de 2% de bito, entretanto essa infeco pode provocar debilidade severa
e levar incapacidade do hospedeiro. A doena tende cronicidade e persistncia,
podendo se tornar uma doena granulomatosa capaz de afetar qualquer rgo
(CHRISTOPHER; UMAPATHY e RAVIKUMAR, 2010).
Diagnosticar a brucelose humana de forma rpida e precisa ainda
considerado um desafio para profissionais da sade em virtude de suas
caractersticas clinicas no especificas, sendo frequentemente confundida com a
gripe em funo da similaridade entre os sintomas iniciais (MEMISH et al., 2000).
Dentre os mtodos para diagnstico, o isolamento do microrganismo, tambm
conhecido como teste direto, o teste padro para confirmar a infeco, porm esse
mtodo requer tempo e tcnicos qualificados. Alm disso, o manuseio das amostras
contendo o patgeno representa um alto risco de contaminao (LUNAMARTNEZ e
MEJA-TERN, 2002; PAPPAS et al., 2006a). J os testes indiretos ou sorolgicos
detectam os anticorpos contra Brucella spp presentes em diversos fluidos corporais
como sangue, muco vaginal, smen e leite (POESTER et al., 2009).
At o momento, a ausncia de uma vacina eficaz para a preveno desta
zoonose em seres humanos faz com que a erradicao ou controle da doena sejam
feitos a partir de medidas aplicadas ao animal hospedeiro. O tratamento dessa
infeco alvo de discusso visto que ainda no existe acordo em relao ao
melhor protocolo a ser usado, mas este geralmente requer a utilizao prolongada
de uma combinao de antibiticos, que produz um alvio na sintomatologia,
diminuindo a durao da doena e a ocorrncia de complicaes, podendo assim
prevenir uma possvel recada (PESSEGUEIRO; BARATA e CORREIA, 2003;
ARIZA et al., 2007; FANNI et al., 2013).
Alm de apresentar relevncia clnica quando acomete o homem, a ocorrncia
da brucelose em outros animais pode resultar em perdas econmicas significativas
como a imposio de barreiras sanitrias e tarifrias ao comrcio internacional de
produtos de origem animal levando a perdas no rendimento industrial, gastos
significativos devido aos altos custos para a implementao dos programas de
controle e erradicao da doena, alm de prejuzos envolvendo a produo animal,
devido ao elevado nmero de abortos, nascimento de animais fracos, baixa
fertilidade nas propriedades rurais e, principalmente, o declnio na produo de leite
e carne (POESTER et al., 2009).
1.5. RESPOSTA IMUNOLGICA CONTRA Brucella sp.
A resposta imune efetiva contra a Brucella sp se inicia com o reconhecimento
de padres moleculares associados ao patgeno (PAMPs - do ingls, pathogen
associated molecular patterns) por receptores de reconhecimento de padres (PRRs
- do ingls, Pattern recognition receptor) (KAWAI e AKIRA, 2007) presentes na
membrana plasmtica ou em compartimentos intracelulares que permitem ao
hospedeiro distinguir bactrias de agentes virais e parasitrios (JANEWAY e
MEDZHITOV, 2002; HOEBE, JANSSEN e BEUTLER, 2004). Entre os PRRs, os
receptores do tipo Toll (TLR do termo em ingls Toll Like Recepor) recebem
destaque uma vez que, aps o reconhecimento e ligao aos PAMPs, atuam de
forma direta ou indireta no processo de gerao de respostas imunolgicas inatas e
adaptativas contra organismos invasores atravs de sinalizaes distintas,
exercendo tambm importante papel na ativao de linfcitos (ONEILL, 2006). Alm
de atuarem na deteco e reconhecimento de patgenos, os TLRs ativam cascatas
de sinalizao induzindo a expresso de molculas coestimulatrias como CD80 e
CD86 expressas sobre a superfcie das clulas apresentadora de antgenos (APC,
do ingls, antigen presented cell) - clulas dendrticas, macrfagos e clulas B -
favorecendo assim o estabelecimento de respostas imunolgicas (HOLGATE, 2012;
DEURLOO et al. 2003).
Em relao aos receptores TLRs envolvidos no reconhecimento da Brucella sp,
estudos anteriores sugerem que os receptores TLR2 e TLR4 reconhecem esse
patgeno e participam da sinalizao que consequentemente induz a produo de
diferentes citocinas (OLIVEIRA et al., 2008).
Em 2005, Huang e colaboradores demonstraram que o DNA (DNA do termo
em ingls desoxyribonucleic acid) da Brucella sp apresenta ligantes para o receptor
TLR9 e que a resposta de citocinas do tipo TH1 (T helper 1) dependente dessa
ativao (HUANG et al., 2005).
Colaborando com esses dados, em 2008, Macedo e colaboradores
evidenciaram a importante participao do TLR9 nesta resposta uma vez que sua
ausncia acarretou significativo aumento da carga bacteriana esplnica, associado a
uma reduo na produo da citocina IL-12 em macrfagos e em clulas dendriticas.
Apesar disso, a produo da citocina TNF- (Fator alfa de Necrose Tumoral) e de
NO (NO - do ingls nitric oxide) no foi afetada pela ausncia de TLR9, sugerindo a
existncia de outros receptores envolvidos nesta resposta. (HUANG et al., 2005;
MACEDO et al., 2008). Alm disso, em estudos mais recentes (2013), Almeida e
colaboradores demonstraram que o TLR6 tambm um importante componente
envolvido no combate ao patgeno e est associado a produo de IL-12 e TNF-
por macrfagos e clulas dendrticas. (ALMEIDA et al., 2013).
Aps serem reconhecidas por tais receptores, bactrias intracelulares como a
Brucella sp sero combatidas principalmente atravs de mecanismos mediados por
clulas que so atradas para o stio infeccioso por meio de quimiocinas como a IL-8
e MCP-1, bem como a produo de citocinas inflamatrias como a IL-1, IL-6 e o
TNF- (COELHO-CASTELLO et al., 2009).
Dentre os diversos tipos celulares envolvidos, os macrfagos so
especialmente importantes na infeco pela Brucella abortus uma vez que so os
principais locais de sobrevivncia e replicao da bactria (BALDWIN e GOENKA,
2006). A ativao de macrfagos leva a fagocitose e a destruio do microrganismo
atravs da produo de uma variedade de mediadores bioqumicos que atuam
diretamente contra as bactrias, dentre eles o perxido de hidrognio (H2O2), nion
superxido (O2- ) e o xido ntrico (NO) so os mais eficazes (COELHO-CASTELLO
et al., 2009). Alm disso, a ativao de macrfagos e de clulas dendrticas
estimula a produo da citocina IL-12 que, como j mencionado, possui um papel
de extrema relevncia. Esta citocina a grande responsvel pela diferenciao dos
linfcitos T para o perfil TH1, relacionado a liberao de citocinas de carter pr-
inflamatrio como IFN- e o TNF- que ativam mais macrfagos e potencializam a
destruio do patgeno (BIRON, 1999; HUANG et al., 2001). Adicionalmente, a IL-
12 tambm ativa clulas Natural Killer (NK) que respondem produzindo mais IFN-
potencializando a ativao de macrfagos (MURPHY et al., 2001).
Tendo em vista que a atuao exclusiva da resposta imunolgica inata no
capaz de promover a eliminao de bactrias patognicas, h necessidade da
participao da resposta imunolgica adaptativa. Nesta etapa destacam-se os
mecanismos efetores que envolvem linfcitos TCD4 e TCD8 (COELHO-CASTELLO
et al., 2009).
