Aula 1. Aspectos Gerais em Microbiologia

PRINCÍPIOS BÁSICOS EM

MICROBIOLOGIA

Prof. Milton Luiz da Paz Lima

Instituto Federal Goiano campus UrutaíLaboratório de MicrobiologiaDisciplina de Microbiologia

Dr. Milton Luiz da Paz Lima

Experimentos de Louis Pasteur

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CONCEITOS Assepsia: Isento de todo germe séptico Limpeza: Ação ou efeito de limpar Desinfetar: "Esterilizar-não totalidade" um ambiente, um

instrumento, ou livrar de infecção uma parte do corpo, pela destruição ou inativação de substâncias ou organismos patogênicos

Desinfestação: Livrar de insetos, roedores ou outros animais infestantes, capazes de transmitir infecção, e que estão presentes numa pessoa, em sua roupa, ou no meio em que vive.

Esterilização: tornar livre de microrganismos Preparo de Meios de Cultura: receitas especiais para cultivo de

microrganismos. Isolamento: retirada de propágulos da fonte para uma condição

artificial. Repicagem: manipulação de propágulos de microrganismos em

condições artificiais. Conservação: de cepas de microrganismos.

Dr. Milton Luiz da Paz Lima3

DESINFETANTESDESINFETANTES são sanitizantes utilizados na indústria farmacêutica, são

substâncias ou produtos capazes de destruir, indiscriminadamente, os microrganismos de uma superfície ou instrumento, sem no entanto, eliminar as formas esporuladas.

Utensílios do laboratório não podem ser esterilizados;

Desinfetantes: substâncias químicas de superficial ou profunda; influenciados pelo tempo, concentração, durabilidade.


EsterilizaçãoEsterilização Via calor

Álcool, cloro, iodo e fenol

Via vapor (autoclave)

Radiação UV

Gases tóxicos e

Filtragem


Métodos FísicosMétodos Físicos

Calor (Fis) Úmido: materiais que não alteram sua forma sob elevada temperatura. Vapor Saturado – AUTOCLAVE. 10-15 min 121 o.C sob pressão 1,1 e 0,7 kgf/cm2. Para solos descanso por 4-5 dias!

Calor (Fis) Seco: tempo maior, uso da ESTUFA ESTERILIZADORA. Temperaturas maiores via calor úmido; 1 hora 180 o.C, 2 h 170 o.C, 4-6 h a 140 o.C


Métodos FísicosMétodos Físicos Flambagem: agulhas, estiletes, bisturis, alça de Drigalski. Bico

de Bunsen ou lamparina com álcool. Temperatura de 45 o.C – metal fica avermelhado. Objetos de vidro várias vezes na chama.

Filtragem: Separação física de microrganismos. Tipos de membrana de celulose, filtro de vidro, filtros de amiantos



Métodos FísicosMétodos Físicos Radiação UV: Desarranjo dos ácidos nucléicos; Lâmpadas que

emitem UV (250-265 nm). Estão acopladas a câmara de Fluxo Laminar.

Radiação Gama e Beta: Esterilização a baixas temperaturas e alto poder de penetração; para materiais termosensíveis.


MÉTODOS QUÍMICOSMÉTODOS QUÍMICOS

Esterilizantes:Óxido de etileno: elevado poder de penetração período

de 3 horas para esterilização, Formaldeído: baixo poder de penetração; restringe ao

uso em incubadoras.Oxido de propileno: menor poder de penetração 5-10 mL

de óxido de propileno por 24 h. Meios de cultura em placas de Petri.


MÉTODOS QUÍMICOSMÉTODOS QUÍMICOS

Desinfestantes:Álcool 70%: desinfestação de superfícies como câmaras

de fluxo e superfícies de trabalho. Imersão de fragmentos por 30 a 60 seg.

Hipoclorito de Na e Ca: Ação oxidante; eficiente para eliminar organismos saprófitas da superfície dos tecidos vegetais, atua nas [0,05 a 1%] por 30 a 60 seg.

Peróxido de Hidrogênio: Ação oxidante, [5%], usado como desinfetante de tecidos vegetais.


Higienização do LaboratórioHigienização do Laboratório

Bancadas e todas as superfícies devem ser desinfestadas;

Piso limpo diariamente com solução desinfestante.

Entrada do laboratório com pano úmido com solução desinfestante;

Compartimentalização dos locais do laboratório – área suja e área limpa.