A ativao dos linfcitos T CD4 ocorre mediante dois sinais. O primeiro
estimulo recebido por esta clula a partir de um receptor presente em sua
superfcie, chamado TCR (do ingls, T cell receptor) que se liga especificamente a
um peptdeo antignico que apresentado via MHC II (MHC - do ingls, Major
Histocompatibility Complex), presente na superfcie de uma clula apresentadora de
antgenos (APC - do ingls, antigen presented cell). O segundo sinal essencial para
a ativao linfocitria fornecido por molculas coestimulatrias que so expressas
na superfcie de clulas apresentadoras de antgeno ativadas. Classicamente, as
molculas B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) recebem destaque entre as molculas
coestimulatrias e exercem papel fundamental na ativao de linfcitos T a partir da
interao com o correceptor CD28 que constitutivamente expresso na superfcie
de clulas T (POD OJIL e MILLER, 2013).
Sabe-se tambm que a interao entre as molculas coestimulatrias CD40L-
CD40 possui papel fundamental em processos imunes celulares. Tem sido
demostrado que a ligao entre a molcula CD40L, expressa principalmente pelas
clulas T e B ativadas, a molcula CD40, presente na superfcie das APCs,
impulsiona a produo de citocinas e induz a expresso de molculas
coestimulatrias facilitando assim a apresentao antignica (ELGUETA et al.,2013).
Outro tipo celular importante na resposta imune contra B. abortus so os
linfcitos T CD8. Uma vez ativadas, estas clulas se diferenciam em linfcitos T
citotxicos (CTLs) capazes de reconhecer e eliminar clulas alvo atravs da
liberao de protenas citotxicas e secreo de citocinas pr-inflamatrias,
principalmente IFN- e TNF-, que ativam os fagcitos (MURPHY et al., 2001). J
foi demonstrado que camundongos que no so capazes de montar uma resposta
atravs de linfcitos T CD8+ (deficientes em MHC de classe I) apresentam um
quadro de brucelose exacerbado, com um aumento substancial na carga bacteriana
esplnica (OLIVEIRA e SPLITTER, 1995).
Os linfcitos B tambm desempenham importante papel no combate ao
patgeno uma vez que atuam na produo de anticorpos antgeno-especifico
capazes de neutralizar e opsonizar o microrganismo, alm de ativar o sistema do
complemento e promover a citotoxicidade mediada por clulas (ADCC) (SKENDROS
e BOURA, 2013).
Em resumo, uma resposta imune efetiva contra a Brucella depende
basicamente da ativao de linfcitos T via MHCI e MHCII, com auxlio dos
coestimuladores (CD80 e CD86). Estas clulas ativadas se diferenciam em linfcitos
TH1 ou CTLs que vo, respectivamente, potencializar a atividade dos macrfagos e
destruir clulas infectadas.
1.6. REGULAO E IMUNOMODULAO
Em paralelo a ativao imunolgica dita anteriormente, um organismo saudvel
frente a infeces apresenta tambm a atuao simultnea de uma resposta
regulatria que extremamente importante para a manuteno da homeostase
(HOLGATE, 2012). Tal resposta compe o repertrio imunolgico e obtida atravs
de clulas e molculas que possuem a funo de suprimir a atuao do sistema
imunolgico e, consequentemente, manter a autotolerncia e prevenir potenciais
efeitos patognicos (YAN e LIU, 2009; FEUERER et al, 2009).
Tem sido relatado que, independente da linhagem, todas as clulas com
carter regulatrio identificadas at o momento podem exercer sua funo
supressora atravs de caractersticas atribudas a dois mecanismos essenciais,
sendo eles o contato direto ou a secreo de citocinas imunossupressoras
(SKAGGS, SINGH e HAHN, 2008).
Dentre as principais citocinas relevantes para o perfil regulatrio esto o TGF-
, IL-10 e a IL-35 que, em geral, promovem a anergia de clulas T e/ou disfuno de
clulas apresentadoras de antgenos (BELKAID, 2007).
O TGF- apresenta efeitos antiproliferativos uma vez que capaz de inibir a
produo da citocina IL-2, essencial para a proliferao de clulas T (BRABLETZ et
al.,1993). Alm disso, essa citocina capaz de induzir a diferenciao de clulas
dendrticas para um perfil tolerognico, limitando a expresso de CD40, CD86 e de
MHCII, alm de aumentar a expresso de CD45RB que considerado um
importante marcador de clulas dendrticas tolerognicas. A citocina em questo
tambm apresentou potencial indutor de IDO (Indoleamine-pyrrole 2,3dioxygenase)
que responsvel pela degradao de triptofano (Song et al, 2014). Sabe-se que a
falta desse aminocido essencial tem sido apresentada como causa da inibio da
ativao de clulas T e, consequentemente, responsvel pela induo de apoptose
dessas clulas (FALLARINO et al., 2003).
A citocina IL-10 tambm uma importante molcula imunorregulatria, sendo
produzida principalmente por linfcitos T, clulas B, macrfagos, neutrfilos e
tambm por alguns subconjuntos de clulas dendrticas (SARAIVA; OGARRA,
2010). Essa citocina apresenta proeminente atividade anti-inflamatria tendo sua
atuao primria em fagcitos e em clulas apresentadoras de antgeno, reduzindo
a produo de citocinas pr-infamatrias, tais como TNF- e IL-12, a expresso de
molculas de MHC II e coestimulatrias, bem como a produo de intermedirios
reativos de oxignio e nitrognio (FIORENTINO; BOND; MOSMANN, 1989; MOORE
et al., 2001).
Outra linha de atuao de clulas regulatrias o contato clula- clula. Nesse
contexto a elevada expresso de molculas coinibitrias como o CTLA-4 e PD-1,
tambm tem participao relevante para o perfil regulatrio (BELKAID, 2007)
(Figura1).
A molcula CTLA-4 (do ingls, cytotoxic T-lymphocyte antigen 4) leva a inibio
da ativao de clulas T por induo de um sinal negativo que coincide com a
estimulao do TCR e/ou por coestimulao inibitria competitiva devido alta
afinidade em ligar-se ao CD80 e/ou CD86 quando comparado com CD28. A ligao
entre clulas T e APCs via CTLA-4 B7 acarreta na inibio das APCs e,
consequentemente, na supresso das respostas de clulas T (VIGNALI, COLLISON
e WORKMAN, 2008).
Outra protena que merece destaque na via de inibio a molcula CD279
tambm conhecida como PD-1 (Programadora de morte celular-1) e seus ligantes
PDL-1 e PDL-2, pertencentes famlia B7:CD28. Tais molculas so expressas em
vrios tecidos, com maiores nveis nos pulmes, corao e fgado, sendo que a
expresso das mesmas induzida por diferentes citocinas (BROWN et al., 2003).
A molcula PD-1 encontrada em clulas T CD4 e CD8, clulas B e clulas
mieloides ativadas, entretanto, no encontrado em clulas no estimuladas. Sua
descrio foi concomitante a dos seus ligantes, PDL-1 e PDL-2, que so
encontrados em moncitos e clulas dendrticas ativadas, sendo que a expresso de
tais ligantes parece ser regulada pela citocina IFN- ou IFN- / LPS (LECHNER et
al., 2001).
A atuao do PD-1 na modulao da resposta imune diferente da utilizada
pela molcula CTLA-4, embora ambas tenham a capacidade de suprimir a ativao
de clulas T (PARRY et al., 2005). Sabe-se que aps interao com seus ligantes
ocorre recrutamento de fosfatases que atuam nas quinases responsveis pela
sinalizao via TCR, acarrentando a reduo dessa via de sinalizao e
consequentemente, inibindo a proliferao e produo de citocinas por clulas T
(GREENWALD, FREEMAN e SHARPE, 2005; MATSUMOTO et al., 2008).
Figura 1: Marcadores de superfcie envolvidos no desenvolvimento de respostas
imunolgicas. Expresso de molculas coestimulatrias e coinibitrias na superfcie de clulas
dendrticas, macrfagos, e clulas tumorais capazes de gerar respostas variadas de acordo com o
receptor alvo presente nas clulas T. FONTE: Adaptado de SHARMA, 2012; MELERO et al.,2013.
Embora a funo da molcula PD-1 j tenha sido bastante estudada na
regulao de clulas T, o seu papel na imunidade inata ainda no est bem
elucidado. O mecanismo de atuao dessa molcula foi estudado em macrfagos
por Huang e colaboradores, que demonstraram que a expresso de PD-1 pode ser
induzida em moncitos e macrfagos frente a resposta inflamatria e dano tecidual,
alm de apresentar sua expresso ampliada em respostas imunolgicas contra
bactrias. Foi visto tambm que animais PD-1 -/- spticos apresentaram os nveis
citocinas pr-inflamatrias elevados e reduzida capacidade de combater/reveter o
quadro de septicemia (HUANG et al., 2009)
Colaborando com esses dados, tambm em 2009, Guitierrez mostrou que
frente a infeco com Trypanosoma cruzi ocorre aumento da expresso de PD-1 em
macrfagos, e que a deficincia dessa protena ocasiona o aumento da capacidade
tripanocida dessas clulas devido a otimizao da ativao celular por IFN- ,
acarretando o aumento da produo de NO (GUTIERREZ, 2009). Tais dados
sugerem que a a atuao da molcula PD-1 em fagcitos similar a que ocorre em
clulas T, sendo ento responsveis pela regulao das respostas imunolgicas.
1.5. SINALIZAO PURINRGICA
O termo purinrgico foi introduzido em 1972 por Burnstock ao sugerir que
molculas de ATP atuariam como um novo transmissor em clulas neuronais. Com
o avano das pesquisas, novos dados corroboraram o papel dos nucleotdeos como
compostos de sinalizao extracelular (KLES, FRST e ILLES, 2007;
BURNSTOCK, 2012).
Os purinoreceptores so representados por diversas famlias e provavelmente
so um dos receptores mais abundantes em mamferos (ABBRACCHIO et al.,
2006). Sua sinalizao dependente de uma variedade de fatores, tais como a
expresso do receptor, sua sensibilidade aos ligantes e a concentrao de
nucleotdeos extracelulares (BOURS et al., 2006).
Os receptores purinrgicos so caracterizados como protenas
transmembranares agrupadas em duas grandes famlias, P1 e P2, de acordo com os
efeitos farmacolgicos de antagonistas e agonistas dos nucleosdeos e nucleotdeos
(BOURS et al., 2006).
Os receptores P1 pertencem a superfamlia de receptores do tipo serpentina,
sendo subdivididos em receptores A1, A2A, A2B e A3, que se ligam a adenosina
extracelular com diferentes afinidades (RALEVIC e BURNSTOCK, 1998).
Com relao a famlia dos receptores do tipo P2, sabe-se que subdivida em
duas sub-famlias, sendo elas P2X e P2Y (BURNSTOCK, G.; KNIGHT, G.E. 2004).
Os receptores do tipo P2X so protenas transmembranas em forma de canal inico
que respondem primariamente ao ATP extracelular e os receptores do tipo P2Y so
protenas transmembrana que apresentam responsividade especifica de acordo com
as subdivises existentes nesse grupo (ABBRACCHIO et al., 2006). Atualmente j
foram descritos oito subtipos do receptor P2Y (P2YR1,2,4,6,11,12,13,14), sendo eles
responsivos a nucleotdeos purnicos (ATP, ADP) e pirimidnicos (UDP e UTP)
(RALEVIC e BURNSTOCK, 1998; JACOBSON, JAYASEKARA e COSTANZI, 2012).
Considerando que o controle dos nveis de nucleotdeos bem como a ativao
dos seus receptores especficos so fatores essenciais para manuteno dos
processos fisiolgicos dependentes da sinalizao purinrgica, tais como inflamao
e tromborregulao (ROBSON, SEVIGNY e ZIMMERMANN, 2006), cabe salientar a
importncia das enzimas capazes de hidrolisar nucleotdeos di e trifosfatados em
seus respectivos mononucleotdeos permitindo assim sua ligao a purinoreceptores e
consequentemente, a sinalizao depentende dessa via (ZIMMERMANN, 2001).
1.5.1. AS ECTO-NUCLEOTIDASES
Os principais nucleotdeos que exercem funo biolgica so o ATP, ADP e
AMP. Essas molculas so formadas a partir de uma base nitrogenada e uma
pentose - ribose - constituindo os nucleosdeos, que posteriormente so fosforilados
por quinases (ATKINSON et al., 2006). Os nucleotdeos representam uma
importante classe de compostos extracelulares que, ao interagirem com seus
receptores especficos, so responsveis pela ativao de vias de sinalizao
fundamentais para o funcionamento celular (SOSLAU e YOUNGPRAPAKORN,
1997).
Sabe-se que tanto nucleotdeos quanto nucleosdeos podem ser liberados no
espao extracelular durante leso mecnica, necrose, apoptose, ativao de clulas
inflamatrias (IDZKO, FERRARI e ELTZSCHIG, 2014) e/ou em resposta a
patgenos exgenos (BOURS et al., 2006).
J foi relatado tambm que molculas de ATP, alm de participarem do
processo de neurotransmisso, contrao muscular, vasodilatao, metabolismo
sseo e metabolismo do glicognio no fgado (BOURS et al., 2006), tambm atuam
como um importante sinalizador na inflamao juntamente com o produto da sua
hidrlise, o ADP (SOUZA et al., 2011).
Adicionalmente, o AMP, um metablito intermedirio da hidrlise do ATP,
funciona como importante molcula sinalizadora intracelular, sendo tambm
substrato para a formao de adenosina (figura 2) que participa da regulao do
processo inflamatrio e apresenta efeitos imunomodulatrios (SOUZA et al., 2011).
J foi demonstrado que o acmulo de adenosina capaz de reduzir a fagocitose e a
produo de reativos de oxignio por macrfagos e neutrfilos alm de inibir a
produo de IL-12 e TNF-. Alm disso, tem sido sugerido que esta molcula
capaz de transformar macrfagos classicamente ativados (M1), relacionados com
processos inflamatrios, em macrfagos alternativamente ativados (M2) (HASK e
PACHER, 2012). Esses ltimos esto associados a um perfil regulador, sendo
grandes produtores de IL-10 e TGF- (BELKAID, 2007)
Figura 2: Exemplificao da produo de adenosina aps degradao sequencial de ATP/ ADP
via CD39 (ENTPD1; ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1) e CD73 (ecto-5'-
nucleotidase) em macrfagos. ATP intracelular, gerado em resposta a padres moleculares
associados a agentes patognicos (PAMPS), liberado e convertido a adenosina pela ao das
molculas CD39 e CD73. A ligao da adenosina a seus receptores capaz de reduzir a produo
de citocinas inflamatrias e estimular a produo de citocinas imunomoduladoras. FONTE: Adaptado
de HAMIDZADEH e MOSSER, 2016.
Nesse contexto, as ecto-nucleotidases, enzimas que podem tanto ser
secretadas quanto localizadas nas membranas celulares (IVANENKOV, MURPHY-
PIEDMONTE e KIRLEY, 2003; MURPHY-PIEDMONTE, CRAWFORD e KIRLEY,
2005), tem sido foco de diversos estudos visto que possuem como funo primria o
metabolismo de nucleotdeos. Sabe-se que os produtos deste metabolismo esto
envolvidos em diversos processos celulares, incluindo a mediao da resposta
imunolgica (figura 2) e interao parasito-hospedeiro (DE MARCO et al., 2003;
MAIOLI et al., 2004).