Autoclavagem de vidrarias 121 o.C por 20 min. Alguns casos esterilização a seco na estufa



AUTOCLAVEAUTOCLAVE



Estufa de esterilizaçãoEstufa de esterilização


Incubadora e Bico de BunsenIncubadora e Bico de Bunsen

Dr. Milton Luiz da Paz Lima

Bico de Bunsen

Câmara de Crescimento17

EQUIPAMENTOSEQUIPAMENTOS


Câmara de fluxo vertical


Câmara de fluxo horizontal



Câmara Asséptica






Métodos físicos de controle do crescimento microbiano


Câmara de Fluxo laminar



Teste de Patogenicidade ou postulados de Koch o organismo deve estar associado a todas as

plantas e ao mesmo sintoma; o organismo deve ser isolado e cultivado

axenicamente (cultura pura livre de contaminantes) em meio de cultura, e seus dados morfológicos anotados;

o organismo vindo de cultura pura deve ser inoculado em plantas hospedeiras susceptíveis iguais às que originalmente ele fora isolado, e induzir os mesmos sintomas anteriormente encontrados;

o organismo deve ser isolado novamente em cultura pura e apresentar as mesmas características observadas anteriormente.



Uso de Meios de culturas Somente para fungos e bactérias Não utiliza-se meio de cultura para:

Vírus e nematóides. biotróficos como oídios (Blumeria, Erysiphe, Microsphaera e

Sphaerotheca), míldios (Peronospora, Bremia e Plasmopara), ferrugens (Puccinia, Uromyces e Transchelia) e carvões (Tilletia, Ustillago, Sphaceloma e Urocystis).


Nutrientes nos meios de Cultura

Elementos essenciais: Os principais são: C , H, O, N (função: principais constituintes da estrutura celular), S (função: constituinte da cisteína, metionina, fosfato de tiamina, coenzima A, biotina e ácido alfa-lipóico), P (função: constituinte do ácido nucléico, fosfolipídeos e nucleotídeos), K (função: principal cátion inorgânico da célula; é o cofator de algumas enzimas), Mg (função: cofator de diversas enzimas; está presente na parede celular, membranas e éster fosfato), Ca [função: cofator de enzimas; presente em exoenzimas (amilases e proteases); dipicolinato de cálcio (presente também na parede celular e) é o componente mais importante dos endósporos] e Fe (presente nos citocromos, ferrodoxinas e outras proteínas ferro-sulfurosas; cofator de algumas enzimas [algumas desidratases]). Além destes fazem-se presentes outros bio-elementos utilizados em menor quantidade pelos organismos tais como Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W e Ni.


Condições Especiais de Meios Elementos estimulantes: Alguns sais com: MgSO4.7H2O,

CaCO3, etc.

Elementos tamponantes: responsáveis pela estabilização do pH, tais como: K2HPO4, Na2HPO4 e CaCO3.

Elementos solidificantes: ágar e menos freqüentemente, gelatina.

Elementos inibidores: antibióticos e ácidos orgânicos, etc.

Elementos indicadores: substâncias que conferem uma característica especial à colônia a qual se pretende isolar.


Quanto a composição os meios podem ser:

Semi-sintéticos: com constituintes de composição química indefinida (caldo de batata, caldo de verduras, extrato de malte, extrato de carne, extrato de levedura, peptona, caseína hidrolizada, ágar, suco de tomate, e outros) e outros constituintes de composição química do meio é definida (Sais minerais e carboidratos);

Sintéticos: com todos os constituintes de composição química definida (Sais minerais, carboidratos, vitaminas e aminoácidos).


Quanto à consistência: (a) Líquido: sem constituinte solidificante; (b) Sólido: possui como constituinte solidificante a gelatina ou ágar.

Quanto à finalidade: (a) Não seletivo: onde vários tipos de organismos podem crescer; (b) Semi-seletivo: onde poucos tipos de organismos são capazes de desenvolver; (c) Seletivo: onde uma espécie ou gênero de organismo se desenvolve.


Meio BDA

Composição: 200g de batata descascada e fatiada; 20g dextrose; 15g ágar; 1 L água destilada;

Preparo: descascar, fatiar e pesar 200 g de batata; cozinhar as batatas por trinta minutos em 1,2 L de água; filtrar e manter o caldo; pesar e colocar em um frasco com capacidade superior a 1,2 L a dextrose (glucose) e o ágar; adicionar o caldo ao frasco, completando o volume para 1l; tampar o frasco com rolha termo-resistente ou algodão; misturar e dissolver o conteúdo em banho-maria por 15 minutos; autoclavar o frasco por 20 minutos (121oC, 1 atm); resfriar a 50oC ou a temperatura onde seja suportável segurar o frasco e vertê-lo.


Receitas de Meios de Cultura para FUNGOS Meio Ágar-água: 15-20g de ágar e 1000ml de água destilada. Meio Suco de tomate - ST (10%): 12-18g de ágar, 3g de CaCO3,

100 ml de suco de tomate temperado (“SuperBom” temperado ou normal) e 900ml de água destilada.

Meio V8 (10%): 12-18g de ágar, 3g de CaCO3, 100ml de suco de tomate V8 e 900ml de água.

Malte-ágar: 25g de extrato de malte, 15-20g de ágar e 1000 ml de água destilada.