A presena destas enzimas foi demostrada em animais vertebrados e
invertebrados, plantas, leveduras (HANDA e GUIDOTTI, 1996; ZIMMERMANN E
BRAUN, 1996; SMITH e KIRLEY, 1998) e diferentes protozorios como Toxoplasma
gondii (BERMUDER et al., 1994; SILVERMAN et al., 1998), Leishmania
amazonensis (BERREDO-PINHO et al., 2001; COIMBRA et al., 2002; PINHEIRO et
al., 2006), Entamoeba histoIitica (BARROS et al., 2000), Trichinella spiralis
(GOUNARIS, 2002), Trichomona vaginalis (DE AGUIAR MATOS et al., 2001), e
Crithidia deanei (DOS PASSOS LEMOS et al., 2002). Em 2007, foi descrita tambm
em procarioto, a Legionella pneumophila, um agente causal de pneumonia
(SANSOM et al., 2007).
Alguns trabalhos apresentam tambm uma correlao entre a ativao de
hidrlise de ATP e um dado efeito biolgico na interao parasito-hospedeiro
(SILVERMAN et al., 1998; SANSOM et al., 2007; DE ALMEIDA MARQUES DA
SILVA, E. et al., 2008; SANSOM, ROBSON e HARTLAND, 2008; Santos et al.,
2009). Estes estudos, aliados a outros trabalhos, fazem associaes entre fatores
como a presena gentica, a expresso gnica e/ou a atividade enzimtica de ecto-
nucleotidases de parasitos com a virulncia, adeso celular, sada do parasito da
clula infectada, controle da concentrao de nucleotdeos das clulas hospedeiras
e do meio extracelular e escape do sistema de defesa do hospedeiro (DE MARCO et
al., 2003; MAIOLI et al., 2004).
Na literatura existem sinnimos para este grupo de enzimas, como ecto-
apirase e ecto-ATPDase. A fim de facilitar a comunicao no meio cientifico, em
2001, Zimmermann e colaboradores propuseram uma nomenclatura nica para este
grupo enzimtico, NTPDases. Contudo, o termo CD39 usado para designar a
NTPDase 1 ainda utilizado na imunologia (ZIMMERMANN et al., 2001; ROBSON,
SEVIGNY e ZIMMERMANN, 2006).
A NTPDase 1, ou CD39, foi caracterizada primeiramente como um marcador
de ativao linfide expresso em linfcitos B (MALISZEWSKI et al., 1994).
Posteriormente sua expresso foi observada tambm em clulas T ativadas, clulas
Natural Killer (NK), moncitos, clulas dendrticas (KOZIAK et al., 1999), clulas T
Regulatrias (TReg) e macrfagos (DWYER et al., 2007), desempenhando
importante funo na sinalizao purinrgica e, consequentemente, na resposta
imune visto que essa enzima responsvel pela degradao de ATP em AMP
(ANTONIOLI et al., 2013). Sabe-se ainda que CD39 pode ter participao na adeso
celular, proliferao, apoptose mediada por ATP e na secreo de citocinas
(DWYER et al., 2007).
Outra enzima que desempenha importante papel no metabolismo extracelular
de nucleotdeos a CD73 (ecto5-nucleotidase). Essa molcula considerada um
antgeno de diferenciao leucocitrio, alm de ser caracterizada como um
marcador de ativao de linfcitos T (CHRITENSEN, ANDERSEN e RYDER, 1996).
Em relao a sinalizao purinrgica, o CD73 responsvel pela concluso da
cascata de hidrlise do ATP, atuando na converso de AMP em adenosina
(ANTONIOLI et al., 2013) que, como j citado, apresenta importante efeitos
imunomodulatrios.
A atuao enzimtica das molculas CD39 e CD73 no sistema imune tem sido
alvo de diversos estudos uma vez que claramente exercem importante papel em sua
funo, bem como na regulao das respostas imunolgicas.
1.6. Brucella sp. E EVASO DA RESPOSTA IMUNOLGICA
Com a finalidade de assegurar a sobrevivncia e a progresso da infeco,
sabe-se que diversos patgenos utilizam as mais variadas estratgias de escape
para manipular os mecanismos regulatrios do sistema imune (BELKAID, 2007).
Como exemplo dessas estratgias, h mecanismos que envolvem a induo
de respostas regulatrias normalmente associadas com o trmino das respostas
imunes efetoras do hospedeiro. Essa induo pode ser feita diretamente, atravs da
produo de citocinas regulatrias em resposta aos constituintes do patgeno, ou de
forma indireta, atravs da gerao de clulas com caractersticas regulatrias
(BELKAID, 2007).
A manipulao de clulas apresentadoras de antgenos tambm pode ser
caracterizada como um mecanismo de evaso visto que interfere na expresso de
molculas coestimulatrias, alm de ser capaz de induzir a produo de citocinas
que podem direcionar os linfcitos para um perfil regulatrio (BELKAID, 2007).
Em relao a Brucella, sabe-se que dentre os mecanismos que impedem a
deteco destas bactrias pelo sistema imunolgico do hospedeiro esto a infeco
intracelular prolongada com modificao da expresso dos genes, a sobrevivncia
em vesculas acidificadas, a alterao da apoptose de macrfagos com bloqueio da
fuso do fagolisossomo e reduo da ativao dos mecanismos inflamatrios
(RAJASHEKARA et al., 2006).
Os microrganismos pertencentes a essa linhagem bacteriana so fagocitados
principalmente por macrfagos logo aps penetrarem na mucosa. Desse modo, sem
ativarem fortemente o sistema imune tais bactrias coordenam a expresso de
mltiplos fatores de virulncia relacionados a sua entrada e trfego, favorecendo
assim a ocupao e permanncia em seu nicho de replicao (RAMBOW-LARSEN
et al., 2009). Diversos mecanismos reguladores da expresso gnica foram
identificados no gnero Brucella, entre eles o Quorum sensing, stringent response,
sistema regulatrio de dois componentes e, mais recentemente, o blue-light
responsive LOV-HK protein, que responsvel pela adaptao da bactria a
diferentes ambientes (RAMBOW-LARSEN et al., 2009).
Alm dos mecanismos j descritos acima, tem sido sugerido que este patgeno
capaz de modular as clulas apresentadoras de antgenos de forma a favorecer
sua sobrevivncia. De fato, j foi demonstrado que esta bactria capaz de infectar
macrfagos (BALDWIN e GOENKA, 2006), linfcitos B (GOENKA et al.; 2012) e
clulas dendrticas (SALCEDO et al., 2008), sendo tambm capaz de inibir a
produo de citocinas pr-inflamatrias, como a IL-12 (SATHIYASEELAN et al.,
2006). Alm disso, APCs infectadas com Brucella apresentam uma reduo na
expresso das molculas coestimulatrias CD80 e CD86 (ZAITSEVA et al., 1996;
BILLARD, DORNAND e GROSS, 2007; SALCEDO et al., 2008), bem como uma
influncia negativa sobre a expresso da molcula apresentadora MHC II (HELLER
et al., 2012). A reduo na expresso dessas molculas resulta em uma menor
ativao e proliferao de linfcitos, podendo favorecer a sobrevivncia do
patgeno. Entretanto, apesar de importantes, os mecanismos envolvidos nesta
imunomodulao ainda no foram completamente elucidados.
Sendo assim, uma vez que diversos estudos tm evidenciado a influncia da
molcula PD-1 e das ecto-nucleotidases CD39 e CD73 na ativao e produo de
citocinas por clulas apresentadoras de antgenos, aliado ao fato de no existirem
estudos que relacionam estes marcadores Brucella, o objetivo deste trabalho
determinar se a infeco com B. abortus capaz de alterar a expresso destas
molculas e assim limitar a ao do sistema imune, favorecendo a sobrevivncia do
patgeno.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar a participao das molculas PD-1, CD39 e CD73 na imunomodulao
induzida pela bactria Brucella abortus em clulas da imunidade inata.
2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
2.2.1. Avaliar a expresso das molculas coestimulatrias CD80 e CD86,
bem como da molcula apresentadora MHC II em macrfagos, clulas dendrticas e
linfcitos B frente a infeco com B.abortus.
2.2.2. Avaliar a expresso das molculas CD39 e CD73 em macrfagos,
clulas dendrticas e linfcitos B infectados por B. abortus.
2.2.3. Caracterizar os mecanismos de ao do efeito imunomodulador
desempenhado pela bactria B.abortus.
3. MATERIAL E MTODOS
3.1. ANIMAIS
Foram utilizados camundongos fmeas da linhagem C57BL/6 com idade entre
8 e 10 semanas, pesando cerca de 18 a 20 g, que foram adquiridos do Centro de
Biologia da Reproduo da Universidade Federal de Juiz de Fora. Os animais foram
acondicionados em gaiolas plsticas e mantidos no Biotrio do laboratrio de
Imunologia da Universidade Federal de Juiz de Fora com gua e rao ad libitum.
3.2. LINHAGEM BACTERIANA E CONDIES DE CULTIVO
Foram utilizadas nesse trabalho bactrias B. abortus pertencentes as linhagens
S2308 e RB51, ambas disponveis no Laboratrio de Imunologia de doenas Infecto-
Parasitrias da Universidade Federal de Juiz de Fora.
As linhagens utilizadas nos ensaios foram cultivadas em meio Brucella Broth
(BB) lquido (DIFCO), a 37C sob agitao constante. Aps trs dias de crescimento,
a cultura bacteriana foi centrifugada e o sedimento foi ressuspendido em tampo
salina fosfato (PBS) 0,15 M pH 7,4 (2,8 mM Na2PO4; 7,2 mM Na2HPO4; 0,14 M
NaCl). As alquotas foram armazenadas em glicerol a 30%, a uma temperatura de -
80C. Para realizao da contagem bacteriana, alquotas destas culturas foram
diludas serialmente e plaqueadas em meio BB solidificado com 1,5% de gar
bacteriolgico. Aps incubao por 72 horas a 37C, foi possvel determinar a
concentrao bacteriana presente na suspenso por meio da contagem do nmero
de unidades formadoras de colnias (UFC) visualizadas na placa.
3.3 INFECO
Os animais foram infectados intraperitonealmente com 1x106 UFC da linhagem
S2308 ou RB51 da bactria B. abortus diludas em 200l de PBS. Aps os tempos
de infeco (24, 48, 72 e 168 horas), os animais foram eutanasiados, por
deslocamento cervical, para a retirada do bao e realizao dos ensaios ex vivo.
3.4. LINHAGEM CELULAR
Os ensaios desenvolvidos nesse trabalho foram realizados em macrfagos
murino pertencentes a linhagem RAW 264.7 (ATCC TIB-71 TM), gentilmente
cedida pelo Prof. Dr. Jair Adriano Kopke de Aguiar.
3.5. CULTURA DE CLULAS
As linhagens RAW 264.7 foram cultivadas em garrafas de cultura de 25 cm3
(SARSTEDT) com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de
antibitico e mantidas em estufa incubadora umidificada a 37C com atmosfera de
5% de CO2. Periodicamente as clulas tinham seu crescimento e morfologia
monitorados sendo que, de acordo com o ndice mittico, foram realizadas trocas do
meio de cultura, havendo monitoramento at estas alcanarem confluncia de
aproximadamente 80%. Tal caracterstica possibilitou que as clulas fossem ento
congeladas em meio apropriado de congelamento (90% SFB, 10% Dimetilsulfxido
(DMSO), VETEC), transferidas para garrafas de maiores dimenses (75 cm3,
SARSTEDT) ou utilizadas nos ensaios.
Uma vez que as linhagens celulares utilizadas so aderentes, suportes
plsticos (cell scraper 71 SARSTED) foram utilizados para sua remoo do interior
das garrafas.
3.6. MACRFAGOS INTRAPERITONEAIS
O recrutamento dos macrfagos intraperitoneais foi realizado pela injeo
intraperitoneal de 2 mL de tioglicolato 3% estril (GORDON, UNKELESS e COHN,
1974). Aps 4 dias, os animais foram eutanasiados para a realizao de uma
lavagem peritoneal onde 5 mL de tampo fosfato-salino (PBS, do ingls phosphate
buffered saline) gelado foram injetados e, em seguida, recolhidos com seringa. O
lquido coletado do peritneo foi acrescido de PBS estril at o volume final de 10
mL e submetido centrifugao a 1500 RPM, por 10 minutos. As clulas obtidas
foram ressuspendidas em 2 mL de meio de cultura RPMI-1640 suplementado com
5% de SFB e 1% de antibitico. A concentrao celular foi determinada utilizando-se
em cmara de Neubauer com corante azul de tripan.
3.7. DETERMINAO DA PRODUO DE XIDO NTRICO
A quantidade de nitrito presente no sobrenadante das culturas estimuladas de
clulas RAW 264.7 foi mensurada como um indicador da produo de NO por meio
da Reao de Griess (GUEVARA et al., 1998). Para tanto, foram adicionadas 100 L
do sobrenadante das culturas tratadas a igual volume do Reagente de Griess. Em
seguida, foi efetuada a incubao temperatura ambiente por 10 minutos e posterior
leitura em espectrofotmetro a 540 nm. A quantidade de nitrito (NO2-) nas amostras
foi obtida por meio de curva padro
3.8. CULTURA DE ESPLENCITOS
O bao extrado de cada animal foi macerado em 10 mL de PBS, com o auxlio
de uma peneira de ao. Aps serem macerados foram submetidos centrifugao
por 10 minutos a 1500 RPM. Posteriormente, o sobrenadante foi descartado e as
clulas foram ressuspendidas em 2 mL de tampo ACK (Ammonium-Chloride-
Potssium - 1% KHCO3 e 8% NH4Cl em gua destilada) e incubadas por 5 minutos,
a temperatura ambiente, ocorrendo a lise osmtica dos eritrcitos. Aps a
incubao, 28 mL de PBS foram acrescentados e seguiu-se nova centrifugao.
Novamente o sobrenadante foi descartado e as clulas foram ressuspendidas em 2
mL de meio RPMI (GIBCO) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% dos
antibiticos penicilina (100 U/mL, GIBCO) e estreptomicina (1 g/mL, GIBCO). Em
seguida a concentrao das clulas foi determinada na cmara de Neubauer.
As clulas foram plaqueadas na concentrao de 1x106 clulas/poo em placas
de 96 poos de fundo em U (NUNC), submetidas a marcao e realizao da
citometria de fluxo.
3.9. DETERMINAO DA PROLIFERAAO CELULAR
Esplencitos derivados de animais de animais infectados ou no foram
cultivados conforme descrito acima e estimulados com o mitgeno Concanavalina A
(5g/ml- Sigma-Aldrich). Aps 72 horas de incubao 37oC e sob atmosfera com
5% de CO2, o sobrenadante ser retirados para a adio de 90 l/poo de meio
RPMI suplementado (10% de soro fetal bovino e 1% de antibitico) e 10 l/poo de
3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil tetrazolium bromido (MTT - Sigma-Aldrich),
(5mg/ml). As clulas sero ento novamente incubadas a 37C e sob atmosfera com
5% de CO2 durante 4 horas. Aps esse perodo, o sobrenadante ser retirados para
adio de 100 l de DMSO (Dimetilsulfxido- Synth). A reao ser avaliada em
leitor de microplaca (Biorad) em comprimento de onda de 550 nm. O ndice de
proliferao ser ento calculado levando-se em conta a metabolizao do MTT de
clulas estimuladas e clulas no estimuladas.