Solução de Czapek em ágar: 30g de sacarose, 2g de NaNO3, 1g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,5g de KCl, 0,01g de FeSO4.7H2O, 0,01g de ágar e 1l de água.

Meio ágar Leonian modificado: 6,25g de maltose, 6,25g de extrato de malte, 1,25g de KH2PO4, 1g de extrato de levedura, 0,25g de MgSO4.7H2O, 0,625g de peptona, 20g de ágar e 1000ml de água destilada.

Meio ágar Rosa de Bengala de Martin: 10 g de glicose, 5 g de peptona, 1g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 0,03 g de estreptomicina, 15 g de ágar e 1000 ml de água destilada.


Receitas de Meios de Cultura para FUNGOS Meio ágar de farinha de milho: 60g de farinha de milho amarelo, 15g ágar e 1000ml

de água destilada.

Meio ágar de farinha de aveia: 100g de farinha de aveia, 15g de ágar e 1000ml de água destilada.

Meio de Nash Snyder: 15g de peptona, 1g de KH2PO4, 0,5g de MgSO4.7H2O, 1g de PCNB a 75 % PM, 0,12g de neomicina em 100ml de água, 1g de streptomicina em 100ml de água, 15g de ágar e 700ml de água destilada.

Meio de Reis: 50mg de benomyl em 100ml de água, 500mg de sulfato de streptomicina em 100ml de água, 30mg de sulfato de neomicina em 100ml de água destilada, 3ml de captam (solução estoque = 133,33mg [75% pm] em 100ml de água), 5ml de Botram (=dicloram; solução estoque = 200mg [50% pm] em 100ml de água), 10g de ágar, 15g de batata com casca em fatias e 2,5g de sacarose, 700ml de água.

Meio de Oxygall: 10g de dextrose, 10g de peptona, 15g de oxygall, 0,4g de estreptomicina, 20g ágar e 1000ml de água destilada.

Meio ágar para extrato de plantas (variável a composição): 50g do vegetal, 12g ágar e 1000 mL de caldo de planta.


Receitas e Meio de Cultura para Bactérias

Meio ágar nutritivo (NA): 3g de extrato de carne, 5-10g de peptona, 2,5g de glicose, 15-20g de ágar, 1l de água destilada. Após a autoclavagem, acrescentar 50ml de solução autoclavada de glicose (10%) e 1ml de MgSO4.7H2O 1M, ajustar para pH 7,2.

Meio 523 (Kado e Heskett): 10g de sacarose, 8g de caseína hidrolizada, 4g de extrato de levedura, 2g de K2HPO4, 300mg de MgSO4.7H2O, 20g de ágar e 1000ml de água.

Meio ágar caldo nutritivo de extrato de levedura: 8g de caldo nutritivo, 2g de extrato de levedura, 2g de K2HPO4, 2g de KH2PO4, 15g de ágar e 1000ml de água destilada. Meio líquido padrão para a bacteriologia com pH = 6,6-7,0.

Caldo de extrato de carne: 3g de extrato de carne, 5g de peptona e 1000ml de água.

Meio de extrato de levedura-dextrose-CACO3 (YDC): 10g de extrato de levedura, 20g de glicose, 2 g de CaCO3, 15g de ágar e 1000ml de água destilada. A glicose deve ser autoclavada separadamente. O meio deve ser resfriado a 50 o.C em ‘banho maria’, e o CaCO3 acrescentado por agitação antes de ser vertido nas placas.

Meio King B (KB): 20g de protease peptona no. 3, 2,5g de K2HPO4.3H2O, 6g MgSO4.7H2O, 15ml de glicerol, 15g de ágar e 1000ml de água destilada.


Receitas e Meio de Cultura para Bactérias Meio NDLA (Nutriente-dextrose-levedura-ágar): 5g de extrato

de carne, 10g de peptona, 4g de extrato de levedura, 5g de dextrose, 0,5g de K2HPO4, 20g de ágar, 1000ml de água.

Meio PSA (potato-sucrose-ágar): 300g de batata picada e fervida em 1250ml de água, 2g Na2HPO4, 0,5g de Ca(NO3)2, 15g de sacarose, 5g de peptona, 20g de ágar.

Meio glucose peptona ágar (GP): 5g peptona bacteriológica, 20g de glucose, 0,5g K2HPO4 (anidro), 0,25g MgSO4.7H2O, 15g de ágar no 3, 1l de água, pH 7,2-7,4.

Meio sacarose nutriente ágar (SNA) ou meio Levan (Lev): 28g nutriente ágar (Oxoid, CM3), 50g sacarose, 1000ml de água destilada (pH 7,2 ).

Meio nutriente dextrose ágar (NDA): 28g nutriente ágar (Oxoid, CM3), 10g D-glucose, 1000ml de água destilada (pH 7,2).


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