3.10. CITOMETRIA DE FLUXO PARA AVALIAO DA EXPRESSO DOS MARCADORES CELULARES DE SUPERFCIE
Aps serem mantidas em cultura (clulas RAW 254.7) ou serem coletadas
(macrfagos intraperitoneais), as clulas foram contadas em cmara de Neubauer
utilizando o corante Azul de Tripan (Sigma), e posteriormente transferidas para
placas de 96 poos de fundo chato, na concentrao de 5 x 105 clulas por poo
(adaptado do estudo de Huo et al.,2012). As clulas foram ento incubadas por 24
horas e posteriormente infectadas com MOI (MOI do ingls, multiplicity of infection)
de 50:1 (WEISS, D. S. et al., 2005) das linhagens S2308 ou RB51 da bactria
Brucella abortus. Aps 2 horas as placas foram ento centrifugadas por 5 minutos,
1500 Rpm, 4 C e lavadas com soluo estril de tampo fosfato-salino (PBS- do
ingls, phosphate buffered saline) acrescido de 1% de antibitico. Foram ento
adicionados o estmulo lipopolissacardeo (LPS) de Escherichia coli a 1 g/mL
(Sigma) como controle positivo e meio RPMI (GIBCO) administrado nas clulas no
estimuladas sendo essas usadas como controle negativo. Aps mais 24 horas de
incubao 37C e sob atmosfera com 5% de CO2 iniciou-se o processo de
marcao celular. Com relao aos esplenocitos oriundos de animais infectados, o
contedo celular foi obtido conforme descrito no item____e em seguida submetido a
marcao celular.
Inicialmente, as placas contendo as clulas foram lavadas com 200 l de
tampo de FACS (PBS acrescido 1% de soro fetal bovino e 0,09% de azida (NaNO3)
gelado a fim de remover as clulas aderidas. Em seguida o contedo celular foi
transferido para uma placa de fundo em U que foi ento centrifugada a 1500 RPM
por 5 minutos a 4C e o sobrenadante foi removido por inverso rpida da placa.
O contedo celular foi ento ressuspenso em 200 l de PBS e posteriormente
centrifugado a 1500 RPM por 5 minutos a 4C. Aps a remoo do sobrenadante
por inverso rpida da placa, as clulas receberam o marcador de viabilidade celular
FVS (VER DADOS) na concentrao de (VER DADOS) por poo. As clulas foram
ento incubadas por 15 minutos a 4C. Poos que tiveram a morte celular induzida
pela administrao de DMSO na concentrao de (VER DADOS) por poo durante
15 minutos foram utilizados como controle positivo na marcao com o corante de
viabilidade celular visto que esse atua sob clulas inviveis.
Posteriormente as placas contendo as clulas foram lavadas duas vezes com
200 l de tampo de FACS gelado e aps remoo do contedo por inverso rpida
da placa, as clulas foram ressuspensas no volume residual e foram adicionados a
cada poo 20L de soluo de tampo de FACS acrescida de anticorpo de bloqueio
anti- CD16/CD32 (Clone 93) na concentrao de 0,3 g por poo. O contedo
celular foi ento incubado por 15 minutos a 4C e posteriormente foram adicionados
100 l/poo de tampo de FACS seguido de centrifugao por 5 minutos, 1500
Rpm, 4 C.
O sobrenadante foi ento removido por inverso rpida da placa e as clulas
foram ressuspendidas no volume residual, sendo adicionado a cada poo 20L de
soluo de tampo de FACS acrescida de 0,3 g por poo dos diferentes anticorpos
de interesse, conforme descrito na tabela abaixo (Tabela 1).
Tabela 1: Anticorpos utilizados nos ensaios de citometria (Becton & Dickinson).
Anticorpos Clone Fluorocromos
anti-CD80 Clone 16-10A1 APC
anti-CD86 Clone GL1 FITC
anti-MHC Clone AF6-120 PE
anti-CD40 Clone 3/23 BV421
anti-PD-1/CD279 Clone J43 BV421
anti-CD39 Clone 24DMS1 PE
anti-CD73 APC
anti-CD25
anti- CD16/CD32 Clone 93 APC
Posteriormente, as amostras foram incubadas por 30 minutos a 4C no escuro
e em seguida foram adicionados 100 l/poo de tampo de FACS seguido de
centrifugao por 5 minutos, 1500 Rpm, 4 C, sendo esse procedimento realizado
duas vezes. As clulas foram ento ressuspensas em 150 l de tampo de FACS e
transferidas para tubos especficos para FACS (CORNING). As amostras foram
coletadas em citmetro de fluxo FACScanto II (Becton & Dickinson), onde 30.000
eventos foram adquiridos e os resultados foram analisados pelo software Flowjo.
A estratgia de gate utilizada para determinao dos fentipos celulares
consistiu inicialmente na retirada dos doublets, seguida da determinao da zona de
demarcao celular de acordo com o tamanho (FSC) x granulosidade (SSC)
caractersticos das clula alvo. As clulas viveis foram ento determinadas a partir
da utilizao do corante de viabilidade clulas VFS e a mdia de intensidade de
fluorescncia (MIF) destas clulas foi determinada.
3.11. CITOMETRIA DE FLUXO PARA AVALIAO DA EXPRESSO DO MARCADOR INTRACELULAR FOXP3
Aps serem extradas e plaqueadas conforme o item__, clulas esplnicas
foram submetidas a marcao intracelular com kit especfico para FoxP3 (Mouse
FoxP3 Buffer Set Becton & Dickinson). Primeiramente as placas contendo as
clulas foram centrifugadas a 1500 RPM por 10 minutos e o sobrenadante removido
por inverso rpida da placa.e posteriormente as clulas foram ento
ressuspendidas em 100l de tampo de FACS (PBS com 1% de soro fetal bovino e
0,09% de azida (NaNO3). Em seguida, as placas de cultura foram submetidas a
nova centrifugao (1500 RPM, 10 minutos) e foram adicionados a cada poo, 20L
de soluo de tampo de FACS acrescida de anticorpos destiados a marcao de
protenas de superfcie (tabela 1). Seguiu-se ento uma incubao por 20 minutos a
temperatura ambiente e acrescentou-se 200 l/poo de tampo de FACS seguida de
centrifugao (1500 RPM, 10 minutos). O sobrenadante foi removido e as clulas
foram ressuspendidas em 200 l do tampo de fixao (Fixation Buffer) e incubadas
por 30 minutos a 4C. Seguiu-se nova centrifugao a 1500 RPM por 5 minutos e
remoo do sobrenadante. As clulas foram ento ressuspendidas em 200 l de
tampo de permeabilizao (Permeabilization Buffer) pr-aquecido (37C).
As placas contendo o contedo celular foram novamente centrifugadas (1500
RPM, 5 minutos), o sobrenadante descartado e as clulas ressuspendidas em 200 l
de tampo de permeabilizao pr-aquecido novamente e posteriormente foi
realizada incubao por 30 minutos a 37C. Em seguida, a placa foi submetida a
nova centrifugao (1500 RPM, 5 minutos), o sobrenadante foi descartado e foram
adicionados a cada poo, 20L de soluo de tampo de FACS acrescida do
anticorpo anti-FoxP3 (Clone MF23), com a marcao PE. Seguiu-se uma incubao
por 20 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, foi acrescentado 200 l/poo de tampo de FACS seguida de
nova centrifugao (1500 RPM, 5 minutos), sendo esse procedimento realizado duas
vezes. As clulas foram ento ressuspendidas em 250 l de tampo de FACS e
transferidas para tubos especficos para FACS (CORNING). As amostras foram lidas
em citmetro de fluxo FACScanto II (Becton & Dickinson), onde 30.000 eventos
foram adquiridos.
A estratgia de gate utilizada para determinao dos fentipos celulares consistiu
inicialmente na retirada dos doublets, seguida da determinao da zona de
demarcao celular de acordo com o tamanho (FSC) x granulosidade (SSC)
caractersticos das clula alvo. As clulas viveis foram ento determinadas a partir
da utilizao do corante de viabilidade clulas VFS e a mdia de intensidade de
fluorescncia (MIF) destas clulas foi determinada.
3.12. CULTURA DE MACRFAGOS E PREPARO DE HOMOGENEIZADO
CELULAR PARA REALIZAO DA TCNICA WESTERN BLOTTING
Para qualificar a NTPDase CD39 foram utilizados macrfagos pertencentes a
linhagem RAW 264.7 cultivados em garrafas de cultura de 25 cm3 (SARSTEDT)
com meio RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB e 1% de antibitico e
mantidas em estufa incubadora umidificada a 37C com atmosfera de 5% de CO2.
As clulas foram ento contadas, plaqueadas na concentrao de 1 x 107 e
posteriormente infectadas e estimuladas conforme descrito anteriormente (item 3.4).
Aps 3 dias de cultura, as clulas foram tradadas com tripsina-EDTA (0,25% Sigma-
Aldrich), coletadas e centrifugadas a 1500 Rpm por 10 minutos. Esse processo foi
seguido por duas lavagens com PBS estril e uma nova centrifugao.
As clulas foram ento ressuspendidas em tampo Tris-HCL 50 mM, pH 7,4,
com sacarose 8% e inibidores de proteases leupeptina (0,5 ug/ml), pepstatina (0,07
ug/ml), inibidor de tripsina (50 ug/ml) e fluoreto de fenilmetilsufonil (2 ug/ml). O
rompimento da membrana celular e liberao de antgenos foram obtidos por meio
de 5 ciclos de congelamento e descongelamento em nitrognio lquido e 5 ciclos no
UltraSonic Cleaner (Unique) por 10 minutos. O homogeneizado de clulas foi
estocado a -20C at o momento de uso. A determinao de protenas totais foi
realizada pelo mtodo de Lowry (LOWRY et al., 1951).
3.13. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E IDENTIFICAO DA PROTENA CD39 PELA TCNICA WESTERN BLOTTING
As amostras de homogeneizado celular foram ento solubilizadas em tampo
de amostra, aquecidas por 5 minutos a 100C e aplicadas em gel de poliacrilamida
10% com 0,1% de dodecil sulfato de sdio (SDS), de acordo com Laemmli (1970).
Tambm foi aplicado um padro de peso molecular pr-corado. A corrida foi
realizada por cerca de 2 horas a 100 V em um sistema de eletroforese (Mini Protean
III, BioRad). Uma parte do gel foi corada com Azul de Comassie (1% de azul de
comassie R (m/v), 30% de cido actico glacial e 40% de metanol) e as protenas da
outra parte foram eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose (Mini Trans-
Blot III, BioRad). As membranas foram cortadas em poos, bloqueadas por 2 h com
tampo fosfato (PBS) + 3% de caseina + Tween 20 0,1% e incubadas com o
anticorpo anti-CD39 na diluio de 1:500. Os ensaios foram revelados por
quimioluminscia utilizando anticorpos secundrios anti-IgG de coelho acoplado a
peroxidase na diluio de 1:1000 (Bethyl Laboratories INC., Montgomery, TX, USA)
e o luminol como substrato, seguido de exposio a filmes de raio-X, de acordo com
as instrues do fabricante (ECL Western blotting System; GE Healthcare Life
Sciences, Brasil).
4. ANLISE ESTATSTICA
Os resultados obtidos neste estudo foram analisados por meio do programa
estatstico Graph Pad Prism 5 (GraphPad Software, Inc), sendo utilizado o teste -
paramtrico ANOVA seguido do ps-teste Dunnet. O nvel de significncia adotado
nas anlises foi de p < 0,05.
5. RESULTADOS
5.1. AVALIAO DA EXPRESSO DE CD80, CD86 E MHC II EM CLULAS RAW
264.7 INFECTADAS COM B. abortus
O reconhecimento de antgenos um fator de suma importncia para o
desenvolvimento de respostas imunolgicas frente a infees e, nesse contexto, a
expresso do complexo de histocompatibilidade (MHC) aliada a expresso de
molculas coestimulatrias desempenha papel fundamental na efetivao das
respostas imunolgicas (KHAN et al., 2012). Dados descritos na literatura sugerem
que diversos patgenos evadem das respostas imunolgicas do hospedeiro atravs
da reduo da expresso de tais molculas. Essa caracterstica auxilia no escape de
mecanismos de imunovigilncia favorecendo dessa forma a cronicidade da infeco
(TOBIAN et al., 2003; ANTONIOU e POWIS, 2008).
Diferentes estudos tm sugerido que um dos mecanismos de evaso utilizado
pela bactria Brucella a diminuio da expresso das molculas coestimulatrias
CD80 e CD86, bem como da molcula apresentadora MHCII. Esta reduo poderia
inibir a ativao de linfcitos T especficos e assim facilitar a sobrevivncia do
patgeno (HELLER et al., 2012).
Para avaliar esta proposio, clulas RAW 264.7 foram cultivadas e infectadas
com as linhagens S2308 ou RB51 da bactria B. abortus. Alm disso, para
determinar a intensidade da imunomoduo, clulas infectadas foram estimuladas
com LPS de E.coli, a fim de induzir a expresso das molculas em questo.
Conforme demonstrado nas figuras 4 e 5, o estmulo com LPS foi efetivo na
induo da expresso das molculas coestimulatrias CD80 e CD86 quando
comparado a clulas no estimuladas (meio). De maneira interessante, a infeco
com B. abortus, tanto da linhagem S2308 quanto da RB51, no foi capaz de
aumentar a expresso dessas molculas de maneira significativa. A estimulao de
clulas infectadas restaurou a expresso das molculas em questo sugerindo que
a bactria no capaz de manter a imunomodulao na presena de outros
estmulos.
Figura 3: Estratgia de gate e eterminao da zona de macrfagos. Clulas pertencentes a
linhagem de macrfagos RAW 264.7 foram mantidas em cultura, e aps realizao do protocolo de
marcao da tcnica de citometria de fluxo, as medidas de disperso foram usadas para determinar
as Single cells. A populao celular foi demarcada de acordo com o tamanho (FSC) x granulosidade
(SSC) caractersticos destas clulas, e atravs do marcador de viabilidade FVS 510 a populao
clular vivel foi determinada. A mdia de intensidade de fluorescncia (MIF) foi determinada com
ndice de 70,6%.
Figura 4: Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD80. Macrfagos RAW 264.7
(5x105/poo) foram infectados com MOI de 50:1 das linhagens S2308 ou RB51 da bactria Brucella
abortus. Aps 2 horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de
Escherichia coli. Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e
clulas estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD80 foi determinada por
citometria de fluxo. (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da
expresso de CD80. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
Figura 5: Anlise da expresso de molculas coestimulatrias CD86. Macrfagos RAW 264.7
(5x105/poo) foram infectados com MOI de 50:1 das linhagens S2308 ou RB51 da bactria Brucella
abortus. Aps 2 horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de
Escherichia coli. Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e
clulas estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD86 foi determinada por
citometria de fluxo. (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da
expresso de CD86. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
A avaliao da expresso das molculas de MHCII evidenciou um perfil
diferente do observado anteriormente. Conforme demonstrado na figura 6, a
infeco com a bactria no foi capaz de estimular significativamente a expresso
de molculas de MHCII.
Meio LPS S23 S23+LPS RB RB+LPS
0
20
40
60
80
MH
C II (M
IF)
Meio LPS S2308 S2308+LPS RB51 RB51+LPS0
20
40
60
80RAW
MH
C II (M
IF)
Figura 6: Anlise da expresso de molculas MHC II. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram
infectados com MOI de 50:1 das linhagens S2308 ou RB51 da bactria Brucella abortus. Aps 2
horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli.
Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas
estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de MHCII foi determinada por citometria
de fluxo. (A) Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de
MHCII. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
5.2. AVALIAO DA EXPRESSO DE CD40 EM CLULAS RAW 264.7
INFECTADAS COM B. abortus
Como j mencionado, a interao entre a molcula CD40 e seu ligante possui
papel fundamental em processos imunolgicos uma vez que, embora a ativao de
clulas T possa ocorrer na ausncia dessa via de sinalizao, funes imunolgicas
como produo de citocinas e expresso de molculas coestimulatrias so
ineficientes na sua ausncia (ELGUETA et al.,2013). Desse modo, a fim de
verificarmos o grau de ativao celular avaliamos a expresso da molcula CD40
em macrfagos RAW 264.7 infectados com a linhagem S2308 da bactria Brucella
abortus.
Conforme demonstrado nos grficos da figura 7, o estmulo com LPS foi capaz
de induzir aumento na expresso da molcula CD40 quando comparado ao controle
negativo (meio). Em relao as clulas infectadas com a bactria Brucella abortus foi
observado que, em relao ao grupo estimulado com LPS, o patgeno em questo
capaz de modular negativamente a expresso desse marcador. Quando as clulas
infectadas so estimuladas com LPS vista uma elevao na expresso de CD40,
sugerindo mais uma vez que o efeito modulador exercido pela bactria no
mantido frente a outros estmulos.
Meio LPS S2308 S2308+LPS RB51 RB51+LPS0
5
10
15
** *
RAWC
D40 (
MIF
)
Figura 7: Avaliao da expresso de molculas CD40. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram
infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 ou RB51 da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas
de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como
controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas
somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD40 foi determinada por citometria de fluxo. (A)
Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de CD40. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
Meio LPS S2308 S2308+LPS RB51 RB51+LPS0
20
40
60
80
* * *
*
PD
-1 (
MIF
)
RAW
Figura 10: Avaliao da expresso de molculas PD-1. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo)
foram infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 ou RB51 da bactria Brucella abortus. Aps 2
horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli.
Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas
somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de PD-1 foi determinada por citometria de fluxo. (A)
Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de PD-1. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
5.4. AVALIAO DA EXPRESSO DE CD39 POR WESTERN BLOTTING
Conforme mencionado anteriormente, sabe-se que diversos patgenos
expressam naturalmente a NTPDase CD39 e utilizam dessa via para evadir das
respostas imunolgicas do hospedeiro favorecendo assim a progresso da infeco.
Dessa forma, a fim de verificarmos a expresso dessa protena na bactria B.
abortus e consequentemente avaliarmos a manipulao do fentipo celular do
hospedeiro frente a infeco com o patgeno em questo, avaliamos pela tcnica de
Western Blotting a expresso de CD39 na bactria B. abortus e utilizamos como
controle positivo macrfagos RAW 264.7
Conforme mostrado na figura 9, foi possvel detectar a protena alvo a
aproximadamente 66 kDa, valor que corresponde a massa molecular da enzima
NTPase-1/CD39 (FIETTO et al., 2004). Os dados obtidos indicam que
diferentemente dos macrfagos RAW 264.7 (figura 9/ banda 1), bactrias B. abortus
S2308 no expressam a protena em questo (figura 9/ bandas 2). Tais resultados
indicam que a variao na expresso da NTPDase CD39 em clulas infectadas se
deve a modificaes induzidas pelo patgeno.
Figura 9: Identificao da NTPDase 1/ CD39 em macrfagos pela tcnica de Western blotting. Alquotas contendo protenas extradas de homogeneizado de clulas foram submetidas a corrida
eletrofortica em gel de poliacrilamida e eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose e
incubados com anticorpos anti-CD39 na diluio de 1:500. Em (1) controle positivo RAW 264.7; (2)
Bactria Brucella abortus S2308.
5.5. DETERMINAO DA EXPRESSO DA MOLCULA CD39 EM CLULAS
RAW 264.7 INFECTADAS POR B. abortus
Uma vez que a infeco por Brucella foi capaz de inibir a expresso dos
coestimuladores CD80 e CD86, CD40 e PD-1, avaliamos se esta imunomodulao
est relacionada ao aumento da expresso da NTPDase CD39. Conforme
demonstrado nos grficos da figura 8, de forma surpreendente, foi percebida
reduo significativa na expresso do marcador CD39 em clulas infectadas quando
comparadas ao controle positivo (LPS). Essa reduo tambm evidenciada no
grupo celular infectado e estimulado com LPS embora de maneira menos efetiva.
Estes resultados sugerem que a diminuio na expresso dos coestimuladores
(figuras 4 e 5) em resposta a infeco por B. abortus no est relacionada ao
aumento da expresso de CD39.
Figura 8: Anlise da expresso de molculas CD39. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram
infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas de
infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como
controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas
somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD39 foi determinada por citometria de fluxo. (A)
Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de CD39. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
Figura 12: Anlise da expresso de molculas CD73. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram
infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308 da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas de
infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com 1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como
controle foram utilizadas clulas no infectadas e no estimuladas (meio) e clulas estimuladas
somente com LPS. Aps 24 horas, a expresso de CD73 foi determinada por citometria de fluxo. (A)
Histograma representativo da intensidade de fluorescncia, (B) Anlise da expresso de CD73. * significativo em relao ao controle estimulado com LPS (P
Visto que o xido ntrico uma molcula sintetizada por diferentes tipos
celulares e participa de diversas funes fisiolgicas incluindo o combate a
patgenos (BOGDAN, ROLLINGHOFF e DIEFENBACH, 2000), ns avaliamos a
produo desse composto atravs de anlises no sobrenadante das clulas RAW
264.7 infectadas e infectadas e estimuladas com LPS de Escherichia coli.
Como apresentado na figura___, vimos que a infeco com B. abortus foi
capaz de promover aumento significativo da produo de NO em clulas RAW 204.7
quando comparado com controle positivo (LPS). Tal variao foi vista tambm em
clulas infectadas e estimuladas com LPS.
Meio LPS S2308 S2308 + LPS0
5
10
15
20 RAW
******
NO
(
xid
o N
tri
co
)
Figura 12: Determinao da produo de xido ntrico em clulas Raw 264.7 infectadas com B.
abortus. Macrfagos RAW 264.7 (5x105/poo) foram infectados com MOI de 50:1 da linhagem S2308
da bactria Brucella abortus. Aps 2 horas de infeco, as clulas foram lavadas e estimuladas com
1 g/mL de LPS de Escherichia coli. Como controle foram utilizadas clulas no infectadas e no
estimuladas (meio) e clulas estimuladas somente com LPS. Aps 24 horas, a produo de NO foi
determinada por meio da Reao de Griess. * significativo em relao ao controle estimulado com
LPS (P
24 horas aps a infeco. Para isso, macrfagos foram coletados, cultivados e
infectados com as linhagens S2308 ou RB51 da bactria B. abortus. Visando
determinar a intensidade da imunomoduo, clulas infectadas foram estimuladas
com LPS de E.coli, a fim de induzir a expresso das molculas em questo.
A partir da estratgia de gate utilizada em nossas anlises, visando selecionar
clulas maduras capazes de induzir proliferao de linfcitos T, foram selecionadas
clulas com expresso elevada do marcador CD11b (CD11b hi). Como apresentado
na figura 13, o estmulo com LPS foi efetivo na induo da expresso das molculas
coestimulatrias CD80 e CD86 quando comparado a clulas no estimuladas
(meio). Vimos tambm que a infeco com B. abortus, tanto da linhagem S2308
quanto da RB51, no foi capaz de aumentar a expresso dessas molculas de
maneira significativa. Assim como em clulas RAW 264.7, vimos que a estimulao
de clulas infectadas restaurou a expresso das molculas em questo sugerindo
que a bactria no capaz de manter a imunomodulao na presena de outros
estmulos.
Figura 3: Estratgia de gate e eterminao da zona de clulas CD11bhi. Macrfagos
intraperitoneais foram coletados e mantidos em cultura. Aps realizao do protocolo de marcao da
tcnica d